Curs 5 imunologie

DEZVOLTAREA SI ACTIVAREA LIMFOCITELOR B

Limfocitele B sunt generate pe tot parcursul vietii, desi in cantitati care cresc progresiv cu varsta, asigurandu-se astfel un aport continu de noi celule B, capabile sa produca anticorpi fata de o mare varietate de patogeni, care sunt astfel recunoscuti si eliminati. La om, precursorii limfocitelor B (celulele pro-B) se gasesc printre insulele de celule hematopoietice din ficat fetal pana In saptamana 8-9 de gestatie. Apoi ficatul fetal inceteaza sa mai produca celule B si aceasta funcfie este preluata de maduva osoasa.
Viata unei celule B poate fi divizata in 4 mari faze: Generarea receptorilor celulelor B in maduva hematopoietic:in timpul dezvoltarii limfocitelor B din celulele progenitoare din maduva hematopoietica se produce rearanjarea genelor pentru imonoglobuline si expresia unui receptor cu o specificitate unica pentru antigen. Aceasta etapa este independenta de antigen, si depepndenta de interactiunea cu celulele stromale din maduva osoasa. > Inducerea tolerantei la antigenele self din maduva hematopoietica: limfocitele B imature care exprima receptori de suprafafa interacfioneaza cu antigenele self prezente in micromediul medular, celulele B cu receptori care recunosc antigenul sunt tolerizate.Primele doua faze se desfasoara in maduva hematopoietica si apoi celulele sunt exportate in periferie, alaturandu-se pool-ului de limfocite periferice.

> Activarea limfocitelor B de catre antigen in organele limfatice periferice: contactul celulelor B cu antigenul in organele limfatice periferice duce la activarea limfocitelor B. > Exercitarea functiei efector a limfocitelor B activate: celulele B activate prin contactul cu antigenul
prolifereaza si se diferentiaza in efectori in organele limfatice periferice; o parte din AFC raman in organele limfatice periferice, dar mai frecvent migreaza in maduva hematopoietica.

Maduva hematopoietica reprezinta un micromediu esenfial pentru dezvoltarea limfocitelor B. Diferenfierea celulei stem din maduva hematopoietica intro celula B imatura poate fi subdivitata in patru etape: Stadiul de celula pro-B precoce: celulele pro-B apar inainte de inceperea rearanjarii genelor pentru
imunoglobuline si sunt identificate prin markeri de suprafafa caracteristici limfocitelor B. Toate stadiile ulterioare de maturare sunt definite prin etapele rearanjarii genelor pentru imunoglobuline, modificarile markerilor de suprafata, dependent de factorii de crestere si localizarea in interiorul stromei medulare.

Stadiul de celula pro-B tardiva: rearanjarea segmentelor genice D si J pentru lantul greu duce la trecerea celulei in stadiul pro-B tardiv. Stadiul de celula pre-B: rearanjarea V-DJ a segmentelor genice ale lantului greu duce la aparifia celulelor preB. Celulele pre-B exprima nivele mari de lanf U. In citoplasma, cat si nivele scazute de lanf u. pe suprafata.

Stadiul de celula B imatura: in final are loc rearanjarea genelor pentru lantul usor, urmata de expresia moleculelor complete de IgM pe suprafata celulei, numita acum limfocit B imatur. Celulele B mature difera de Iimfocitele imature prin faptul ca exprima concomitent si IgM si IgD.Toate stadiile de dezvoltare ale limfocitelor B se desfasoara in maduva hematopoietica si sunt dependente de celulele stromale: celulele stem prelevate din maduva hematopoietica si mentinute in cultura nu reusesc sa se diferenfieze in limfocite B decat daca in cultura sunt prezente si celule stromale.
Celulele stromale contribuie la dezvoltarea limfocitelor B: in stadiile precoce, precursorii limfocitelor B trebuie sa vina in contact direct cu celulele stromale; in stadiile mai avansate, dezvoltarea celulelor B este dependents de factori de crestere secretafi de celule stromale.

