Investete n oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013 Axa prioritar 1 Educaie i formare profesional n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pe cunoatere Domeniul major de intervenie 1.5. Programe doctorale i post-doctorale n sprijinul cercetrii Titlul proiectului: Burse doctorale pentru dezvoltare durabila BD-DD Numrul de identificare al contractului: POSDRU/107/1.5/S/76945 Beneficiar: Universitatea Transilvania din Braov

Universitatea Transilvania din Brasov

Scoala Doctorala Interdisciplinara Departament: Silvicultur

Ing. Iacob I. CRCIUNESC

Evaluarea nivelului de hibridare natural la specii autohtone de cvercinee: analiz de caz n rezervaia natural Bejan-Deva Evaluation of natural hybridization in native species of oaks: a case study in Bejan-Deva Natural Reserve

Conductor tiinific Prof.dr.ing. Neculae OFLETEA

BRASOV, 2013

MINISTERUL EDUCAIEI NAIONALE

UNIVERSITATEA TRANSILVANIA DIN BRAOV

BRAOV, B-DUL EROILOR NR. 29, 500036, TEL. 0040-268-413000, FAX 0040-268-410525 RECTORAT

D-lui (D-nei) .............................................................................................................. COMPONENA Comisiei de doctorat

Numit prin ordinul Rectorului Universitii Transilvania din Braov Nr. 5998 din 10.09.2013 PREEDINTE: Prof.univ.dr.ing. Gheorghe SPRCHEZ PRODECAN al Facultii de Silvicultur i Exploatri Forestiere Universitatea Transilvania din Braov CONDUCTOR TIINIFIC: Prof.univ.dr.ing. Neculae OFLETEA Universitatea Transilvania din Brasov REFERENI: Conf.univ.dr. Liviu FRTI Universitatea tefan cel Mare Suceava C.S.gr.II.dr.ing. Flaviu POPESCU I.C.A.S. Bucureti, Staiunea Simeria Conf.univ.dr.ing. Alexandru-Lucian CURTU Universitatea Transilvania din Brasov

Data, ora i locul susinerii publice a tezei de doctorat: 11.10.2013, ora 1100, sala SI2, Facultatea de Silvicultur i Exploatri Forestiere. Eventualele aprecieri sau observaii asupra coninutului lucrrii v rugm s le transmitei n timp util, pe adresa Facultatea de Silvicultur i Exploatri Forestiere, Braov, irul Beethoven, nr. 1, 500123, la numrul de fax: 0268.475705 sau la adresa de e-mail iacob.craciunesc@unitbv.ro.

Totodat v invitm s luai parte la edina public de susinere a tezei de doctorat. V mulumim.

CUPRINS
Pg. teza Pg. rezumat

INTRODUCERE 1. STADIUL ACTUAL AL CUNOTINELOR PRIVIND RELEVAREA I EVALUAREA FENOMENULUI DE HIBRIDARE NATURAL LA CVERCINEE 1.1. Taxonomia i filogenia genului Quercus 1.2. Conspectul de specii din genul Quercus n flora Romniei i semnalarea hibridrii naturale 1.3. Aspecte ale fenologiei cvercineelor 1.4. Hibridarea natural n cadrul genului Quercus 1.4.1. Amploarea fenomenului i relevarea acestuia n literatura de specialitate 1.4.2. Relevarea hibridrii la cvercinee prin analize de markeri genetici 1.4.2.1. Studii de izoenzime 1.4.2.2. Studii cu markeri PCR-RFLP, RAPD, AFLP 1.4.2.3. Analize de microsatelii 1.4.2.4. Cartografierea genomului 2. SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRILOR 2.1. Scopul cercetrilor 2.2. Obiectivele cercetrilor 3. MATERIAL I METODE DE CERCETARE 3.1. Material i metode de cercetare pentru observaiile fenologice 3.2. Material i metod de cercetare pentru evaluarea hibridrii naturale la arborii maturi 3.2.1. Zona studiat i materialul de analiz 3.2.2. Efectuarea analizelor de laborator 3.2.3. Analiza setului de date genetice 3.2.3.1. Evaluarea erorilor de citire i a alelelor nule din setul de date 3.2.3.2. Parametrii genetici 3.2.3.3. Stabilirea celei mai bune metode de grupare pe specii 3.2.3.4. Stabilirea numrului de clustere genetice 3.2.3.5. Diferenierea interspecific 3.3. Material i metod de cercetare pentru evaluarea fluxului genic actual 3.3.1. Recoltarea ghindelor 3.3.2. Genotiparea ghindelor 3.3.3. Analizele de paternitate 4. REZULTATE I DISCUII 4.1. Structura fenologic n complexul de cvercinee Bejan-Deva 4.1.1. Datele climatice pentru cei trei ani de observaii fenologice 4.1.1.1. Date climatice n anul 2011 4.1.1.2. Date climatice n anul 2012 4.1.1.3. Date climatice n anul 2013 4.1.2. Fenofaza de deschidere a mugurilor foliari 4.1.2.1. Deschiderea mugurilor foliari n anul 2011 4.1.2.2. Deschiderea mugurilor foliari n anul 2012 4.1.2.3. Deschiderea mugurilor foliari n anul 2013 1

9 9 14 15 17 17 19 19 20 22 29 30 30 30 31 31 34 34 35 40 41 42 43 44 45 47 47 48 49 51 51 51 51 52 53 54 54 56 59

8 8 9 9 10 10 11 11 11 13 16 16 16 17 17 17 19 19 19 22 23 24 24 25 25 25 25 26 26 27 27 27 27 27 27 28 28 29 29

4.1.2.4. Concluzii privind fenofaza deschiderea mugurilor 4.1.3. Fenofaza de nflorire 4.1.3.1. nflorirea n anul 2011 4.1.3.2. nflorirea n anul 2012 4.1.3.3. Concluzii privind fenofaza nfloririi 4.1.3.4. Androsterilitatea fenotipic n pdurea Bejan 4.1.3.5. Intensitatea nfloririi n doi ani de observaii 4.1.4. Evaluarea corelaiilor fenologice 4.1.4.1. Analiza categoriilor fenologice individuale de deschidere a mugurilor foliari n ani consecutivi de observaii 4.1.4.2. Analiza stadiilor fenologice individuale de nflorire n ani consecutivi de observaii 4.1.4.3. Analiza comparativ dintre fenofazele de deschidere a frunzelor i nflorire n ani consecutivi 4.2. Structura genetic evaluat prin analize de markeri moleculari 4.2.1. Echilibrul Hardy-Weinberg i dezechilibrul linkage 4.2.2. Structura alelic a celor patru specii de stejari n complexul BejanDeva 4.2.2.1. Markerul ZAG112 4.2.2.2. Markerul ZAG39 4.2.2.3. Markerul ZAG96 4.2.2.4. Markerul ZAG110 4.2.2.5. Markerul ZAG11 4.2.2.6. Markerulul ZAG87 4.2.2.7. Markerul ZAG7 4.2.2.8. Markerul ZAG20 4.2.2.9. Markerul ZAG9 4.2.2.10. Markerul GOT021 4.2.2.11. Markerul PIE040 4.2.2.12. Markerul PIE215 4.2.2.13. Markerul PIE223 4.2.2.14. Markerul PIE239 4.2.2.15. Markerul PIE227 4.2.2.16. Markerul DHN3 4.2.3. Estimarea parametrilor genetici 4.2.3.1. Numrul mediu de alele (Na) 4.2.3.2. Numrul efectiv de alele (Ne) 4.2.3.3. Bogia alelic (AR) 4.2.3.4. Heterozigoia observat (Ho) 4.2.3.5. Heterozigoia ateptat (He) 4.2.3.6. Indicele de fixare (F) 4.2.3.7. Recomandri pentru diferenierea interspecific i analizele de alocare genetic a indivizilor la specii 4.2.4. Diferenierea interspecific 4.2.4.1. Indicele de difereniere Dest 4.2.4.2. Indicele de fixare Fst 4.2.4.3. Valori globale ale indicelor de fixare i difereniere 4.2.5. Testarea analizei genetice a gruprii exemplarelor studiate pe specii 4.2.6. Analiza alocrii arborilor din Pdurea Bejan la specii i hibrizi 4.2.6.1. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus frainetto 4.2.6.2. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus petraea

61 62 62 64 66 67 68 69 69 70 70 72 72 73 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 85 86 87 88 88 89 90 92 93 94 95 96 96 97 100 101 104 106 108

30 31 31 32 33 33 33 34 34 34 35 36 36 36 36 37 37 37 38 38 39 39 40 40 41 41 42 42 43 43 44 44 44 45 46 46 47 47 47 48 48 49 49 50 51 52

4.2.6.3. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus pubescens 4.2.6.4. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus robur 4.2.6.5. Concluzii privind analiza alocrii genetice a arborilor din Pdurea Bejan 4.2.6.6. Compararea analizei de grupare a indivizilor la specii n dou studii diferite 4.3. Estimarea fluxului genic actual prin analize de paternitate 4.3.1. Identificarea arborilor donatori de polen 4.3.2. Dispersia polenului 4.3.3. Analiza ncrucirilor din suprafaa de cercetare 4.3.4. Sintez comparativ a analizelor de paternitate i a datelor fenologice 5. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUII ORIGINALE. DISEMINAREA REZULTATELOR. DIRECII VIITOARE DE CERCETARE 5.1. Concluzii finale 5.1.1. Concluzii rezultate din efectuarea observaiilor fenologice 5.1.2. Concluzii rezultate din evaluarea hibridrii arborilor maturi 5.1.3. Concluzii rezultate din analizele de paternitate 5.2. Contribuii originale 5.3. Diseminarea rezultatelor 5.4. Direcii viitoare de cercetare BIBLIOGRAFIE REZUMAT CURRICULUM VITAE

110 111 113 117 118 118 123 125 130 134 134 134 135 136 137 138 139 140 174 175

53 54 55 57 57 57 59 60 63 64 64 64 65 66 67 67 68 69 80 81

TABLE OF CONTENTS
Pg. thesis Pg. abstract

INTRODUCTION 1. CURRENT STATE OF KNOWLEDGE REGARDING THE DISCLOSURE AND ASSESSMENT OF THE NATURAL HYBRIDIZATION PHENOMENON IN OAKS 1.1. The taxonomy and phylogeny of genus Quercus 1.2. The species compendium of the genus Quercus in the Romanian flora and the highlight of the natural hybridization 1.3. Aspects of oaks phenology 1.4. Natural hybridization within genus Quercus 1.4.1. The spread of the phenomenon and its disclosure in the speciality literature 1.4.2. Highlight of hybridization in oaks with genetic markers analysis 1.4.2.1. Isozymes studies 1.4.2.2. Studies with PCR-RFLP, RAPD, AFLP markers 1.4.2.3. Microsatellites analysis 1.4.2.4. Genome mapping 2. THE AIM AND OBJECTIVES OF THE RESEARCHES 2.1. The aim of the researches 2.2. The objectives of the researches 3. MATERIAL AND METHODS 3.1. Material and methods for phenological observations 3.2. Material and method for the natural hybridization assessment in adult trees 3.2.1. The study area and material 3.2.2. Accomplishment of laboratory analysis 3.2.3. The analyse of the genetic data set 3.2.3.1. Assessment of reading errors and null alleles from the data set 3.2.3.2. Genetic parameters 3.2.3.3. Establishment of the best method of grouping by species 3.2.3.4. Establishment of genetic clusters 3.2.3.5. Interspecific differentiation 3.3. Material and method for the assessment of the present gene flow 3.3.1. Acorns harvest 3.3.2. Acorns genotyping 3.3.3. Paternity analysis 4. RESULTS AND DISCUSSIONS 4.1. Phenological structure in Bejan-Deva oaks complex 4.1.1. Climatic data for the three years of phonological observations 4.1.1.1. Climatic data in 2011 4.1.1.2. Climatic data in 2012 4.1.1.3. Climatic data in 2013 4.1.2. The phenophase of the foliar bud burst 4.1.2.1. Foliar bud burst in 2011 4.1.2.2. Foliar bud burst in 2012 4.1.2.3. Foliar bud burst in 2013 4.1.2.4. Conclusions regarding the bud burst phenophase 4.1.3. Flowering phenophase

9 9 14 15 17 17 19 19 20 22 29 30 30 30 30 31 34 34 35 40 41 42 43 44 45 47 47 48 49 51 51 51 51 52 53 54 54 56 59 61 62

8 8 9 9 10 10 11 11 11 13 16 16 16 17 17 17 19 19 19 22 23 24 24 25 25 25 25 26 26 27 27 27 27 27 27 28 28 29 29 30 31

