BIOREACTOARE PENTRU CELULE VEGETALE

1. Cultivarea celulelor vegetale in bioreactoare

Intrucat culturile de celule vegetale au importanta practica in cataliza unor reactii de
biotransformare, ca surse de metaboliti secundari, in producerea de enzime specifice etc., pentru
cultivarea lor sunt necesare bioreactoare cu capacitati mari.
Daca pentru cultivarea microorganismelor prin capacitate mare se inteleg volume de 10
000 - 100 000 litri, in cazul cultivarii celulelor vegetale (tabelul 1) este vorba, de obicei, de
volume mai mici de 100 litri, cu toate ca au fost semnalate si volume de pana la 75 000 litri.

Tabelul 1. Exemple de bioreactoare de mare capacitate folosite pentru cultivarea celulelor

vegetale
Anul Planta Tip bioreactor Volum, l
1959 Trandafiri (Rosaceae), ilice Balon de sticla cu 10
1960 (Ilex aqvifolium), ginkgo barbotare
Vasde otel 30 ; 134
(arbusl japonez cu flori) inoxidabil cu
barbotare
1962 Morcov {Daucus carota) Bioreactor cu amestecare 7,5 ; 15
1972 Tutun {Nicotiana tabacum) Bioreactor cu amestecare 30 ; 600
1974 Patrunjel {Petroselinum Bioreactor cu amestecare 300
crispum)
1977 Tutun {Nicotiana tabacum) Bioreactor cu amestecare 20 000
Morinda citrifolia Bioreactor air-lift 10; 20
1982 Tutun {Nicotiana tabacum) Bioreactor cu 20 000
amestecare cu
functionare continua
1983 Digitalis canata Bioreactor air-lift 200
1986 Solarium demissum Bioreactor cu amestecare 800
1990 Echinacea Bioreactor cu amestecare 75 000
2004 Digitalis lanata Bioreactor air-lift 300

In tabelul 2 sunt prezentate cateva exemple vegetale si parti ale acestora cultivate in
bioreactoare in vederea multiplicarii celulelor, obtinerii de soiuri si hibrizi noi, cu proprietati
imbunatatite, care sa permita realizarea unor productivitati mari, in cazul plantelor de cultura, a
unor arbusti si plante decorative deosebit de atragatoare etc.
Tabelul 2. Exemple de plante multiplicate sub forma de culturi de celule in
bioreactoare
Anul Planta Parti ale plantei obtinute
1990 Telina (Apium graveolens) Embrioni somatici
Gladiole {Gladiolus Lastari cu muguri, plante, bulbi
1992 Lucernagrandiflorum)
(Medicago sativa) Tesut, embrioni somatici
1993 Cafea (Coffea arabica) Lastari ramificati, plante
1994 Cartof {Solatium tuberosum) Tuberculi, lastari, radacini, plante
Morcov (Daucus carota) Tesut, embrioni somatici
Poinsetia {Euphorbia Embrioni somatici
pulcherrima)
Molid {Picea) Embrioni somatici

-1-
 1995 Arbore de cauciuc {Hevea Muguri, plante
brasillensls)
1997 Muscate (Dianthus caryophyllus) Lastari, plante
1998 Amarilis {Amaryllis hippeastrum) Muguri, plante, bulbi
Ciclame {Cyclamen persicum) Tesut, embrioni somatici
Capjune (Fragraria) Lastari, plante
Zambile {Hyacinthus orientalis) Bulbi, plante
1999 Ananas {Ananas comosus) Lastari ramificati
1

Primul produs obtinut comercial prin cultivarea celulelor vegetale si inregistrat a fost
shikonina, aditiv de culoare si farmaceutic obtinuta prin cultivarea celulelor de Lithospermum
erythrorhlzon. Aceasta realizare a fost urmata de obtinerea ginseng-ului (Panax ginseng) si de a
altor compusi. (tabelul 3).

