Modulul 5 – Biochimie

Curs 12. Metodele de laborator pentru determinarea unor constant biologice ale
organismului si compozitiei chimice a probelor biologice de analizat

Metodele fizice utilizate in laborator - pH – metrie, spectrofotometrie, cromatografie,

electroforeza

Spectrofotometria
Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizeaza transmiterea luminii printr-o solutie pentru
determinarea concentratiei unui solut in solutia respectiva. Spectrofotometrul  difera de
colorimetru prin modul in care lumina este separata in lungimile de unda componente.
Spectrofotometrul utilizeaza o prisma pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizeaza
filtre. Ambele se bazeaza pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de unda
cunoscuta printr-o proba si masurarea cantitatii de energie luminoasa care este transmisa.
Aceasta se realizeaza prin plasarea unei fotocelule in partea opusa a probei respective. O
raza de lumina este formata din fotoni; cand un foton intalneste o molecula de analit, exista
sanse ca analitul sa absoarba fotonul. Aceasta absorbtie reduce numarul de fotoni din raza
de lumina, astfel reducand intensitatea luminoasa.Toate moleculele absorb energie radianta
la anumite lungimi de unda. Cele care absorb energie in spectrul vizibil sunt cunoscute ca
pigmenti. Proteinele si acizii nucleici absorb lumina in domeniul ultraviolet. Un
spectrofotometru implica o sursa de lumina, o prisma, un suport pentru probe si o fotocelula.
Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controleaza intensitatea
luminii, lungimea de unda si conversia energiei primite la nivelul fotocelulei in fluctuatii
voltmetrice. Fluctuatiile voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scala metrica/digitala si valorile
sunt inregistrate intr-un computer.
Intensitatea culorii dintr-o proba depinde de cantitatea de solut din proba respectiva.
Transmisia luminii nu este o functie liniara, ci mai degraba exponentiala. Transmitanta este
procentul relativ de lumina care a trecut prin proba. Transmitanta procentuala este
transformata intr-o functie logaritmica inversa cunoscuta ca absorbanta (sau densitate
optica).
Legea Beer-Lambert: absorbanta este minus log10 din transmitanta (A = - log10T). Aceasta
valoare este mai utila decat transmitanta deoarece proiectia absorbantei versus concentratie
determina o linie dreapa, absorbanta crescand odata cu cresterea concentratiei
(transmitanta scade odata cu cresterea concentratiei de analit).
Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesara stabilirea unei serii cunoscute de dilutii a
unor cantitati cunoscute de solut. Una din acestea nu contine solut si este cunoscuta ca
“blank”. Este utilizata pentru ajustarea instrumentului sa citeasca 100% transmitanta pentru
absorbanta 0. O valoare a transmitantei de 0% (absorbanta infinita) este stabilita prin
plasarea unei bariere intre sursa de lumina si fotocelula. Toate celelalte masuratori sunt apoi
efectuate prin simpla plasare a probelor in calea luminii. Dupa inregistrarea absorbantei
pentru o serie de probe standard este efectuata o dreapta absorbanta versus concentratie.
Panta dreptei reprezinta coeficientul de extinctie. Aceasta valoare este o constanta si este
utilizata pentru conversia oricarei absorbante masurate in concentratia corespunzatoare (C =
A/ε).
Un spectrofotometru poate utiliza atat lumina vizibila (de obicei avand ca sursa de lumina o
lampa cu tugsten/halogen), cat si lumina UV. Singura modificare necesara este inlocuirea
tuburilor de sticla cu cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV si nu este potrivita pentru
un spectrofotometru UV).

Majoritatea testelor de chimie clinica efectuate pe analizorul automat sunt teste colorimetrice,

1
Modulul 5 – Biochimie

distingandu-se urmatoarele tipuri de teste:

- teste enzimatice colorimetrice in care substanta de analizat este tratata cu una sau mai
multe enzime specifice, in urma reactiei rezultand hidrogen peroxid, care in prezenta unui
substrat, sub actiunea peroxidazei duce la formarea unui pigment iminoquinonic care este
determinat fotometric, intensitatea culorii formate fiind proportionala cu concentratia analitului
respectiv (ex: determinarea acidului uric cu utilizarea uricazei);
- teste colorimetrice in care substanta de analizat se cupleaza specific cu reactivul cu
formarea unui produs conjugat colorat care este determinat fotometric (ex.: bilirubina se
cupleaza cu ionul diazoniu in mediu puternic acid cu formarea azobilirubinei de culoare
rosie); in cazul determinarii enzimelor, acestea cliveaza enzimatic un substrat specific,
produsul rezultat fiind colorat/ se cupleaza cu un cromogen si formeaza un complex colorat;
- teste UV:  NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat in timpul reactiilor care au loc
este determinat fotometric in lumina ultravioleta, concentratia sa fiind direct, respectiv invers
proportionala cu concentratia analitului de determinat (ex: determinarea ALT si AST).
- teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (in timp fix), ceea ce ofera o linearitate
mai mare (ex.: test kinetic UV pentru determinarea ureei).

