Programul Cercetare de Excelenta - CEEX Modul: Sntate Tip proiect: P-CD Contractor: UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

Nr. nregistrare _______/________________ Pagina: Contract nr. 77/2006

APROBAT, DIRECTOR PROGRAM Prof. Univ. Leon Zagrean AVIZAT, RESPONSABIL DE PROIECT

RAPORT DE CERCETARE DEZVOLTARE

Denumirea proiectului: Studii la nivel celular i molecular privind activitile biologice ale curcuminei n vederea evalurii potenialului terapeutic Perioada raportat (Nr. faz/perioada de derulare) Faza I/ 1.09.2006- 10.12.2006

Autori/Coautori RECTOR, Prof. Dr. Ioan Pnzaru DIRECTOR DE PROIECT, Lector Dr. Anioara Cmpean COLECTIV DE LUCRU, (Nume i prenume) Lector Dr. Anioara Cmpean i colectivul CONTABIL EF DELEGAT, Ec. Florentina Paraschiv (Nume i prenume, semntur) Dr. Braoveanu Lorelei CS I i colectivul Dr. Liliana Puiu CS II i colectivul Conf Dr. Ion Romulus Scorei i colectivul

Programul Cercetare de Excelenta - CEEX Modul: Sanatate Tip proiect: P-CD Contractor:UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

Nr. nregistrare _______/________________ Pagina: Contract nr. 77/2006

I. Denumirea Proiectului: Studii la nivel celular i molecular privind activitile biologice ale curcuminei n vederea evalurii potenialului terapeutic Categoria de proiect Modul I Sanatate; Proiect P-CD/ Nr. faz: I Denumirea fazei: Studii in vitro pe linii celulare tumorale mamare privind influena curcuminei asupra reglrii expresiei MMP de ctre factori transcripionali Obiectiv planificat: Un studiu complex la nivel celular i molecular pe linii celulare tumorale din carcinomul mamar (MDA-MB-231 i MDA-MB-435) privind activitile biologice ale curcuminei (CM) n vederea evalurii potenialul.ui su terapeutic.

II. Descrierea activitii (desfurate n cadrul fazei cu utilizare de cuvinte cheie i DESCRIPTORI):
Pentru realizarea obiectivelor propuse s-au utilizat tehnici de biologie celular i molecular i tehnici de biochimie: - culturi de celule; - teste de citotoxicitate (MTT i LDH); - metode de chemotaxie (MigrationIInvasion assay); - western-blot; - zimografie; - tehnici de amplificare genic (RT-PCR); - tehnici de transfecie cu vectori de supraexpresie pentru proteinele cJun, cFos; - silencing transfecii cu molecule ARN de interferen anti-cJun. - EMSA (electrophoretic mobility assay) metod de evideniere a activitii funcionale a factorilor de transcripie Rezultate obinute (se nominalizeaz rezultatele cuantificabile/indicatori tehnici, economici, sociali, etc.- efecte economice
nregistrate la unitatea de CD):

Studiile ntreprinse pe celule tumorale mamare au evideniat c: activitile factorilor transcripionali AP-1, NFkB i CRE cresc odat cu scderea densitii celulare ceea ce conduce la activiti proteolitice MMP crescute; supraexprimarea i inhibarea proteinelor complexului AP-1 au efecte complementare astfel nct supraexprimarea factorului AP-1 induce expresia MMP i inhib pe cea a inhibitorilor TIMP iar silencing pentru proteina c-Jun reduce expresia MMP i induce pe cea a inhibitorilor TIMP; transfecia cu vectorul de expresie c-fos a determinat o inducie semnificativ a invazivitii celulelor MDA-MB-231 i MDA-MB-435 dar cu o mai mic amploare comparativ cu efectele induse de c-jun. Curcumina exercit efecte citotoxice ce se manifest mai pregnant asupra culturilor subconfluente. Totodat ea determin inhibarea expresiei i activitii MMP precum i a potenialului invaziv al celulelor tumorale mamare. Efectele citotoxice i anti-invazive demonstrate ale curcuminei constituie baza studiilor urmtoare din cadrul acestui proiect n vederea evalurii potenialului su terapeutic n procesele tumorale. Stadiul realizrii obiectivului planificat/forma de finalizare (a activitii n cadrul fazei): Obiectivele etapei de cercetare au fost ndeplinite n totalitate fr abateri de la activitile planificate.

III. Elemente de noutate

Brevet Lucrare tiinific

Comunicare tiinific

(se descriu elementele de noutate, nominalizndu-se dup caz, titlul de brevet, lucrare sau comunicare tiinific)

Cercetarea realizat reprezint un element de noutate n ceea ce privete reglarea expresiei MMP de ctre curcumin n celulele tumorale MDA-MB-231 i MDA-MB-435. Studiile au fost comunicate la 2nd International Congress of The Romanian Society for Cell Biology, Iai 2006.

IV. Metode de valorificare si eficienta economica a aplicarii rezultatelor

(se descrie domeniul, beneficiarul i/sau activitatea specific vizat, efectele economice obinute de agentul economic beneficiar al rezultatelor)

Cercetrile ntreprinse au o importan deosebit n terapia anti-tumoral. Curcumina poate reprezenta o surs de principii naturale ce ar putea fi valorificate n industria farmaceutic. Beneficiarul direct al rezultatelor obinute este populaia afectat de cancer mamar.

V. Perspective
(se pun n eviden posibilitile de extindere a aplicrii rezultatelor la mai muli beneficiari i/sau n alte domenii)

Proprietile biologice ale curcuminei pot fi testate i pe alte sisteme celulare tumorale, aplicaiile sale terapeutice putnd fi extinse.

VI. nregistrri
(se nominalizeaz documentele care se anexeaz pentru susinerea RCD:, documentaii msurare/testare/analiz, planuri de afaceri, diagnoze, evaluri, prognoze etc.) Nu este cazul. de execuie, buletine de

I. Date din literatur privind aciunea curcuminei n diferite stri patologice

n ultimii ani au fost descrii mai muli compui biologici naturali i sintetici cu aciune inhibitoare asupra metaloproteinazelor matriceale cu scopul de a stopa aciunea pro-metastazic a acestor enzime i de a creea posibile tratamente cu importan clinic n terapia anticanceroas. Un astfel de compus intens studiat n diverse modele celulare de cancer uman este curcuminei. Modularea expresiei MMP i a potenialului invaziv al celulelor tumorale de ctre curcumin (diferuloiImetan), principiul activ al ofranului, pare a fi o posibilitate important de investigare a mecanismelor supresoare asupra creterii celulelor tumorale. Curcumina este un compus biologic activ, polifenolic obinut din rizomul unei plante medicinale, Curcuma longa. Curcumina este pigmentul galben extras din ofran, care este larg folosit ca aditiv n alimentaie (n condimente, mutar, budinci, gelatine, ngheate, supe, margarin, buturi alcoolice i ne-alcoolice, etc). Constituenii si activi sunt uleiuri volatile de culoare galben-portocalie, numite curcuminoide. Curcumina [diferuloilmetan; 1,7-bis-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadien-3,5-dion] exercit proprieti anti-inflamatorii, anti-oxidante i anti-carcinogenice. Aceast plant indian conine 77% curcumin, 17% demetoxicurcumin i 3% bis-demetoxicurcumin. Expunerea populaiei la curcumin i utilizrile sale multiple au avut ca rezultat ntreprinderea de numeroase studii la nivel mondial privind activitile sale biologice. Astfel, cercetri intense din ultimii 50 de ani au demonstrat c acest compus acioneaz ca scavenger de radicali liberi i anti-oxidant [Ruby i colab., 1995] inhibnd peroxidarea lipidelor i alterarea oxidativ a ADN. Inhibarea lipoxigenazei i cicloxigenazei ce determin eliberarea sczut de acid arahidonic mpreun cu capacitatea de a inhiba activarea NF-kB [Singh i Aggarwal, 1995] pot contribui la activitatea anti-inflamatorie a acestui compus i a unor derivai ai si (curcuminoide). O alt proprietate manifestat de ctre curcumin este aceea de a inhiba funcia c-jun/AP-1 [Huang i colab., 1991] i activarea JNK. Inhibarea activrii JNK a fost asociat cu inducerea mediat de chimioterapie a apoptozei n celulele tumorale. Curcuminoidele s-au dovedit a fi inhibitori ai citocromului P450 [Oetari i colab., 1996] i manifest capacitatea de a induce glutation-S-transferaza i n consecin li s-a atribuit un rol de chemoprevenie. Deoarece curcumina inhib formarea tumorilor n esuturi murine i antagonizeaz att iniierea ct i promovarea tumorilor pe modele de cancer epitelial i de colon, interesul privind implicarea acestui compus n chemoprevenie a devenit din ce n ce mai mare. De

asemenea, au fost demonstrate proprietile anti-angiogenice n cteva laboratoare i pe modele in vivo. Activitatea de chemoprevenie a curcuminei pe modele animale a condus pe o serie de cercettori la studierea impactului su asupra creterii celulelor tumorale i apoptozei. Astfel, a fost raportat efectul anti-proliferativ al curcuminei pe celule n cultur n cancerul de colon [Hanif i colab., 1997] i cancerul de sn [Ramachandran i You, 1999]. Acesta s-ar putea datora n parte morii celulare programate deoarece la concentraii mari curcumina poate induce apoptoza, ca de exemplu n celulele leucemice umane. Dimpotriv, n alte sisteme curcumina poate inhiba apoptoza, ca de exemplu n cazul limfocitelor T i protejeaz plmnii de vtmarea indus de bleomicin i miocardul de obolan de adriamicin. Totui, impactul su asupra aplicaiilor terapeutice ale medicamentelor anti-neoplazice nu a fost studiat n detaliu. Deoarece speciile reactive de oxigen par a ndeplini roluri importante n apoptoza indus de medicamente se poate presupune c curcumina, n calitate de anti-oxidant sau scavenger de ROS ar putea inhiba capacitatea medicamentelor chemoterapeutice de a induce apoptoza. Farmacologic, curcumina a fost gasit fr risc pentru organism. Tratamente clinice pe om arat lipsa toxicitii independent de doz, cnd s-a administrat la doze pn la 10g\zi. Toate aceste studii au sugerat c curcumina are potenial enorm n prevenia i terapia cancerului. Peste 50 de ani de investigaii indic faptul c curcumina reduce colesterolul sanguin, previne oxidarea LDL, inhib agregarea plachetelor sangvine, previne tromboza i infarctul miocardic, supreseaza simptome asociate cu diabetul tip II, artrita reumatoid, scleroza multipl i Alzheimer [Lim i colab., 2001], inhib replicarea HIV [Jordan i colab., 1996], stimuleaz vindecarea rnilor, protejeaz ficatul mpotriva leziunilor, crete secreia biliar, protectie fa de modificrile patologice care conduc la cataract, protecie mpotriva toxicitii pulmonare i a fibrozei [Venkatesan, 1995], antiaterosclerotic. n plus, exist o bogat literatur care sugereaz c acest produs natural are un potenial n prevenirea i tratarea cancerului. II.1. Linii celulare i tratamente