Tabelul 3. Metaboliti secundari obtinuti prin culturi de celule si tesuturi vegetale

Productivitate, % Tip de
Compus Planta cultura
Cultura Planta
Shikonina Lithospermum 20 1,5 submersa
Ginseng Panax ginseng 27 4,5 calus
Antrachinone Morinda citrifolia 18 0,3 submersa
Acid rosmarinic Coleus blumei 15 3,0 submersa
Ubiquinona-10 Nicotiana tabacum 0,036 0,003 submersa
Diosgenina Dioscorea deltoides 2 2,0 submersa
Benzil Coptis japonica 11 5-10 submersa
izoquinona;
alcaloizi
Antrachinone Galium verum 5,4 1,2 submersa
Galium aparine 3,8 0,2 submersa
Nicotina Nicotiana tabacum 3,4 2,0 calus

2. Caracteristicile culturilor submerse de celule vegetale

In comparatie cu celulele de microorganisme, celulele vegetale sunt mai mari,
dimensiunile si forma lor putand varia mult. Adesea, ele se gasesc in grupuri sau asociatii care se
modifica pe parcursul ciclului de crestere sau odata cu modificartea conditiilor de cultivare.
Aceste grupuri pot avea dimensiuni de pana la 2 mm, ceea ce face ca prelevarea probelor
reprezentative sa fie dificila si adesea necesita largirea porturilor bioreactorului folosite pentru
inoculare sau pentru prelevare probe.
Dimensiunile celulelor si a aglomeratelor contribuie la separarea lor rapida prin
sedimentare, astfel ca este necesara o agitare continua si eliminarea oricaror spatii neomogene,
neagitate si a obstacolelor pentru evitarea depunerii celulelor vegetale. Cu toate ca formarea
agregatelor inca nu este pe deplin inteleasa, se presupune ca se datoreaza nesepararii celulelor
dupa diviziune. Pe de alta parte, agregatele pot forma in interior medii care incurajeaza
acumularea produselor secundare.
Dimensiunile mari, peretii celulari celulozici rigizi si vacuolele mari au fost considerate
cauzele sensibilitatii celuielor vegetale la forfecare, la solicitari mecanice produse de amestecare,
in general, sensibilitate acuzata de dificultatea cu care celulele vegetale au fost cultivate submers
in bioreactoare cu amestecare in anii '70 si '80. In schimb, bioreactoarele air-lift, datorita
solicitarilor reduse de forfecare au inlocuit cu succes bioreactoarele cu amestecare in acea
perioada.

-2-
 Intrucat agitarea este importanta la cultivarea celulelor in bioreactoare, pentru a se
preveni depunerea, dar si pentru a raspunde sensibilitatii la forfecare, au fost construite diferite
tipuri de dispozitive de amestecare.
O serie de cercetari au fost orientate spre stabilirea gradului sensibilitatii la forfecarea
cauzata de agitare. Astfel, s-a determinat viabilitatea celulelor vegetale din culturile supuse la
stres, masurandu-se integritatea peretilor celulari prin colorare, metoda care nu indica, insa, daca
cresterea are Ioc sau nu, deci daca celulele se divid. Cea mai buna metoda utilizata a constat in
urmarirea cresterii celulelor vegetale in cultura submersa intr-un bioreactor de laborator cu un
volum de 3 l dupa expunere la o turatie mare (1 000 rot/min = 16,7 rot/s) un timp scurt,
maximum 5 ore, respectiv un timp lung, pana la 21 zile. S-a constatat ca exista, totusi, multe
celule vegetale cultivate submers care devin tolerante la conditiile de forfecare, comportament ce
se dezvolta in timp, in paralel cu imbunatatirea vitezei de crestere si a caracteristicilor culturale
(tabelul 4).
Viteza de crestere a celulelor vegetale cultivate in conditii submerse este foarte mica,
timpul de dublare fiind, de obicei, de 2 - 6 zile. Cea mai rapida crestere a fost inregistrata la
cultivarea celulelor de tutun, dar aceasta este o exceptie.
Consecinta practica a vitezei de multiplicare mici este durata mare de functionare a
bioreactorului care poate ajunge pana la 21 zile, timp in care mentinerea conditiilor de sterilitate,
intretinerea functionarii si pierderea de apa reprezinta o problema.