4.1.3.1. Flowering in 2011 4.1.3.2. Flowering in 2012 4.1.3.3. Conclusions regarding the flowering phenophase 4.1.3.4. Phenotypical androsterility in Bejan Forest 4.1.3.5. The flowering intensity in two years of observations 4.1.4. Assessment of phenological correlations 4.1.4.1. The analyse of the individual phenological categories of foliar bud burst in consecutive years of observations 4.1.4.2. The analyse of the individual phenological stages of flowering in consecutive years of observations 4.1.4.3. Comparative analyse between the phenophases of leaves opening and flowering in consecutive years 4.2. The genetic structure assessed with molecular markers analysis 4.2.1. Hardy-Weinberg equilibrium and linkage disequilibrium 4.2.2. Allelic structure of the four species of oaks in Bejan-Deva complex 4.2.2.1. ZAG112 marker 4.2.2.2. ZAG39 marker 4.2.2.3. ZAG96 marker 4.2.2.4. ZAG110 marker 4.2.2.5. ZAG11 marker 4.2.2.6. ZAG87 marker 4.2.2.7. ZAG7 marker 4.2.2.8. ZAG20 marker 4.2.2.9. ZAG9 marker 4.2.2.10. GOT021 marker 4.2.2.11. PIE040 marker 4.2.2.12. PIE215 marker 4.2.2.13. PIE223 marker 4.2.2.14. PIE239 marker 4.2.2.15. PIE227 marker 4.2.2.16. DHN3 marker 4.2.3. Assessment of the genetic parameters 4.2.3.1. The average number of alleles (Na) 4.2.3.2. The effective number of alleles (Ne) 4.2.3.3. Allelic richness (AR) 4.2.3.4. Observed heterozygosity (Ho) 4.2.3.5. Expected heterozygosity (He) 4.2.3.6. Fixation index (F) 4.2.3.7. Recommendations for the interspecific differentiation and the analysis of genetic assignment of the individuals to the species 4.2.4. Interspecific differentiation 4.2.4.1. Dest differentiation index 4.2.4.2. Fst fixation index 4.2.4.3. Global values of the fixation and differentiation indices 4.2.5. Testing of the genetic assignment 4.2.6. The analyse of the trees assignment from Bejan Forest to species and hybrids 4.2.6.1. The analyse of the genetic assignment of the trees morphologically grouped to Quercus frainetto 4.2.6.2. The analyse of the genetic assignment of the trees morphologically grouped to Quercus petraea 4.2.6.3. The analyse of the genetic assignment of the trees morphologically grouped to Quercus pubescens

62 64 66 67 68 69 69 70 70 72 72 73 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 85 86 87 88 88 89 90 92 93 94 95 96 96 97 100 101

31 32 33 33 33 34 34 34 35 36 36 36 36 37 37 37 38 38 39 39 40 40 41 41 42 42 43 43 44 44 44 45 46 46 47 47 47 48 48 49 49

104 50 106 51 108 52 110 53

4.2.6.4. The analyse of the genetic assignment of the trees morphologically grouped to Quercus robur 4.2.6.5. Conclusions regarding the analyse of the genetic assignment of the trees from Bejan Forest 4.2.6.6. Comparison of the analyse of the individuals assignment to the species in two different studies 4.3. Estimation of the present gene flow with paternity analysis 4.3.1. Identification of the pollen donor trees 4.3.2. Pollen dispersal 4.3.3. The analyse of the crosses from the study area 4.3.4. Comparative synthesis of the paternity analysis and phenological data 5. FINAL CONCLUSIONS. ORIGINAL CONTRIBUTIONS. RESULTS DISSEMINATION. FUTURE RESEARCH DIRECTIONS. 5.1. Final conclusions 5.1.1. Conclusions drawn from the phenological observations 5.1.2. Conclusions drawn from the assessment of the adult trees hybridization 5.1.3. Conclusions drwn from paternity analysis 5.2. Original contributions 5.3. Results dissemination 5.4. Future research directions BIBLIOGRAPHY ABSTRACT CURRICULUM VITAE

111 54 113 55 117 118 118 123 125 57 57 57 59 60

130 63 134 64 134 64 134 64 135 136 137 138 139 140 174 175 65 66 67 67 68 69 80 81

INTRODUCERE

Populaiile naturale de plante se gsesc la nceputul secolului XXI n faa unei noi provocri: schimbrile climatice la scar planetar. Cu toate c speciile de plante au trecut n decursul timpului prin mai multe succesiuni termice, n prezent se contureaz o dinamic diferit a acestora. Datorit activitilor antropice abuzive asupra mediului nconjurtor, schimbrile climatice care se preconizeaz se disting n raport cu cele din trecut prin rapiditatea lor, care poate surprinde capacitatea de migraie a speciilor de plante (Davis i Shaw, 2001). Rspunsurile posibile ale acestor specii n raport cu modificrile condiiilor de mediu pot fi de trei tipuri (Aitken et al., 2008): i) migraia n latitudine sau altitudine, pe urmele condiiilor de mediu favorabile, ii) adaptarea populaiilor existente la noile condiii de mediu sau iii) extincia local a populaiilor. Totodat, speciile i populaiile lor actuale ar putea fi afectate nu numai de nclzirea global, ci i de fenomene climatice extreme, fluctuante, manifestate dincolo de amplitudinea de manifestare a acestora asimilat n comportamentul actual al speciilor. Genul Quercus pare s fie unul din cele care dein un arsenal pentru contracararea ameninrilor extinciei. Pe de o parte, prin numrul remarcabil de specii repartizate la nivel planetar i adaptate la condiii de mediu extrem de diverse. Pe de alt parte, prin plasticitatea fenotipic care poate permite un rspuns rapid la schimbrile brute de mediu. Nu n ultimul rnd, datorit unei divergene relativ recente ntre specii, barierele reproductive nu sunt izolate n totalitate, ceea ce poate cauza producerea ncrucirilor interspecifice, fenomen cunoscut sub numele de hibridare natural. Relativ recent, s-a emis ipoteza conform creia hibridarea la speciile de plante are un rol important n migraie (Petit et al., 2004). n ultimul timp, datorit avansului tehnologic din domeniul geneticii moleculare, hibridarea a fost subiectul unor cercetri la un alt nivel. Astfel, deoarece speciile din genul Quercus au dat de bnuit de mult timp prin caracterele morfologice intermediare la anumii arbori, acest gen de arbori a constituit un adevrat model pentru studiul genetic al hibridrii. Datorit faptului c acest fenomen a fost invocat i la nivelul rii noastre (Georgescu i Moraru, 1948; Nyarady et al., 1952; DumitriuTtranu, 1960; Stnescu et al., 1991), aceast tez i propune s analizeze, cu ajutorul markerilor moleculari, o suprafa de cercetare amplasat n rezervaia natural Bejan-Deva, caracterizat prin existena mai multor specii simpatrice de cvercinee. Complementar scanrii genomului n vederea alocrii genetice a arborilor la specii sau hibrizi, s-au ntreprins observaii fenologice n trei ani consecutivi cu scopul de a investi ga rolul fenologiei arborilor ca barier mpotriva hibridrii sau dimpotiv, ca factor favorizant. De asemenea, s-au realizat analize de paternitate pentru a surprinde dinamica fluxului genic n condiiile actuale de mediu.

1. STADIUL ACTUAL AL CUNOTINELOR PRIVIND RELEVAREA I EVALUAREA FENOMENULUI DE HIBRIDARE NATURAL LA CVERCINEE
1.1. Taxonomia i filogenia genului Quercus Genul Quercus este ncadrat taxonomic n familia Fagaceae, una din cele mai bogate familii din punct de vedere dendrologic, cu aproximativ 1000 de specii la nivel global, separate n apte genuri, rspndite n emisfera nordic, de la regiunile boreale la cele tropicale sau chiar ecuatoriale (Kremer et al., 2007). Genul Quercus are o distribuie extins n emisfera nordic, acoperind zone ntinse ale Europei, Asiei, Americii de Nord, nordul Africii, rspndindu-se n sud-vest spre Columbia (America de Sud) i n sud-est spre Indonezia. Din punct de vedere ecologic, ocup ecosisteme variate, de la pdurile temperate pn la comunitile de plante montane tropicale i cele sclerofile mediteraneene (Axelrod, 1983). Distribuia altitudinal a speciilor de cvercinee este la fel de variat, de la nivelul mrii pn la 4000 de metri n Munii Himalaya (Menitsky, 2005). Ultima trecere n revist a speciilor de stejari a fost facut n 1998 de Govaerts i Frodin i include 531 specii de arbori i arbuti. Totui, numrul speciilor alocate genului Quercus a variat considerabil de-a lungul timpului datorit variabilitii caracterelor morfologice care a cauzat ataarea expresiei crux botanicorum genului Quercus (Schwarz, 1937). O parte a acestei variabiliti a caracterelor morfologice a fost explicat prin fenomenul de hibridare natural care s-a observat mai ales n zonele de contact dintre specii (Rushton, 1993; Bacilieri et al., 1993; Howard et al., 1997). Cele mai noi studii filogenetice bazate pe genetica molecular (Manos et al., 1999; Manos i Stanford, 2001; Denk i Grimm, 2010) indic o grupare infrageneric a genului Quercus n urmtoarele grupuri independente unele de celelalte (Denk i Grimm, 2010): grupul Cerris, grupul Cyclobalanopsis, grupul Lobatae, grupul Ilex, grupul Protobalanus i grupul Quercus. Cu ajutorul markerilor cloroplastici, motenii pe cale matern la stejari (Dumolin et al., 1995), s-au identificat liniile filogenetice ale cvercineelor i s-a reuit retrasarea cilor de migraie post-glaciare prin care taxonii din genul Quercus au recolonizat teritoriile europene (Petit et al., 2002a). Prin alturarea acestor date genetice cu cele palenologice (Brewer et al., 2002), au fost comunicate trei refugii glaciare principale n zonele muntoase ale peninsulelor Iberic, Italic i Balcanic (Petit et al., 2002b). Repartiia actual a haplotipurilor cloroplastice pe continentul european arat c fiecare refugiu a recolonizat o parte din teritoriu, pe direcia sud nord de migraie global. La ora actual variantele cloroplastice (haplotipuri) nu permit distingerea speciilor, cci majoritatea haplotipurilor sunt mprite local ntre specii.

1.2. Conspectul de specii din genul Quercus n flora Romniei i semnalarea hibridrii naturale n Romnia, genul Quercus este reprezentat de 5-9 specii, n funcie de ncadrarea lor taxonomic (Georgescu i Morariu, 1948; Nyarady et al., 1952, Stnescu et al., 1997; ofletea i Curtu, 2007). Cvercineele din ara noastr sunt reprezentate de: Quercus robur L. stejar (stejar pedunculat), Q pedunculiflora K.Koch stejar brumriu, Q. petraea (Matt.) Liebl. ssp. petrea (Liebl.) gorun comun, Q. petraea ssp. dalechampii (Ten.) gorun de Dalmaia, Q. petraea ssp. polycarpa (Schur) gorun transilvnean, Q. frainetto Ten. grni, Q. pubescens Willd. stejar pufos, Q.virgiliana Ten. stejar italian i Q. cerris L. cer (ofletea i Curtu, 2007). n arboretele mixte de cvercinee din Romnia a fost semnalat existena unor centre de hibridare sau a unor hibrizi (Georgescu i Moraru, 1948; Nyarady et al., 1952; Dumitriu Ttranu, 1960; Stnescu et al., 1991). Stanciu (1997) a semnalat existena a 14 tipuri de entiti hibride n 44 de puncte geografice ale Romniei. Relativ recent, Sanda et al. (2004) au mai identificat ali 5 taxoni hibrizi prezeni n pdurile Romniei, n principal n Moldova. n ultimul timp, fenomenul de hibridare natural a fost investigat, cu ajutorul markerilor moleculari i a analizelor statistice multivariate a caracterelor foliare, n rezervaia natural Bejan-Deva (Curtu et al., 2007b; ofletea et al., 2011), unde s-a realizat i o evaluare a fluxului genic actual prin intermediul microsateliilor i a analizelor de paternitate (Curtu et al., 2009). n privina contextului mediogen care favorizeaz sau limiteaz producerea hibridrilor, ca n cazul pdurii Bejan-Deva, se afirm pe de-o parte c ntlnirea n acelai arboret sau trup de pdure a unor specii cu exigene ecologice diferite se face, de regul, la limitele de areal ale unora dintre ele. Totui, n literatura de specialitate din Romnia lipsete o cercetare a fenofazelor nfloririi i a implicaiilor acesteia asupra hibridrii.

1.3. Aspecte ale fenologiei cvercineelor Stejarii sunt specii unisexuat-monoice, adic produc flori mascule i femele pe acelai arbore. Distribuia mugurilor este influenat de poziia de pe ramuri: aproximativ 72% din totalul mugurilor apar pe lujerul terminal din acel an, 26% pe lujerii vechi de 1 an, respectiv 2% pe lujerii vechi de 2 ani (Johnson et al., 2009). S-a observat faptul c la stejarii albi, amenii apar dup 10 zile n care temperaturile minime zilnice au fost mai mari sau egale cu 10C (Sharp i Chisman, 1961). Imediat dup apariie, amenii sunt ereci. n cteva zile devin semi -pendeni, devenind complet pendeni n 5-12 zile de la apariie, cnd are loc nflorirea total sau anteza (Sharp i Chisman, 1961). Amenii apar mai nti pe ramurile superioare, apoi deschiderea lor apare i pe ramurile inferioare (Johnson et al., 2009).

Dup ce s-a realizat dispersia polenului, s-a observat c suprafaa frunzelor crete cu 50% (Johnson et al., 2009), ceea ce poate conduce la o identificare a arborilor la care s-a terminat eliberarea polenului pe baza dezvoltrii frunzelor. Se crede c acest fenomen favorizeaz dispersia polenului deoarece minimizeaz interferenele din coronament. n Romnia, primele observaii fenologice dateaz de peste un secol (Teodosiu i Mateescu, 2005), ns literatura de specialitate care abordeaz studiile fenologice asupra cvercineelor este srac (Rdulescu, 1938, Blnic i Tomescu, 1953, Tomescu et al., 1967, Teodosiu et al., 2005, Chesnoiu et al., 2009). n ultimul timp (Chesnoiu et al. 2009), cercetri fenologice la cvercinee au fost efectuate n suprafaa intensiv Fundeanu (Ocolul Silvic Grivia). Datele fenologice din suprafaa respectiv indic interferena fenofazelor de primvar la t oate cele patru specii i posibilitatea departajrii de grupuri difereniate dup precocitate/tardivitate.