Turbidimetria si nefelometria: se bazeaza pe formarea de complexe antigen-anticorp in

solutie. Solutiile de antigen si anticorp sunt mixate, fiind necesare cantitati foarte mici de
reactiv; formarea de agregate survine rapid. Turbidimetria masoara cantitatea de lumina
transmisa nedeviata prin solutie; fotosenzorul este plasat in linie dreapta cu sursa de lumina;
o solutie complet limpede va transmite 100% din lumina; cu cat concentratia de particule
este mai mare, cu atat mai putina lumina este transmisa. Ca si in colorimetrie se aplica legea
Beer-Lambert.
Nefelometria masoara cantitatea de lumina dispersata in unghi drept fata de raza de lumina,
fotosenzorul fiind plasat la un unghi de 90° fata de sursa de lumina; o solutie complet
limpede nu disperseaza lumina. Deoarece masuratorile nefelometrice vizeaza cresterile
peste un nivel de baza zero (spre deosebire de turbidimetrie care vizeaza reduceri ale
transmisiei sub 100%), nefelometria este mai sensibila la concentratii mici ale analitilor.
Nefelometria de rata reprezinta masurarea kinetica a formarii agregatelor. Timpul in care
panta curbei “lumina dispersata – timp” este maxima, este proportional cu concentratia de
antigen.
Aplicatii ale turbidimetriei si nefelometriei: determinarea albuminemiei si microalbuminuriei, a
imunoglobulinelor IgA, IgG, IgM si a fractiunilor complementului C3c, C4.

pH –metru

pH-ul reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației ionilor din soluție. Prin

noțiunea de pH se exprimă cantitativ aciditatea (sau bazicitatea) unei substanțe, pe baza
concentrației ionilor numiți hidroniu H3O+. Pentru soluțiile foarte diluate se consideră că pH-ul
nu mai este egal cu concentrația hidroniului, ci cu concentrația molară a soluției.

Limite pH[modificare | modificare sursă]

0 ≤ pH < 7 => pH acid | soluție acidă
pH = 7 => pH neutru | soluție neutră
7 < pH ≤ 14 => pH bazic (alcalin) | soluție bazică (alcalină)

Indicatori acido-bazici
1. indicator  | 2. mediu neutru | 3. mediu acid | 4. mediu bazic

2
 Valori reprezentative ale pH-ului
Modulul 5 – Biochimie Tipuri de substanțe pH
Acid clorhidric - HCl , 1M 0.1
Acid de baterie 0.5
Acidul gastric 1.5 – 2.0
Suc de lămâie 2.4
Cola 2.5
Oțet - CH3COOH 2.9
Suc de portocală sau de măr 3.5
Bere 4.5
Ploaie acidă <5.0
Cafea 5.0
Ceai 5.5
Lapte 6.5
Suc intestinal 6-7
Apă pură / distilata - H20 7.0
Saliva omului sănătos 6.5 – 7.4
Sânge 7.34 – 7.45
Apă de mare 8.0
Săpun de toaletă 9.0 – 10.0
Amoniac - NH3 11.5
Înălbitor 12.5
Sodă caustică - NaOH 13.9
_________________________________________________________________
1. fenolftaleina | 2. Incolor | 3. incolor | 4. roșu carmin
_________________________________________________________________
1. metiloranj  | 2. oranj | 3. roșu | 4. galben
_________________________________________________________________
1. turnesol  | 2. violet | 3. roșu | 4. albastru

Măsurare
pH-ul poate fi măsurat prin:

 Adăugarea unui indicator de pH în soluția de analizat. Culoarea luată de indicator

variază în funcție de pH-ul soluției. Utilizarea indicatorilor pentru determinări calitative
trebuie să țină cont de variația de culoare a acestuia, în funcție de pH-ul soluției (de
preferat sunt indicatorii care variază pe un interval de pH cât mai mic).
 Utilizarea unui aparat pH-metru cu electrozi pH selectivi: electrod de sticlă, electrod
de hidrogen, electrod de chinhidronă.
 Determinarea exactă a valorii pH-ului se face totuși prin metode combinate: utilizarea
de indicatori împreună cu metode spectrofotometrice, pentru identificarea fiecărui
constituent ce influențează pH-ul (culoarea indicatorului).