Progenitorii celuleor limfoide si celulele pro-B precoce interacjioneaza prin intermediul moleculei CD44 exprimata pe suprafata lor cu acidul hialuronic de pe suprafata celulelor stromale. Aceasta interacfiune promoveaza interactiunea unei tirozin-kinaze, numita c-kit
1

Curs 5 imunologie

exprimata de celulele pro-B precoce, cu SCF de pe celulele stromale. Legarea c-kit de SCF duce la activarea kinazei care induce diviziunea celulelor pro-B. Celulele pro-B tardive necesita pentru crestere si maturare atat prezenta SCF pe suprafata celulelor stromale, cat si IL-7 solubila. In stadiul pro-B tardiv celula Tncepe sa se exprime receptorii pentru IL-7, care este un factor de crestere secretat de celulele stromale. Celulele pre-B continua sa fie dependente de IL-7, dar datorita faptului ca i nceteaza sa mai exprime
c-kit, Tsi pierd dependenta de SCF si se desprind de pe suprafata celulelor stromale. Unul din markerii cei mai precoce ai celulelor B in dezvoltare este reprezentat de o izoforma a tirozinfosfatazei CD45 (CD45R). CD45 are rol in semnalizarea prin receptorii pentru antigen ai limfocitelor B si T, poate modula activitatea unor tirozin-kinaze dar rolul exact al sau Tn dezvoltarea limfocitelor B nu este cunoscut.

CD 19, CD21 si CD45 au rol important in semnalizare in timpul activarii celulelor B. MHC II prezinta antigenul celulelor T helper, iar CD40 participa la interactiunea dintre Iimfocitele B si T. CD10, CD20, CD38 sunt markeri utili pentru identificarea celulelor B in dezvoltare. Prezenta lanturilor in citoplasma celulelor pre-B este caracteristica pentru acest stadiu, desi aceste limfocite pot si sa exprime pe suprafata nivele mici de lanturi .
Markeri Celula stem Pro-B precoce Pro-B tardiv Pre-B Celula B imatura Celula B matura

CD34 CD45R MHC II CD10 CD19 CD38 CD20 CD40 CD21 Lant n IgM IgD

+ + + + -

+ + + + + -

+ + + + + + + -

+ + + + + + + -

+ + + + +
-

+ -

+ + + + + + + +

Tabelul 12.1. Markeri exprimafi in diferite stadii ale maturarii limfocitelor B (E. Carasevici)

Limfocitele B imature se diferentiaza in cateva zile in celule B mature naive care co-exprima pe suprafata IgM si
IgD. Cele doua izotipuri exprimate au aceeasi specificitate antigenica si apar prin procesarea alternative a mARNului pentru lantul greu. Dezvoltarea limfocitelor este dependenta de rearanjarea secventiala productive a genelor pentru lanturile grele si usoare ale imunoglobulinelor. Primele se rearanjeaza genele pentru lantul greu al imunoglobulinelor. In stadiul pro-B precoce se produce rearanjarea D-J pe ambii cromozomi. In celula pro-B tardive are loc rearanjarea V-DJ pe unul din cei doi cromozomi. In stadiul pre-B Tncepe rearanjarea genelor pentru lantul usor. Mai Intai se rearanjeaze genele pentru lantul K pe unul din cromozomi;daca rezulta o aranjare productiva celula exprime IgM K si devine celule B imature; dace prima rearanjare este neproductiva are loc rearanjarea genelor pentru K pe cel de-al doilea cromozom. Daca si cea de-a doua rearanjare este incorecta Incepe rearanjarea genelor pentru lanful , pe unul din cromozomi.

Spre deosebire de procesul de rearanjare a segmentelor genice pentru lanful greu, in cazul lanfului usor se pot Tncerca rearanjari succesive pe acelasi cromozom, inainte de a fi initiate orice rearanjare pe celalalt cromozom. Acest fenomen este posibil datorita existenfei mai multor segmente genice J si a organizarii genelor pentru Ianfurile usoare.