1.4. Hibridarea natural n cadrul genului Quercus 1.4.1. Amploarea fenomenului i relevarea acestuia n literatura de specialitate Hibridarea interspecific, neleas ca procesul de producere a unor urmai viabili, parial viabili sau neviabili n urma ncrucirilor ntre exemplare care aparin la specii diferite, apare la aproximativ 10% din speciile de animale i respectiv la 25% din speciile de plante (Mallet, 2005). Uneori hibridarea poate conduce spre introgresie, adic procesul de integrare stabil a materialului genetic de la o specie la alta prin retroncruciare repetat (Rieseberg i Wendel, 1993), respectiv spre speciaie (Arnold, 1997). Hibridarea este un fenomen larg rspndit printre taxonii de plante (Rieseberg i Carney, 1998; Mallet, 2005). Schimbul de gene i hibridarea din cadrul genului Quercus au stimulat n trecut multe dezbateri asupra conceptului de specie biologic i s-a sugerat c aceast accepiune este inadecvat pentru stejari, dat fiind amploarea hibridrilor (Burger, 1975; Coyne, 1994). De asemenea, stejarii au avut un rol central n problema privind importana introgresiei n evoluia plantelor (Anderson, 1949; Muller, 1952; Rieseberg i Wendel, 1993), au stimulat discuii asupra rolului factorilor ecologici care limiteaz hibridarea (Muller, 1952) i au servit ca model n dezvoltarea conceptului de specii care se bazeaz pe criterii ecologice (Stebbins, 1950; Muller, 1952; VanValen, 1976). n cazul cvercineelor, n pofida hibridrii extensive, speciile rmn bine difereniate la nivel morfologic i ecologic. Pn acum, mecanismele meninerii integritii speciilor sunt nc puin nelese, dar fenomenul n sine este demn de consemnat i avut n vedere atunci cnd se analizeaz n dinamica sa de manifestare.

10

1.4.2. Relevarea hibridrii la cvercinee prin analize de markeri genetici

1.4.2.1. Studii de izoenzime Izoenzimele au fost folosite pentru prima oar n anii 1950, cnd au constituit un mare progres pentru studiile de genetica populaiilor arborilor forestieri, deoarece caracteristicile morfologice ofereau rezultate limitate. Cele mai importante avantaje ale izoenzimelor sunt legate de faptul de a fi markeri codominani i markeri universali, fiind folosite la toate speciile (Vendramin i Hansen, 2005). La stejari, analizele cu izoenzime nu au descoperit niciun marker specific (Zanetto i Kremer, 1995; Bacilieri et al., 1995), dar au confirmat hibridarea asimetric ntre gorun i stejar pedunculat n arborete naturale (Bacilieri et al., 1993, 1996a,b), dup ce s-a demonstrat acest lucru prin ncruciri artificiale (Steinhoff, 1993). Gmry i Schmidtov (2007) au studiat hibridarea dintre Q. robur, Q. petraea i Q. pubescens cu ajutorul a 9 sisteme izoenzimatice controlate de 13 loci. Mir et al. (2009) au analizat hibridarea dintre Q. suber i Q. ilex cu ajutorul a 3 loci izoenzimatici i prin compararea regiunilor de ADN cloroplastic. S-au identificat hibrizi ntr-un procent de 40% din indivizii care au prezentat o morfologie tipic speciilor. Un studiu recent care a combinat izoenzimele i analizele foliare multivariate (Curtu et al., 2011) la taxonii Q. robur i Q. pedunculiflora a subliniat c diferenele interspecifice sunt limitate, ceea ce trdeaz o speciaie ecologic incomplet.

1.4.2.2. Studii cu markeri PCR-RFLP, RAPD, AFLP Dup descoperirea i punerea la punct a reaciei de polimerizare n lan (engl. Polymerase Chain Reaction - PCR) (Mullis i Faloona, 1987) au nceput s se utilizeze tipuri noi de markeri moleculari bazai pe aceast tehnic. Markerii PCR-RFLPs (engl. Restriction Fragment Length Polymorphisms sau polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie) au fost utilizai la cvercinee mai ales pentru analiza ADN-ului cloroplastic. Astfel, Whittemore i Schaal (1991) au descoperit schimburi considerabile ale genomului cloroplastic la cinci specii de stejari albi americani (Quercus alba, Q. macrocarpa, Q. michauxii, Q. stellata i Q. virginiana var. fusiformis). Autorii au concluzionat c hibrizii recunoscui morfologic sunt mai rari n natur dect prin estimarea fluxului genic extranuclear. Studiile ulterioare bazate pe ADN-ul cloroplastic din eantioane mai mari de populaii alctuite din dou specii de stejari albi (Q. robur i Q. petraea) din Europa de Vest au sugerat c modelarea geografic i discontinuitile dintre haplotipuri pot fi explicate de barierele geografice (Ferris et al., 1993) i de migraia postglaciar printr-o dispersie pe distane lungi (Petit et al., 1993, 1997).

11

Dumolin-Lapgue et al. (1997) au studiat variaia ADN-ului cloroplastic i au descoperit c este evident hibridarea sistematic i introgresia ntre cele 8 specii de stejari albi analizate. Marea majoritate a polimorfismului ADN-ului cloroplastic pare s fie anterioar nceputului ultimei recolonizri care a avut loc dup ultima glaciaiune (acum 13000 de ani). Lumaret i Jabbour-Zahab (2009) au analizat fluxul vechi i actual ntre dou specii sempervirescente de stejari din zona mediteranean: Quercus suber i Q. ilex. Rezultatele nu au oferit probe pentru variaia geografic a fluxului genic dintre specii.

Markerii RAPDs (engl. Random Amplified Polymorphic DNA - ADN-ul polimorfic amplificat randomizat). Bodns et al. (1997) au comunicat o omogenitate mare ntre gorun i stejarul pedunculat, deoarece din 2800 de fragmente RAPD doar 2% au afiat diferene semnificative ale frecvenelor alelelor. Rezultate bune ale utilizrii fragmentelor RAPD au fost comunicate de Howard et al. (1997), care au reuit s diferenieze speciile Q. grisea i Q. gambelli. De asemenea, Samuel (1999) a identificat fragmente RAPD care pot detecta hibridarea dintre Q. robur i Q. petraea. Totodat, aceti markeri au fost folosii pentru analiza izolrii reproductive dintre stejari (Q. grisea i Q. gambelli) i s-a propus ipoteza emasculrii mediului care susine c stresul cauzat de factorii de mediu poate crete probabilitatea formrii hibrizilor prin reducerea abilitii competitive a gameilor paterni ai unei specii (Williams et al., 2001). Markerii RAPD s-au utilizat n unele studii mpreun cu analizele foliare, pentru estimarea hibridrii naturale la speciile de stejari roii din Mexic (Tovar-Sanchez i Oyama, 2004; Gonzalez-Rodriguez et al. 2004) sau la evaluarea diferenierii populaiilor de Quercus pubescens din Croaia (Franjic et al., 2006). De asemenea, originea hibrid a speciei Q. crenata din ncruciarea speciilor Q. cerris i Q. suber a fost dovedit de Conte et al. (2007).

Markerii AFLPs (engl. Amplified Fragment Length Polymorphisms - polimorfismele de lungime ale unor fragmente amplificate). Studii cu markeri AFLP s-au realizat la complexul Q. robur-Q. petraea (Coart et al., 2002; Mariette et al., 2002; Kelleher et al., 2005), ntre Q. suber i Q. ilex (Coelho et al., 2006) i ntre 4 specii de stejari roii americani (Dodd i Kashani, 2003), toate rezultatele indicnd o slab difereniere ntre speciile analizate. De asemenea, Ishida et al. (2003) au analizat gradul de difereniere i hibridare dintr-un arboret mixt de Q. crispula i Q. dentata din Japonia, pe baza analizelor multivariate ale descriptorilor foliari i analiza componentelor principale (PCA) folosind markeri AFLP. Din cauza diferenierii moleculare sczute dintre cele dou speci i, markerii AFLP nu au fost informativi. Matsumoto et al. (2009) au identificat hibrizi ntre 3

12

specii de stejari albi din Japonia (Quercus crispula, Quercus dentata i Quercus serrata) cu ajutorul a 66 markeri AFLP polimorfici (din care 4 au fost aproape specifici celor 3 specii) i a dou programe de identificare a hibrizilor (HINDEX i STRUCTURE). 1.4.2.3. Analize de microsatelii Microsateliii sau secvenele simple repetitive (SSRs engl. Simple Sequence Repeats) sunt motive repetate n tandem cu 1-6 perechi de nucleotide, gsite n toate genomurile procariote i eucariote (Zane et al. 2002). Prima utilizare a microsateliilor n cadrul genului Quercus a fost comunicat de Dow et al. (1995) la specia nord american a stejarilor albi Quercus macrocarpa, la care s-au elaborat 3 microsatelii. Ulterior au fost dezvoltai 9 microsatelii pentru specia asiatic Q. myrsinifolia (Isagi i Suhandono, 1997). n Europa, prima utilizare a microsateliilor s -a realizat la Q. petraea (Steinkellner et al., 1997a), cnd au fost identificai 17 loci polimorfici. Steinkellner et al. (1997b) au artat c aceti loci se conserv la alte 6 specii de stejari. O contribuie important pentru dezvoltarea microsateliilor pentru stejarii albi europeni au adus Kampfer et al. (1998) care au dezvoltat 32 de microsatelii pentru Q. robur. Ulterior, pentru specia Q. rubra s-au dezvoltat un numr total de 30 de microsatelii (Aldrich et al., 2002, 2003) cu scopul de a fi utilizai pentru stejarii roii. Cea mai recent noutate n privina microsateliilor este dezvoltarea lor din regiuni care conin informaie genetic, respectiv din aa numitele EST (engl. Expressed Sequence Tags). Astfel de microsatelii au fost obinui pentru speciile Q. mongolica var. crispula (Ueno i Tsamura, 2008), respectiv Q. petraea i Q. robur (Durand et al., 2010). Un domeniu de utilizare a mcrosateliilor este cel al studierii diversitii genetice i a diferenierii interspecifice a cvercineelor. Astfel, s-au putut diferenia statistic speciile Q. robur i Q. petraea, pe baza diferenelor observate la frecvene alelice (Streiff et al., 1998; Muir et al., 2000; Muir i Schotterer, 2005), dar nu s-au identificat loci sau alele specifice unui taxon. Pentru a explica acest model al structurii genetice dintre specii au fost invocate originea comun sau fluxul genic interspecific (Muir i Schotterer, 2005; Lexer et al., 2006). ntre aceleai dou specii europene, Neophytou et al. (2010) au folosit un set de microsatelii pentru a detecta diferenierea interspecific i geografic, rezultatele sugernd c tiparul observat este modelat de fluxul genic i selecia natural. O difereniere semnificativ s-a observat ntre Q. alnifolia i Q. coccifera n Cipru (Neophytou et al., 2011a), indicnd un nivel redus al fluxului genic interspecific n populaiile pure i simpatrice. Bruschi et al. (2000) au relatat c trei microsatelii nucleari au difereniat mai slab speciile Q. petraea i Q. pubescens dect un set de 5 caractere micromorfologice ale frunzei. Totui, combinnd caracterele micromorfologice i 5 microsatelii nucleari, Fortini et al. (2009)

13

au reuit s discrimineze cinci specii de stejari care sunt destul de greu de separat ( Q. robur, Q. petraea, Q. frainetto, Q. pubescens i Q. virgiliana). La speciile Q. suber (Lopez-Aljorna et al., 2007), Q. semiserrata (Pakkad et al., 2008), Q. petraea (Pospiskova i Dostalek, 2009), Q. robur (Crciunesc et al., 2011), Quercus acutissima (Zhang et al., 2013) s-au comunicat valori ridicate ale diversitii genetice, dar majoritatea variaiei a fost situat n interiorul populaiilor. Observaiile asupra variaiei genetice de-a lungul transectelor ecologice au artat c adaptarea influeneaz o mic parte din genomul speciei Q. petraea (Alberto et al., 2010). Curtu et al. (2007a) au calculat variaia genetic i diferenierea din cadrul unei comuniti naturale cu cinci specii de cvercinee n Romnia ( Q. robur, Q. petraea, Q. pubescens, Q. frainetto i Q. cerris), fiind utilizate mpreun seturi de microsatelii i analize foliare. O strategie asemntoare a fost urmat de Yucedag i Gailing (2013) la speciile Q. petraea i Q. robur, n Turcia. Microsateliii s-au utilizat pe scar larg n studii de hibridare natural la cvercinee. Astfel, odat cu dezvoltarea unor aplicaii statistice puternice pentru alocarea indivizilor pe specii, s-a putut efectua evaluarea hibridrii natural la un nivel avansat. La genul Quercus, prima utilizare a metodelor bayesiene de alocare pe specii a fost realizat de Craft et al. (2002) la speciile americane Q. lobata i Q. douglasii, fiind comunicat un nivel sczut al hibridrii (4,6%). Valbuena-Carabaa et al. (2007) au analizat structura genetic spaial n trei populaii din Spania alctuite din Q. petraea i Q. pyrenaica. Pentru identificarea hibrizilor s-au folosit 9 microsatelii i 15 descriptori ai frunzelor. Este primul studiu n care hibridarea a fost descris ca un factor potenial important care modeleaz structura spaial n cadrul unei populaii aparinnd unei singure specii. Burgarella et al. (2009) au identificat hibrizii dintre dou specii mediteraneene de stejari (Q. suber and Q. ilex) cu ajutorul a 8 microsatelii i dou abordri bayesiene de alocare a indivizilor la specii i hibrizi. Rata medie de hibridare a fost foarte sczut (<2% indivizi introgresivi). O dinamic mai complex a hibridrii a fost evideniat n studiile care au utilizat mai multe specii de cvercinee, att n Europa (Curtu et al., 2007b; Lepais et al., 2009; Viscosi et al., 2012), ct i n Mexic (Penaloza-Ramirez et al., 2010). Speciile asiatice Q. liaotungensis i Q. mongolica prezint un tipar al hibridrii diferit n funcie de localizarea i compoziia arboretelor studiate, fiind comunicate proporii ale hibridrii n intervalul 8 - 57% la populaiile mixte (Zeng et al., 2010). La aceleai dou specii asiatice exist bariere reproductive puternice n nord-estul Chinei, ns acestea sunt mai permeabile n nordul Chinei, acolo unde cele dou specii sunt de mai puin timp n contact (Zeng et al., 2011). n schimb, la stejarii europeni s-a observat o hibridare limitat ntre speciile Q. coccifera i Q. ilex n Spania (Ortego i Bonal, 2010) sau ntre Q. alnifolia i Q. coccifera n Cipru (Neophytou et al., 2011b), probabil datorit unor bariere reproductive puternice.