Tabelul 4. Exemple de comportare a celulelor vegetale la forfecare

Expunere limp scurt (0,5 ore) Expunere timp lung (crestere)
Exemple de celule Efect Exemple de celule Efect
Catharanthus roseus Tolerante Catharanthus Tolerante
Jimsonweed {Datura Sensibile roseus
Nicotiana tabacum Tolerante
Floarea stramonium)
soarelui (Helianthus Tolerante Tabernaemonta
Tolerante
Vita de vieannus)
(Vitis vinifera) Tolerante na divaricata
Tutun (Nicotiana tabacum) Sensibile Cinchona robusta Sensibile

Spre deosebire de majoritatea celulelor de microorganisme, celuiele vegetale sunt

caracterizate de o concentratie critica a inoculului sub care cresterea nu are loc. Aceasta este
corelata cu contactul dintre celule sau cu substantele produse de celule si eliberate in mediu. O
concentratie initiala de celule insuficienta inseamna ca aceste substante nu sunt produse la
concentratia necesara, iar cresterea nu demareaza. De obicei se foloseste tin inocul de 10 %, de
circa 5-20 ori mai mare decat pentru cultivarea celulelor de microroganisme.
In afara de viteza de crestere scazuta, culturile submerse de celule vegetale au si un
necesar scazut de oxigen situat in intervalul 0,1-10 mM /(L-h) pentru culturi cu o concentratie de
10 kg s.u./m3 (g s.u./L). Aceste valori sunt mici in comparatie cu cerintele microroganismelor
aerobe: 5-200 mM /(L-h). In general, oxigenul este putin solubil in mediul de cultura astfel ca
proiectarea barbotoarelor si a dispozitivelor de amestecare este orientata spre imbunatatirea
alimentarii cu oxigen si a transferului acestuia in faza lichida si catre celule. Nu este si cazul
bioreactoarelor folosite pentru cultivarea celulelor vegetale datorita necesarului scazut de oxigen
al acestora. Insa, dispozitivele de amestecare trebuie, totusi, proiectate cu grija pentru a asigura
mentinerea submersa a celulelor, fara depunerea lor, la turatiile mici si relativ mici care tin seama
de sensibilitatea la forfecare a celulelor vegetale.
In general, culturile submerse de celule vegetale sunt cultivate in bioreactoare la
concentratii de 10-15 kg / m3, desi exista numeroase cercetari efectuate la valori de pana la 40 kg
s.u. / m3, caz in care vascozitatea poate deveni o problema. Primele studii ale vascozitatii
mediilor de cultura cu celule vegetale au fost contradictorii intrucat unii cercetatori au

-3-
concluzionat ca acestea sunt fluide tixotrope, altii ca sunt fluide non-newtoniene si
pseudoplastice. Problemele de caracterizare erau cauzate de metodele de masurare a vascozitatii
intrucat in vascozimetrele rotative aveau loc diferite procese de decantare, separare a fazelor sau
chiar distrugeri ale celulelor. Pentru eliminarea acestor probleme au fost construite vascozimetre
prevazute cu dispozitive de agitare de tip turbina care, desi produc o curgere turbulenta, permit
masurarea cu suficienta acuratete a vascozitatii mediilor cu concentratii de 10-40 kg s.u. / m". In
general, acestea sunt fluide Bingham si au vascozitati de (3-25)x 10~3 Pa (Scrag, 1991).
Culturile submerse de celule vegetale secreta in mediu un numar considerabil de proteine
si, in multe cazuri, de poliglucide. In multe bioreactoare are loc formarea unei cruste, la inceput
deasupra spumei, apoi aceasta adera pe peretii aparatului. Crusta consta din biofilme de celule
vegetale si poliglucide. Atat spuma, cat si crusta pot fi reduse considerabil prin adaosul de
antispumanti: produse pe baza de silicon (ex. ulei siliconic) sau polipropilena.

3. Cerinte pentru bioreactoare

Cunoscandu-se caracteristicile speciale ale unei culturi submerse de celule vegetale, pot fi
estimate conditiile pe care trebuie sa le indeplineasca un bioreactor pentru a putea fi utilizat pentru
cultivarea celulelor vegetale (tabelul 5).

