CITOMETRIA DE FLUX.

DETECTAREA MARKERILOR DE SUPRAFATA

SI CITOPLASMATICI IN IMUNODEFICIENTE (CUANTIFICAREA
SUBSETURILOR LIMFOCITARE SI ALE ALTOR CELULE,
IMUNOFENOTIPARE IN BOLI LIMFOPROLIFERATIVE, ANALIZA
CICLULUI CELULAR AND, CITOTOXICITATE)

Celulele sistemului imun sunt: limfocitele T, limfocitele B, celulele NK, granulocitele,

macrofagele/monocitele, fibrobaştii, celulele epiteliale, celulele dendritice

Celulele prezentatoare de antigen (APC) reprezintă un grup de celule heterogen din punct de
vedere morfologic şi funcţional, provin din precursori medulari şi sunt specializate în a prezenta
antigenele limfocitelor, în special celulelor T. Aceste celule profesionale prezentatoare de antigen
includ monocite (prezente în sângele periferic), macrofage (monocite tisulare), celule rezidente de
la nivelul organelor limfoide ale sistemului imun (celule dendritice) şi constituenţi ai sistemului
monoci-tmacrofag din alte organe solide. Caracteristica definitorie a acestor celule este
exprimarea moleculelor MHC I şi II pe suprafaţa lor, precum şi a moleculelor accesorii necesare
pentru activarea limfocitelor T: CD86 şi CD80. Imediat după activare, APC pot să secrete citokine
care induc funcţii specifice în celulele cărora le prezintă antigenul.

Moleculele de legare a antigenelor, prin capacitatea lor de a lega antigenele străine organismului
uman, sunt responsabile de specificitatea răspunsului imun dobândit. Există trei seturi de astfel de
molecule: imunoglobuline (Ig), receptorul celulelor T (TCR) şi moleculele MHC, toate aceste
molecule facând parte din superfamilia de imunoglobuline (IgSF). Ig sunt exprimate pe suprafaţa
limfocitelor B şi secretate ca anticorpi în cadrul răspunsului imun umoral. Majoritatea limfocitelor
T exprimă αβ-TCR. Genele HLA situate pe cromozomul 6 codifică moleculele complexului major
de histocompatibilitate MHC I şi II.
Limfocitele T care exprimă pe suprafaţa lor receptori αβ-TCR pot fi divizate în două subpopulaţii
majore. Această împărţire este bazată pe clasa de molecule MHC recunoscută de receptorii αβ-
TCR şi de expresia moleculelor CD4 sau CD8, care prin ataşarea de moleculele MCH contribuie
la completarea legăturii molecular intercelulare. În timp ce limfocitele CD4 recunosc antigenul
legat de moleculele MHC I, limfocitele CD8 recunosc antigenul legat de moleculele MCH II;
raportul limfocitelor CD4/CD8 în sângele periferic este aproximativ 2:1. Toate celulele nucleate
exprimă molecule MHC I şi sunt APC nonprofesionale,
APC profesionale exprimând molecule MHC II. Interacţiunea dintre complexul MHC, peptidul
antigenic şi TCR deţine un rol esenţial în protecţia imună, deoarece un răspuns imun complet
necesită intervenţia celulelor T antigen specifice. Acesta reprezintă practic un mecanism de
siguranţă pentru a minimaliza posibila auto-reactivitate (reactivitate împotriva self-ului), astfel
încât un limfocit T devine activat numai pentru că a întâlnit un antigen străin (non-self).
Limfocitele B provin din celulele stem hematopietice care, diferenţierea finală spre celulele B
necesită ca celulele fiice PLC (precursori limfoizi comuni) să fie expuse unor micromedii
specializate, aşa cum sunt cele prezente în ficatul fetal şi măduva osoasă. Trecerea de la ficatul
fetal la măduva osoasă începe la mijlocul vieţii fetale şi se termină chiar înainte de naştere;
celulele B continuă să fie produse în măduva osoasă pe parcursul întregii vieţi.
Diferenţierea celulelor B are loc în două stadii, diferite din punct de vedere anatomic şi funcţional;
astfel, primul stadiu are loc în măduva osoasă şi este antigen independent, iar cel de-al doilea
stadiu are loc în organele limfoide periferice şi este antigen dependent.
Limfocitele B imature, care exprimă pe suprafaţa lor mIgM (imunoglobulină de membrană) şi
BCR (receptorul celulei B), părăsesc măduva osoasă după un proces de selecţie negativă a
celulelor B auto-reactive şi pătrund în periferie (sânge şi organe limfoide secundare) unde îşi
completează diferenţierea în celule B mature care exprimă pe suprafaţa lor mIgM şi mIgD şi pot fi
activate prin legarea de antigen.
Celulele B imature auto-reactive, ce exprimă mIgM self-reactiv, urmează un proces cunoscut ca
“receptor editing“, în care un rearanjament la nivelul genelor care codifică lanţul greu al
imunoglobulinelor (IgH) modifică specificitatea antigenică a receptorului. Dacă acest proces
eşuează, celulele B imature autoreactive devin anergice sau vor suferi apoptoză în urma
contactului cu antigenul. Aceasta contrastează cu abilitatea celulelor B mature de a deveni activate
în urma contactului antigenic.
Limfocitele B vor prezenta antigenul, recunoscut cu ajutorul BCR, limfocitelor T helper CD4
care au fost activate anterior de acelaşi antigen, limfocitele T helper fiind selectate din pool-ul de
limfocite T naive de către celulele dendritice prezentatoare de antigen. Acest process de activare a
limfocitelor B, dependent de limfocitele T, are loc prin interacţiunea dintre CD40 de pe suprafaţa
celulelor B şi ligandul său, CD145, de pe suprafaţa celulelor T helper şi prin secreţia de
interleukină-4 (IL-4) de către celulele helper. Ambele semnale servesc la promovarea şi
menţinerea activării iniţiate de BCR.
După proliferare şi maturaţie, celulele B din centrul germinativ se pot diferenţia în plasmocite de
lungă durată şi celule B de memorie. Majoritatea plasmocitelor de lungă durată migrează în
măduva osoasă şi sunt răspunzătoare de menţinerea nivelului seric de anticorpi (anticorpi de înaltă
afinitate); celulele B de memorie pot rămâne pentru o lungă perioadă de timp la nivelul organelor
limfoide secundare sau pot migra şi habita în măduva osoasă. În urma contactului antigenic,
celulele B de memorie răspund printr-o proliferare rapidă şi diferenţiere în plasmocite, refăcând
astfel rezerva de celule B de memorie şi plasmocite.
Prin dezvoltarea tehnologiei anticorpilor monoclonali, analiza anumitor molecule de pe suprafaţa
celulelor B (CD = “cluster determinants”) a ajutat la definirea stadiilor care se succed pe parcursul
întregului proces de diferenţiere şi maturaţie a celulelor B