14

Un alt domeniu extrem de important n genetica forestier este cel al studierii fluxului genic prin analize de paternitate i parentale. Fluxul genic este o caracteristic important a geneticii populaiilor, modelnd diversitatea speciilor. Fluxul genic actual poate fi studiat cu ajutorul markerilor genetici, prin reconstruirea relaiilor dintre generaia prinilor i cea a urmailor cu ajutorul analizelor de paternitate sau de prini. Analizele de paternitate (engl. paternity analysis) se realizeaz atunci cnd este cunoscut arborele de unde provin seminele, care vor fi genotipate la un numr de loci genici. Prin genotiparea ctorva sute de semine se poate obine o imagine detaliat a distribuiei distanelor i direciilor de polenizare, dar i a succesului reproducerii parentale (Ashley, 2010). Analizele de paternitate au artat c stejarii, specii anemofile, pot s i rspndeasc polenul pe distane lungi (Dow i Ashley, 1998; Streiff et al., 1999; Pluess et al., 2009). n pofita nivelului ridicat raportat pentru fluxului genic ndeprtat, ncrucirile apar de obicei ntre arborii apropiai, determinnd diferene semnificative n compoziia genetic a fondului de gene efectiv recepionat de fiecare arbore-mam ntr-un singur an (Streiff et al., 1999) sau n ani de reproducere diferii (Nakanishi et al., 2005). Analizele de paternitate bazate pe microsatelii au fost folosite pentru estimarea nivelului de hibridare la scar fin n arborete de cvercinee amestecate (Dow i Ashley, 1998; Salvini et al., 2009). Analizele de paternitate realizate asupra ghindelor provenite din ncruciri artificiale (Olrik i Kjaer, 2007) ale unui hibrid Q. robur x Q. petraea i speciile parentale au reliefat c arborele hibrid a prezentat o viabilitate ridicat a polenului. De asemenea, ntr-o livad semincer de Q. robur, prin aceste analize s-a identificat o proporie ridicat a polenizrilor din exteriorul acesteia (Buiteveld et al., 2001). Analizele parentale (sau de prini engl. parentage analysis) se realizeaz atunci cnd nu este cunoscut niciunul dintre genitorii puieilor sau seminelor. Acest tip de analize s-au efectuat ntr-un arboret mixt de Q. petraea i Q. robur din Frana de ctre Gerber et al. (2000). La aceeai pereche de specii, Chybicki i Burczyk (2010) au comunicat distane medii ridicate ale fluxului genic, de 298 i 463 m n dou arborete, n timp ce dispersia efectiv a ghindelor a fost mult mai redus (8,8 i 15,6 m). n Spania, ValbuenaCarabaa et al. (2005) au analizat nivelul fluxului genic i al hibridrii ntr-un arboret mixt cu Q. petraea i Q. pyrenaica, fiind observat o polenizare important din exteriorul zonei de studiu i o pondere a hibridrii de 8,5%. ntr-un studiu asupra a trei specii de stejari roii americani, Moran et al. (2012) au comunicat c peste 20% din puieii eantionai sunt hibrizi poteniali. Lepais i Gerber (2011) au studiat sistemul de ncruciare la patru specii de stejari albi dintr-un arboret mixt din sud-vestul Franei. n acest scop au fost combinate analizele de prini i cele de paternitate. Rezultatele ofer noi descoperiri n dinamica fluxului genic interspecific.

15

n primul rnd, hibrizii sunt n totalitate fertili i pot ndeplinii ambele roluri la reproducere, demontnd incompatibilitatea hibrizilor ca o barier reproductiv post-zigotic. n concluzie, fluxul genic este considerat mecanismul principal care menine integritatea speciilor, n timp ce existena barierele reproductive se presupune a fi premisa necesar pentru meninerea identitii speciilor (Rieseberg et al., 2004).

1.4.2.4. Cartografierea genomului Analiza cariotipului stejarilor a reliefat faptul c numrul cromozomilor este de 2n=24 (DEmerico et al., 1995), dei uneori a fost semnalat apariia natural a triploizilor (Dzialuk et al., 2007). La stejari construcia hrilor genetice de linkage s-au construit cu ajutorul analizelor familiilor de frai-buni (engl. full-sibs) i semi-frai (engl. half-sibs) (Kremer et al., 2007). Primele hri genetice la stejari au fost raportate la Q. robur (Barreneche et al., 1998; Bakker, 2001) i la Q. rubra (Romero-Severson et al., 2003). Ulterior, densitatea hrilor genomice ale stejarilor a fost crescut, mbuntiri ale acestora fiind semnalate de Barreneche et al. (2004), Lesur et al. (2011), Faivre Rampant et al. (2011), Bodenes et al. (2012). Hrile genetice au fost folosite pentru identificarea regiunilor genomice implicate n diferenierea speciilor. Astfel, Scotti-Saintagne et al. (2004a) au identificat puine regiuni cu diversitate interspecific ridicat la speciile Q. robur i Q. petraea. Acest model de difereniere interspecific este explicat de conceptul modern al speciei conform cruia gena este unitatea major de speciaie iar genomul este unul poros (Wu, 2001; Lexer i Widmer, 2008). Din aceste considerente evoluiile viitoare din domeniul genomicii sunt de un interes major pentru studiul diferenierii genetice i a identificrii hibrizilor dintre numeroii taxoni ai genului Quercus.

2. SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRILOR

2.1. Scopul cercetrilor Cercetrile ntreprinse i-au propus s aduc elemente noi privind hibridarea natural ntre speciile de cvercinee existente n fitocenoza forestier Bejan-Deva, recunoscut ca centru de hibridare a speciilor Quercus robur L. (stejar pedunculat), Q. petraea (Matt.) Liebl. (gorun), Q. frainetto Ten. (grni) i Q. pubescens Willd. (stejar pufos). Fa de cercetrile genetice anterioare efectuate cu ajutorul markerilor genetici de ctre Curtu (2006), cele din teza de fa prezint un nivel avansat de analiz i interpretare ca urmare a: i) investigrii fenologiei

16

nfloririi pentru a determina eventuale bariere prezigotice, respectiv a determina corespondena dintre fenologia taxonilor i nivelul de hibridare din fitocenoza luat n studiu; ii) utilizrii unui set mai mare de markeri moleculari capabili s exploreze regiuni mai mari din genom i s asigure o rezoluie mai bun de difereniere a speciilor i a hibrizilor dintre acestea. Totodat, se are n vedere continuarea evalurii fluxului genic actual pe baza analizelor de paternitate, pe un eantion mai mare de arbori seminceri.

2.2. Obiectivele cercetrilor Pentru atingerea scopului propus s-au stabilit urmtoarele obiective de cercetare: 1. Evaluarea fenologiei deschiderii mugurilor foliari i nfloririi ntr-un arboret mixt de stejari albi, n vederea stabilirii implicaiilor acesteia n producerea hibridrilor interspecifice; 2. Estimarea diversitii i diferenierii genetice n interiorul i ntre speciile de cvercinee i identificarea hibrizilor interspecifici pentru arborii maturi din complexul interspecific BejanDeva; 3. Estimarea fluxului genic actual cu ajutorul analizelor de paternitate.

3. MATERIAL I METODE DE CERCETARE

3.1 Materialul i metoda de cercetare pentru observaiile fenologice Observaiile fenologice s-au realizat n arboretul mixt din rezervaia natural BejanDeva (45 51' N 22 53' E, altitudine medie 326 m), localizat n sud-vestul Transilvaniei. n prezent, aceast pdure, aflat n administraia Ageniei pentru Protecia Mediului Hunedoara, este declarat sit Natura 2000 (cod ROSCI0136, tip SCI - sit de importana comunitar, pe o suprafa de 99 ha) datorit bogiei dendrologice de excepie, n special a genului Quercus. Suprafaa de cercetare a inclus 325 arbori ajuni la vrsta fructificaiei, aparinnd celor patru specii de cvercinee analizate i anume: 64 de exemplare de stejar pedunculat ( Quercus robur), 135 de gorun (Q. petraea), 47 de grni (Q. frainetto) i 79 de stejar pufos (Q. pubescens). Fiecare arbore a fost marcat n teren i cartat cu ajutorul aparatului Field-Map Antilope. Datele au fost prelucrate, iar cu ajutorul software-ului ArcGIS (ESRI), versiunea 9.3, sa realizat harta cu repartiia arborilor pe specii.

17

Datele climatice au fost furnizate prin intermediul unui senzor de temperatur i umiditate relativ a aerului (HOBO Pro v2), instalat n interiorul arboretului n data de 14 martie 2011, cu ajutorul cruia s-au nregistrat condiiile microclimatice la un interval de 30 de minute. Anterior deplasrii pe teren a fost stabilit metodologia de evaluare a fenofazei deschiderea mugurilor foliari prin care s-a stabilit c fiecrui arbore analizat s i fie atribuit la data msurtorilor o anumit valoare din intervalul 1-4 care semnific un anumit nivel din stadiul de nfrunzire. Aceast metodologie a fost preluat dup manualul de fenologie elaborat pentru studii de evaluare a efectelor poluanilor asupra pdurilor (Preuhsler, 1999). Astfel, arborii analizai la nivelul coronamentului au primit urmtoarele valori corespunztoare procentelor mugurilor foliari deschii: 1 procentul mugurilor deschii este 0; 2 procentul mugurilor deschii este cuprins ntre 1 i 33%; 3 - procentul mugurilor deschii este cuprins ntre 34 i 66%; 4 - procentul mugurilor deschii este cuprins ntre 67 i 100%. Cercetrile fenologice privind nflorirea s-au axat doar pe studiul florilor mascule (grupate n ameni), deoarece florile femele sunt de dimensiuni foarte mici (civa mm) i nu au putut fi observate cu suficient acuratee n coronament, la nlimi mari. Amenii masculi s-au clasificat dup culoarea i proporia lor (tabelul 3.1), utiliznd un telescop (40x) , pe un eantion de 108 exemplare din cele 4 specii de cvercinee: cte 28 de exemplare de stejar pedunculat (Quercus robur), 22 de gorun (Q. petraea), 37 de grni (Q. frainetto) i 21 de stejar pufos (Q. pubescens).
Tabelul 3.1. Clasificarea utilizat pentru aprecierea stadiului de dezvoltare a amenilor mascul i Table 3.1. The classification used for the appreciation of the male catkins development stage Stadiul 1 2 3 4 5 Descriere 100 % ameni de culoare verde sau verde -glbuie, ameni compaci pn la 50% din ameni de culoare glbui- cenuie, ameni alungii 50-100% din ameni de culoare glbui-cenuie, ameni alungii pn la 50% din ameni de culoare cenuie -negricioas (uscai) 100% ameni uscai, de culoare cenuie-negricioas Eliberare polen nu se elibereaz polen se elibereaz polen maxim eliberare polen se elibereaz polen nu se mai elibereaz polen

Pentru a evalua nivelul androsterilitii fenotipice, s-au efectuat i observaii privind numrul de ameni (flori mascule) raportat la mrimea coroanei. S-au folosit urmtoarele notaii: O lips ameni, P numr redus de ameni i M numr mare de ameni. Pentru testarea corelaiilor care apar ntre ani diferii la aceeai fenofaz, sau ntre cele dou fenofaze n aceiai ani s-a folosit testul neparametric Spearman din cadrul pachetului software SPSS Statistics 20 (IBM).

18

3.2. Materialul i metoda de cercetare pentru evaluarea hibridrii naturale la arborii maturi 3.2.1. Zona studiat i materialul de analiz Un set de 492 de arbori a fost eantionat, pe o suprafa de 8,5 ha, n rezervaia natural Bejan-Deva. Speciile avute n vedere pentru evaluarea fenomenului de hibridare natural n suprafaa de cercetare sunt: Quercus robur L. (stejar pedunculat), Q. petraea (Matt.) Liebl. (gorun), Q. frainetto Ten. (grni) i Q. pubescens Willd. (stejar pufos). ncadrarea taxonomic a exemplarelor eantionate s-a realizat cu ajutorul unui set de descriptori morfologici, conform cu ofletea i Curtu (2007). Coordonatele geografice au fost obinute cu ajutorul aparatului Field-Map Antilope. Ulterior, datele au fost prelucrate, iar cu ajutorul software-ului ArcGIS, versiunea 9.3, s-a realizat harta cu repartiia arborilor pe specii. Materialul necesar analizelor genetice a constat din muguri sau frunze prelevate din coroana arborilor cu ajutorul foarfecelor telescopice i a unei catapulte. Probele biologice au fost transportate n laboratorul de genetic molecular din Braov, unde au fost stocate la temperatura de -60C.