Studiile au fost realizate pe linii celulare de carcinom uman mamar (obinute prin donaie din partea Dr. Bachmeier, Ludwig Maximilian Universitat Munchen, Germania). Sunt linii celulare izolate prin efuzii pleurale ale unor pacieni cu carcinom mamar. Celulele MDA-MB-231 au fost descrise ca fiind negative pentru receptorii de estrogen. Celulele au o morfologie epitelial-like, rotunde, crescnd n monostrat. Sunt invadatoare i moderat metastazice, in vivo. Celulele MDA-MB-435 au o morfologie epitelial-like, rotunde cu scurte prelungiri, crescnd n monostrat cu pierderea inhibiiei de contact. Celulele MDA-MB -435 sunt cele mai agresive, invadatoare i metastatice dintre toate liniile de carcinom mamar, in vivo. Condiii de cultivare: Cultura se menine n mediu de cretere MEM suplimentat (ser fetal bovin 5%, vitamine, aminoacizi neeseniali, piruvat de sodiu, antibiotice) la 37oC n atmosfer de CO2 5%, umiditate 95% i n flascuri de cultur Falcon. II. 2. Tratamentul celulelor cu curcumin Pentru toate experimentele curcumina a fost utilizat ntr-o unic concentraie, 25M, soluia stoc de 2,5mM a fost diluat n mediul de cultur. Tratamentul a durat diferite perioade de timp, de la o or pn la 48 de ore, dup care s-a stopat efectul prelevnd mediul de cultur, celulele au fost recuperate i supuse mai multor teste ce au avut ca scop studiul efectului acestei substane ce afecteaz metabolismul normal al celulelor de carcinom mamar n cultur. Pentru fiecare experiment a fost ales un eantion de celule ce au fost prelucrate in aceleai condiii ca mai sus cu o singur excepie, in mediul lor de cultur nu a fost aplicat tratament, acest eantion este considerat control i este util n interpretarea rezultatelor folosindu-se ca etalon. II.3. Testul de viabilitate celular (MTT) Principiul metodei: Tratarea celulelor cu [bromur de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazoliu] MTT permite evaluarea metabolismului oxidativ i a rspunsului unei populaii celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra vieii celulelor n cultur. Din acest motiv testul MTT este folosit ca test pentru studii de viabilitate, citotoxicitate i proliferare celular.

Celulele au fost nsmnate n plac ELISA de 96 godeuri ntr/un volum de 0,2 ml i incubate pentru 24 ore la 37oC au fost tratate cu 25M curcumin mai multe perioade de timp (0, 2, 4, 24 ore);

Mediul de cultur a fost ndeprtat, iar celulele au fost splate de dou ori cu PBS i tratate cu soluie MTT 1mg/ml. Dup incubare la 37oC cristalele de formazan sunt solubilizate n izopropanol iar soluia obinut este densitometrat la 570nm.

II.4. Testul de citotoxicitate (LDH) Citotoxicitatea, de regul, se studiaz prin testul activitii LDH (lactat dehidrogenaza), evaluat spectrofotometric prin urmrirea oxidrii NADH n prezena piruvatului. Reacia este monitorizat prin scderea absorbanei la 340 nm. Scderea viabilitii celulare este urmrit prin creterea activitii enzimatice n mediul de cultur. n aceast tehnic s-a studiat activitatea LDH. II.5. Metoda de chemotaxie (Migration\Invasion Assay) Principiul metodei: Scopul metodei de chemotaxie este de a determina dac anumite molecule de interes biologic au activitate chemotactic pentru un anumit tip celular. Chemotaxia este proprietatea unei proteine de a direciona migrarea unor celule specifice. Aceast metod se bazeaz pe premiza crerii unui gradient a agentului chemotactic permind celulelor s migreze printr-o membran ctre agentul chemotactic. Suspensia celular se pune peste un filtru (membran) cptuit cu colagen tip IV (n cazul migrrii) sau cu o soluie de matrigel (n cazul invaziei), sub acest filtru existnd o soluie ce conine chemoatractant, totul ntr-o camer Boyden-Chamber. Dac celulele au capacitate migratoare respectiv invaziv vor trece prin acest filtru, iar cele care au trecut sunt colorate i numrate, bineneles raportate la control (fr chemoatractant-control negativ; fr tratament cu curcumin- control pozitiv).

Se prepar o suspensie celular n mediu i se aplic ntr-o camer Boyden Chamber peste filtrul cptuit cu membran artificial i sub care a fost adugat n prealabil soluia de chemoatractant. Dup incubare la 37oC diferite

perioade de timp se cuantific numrul de celule de pe faa intern a membranei colorate n prealabil cu albastru de toluidin. II.6. Zimografie Principiul metodei: Aceast metod permite evidenierea activitii unor enzime proteolitice separate electroforetic n geluri de poliacrilamid (PAA) ce conin substratul lor. Gelurile de poliacrilamid vor evidenia plaje de liz situate corespunztor masei moleculare a enzimelor testate n prezena unor markeri de mas molecular. Mediul de cultur condiionat recoltat de pe celule tumorale i lizatul celular au fost aplicate pe geluri ce conin gelatin sau cazein i supuse migrrii electroforetice n prezen de markeri de MM

Dup electroforez, gelurile sunt splate pentru ndeprtarea SDS n soluie Triton x 100 ceea ce permite enzimei s se renatureze. Gelurile se incubeaz la 37C peste noapte n tampon de activare ceea ce permite degradarea substratului. Colorarea gelurilor se realizeaz cu o soluie de Comassie Brilliant Blue i este urmat de o etap de decolorare avnd ca rezultat clarificarea benzilor de liz.

II.7. Western blotting Principiul metodei: Metoda este utilizat pentru identificarea i determinarea mrimii unor antigene (proteine) care reacioneaz cu un anticorp specific. Proteinele, la nceput, sunt separate electroforetic n geluri de SDS-PAGE i apoi transferate electroforetic de pe gel pe un substrat solid, ca nitroceluloza, difluorid polivinidil (PVDF) sau membran cationic de nylon. Apoi situsurile de legare nespecifice nereacionate de pe membran sunt blocate pentru a supresa adsorbia nespecific a anticorpilor, proteinele imobilizate reacionnd specific cu anticorpi monoclonali sau policlonali. Complexele antigen-anticorp sunt localizate radiografic, cromogenic sau prin reacii chemiluminiscente. Probele (mediu de cultur condiionat sau lizat celular) migrate electroforetic sunt supuse transferului pe membrana de nitroceluloz. Situsurile libere ale membranei sunt blocate pentru a suprima adsorbia ulterioar a anticorpului primar, cu o soluie de lapte degresat n tampon TTBS. Anticorpul 8

primar diluat se incubeaz cu membrana cel puin 2 ore. Membrana este splat cu tampon TTBS. Anticorpul secundar, cuplat cu fosfataza alcalin, diluat se incubeaz cu membrana. Pentru detecia cromogenic cu fosfataza alcalin, se prepar o soluie de developare care conine substratul fosfatazei alcaline NBT i BCIP. Membrana se spal, usuc i pstreaz ntr-un mediu ferit de lumin II.8. EMSA (electrophoretic mobility assay) Principiul metodei: EMSA (electrophoretic mobility assay) este metoda de studiu a interaciilor ADN-proteine. Se bazeaz pe mobilitatea diferit a complexelor ADNprotein, n timpul migrrii electroforetice, fa de proteinele care nu leag ADN. Aceast diferen poate fi vizualizat pe geluri de poliacrilamid folosind ADN marcat radioactiv n formarea complexelor ADN-proteine. EMSA este o metod electroforetic de punere n eviden a activitii funcionale a unor proteine nucleare (factori transcripionali) prin formarea unor complexe proteine int-secvene ADN marcate radioactiv, complexe care vor fi analizate radiografic dup migrarea electroforetic. Secvena ADN marcat radioactiv, specific pentru un anumit factor transcripional este incubat cu extractul nuclear din celulele de interes, unde se presupune existena proteinei urmrite, complexul format este migrat electroforetic n prezena unui control negativ (secvena ADN marcat radioactiv, pus pe gel ca atare necomplexat cu proteina nuclear int). Complexul rezultat este vizualizat dup expunerea gelului la un film radiografic urmat de developarea acestuia, intensitatea benzii obinute fiind dependent de gradul de radioactivitate utilizat. Se realizeaz electroforeza probelor (extract nuclear proteic din celule tumorale i oligonucleotide marcate radioactiv cu secven specific pentru proteinele de interes) n geluri de PAA 5%.

Dup migrare, gelul este transferat pe o hrtie de filtru i uscat ntr-un incubator la 75-80oC, se acoper cu o folie transparent de celofan i este expus unui film radiografic ntr-o camer ntunecoas n cutie special, pentru perioade de timp diferite n funcie de intensitatea semnalului radioactiv.

II.9. Reacia de amplificare PCR ADNc obinut prin revers transcriere a fost amplificat prin reacii PCR, folosind Taq ADN polimeraza. Prin definiie, reacia PCR este o reacie n lan. Produsul unui ciclu de amplificare servete ca substrat pentru urmtorul ciclu. Ca urmare, cantitatea de produs de reacie (amplimer) crete exponenial i nu linear, ca n majoritatea proceselor enzimatice. Cinetica reaciei PCR poate fi urmrit n timp real (Real-Time PCR) prin introducerea n amestecul de reacie a unor compui fluoresceni. SybrGreen I este un colorant fluorescent, specific pentru molecule dublu catenare. n timpul fiecrei faze a sintezei ADN, colorantul SybrGreen I se intercaleaz n fosa minor a moleculelor de ADN dublu catenare, iar amplimerul este detectat prin fluorescena sa. Reaciile RT-PCR cantitative, n segmentul exponenial de amplificare, au fost realizate folosind Light Cycler FastStart Master SybrGreen I kit -Roche, respectnd condiiile de lucru cerute de furnizor. Specificitatea reaciei este dat de analiza curbei de topire determinat automat la sfritul reaciei PCR. II.10. Tehnica de atenuare Silencing a proteinei c-Jun Principiul metodei: Procesul de silencing se bazeaz pe introducerea n celule (prin transfecie sau microinjecie) a unor molecule mici de interferen dublu catenare de ARN (small interfering RNA). Moleculele de ARNsi sunt tipic fcute din 2 matrie sintetice complementare coninnd 19 baze ARN urmate de 2 baze ADN (de preferin timina T). ARNsi, n celul, se leag complementar la ARN mesager i intervine n dereglarea proceselor celulare, permite analiza funciilor genice a celulelor mamaliene. Moleculele de ARNsi pentru c-jun, introduse n celule prin permeabilizarea acestora cu lipofectamin, interfer cu translaia ARN mesager pentru proteina c-Jun, crend o regiune loop n structura acestuia sau ducnd chiar la degradarea moleculei de ARNm. Celulele au fost nsmnate la o confluen de 40%; Mediul de cultur este schimbat i se adaug urmtorul amestec ce conine mediu de cultur simplu, lipofectamin, ARNsi, iar pentru control acelai amestec coninnd n loc de ARNsi, o secven ARN non-si conjugat cu fluorescein.