Curs 5 imunologie

Celulele pre-B produc doua proteine similare imunoglobulinelor, care impreuna formeaza un lanf usor surogat. Una din cele doua proteine, numita 5 este similara domeniului C, iar cealalta (VpreB), seamana cu un domeniu variabil, dar are in plus o secvenfa proteica la capatul ami noterminal. Cele doua molecule 5 si VpreB formeaza un complex pe suprafata celulei impreuna cu lanful . si cu Ianfurile constante Iga si Ig.
Se pare ca acest complex semnalizeaza celulei B in dezvoltare ca s-a format o gena completa pentru lanful greu, inhiband rearanjarea in continuare a genelor pentru lanful greu si declansand inceperea rearanjarii genelor pentru lanful usor. Astfel complexul : 5:VpreB acfioneaza ca un receptor al celulei pre-B si poate induce proliferarea celulelor pre-B tnainte de rearanjarea genelor pentru lanful usor. Din momentul in care genele pentru lanful usor s-au rearanjat corect, produsul acestor gene inlocuieste lanful usor surogat si se formeaza o molecula de IgM intacta. Expresia IgM pe suprafafa celulei B reprezinta semnalul pentru incetarea rearanjarii genelor pentru lanful usor.

Fiecare etapa din procesul de rearanjare a genelor pentru imunoglobuline este reglata de produsul etapei precedente, in final fiecare limfocit B exprimand doar un singur tip de lanf greu si un singur tip de lanf usor. Reglarea expresiei genelor pentru imunoglobuline garanteaza monospecificitatea moleculelor de anticorpi si este explicafia fenomenului de excluzie alelica. Limfocitele B imature pot fi eliminate sau inactivate prin contactul cu forme multimerice ale moleculelor self (liganzi multivalenfi). Antigenele self din maduva osoasa pot induce delefia sau inactivarea celulelor B imature. Celulele B imature cu receptori IgM care recunosc antigene self ubicuitare de pe suprafafa celulara sunt deletate. Aceste celule mor prin apoptoza. Mecanismul de inducere a
toleranfei la self in limfocitele B este numit deletie clonala.

Limfocitele B imature care leaga antigene self solubile sunt facute anergice (incapabile sa raspunda) la antigen. Mecanismul de inducere a toleranfei la self este denumit anergic Majoritatea limfocitelor B necesita pentru activare prezenfa celulelor T helper si in absenta helpul de la celulele T, limfocitele B nu pot sa prolifereze si sa se diferenfieze in celule secretoare de anticorpi.
Un subset de celule B apare precoce in ontogenie, are un repertoriu al receptorilor pentru antigen diferit si propietafi funcfionale distincte. Aceste celule B sunt caracterizate de prezenta pe suprafafa a unei mulecule CD5 si exprima pe suprafafa IgM cu nivele foarte mici sau fara IgD. Molecula CD5 are drept ligand proteina CD72, expresia CD5 pe limfocitele B are rolul de a stimula interacfiunile dintre celulele B.

Exista putine limfocite B CD5 + in ganglionii limfatici si in splina, dar celulele B CD5 + constituie populafia predominanta de limfocite B in cavitatea peritoneala. La adult, celulele B CD5+ persita prin autoreplicare la nivelul fesuturilor limfatice periferice, unde pot fi sursa unei tumori maligne leucemia limfatica cronica cu celule B. Limfocitele B se gasesc in maduva hematopoietica, sange, organele limfatice si in limfa. La adult, limfocitele B se dezvolta in maduva osoasa, migreaza prin intermediul sangelui in organele limfatice, unde patrund traversand venulele cu endoteliu inalt in cortexul organelor limfatice.