3.2.2. Efectuarea analizelor de laborator Izolarea ADN-ului este prima etap n realizarea analizelor genetice cu ajutorul markerilor moleculari. Aceast operaiune a necesitat n prealabil decorticarea, cu ajutorul unui bisturiu i al unei pensete, a 4-6 muguri aflai n repaus vegetativ. Materialul vegetal provenit din interiorul mugurilor (aproximativ 50 mg) s-a introdus ntr-un tub de 2 ml, etichetat cu numrul arborelui de provenien, mpreun cu dou bile de wolfram. Cu ajutorul unei mori de tipul Tissue Lyser Rotch MM400 s-a efectuat macerarea probelor, n dou etape succesive a cte un minut, cu o frecven de 30 Hz. Izolarea propriu-zis s-a realizat conform protocoalelor de lucru Qiagen (Mini kit) i Bioline (ISOLATE Plant DNA Mini kit). Rezultatul izolrii const n obinerea unor. Volumul obinut prin acest procedeu, la fiecare individ, este de 100 l soluie stoc care conine ADN-ul arborilor eantionai. Testarea calitii i a concentraiei ADN-ului izolat s-a realizat cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop 8000. Calitatea ADN-ului izolat se apreciaz n funcie de raportul 260/280 la care valorile optime sunt situate n intervalul 1,8 2,0. n funcie de aceste dou proprieti ale soluiilor stoc de ADN s-au efectuat diluiile acestora. Efectuarea reaciilor de polimerizare n lan. n acest studiu s-a folosit un set de 16 markeri moleculari nucleari (tabelul 3.2) dezvoltai anterior pentru amprentarea genetic a speciilor de stejari (Steinkellner et al., 1997a; Kampfer et al., 1998; Durand et al., 2010; Vornam et al., 2011). Din cei 16 markeri utilizai, 15 sunt microsatelii iar un marker este o poriune

19

dintr-o gen (DHN3). Cei 15 microsatelii sunt de dou tipuri: i) microsatelii genomici, la care nu se tie cu exactitate dac sunt localizai n regiunile n care se codific sau nu proteinele; ii) microsateliii EST care sunt localizai n regiunile unor gene.
Tabelul 3.2. Caracteristicile markerilor moleculari utilizai Table 3.2. Characteristics of the molecular markers used
Tipul markerilor Microsate-lii genomici (gSSRs) Locus Secvena primerilor (nainte/ napoi) CAACTTGGTGTTCGGATCAA GTGCATTTCTTTTATAGCATTCAC GCAATTACAGGCTAGGCTGG GTCTGGACCTAGCCCTCATG CCTTGAACTCGAAGGTGTCCTT GTAGGTCAAAACCATTGGTTGACT CCATTAAAAGAAGCAGTATTTTGT GCAACACTCAGCCTATATCTAGAA CACCGCTGGAATTTTAAGGGA GACCTAAGCCAAAGTGTGGGC TCCCACCACTTTGGTCTCTCA GTTGTCAGCAGTGGGATGGGTA CCCAGTCACATCCACTACTGTCC GGTTGGGAAAAGGAGATCAGA GGAGGCTTCCTTCAACCTACT GATCTCTTGTGTGCTGTATTT TTCTTGCTTTGGTGCGCG GTGGTCAGAGACTCGGTAAGTATT C AGAAAGTTCCAGGGAAAGCA CTTCGTCCCCAGTTGAATGT GAGAGAGAGAGAGACAAAGAAGA AAAA AAATTCTCCGCCACATTGAG ACGAAATGGAGCTGTTGACC TCTCCTTCTCTTCTGCCATGA AGAAGCCCAACACGGCTAC AGCAAAACACAAACGCACAA CAACAAATGGCTCAACAGTG CCCATTTGGTAGCAAAGAGTC TGTAAAACGACGGCCAGTTACCATGATCTGGGAAGCAAC AAGGGCTTGGTTGGGTTAGT TCCATCACTCCCTTCTTCTGA TGTCGCATTACCAAAACCAG Motivul / Tipul nucleotidelor di- / TC di- / AG di- / TC di- / TC di- / TC di- / TC di- / TC di- / AG di- / GA di- / AT tri- / TTC tri- / GAG tri- / GGT di- / AT tri- / TGG Grupul linkage 2 7 10 1 5 2 10 8 12 3 11 12 2 Culoarea Beckmann D4 (albastru) D2 (negru) D3 (verde) D3 (verde) D2 (negru) D2 (negru) D3 (verde) D4 (albastru) D4 (albastru) D2 (negru) D3 (verde) D4 (albastru) D3 (verde) D4 (albastru) M13 nemarcat Vornam et al., 2011 Steinkellner et al., 1997a Kampfer et al., 1998 Kampfer et al., 1998 Referin Kampfer et al., 1998 Steinkellner et al., 1997a

ZAG7 ZAG9 ZAG11 ZAG20 ZAG39 ZAG87 ZAG96 ZAG110 ZAG112

Microsate-lii EST (engl. Expressed Sequence Tag) (eSSRs)

GOT021 PIE040 PIE215 PIE223 PIE239 PIE227 DHN3

Durand et al., 2010

Procedura de lucru adoptat a presupus gruparea microsateliilor n 3 kituri multiplex i 2 reacii PCR independente (tabelul 3.2). Toate reaciile de polimerizare n lan (PCR) s -au realizat ntr-un volum optimizat de 10l care a coninut 20ng ADN, 1x buffer PCR (Promega), 2,25 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP (Fermentas), 0,5 uniti (U) polimeraz Taq (Promega) i fiecare pereche de primeri la diferite concentraii (tabelul 3.3). Totui, o excepie este reprezentat de locusul microsatelitic PIE227, care este marcat cu primerul fluorescent universal M13 (Schuelke, 2000). Dup optimizri, volumul necesar acestei reacii PCR a fost de 5l, din care jumtate este ocupat de HotStarTaq MasterMix (Qiagen), 0,15l primerul nainte, cte 0,60l primerul napoi, respectiv primerul M13, 0,15l ap pur i 1l ADN (20ng). Reaciile de polimerizare n lan s-au efectuat pe una din cele dou maini PCR (eng. thermocycler): Palm-Cycler CG1-96 (Corbett) i Mastercycler Gradient (Eppendorf). Dup

20

efectuarea unor teste i optimizri, s-a creat un singur program PCR pentru kiturile 1, 2 i 3, dar i pentru reacia simplex la locusul DHN3. Acest program const ntr-un prim pas de denaturare iniial a ADN-ului la temperatura de 95C, timp de 3 minute, urmat de 30 de cicluri cu urmtoarea structur: ruperea punilor de hidrogen dintre nucleotidele complementare la 95C, timp de 40 de secunde, legarea primerilor la 55C timp de 1 minut, sintetizarea noilor catene la temperatura de 72C, timp de 2 minute. Etapa final presupune o sintetizare suplimentar, timp de 15 minute, la temperatura de 72C. La final, programul prevede meninerea unei temperaturi constante de 4-8C n blocul mainii pn la preluarea.
Tabelul 3.3. Aranjarea markerilor n kituri PCR Table 3.3. Disposal of markers in PCR kits
Kitul Locus ZAG112 ZAG39 ZAG96 ZAG110 ZAG11 ZAG87 ZAG7 ZAG20 ZAG9 GOT021 PIE040 PIE215 PIE223 PIE239 PIE227 DHN3 Culoarea Beckmann D4 (albastru) D2 (negru) D3 (verde) D4 (albastru) D3 (verde) D2 (negru) D4 (albastru) D3 (verde) D2 (negru) D2 (negru) D3 (verde) D4 (albastru) D3 (verde) D4 (albastru) M13-D4 (albastru) nemarcat Concentraia primerilor (M) 0,05 0,35 0,30 0,20 0,35 0,25 0,30 0,40 0,30 0,30 0,28 0,15 0,17 0,35 0,5 Lungimea alelelor (pb) 74 - 140 103 - 209 140 186 203 - 273 243 - 311 99 - 195 117 - 173 155 - 199 178 - 260 97 - 121 169 - 192 190 - 223 203 - 233 80 - 108 170 197 1) 290 330 2)

4 5

* 1) alelele advrate au lungimea mai mic cu 18 perechi de baze din cauza secvenei de nucleotide fosforescente necesare metodei M13; 2) intervalul este estimat vizual dup o scar BenchTop PCR Markers (Promega).

La probele care au prezentat o calitate mai slab a ADN-ului izolat, s-a utilizat o enzim mai puternic, denumit HotStarTaq (Qiagen). Un program PCR diferit a fost creat i pentru locusul microsatelitic PIE227. n acest caz, programul nested PCR are urmtoarea configuraie: denaturarea iniial la 94C timp de 15 minute, urmat de 30 de cicluri necesare amplificrii regiunii de interes (denaturare la 94C, timp de 45 secunde; legarea primerilor la temperatura de 56C, timp de 1 minut; elongarea catenelor timp de 1 minut i 30 secunde, la 72C) i 8 cicluri necesare atarii primerului M13 de primerul napoi (denaturare la 95C, timp de 30 secunde; legarea primerului M13 la temperatura de 53C, timp de 45 secunde; elongarea catenelor timp de 45 secunde, la 72C). Elongarea final a catenelor se produce la 72C, timp de 15 minute. Genotiparea cu ajutorul electroforezei capilare. Genotiparea arborilor la 15 dintre loci s-a realizat cu ajutorul electroforezei capilare rulat pe aparatul GenomeLab GeXP (Beckman-Coulter), dotat cu un set de opt capilare. Anterior rulrii electroforezei capilare s-au pregtit probele ntr-un volum de 40l pentru fiecare prob analizat, care a coninut 2l produs PCR, 37,68 SLS i 0,32l Size Standard 400. Ultimul compus are rolul de etalon pentru secvenele analizate i este marcat cu culoarea fluorescent D1 (rou). Citirea genotipurilor s-a

21

realizat vizual, deoarece altfel exista riscul de a nu fi identificate alelele mai puin puternice. Un exemplu al rezultatelor furnizate de electroforeza capilar este redat n figura 3.1.

Figura 3.1. Electroforegram pentru cinci microsatelii. Un individ heterozigot prezint dou peak-uri de lungimi diferite, iar un individ homozigot are un singur peak. Figure 3.1. Electrophoregram for 5 microsatellites. A heterozygous individual has two peaks of different lenghts and a homozygous individual has just one peak.

Genotiparea cu ajutorul electroforezei orizontale. Pentru a genotipa indivizii analizai la locusul genic DHN3, s-a utilizat electroforeza orizontal. Mediul de migrare al produselor PCR a fost gelul de agaroz de concentraie 2%, colorat cu GelRed (Biotium). Cte 4l de produs PCR s-a introdus n fiecare godeu, iar ca etalon s-a folosit scara BenchTop PCR Markers (Promega) cu 50 de linii. Parametrii electroforezei au fost urmtorii: 100 V, 300 mA, 300 W, timp de 90 de minute. Genotipul fiecrui arbore s-a citit n lumin ultraviolet cu ajutorul transiluminatorului GelDoc-It TS Imaging System (UVP). Un exemplu de interpretare al rezultatelor obinute n urma electroforezei orizontale sunt afiate n figura 3.2.

Figura 3.2. Variaia locusului genic DHN3 evideniat prin electroforez orizontal. Un individ heterozigot prezint dou benzi de lungimi diferite, iar un individ homozigot are o singur band. Alelele de lungime mai mic au migrat mai repede. n primul godeu se afl etalonul BenchTop. Figure 3.2. Variation of the DHN3 genic locus highlighted by horizontal electrophoresis. A heterozygous individual has two lines of different lenghts and a homozygous individual has one line. Alleles of a smaller lenght have migrated faster. In the first hole there is the BenchTop standard.

3.2.3 Analiza setului de date genetice Datele obinute n urma electroforezelor capilar i orizontal s-au trecut ntr-un fiier Excel (Microsoft) n care s-au realizat rotunjirile lungimilor alelelor la numere ntregi i s-au construit genotipurile multilocus ale celor 492 de indivizi. Stejarii sunt specii diploide, deci

22

prezint cte dou alele la fiecare locus genic, una motenit de la arborele donator de polen i cealalt de la arborele-mam (semincer). Un individ este considerat homozigot la un locus genic dac cele dou alele au lungimi egale. n schimb, un individ heterozigot la un locus genic prezint dou alele de lungimi diferite pe cromozomii pereche, astfel nct pe electroforegrame sunt dou peak-uri diferite. Pentru analiza genetic a setului de date, s-au constituit pe criterii morfologice patru populaii corespunztoare speciilor de cvercinee analizate. 3.2.3.1. Evaluarea erorilor de citire i a alelelor nule din setul de date Cu ajutorul programului Microchecker 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) s-a evaluat setul de date pentru posibile erori de citire (engl. scoring errors) i existena alelelor nule (neamplificate). Cele mai frecvente erori de citire sunt: i) omiterea unei alele de lungime mare datorit unei semnal foarte slab al peak-ului corespunztor acesteia (engl. large allele drop-out); ii) prezena unor alele care difer doar printr-o pereche de baze (engl. stuttering) din cauza unor mutaii care creaz o abatere de la respectarea motivului cunoscut (Van Oosterhout et al., 2004). Testele au presupus 1000 de randomizri ale alelelor la fiecare locus din oricare populaie, cu un interval de ncredere de 95%. Rezultatele indic o posibil apariie a alelelor nule la 6 din cei 16 loci analizai (tabelul 3.4). Totui, locusul PIE239 prezint alele nule la toate cele patru populaii, ZAG7 la trei populaii (excepie Q. frainetto), ZAG11 i PIE227 la Q. petraea i Q. robur, ZAG39 la Q. frainetto i Q. pubescens, doar ZAG20 este identificat la o singur populaie. Cel mai predispus locus genic la alele nule pare s fie PIE239, cu frecvene ale acestora situate ntre 8,86% (Q. pubescens) i 25,67% (Q. petraea).
Tabel 3.4. Frecvenele alelelor nule calculate cu metota Oosterhout Table 3.4. Frequencies of the null alleles calculated with the Oosterhout method Frecven alele Frecven alele Specia Locus nule Oosterhout Specia Locus nule - Oosterhout (%) (%) 1 ZAG39 6,28 ZAG39 6,421 Quercus frainetto Quercus pubescens 1 PIE239 24,86 PIE239 8,861 ZAG11 3,81 ZAG11 2,93 ZAG7 2,21 ZAG7 3,17 Quercus petraea PIE239 25,671 Quercus robur ZAG20 4,34 PIE227 4,13 PIE239 18,81 Quercus pubescens ZAG7 3,25 PIE227 5,941 1 situaie n care s-au calculat frecvenele alelelor ajustate

Programul Microchecker a identificat apariia unor posibile erori datorate prezenei unor alele care difer doar printr-o pereche de baze (engl. stuttering) la locusul PIE239, la speciile Quercus petraea, Q. robur, respectiv Q. frainetto. Erori de citire cauzate de omiterea unei alele de lungime mare (engl. large allele drop-out) nu au fost identificate n niciunul dintre cazuri.

