Translated from English to Romanian - www.onlinedoctranslator.

com

În prima parte a LP, am efectuat scanări de excitație a Fura-2 în soluție, cu și fără Ca

2+:

Figura 1: Scanări de excitare a Fura-2 în soluție.

Figura 1 arată modificarea proprietăților spectrale ale Fura-2 cu creșterea Ca2+

concentratii.

Interpretarea rezultatelor este următoarea:

1) Fura-2 afișează două maxime de excitație diferite: unul maxim în jurul valorii de 380 nm (Cafree,
curbă neagră) și unul maxim în jurul valorii de 340 nm (curba roșie legată de Ca).

2) Când Ca2+ionii se leagă de Fura-2, fluorescența la excitația de 380 nm scade și

fluorescența la excitația de 340 nm crește în același timp. Aceste modificări sunt
indicate în Figura 1 prin săgețile cu linii întrerupte.

3) Punctul în care se intersectează toate curbele se numește punct izosbestic. În acest moment,
fluorescența Fura-2 este constantă și independentă de Ca2+ionii.
 În a doua parte a LP, am introdus Fura-2-AM în celule (fibroblaste de șoarece) și am aplicat ATP
pentru a induce un semnal de Ca celular.

La începutul înregistrării celula este în repaus și [Ca2+]ieste scăzut. Pentru a determina

modificarea în [Ca2+]i, iluminăm celula în mod alternativ la 340 nm (pentru a monitoriza Fura-2 la
concentrații mari de Ca) și la 380 nm (pentru a monitoriza Fura-2 la concentrații scăzute de Ca) și
colectăm fluorescența emisă pentru ambele moduri de excitare separat. În înregistrările noastre am
schimbat între 340 nm și 380 nm în fiecare secundă.

Figura 2A prezintă urmele fluorescente corespunzătoare: F1în roșu (excitație la 340 nm)
și F2în albastru (excitație la 380 nm).

Figura 2: O măsurare rațională Fura-2 a unui semnal de Ca indus de ATP într-un fibroblast de șoarece.

Când semnalul Ca se dezvoltă și [Ca2+]icrește (caseta gri din Figura 2), apoi mai mult
Ca2+se va lega de Fura-2. În consecință, F1crește și F2scade in acelasi timp. Când semnalul
este terminat, ambele urme fluorescente revin la liniile de bază corespunzătoare.

Figura 2B arată raportul calculatF1/F2, care reflectă schimbarea reală în [Ca2+]ipeste

timp. Cele două avantaje principale ale utilizării raportului sunt:

1) Cote în Ca2+sunt afișate ca o creștere a raportului: cu cât mai mult Ca2+, cu atât raportul este mai
mare.

2) Raportul este independent de modificările individuale ale lui F1și F2, care nu au legătură cu Ca2+,
de exemplu, mișcarea celulelor, albirea colorantului etc.
 Apoi am încercat să inducem diferite răspunsuri celulare de Ca folosind ATP. Figura 3 prezintă
diferitele semnale de Ca pe care le-am obținut în timpul ambelor sesiuni ale LP. Pentru o comparație
mai bună, Figura 3 arată doar rapoartele Fura-2 calculate.

Figura 3: Semnale diferite de Ca induse de ATP ale fibroblastelor de șoarece în prezența și absența Ca
extracelular2+.

Semnalul de Ca al unui fibroblast ca răspuns la ATP este SOCE. Are două componente,
mai întâi o lansare de Ca2+din ER (notat ca unul în Figura 3) care este urmat de o intrare
întârziată a Ca2+din spațiul extracelular prin canale ionice (notate ca două în Figura 3).

În prima situație experimentală am aplicat ATP fără Ca extracelular (Figura 3A). În acest
scenariu, ATP va provoca doar eliberarea intracelulară de Ca2+din ER, în timp ce activitatea
canalului ionic este împiedicată (partea din stânga a figurii 3A). Aplicarea ATP a dus la o creștere
rapidă și mare a [Ca2+]eu,care scade în timp și revine la valoarea de bază. Aceasta este eliberarea
izolată de Ca2+de la Urgențe.
 În a doua condiție experimentală (Figura 3B), am aplicat ATP în prezența a 2 mM Ca
extracelular. Am înregistrat un semnal de Ca care a fost ușor diferit: la începutul semnalului,
răspunsul la ATP a fost similar, dar apoi semnalul de Ca a fost extins și a durat mai mult. Acest
lucru este clar vizibil dacă comparați săgețile din figurile 3A și 3B, care indică punctele de timp
de terminare a semnalului. Această prelungire a semnalului de Ca este un aflux de Ca2+datorită
activității de Ca2+canale ionice. Întregul semnal este semnalul de Ca nativ al fibroblastelor, care
se numește SOCE.

Unele celule răspund la ATP într-un mod mai puțin stabil și prezintă fluctuații frecvente ale
semnalului Ca (Figura 3C). Aceste tipuri de semnale se numesc oscilații Ca și pot fi găsite în multe
tipuri de celule. Ele sunt adesea observate în prezența Ca extracelular2+. Cu toate acestea, oscilațiile
pot fi cauzate de ambele, eliberarea fluctuantă de Ca din ER sau activitatea oscilantă a canalului ionic.
Fără experimente suplimentare nu putem determina care dintre ele provoacă oscilațiile observate.