In absenta antigenului, limfocitele B migreaza prin foliculii primari si se intorc in circulatie prin intermediul sistemului limfatic, care comunica cu torentul sanguin prin ductul toracic.
In prezenja antigenului, celulele B sunt activate de catre limfocitele T helper si formeaza focare primare de celule care prolifereaza si apoi migreaza pentru a forma centrul germinal al foliculilor secundari. Imunitatea umorala este mediata de anticorpii produsi de celulele din lineajul B. Functia anticorpilor este de a neutraliza si elimina diferite antigene prin mecanisme efectorii diverse, dependente de izotip

12.1. Receptorul pentru antigen al limfocitelor B (BCR) Limfocitele B recunosc antigenele prin intermediul imunoglobulinelor prezente pe suprafata celulara. Imunoglobulinele de suprafata (membranare) prezinta un domeniu transmembranar hidrofob de aproximativ 25 de aminoacizi si o scurta coada citoplasmatica care confine doar 3 aminoacizi.
3

Curs 5 imunologie

Cozile citoplasmatice scurte ale imunoglobulinelor membranare nu pot transduce

semnalele generate de legarea incrucisata a Ig de suprafata de catre antigen. Functia de transducere a semnalului este preluata de Iga si Ig, care prezinta cate un domeniu extracelular, cu structura similara domeniilor imunoglobulinice si cate o coada citoplasmatica lunga, care confine secvente IT AM. Fosforilizarea secventelor ITAM la nivelul tirozinei reprezinta prima etapa a cascadei de semnalizare intracelulara declansata de recunoasterea antigenului de catre celulele B. Moleculele Iga si IgP sunt necesare pentru expresia pe suprafata a limfocitelor B a Ig membranare, cu care formeaza complexul receptor pentru antigen al celulei B (BCR). Legarea incrucisata de catre antigen a receptorului al limfocitelor T induce urmatoarele raspunsuri functionale:

Intrarea celulelor in faza Gi a ciclului celular Cresterea expresiei moleculelor MHC si a co-stimulatorilor (b7-l si B7-2), datorita carora
limfocitele B stimulate antigenic pot prezenta antigene limfocitelor T helper activandu-le Creste exprsia unor receptori pentru citokine produse de limfocitele T, care permit raspunsul limfocitelor B antigen-specifice sa raspunda la semnalele furnizate de celulele T helper. Toate aceste raspunsuri sunt rezultatul transmiterii intracelulare a semnalului generat de interacfiunea BCR cu antigenul specific.

12.2.Evenimentele biochimice intracelulare ale activarii limfocitelor B Receptorul pentru antigen al limfocitelor B este asociat cu protein tirozin kinaze din familia src, numite Fyn, Blk, Lyn. Legarea antigenului la imunoglobulinele de suprafata determina
agregarea complexului receptor pentru antigen al limfocitului B, ceea ce permite kinazelor asociate receptorului sa fosforileze secvenfele ITAM ale lanfurilor Iga si Ig. Reziduurile de fosfotirozina permit atasarea la ITAM prin domeniile SH2 a protein kinazei numita Syk (poate fi fosforilata de catre kinazele asociate BCR, fund activata). Activarea kinazelor asociate receptorului pentru antigen al limfocitelor B (Fyn, Blk, Lyn) este realizata prin defosforilarea situsului inhibitor de catre domeniul citoplasmatic fosfatazic al CD45. Activarea Syc induce la randul ei activarea fosfolipazei C-y (PLC-y) si a Ras.

PLC-ycatalizeaza clivarea fosfatidilinozitol bifosfatului (PIP2) din membrana plasmatics in inozitol trifosfat (IP3) si diacilglicerol (DAG). IP3 mobilizeaza Ca2+ de la nivelul depozitelor intracelulare si induce deschiderea canalelor de calciu din membrana. Ca 2+ poate sa se cupleze cu calmodulina si acest complex determina activarea calciurinei. DAG activeaza protein kinaza C (PKC), care fosforileaza o serie de proteine la nivelul reziduurilor de serina sau treonina, activandu-le, in prezenfa unor nivele mari de Ca2+.
Consecinfa diferitelor cai de transmitere a semnalului este activarea unor factori transcripfionali, care declanseaza expresia unor gene ale limfocitelor B stimulate antigenic. Produsii acestor gene sunt necesari proliferarii si diferenfierii celulelor B activate. Receptorul pentru antigen al limfocitelor B este modulat de un complex co-receptor, format din 3 molecule: CD19, CR2 si TAPA-1. Complexul co-receptor al limfocitelor B este similar moleculelor CD4 sau CD8 ale limfocitelor T.