Limfocitele T citotoxice (CTL) şi celulele NK

Aceste două tipuri celulare, distincte din punct de vedere fenotipic, dar strâns legate prin funcţia
lor citolitică (“killer”), sunt importante atât în controlul infecţiilor, cât şi în identificarea şi
eliminarea celulelor tumorale. Celulele CTL sunt limfocite T CD8+ care îşi îndeplinesc funcţia de
“killer“ prin două căi majore: liza mediată de perforine şi granzime ce sunt eliberate din lizozomi
şi apoptoza receptor indusă (TNFR), ambele căi necesitând un contact apropriat între celula litică
şi ţinta sa, în special prin interacţiunea dintre TCR şi moleculele MHC I. Răspunsul CTL la o
infecţie acută are loc în trei faze:
- prima constă în activarea iniţială şi proliferarea CTL;
- a doua în contracţia celulelor T efectoare în celule T de memorie;
- a treia fază se referă la menţinerea de lungă durată a pool-ului de celule T de memorie.
Procesul infecţios conduce la o creştere dramatică a CTL patogen/antigen specifice, iar
magnitudinea acestui proces depinde de natura infecţiei şi de inoculul/doza de antigen. Această
expansiune este urmată de contracţia CTL efectoare în celule T de memorie. Un procent de 5%
din populaţia celulelor efectoare expansionate supravieţuieşte sub forma celulelor de memorie de
lungă durată.
Compartimentul CTL de memorie este compus din două tipuri celulare: CTL de memorie-
efectoare (Tem) şi CTL de memorie-centrale (Tcm), acestea din urmă fiind capabile de o auto-
reînnoire antigenindependentă homeostatică prelungită. La întâlnirea cu antigenul, aceste celule
dobândesc rapid funcţia efectoare şi fenotipul celulelor Tem. Celulele CD4 şi citokinele IL-15, IL-
7, IL-2 şi GM-CSF (factorul de stimulare al coloniilor pentru granulocite şi monocite) au un rol
important în supravieţuirea şi menţinerea rezervei de CTL de memorie.
În final, activitatea citotoxică a CTL are loc prin două mecanisme:
• citolitic: dependent de producţia de granzime (A, B) şi perforine;
• non-citolitic: dependent de producţia de citokine (IFNγ şi TNF-α) care au capacitatea de a inhiba
proliferarea agenţilor patogeni intracelulari11;12.
36
Celulele NK aparţin liniei celulare limfoide şi sunt implicate în răspunsul imun înnăscut. În
comparaţie cu CTL, celulele NK sunt de talie relativ mare, granulare şi nu necesită pre-activare
pentru a recunoaşte şi a liza celule tumorale sau aberante. De asemenea nu au nevoie de prezenţa
moleculelor MHC I. Aceste celule sunt capabile să producă cantităţi importante de citokine şi
chemokine, care le permit să moduleze răspunsul imun. IL-15 este necesară pentru a menţine
nivelul homeostatic al celulelor NK în organism, activitatea de „killer” fiind exercitată în acelaşi
mod ca şi în cazul CTL.
Receptorii celulelor NK sunt clasificaţi în activatori şi inhibitori şi apartin la două familii
importante de receptori: killer cell immunoglobulin-like (KIR) şi lectin-like. Prin receptorii
inhibitori celulele NK recunosc moleculele MHC I de pe suprafaţa celulei ţintă şi primesc astfel
un semnal inhibitor - nokilling; prin receptorii activatori recunosc liganzi celulari, virali sau induşi
de stres, care transmit un semnal activator - pro-killing. În cazul în care o celulă ţintă nu exprimă
moleculele MHC I pentru a evita acţiunea citolitică a CTL, aceasta va fi distrusă de către NK.
NK sunt de obicei definite prin intermediul unei combinaţii de markeri de suprafaţă celulară (CD):
CD3-, CD16+, CD56+. Astfel pot fi clasificate în două subseturi, în funcţie de exprimarea CD16
şi CD56:
• NKCD56dimCD16bright reprezintă >90% din NK din sângele periferic, exprimă nivele mari de
KIR şi activitate citotoxică/citolitică mare (secreţie crescută de perforine/granzime);
• NKCD56brightCD16dim se caracterizează printr-o producţie mai mare de citokine, potenţial
proliferativ mai înalt şi reprezintă principala populaţie celulară NK de la nivelul organelor
limfoide secundar.
Celulele T helper-CD4
Iniţial, celulele T nu exprimă TCR şi sunt CD3-/CD4-/CD8- (triplu negative). Etapele de
diferenţiere timică includ stadiile:
• preTCR CD3+/CD4-/CD8- (dublu negative);
• TCR CD3+/CD4+/CD8+ (dublu pozitive);
• în ultima etapă, celulele T al căror TCR recunoaşte antigenul prezentat de moleculele MHC II
devin TCR CD3+/CD4+, iar cele al căror TCR recunoaşte antigenul prezentat de moleculele
MHC I devin TCR CD3+/CD8+.
Celulele T naive, pozitive pentru un singur CD (CD4 sau CD8) părăsesc timusul şi recirculă din
sânge în ariile timus-dependente (TDA) ale organelor limfoide secundare. În majoritatea
răspunsurilor imune, activarea celulelor T CD4+ are loc în TDA ale organelor limfoide secundare,
iar celulele prezentatoare de antigen sunt reprezentate de celulele dendritice.
Prezentarea eficientă a antigenului non-self stimulează activarea, proliferarea şi diferenţierea
limfocitelor CD4+ în trei categorii funcţionale:
- cellule CD4+ cu activitate proinflamatorie,
- celule CD4+ cu activitate reglatoare/antiinflamatorie
- celule CD4+ ce funcţionează ca celule de memorie.
Diferenţierea dintre celulele T naive, efectoare şi de memorie se face baza moleculelor exprimate
pe suprafaţa lor.
Celulele CD4+ efectoare sunt cele care susţin procesele inflamatorii prin eliberarea de citokine,
fiind divizate în trei categorii: Th1 , Th2, Th1711;12.