Tabelul 5. Conditii pentru bioreactoare destinate cultivarii submerse a celulelor vegetale

Parametru Valoare Consecinte
Raport inocul / mediu 1/10 Inocul mare
Vascozitate mare,
Concentratie de biomasa 20 - 40 kg / m3 amestecare si aerare
reduse
Viteza specifica de Durata de functionare: min
0,34 (rrf = 2 zile)
multiplicare (μ) 21 zile
Temperatura de cultivare 25°C Necesar redus de
Vascozitate mediu Mare la 40 incalzire/racire
Afecteaza aerarea si
Aerare (oxigen dizolvat) kg/m3
0,1-10 amestecarea
Valori critice mici ale kla
Necesara
mM/(Lh) Depunerea poate fi
Amestecare pentru a determinata de vascozitate si
preveni de sensibilitatea la forfecare
sedimentarea
Unele culturi Este posibila cultivarea
Sensibilitate la forfecare pot fi tolerante in bioreactoare cu amestecare

Necesarul de inocul in concentratie ridicata nu afecteaza bioreactorul ca atare, insa

presupune existenta unor vase de inoculare mari si un raport de capacitati exprimat prin expresia
„transpunere la scara" (scale-up) relativ mic. De asemenea, datorita sensibilitatii la forfecare si
naturii agregative a celulelor cultivate submers, conexiunile dintre vasul de inoculare si
bioreactor trebuie sa fie largi, transferal inoculului efectuandu-se pe principiu gravitational sau cu
presiune de aer.
Datorita vitezei mici de multiplicare, s-au propus concentratii de biomasa cuprinse in
intervalul 20-40 kg / m pentru cresterea productivitatii. Desi la asemenea concentratii
vascozitatea este mai mare, celulele vegetale pot fi cultivate atat in bioreactoare cu amestecare,
cat si in bioreactoare air-lift, conditia fiind, pentru acestea din urma, evitarea zonelor in care se
creeaza conditii anoxice si a sedimentarii celulelor.
Viteza de crestere mica presupune o durata de functionare de pana la 21 zile, astfel ca
numarul de cultivari posibile intr-un an este, teoretic, de circa 12 (scazand timpul necesar pentru
golire, spalare, sterilizare, pornire, remont etc. din timpul total). De asemenea, durata mare

-4-
implica gasirea unor solutii de reducere a pierderilor de apa sau de completare a acestora.
Temperatura la care se multiplica celulele vegetale, in general 25°C, si cresterea lenta
(cantitate de caldura degajata mica) determina un necesar scazut de energie pentru incalzire sau
pentru racire.
Necesarul de aerare de 0,1-0,5 mM/(g-h) oxigen pentru 10 kg/m concentratie de biomasa
si de 1-10 mM/(g-h) oxigen pentru 20 kg/m3 concentratie de biomasa conduc la valori critice
ale produsului kla cuprinse intre 2,36 si 42 h-1 (6,55x10-4 s-1 - l,16xl0-2 s-1) care trebuie
asigurate de conditiile de lucru din bioreactor.
Agitatorul unui bioreactor folosit pentru cultivarea microorganismelor are rol dublu: sa
asigure omogenitatea in sistem, respectiv sa reduca dimensiunile si sa distribuie bulele de aer
pentru a mari transferul de oxigen din faza gazoasa in faza lichida. Adesea, ultima functie este cea
mai importanta. In bioreactoarele folosite pentru cultivarea celulelor vegetale rolurile sunt
inversate datorita necesarului redus de oxigen si vitezelor mari de sedimentare.
Conditiile de amestecare trebuie indeplinite cu conditia respectarii sensibilitatii celulelor
vegetale la forfecare astfel ca, la inceput, bioreactoarele cu amestecare au fost prevazute cu
agitatoare de tip turbina cu turatie mica, de 50-100 rot/min. Ulterior au fost realizate multe alte
tipuri de dispozitive de amestecare, o parte din acestea fiind prezentate in continuare.