- pH-ul urinei reprezintă reacţia urinei şi are valori normale între 4,8 şi 7,8

3
Modulul 5 – Biochimie

pH-metria esofagiană computerizată tip Holter reprezintă o tehnică modernă de investigare

a acidităţii stomacului şi esofagului;

 În funcţie de tipul de electrod ataşat, metoda poate înregistra pH-ul la unul sau mai
multe niveluri (esofag proximal, esofag distal, sfincter esofagian inferior, stomac) sau se
poate folosi pentru înregistrarea concomitentă a presiunilor la nivelul tubului digestiv
superior.

 Procedura este utilizată pentru a preciza cantitativ severitatea refluxului gastric sau
pentru a diferenţia patologia de reflux de alte boli.

 Testul stabileşte dacă există o corelaţie între regurgitarea de acid şi diverse

simptome: durere retrosternală, tuse seacă nocturnă, senzaţia de sufocare nocturnă, astm,
răguşeală (disfonie), senzaţia de nod sau durere în gât.

Procedura de investigare este următoarea:

 Pacientul este invitat să stea în poziţie şezândă sau aşezat pe masa de examinare
într-o atitudine relaxată;

 În general nu este necesară sedarea deoarece testul nu este dureros, de obicei

apărând o discretă senzaţie de disconfort nazal sau faringian de scurtă durată;

 Examinatorul introduce un tub (electrod) de unică folosinţă, foarte subţire şi flexibil

prin nas în esofag, după o anesteziere locală prealabilă;

 Pentru a uşura introducerea electrodului trebuie să faceţi mişcări adânci de înghiţire,

iar uneori puteţi fi invitat să beţi puţină apă;

 La vârful tubului există un senzor care monitorizează pH-ul prin măsurarea acidităţii.
Tubul este petrecut şi legat în spatele urechii şi apoi adus în jos la un dispozitiv de
înregistrare montat în jurul taliei.

 Electrodul plasat la nivelul esofagului, sfincterului esofagian inferior sau stomacului,

transmite imagini dispozitivului de înregistrare şi stocare a informaţiilor, pe care
pacientul îl poartă la brâu sau montat pe piept;

 În cursul investigaţiei (aproximativ 24 ore) subiectul examinării se poate mişca liber

şi-şi poate continua activitatea, poate mânca, bea sau dormi;

 În funcţie de scopul pH-metriei, pacientul îşi poate lua sau nu tratamentul antiacid
obişnuit;

 Cu ajutorul unor butoane şi comutatoare bolnavul va informa înregistratorul de pH ori

de câte ori:

4
Modulul 5 – Biochimie

o simte arsuri pe gât (pirozis), regurgitaţii şi mai ales durere retrosternală (în
piept),

o când stă culcat sau în picioare,

o când mănâncă;

 După finalizarea procedurii, medicul vizualizează şi interpretează pe calculator

curbele de pH înregistrate, le corelează cu durerile semnalate de bolnav, precum şi
perioadele de clinostatism (poziţie orizontală), ortostatism (poziţie verticală) sau cu
perioadele de prânz alimentar şi ulterior formulează diagnosticul endoscopic.

 Electrodul explorator care se conectează la înregistrator are aspectul unui tub flexibil
cu un diametru de 2-3 mm care se introduce printr-o nară în faringe şi apoi în esofag
sau stomac. La vârful tubului există un senzor care sesizează pH-ul şi transformă
informaţiile despre aciditatea mediului în unde electromagnetice care vor fi trimise la
înregistrator.

 După conectarea electrodului la pH-metru, se calibrează

aparatul prin scufundarea succesivă a cateterului pentru 5
minute în soluţiile de calibrare standardizate (bazică,
neutră şi acidă);

Reactii de latex-aglutinare: sunt teste serologice care se

bazeaza pe reactia antigen-anticorp – microparticule de latex
invelite in molecule de antigen/anticorp aglutineaza in urma
cuplarii cu anticorpul, respectiv antigenul corespunzator din serul de testat. Latex-aglutinarea
a fost adaptata pentru teste cantitative care utilizeaza turbidimetria/nefelometria, asigurand
cresterea sensibilitatii.
Aplicatii in laboratoarele Synevo: determinarea ASLO, CRP, factor reumatoid.