Celulele T reglatoare (Treg)

Pentru a preveni răspunsurile imune auto-distructive şi a permite cele protective împotriva
antigenelor non-self, sistemul imun a dezvoltat o serie de mecanisme reglatoare care au rolul de a
inhiba generarea de limfocite T şi B self-reactive potenţial dăunătoare - toleranţa imună centrală -
şi de a scădea activarea celulară şi expansiunea limfocitelor atunci când acestea întâlnesc antigene
self -toleranţa imună periferică.
Au fost descrise mai multe tipuri de celule T cu activitate reglatoare: celule T TCRγδ +, celule
NK, limfocite T CD8+ şi limfocite T CD4+.
Celulele T CD4+ reg pot fi divizate în două categorii: celulele Treg care apar natural (generate în
timus) şi celulele Treg induse (Treg 1 care secretă IL-10, Th3 care secretă TGFβ), diferenţiate din
celulele T naive.

Celulele T de memorie
Nivelul protecţiei imune se corelează cu numărul de celule T de memorie antigen specifice. În
cursul infecţiei primare există o expansiune importantă a rezervei de celule T CD4+ şi celule T
CD8+ specific antigenului patogen.
Celulele T de memorie pot fi clasificate în: celule T centrale de memorie şi celule T efectoare de
memorie.
Celulele T de memorie CD4+ şi CD8+ îşi pot păstra responsivitatea lor rapidă în absenţa
stimulului antigenic şi sunt capabile să confere o imunitate protectivă.
17DE 17
ALERGOLOGIE ŞI IMUNOLOGIE
Profilul imun de bază şi recomandări pentru efectuarea acestui test
În cadrul profilului de bază sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută principalele
subseturi de limfocite implicate în răspunsul imun, prin identificarea markerilor de suprafaţă
specifici
(moleculele CD):
- limfocitele T totale (CD3+);
- limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
- limfocitele T supresoare/citotoxice (CD3+/CD8+);
- raportul CD4+/CD8+;
- limfocitele T imature CD3+/CD8+/CD4+ ;
- limfocitele B (CD19+);
- celulele NK (CD3-/CD16+/CD56+);
- limfocitele T activate (HLA DR+/CD3+).
Profilul de bază este suficient pentru excluderea defectelor imune celulare cantitative.
Determinarea subseturilor limfocitare este utilă atât pentru clasificarea şi diagnosticul
imunodeficienţelor primare cât şi pentru evaluarea şi monitorizarea pacienţilor cu infecţie HIV.
Imunodeficienţele primare rezultă ca urmare a unor defecte congenitale ale sistemului imun. Acest
test stabileşte dacă anumite subseturi limfocitare sunt reduse sau absente pentru a susţine
diagnosticul de imunodeficienţă celulară numerică. Imunodeficienţele cauzate de disfuncţii
celulare pot fi detectate prin testul de transformare limfoblastică (LTT).
Imunodeficienţele datorate generării defectuoase a limfocitelor T (de exemplu, sindromul
DiGeorge) se caracterizează prin pierderea completă sau reducerea limfocitelor T CD3+.
În cazul pacienţilor cu infecţie HIV determinarea limfocitelor T CD4+ este utilă pentru
stadializarea infecţiei HIV, stabilirea momentului începerii terapiei antiretrovirale precum şi a
terapiei împotriva infecţiilor oportuniste, pentru monitorizarea progresiei bolii şi a răspunsului la
tratament.
Specimen recoltat - sânge venos.
Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant.
Volum probă – 5 mL sânge.
Stabilitate probă - sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează
testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea
probei.
Cauze de respingere a probei - specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe
refrigerate sau congelate
Metodă - citometrie în flux.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei
pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute
Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de
factori biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile
circadiane au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp
ce limfocitele CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în
cursul după-amiezei. Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a
populaţiilor limfocitare se recomandă ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al
zilei.

Imunofenotiparea prin citometrie în flux (IFCF) reprezintă un instrument indispensabil

pentru diagnosticul, clasificarea, stadializarea şi monitorizarea neoplaziilor hematologice.
Recomandări privind indicaţiile medicale ale testării prin citometrie în flux, în următoarele situaţii
clinice:
- citopenii, în special bicitopenia şi pancitopenia;
- număr crescut de leucocite, incluzând limfocitoza, monocitoza şi eozinofilia;ŞI IMUNOLOGIE
- prezenţa de celule atipice sau blaşti în sângele periferic, măduva osoasă sau alte lichide ale
corpului;
- plasmocitoza sau gamopatia monoclonală;
- organomegalia şi masele tisulare.
În aceste situaţii imunofenotiparea poate constitui un screening sensibil pentru prezenţa/absenţa
unei neoplazii hematologice. În plus, citometria în flux este un instrument util în stadializarea unei
neoplazii limfoide diagnosticate anterior, în monitorizarea răspunsului la tratament incluzând
detectarea bolii minime reziduale, în documentarea recăderii sau progresiei şi în diagnosticul unei
malignităţi hematologice intercurente.
În malignităţile hematologice mai mulţi paşi sunt urmaţi în aplicarea şi interpretarea informaţiei
imunofenotipice:
1. identificarea celulelor din linii diferite şi determinarea dacă acestea sunt mature sau imature;
2. detectarea celulelor anormale prin identificarea expresiei antigenice care diferă semnificativ de
normal;
3. documentarea detaliată a fenotipului populaţiei celulare anormale (adică prezenţa sau absenţa
antigenelor) şi, prin comparaţie cu populaţia normală, documentarea unei creşteri sau scăderi a
intensităţii colorării cu anticorpi marcaţi cu fluorocromi;
4. evaluarea faptului dacă informaţiile obţinute sunt diagnostice pentru o anumită boală, iar dacă
nu, stabilirea unei liste de entităţi posibile cu sugerarea unor studii suplimentare ce pot avea
valoare diagnostică, cum ar fi imunohistochimie (IHC), citogenetică, FISH sau studii moleculare;
5. furnizarea de informaţii imunofenotipice ce pot avea valoare prognostică suplimentară,
incluzând identificarea de ţinte pentru o potenţială terapie ţintită.
Atunci când se primeşte o probă pentru testare prin citometrie în flux, se stabilesc liniile celulare
şi antigenele ce trebuie evaluate pe baza tipului de probă şi alte informaţii disponibile, cum ar fi:
indicaţia medicală pentru testare, istoricul clinic, elementele morfologice, testările anterioare prin
citometrie în flux, rezultatele altor teste de laborator, precum şi rezultatele unei eventuale testări
preliminare sceening prin citometrie în flux. Pentru indicaţiile medicale identificate de grupul
Bethesda s-a stability un consens privind liniile celulare care trebuie evaluate şi antigenele incluse
în evaluarea primară a fiecărei linii.LOGIE ŞI IMUNOLOGIE 17
Este furnizat de asemenea un set secundar de reactivi potrivit pentru caracterizarea în situaţii
specifice, dar numai un număr limitat dintre aceştia va fi utilizat într-un caz particular. De
menţionat faptul că în condiţii practice specifice poate fi necesară înlocuirea anumitor reactivi
între cele două paneluri pentru adaptarea la o anumită populaţie de pacienţi sau o anumită
prevalenţă a bolilor, dar numărul total al reactivilor utilizaţi trebuie să rămână acelaşi.
În prezent imunofenotiparea limfocitelor din sângele periferic este utilizată în mod comun în
evaluarea pacienţilor cu limfocitoză susţinută pentru determinarea naturii sale reactive sau
maligne.