23

3.2.3.2. Parametrii genetici Pentru fiecare locus genic s-a evaluat intervalul de variaie al alelelor, prezena alelelor specifice (care apar doar la o singur specie), frecvenele alelelor, cu ajutorul programului genetic GenAlEx 6.5 (Peakall i Smouse, 2006). Pentru evaluarea caracteristicilor genetice ale complexului de cverci nee din Pdurea Bejan-Deva au fost calculai urmtorii parametrii genetici, cu ajutorului programului GenAlEx 6.5 (Peakall i Smouse, 2006, 2012): Ne (numrul efectiv de alele pe locus), Na (numrul mediu de alele pe locus), Ho (heterozigoia observat), He (heterozigoia ateptat, diversitatea genetic), F (indicele de fixare). Parametrul AR (engl. allelic richness), o msur a diversitii independent de mrimea eantionajului (Petit et al., 1998), s-a calculat cu programul FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2002). n acest studiu, mrimea acestui parametru s-a calculat pentru 63 de indivizi, valoare corespunztoare celui mai mic eantion. Echilibrul Hardy-Weinberg la fiecare populaie (specie n cazul de fa) sau la fiecare locus pentru ntregul eantion, a fost testat cu ajutorul programului GenePop 4.2 (Raymond i Rousset, 1995; Rousset, 2008), prin metoda testului exact (engl. exact test). Cu acelai program s-a ncercat evaluarea dezechilibrului linkage dintre locii analizai.

3.2.3.3. Stabilirea celei mai bune metode de grupare pe specii Metodele de alocare a indivizilor la specii sau hibrizi (engl. genetic assignment) sunt un set de abordri statistice puternice care pot fi folosite pentru a stabili apartenena indivizilor la o anumit populaie sau taxon, permind estimarea proporiei de apartenen la speciile parentale a genomului indivizilor hibrizi. Cu toate c la ora actual exist mai multe programe de alocare genetic a indivizilor la specii, ntr-un articol recent (Crciunesc et al., 2013) s-au testat, pentru condiiile specifice Pdurii Bejan, patru din cele mai des utilizate programe. Rezultatele au indicat c cel mai bun program de alocare genetic este STRUCTURE i din aceast cauz va fi utilizat la identificarea hibrizilor. Pentru identificarea ct mai exact a hibrizilor, n condiiile specifice utilizrii unui anumit set de markeri genetici, se recomand calcularea urmtorilor parametrii (Vaha i Primmer, 2006) cu scopul de a indica cel mai potrivit prag (o proporie din genomul arborilor) care delimiteaz arborii care aparin unei anumite specii de exemplarele hibride: eficiena, acurateea i performana global. Pentru ndeplinirea acestui scop, s-a stabilit urmtoarea strategie pentru efectuarea testrii: cu ajutorul programului STRUCTURE 2.3.3 (Pritchard et al., 2000) s-au rulat cei 492 de arbori eantionai n suprafaa de cercetare. Dup analiza rezultatelor s-au selectat cele mai probabile 35 de exemplare, cu coeficientul de apartenen q>0,90, al cror genotip s aparin la

24

fiecare din cele patru specii. Cu ajutorul acestor 140 de genotipuri multilocus i a programului HYBRIDLAB v1.0 (Nielsen et al., 2006) s-au simulat n total 4900 de indivizi pentru mai multe categorii pure sau hibride. Cel mai potrivit prag de discriminare ntre exemplarele pure i hibride este cel corespunztor celei mai ridicate performane a programului STRUCTURE. 3.2.3.4. Stabilirea numrului de clustere genetice Pentru evaluarea structurii genetice i stabilirea numrului de clustere genetice din meta-populaia eantionat a fost folosit metoda Bayesian implementat n programul STRUCTURE 2.3.3 (Pritchard et al., 2000). Numrul de clustere genetice (K) a fost setat n intervalul 1-10. Pentru fiecare K s-au efectuat 10 rulri independente, cu 200000 de pai pentru burn-in, urmai de 500000 repetri MCMC.. Dup terminarea rulrii programului STRUCTURE, de mare importan este deducerea valorii K care corespunde numrului de clustere pentru eantionul studiat. La ora actual majoritatea studiilor care utilizeaz programul STRUCTURE iau n considerare metoda propus de Evanno et al. (2005). Pentru realizarea acestui deziderat sa utilizat programul online Structure Harvester v. 0.6 (Earl i vonHoldt, 2012). 3.2.3.5. Diferenierea interspecific n genetica populaiilor, unul dintre obiectivele importante este identificarea, cuantificarea i compararea diferenierii genetice populaii, specii sau chiar studii (Bird et al., 2011). n studiile care folosesc markeri foarte polimorfici (de ex. microsateliii), diferenierea genetic este subestimat prin folosirea indicilor de fixare (Hedrick, 1999). La ora actual, n categoria indicilor de fixare sunt catalogai urmtorii parametri: GST (Nei 1973, 1987), (Cockerman 1969, 1973; Weir i Cockerham, 1984) i ST generat de AMOVA (Excoffier et al., 1992). O alt abordare a fost propus de Jost (2008) care a folosit adevrata diversitate alelic () pentru a deriva o msur a diferenierii genetice: Dest. Acest indice face parte din categoria indicilor de difereniere. n studiul de fa s-au utilizat indici de fixare i indici de difereniere, calculai cu ajutorul programelor GenAlEx 6.5 i Genepop 4.2.

3.3. Material i metod de cercetare pentru evaluarea fluxului genic actual

3.3.1. Recoltarea ghindelor Pentru caracterizarea sistemului reproductor al stejarilor s-au recoltat ghinde din suprafaa de cercetare, de sub coroana unor arbori considerai arbori-mam. n toamna anului 2012 s-a recoltat un numr de 313 ghinde de la 15 arbori-mam, din care 8 au putut fi alocai

25

genetic la o specie de stejar (4 arbori de Q. robur, 2 arbori de Q. petraea i 2 arbori de Q. pubescens) i 7 arbori au fost considerai hibrizi din punct de vedere genetic, ntre diferite perechi de specii (2 arbori hibrizi ntre Q. frainetto i Q. pubescens, 1hibrid ntre Q. frainetto i Q. robur, 3 hibrizi ntre Q. petraea i Q. pubescens, respectiv 1 arbore hibrid ntre Q. petraea i Q. robur). Numrul ghindelor recoltate de la un arbore-mam a variat ntre 8 i 31.

3.3.2. Genotiparea ghindelor Ghindele recoltate din rezervaia natural Bejan-Deva au fost transportate n laboratorul de Genetic forestier dinBraov, unde au fost pstrate la temperaturi de -20C pn la momentul extraciei ADN-ului. Pentru izolarea ADN-ului s-au secionat ghindele transversal i s-au extras seciuni din embrionul ghindei. Aproximativ 40-60 mg de material vegetal a fost mrunit cu bisturiul i introdus ntr-un tub de 2ml mpreun cu 2 bile de wolfram. Dup o macerare cu ajutorul morii cu bile Tissue Lyser Rotch MM400, s-au urmat paii descrii n protocoalele de lucru ale kitului de extracie a ADN-ului Bioline (ISOLATE Plant DNA kit). Dup testarea concentraiei soluiei stoc de ADN cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop 8000, s-au realizat diluiile la concentraia 1: 20. Reaciile de polimerizare n lan s-au efectuat cu 10 din microsateliii utilizai la genotiparea arborilor maturi, grupai n dou kituri multiplex: kitul 1 (ZAG9, ZAG11, ZAG96, ZAG110 i ZAG112) i kitul 2 (ZAG7, ZAG20, ZAG87, PIE215 i PIE223). Genotiparea la cei 10 loci s-a realizat prin electroforez capilar cu dou rulri pentru fiecare ghind, corespunztoare celor dou kituri PCR.

3.3.3. Analizele de paternitate Pentru a determina arborii donatori de polen pentru ghindele recoltate din suprafaa de cercetare s-a utilizat programul CERVUS 3.0 (Kalinowski et al., 2007), pentru a realiza analizele de paternitate. Dup ce s-a creat un fiier cu toate genotipurile disponibile, s-au introdus numerele arborilor maturi i ale ghindelor n alte dou fiiere text. Pasul urmtor const n analiza frecvenelor alelice pe care se bazeaz analizele ulterioare. Pentru a estima valorile critice ale statisticii log-likelihood (LOD) sau Delta necesare unei evaluri statistice ale intervalului de ncredere pentru analizele parentale, s-a realizat o analiz de simulare parental. Parametrii utilizai au fost urmtorii: numrul de urmai - 30000, prini candidai - 700, proporia eantionat - 0,7, proporia locilor etichetai greit - 0,05, numrul minim de loci etichetai - 5. Urmtoarea etap este analiza parental propriu-zis prin care s-au calculat probabilitile maxime de identificare a potenialilor arbori-tat din eantion, pe baza statisticii Delta () care exprim diferena dintre scorurile LOD ale celor mai posibili doi candidai.

26

4. REZULTATE I DISCUII

4.1. Structura fenologic n complexul de cvercinee Bejan-Deva 4.1.1. Datele climatice pentru cei trei ani de observaii fenologice 4.1.1.1. Date climatice n anul 2011 Datele brute raportate de senzorul de temperatur i umiditate relativ a aerului au fost prelucrate i s-au obinut mediile zilnice pentru perioada 15 martie 8 mai 2011. n acest intervalul temperaturile medii zilnice au fost cuprinse ntre 5,0C (20 martie 2011) i 15,6C (22 aprilie 2011). Amplitudinea medie din acest inteval a fost de 10,6C, iar temperatura medie a fost de 11,2C. Temperatura minim absolut din interiorul arboretului a fost de 2,8C, nregistrat n data de 22 martie 2011 (ora 6:00), n timp ce temperatura maxim absolut s-a produs n data de 4 aprilie 2011 (ora 15:00) cu valoarea de 21,6C. Astfel, amplitudinea absolut din intervalul analizat a fost de 18,8C.. 4.1.1.2. Date climatice n anul 2012 n intervalul analizat temperaturile medii zilnice au fost cuprinse ntre 3,7C (9 aprilie 2012) i 23,1C (3 mai 2012). Amplitudinea medie din inteval 15 martie 8 mai a fost de 19,4C, iar temperatura medie a fost de 12,9C. Temperatura minim absolut din interiorul arboretului a fost de 0,5C, nregistrat n data de 2 aprilie 2012 (ora 6:30), n timp ce temperatura maxim absolut s-a produs n data de 3 mai 2012 (ora 14:30) cu valoarea de 26,9C. Astfel, amplitudinea absolut din intervalul analizat a fost de 26,4C. Ultima zi cu temperaturi negative din primvara anului 2012 s-a nregistrat n afara intervalului analizat, i anume n data de 9 martie. 4.1.1.3. Date climatice n anul 2013 Anul 2013 s-a caracterizat printr-o primvar cu temperaturi sczute care nu au depit pragul de 10C pn n data de 12 aprilie. n intervalul de timp analizat temperaturile medii au variat ntre -0,2C (16 i 17 martie) i 22,7C (3 mai), ceea ce marcheaz o amplitudine medie de 22,9C. Temperatura medie n perioada 15 martie 8 mai a fost de doar 10,9C. n perioada temporal analizat, n interiorul arboretului s-a nregistrat temperatura minim absolut de 1,3C n data de 17 martie 2013 (ora 8:00), iar temperatura maxim absolut a fost de 25,8C, raportat n data de 30 aprilie 2013 (ora 18:00). Astfel, amplitudinea absolut a fost de 27,1C, fiind cea mai ridicat n cei trei ani de observaii: cu 0,7C mai mare dect n anul 2012 i cu 8,3C superioar celei din anul 2011.

27

Interesant este c n anul 2013 ultima zi cu temperaturi negative a fost 29 martie (0,2C). Acest aspect difereniaz anul 2013 de ceilali doi ani, deoarece n acest an temperaturile negative au aprut cu cel puin 20 de zile mai trziu.

4.1.2. Fenofaza de deschidere a mugurilor foliari 4.1.2.1. Deschiderea mugurilor foliari n anul 2011 Observaiile fenologice privind deschiderea mugurilor s-au efectuat n perioada 1 aprilie 26 aprilie. Debutul acestei fenofaze s-a nregistrat n data de 3 aprilie 2011, dup 4 zile n care temperaturile maxime au depit 15C. Aceast zi va fi folosit ca reper, fiind numerotat cu numrul 1 (tabelul 4.1).
Tabelul 4.1. Numerotarea zilelor calendaristice n anul 2011 Table 4.1. Day numbers of the year 2011 Data Nr. Data Nr. Data Nr. Data 11 apr. 13 15 apr. 17 19 apr. 21 23 apr. 12 apr. 14 16 apr. 18 20 apr. 22 24 apr. 13 apr. 15 17 apr. 19 21 apr. 14 apr. 16 18 apr 20 22 apr.