10

Se extrage ARN total, se obine ADN complementar prin revers transcriere iar acesta din urm este supus experimentelor de RT-PCR. Mediul de cultur este supus experimentelor de western blot i zimografie.

II.11. Supraexprimarea proteinelor c-Jun/c-Fos Principiul metodei: Transfecia este un proces, n general, de introducere a unei molecule de ADN strin n celule, monitoriznd apoi expresia proteic. Transfecia ADN este esenial pentru studiul funciei i reglrii genice. Acest proces presupune utilizarea unor vectori de expresie pentru proteinele int (c-Jun, c-Fos), care introdui n celula gazd vor permite inserarea secvenelor ADN specifice n structura ADN gazd i s exprime proteinele de interes. Au fost creai vectori plasmidiali ce conin gene de cjun i cfos pentru supraexprimarea proteinelor corespunztoare: S-a realizat un amestec din 3l FuGene, 50 l mediu de cultur fr suplimente i 2g ADN total al vectorilor de expresie c-jun/c-fos, care a fost preincubat 30 minute naintea aplicrii pe celule; n paralel a fost realizat i un amestec similar (control) dar cu vectori de transfecie care nu conduc la expresia proteinelor studiate Se extrage ARN total, se obine ADN complementar prin revers transcriere iar acesta din urm este supus experimentelor de RT-PCR. Mediul de cultur este supus experimentelor de western blot i zimografie.

III. REZULTATE I DISCUII Experimentele au fost efectuate pe linii celulare de carcinom mamar, cu grade diferite de malignitate MDA-MB-231<MDA-MB-435.

11

Figura 2. Aspectul citomorfologic al liniilor celulare de carcinom mamar n cultur. Celule MDA-MB231 la densitate celular mic, 24ore dup nsmnare (A); Celule MDA-MB-231 la confluen, 48 ore dup nsmnare (B); Celule MDA-MB-435 la densitate celular mic, 6 ore dup nsmnare (C); Celule MDA-MB-435 la confluen, 24 ore dupa nsmnare (D).

Culturile celulare au fost meninute la diferite stadii de confluen (Fig. 2), stadiul de densitate celular avnd un efect major asupra observaiilor experimentale ulterioare (stadiul subconfluent = 50-55% confluenta; confluent = 75-95%). n funcie de densitatea celular, liniile celulare studiate au prezentat o citomorfologie diferit. Pe masur ce potenialul invaziv al celulelor crete, celulele ii pierd parial caracteristicile celulelor epiteliale. Astfel, celulele MDA-MB-231 i MDA-MB-435 devin fuziforme, ii pierd inhibiia de contact formnd la densiti celulare mari formaiuni tumorale. Aceste celule au rat mare de proliferare. Tratamentele cu curcumin asupra liniilor celulare tumorale mamare umane determin efecte difereniate n funcie de stadiul de densitate celular. Imaginile microscopice urmtoare arat modificrile morfologice ale celulelor n cultur, care sunt

12

mult mai evidente n culturile rare i n funcie de prelungirea timpului de aciune al curcuminei, acestea devin progresiv observabile i n culturile confluente (Fig. 3 i 4). Subconfluent Confluent

Figura 3. Micrografie n contrast de faz: linia celular MDA-MB-231 n cultura subconfluent (partea stang) i confluent (partea dreapt) dup tratament cu 25M curcumin la 6 i 24 de ore. Sunt evideniate modificrile morfologice induse de tratamentul cu curcumin dar i fenomenul de inhibare a proliferrii celulare.

13

Subconfluent

Confluent

Figura 4. Micrografie n contrast de faz: linia celulara MDA-MB-435 n cultura subconfluent (partea stang) i confluent (partea dreapt dup tratament cu 25M curcumin la 6 i 24 de ore. Nu sunt observate modificri morfologice induse de tratamentul cu curcumin. Proliferarea celular scade foarte puin, vizibil dup 24 de ore.

Celulele MDA-MB-231 n stadiul de densitate mic ncep s-i modifice caracteristicile morfologice la scurt timp dup tratamentul cu curcumin. Dup ase ore

14

de tratament proliferarea celular scade, ncep s apar celule n suspensie, celulele sunt mai mici i subiri cu membrana celular neregulat. Dup 24 de ore, celulele sunt rotunde, majoritatea aflandu-se n apoptoz. La densitate mare, celulele i schimb morfologia abia dup 24 de ore de tratament, celulele au acelai profil morfologic ca cel indus de curcumin asupra celulelor subconfluente, dup 6 ore de tratament. Celulele MDA-MB-435 sufer modificri morfologice foarte slabe, vizibile doar dup 24 de ore de tratament, mai pronunate n culturile cu densitate mic. Proliferarea celular ncepe s scad, iar celulele au tendin mai mic de a forma formaiuni tumorale. Influena densitii celulare asupra factorilor de transcripie AP-1, NFkB i activitii MMP Se tie c celulele carcinomului mamar, n general invadeaz esuturile nvecinate, n clustere mici celulare desprinse din masa tumoral principal iar densitatea celular joac un rol important n mecanismele celulare. Fenotipul invaziv al celulei tumorale ar putea depinde i de micromediul tumorii i este de ateptat ca celulele situate la distan de tumora primar s aib o capacitate invaziv mai mare fa de celulele din masa tumoral principal. Diferenele n potenialul metastazic pot fi asociate printre ali factori cu interaciile celul-celul. n consecin, una din activitile ntreprinse este optimizarea densitii celulare n vederea evalurii ct mai corecte a studiilor ulterioare. Publicaii pe sisteme model de linii celulare de carcinom mamar arat c exist o asociere ntre producia de MMP i comportamentul biologic al celulelor. Aceleai surse susin c o cretere semnificativ n cantitatea de MMP sintetizate este corelat cu creterea invazivitii i a creterii metastazice [Bachmeier si colab., 2001]. Mai multi autori au descris c enzimele proteolitice sunt produse exclusiv de celule stromale peritumorale mai degrab dect de celule tumorale. Ei susin c celulele tumorale elibereaz citokine i factori de cretere care determin celulele stromale s sintetizeze i s elibereze enzime degradative. ntr-o analiz extensiv recent a carcinoamelor mamare, studii de biologie molecular (hibridizare in situ) au artat c MMP-2, MMP-9 i MMP-3 sunt sintetizate att de celule stromale ct i de celule tumorale; oricum acestea

15

nu arat cu certitudine ce tip celular contribuie la proteoliza matricei sau cu ce intensitate. i pentru alte tipuri tumorale (carcinom celular scuamos) au fost obinute aceleai observaii [Nerlich si colab., 1998]. Aceste analize arat c producia de MMP n celule tumorale contribuie semnificativ la activitatea proteolitic. Studiile de zimografie, pe cele trei linii celulare de carcinom mamar au artat c activitile proteolitice ale gelatinazelor (MMP-2, MMP-9) s-au redus cu creterea densitii celulare pentru linia celular MDA-MB-231, MDA-MB-435 (Fig.5) i c activitile proteolitice au fost considerabil mai mari n grupurile celulare tumorale mai puin dense comparativ cu celulele confluente. Acestea ne-au condus la ipoteza c densitatea celular ar putea influena reglarea transcripional a MMP i prin testarea activitilor funcionale ale factorilor transcripionali AP-1, NFkB i CRE am artat dac factorii transcripionali implicai n reglarea MMP sunt influenai de gradul de densitate celular. 1 2 3

B
Figura 5. Efectele densitii celulare asupra activitii proteolitice a gelatinazelor, prin zimografie. Zimogramele indic reducerea activitii enzimatice cu creterea densitii celulare, n cultura subconfluent (linia 1) comparativ cu cultura confluent (linia 3), din mediu de cultur condiionat al celulelor MDA-MB-231 (A), MDA-MB-435 (B). Co-migrarea gelatinazelor n prezena markerilor de mas molecular (linia 2) ne-a permis determinarea MM ale gelatinazelor exprimate (sgei).

Asocierea dintre densitatea celular i expresia celular a celor mai importante MMP n carcinogenez a fost descris pn acum foarte puin. Investigaii in vivo pe probe de esut tumoral, prin evaluare morfologic cantitativ i semicantitativ, au artat c grupuri celulare tumorale crescute n formaiuni mai puin dense au nivele mai mari de MMP. Xie i colab. [1994] au artat c celulele de carcinom epidermal uman secret MMP-9 ca rspuns la citokine i factori de cretere numai cnd sunt crescute la confluen. Menashi i colab. [1998] au investigat asocierea MMP-2 cu suprafaa celulelor

16

de carcinom mamar uman i au demonstrat c situsurile de legare ale MMP-2 sunt exprimate n celule nsmnate la densitate mic i dispar progresiv pe msur ce celulele ating stadiul de confluen i c acest proces este independent de nivelul de expresie al MT1-MMP, TIMP-2 sau v integrin. Analizele lor zimografice au artat c activitile gelatinolitice mari ale MMP-2 sunt asociate cu culturile celulare de densiti mici i c activitile enzimatice sunt reduse gradat pe msura creterii densitii celulare, aceste activiti enzimatice fiind foarte slabe sau chiar nedetectabile la confluen, ns mecanismele acestor observaii nu au fost investigate. Factorul NF-B (Nuclear Factor-KappaB) este o protein heterodimeric compus din combinaiile diferite ale membrilor familiei Rel de factori transcripionali. Aceast familie de factori transcripionali este n principal implicat n stresul indus, rspunsurile imune i antiinflamatorii. Mai mult, aceste molecule au roluri importante n timpul dezvoltrii ctorva celule hematopoietice, keratinocitelor i structurilor organelor limfoide. Mai recent, membrii familiei NF-B sunt implicai n progresia neoplazic i formarea sinapselor neuronale. Factorul NF-B este de asemenea un reglator important n soarta celulelor, ca apoptoza i controlul proliferrii i este critic n procesul de tumorigenez [Schwabe i Rhodes, 1991]. Inducia transcripional ca rspuns la PMA, citokine i factori de cretere este stimulat prin activitatea situsului AP-1 dar nu depinde n ntregime de el, aceast inducie rezult din cooperarea dintre seriile de elemente cis-acting localizate n promotorii MMP. Expresia genic pentru MMP nu depinde numai de situsul AP-1. Astfel, promotorul pentru MMP-9 este reglat de o secven de 670 pb ce conine o serie de elemente cis activatoare, care includ situsuri AP-1, PEA3, Sp1 i NFkB. Analizele dup deleii sau mutaii au artat c situsul AP-1 localizat la -70pb nu este suficient pentru stimularea de ctre PMA. Inducerea necesit cooperarea fie cu proteinele de legare NFkB (-600 pb) fie cu Sp1 (-588 pb) situate upstream de situsul AP-1 (-79 pb). Expresia MMP este diferit n funcie de tipul celular dar i de strile de transformare ale celulei. Linii celulare embrionare de oarece transformate metastazic exprim nivele mari de MMP-3 i MMP-10 n timp ce linii celulare non-metastazice exprim nivele mici sau nedetectabile ale acestor enzime. Mai mult, reglarea pozitiv i negativ a genei MMP-1 de ctre TGF, n fibroblaste i keratinocite a fost atrbuit