NEOPLAZIILE LIMFOIDE MATURE

Acestea includ leucemia limfocitară cronică şi limfoamele non-Hodgkin, recunoscute după un

fenotip care este similar celulelor limfoide mature normale (cum ar fi prezenţa Ig de suprafaţă pe
celulele B mature) şi lipsa trăsăturilor antigenice de imaturitate (cum ar fi expresia TdT, CD34 şi
intensitate scăzută a expresiei CD45). Prin identificarea antigenelor asociate liniei celulare,
neoplaziile limfoide mature pot fi împărţite în neoplazii ale liniei celulare B, T sau NK.

Neoplaziile limfoide cu celulă B matură

Citometria în flux este indispensabilă pentru diagnosticul neoplaziilor limfoide cu celulă B
matură, prin identificarea celulelor anormale fenotipic aparţinând liniei celulare B şi recunoaşterea
fenotipurilor caracteristice diferitelor entităţi. Multe cazuri de posibil limfom cu celulă B sunt
evaluate iniţial prin imunofenotiparea sângelui periferic şi/sau aspiratului de măduvă osoasă
înaintea efectuării biopsiei tisulare. Limfoamele cu celulă B identificate astfel sunt adesea
încadrate în spectrul larg al bolilor limfoproliferative cronice cu celulă B (BLPC-B)
În plus citometria în flux poate fi utilizată pentru identificarea expresiei unor ţinte pentru terapia
cu anticorpi şi furnizarea de informaţii prognostice suplimentare. De asemenea, în urma terapiei,
citometria de flux constituie metoda stabilită pentru evaluarea bolii minime reziduale .
Celulele limboide B mature neoplazice pot fi distinse de celulele normale prin identificarea a 2
tipuri principale de anomalii fenotipice: restricţia clasei lanţurilor uşoare de Ig şi expresia
aberantă de antigene.
În mod tipic, leucemia limfocitară cronică (CLL) prezintă o intensitate scăzută a colorării pentru
Ig de suprafaţă. Unele celule B nu prezintă Ig de suprafaţă, acestea incluzând limfoblaştii,
plasmocitele şi celulele B timice, precum şi corespondentele lor neoplazice: leucemia acută
limfoblastică, neoplaziile plasmocitare şi limfomul cu celulă B mediastinal primar.
Rezultate fals negative pentru Ig de suprafaţă se pot datora interferenţei Ac solubili cu legarea Ac
de detecţie sau alterării/deleţiei epitopilor recunoscuţi, datorate de exemplu mutaţiilor
hipersomatice din limfomul folicular.
Prin IFCF se poate identifica expresia aberantă de antigene la nivelul celulelor B. Expresia CD5 la
nivelul celulelor B este în general raportată ca un fenotip aberant, dar există populaţii mici de
cellule B normale mature CD5+, aflate de obicei în sângele periferic, dar şi la nivelul ganglionilor
limfatici, în special la pacienţii cu boli autoimune. Expresia CD5 a fost raportată şi la nivelul unor
precursori normali ai celulelor B din măduva osoasă. Astfel expresia CD5 trebuie interpretată în
corelaţie cu alte anomalii, incluzând restricţia lanţului uşor de Ig sau alterarea intensităţii colorării
CD20, CD22 şi CD79b.
Imunofenotiparea prin citometrie în flux este în mod particular utilă pentru subtiparea
limfoamelor/leucemiilor cu celulă B compuse predominant din celule mici

 Expresia aberantă a CD5 este caracteristică pentru CLL/SLL şi MCL, care prezintă manifestări
superpozabile. Coexpresia omogenă a CD5 şi CD23 de către o BLPC-B, atunci când este
însoţită de colorarea slabă atât pentru sIg cât şi pentru CD20, CD22, CD79b, iar FMC-7-
prezice CLL/SLL cu specificitate înaltă
 LExpresia CD10 la IFCF se corelează puternic cu diagnosticul tisular de limfom folicular (FL)
sau limfom difuz cu celulă mare B (DLBCL), urmate de limfomul Burkitt (BL). Expresia
CD10 în alte tipuri de limfoame este neobişnuită, fiind foarte rară în LPL, MZL şi MCL. Pe de
altă parte CD10 este în mod normal exprimat de celulele B ale centrului folicular,
leucemia/limfomul limfoblastic cu precursor de celulă B, subseturi de celule T mature,
limfoblaşti precursori ce celulă T, neutrofile şi unele cellule nonhematolimfoide.
 E7HCL are un fenotip distinctiv care permite diagnosticul şi detecţia unor niveluri scăzute de
boală ulterior terapiei: CD20 intens, CD22 intens, CD11c intens, CD25+, CD103+, sIg
intermediar sau intens, FMC-7+, CD23-, CD5-, CD10-.
 LNeoplazii limfoide cu celulă B matură care să exprime atât CD5 cât şi CD10 sunt puţin
comune. Acest grup include, în ordinea incidenţei: DLBCL, FL, MCL, CLL/SLL, BL.
Evaluarea morfologică şi studii genetice (rearanjamentele genei BCL-2 în FL, tranlocaţia
t(11;14)(q13;q32) sau rearanjamentele genei CCND1 în MCL, translocaţiile MYC în BL) pot
fi necesare pentru stabilirea diagnosticuluiE
 Expresia CD38 şi ZAP-70 a fost raportată că ar avea valoare prognostică în CLL/SLL