Nr. 1 2 3 4

Data 3 apr. 4 apr. 5 apr. 6 apr.

Nr. 5 6 7 8

Data 7 apr. 8 apr. 9 apr. 10 apr.

Nr. 9 10 11 12

Gorunul este specia care a dominat aceast fenofaz n prima sptmn, cnd s-a observat deschiderea mugurilor la 84% din totalul exemplarelor (figura 4.1). Zilele n care la o specie s-a nregistrat deschiderea mugurilor n cea mai mare proporie sunt urmtoarele: ziua a 7a de la debutul fenofazei (9 aprilie 2011) pentru gorun, stejarul pufos i stejarul pedunculat, n timp ce grnia este specia care prezint cel mai mare procent al deschiderii mugurilor ntr-o singur zi, respectiv 41% n data de 12 aprilie 2011. Gorunul a avut nevoie de cel mai mic interval de timp (16 zile) n care toi arborii eantionai la aceast specie au atins stadiul 2 al deschiderii mugurilor (figura 4.1). Totui, diferenele fa de celelalte specii nu sunt mari, deoarece grnia a atins pragul de 100% arbori nmugurii n 17 zile, stejarul pedunculat n 18 zile, iar stejarul pufos n 20 de zile.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Figura 4.1. Procentul arborilor pornii n vegetaie n anul 2011 (prima zi de nmugurire a fost n 3 aprilie, ultima zi n 24 aprilie) Figure 4.1. The percentage of the flushing trees in 2011 (the first day of bud burst was the 3rd of April, the lasy day was the 24th of April)

FRA PET PUB ROB

28

Interesant este i viteza cu care speciile au atins pragul de 90% din totalul arborilor pornii n vegetaie. Primul loc n clasament este ocupat de Quercus petraea, la un avans considerabil (5 zile) de Q. frainetto, Q. pubescens i Q. robur, desprite ntre ele de cte o zi. 4.1.2.2. Deschiderea mugurilor foliari n anul 2012 n anul 2012 pornirea n vegetaie a arborilor a debutat n data de 6 aprilie care coincide cu un prim maxim de temperatur realizat n zilele de 5 i 6 aprilie. Ziua de 6 aprilie va fi folosit n acest studiu ca zi de reper i va fi notat cu ziua 1, toate celelalte zile fiind numerotate n funcie de aceast zi (tabelul 4.2). Totui, din cauz c n urmtoarele zile temperatura a sczut destul de mult, s-a produs o stagnare a procesului de deschidere a mugurilor care s-a manifestat pe un interval de o sptmn. n acest interval mediile termice zilnice s-au situat sub 10C, minima zilnic fiind de 0,6C n data de 10 aprilie.
Tabelul 4.2. Numerotarea zilelor calendaristice n anul 2012 Table 4.2. Day numbers of the year 2012 Nr. Data Nr. Data Nr. Data Nr. Data 13 18 apr. 17 22 apr. 21 26 apr. 25 30 apr. 14 19 apr. 18 23 apr. 22 27 apr. 26 1 mai 15 20 apr. 19 24 apr. 23 28 apr. 27 2 mai 16 21 apr. 20 25 apr. 24 29 apr.

Nr. 1 2 3 4 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Data 6 apr. 7 apr. 8 apr. 9 apr.

Nr. 5 6 7 8

Data 10 apr. 11 apr. 12 apr. 13 apr.

Nr. 9 10 11 12

Data 14 apr. 15 apr. 16 apr. 17 apr.

FRA PET PUB

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Figura 4.2. Procentul arborilor pornii n vegetaie n anul 2012 Figure 4.2. The percentage of the flushing trees in 2012

Diferene interspecifice exist la intervalul format ntre primul i ultimul arbore care a pornit n vegetaie (figura 4.2). Pragul de 90% al arborilor la care s-a consemnat deschiderea mugurilor este atins cel mai repede de specia Q. petraea, urmat de Q. pubescens, Q. robur i Q. frainetto, ultimele dou cu o diferen foarte mic ntre ele. 4.1.2.3 Deschiderea mugurilor foliari n anul 2013 Fenofaza deschiderea mugurilor a fost influenat semnificativ de temperaturile sczute nregistrate n lunile martie i aprilie. Debutul acestei fenofaze a fost consemnat n data de 18 aprilie, probabil sub influena celor 7 zile anterioare cu temperaturi mai mari de 10C. Ziua de 18

29

aprilie este reper pentru aceast fenofaz n anul 2013, iar toate celelalte zile n care s -a consemnat deschiderea mugurilor n suprafaa cercetat sunt dependente de aceasta (tabelul 4.3).
Tabelul 4.3. Numerotarea zilelor calendaristice n anul 2013 Table 4.3. Day numbers of the year 2013 Nr. Data Nr. Data Nr. Data Nr. Data 1 18 apr. 4 21 apr. 7 24 apr. 10 27 apr. 2 19 apr. 5 22 apr. 8 25 apr. 11 28 apr. 3 20 apr. 6 23 apr. 9 26 apr. 12 29 apr.

Din cauza debutului trziu al acestei fenofaze, intervalul temporal pe care aceasta s-a manifestat a fost de doar 12 zile. La specia Q. pubescens debutul acestei fenofaze a fost n ziua de 19 aprilie, la Q. robur n data de 21 aprilie, iar la Q. frainetto n ziua de 22 aprilie. Pe fondul creterii progresive a temperaturii are loc o evoluie treptat a fenofazei deschiderea mugurilor, care a culminat n data de 24 aprilie (ziua a aptea de la nceputul fenofazei) cnd s -a observat stadiul 2 al acestei fenofaze la 36,5% din arborii eantionai.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

FRA PET PUB ROB

Figura 4.3. Procentul arborilor pornii n vegetaie n anul 2013, n funcie de specie Figure 4.3. The percentage of the flushing trees in 2013, acoording to the species

n ceea ce privete dinamica i comportamentul observat la fenofaza deschiderea mugurilor la cele patru specii de cvercinee trebuie precizat faptul c Q. petraea a fost specia cu cea mai rapid rat de avans observat la pragul de 90% (figura 4.3). Speciile clasate pe urmtoarele locuri au fost, n ordine, Q. pubescens, Q. robur i Q. frainetto, la o diferen semnificativ de gorun. Cea mai mare diferen interspecific observat la aceast fenofaz s-a consemnat n ziua a aptea, cnd proporia arborilor la care s-a declanat deschiderea mugurilor a fost de 97% pentru Q. petraea i de doar 26% pentru Q. frainetto.

4.1.2.4. Concluzii privind fenofaza deschiderea mugurilor n general, s-a observat un interval mediu de 4-5 zile n care un arbore din eantion a ajuns din stadiul 2 n stadiul 4 al deschiderii mugurilor foliari. Din analiza datelor fenologice ale deschiderii mugurilor din cei trei ani de observaii se poate observa c gorunul a pornit primul n 30

vegetaie, cu un avans care s-a meninut pn la final. Totui, diferenele dintre speciile clasate pe locurile 2-4 sunt destul de mici. De remarcat este faptul c n anii 2012 i 2013 acest clasament a rmas nemodificat, n pofida unor intervale de timp cu lungimi diferite. Clasarea gorunului pe primul loc n cei trei ani este explicat prin cerinele acestuia fa de cldur, fiind o specie mezoterm situat la limita inferioar a arealului altitudinal n zona studiat. Cerinele ecologice fa de temperatur ale celorlalte specii de cvercinne sunt urmtoarele: stejarul pufos este specie euterm, grnia este euterm-mezoterm, iar stejarul pedunculat este mezotermeuterm (ofletea i Curtu, 2007). ntr-un studiu fenologic realizat n estul Romniei ntr-un arboret mixt de cvercinee (n principal alctuit din taxonii Quercus pedunculiflora i Q. robur, dar i Q. petraea sau Q. pubescens), Chenoiu et al. (2009) au raportat o lungime a intervalului deschiderii mugurilor de 21 de zile, foarte apropiat de valoarea observat n acest studiu n anul 2011 (22 de zile). 4.1.3. Fenofaza de nflorire 4.1.3.1. nflorirea n anul 2011 Fenofaza nflorire a debutat n anul 2011 n data de 24 aprilie cnd 25 de arbori (23%) din eantion au afiat stadiul 2 al acestei fenofaze (figura 4.4). n ziua de 27 aprilie toi arborii la care s-au observat flori mascule (95 de exemplare) au trecut prin stadiul 2, ceea ce nseamn c ntr-un interval de doar 4 zile toi arborii au nceput s nfloreasc, respectiv s nceap eliberarea polenului. Arborii la care nu s-au observat flori mascule vor fi tratai ntr-un subcapitol separat. Din metodologia aplicat n acest studiu reiese faptul c eliberarea polenului din florile mascule se realizeaz ntre stadiile 2 i 4. Astfel, din observaiile noastre fenologice, durata medie eliberrii polenului unui arbore este de 2,5 zile. Totui, aceste date nu acoper toate florile din coroan, ci sunt valori medii, ceea ce nseamn c durata eliberrii efective a polenului unui arbore este mai mare, deoarece exist o variaie individual la apariia florilor mascule.
80% 60% 40% 20% 0% 1 2 3 4 Figura 4.4. Repartiia pe zile a stadiului 2 de nflorire (nceputul polenizrii) pentru speciile de cvercinee n anul 2011 (prima zi de nflorire este 24 aprilie 2011, ultima este 27 aprilie 2011) Figure 4.4. Distribution by days of the 2nd stage of flowering (pollination beginning) for the oaks species in 2011 (the first day of flowering is the 24th of April 2011, the last day is the 27th of April 2011) FRA PET PUB ROB

31

n ceea ce privete diferenele interspecifice ale nfloririi n anul 2011 reiese faptul c sunt nesemnificative. Astfel, toate exemplarele de gorun i stejar pedunculat ncep polenizarea n trei zile, dar majoritatea (>95%, respectiv 85%) ating stadiul 2 n dou zile. Astfel, dac inem cont de faptul c durata medie n care un arbore elibereaz polen este de 3 zile, n ziua a doua au nceput polenizarea aproximativ 76% din totalul arborilor cu flori mascule i n ziua a patra toi arborii au nflorit, rezult c n acest an nflorirea n complexul Bejan-Deva s-a suprapus la cele patru specii de cvercinee, ceea ce constituie o premis p entru realizarea hibridrii interspecifice. 4.1.3.2. nflorirea n anul 2012 n anul 2012 lungimea efectiv a fenofazei nflorire a fost de 12 zile n 2012 (figura 4.5), de 3 ori mai lung dect n anul precedent. Totui, n primele trei zile au nceput s elibereze polen aproximativ 84% din arborii cu flori mascule. n restul zilelor progresul a fost lent, doar n ziua a patra fiind observat un procent mai mare, de 17% din arborii ncadrai la Q. frainetto (aproximativ 6% din totalul arborilor cu ameni).
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Figura 4.5. Repartiia pe zile a stadiului 2 de nflorire (nceputul polenizrii) pentru speciile de cvercinee n anul 2012 (prima zi de nflorire este 27 aprilie 2012, ultima este 8 mai 2012) Figure 4.5. Distribution by days of the second stage of flowering (pollination beginning) for the oaks species in 2012 (the first day of flowering is the 27th of april 2012, the last day is the 8th of May 2012) FRA PET PUB ROB

n ceea ce privete diferenierea interspecific nregistrat la aceast fenofaz, n ziua a treia de la debutul nfloririi (29 aprilie) peste 90% din arborii ncadrai la Quercus robur, Q. petraea i Q. pubescens au nceput s elibereze polen, doar la Q. frainetto procentul din aceast zi fiind mai sczut (66%). Un procent de aproximativ 90% la grni este atins n ziua a cincea, atunci cnd toi arborii de stejar pedunculat au atins stadiul 2 al nfloririi iar aproximativ 95% din goruni i stejarii pufoi erau la acest stadiu. ncepnd cu ziua a asea a nflorii i pn n cea dea 12-a zi, au mai nceput s elibereze polen 12% din arborii cu ameni. Astfel, innd cont de faptul c intervalul de timp mediu n care un arbore elibereaz polen este de 3 zile (ca i n primul an) este posibil polenizarea interspecific pentru major itatea indivizilor eantionai n acest an de observaii.

32

4.1.3.3. Concluzii privind fenofaza nfloririi Din observaiile fenologice privind deschiderea amenilor masculi n cei doi ani consecutivi (2011-2012) s-a constatat o variaie a lungimii nceputului acestei fenofaze, de la 4 zile n anul 2011, pn la 12 zile n anul 2012. Aceste rezultate sunt n concordan cu cele comunicate de Bacilieri et al., (1994), care ntr-un arboret mixt de Q. robur i Q. petraea din nord-vestul Franei au observat o durat a perioadei de nflorire cuprins ntre 10 i 12 zile. n anul 2008, n estul Romniei (pdurea Fundeanu), s-a observat o perioad de 6 zile n care majoritatea florilor mascule au fost mature, n intervalul 20-25 aprilie, la taxonii Quercus pedunculiflora, Q. robur, Q. petraea i Q. pubescens (Chenoiu et al., 2009). Important este i modul n care s-a realizat polenizarea florilor femele. Dei acest studiu nu a vizat observaiile acestui tip de flori din cauza condiiilor dificile de evaluare, s -a observat pe arbori din lizier c florile femele devin receptive n perioada n care are loc i polenizarea. Totui, datele din literatura de specialitate sunt contradictorii n ceea ce privete apariia florilor la stejarii albi (Sharp i Sprague, 1967; Franjic et al., 2011). 4.1.3.4. Androsterilitatea fenotipic n pdurea Bejan n cei doi ani de observaii fenologice privind nflorirea s-a observat absena florilor mascule la unii dintre arborii studiai. Procentele arborilor sterili din acest studiu (5, respectiv 12%) sunt comparabile cu cele comunicate de Bacilieri et al. (1994) pentru un arboret mixt de stejar i gorun, unde s-au observat ntre 2 i 8% arbori sterili, n funcie de an i specie. 4.1.3.5. Intensitatea nfloririi n doi ani de observaii n cei doi ani de observaii, concomitent cu fenologia nfloririi, s-a analizat intensitatea acesteia. S-a observat faptul c peste jumtate dintre arborii analizai au avut aceeai intensitate n cei doi ani (figura 4.6). Interesant este faptul c muli indivizi de Quercus robur (65%) au prezentat un numr mare de ameni (M) n cei doi ani, n timp ce doar 4% au avut un numr redus de ameni (P). O situaie opus s-a ntmplat la Q. petraea unde aproape jumtate din arbori (47%) au avut un numr redus de ameni (P), respectiv 6% au prezentat un numr mare de ameni (M).