17

expresilor difereniate ale membrilor familiei Fos i Jun. Inhibiia MMP-1 n fibroblaste este mediat prin JunB, n timp ce activarea acestei gene, n keratinocite de ctre TGF, este determinat de nivele mari de c-Jun. Probabil raportul dintre cantitatea c-Jun i Jun B conteaza pentru reglarea genei MMP-1 de ctre TGF. ntr-adevr, supraexprimarea proteinei c-Jun duce la cresterea expresiei MMP-1 n ambele tipuri celulare. Proteinele Jun au abilitatea de a forma dimeri (Jun-Jun) stabili i capabili de a recunoate i lega secvenele consensus AP-1 de la nivelul moleculelor de ADN mediind expresia genic. Proteinele Fos, pe de alt parte, nu pot forma homodimeri stabili. n schimb, ele mediaz expresia genic prin formarea heterodimerilor cu variate proteine Jun. Acetia sunt mult mai stabili dect dimerii Jun-Jun i posed o activitate mai mare de legare la ADN. Astfel, compoziia subunitilor influeneaz i moduleaz afinitatea de legare a proteinelor AP-1. De exemplu, n timp ce heterodimerizarea proteinelor c-Jun i c-Fos este mai stabil i transcripional activ, formarea heterodimerului c-Jun-Jun B descrete activitatea de legare la ADN [Ryseck i Bravo, 1991]. Am investigat legarea oligonucleotidelor specifice factorilor transcripionali AP-1 i NFkB, prin metoda EMSA (electrophoretic mobility assay) de proteinele din extractele nucleare pentru a evalua dac efectul generat de densitatea celular se coreleaz cu creterea legrii acestor factori transcripionali la secvena ADN consensus n regiunile promotor ale diferitelor MMP. 10 g extract proteic nuclear preparat din celulele subconfluente i confluente, au fost incubate cu
32

P i cu oligonucleotide dublu catenare specifice factorilor

transcripionali AP-1, NFkB iar complexele ADN-proteine rezultate au fost supuse electroforezei n gel de poliacrilamid. Benzile radioactive de pe gelurile uscate au fost vizualizate n sistem de detecie radiografic. n extractele nucleare din celulele subconfluente ale tuturor liniilor celulare testate, a fost observat o cretere a legrii proteinelor nucleare la fragmentele de ADN marcate radioactiv (Fig. 6) pentru factorii transcripionali AP-1(A) i NFkB (B), comparativ cu extractele nucleare din celulele confluente.

MDA-MB-231 MDA-MB-435 S C S C

MDA-MB-231 MDA-MB-435 S C S C

18

A-AP-1

B-NFkB

Figura 6. Legarea crescut a proteinelor nucleare din culturi celulare subconfluente la secvenele AP-1, NFkB la diferii promotori ai MMP. Experimentele EMSA realizate pentru culturi subconfluente (S) i confluente (C) de celule MDA-MB-231 i MDA-MB-435 folosind 10g protein nuclear incubat cu oligonucleotide marcate cu 32P, au artat un coninut mai mare al proteinei AP-1 (A), NFkB (B), n celule subconfluente (sgeata arat complexul ADN-protein). Experimentele au fost repetate de trei ori.

Aceste rezultate arat c nucleii celulelor canceroase mamare subconfluente conin nivele constitutive mai mari ale proteinelor active AP-1 i NFkB . Bachmeier i colab. [2005] au artat c fenomenul de reglare negativ a unui numr de MMP n diferite linii celulare de carcinom mamar de ctre densitatea celular este nsoit de o scdere a expresiei proteinelor c-Jun i c-Fos n celulele confluente. Acest fapt sugereaz c densitatea celular afecteaz n general factorii de transcripie la diferii promotori ai MMP, rezultat demonstrat prin experimentele EMSA . Rolul AP-1 n modularea expresiei MMP, TIMP i a potenialului invaziv al celulelor tumorale prin supraexprimare i silencing a componentelor c-Jun i c-Fos innd cont de rezultatele anterioare obinute privind influena densitii celulare asupra activitii factorilor transcripionali i asupra activitilor enzimatice ale metaloproteinazelor, am ncercat s art veridicitatea rezultatelor prin experimentele de supraexprimare i silencing ale factorului transcripional AP-1, investignd totodat reglarea posibil a expresiei MMP i a inhibitorilor TIMP dependent de stadiul de confluen. S-a pus problema dac procesul de supraexprimare a proteinelor c-Jun i cFos este capabil s induc expresiile acelor MMP care sunt exprimate n mod normal la valori sczute, n celule confluente.

19

Complementar cu acest experiment, am realizat procedee de atenuare (silencing) a expresiei proteinelelor c-Jun i c-Fos folosind tehnici de transfecie, cu scopul de a analiza dac acestea conduc la reducerea expresiei acelor MMP ce sunt exprimate la nivele mari n celule subconfluente. ntr-un mod similar am analizat i expresia inhibitorilor TIMP. De asemenea am investigat dac expresia MMP modificat, obinut dup procesul de supraexprimare a proteinelor complexului AP-1, prin transfecie cu construci plasmidiali sau dup inhibiia acelorai proteine int, c-Jun i c-Fos, prin procedeul de silencing folosind molecule ARNsi, conduce la un potenial invaziv diferit al celulelor tumorale. Supraexprimarea proteinelor c-Jun/c-Fos n cultura confluent de celule MDA-MB-231 Linia de celule MDA-MB-231 a fost transfectat cu plasmide ce contineau vectori de transfecie pentru genele c-jun/c-fos. Dup transfecie, celulele ncep s supraexprime proteinele factorului transcripional AP-1. Expresiile proteinelor c-Jun i c-Fos au fost cuantificate prin metoda RT-PCR. n urma experimentelor de supraexpresie, ARNm pentru proteinele c-Jun i c-Fos a fost cuantificat rezultnd o cretere drastic a expresiilor celor dou proteine, de 1472 de ori pentru c-Jun i respectiv 398 de ori pentru c-Fos (Fig. 7). Supraexprimarea proteinelor complexului transcripional AP-1 a condus la supraexprimarea ARNm pentru MMP i a inhibrii ARNm specific inhibitorilor TIMP. Reglarea negativ a inhibitorului TIMP-1 a fost observat numai n celulele transfectate pentru proteina c-Jun, dup 21 ore i mai evident dup 40 ore (0,44ori) n timp ce expresia ARNm pentru inhibitorul TIMP-2 a fost redus n celulele tranfectate pentru proteina c-Fos dar nu i n cele pentru proteina c-Jun (Fig. 8). Dup transfecie, pentru proteina c-Jun, s-a observat revenirea la nivelul iniial a expresiei inhibitorului TIMP-2, dup 40 ore de la transfecie, cnd nivelele transgenice erau oricum mici (Fig. 8). Mai trziu, dup transfecie, celulele transfectate cu gena c-jun au aratat o expresie indus a inhibitorului TIMP-2 care a nsoit inducia puternic a MMP9

20

Fig. 7. Supraexprimarea proteinelor c-Jun i c-Fos ale factorului transcripional AP-1 n cultura confluent de celule MDA-MB-231. Cuantificarea ARNm la diferite perioade de timp (21 i 40 ore) dup transfecie cu vectori de supraexprimare a proteinelor c-Jun i c-Fos a artat expresia crescut a acestor proteine (de 1472 de ori i respectiv 398 de ori).

Figura 8. Efectul supraexprimrii proteinelor c-Jun i c-Fos ale factorului transcripional AP-1 n cultura confluent de celule MDA-MB-231, asupra expresiilor inhibitorilor TIMP-1 i TIMP-2. Expresia inhibitorului TIMP-1 este redus n celulele transfectate cu gena c-fos, la 21ore, cu o revenire la nivelul iniial dup 40 ore, celulele transfectate cu gena c-jun arat o inducie a expresiei TIMP-1 dup 40 ore. Expresia inhibitorului TIMP-2 arat nivele reduse n celulele transfectate pentru supraexprimarea proteinei c-Jun. Toate valorile sunt normalizate la nivele de expresie n raport cu celulele control transfectate (1=neschimbat; a se observa bara orizontal) i indic gradul de modificare fa de control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard SD; *=p<0.05, ***= p<0.001.

Aceste rezultate indic efecte difereniate ale partenerilor dimerului AP-1 a cror

activitate ar putea fi bazat pe interacii specifice cu parteneri de dimerizare exprimai endogen.

21

Experimentele RT-PCR pe celulele MDA-MB-231 au artat o corelaie clar ntre supraexprimarea proteinei c-Jun i expresia crescut a MMP-2 i MMP-9, i cu un mai mic efect pentru MMP-3. Supraexprimarea proteinei c-Fos a condus semnificativ la creterea expresiilor MMP-1, MMP-3 i MMP-13 (Fig. 9) dar nu i cea a MMP-9. Smith i colab. [1999] au artat c supraexprimarea proteinei c-Jun n celule mamare MCF7 determin schimbri biologice i biochimice ce mimeaz caracteristicile clinice observate n cancerul mamar. Ei susin c se produc alterri n compoziia complexului transcripional AP-1 prin reducerea expresiei proteinei junB i creterea expresiei proteinei fra-1, ce au ca rezultat creterea agresivitii biologice. Autorii arat c celulele MCF7 ce supraexprim proteina c-Jun nu mai raspund la efectele stimulatoare de cretere ale estrogenului sau la efectele inhibitoare ale proliferrii generate de tamoxifen.

22

B
Figura 9. Efectele supraexprimrii proteinelor c-Jun i c-Fos n cultura confluent de celule MDAMB-231, asupra nivelelor de ARNm pentru MMP A: Expresia MMP-2 i a MMP-9 a fost puternic indus dup transfecie. B: MMP-1, MMP-3, MMP-13 au fost induse n celulele c-fos transfectate dar numai expresia MMP-3 a fost indus prin supraexprimarea proteinei c-Jun. Toate valorile sunt normalizate la nivele de expresie n raport cu celulele control transfectate (1=neschimbat; a se observa bara orizontal) i indic gradul de modificare fa de control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard SD; *=p<0.05, ***= p<0.001.