Neoplaziile limfoide cu celulă T şi NK matură

IFCF poate contribui la diagnosticul şi clasificarea neoplaziilor limfoide cu celulă T şi NK matură,

însă adesea celulele T sau NK anormale fenotipic sunt mai dificil de identificat în comparaţie cu
celulele B mature anormale. Pe de altă parte clasificarea neoplaziilor cu celulă T şi NK este mai
puţin bine stabilită decât cea a neoplaziilor cu celulă B şi multe neoplazii rămân în categoria
limfomului cu celulă T periferică, nespecificat (PTCL,U). Clasificarea conform schemei curente
nu urmează un algoritm simplu şi necesită adesea asimilarea de informaţii diverse, incluzând
studii morfologice, imunohistochimice, citometrie în flux, citogenetică, FISH şi teste moleculare.
Neoplaziile cu celulă T/NK matură (periferică) sunt divizate în leucemice, cutanate şi
extraganglionare şi cele cu origine ganglionară.
Neoplasmele cu celulă T şi NK matură pot fi identificate prin IFCF pe baza detecţiei expresiei
antigenice aberante, spre deosebire de celulele B neexistând un marker surogat de clonalitate la fel
de fidel ca expresia kappa şi lambda. În plus expresia antigenică aberantă trebuie distinsă de
variaţiile fenotipice normale observate între multiplele subseturi de celule nonneoplazice.
Ocazional expresia antigenică aberantă poate consta în lipsa completă a colorării pentru unul sau
mai multe antigene pan-celulă T, CD5 şi CD7 fiind antigenele cel mai frecvent pierdute. Celulele
neoplazice CD7- trebuie distinse de o populaţie mică de celule T normale CD7- din piele şi sânge
care pot creşte în dermatoze benigne şi alte condiţii reactive.
Mai frecvent neoplaziile T şi NK demonstrează o alterare mai subtilă a colorării pentru antigene
decât lipsa completă a acestora, cele mai frecvente fiind colorarea celulelor T mai intensă sau mai
slabă pentru CD3 sau CD5, colorarea mai slabă a celulelor NK pentru CD2, CD7, CD56 şi CD57,
o expresie intensă mai omogenă a CD8 şi CD16 de către celulele NK.
Evaluarea prin IFCF a expresiei TCR V-β permite identificarea de populaţii restricţionate de
cellule T, dar, spre deosebire de testele PCR pentru rearanjamentele genei TCR care pot fi
efectuate atât pe specimene proaspete cât şi îngheţate şi fixate, acest test este laborios şi necesită
analizarea de preferinţă în 24 ore de la recoltare.
Celulele NK nu prezintă expresia TCR, pentru demonstrarea clonalităţii celulelor NK fiind
dezvoltată analiza prin citometrie în flux a expresiei receptoruui NK (NKR), incluzând receptorii
pentru Ig ai celulelor killer (KIR) şi complexul CD94/NKG2, care pot fi de asemenea aplicate
celulelor T citotoxice de memorie din leucemia cu limfocite mari granulare (LGL) cu celule T.

Neoplaziile cu ceulă T matură

Expresia CD4 şi CD8 poate fi utilizată pentru formularea unei liste de posibilităţi diagnostice şi
determinarea informaţiilor necesare pentru subclasificarea acestora.
▪ Neoplaziile CD4+/CD8- includ sindromul Sézary/limfomul cu celulă T cutanat (CTCL);
leukemia prolimfocitară cu celulă T (T-PLL); leucemia/limfomul cu celulă T al adultului (ATLL);
ALCL; limfomul cu celulă T angioimunoblastic (AITCL); PTCL, U; rar LGL. În primul rând vor
fi luate în considerare bolile care afectează primar sângele, incluzând sindromul Sézary/CTCL,
ATLL şi T-PLL.
▪ Cel mai frecvent neoplasm cu celulă T CD4-/CD8+ este T-LGL. În sângele periferic alte entităţi
care trebuie luate în considerare sunt PTCL,U CD8+, o mică proporţie din PLL şi rar
CTCL/sindromul Sézary. În splină şi alte situsuri extraganglionare diagnosticul diferenţial include
şi limfomul cu celulă T subcutanat panniculitis-like (SPTCL), rar limfomul cu celulă T
hepatosplenic (HSTCL) şi limfomul cu celulă T γ/δ nonhepatosplenic.
▪ Expresia duală CD4+/CD8+ este neobişnuită în limfoamele cu celulă T matură şi trebuie să
ducă la considerarea ALL cu precursor de celulă T. Cel mai caracteristic neoplasm limfoid cu
celulă T matură CD4+/CD8+ este T-PLL. Acesta exprimă CD3 de suprafaţă şi un set complet de
antigene T ca CD2, CD5 şi CD7, lipsesc markerii de imaturitate CD34, CD10
▪ Categoria CD4-/CD8- include EATCL, HSTCL, limfomul cu celulă T γ/δ nonhepatosplenic,
PTCL,U şi rar limfomul cu celulă NK/T tip nazal.