Cromatografia reprezinta un grup de metode de laborator care se bazeaza pe adsorbtia

selectiva,  prin care componentele unui amestec complex pot fi identificate si/sau purificate
(adsorbtia reprezinta aderenta moleculelor la suprafata unei alte substante). Metoda a fost
utilizata initial de botanistul rus Mikhail Tsvett pentru separarea de produsi intens colorati, de
unde denumirea de cromatografie.

Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri , care
se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții)
cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și
faza mobilă (aflată în mişcare, se deplasează prin golurile primei faze).
Indiferent de natura chimică sau starea de agregare, faza staționară se găsește intr-o
pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât
mai mare.
Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice

5
Modulul 5 – Biochimie

Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza
mobilă și faza staționară.
Amestecul strabate sistemul cromatografic , fiind antrenat de către faza mobilă.
Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele
două faze, fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea.

Cromatografia in coloana implica o faza mobila (lichid sau gaz) care curge peste o faza
stationara (solida sau lichida). In cromatografia in coloana un amestec de molecule este
separat pe baza afinitatii fiecarei molecule pentru faza mobila sau stationara: daca o
molecula are o afinitate mai mare pentru faza stationara decat o alta molecula, atunci cea din
urma va migra prin coloana mai rapid decat prima molecula. Solutia de analizat este
adaugata prin partea superioara a coloanei si este apoi eluata cu solvent; fractiunile sunt
colectate prin partea inferioara a coloanei. Exista mai multe varietati de cromatografie in
coloana: cromatografia cu gel filtrare (excludere moleculara), cromatografia cu schimb de
ioni, cromatografia cu faza inversa, cromatografia cu gaz-lichid, cromatografia cu interactiuni
hidrofobe, cromatografia cu afinitate, cromatografia cu separare.
In cromatografia cu gel-filtrare (excludere moleculara) moleculele dintr-o solutie sunt
separate in functie de marimea lor pe masura ce trec printr-o coloana de bile legate intre ele
intr-o retea tridimensionala. Aceste bile polimerice (dextran, agaroza sau acrilamid) prezinta
pori de anumite dimensiuni. Pe masura ce o proba trece prin coloana, moleculele mai mari
decat dimensiunile porilor nu vor patrunde in ochiurile retelei ramanand in solutie, astfel incat
ele vor elua primele din coloana. Moleculele mai mici vor patrunde prin pori in ochiurile
retelei si astfel se vor deplasa mai lent prin coloana si vor elua ultimele din solutie. Pe
masura ce proba elueaza la capatul coloanei fractiunile sunt colectate in tuburi. Fractiunile
eluate sunt apoi testate pentru determinarea compozitiei si cantitatii componentelor
respective prin spectrofotometrie, electroforeza sau teste functionale. Cromatografia cu gel
filtrare este utilizata in primul rand pentru a purifica proteine sau alte molecule si poate fi
utilizata pentru estimarea marimii unor proteine necunoscute (coloane calibrate cu proteine
cu GM cunoscuta).
In cromatografia cu schimb de ioni moleculele sunt separate pe baza incarcaturii lor ionice.
Faza stationara este reprezentata de o rasina cu incarcatura fixa; daca aceasta incarcatura
este negativa (carboximetil celuloza), procesul se numeste cromatografie cu schimb de
cationi, iar daca incarcatura este pozitiva (dietilaminoetil celuloza), este cromatografie cu
schimb de anioni. Faza mobila este reprezentata de o solutie tampon. Atunci cand o proteina
trece prin coloana se poate lega de matrice si poate fi in continuare eluata prin cresterea
concentratiei ionice a solutiei tampon (elutia poate fi privita ca o competitie pentru situsurile
de legare ale matricei; pe masura ce puterea ionica a tamponului creste, o sare ionica din
tampon va ocupa un situs al matricei si proteina va fi eluata din coloana). pH-ul solutiei
tampon este critic in cromatografia cu schimb de ioni. Exista doua cai de efectuare a elutiei:
prin gradient, in care concentratia salina creste constant si gradual in timpul procesului de
elutie si elutia brusca, in care modificarea in concentratia salina este abrupta.
Electroforeza, ca si cromatografia cu schimb de ioni, poate fi utilizata ca un instrument
eficient pentru analiza unui amestec de ioni. O fasie de hartie sau gel polimeric saturata cu
un electrolit  este asezata astfel incat sa traverseze doua solutii care contin electrozi.
Amestecul de analizat este aplicat pe hartie/gel si cei doi electrozi sunt conectati la o sursa
de inalta energie (~5000 volti). Ionii pozitivi vor migra intr-o directie, iar cei negativi in cealalta
directie. Cu cat este mai mare incarcatura ionului, cu atat va migra mai departe. Metoda este

6
Modulul 5 – Biochimie

in mod special utila pentru separarea amestecurilor proteice.