Procesul de atenuare (silencing) pentru proteina c-Jun n cultura subconfluent de celule MDA-MB-231 Prin procedeul de silencing pentru proteina c-Jun mi-am propus s afectez expresia acelor MMP care sunt exprimate la nivele mari n cultura subconfluent. n celulele MDA-MB-231 subconfluente s-au introdus molecule ARN de interferen care s induca o inhibare a expresiei proteinei int. Cantitatea de ARN total, dupa transfecie, a fost revers transcris n ADN complementar i supus ulterior analizelor de RealTime PCR pentru studiul expresiilor proteinelor c-Jun, MMP-3, MMP-9, MMP-13 i a inhibitorilor TIMP-1 i TIMP-2. Astfel, transfecia celulelor tumorale cu oligonucleotide ARN dublu catenare, specifice pentru silencing c-Jun, a determinat reducerea expresiei ARNm pentru proteina c-Jun cu un vrf de activitate la 24 ore (Fig. 10). La acest interval de timp s-a nregistrat o scdere maxim a expresiei proteinei c-Jun de aproape 90%. Din acest motiv, am analizat expresia MMP la acest interval de timp.

23

Figura 10. Profilul expresiilor ARNm pentru proteina c-Jun dup transfecia (silencing) cu molecule ARNsi i ARN non-si n celule MDA-MB-231 subconfluente, la diferite perioade de timp. Cuantificarea ARNm la intervale de timp diferite (6, 24 si 48 ore) dup transfecie cu oligonucleotide ARNsi pentru silencing c-Jun comparativ cu controale non-silncing irelevante, a artat o scdere a expresiei proteinei c-Jun cu un efect maxim dup 24 ore, de aproape 90%.

Figura 11. Efectul silencing al proteinei c-Jun n culturi subconfluente de celule MDA-MB-231 asupra cunantificrii ARNm pentru MMP-3, -9 i -13. Expresiile proteinazelor MMP-3, MMP-9 i MMP-13 au fost reduse pn aproape de 100% dupa 24ore.Toate valorile sunt normalizate cu nivele de expresie pentru celulele control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de eroare indic deviaia standard SD; ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferronis post test)

24

Expresiile ARNm au artat o inhibiie semnificativ (p<0.001), 90% pentru MMP-3 i aproape 100% pentru MMP-9 i MMP-13, la 24 ore dup transfecie comparativ cu controalele irelevante non-silencing (Fig. 11).

Figura 12. Efectul silencing al proteinei c-Jun n culturi subconfluente de celule MDA-MB-231 asupra cuantificrii ARNm pentru inhibitorii tisulari ai MMP, TIMP-1 i -2. Nivelele inhibitorilor TIMP1 i TIMP-2 au fost induse de aproape 3 ori dup 24ore. Toate valorile sunt normalizate cu nivele de expresie pentru celulele control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de eroare indic deviaia standard SD; ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferronis post test)

Expresiile ARNm pentru inhibitorii TIMP-1 i TIMP-2 au crescut semnificativ (p<0.001) de 3 ori dup 24 ore (Fig. 12) de la tranfecia prin silencing a proteinei c-Jun. Aceste observaii complementare sunt n legtur cu rezultatele de la experimentele de supraexprimare unde expresia MMP a fost indus iar expresia inhibitorilor TIMP represat. Datele susin ipoteza de modulare a factorului transcripional AP-1 n vederea modificrii statusului de exprimare a MMP n cancerul mamar

Efectele procesului de silencing anti-cJun asupra sintezei MMP, TIMP i asupra activitii enzimatice Am realizat analize de western blot a unor cantiti egale de protein din mediu de cultur condiionat, de pe celulele ce au suferit c-Jun silencing, pentru a fi siguri c efectele observate dup procesul de silencing pentru proteina c-Jun asupra expresiilor ARNm pentru MMP i TIMP sunt de asemenea verosemile la nivel proteic.

25

Figura 13. Efectul silencing al proteinei c-Jun n culturi subconfluente de celule MDA-MB-231 asupra sintezei/ secreiei MMP. Analizele de Western Blot au artat reducerea cantitilor de MMP-1 (stanga), MMP-3 (mijloc), MMP-9 (dreapta) n mediul de cultur condiionat al celulelor MDA-MB-231, transfectate cu oligonucleotide ARNsi pentru c-Jun (liniile 2) comparativ cu controalele nonsilencing (liniile 1).

Astfel, prin tehnica amintit am artat c mediul de cultur de pe celulele MDAMB-231, transfectate cu ARNsi pentru proteina c-Jun, a coninut numai aproximativ 50% din cantitatea de MMP-1 secretat comparativ cu mediul de cultur al celulelor nonsilencing. Efectul silencing asupra sintezei MMP-3 a fost chiar de 90% i asupra MMP-9 de aproximativ 30% iar sinteza inhibitorului TIMP-1 a fost indus peste 50% (Fig.13). Activitile enzimatice ale MMP testate, MMP-2, MMP-9 i MMP1 din mediul de cultur al celulelor MDA-MB-231, au fost de asemenea verificate prin tehnica zimografic, dup procedeul de silencing pentru proteina c-Jun, analiz care permite detecia lor pe geluri continnd substrate de gelatin (pentru identificarea activitilor specifice MMP-2, -9) sau cazein (MMP-1). Proteinazele MMP au fost identificate pe baza comportamentului lor de migrare electroforetic n comparaie cu preparaiile MMP control (Fig. 14). Aa cum s-a observat i pentru sinteza proteic, activitatea enzimatic a MMP a fost inhibat datorit inhibiiei expresiei proteinei c-Jun.

Figura 14. Analiza zimografic a efectului de procedeu silencing c-Jun, n culturi subconfluente de celule MDA-MB-231, privind activitile funcionale ale gelatinazelor MMP. Zimograma pentru gelatinaze, MMP-2 i MMP-9 ca i cazeinograma pentru MMP-1 au artat o reducere a activitilor proteolitice prezente n mediul de cultur din MDA-MB-231 subconfluente dup silecing (liniile 2) comparativ cu controalele non-silencing (liniile 1). MMP au fost identificate n raport cu migrarea lor efectroforetic fa de markeri de mas molecular (M, nearatati pentru MMP-2, -9) i fa de un control MMP-1 (linia C).

26

Aceste date arat c procesul de silencing pentru proteina c-Jun conduce la descreterea sintezei i a secreiei enzimatice (Fig. 13 i 14, liniile 2) comparativ cu mediile de cultur (control) de pe celulele transfectate cu secvena non-silencing c-Jun (liniile 1). Cnd comparm expresia genic cu datele despre expresia proteic i activitatea enzimatic trebuie s avem n vedere c rezultatele RealTime-PCR reflect nivele ale unei stri stabile, constante, n timp ce prin analizele de western blot i zimografie, utiliznd medii celulare de cultur, evalum nivelele proteice ca fiind accumulate dup mai multe perioade de timp i trebuie luat n calcul efectul de acumulare. Aceast fapt este important n particular pentru MMP-2 pentru care n general am detectat nivele de expresie a ARNm absolut foarte mici dar se acumuleaz nivele considerabile de enzima secretat. Determinarea potenialului invaziv al celulelor tumorale dup supraexprimarea i atenuarea expresiei proteinelor factorului AP-1

Dup modularea activitii funcionale a celor doi membrii c-Jun i c-Fos ai factorului transcripional AP-1, pentru a determina rolul lor n reglarea expresiilor MMP i TIMP, prin studii de supraexprimare n culturi confluente i de inhibare n expresiilor MMP prin evaluarea potenialului invaziv al celulelor transfectate. Transfecia cu vectori de expresie pentru proteina c-Jun a fost realizat pe celule confluente cu o capacitate invaziv scazut iar celulele subconfluente puternic invasive au suferit silencing. Aceste dou categorii celulare au fost testate prin metode de chemotaxie. Supraexprimarea proteinei c-Jun a dus la o cretere semnificativ (p<0.001) a invazivitii celulelor MDA-MB-231 i MDA-MB-435 (de 2 ori fiecare) comparativ cu controalele (Fig. 15). Supraexprimarea proteinei c-Jun n celulele MCF-7, celule cu o capacitate minim s invadeze prin membrana bazal artificial, a rezultat ntr-o i mai mare cretere a invazivitii celulare (p<0.001). Transfecia acelorai tipuri celulare cu vectorul de expresie al proteinei c-Fos, de asemenea a determinat o inducie semnificativ a invazivitii n celulele MDA-MB-231 i 27 culturi subconfluente, am examinat consecinele funcionale ale creterii sau descreterii

MDA-MB-435 dar cu o mai mic amploare comparativ cu efectele induse de proteina cJun (Fig. 16). Procesul de silencing al proteinei c-Jun n culturile subconfluente MDA-MB-231 a fost suficient pentru a reduce capacitatea invaziv a acestor celule tumorale (p<0.001) (Fig. 17). Silencing c-Jun a redus potenialul invaziv al celulelor MDA-MB- 231 mai mult de 60% fa de celulele control transfectate. Aceasta sugereaz ca modularea proteinei c-Jun poate constitui o posibil abordare n terapia de inhibiie a potenialului metastazant al celulelor tumorale.

Figura 15: Influena supraexprimrii proteinei c-Jun asupra potenialului invaziv al celulelor de carcinom mamar. Liniile celulare MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 au fost transfectate cu vector de expresie c-Jun. Supraexpresia c-jun a condus la o cretere de aproximativ 2 ori a capacitii invazive a celulelor. Numrul celulelor invadatoare per cmp microscopic a fost normalizat, raportat la valorile obinute pentru celulele tansfectate cu vectori control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard SD. ***=p<0.01 (one-way ANOVA with Bonferronispost-test).(C=control; T=transfectat). Invasion index = controlul este setat la valoarea 1 iar celelalte valori sunt generate din numarul de celule migratoare/ invadatoare per camp microscopic raportate la control.

28

Figura 16: Influena supraexprimrii proteinei c-Fos asupra potenialului invaziv al celulelor de carcinom mamar. Liniile celulare MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 au fost transfectate cu vector de expresie c-Fos. Efectul de stimulare a potenialului invaziv celular indus de proteina c-Fos a fost mai slab comparativ cu c-Jun, dar semnificativ . Numrul celulelor invadatoare per camp microscopic a fost normalizat, raportat cu valorile obinute pentru celulele tansfectate cu vectori control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard SD. *=p<0.05, ***=p<0.01 (one-way ANOVA with Bonferronispost-test).

Figura 17: Influenta silencing c-Jun asupra potenialul invaziv al celulelor de carcinom mamar MDAMB- 231. Linia celular MDA-MB- 231 a fost transfectat cu ARNsi pentru proteina c-Jun. Silencing c-Jun a redus potenialul invaziv al celulelor MDA-MB- 231 mai mult de 60% (231 SI) fa de celulele control transfectate (non-silencing-231 NO), p<0.001(t-test). Numrul celulelor invadatoare per camp microscopic a fost normalizat, raportat la valorile obinute pentru celulele tansfectate cu vectori control. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard SD.***=p<0.01 (one-way ANOVA with Bonferronispost-test).