Neoplaziile cu celulă NK matură

Includ limfomul extraganglionar cu celulă T/NK tip nazal (EN-NK/TNT), leucemia agresivă cu
celulă NK şi un subset de LGL. Neoplaziile cu celulă NK pot fi localizate sau diseminate în
momentul examinării iniţiale şi majoritatea se comportă agresiv, dar este important diferenţierea
LGL cu celulă NK care prezintă un curs mai indolent. Spre deosebire de celelalte neoplazii cu
celulă NK aceasta exprimă adesea CD57 alături de CD56 şi este EBV-.

Neoplaziile blastice limfoide

Includ leucemia acută şi limfomul limfoblastic. ALL şi LL au caracteristici comune morfologice,

imunofenotipice şi citogenetice, distincţia dintre ele fiind considerată de mulţi arbitrară. Astfel în
clasificarea OMS acestea sunt încadrate în categoria leucemie/limfom limfoblastic cu precursor de
celulă B şi T. Deşi unii pacienţi cu LL pot apărea la evaluarea clinică şi morfologică cu boală
localizată, studii sensibile de IFCF şi moleculare evidenţiază frecvent afectarea submicroscopică a
măduvei osoase sau sângelui periferic.
IFCF permite identificarea celulelor imature sau anormale, distincţia lor de celulele imature
prezente în mod normal în măduiva osoasă şi timus, diferenţierea între ALL şi AML, identificarea
liniei celulare B sau T, subtiparea acestora şi urmărirea răspunsului la tratament, incluzând
identificarea responder-ilor precoce şi detecţia bolii minime reziduale.
Utilizarea unui plot CD45 versus lumina dispersată lateral este foarte utilă în identificarea
blaştilor, aceştia prezentând o intensitate scăzută a expresiei CD45 şi lumină dispersată lateral
scăzută. Aceasta permite distincţia de limfocite (CD45 intens), precursorii eritroizi (CD45
negativ), precursorii neutrofilici şi eozinofilici (lumină dispersată lateral mai crescută) şi monocite
(lumina dispersată lateral mai crescută şi CD45 mai intens).

Pattern-uri imunofenotipice asociate leucemiei, clasificate în 4 tipuri:

1) expresia aberantă de markeri care nu sunt în mod normal prezenţi pe celulele liniei respective;
2) expresia asincronă sau fenotipul conţine aspecte neaşteptate pentru stadiul de maturaţie
respectiv, cum ar fi expresia CD20 pe suprafaţa precursorilor de celulă B;
3) supraexpresia
4) lipsa expresiei unor markeri.
Distincţia între AML şi ALL este importantă pentru selecţia terapiei corespunzătoare. În ALL
CD19 are sensibilitatea şi specificitatea cele mai mari pentru detecţia liniei B, iar cCD3 pentru
detecţia liniei T.
ALL demonstrează frecvent expresia a 1 sau 2 antigene mieloide, care contribuie la detecţia
celulelor anormale şi nu trebuie să ducă la diagnosticul de leucemie bifenotipică. Mai puţin de 5%
din cazuri prezintă heterogenitate lineală, fie leucemie bifenotipică (expresia de antigene de la mai
mult de o linie de către o singură populaţie de blaşti) sau leucemie bilineală (două populaţii de
blaşti din linii diferite).
LL este rar la adult, dar este comun la copii. Aproximativ 90% din LL sunt de linie T, restul fiind
de linie B, foarte rar putând avea originea într-o celulă NK. De obicei LL sunt TdT pozitive, un
marker care distinge acest tip de neoplazie de alte tipuri de limfoame.
CD34 este de asemenea exprimat de multe LL, fiind util pentru diferenţierea acestora de limfomul
Burkitt (BL).
Toate recăderile T-LL trebuie restudiate imunologic deoarece un număr mic de cazuri pot
prezenta o comutare fenotipică la leucemie acută mieloidă.
ALL la adult sunt în 70% din cazuri cu precursor de celulă B, 25% cu precursor de celulă T şi 5%
cu celulă B matură (celulă Burkitt). Există o incidenţă uşor mai mare a expresiei antigenelor
mieloide în ALL la adulţi decât la copii, comun fiind detectate CD13, CD15 şi CD33. Cazurile
rare cu coexpresia mai multor antigene mieloide şi limfoide pot fi considerate leucemii acute
bifenotipice.
Expresia CD34, mai frecventă la adult în ALL de linie B, a fost de asemenea raportată ca având
efect advers, dar aceasta se suprapune atât cu un număr crescut de leucocite, cât şi cu prezenţa
cromozomului Ph, caracterizate de asemenea printr-un efect nefavorabi.
La copii, ALL cu celulă pre-B precoce cuprinde aproximativ două treimi din cazuri, se asociază
cu un prognostic favorabil, majoritatea fiind CALLA pozitive, expresia acestuia nepărând a avea
semnificaţie prognostică independentă.