In cromatografia cu faza inversa moleculele sunt legate de o matrice hidrofoba (hidrocarburi
cu lant lung legate de o matrice de silicon) intr-un tampon hidrofil. Moleculele pot fi apoi
eluate prin scaderea polaritatii tamponului, de exemplu prin cresterea concentratiei de alcool
sau alt solvent nepolar din tampon.
Cromatografia cu afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare; moleculele sunt
separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Sunt utilizati
liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport, din care este efectuata o coloana; peste
coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii continuti
in coloana; proteina este apoi eluata, fie prin modificarea conditiilor din coloana (modificarea
pH-ului sau concentratiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra in
competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Exemple de
liganzi in functie de substanta de purificat: substrat, inhibitor, cofactor (pentru enzime),
antigene (pentru anticorpi), secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici).
Cromatografia lichida de inalta performanta utilizeaza pompe care furnizeaza presiuni inalte
care imping solventii prin coloane metalice. Aceasta creste viteza procesului de separare si
previne raspandirea solutiilor care poate aparea in cromatografia in coloana gravitationala.
Separarea are loc in minute in loc de ore si este net superioara. Utilizand cromatografia cu
faza inversa pot fi separate doua proteine a cate 100 aminoacizi fiecare care difera printr-un
singur aminoacid.
Cromatografia cu gaz utilizeaza un lichid cu punct de fierbere inalt impregnat intr-un suport
solid inert ca faza solida si heliu ca faza mobila, intregul sistem fiind incalzit. Solutul este
injectat in coloana si se volatilizeaza imediat, heliul indepartand componentele din coloana,
fiecare component fiind inregistrat de un detector care determina cantitatea relativa a
acestuia. Polaritatea si volatilitatea componentelor determina timpul cat acestea sunt retinute
de coloana. Capacitatea coloanei in cromatografia cu gaz fiind foarte mica, aceasta este
utilizata in principal ca un instrument analitic.
In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie coloana este inlocuita cu un strat
adsorbant (silicon, aluminiu, celuloza) aplicat pe un suport de sticla/plastic/folie de aluminiu.
Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar solventul este lasat sa se evapore. Apoi
componentele sunt eluate cu un solvent care este lasat sa urce pe placuta prin actiune
capilara, antrenand componentele amestecului in grade diferite. In final se aplica un agent
oxidant, astfel incat fiecare component apare ca o pata intunecata pe placuta, localizarea si
marimea fiecareia dintre acestea servind pentru identificarea si masurarea cantitatii relative a
componentelor.
Aplicatii ale cromatografiei in laboratorul Synevo: determinarea acidului  vanilmandelic,
metanefrinelor si 17-cetosteroizilor urinari. 

Electroforeza

Electroforeza este una din metodele eficace pentru studiul proteinelor serice
(separarea si identificarea diferitelor fractiuni proteice).

Crearea unui camp electric intr-o solutie care contine particule coloidale incarcate electric
determina migrarea acestora spre anod sau spre catod, in functie de sarcina electrica.
Fenomenul poarta denumirea de electroforeza.

Electroforeza bidimensională (2-DE) este o tehnică care combină focusarea izoelectrică

(metoda în care separarea se face pe baza sarcinii totale) cu SDS-poliacrilgelelectroforeza

7
Modulul 5 – Biochimie

(metoda în care proteinele sunt separate pe baza masei moleculare). Combinarea celor
două metode conduce la îmbunătăţirea rezoluţiei separărilor amestecurilor complexe de
proteine. Proteinele astfel separate pot fi observate sub forma unor spoturi situate în geluri .
Această tehnică este indispensabilă pentru cercetătorii care lucrează în domeniul
proteomicii, disciplină care vizează studiul structurii, interacţiunilor, şi a funcţiilor biologice a
proteinelor rezultate în urma expresiei genomului (sub forma proteomului) unui organism.

De asemenea, această tehnică permite separarea izoenzimelor, proteine a căror masă

moleculară este apropiată şi au funcţii asemănătoare, dar care se diferenţiază prin
compoziţia acestora în aminoacizii componenţi (din structura primară a proteinei).