29

Expresiile MMP i a inhibitorilor TIMP sunt reglate n direcii opuse prin activarea transcripional a genelor lor. Lein i colab., [1999] au artat c supraexprimarea factorului transcripional AP-1 este corelat cu descreterea activitii receptorilor estrogenici facnd ca tumorile mamare s fie mai agresive, invazive i chemorezistente, nerspunznd la terapia hormonal. n experimentele prezentate am artat creterea funciei de legare a factorilor transcripionali NFkB i AP-1 n culturi rare de celule de carcinom mamar uman. Supraexprimarea proteinelor c-Jun i c-Fos n culturi dense induce transcripia mai multor MMP, n timp ce procesul de silencing c-Jun reduce transcipia n culturi subconfluente. Supraexprimarea i silencing au efecte complementare n sensul c supraexprimarea factorului AP-1 n celule confluente stimuleaz expresia MMP, activitatea proteolitic i invazivitatea dar i regleaz negativ expresia inhibitorilor TIMP iar procesul de silencing pentru proteina c-Jun, n culturi rare regleaz negativ MMP i induce expresia inhibitorilor TIMP comparativ cu celulele control. Am artat c densitatea celular influenteaz potenialul invaziv al celulelor tumorale prin reglarea MMP i TIMP de ctre factorii transcripionali AP-1 i NFkB . Aceste rezultate pot contribui la explicarea mecanismului prin care celulele tumorale capt un potenial invaziv. Deoarece activitile poteolitice ale MMP regleaz compoziia matricei extracelulare, ele joac un rol central n controlul semnalelor eliberate de moleculele matriceale, reglnd astfel proliferarea, diferenierea i moartea celular. n acest context, studiile ulterioare privind influena densitii celulare i a factorilor de transcripie, asupra MMP, au ajutat la nelegerea complexitii mecanismelor de reglare ale creterii potenialului tumoral i metastazic. Astfel, orice nivel al reglrii expresiei MMP n celule tumorale poate fi considerat ca o int pentru intervenia terapeutic. Stabilirea potenialului citotoxic al curcuminei prin MTT i LDH Dup tratarea celulelor cu curcumin 25M diferite perioade de timp, am msurat eliberarea, din celule, n mediul de cultur, lactat dehidrogenazei LDH. Metoda bazat pe activitatea LDH, este folosit pentru monitorizarea, in vitro, a citotoxicitii substanelor testate n culturile celulare, prin msurarea cineticii activitii enzimatice, a enzimei

30

eliberate de celule n mediul de cultur. LDH este o enzim citosolic stabil care este eliberat din celule n urma lizei celulare. Am monitorizat citotoxicitatea indus de curcumin timp de 24 de ore pentru dou stadii de densitate celular, subconfluen i confluen. Eliberarea lactat dehidrogenazei a fost observat pentru ambele linii celulare dup 24 de ore de tratament cu curcumin. Pentru linia celular MDA-MB-231, aa cum preconizam datorit studiilor anterioare, stadiul de densitate celular a influenat gradul de citotoxocitate indus de curcumin (Fig. 18). Celulele cultivate la un stadiu de densitate mai mic sunt mai sensibile la curcumin. Eliberarea LDH n mediul de cultur al celulelor subconfluente crete de patru ori, dup 24 de ore de tratament, cu 25M curcumin fa de celulele netrate, i de numai dou ori n mediul de cultur al celulelor confluente. Pentru linia celular MDA-MB-435, de asemenea, stadiul de densitate celular a influenat gradul de citotoxocitate indus de curcumin (Fig. 19). Celulele cultivate la o densitate celular mai mic sunt mai sensibile la curcumin, eliberarea enzimei n mediul de cultur fiind uor mai pronunat. Eliberarea LDH n mediul de cultur al celulelor subconfluente crete cu numai 1,5 ori, dup 24 de ore de tratament cu 25M curcumin fa de celulele netrate, iar n mediul de cultur al celulelor confluente, creterea este foarte mic, statistic nesemnificativ.

Figura 18: Profilul citotoxicitii induse de tratamentul cu curcumin asupra liniei celulare MDA-MB231 n stadiul de subconfluen (231 sub) i la confluen (231 con). Eliberarea LDH n mediul de cultur al celulelor subconfluente crete de patru ori, dup 24 de ore de tratament, cu 25M curcumin fa de celulele netrate, i de numai dou ori n mediul de cultur al celulelor confluente.

31

Figura 19: Profilul citotoxicitii induse de tratamentul cu curcumin asupra liniei celulare MDA-MB435 n stadiul de subconfluen (435 sub) i la confluen (435 con). Eliberarea LDH n mediul de cultur al celulelor subconfluente crete cu numai 1,5 ori, dup 24 de ore de tratament cu 25M curcumin fa de celulele netrate, iar n mediul de cultur al celulelor confluente, creterea este foarte mic nesemnificativ

Metoda MTT a artat c n urma tratamentului cu curcumin, a fost inhibat activitatea mitocondrial a celulelor MDA-MB-231 i MDA-MB-435 ntr-o manier dependent de timpul de aciune al curcuminului i de stadiul de densitate celular, confluen i subconfluen. Menionez c aceste linii celulare nu manifest inhibiie de contact.

Figura 20: Influena tratamentului cu 25M curcumin asupra proliferrii celulare pentru linia celular MDA-MB-231 n stadiul de subconfluen (231 sub) i n stadiul de confluen (231 con). Viabilitatea celulelor cu densitate mic scade dup tratamentul cu curcumin n proporie de aproximativ 50% dup numai dou ore ajungnd la 53% dup 24 de ore de tratament, n timp ce pentru celulele confluente viabilitatea scade cu o mai mic intensitate, cu 50% dup 24 de ore de tratament

32

Figura 21: Influena tratamentului cu 25M curcumin asupra proliferrii celulare pentru linia celular MDA-MB-435 n stadiul de subconfluen (435 sub) i n stadiul de confluen (435 con). Gradul de proliferare celular scade odat cu prelungirea timpului de actiune al curcuminei. Profilul viabilitii celulare pentru celulele MDA-MB-435 este asemanator pentru cele dou stadii de densitate celular cu un maxim de inhibitie dup 24 de ore de aproximativ 25%

Curcumina a redus proliferarea celular la 50% dup 2 ore n celulele MDA-MB231 subconfluente. Tratamentul prelungit cu curcumin nu a condus la reducere semnificativ fa de cea nregistrat dup 2 ore de tratament, 53% (Fig. 20). Celulele confluente sunt mai puin sensibile la tratamentul cu curcumin dect celulele subconfluente. n acest caz proliferarea celular a fost redus de aproximativ 30% dup 2 ore i ulterior la aproape 50% dup 24 de ore de tratament. Rspunsul celulelor MDA-MB-435 este de asemenea rapid dar mult mai slab, nesemnificativ statistic (p0.5), dar spre deosebire de linia MDA-MB-231 viabilitatea scade mai mult odat cu prelungirea timpului de aciune al curcuminei. Profilul viabilitii celulare pentru celulele MDA-MB-435 este asemntor pentru cele dou stadii de densitate celular cu un maxim de inhibitie dup 24 de ore de aproximativ 25% (Fig. 21). Reducerea activitii mitocondriale i a proliferrii celulare induse de tratamentul cu curcumin, este mult mai pronunat n celule subconfluente dect n cele confluente. Aciunea curcuminei asupra activitii i exprimrii unor enzime MMP Activitile enzimatice prezente n mediile de cultur de pe celulele tratate i netratate cu curcumin 25M, au fost detectate ca benzi translucide pe un fond albastru, dat de coloraia cu Comassie brilliant blue, a gelurilor de poliacrilamid ce conin

33

substratul enzimelor proteazice, gelatina pentru MMP-2 i MMP-9 i respectiv cazeina pentru MMP-1. Analizele zimogramelor celulelor de carcinom mamar MDA-MB-231 i MDA-MB435 au artat c att activitile gelatinolitice ct i cele cazeinolitice au nregistrat o reducere, din mediul de cultur, n urma tratamentului cu curcumin, comparativ cu controlul. Celulele MDA-MB-231 au rspuns la tratamentul cu curcumin printr-o inhibiie tranzitorie a activitii enzimatice a MMP-2 i o supresie persistent a activitii MMP-1 (Fig. 22, 23), n timp ce activitatea gelatinazei B, MMP-9 a rmas neafectat de tratament, posibil aceast enzim ramnnd stocat n compartimentul celular. Oricum se observ c expresia constitutiv a MMP-9 n celulele MDA-MB-231 este mai scazut dect cea a MMP-2. Acest lucru se explic, posibil prin faptul c MMP-9 este o enzim corelat cu creterea gradului de malignitate iar aceast linie celular MDA-MB-231 are un grad mediu de metastazare. Influena tratamentului cu curcumin asupra activitii enzimatice a MMP-1, o proteinaz cu specificitate de substrat att pentru gelatin dar mai mult pentru cazein, a fost pus n eviden pe cazeinogram. Se observ un efect pronunat de inhibiie a activitii enzimatice a MMP-1 determinat de curcumin. MMP-1 este enzima care iniiaz prima un efect de proteoliz prin degradarea moleculelor de colagen native, iar prin acest efect de inhibiie observat, determinat de ctre curcumin, este posibil ca ntr-o anumit etap a procesului de migrare celular pentru metastazare, MMP-1 s aib un rol critic. n mediul de cultur MDA-MB-435 expresia constitutiv a MMP-9 este mult mai mare dect cea obsevat la linia celular MDA-MB-231, acest fapt ntrind ipoteza amintit mai sus, c celulele cu potenial invaziv mai mare secret cantiti mai mari de MMP-9. Activitile enzimatice ale MMP-9 i MMP-2 au descrescut n urma tratamentului cu curcumin, dar cu o mai mare intensitate pentru MMP-9 fa de MMP-2. Aciunea inhibitoare a curcuminei asupra activitii MMP-9 este redresat dup 15 ore de la tratament, celulele MDA-MB-435 avnd un grad maxim de malignitate sunt astfel mult mai rezistente la tratamentul cu curcumin (Fig. 24). n aceste celule activitatea enzimatic a MMP-1 nu a putut fi detectat deloc (Fig. 25). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

34

MMP-9 MMP-2 MMP-1

Figura 22: Gelatin zimografie din mediu de cultur al celulelor MDA-MB-231 Numere impare-celule tratate cu curcumin/Numere pare-celule netratate (control).; 1,2: dup 2ore; 3,4: dup 3ore; 5,6: dup 4ore; 7: MMP-9-control; 8: MMP-2 control; 9,10 dup 5ore; 11,12: dup 6 ore.