Boala minimă reziduală (MRD)

În prezent majoritatea testelor de citometrie în flux pentru MRD ţintesc să detecteze populaţii
reprezentând 0.01% din evenimente, cu scopul detectării a cel puţin 50-100 evenimente de interes,
putând concura astfel ca sensibilitate cu metodele PCR, citometria în flux prezentând avantajul
discriminării între celulele viabile şi cele moarte şi măsurarea directă a proporţiei celulelor
pozitive. Provocarea pentru detecţia MRD prin IFCF este separarea celulelor leucemice reziduale
de celulele nonmaligne, mai ales în stadiile de regenerare a măduvei osoase în care aceasta poate
conţine mai multe forme de maturaţie precoce.
Primele 4 combinaţii pentru detecţia MRD în AL la IFCF sunt:
1) CD19/CD34/CD10;
2) CD13/CD33/CD34;
3) CD13/CD33/CD117;
4) CD13/CD34/CD117,
- ceea ce presupune că aceste aspect imunofenotipice trebuie urmărite la diagnostic.
Fenotipul se poate schimba adesea odată cu trecerea timpului şi în urma tratamentului, astfel testul
pentru MRD nu trebuie să se bazeze pe potrivirea exactă a fenotipului bolii reziduale şi cel al
specimenului diagnostic original. Totuşi subsetul de celule leucemice care persistă menţin
aspectul clonal şi continuă să prezinte trăsături omogene. Aceste celule reziduale apar la studiile
prin IFCF ca un grup de celule îngust prezentând un fenotip “îngheţat” printre celulele în
maturare.
IFCF are un rol stabilit în detecţia MRD în ALL, un rol în actualitate în CLL/SLL şi un rol
potenţial în alte malignităţi hematopoietice şi limfoide.
IFCF multiparametrică standardizată a fost propusă ca metoda preferată pentru detecţia MRD în
CLL/SLL. Aceasta recomandă 3 combinaţii, respectiv asocierea CD5/CD19 cu CD20/CD38,
CD81/CD22 şi CD79b/CD43.

Recomandări imunofenotipare sindroame limfoproliferative

transpiraţii nocturne, febră, scădere ponderală, oboseală, infecţii, anemie, tendinţă la sângerare;

monoclonale;

istincţia între leucemia limfoblastică acută (LAL) şi leucemia mieloidă acută (LAM);

Specimen recoltat - sânge venos.

Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant.
Volum probă - 5 mL sânge.
Stabilitate probă - sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează
testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea
probei.
Cauze de respingere a probei - specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe
refrigerate sau congelate.
Metodă - citometrie în flux.
Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor
Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei
pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute.
Limite şi interferenţe
uşoare de Ig a fost raportată rar în populaţii de celule B reactive
nonclonale; restricţia lanţului uşor de Ig nu este sinonimă cu monoclonalitatea. De asemenea
unele populaţii care prezintă restricţia lanţului uşor şi sunt monoclonale nu sunt neoplazice,
Astfel, rezultatele imunofenotipării trebuie interpretate în conjuncţie cu alte date clinice,
morfologice şi uneori genotipice.

de celule B anormale fenotipic (mai puţin de 5% din toate celulele analizate) nu trebuie să ducă la
stabilirea unui diagnostic nou decât în corelaţie cu datele clinice, morfologice sau alte modificări.
 laştilor pe
frotiurile din aspiratul medular, aceasta putând avea diferite explicaţii, cum ar fi: diluţia mai mare
cu sânge periferic decât partea utilizată pentru frotiuri, includerea unor precursori imaturi normali
(hamatogonii) la numărătoarea manuală, utilizarea unui numărător diferit pentru determinarea
procentului de blaşti, la numărătoarea manuală aceştia fiind determinaţi ca procent din toate
celulele nucleate, în timp ce la IFCF aceştia sunt determinaţi ca procent din toate celulele
analizate sau din celulele noneritroide (etapa de liză utilizată pentru îndepărtarea celulelor roşii
anucleat îndepărtează de asemenea un număr variabil de precursori eritroizi nucleaţi). De
asemenea blaştii pot fi dificil de recunoscut la numărătoarea manuală sau pot fi distruşi la
efectuarea frotiurilor. În plus celulele mieloide hipogranulare pot avea o lumină dispersată lateral
scăzută şi pot intra în regiunea blaştilor în plot-ul CD45 versus dispersia lateral.