12.3. Producerea anticorpilor de catre limfocitele B Activarea limfocitelor B naive necesita semnale accesorii, care pot fi livrate de catre limfocitele T helper, fie direct de catre unii constituienti microbieni. Antigenul proteic este legat de catre imunoglobulina de suprafata, este semnalizat si procesat in
interiorul celulei B, pentru ca in final sa fie exprimat pe suprafata sub forma de peptide prezentate in cupa MHC II. Antigenele proteice nu pot induce activarea limfocitelor B si producerea de anticorpi la indivizii la care timusul nu se dezvolta si sunt numite antigene timus-depedente (antigene TD).

Curs 5 imunologie

Multi constituienti microbieni (polizaharidele bacteriene) pot induce direct activarea limfocitelor B si producerea anticorpilor,. In absenta celulelor T helper. Aceste antigene microbiene sunt denumite Antigene timusindependente (antigene TI). 12.4. Raspunsul limfocitelor B la antigene T-dependente Producerea anticorpilor fata de antigene proteice presupune recunoasterea antigenului detatre celulele T helper si cooperarea bidirecfionala dintre limfocitele B antigen-specifice si limfocitele T. Limfocitele B antigen-specifice leaga antigenul nativ prin intermediul imunoglobulinelor de suprafata. Limfocitele B functioneaza ca celule prezentatoare de antigen (APC), complexele peptid: MHC II fiind recunoscute de limfocitele T helper CD4+ specifice. Simultan cu procesarea si prezentarea antigenului, limfocitele B sunt activate prin semnalul inifiat de interacfiunea imunoglobulinelor membranare cu antigenul. Activarea celulelor B este indusa prin stimuli generati prin contactul fizic cu limfocitele T helper si prin factori solubili (citokine) secretafi de catre celulele T. Contactul fizic dintre limfocitele B specifice fata de antigenul nativ si limfocitele T helper
specifice fata de peptide derivate din procesarea antigenului este mediata de interacfiunea unor multiple pereche ligand-receptor. B7:CD28 si CD40:CD40L sunt alte doua perechi ligand-receptor critice pentru activarea limfocitelor. Recunoasterea antigenului de catre limfocitele B induce cresterea expresiei co-stimulatorilor (B7-1, B72). Moleculele co-stimulatoare interacfioneaza cu CD28 de pe celulele T specifice pentru complexele peptid: MHC II prezente pe suprafata limfocitelor B. Dupe activare, celulele T vor exprima o molecule CD40L, care interactioneaza cu molecula CD40 exprimata constitutional de limfocitele B. Interactiunea CD40L cu CD40 are drept rezultat oligomerizarea moleculelor CD40, care induce asocierea unor proteine citoplasmatice (TRAF) la domeniile carboxi-terminale ale CD40. TRAF sunt activate si vor induce activarea si translocarea Tn nucleu a unor factori transcriptional care declanseaza proliferarea si diferenfierea celulelor B.

12.5. Rolul citokinelor secretate de celulele T helper in activarea limfocitelor B. Citokinele secretate de limfocitele T helper indu ce comutarea izotipului anticorpilor produsi
de celulele B. Diferitele citokine secretate de limfocitele T helper indue comutarea selective la anumite clase de imunoglobuline. IL-6, de exemplu, produsa de celulele T, macrofage si alte celule, este un factor de crestere pentru limfocitele B care s-au diferendat deja in plasmocite producatoare de anticorpi. Limfocitele T helper regleaza atat producerea anticorpilor de catre limfocitele B, cat si izotipul care detremina Tn final funcfiile efector ale anticorpilor produsi.