9 10 11 12

13 14 15 16

MMP-1

MMP-1

Figura 23: Cazein zimografie din mediu de cultur al celulelor MDA-MB-231 Numere impare- celule tratate cu curcumin/ Numere pare- celule netratate (control). C- MMP-1control; 1,2: dup 2 ore; 3,4: dup 3 ore; 5,6: dup 4 ore; 7,8 dup 5 ore; 9,10: dup 6ore; 11,12: dup 7 ore; 13,14: dup 15 ore; MMP-1 15,16: dup 24 ore

MMP-1

Figura 24: Cazein zimografie din mediu de cultur al celulelor MDA-MB-435 Numere impare-celule tratate cu curcumin/ Numere pare-celule netratate (control). C- MMP-1 control; 1,2: dup 2 ore; 3,4: dup 6 ore; 5,6: dup 15 ore; 7,8 dup 24 ore

Interesant, efectul inhibitor al curcuminului asupra reducerii activitii MMP n mediul de cultur este dependent de tipul celular ca i de tipul de proteaz. Aceste

35

rezultate susin ideea c tratamentul in vitro cu curcumin ar putea fi eficient n stoparea migrrii celulare induse de ctre MMP, n cazul unor celule cu grad mediu de malignizare. 1 2 3 4 5 6 7 8

MMP-9 MMP-2

10

11

12

13

14

MMP-9 MMP-2

15

16

17

18

19

20

21

22

MMP-9 MMP-2

Figura 25: Gelatin zimografia din mediul de cultur al celulelor MDA-MB-435 Numere impare- celule tratate cu curcumin/ Numere pare- celule netratate (control). 1,9,15 -MMP-9 control; 2,10,16- MMP2 control; M- markeri de mas molecular 3,4: dup 2 ore; 5,6: dup 3 ore; 7,8: dup 4 ore; 11,12 dup 5 ore; 13,14: dup 6 ore; 17,18: dup 8 ore; 19,20: dup 15 ore; 21,22: dup 24 ore

Analize de western blotting pe medii celulare condiionate (Fig. 26) arat o puternic supresie a proteinelor MMP dup tratamentul cu acest polifenol. A fost monitorizat n prezena sau n absena unei concentraii de 25M curcumin acumularea unor cantiti noi de MMP eliberate n mediul de cultura fr ser. 36

Celulele MDA-MB-231 elibereaz extracelular MMP-1, -2 si -3, iar numai dup trei ore de incubare, cantitatea de protein MMP-1 secretat n mediul celulelor a fost complet suprimat n prezena curcuminei fa de control (cantitatea de proteina MMP-1 secretat n mediul celulelor netratate)(Fig. 26A). Efectul asupra MMP-2 a fost similar, dei nivelul de expresie a fost mai sczut i a atins un maxim de detecie dup 15 ore (Fig. 26B). Chiar i dup 24 de ore proteinele MMP-1 i MMP-2 nu au fost detectabile n mediul de cultur al celulelor tratate cu curcumin. MMP-3, att forma inactiv ct i forma activ a fost detectat numai dup 24 de ore de acumulare n mediul de cultur al celulelor netratate. Ambele benzi corespunzatoare formelor MMP-3 au disparut n celulele tratate cu curcumin (Fig. 26C). MMP-9, proteina major exprimat n mediul de cultur al celulelor MDA-MB-435 a fost detectat cu cele dou forme, inactiv i activ, dup 3 ore n celulele control dar nu i n celulele tratate cu curcumin (Fig. 26D). Pentru a vedea dac tratamentul cu curcumin va afecta i la nivel citoplasmatic expresia MMP, am analizat prin tehnica de western blot aceleai proteaze care se gsesc stocate intracelular. Concentraiile proteice din extractele celulare obinute dup tratamentul cu curcumin asupra liniilor celulare MDA-MB-231 i MDA-MB-435 au fost verificate prin efectuarea unui western blot i pentru actin, o protein intracelular constitutiv (Fig. 29). Benzile proteice obinute pentru actin au acelai profil, ceea ce a indicat c am folosit cantiti egale de protein pentru experimentele de westen bloting din extracte celulare. MMP-2 nu a putut fi detectat n extractele celulare n ambele linii celulare, posibil datorit secretrii sale imediate dup sintez. n acest sens am detectat proteazele MMP-9 (Fig. 27) i MMP-1 (Fig. 28) din extractele celulare. Pentru MMP-9, att forma inactiv ct i forma activ au fost detectate n lizatele celulelor netratate i tratate. Ambele benzi corespunzatoare formelor MMP-9 au rmas nemodificate n urma tratamentului cu curcumin. Monitorizarea s-a realizat dup 4 ore pn la 15 ore. Pentru MMP-1 a fost detectat numai forma activ dar i n acest caz tratamentul cu curcumina nu a acionat asupra proteazei intracelulare. Nu s-au constatat diferene intre celulele tratate cu curcumin i cele netratate . Analizele de imunoblot ale extractelor citosolice i a mediilor de cultur ale celulelor MDA-MB-231 i MDA-MB-435 au artat c curcumina nu are efect asupra enzimelor MMP stocate intracelular dar are un efect inhibitor asupra proteazelor secretate. 37

5 6

9 10 11 12 13 14 15 16
MMP-1

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16
MMP-2

B 12 13 15 16
MMP-3

8
MMP-9

Figura 26: Analiza western blot din medii de cultur a celulelor MDA-MB 231 i MDA-MB-435: A: MMP-1, celule MDA-MB-231; B: MMP-2, celule MDA-MB-231; C: MMP-3, celule MDA-MB-231; D: MMP-9, celule MDA-MB-435. Numere impare- celule tratate cu curcumin; Numere pare- celule netratate (control); M- markeri de mas molecular; 1,2: dup 2 ore; 3,4: dup 3 ore; 5,6: dup 4 ore; 7,8 dup 5 ore; 9,10: dup 6 ore; 11,12: dup 7 ore; 13,14 dup15 ore; 15,16: dup 24 ore

6
MMP-9

Figura 27: Analiza western blot pentru MMP-9 din extracte celulare; A: Celule MDA-MB 231; B: Celule MDA-MB 435 Numere impare- celule tratate cu curcumin; Numere pare- celule netratate (control); M- markeri de mas molecular; C- MMP-9 control 1,2: dup 4 ore; 3,4: dup 6 ore; 5,6: dup 15 ore.

6
MMP-1

Figura 28: Analiza western blot pentru pentru MMP-1 din extracte celulare din MDA-MB-231; Numere impare- celule tratate cu curcumin; Numere pare-celule netratate(control)1,2: dup 4 ore; 3,4: dup 6 ore; 5,6: dup 15 ore.

38

Figura 29. Analiza western blot pentru actina din extracte celulare. A: Celule MDA-MB 231 ; B: celule MDA-MB 435. Numere impare-celule tratate cu curcumin Numere pare-celule netratate(control); 1,2: dup 4 ore; 3,4: dup 6 ore; 5,6: dup 15 ore

Influena curcuminei asupra expresiei ARNm pentru MMP Deoarece tratamentul cu curcumin asupra liniilor celulare de carcinom mamar uman a condus la inhibarea activitii enzimatice a MMP, am investigat influena acestui polifenol la nivel transcripional. Am determinat expresia ARNm pentru mai multe MMP prin PCR semicantitativ iar valorile expresiilor MMP au fost normalizate prin raportare la control expresia unei gene constitutive obinut n paralel. Analize anterioare au artat c MMP-1, -2, -3 i -9 sunt exprimate de ctre celulele MDA-MB-231, ultima enzim, MMP-9, fiind secretat numai n cantiti foarte mici. Proteina MMP-2 este secretat n cantiti considerabile dar transcripional au putut fi detectate numai cantiti mici, posibil datorit instabilitii moleculelor de ARNm. Tratamentul cu curcumin pe celule MDA-MB-231 a determinat o reducere puternica a expresiilor ARNm pentru MMP-1 si MMP-2 la numai 2 ore dupa tratament conducnd dup 24 de ore de tratament la o reducere a expresiei MMP-1 de 3,45 ori i a MMP-2 de 2,5 ori (Fig. 30). Din contr, expresiile ARNm pentru MMP-9 i MMP-3 nu au fost modificate considerabil de ctre tratament. Celulele MDA-MB-435, n principal, exprim MMP-9 i MMP-3 i n cantiti mai mici MMP-1. Expresiile MMP-9 i MMP-1 sunt inhibate de tratamentul cu curcumin ntr-o manier dependent de timp, n timp ce pentru MMP-3 nu am observat nici un efect asupra expresiei sale determinat de tratamentul cu curcumin (Fig. 31).

39

Figura 30: Efectul curcuminei asupra expresiei MMP i a proteinei c-Jun n culturi celulare subconfluente MDA-MB-231. Cuantificarea prin RT-PCR a ARNm pentru MMP din celule tumorale mamare MDA-MB-231 tratate cu 25M Curcumin. Tratamentul cu curcumin a dus la o descretere semnificativ a expresiei MMP-1 i MMP-2 n celulele MDA-MB-231. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard, SD; *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferronis post test).

Figura 31: Efectul curcuminei asupra expresiei MMP i a proteinei c-Jun n culturi celulare subconfluente MDA-MB-435.Cuantificarea prin RT-PCR a ARNm pentru MMP din celule tumorale mamare MDA-MB-435 tratate cu 25M Curcumin. Tratamentul cu curcumin a dus la o descretere semnificativ a expresiei MMP-1 i MMP-9 n celulele MDA-MB-435), efectul ncepnd dup 2 ore de tratament i potenndu-se pn la 20 de ore. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard, SD; *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferronis post test).

40

Am msurat, de asemenea, n celule control (netratate) i n celule tratate cu curcumin expresia ARNm pentru subunitatea c-Jun a factorului transcripional AP-1, al crui situs de legare este prezent n regiunea promotor a mai multor MMP. Polifenolul reduce puternic expresia c-Jun n ambele tipuri celulare, MDA-MB-231 i MDA-MB-435 (Fig. 32).

Figura 32: Efectul curcuminei asupra expresiei proteinei c-Jun n culturi celulare subconfluente MDA-MB-231 i MDA-MB-435. Cuantificarea prin RT-PCR a ARNm pentru proteina c-Jun din celule tumorale mamare tratate cu 25M Curcumin. Expresia proteinei c-Jun a fost redus n proporie de 60% dup 2 ore de tratament comparativ cu celule netratate. Experimentele au fost realizate n triplicat; barele de erori indic deviaia standard, SD; *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferronis post test).