4. Bioreactoare cu amestecare pentru celule vegetale

Principalele tipuri de bioreactoare folosite pentru cultivarea submersa a celulelor vegetale
sunt:
- bioreactoare cu amestecare prevazute cu diferite tipuri de dispozitive de agitare;
- bioreactoare cu amestecare prevazute cu filtru rotativ;
- bioreactoare air-lift.
In anii 1970, bioreactoarele cu amestecare au fost partial mlocuite cu bioreactoare air-lift
cu volum de pana la 80 litri pentru cultivarea multor tipuri de celule vegetale.
Desi eficiente, bioreactoarele air-lift raman doar o alternative a bioreactoarelor cu
amestecare datorita problemelor pe care le implica utilizarea unor debite mari de gaz pentru a
realiza o amestecare corecta. Multe cuituri submerse de celule vegetale sunt sensibile la
concentratia fie prea ridicata, fie prea coborata, de C02, ceea ce are ca rezultat Tncetinirea
cresterii celulelor.
Prin urmare, bioreactoarele cu amestecare sunt utilizate in continuare pentru cultivarea
submersa a celulelor vegetale, folosindu-se diferite tipuri de dispozitive de amestecare care
lucreaza la turatii de 60-100 rot/min.
Intrucat bioreactoarele air-lift utilizate pentru cultivarea submersa a celulelor vegetale nu
difera prin nimic de cele destinate cultivarii microorganismelor, in continuare sunt prezentate
principalele tipuri de bioreactoare cu amestecare.
In cazul bioreactoarelor de laborator se pot folosi dispozitive de agitare simple, care sa
lucreze la turatii mici pentru a asigura transferul substantelor nutritive si al oxigenului catre celule
si pentru a mentine omogenitatea mediului.
Astfel, in fig. 1 sunt prezentate cateva tipuri de bioreactoare de amestecare utilizate pentru
cultivarea submersa a celulelor si a tesuturilor vegetale care se diferentiaza prin tipurile de
dispozitive de amestecare cu care sunt prevazute: bara de agitare (fig. 1 a), dispozitiv cu palete
(fig. 1 b), elice (fig. 1 c), dispozitiv de amestecare vibrator (fig. 1.d).
Dispozitivul de amestecare tip elice are avantajul realizarii simultane a unei amestecari
radiale si verticaie. In cazul dispozitivului vibrator, agitarea este obtinuta prin miscarea pe
verticala, in sus si in jos, pe o distanta de 2 mm si cu o frecventa de 60 Hz, a unui disc de

-5-
amestecare prevazut cu orificii conice.

Fig. 1.
Bioreactoare cu amestecare prevazute cu dispozitive de amestecare simple pentru cultivare
celule vegetale si animale:
a - bioreactor cu dispozitiv de tip bara de agitare; b - bioreactor cu dispozitiv de amestecare cu
palete; c - bioreactor cu dispozitiv de amestecare tip elice; d - bioreactor cu dispozitiv de
amestecare vibrator:
/ - bioreactor; 2 - arbore dispozitiv de amestecare; 3 - bara de agitare; 4 - palete; 5 - elice; 6 - disc
de amestecare; 7 - orificii conice in discul de amestecare.

In urma cu doua decenii s-au utilizat o turbina cu palete tip Rushton, o ancora si o turbina
cu palete inclinate, ajungand la concluzia ca cea din urma asigura cele mai bune rezultate pentru
cultivarea Panax ginseng intr-un bioreactor de 30 L.
In 1985 s-au comparat turbina si ancora (fig. 2 a) cu un dispozitiv de amestecare in forma
de spirala (fig. 2 b) si s-a ajuns la concluzia ca spirala este mai eficienta pentru cultivarea
celulelor de Coleus blumei pentru obtinerea de acid rozmarinic.

-6-
 Fig. 2. Bioreactoare cu amestecare pentru cultivarea submersa a celulelor vegetale:
a - cu agitator tip ancora; b - cu agitator in forma de spirala; c - cu turbina celule-lift;
d - cu turbina cu palete drepte mari:
1 - bioreactor; 2 - ancora; 3 - arbore dispozitiv de amestecare; 4 - spirala; 5 - turbina
ascendenta; 6 - tuburi laterale de evacuare; 7 - palete drepte mari.

Agitatoarele de tip rotor cu pale inclinate au fost folosite si la turatii mai mari, de 300 - 1
000 rot/min si s-au dovedit a fi mai eficiente decat turbinele Rushton normale, motivul fiind ca
palele inclinate produc mai putin stres de forfecare asupra celulelor, amestecarea fiind buna.
Pentru cultivarea submersa a celulelor vegetale au fost proiectate si alte tipuri de
dispozitive de amestecare (fig. 2 c si d). Astfel, in 1989 s-au utilizat, pentru culturi de celule
vegetale, bioreactoare de laborator de 1,25 si 2,5 litri prevazute cu dispozitive de amestecare cu
palete drepte, cu elice sau turbina celule-lift (fig. 2 c), cu o turatie de lucru de 30-80 rot/min.
Agitatorul tip turbina celule-lift s-a dovedit a fi mai bun din punct de vedere al mentinerii
viabilitatii celulelor.
Un alt studiu (1990) a comparat agitatoarele cu palete drepte cu agitatoare cu elice si
agitatoare cu palete drepte largi (inalte), acestea din urma dovedindu-se a fi mai eficiente in
termeni de efectuare a agitarii si de mentinere a viabilitatii celulelor (fig. 2 d).
Functionarea normala a bioreactoarelor folosite pentru cultivarea submersa a celulelor
vegetale este cea discontinua, functionarea semicontinua sau continua utilizandu-se mai rar.
Intrucat multe produse de metabolism sunt produse secundare obtinute dupa incetarea
cresterii sau au nevoie de o modificare a mediului nutritiv se recurge la o cultivare in doua trepte,
ceea ce presupune utilizarea a doua bioreactoare in serie. Acest mod de cultivare permite trecerea
spre o functionare semicontinua in care bioreactorul este inoculat cu o cantitate mare de inocul,