12.6. Reactiile din centrul germinal: maturarea de afinitate si generarea celulelor B cu memorie. Generarea de anticorpi cu mare afinitate si a celulelor B cu memorie fate de antigene proteice are loc in centrii germinali din organele limfatice secundare. Centrul germinal reprezinta un micromediu specializat, in care are loc proliferirarea celulelor B, hipermutatia somatica si selecfia afinitefii
de legare a antigenului. Limfocitele B care au fost activate de celulele T helper in aria T-dependente a organelor limfatice secundare, pot sa migreze la nivelul corzilor medulare (sa se diferentieze in plasmocite cu scurte durate de viate, care secrete IgM sau IgG), sau sa migreze Tmpreuna cu celulele T care le-au activat in interiorul foliculilor primari adiacenti (sa se prolifereze rapid, formand centrii germinali). Foliculii primari confin celule B in repaus grupate i ntr-o refea densa formate de prelungirile celulelor foliculare dendritice (FDC - nu exprima MHC II, exprima receptori pentru complement si receptori Fc). Limfocitele B care prolifereaza in centrii germinali se divid rapid si se numesc centroblasti. Centroblastii formeaza zona intunecate a centrul germinal. Pe masura ce se matureaza, celulele nu se mai divid si devin celule mici, numite centrocite, care formeaza zona clara a centrului germinal. Restul limfocitelor B din folicul care nu sunt specifice pentru antigen si care nu se divid, sunt impinse la periferie si vor forma zona manta.

La nivelul genelor pentru imunoglobuline ale centroblastilor care se divid in centrii germinali survine hipermutatia somatica, are loc acumularea secventiala de mutatii in genele
5

Curs 5 imunologie

rearanjate pentru regiunea variabila a anticorpilor. Receptorii mutanti rezultati sunt exprimati pe suprafafa centrocitelor rezultate prin diviziunea centroblastilor. In centrul germinal vor fi vizibile zone intunecate (unde se gasesc grupati centroblastii si exista cateva FDC) si zona clara (unde centrocitele fac contact cu numeroase FDC). Pentru a fi salvate de la apoptoza, centrocitele trebuie sa exprime
receptori cu afinitate progresiv crescanda pentru antigen - baza maturarii afinitafii anticorpilor pentru antigen. In timp ce aceste procese se desfasoara in organele limfatice, anticorpii care au fost sintetizafi precoce si secretafi in circulafie, leaga molecule reziduale de antigen si pot activa cascada complementului. Unele celule B nu se diferenfiaza in plasmocite secretoare de anticorpi, dar capata capacitatea de a supraviefui un timp indelungat, aparent in absenfa stimularii antigenice si circula liber in sange, fesuturi limfatice si centrii germinali. Acestea sunt celule B cu memorie, capabile a declanseze rapid raspunsul imun la contactele ulterioare cu acelasi antigen. Interacfiunile dintre CD40 si CD40L sunt necesare formarii centrilor germinativi, fapt demonstrat prin absenfa centrilor germinali la indivizii deficienfi in oricare din aceste doua molecule.

12.7. Raspunsul limfocitelor B la antigene T-independente Antigenele TI care activeaza limfocitele B sunt antigenele TI-1 si antigenele TI-2
Antigenele TI-1 prezinta capacitatea intrinseca de a induce direct proliferarea celulelor B. Prin fenomenul de activare policlonala aceste molecule determina proliferarea si diferenfierea limfocitelor B, indiferent de specificitatea receptorilor lor pentru antigen. Antigenele TI-1 se mai numesc si mitogeni ai limfocitelor B datorita caracteristicii lor de a stimula dividerea limfocitelorB. Ca antigene TI-1 functioneaza lipopolizaharidul bacterian (LPS) si constituienfi din Brucella abortus. Antigenele TI-2 prezinta epitopi inalt repetitivi. Antigenele IL-2 indue activarea limfocitelor Bmature specifice prin legarea incrucisata excesiva a imunoglobulinelor de suprafafa. Densitatea epitopilor este critica pentru activarea limfocitelor B de catre antigenele TL-2: o cantitate prea mica de epitopi este insuficienta pentru legarea incrucisata a receptorilor si activarea celulelor B; o densitate prea mare a epitopilor induc energia limfocitului B.