Analizele Western blot au artat c este o reglare post-transcripional a expresiilor MMP. Expresia ARNm pentru MMP-3 nu a fost afectat de curcumin n celulele MDA-MB-231 dar expresia proteinei corespunzatoare, dup translaie a fost afectat. Nivelele de MMP-1 i MMP-2 par a fi mai puternic reglate la nivel proteic (Fig. 26) dect la nivel de ARNm (Fig. 30). Efectul curcuminei asupra capacitii invazive a celulelor tumorale mamare Pentru a vedea dac reducerea exocitozei MMP, datorat aplicrii de curcumin pe celule, a fost suficient s modifice capacitatea invaziv/migratoare a celulelor tumorale, am realizat metode de chemotaxie. Migrarea celulelor individuale poate fi observat n camere Boyden, n care chemoatractantul este plasat n compartimentul inferior al camerei. Filtrul este acoperit cu o membran bazal artificial (colagen IV sau 41

Matrigel), migrarea/invazia celular i digestia proteolitic a matricei este necesar celulelor tumorale s raspund la stimul (chemoatractantul). Tratamentul ambelor linii celulare MDA-MB 231 i respectiv MDA-MB-435 cu 25 M curcumin pentru 16 ore a avut ca rezultat o semnificativ reducere (p <0.001) a capacitii de migrare (Fig. 32) i o descretere semnificativ (p<0.001) a capacitii invazive (Fig. 33) comparativ cu celule netratate. Att capacitatea de migrare ct i cea invaziv au fost modificate de curcumin n ambele linii celulare, mai puternic n linia MDA-MB-231.

Figura 32: Studii de migrare celular. Mediu condiionat de fibroblaste a fost folosit ca i chemoatractant i colagen IV ca o matrice extracelular echivalent. Tratamentul celulelor MDA-MB231 i MDA-MB-435 cu 25M curcumin timp de 16 ore conduce la o reducere semnificativ a capacitii de migrare n ambele linii celulare, comparativ cu controlul.

Deoarece viabilitatea celulelor MDA-MB-231 tratate cu curcumin a sczut la scurt timp de la tratament, s-au realizat metodele de chemotaxie nainte ca celulele s devin apoptotice. Astfel, am msurat capacitatea migratoare i invaziv a celulelor tratate numai 6 ore cu curcumin. Din nou, o reducere semnificativ a fost observat (Fig. 34)

42

Figura 33: Studii de invazivitate celular. Mediu condiionat de fibroblaste a fost folosit ca i chemoatractant i Matrigel ca o matrice extracelular echivalent. Tratamentul celulelor MDA-MB231 i MDA-MB-435 cu 25M curcumin timp de 16 ore conduce la o scdere semnificativ a capacitii invazive n ambele linii celulare, comparativ cu controlul. Inhibiia a fost mai slab pentru celulele MDA-MB-435.

Figura 34: Studii de migrare i invazie celular prin chemotaxie. Mediu condiionat de fibroblaste a fost folosit ca i chemoatractant i colagen IV/Matrigel ca o matrice extracelular echivalent. Tratamentul celulelor MDA-MB-231 i MDA-MB-435 cu 25M curcumin timp de 6 ore conduce la o scdere semnificativ a capacitailor migratoare i invazive n ambele linii celulare, comparativ cu controlul. Inhibiia a fost mai slab pentru celulele MDA-MB-435. Experimentele au fost realizate n triplicat, barele de erori indic deviaia standard. ***= p<0.001(one-way ANOVA with Bonferronis post-test).

43

IV. Concluzii Activitile funcionale ale factorilor de transcripie AP-1 i NFkB cresc odat cu scderea densitii celulare ceea ce conduce la activiti proteolitice MMP crescute. Celulele de carcinom mamar exprim nivele mai mari de MMP n culturi rare, similar cu celulele de la periferia tumorii principale, fa de celulele compacte, crescute la confluen, similar cu celulele din centrul masei tumorale Supraexprimarea i inhibarea (silencing) proteinelor complexului AP-1 au efecte complementare asupra expresiei MMP, inhibitorilor TIMP i asupra potenialului invaziv . S-a observat c expresia crescut a proteinei c-Jun in vitro a avut ca rezultat i) creterea activitii factorului transcripional AP-1 cu modificarea expresiilor genelor cuplate cu factorul AP-1; ii) creterea expresiilor enzimelor MMP; iii)creterea motilitii i invazivitii celulelor tumorale. Supraexprimarea proteinelor c-Jun i c-Fos induce transcripia mai multor MMP iar procedeul de silencing pentru c-Jun reduce transcripia MMP induce pe cea a inhibitorilor TIMP n cultura subconfluent. Aceast reglare are un clar efect asupra comportamentului invaziv al celulelor evaluat in vitro prin metode de chemotaxie. Transfecia acelorai tipuri celulare cu vectorul de expresie al proteinei c-Fos, de asemenea a determinat o inducie semnificativ a invazivitii n celulele MDA-MB-231 i MDA-MB-435 dar cu o mai mic amploare comparativ cu efectele induse de proteina cJun. Supraexprimarea proteinei c-Jun a dus la o cretere semnificativ a invazivitii celulelor MDA-MB-231 i MDA-MB-435 (de 50% fiecare) comparativ cu controalele. Aceastea sugereaz ca modularea proteinei c-Jun poate constitui o posibil abordare n terapia de inhibiie a potenialului metastazant al celulelor tumorale. Reducerea activitii mitocondriale i a proliferrii celulare, induse de curcumin, este mult mai pronunat n celule subconflunte dect n cele confluente. Rezultatele analizelor asupra expresiilor MMP au artat o influen semnificativ a curcuminei la nivel de ARNm, proteic sau a activitii enzimatice eliberate din celule Efectul inhibitor al curcuminei asupra reducerii activitii MMP secretate n mediul de cultur este dependent de tipul celular i de tipul de proteaz. Tratamentul cu curcumin nu are efect asupra enzimelor MMP stocate intracelular Activitile enzimatice gelatinolitice ct i cele cazeinolitice au sczut n mediul de cultur, n urma tratamentului cu curcumin, comparativ cu controlul, pentru ambele linii celulare. Celulele MDA-MB-231 au rspuns printr-o inhibiie tranzitorie a activitii 44

enzimatice a MMP-2 i o supresie persistent a activitii MMP-1, n timp ce activitatea gelatinazei B, MMP-9 a rmas neafectat de tratament, posibil aceast enzim ramnnd stocat n compartimentul celular. n celulele MDA-MB-435 activitile enzimatice ale MMP-9 i MMP-2 au sczut n urma tratamentului cu curcumin, dar cu o mai mare intensitate pentru MMP-9 fa de MMP-2. Aciunea inhibitoare a curcuminei asupra activitii MMP-9 este redresat dup 15 ore de la tratament. Potenialul migrator i cel invaziv al celulelor tumorale mamare au fost inhibate de ctre curcumin, mai puternic n linia celular MDA-MB-231. V. Bibliografie
Bachmeier, B.E., Nerlich, A., Lichtinghagen, R., Sommerhoff, C.P. Matrix metalloproteinases (MMPs) in breast cancer cell lines of different tumorigenicity. Anticancer Res. 21:3821-3828, 2001. Bachmeier, B. E., Albini, A., Vene, R., Benelli, R., Noonan, D., Weigert, C., Weiler, C., Lichtinghagen, R., Jochum, M., Nerlich, A. G. Cell density-dependent regulation of matrix metalloproteinase and TIMP expression in differently tumorigenic breast cancer cell lines. Exp.Cell Res., 305: 83-98, 2005. Hanif, R., Qiao, L., Shiff, S. J., Rigas, B., Curcumin, a natural plant phenolic food additive, inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandinindependent pathway, J. Lab. Clin. Med., 130: 576-584, 1997. Huang, M.T., Lysz, T, Ferraro, T., Abidi, T.F., Laskin, J.D., Conney, A.H. Inhibitory effects of curcumin in in vitro lipoxygenase and cyclooxygenase activities in mouse epidermis. Cancer Res. 51: 8139, 1991 Jordan, W.C. i Drew, C.R. Curcumin-a natural herb with anti-HIV activity. J.Natl.Med. Assoc. 88:333, 1996. Lein, M., Nowak, L., Jung, K., Laube, C., Ulbricht, N., Schnorr, D., Loeening, S.A. Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Matrix-Metalloproteinases in Plasma of Patients with Prostate Cancer and in Prostate Cancer Tissue Ann. N Y Acad. Sci. 878: 544 546, 1999. Lim, G.P., Chu, T., Yang, F., Beech, W., Frautscky, S.A., Cole, G.M. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J.Neurosci. 21:83707, 2001. Menashi, S., Dehem, M., Souliac, I., Legrand, Y., Fridman, R. Density-dependent regulation of cellsurface association of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in breast-carcinoma cells. Int.J.Cancer 75:25965, 1998. Nerlich, A., Lebeau, A., Hagedorn, H.G., Sauer, U., Schleicher, E.D. Morphological aspects of altered basement membrane metabolism in invasive carcinomas of the breast and the larynx. Anticancer Res. 18:3515-3520, 1998. Oetari, S., Sudibyo, M., Commandeur, J. N., Samhoedi, R., Vermeulen, N. P., Effects of curcumin on cytochrome P450 and glutathione S-transferase activities in rat liver, Biochem. Pharmacol., 51: 39-45, 1996. Ramachandran, C., You, W., Differential sensitivity of human mammary epithelial and breast carcinoma cell lines to curcumin, Breast Cancer Res. Treat., 54: 269-278, 1999. Ruby, A. J., Kuttan, G., Babu, K. D., Rajasekharan, K. N., Kuttan, R., Antitumor and antioxidant activity of natural curcuminoids, Cancer Lett., 94: 79-83, 1995. Ryseck, R.P. i Bravo R. c-JUN, JUN B, and JUN D differ in their binding affinities to AP-1 and CRE consensus sequences: effect of FOS proteinsOncogene 6, 533-542, 1991. Schwabe, J.W. i Rhodes, D. Beyond zinc fingers: steroid hormone receptors have a novel structural motif for DNA recognition. Trends Biochem. Sci. 16: 291-296, 1991. Singh, S. i Aggarwal, B. B. Activation of transcription factor NF-B is supressed by curcumin (diferuloylmethane) [published erratum appears in J. Biol. Chem. 270: 30235, 1995]. J. Biol. Chem., 270: 24995-25000, 1995.

45

Smith, L.M., Wise, S.C., Hendricks, D.T., Sabichi, A.L., Bos, T., Reddy, P. et al. c-Jun overexpression in MCF7 breast cancer cells produces a tumorigenic, invasive and hormone resistant phenotype. Oncogene 18: 6063-70, 1999. Venkatesan, N. i Chandrakasaan, G. Modulation of cyclophosphamide-induced early lung injury by curcumin, an anti-inflamatory antioxidant. Mol.Cell. Biochem. 142: 79-87, 1995. Xie, B., Bucana, C.D., Fidler, I.J. Density-dependent induction of 92-kd-type-IV-collagenase activity in cultures of A431 human epidermoid carcinoma cells. Amer.J.Pathol. 144:1058-1067, 1994.

46