-7-
din care circa 90% este evacuat si inlocuit cu mediu nutritiv. In acest fel, sursa de carbon, de
obicei glucide simple, este adaugata treptat, evitandu-se cresterea presiunii osmotice si efectul
inhibitor al unei concentratii prea mari de glucide asupra vitezei de multiplicare a celulelor
cultivate.
In general, celulele vegetale sunt cultivate in bioreactoare in stare submersa, dar culturile
de tesuturi (ex. radacini, lastari, embrioni etc.) sunt cultivate fie pe suprafete solide, fie in mediul
lichid pentru stimularea formarii unor produse secundare. Sunt, insa, mult mai sensibile la
forfecare decat suspensiile de celule, astfel ca se impune o modificare a constructiei
bioreactorului.
In 1988 s-a utilizat un bioreactor cu amestecare prevazut cu un dispozitiv de amestecare cu
brate drepte dispuse pe trei randuri si cu sicane intercalate (fig. 3). Turatia dispozitivului de
amestecare este foarte mica, doar 10 rot/mi n.
Cultivarea submersa poate fi folosita si pentru embriogeneza cu obtinerea de plante din
seminte, aplicarea acestei tehnici pe scara larga conducand la producerea de seminte pe cale
artificiala. Pentru aceasta s-au folosit atat bioreactoare cu amestecare, cat si air-lift, acestea din
urma dovedindu-se ceva mai potrivite.

5. Bioreactoare cu filtru rotativ pentru celule vegetale

Bioreactorul cu filtru rotativ sau cu rasucire {spin filter bioreactor) a fost utilizat cu succes
pentru embriogeneza unor seminte de plante (fig. 4).
Acest bioreactor este prevazut cu un filtru rotativ (3) a carui miscare contribuie la
omogenizarea culturii in care se adauga mediu nutritiv prin portul (10) si din care se evacueaza
mediu epuizat care poate contine si celule vegetale prin portul (6). Daca se doreste retinerea
celulelor in stare submersa, mediul epuizat este evacuat prin portul (8) dupa o prealabila filtrare
prin filtrul rotativ (3).

Fig. 3. Bioreactor cu amestecare cu palete drepte dispuse pe trei randuri si cu sicane cu

palete drepte intercalate:
/ - bioreactor;
2 - arbore al dispozitivului de amestecare;
3 - palete drepte;
4- ax fixare sicane;
5- palete drepte din structura sicanelor;

-8-
 6- barbotor de gaz (aer);
7- bara de sustinere sicane; 8 - capac; 9- cutia sistemului de antrenare si de etansare.

Fig. 4. Bioreactor cu filtru rotativ (spin filter bioreactor):

1 - bioreactor;
2 - tub de fixare a filtrului rotativ si de evacuare a mediului epuizat filtrat;
3 - filtru rotativ;
4 - barbotor;
5 - capac bioreactor;
6 - evacuare mediu epuizat ce confine si celule;
7 - alimentare cu aer;
8 - evacuare mediu epuizat filtrat;
9 - evacuare aer;
10- alimentare cu mediu nutritiv;
11-port izolat.

-9-
 BIBLIOGRAFIE

[1] Maria Turtoi, Bioreactoare. Noţiuni fundamentale, Ed.

Academica, Galaţi, 2006
[2] Banu C. şi colab., Manualul Inginerului de Industrie Alimentară,
vol. II, Ed. Tehnică, Bucureşti, 2002

- 10 -