100% M 2011, P 2012 50% 0% TOTAL FRA PET PUB ROB P 2011, M 2012 P 2011+2012 M 2011+2012

Figura 4.6. Intensitatea nfloririi n anii 2011 i 2012 Figure 4.6. The flowering intensity in 2011 and 2012

33

Corelaia dintre valorile intensitii nfloririi n cei doi ani s-a testat cu ajutorul testului neparametric Spearman. Rezultatele indic lipsa unei corelaii ntre cei doi ani de observaii. Astfel, intensitatea nfloririi unui arbore nu depinde de intervalul temporal, ci probabil este influenat de variabilitatea de la nivelul arborilor. 4.1.4. Evaluarea corelaiilor fenologice

4.1.4.1. Analiza categoriilor fenologice individuale de deschidere a mugurilor foliari n ani consecutivi de observaii Pentru a permite efectuarea unei corelaii ale acestei fenofaze n ani consecutivi s-au utilizat codurile numerice ale zilelor calendaristice n care a debutat deschiderea mugurilor. Evaluarea distribuiilor valorilor din cei trei ani indic lipsa unei distribuii normale n toate cazurile, ceea ce implic folosirea testului de corelaie neparametric Spearman. Valorile corelaiei fenofazei analizate (tabelul 4.4) sunt foarte ridicate ntre cei trei ani de observaii, ceea ce scoate n eviden faptul c o proporie semnificativ din arborii eantionai i pstreaz ordinea la deschiderea mugurilor foliari n intervalul de timp analizat.
Tabelul 4.4. Corelaia deschiderii mugurilor foliari n trei ani consecutivi de observaii Table 4.4. The correlation of the leaf bud burst in three consecutive study years Coeficientul de corelaie Numrul de Semnificaia, Anii de observaii fenologice Spearman, rS arbori p 2011 2012 0,741 312 <0,01 2011 2013 0,729 305 <0,01 2012 2013 0,820 320 <0,01

Rezultate diferite au fost observate ntr-un studiu fenologic din Frana (Bacilieri et al., 1994). Totui, recent (Lepais, 2008) s-a confirmat faptul c ordinea n care se realizeaz deschiderea mugurilor foliari se pstreaz ntre doi ani de observaii (2006 i 2007). 4.1.4.2. Analiza stadiilor fenologice individuale de nflorire n ani consecutivi de observaii Corelaia pentru anii 2011 i 2012 a fenofazei nflorire s-a efectuat prin utilizarea codurile numerice ale zilelor calendaristice n care a debutat nflorirea n suprafaa de cercetare. Testarea corelaiei s-a realizat cu ajutorul coeficientului neparametric Spearman (tabelul 4.5), iar rezultatele indic faptul c la grni, gorun i stejar pufos nu exist o corelaie semnificativ (p<0,05). Totui, la stejarul pedunculat corelaia este semnificativ. Pentru ntregul eantion corelaia nfloririi n cei doi ani consecutivi este semnificativ, dei are o valoare mic. Acest lucru subliniaz faptul c n cei doi ani de observaii, aproximativ 24% din exemplarele studiate i-au pstrat ordinea n aceast fenofaz.

34

Specia Quercus frainetto Quercus petraea Quercus pubescens Quercus robur Cvercinee-Bejan

Tabelul 4.5. Corelaia dintre nflorirea cvercineelor ntre anii 2011 i 2012 Table 4.5. The correlation of the cvercinee flowering between 2011 and 2012 Numrul de Semnificaia Coeficientul de corelaie Spearman, r S arbori ,p 32 17 17 26 92 0,145 -0,063 0,434 0,396 0,239 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05

4.1.4.3. Analiza comparativ dintre fenofazele de deschidere a frunzelor i nflorire n ani consecutivi Testarea acestei corelaii s-a realizat cu ajutorul testului neparametric Spearman (al corelaiei diferenelor rangurilor). Singurul caz n care corelaia a fost nesemnificativ este la gorun (tabelul 4.6). Pe eantionul de 84 de arbori corelaia dintre cele dou fenofaze a fost semnificativ. Astfel, ntr-o proporie de 54%, fenofaza deschiderii mugurilor s-a corelat direct cu nflorirea amenilor n anul 2011.
Tabelul 4.6. Corelaia dintre deschiderea mugurilor foliari i nflorire n anul 2011 Table 4.6. The correlation between the foliar buds burst and flowering in 2011 Numrul de Semnificaia Coeficientul de corelaie Spearman, r S arbori ,p 27 19 16 22 84 0,579 0,284 0,566 0,639 0,541 <0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Specia Quercus frainetto Quercus petraea Quercus pubescens Quercus robur Cvercinee-Bejan

n anul 2012 corelaia dintre cele dou fenofaze s-a realizat pe un eantion de 96 de exemplare. La cele patru specii corelaiile sunt semnificative (tabelul 4.7), cu un maxim la grni i un minim la stejarul pedunculat. Astfel, pe ntregul eantion exist o corelaie semnificativ ntre cele dou fenofaze, ceea ce explic o influen a deschiderii mugurilor asupra nfloririi ntr-o proporie de 60%.
Tabelul 4.7. Corelaia dintre deschiderea mugurilor foliari i nflorire n anul 2012 Table 4.7. The correlation between the foliar buds burst and flowering in 2012 Numrul de Semnificaia Coeficientul de corelaie Spearman, r S arbori ,p 32 17 20 27 96 0,701 0,517 0,640 0,427 0,595 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Specia Quercus frainetto Quercus petraea Quercus pubescens Quercus robur Cvercinee-Bejan

n concluzie, n cei doi ani de observaii, exist corelaii semnificative ntre cele dou fenofaze studiate, ceea permite restrngerea observaiilor fenologice privind nflorirea la evaluri

35

ale deschiderii mugurilor foliari, observaii care sunt mult mai uor de efectuat dect pentru fenofaza nflorire.

4.2. Structura genetic evaluat prin analize de markeri moleculari 4.2.1. Echilibrul Hardy-Weinberg i dezechilibrul linkage Unul dintre cele mai cunoscute principii n genetica populaional este echilibrul Hardy Weinberg, conform cruia frecvenele alelelor i genotipurilor rmn constante de la o generaie la alta n absena unor factori destabilizatori. La cei mai muli loci nu se observ abateri de la echilibrul Hardy-Weinberg, cele mai numeroase cazuri s-au gsit la Q. pubescens (13), iar cele mai puine la Q. petraea i Q. robur (10). La toate cele patru specii analizate s-au observat abateri de la echilibrul Hardy-Weinberg, cel mai afectat locus fiind PIE239. Din cele 120 de teste ale dezechilibrului linkage ntre perechile de loci, s-au identificat 22 de cazuri n care exist o probabilitate semnificativ (p<0,05) ca acesta s existe. 4.2.2. Structura alelic a celor patru specii de stejari n complexul Bejan-Deva

4.2.2.1. Markerul ZAG112 La markerul ZAG112 au fost recenzate un numr total de 21 de alele la cele 4 specii, n intervalul 74 140 pb (perechi de baze). Situaii asemntoare ale spectrului alelic s-au comunicat i n alte studii care au analizat aceste specii la locusul ZAG112 (Lepais et al., 2006: 72-106 pb; Curtu et al., 2011: 82 112 pb; Moldovan, 2011: 78 122 pb; Enescu, 2012: 80 124 pb), dar ntr-un arboret mixt alctuit din 273 de arbori (stejari pedunculai i goruni) n Frana, Guichoux et al. (2011) au recenzat 12 alele n intervalul 85-96 pb, ceea ce nseamn c toate alelele au avut o diferen ntre ele de doar o pereche de baze. La dou specii asiatice de cvercinee (Q. mongolica i Q. liaotungensis) s-au identificat 19 alele cu lungimi ntre 73-115 pb (Zeng et al., 2010), iar la Q. suber i Q. ilex un numr de 17 alele n intervalul 80-112 pb (Lumaret i Jabbour-Zahab, 2009). Cea mai frecvent alel pentru toate cele patru specii a fost cea cu lungimea de 88 pb, care n complexul de cvercinee studiat a avut o frecven relativ de 57%. Exist totui cteva diferene ntre speciile studiate: dac la grni i gorun acest locus este aproape monomorfic pentru aceast alel (87%, respectiv 81%), la stejarul pufos i stejarul pedunculat alela 88 pb prezint o frecven relativ de aproximativ 30% i exist alte alele cu frecvene peste 20% (alelele 92 i 96).

36

4.2.2.2. Markerul ZAG39 La acest marker au fost identificate 46 de alele cu lungimi cuprinse ntre 103 209 pb. Dintre toi microsateliii utilizai, amplitudinea intervalului de variaie a alelelor la acest loc us este cea mai mare, de 106 pb. Un spectru alelic mai mic a fost observat la un eantion de 90 de stejari albi din Frana (103-139 pb) de ctre Lepais et al. (2006). Deoarece acest locus este foarte polimorfic, foarte puine alele prezint frecvene relative ridicate: alela 113 pb la Quercus petraea (22%) i Q. pubescens (15,5%), alela 115 pb la Q. frainetto (19%), respectiv alela 117 pb la Q. robur (24%). Frecvene mult mai sczute prezint cele 8 alele private identificate la gorun (ntre 1,1% i 7,5% pentru ntreaga metapopulaie de stejari) i una singur la grni (alela 209 pb cu o frecven relativ de 1,1%).

4.2.2.3. Markerul ZAG96 Markerul ZAG96 a prezentat 24 de alele cu lungimi cuprinse ntre 140 i 186 pb. De remarcat c acelai spectru alelic a fost observat de Curtu et al. (2009) sau Neophytou et al. (2010), dar cu alt tip de secveniator (136-182 pb, respectiv 135-181 pb). n Frana, Guichoux et al. (2011) au recenzat 18 alele n intervalul 135-194 pb. Tiparul frecvenelor relative ale alelelor identificat la acest locus are dou trsturi care pot juca rol n diferenierea speciilor: pe de o parte, la Quercus robur alela 140 pb se gsete la 75% din genotipurile recenzate dar este prezent n proporii sczute (<10%) la celelate 3 specii; pe de alt parte, toate celelalte alele ale acestui locus prezint o frecven mai mic de 15% la toate cele 4 specii, cu excepia alelei 148 pb la Q. petraea (18%). Un studiu realizat n nordul Turciei (Yucedag i Gailing, 2013) a subliniat c exist mai multe alele identificate la stejarul pedunculat dect la gorun, ceea ce este situaia opus pentru Pdurea Bejan i pentru alte studii care au analizat acest locus la cele dou specii.

4.2.2.4. Markerul ZAG110 La markerul ZAG110 au fost recenzate 29 de alele n intervalul 203 273 pb, cu secvena repetitiv de 2 pb care a fost respectat la toate alelele. La acest locus, Lepais et al. (2006) au descoperit unele alele diferite, n intervalul 193-235 pb, la stejarul pedunculat, gorun i stejarul pufos (18 alele n total), iar pentru Zeng et al. (2010), la Q. mongolica i Q. liaotungensis, spectrul alelic a fost situat ntre 190-244 pb, cu 22 de alele. n aceeai zon geografic, dar pentru specia endemic Q. aquifolioides, Zhang et al. (2006) au comunicat 26 de alele cu lungimi cuprinse ntre 204 i 268 pb. Un interval puin mai restrns (206-262 pb) a fost identificat pentru cele mai rspndite dou specii de stejari europeni, Q. robur i Q. petraea, de ctre Guichoux et al. (2011), cu 16 alele.

37

n complexul de cvercinee Bejan, cea mai des ntlnit alel la acest locus este cea cu lungimea de 207 pb, cu o frecven de 40%, mult superioar alelei clasate pe locul doi (alela 221 pb cu o frecven de 7,2%). De altfel, dintre toate alelele identificate la cele patru specii, alela 207 pb prezint cea mai ridicat frecven: 51% la Q. frainetto i Q. robur, 36% la Q. pubescens, respectiv 32% la Q. petraea.

4.2.2.5. Markerul ZAG11 Dintre cei 16 markeri moleculari analizai, locusul ZAG11 se caracterizeaz prin cel mai ridicat grad de polimorfism, fiind identificate 48 de alele diferite cu lungimi care au variat ntre 243 i 311 pb. ntr-un studiu realizat n Frana, Guichoux et al. (2011) au comunicat doar 21 de alele, n intervalul 238-267 pb. Totui, trebuie menionat c primerii au fost puin modificai. Lepais et al. (2006) au gsit doar 16 alele n intervalul 242-286 pb. Un numr asemntor de alele (17), cu lungimi cuprinse ntre 246 i 304 pb, a fost comunicat de Ortego i Bonal (2010) care au evaluat hibridarea dintre Q. ilex L. i Q. coccifera L. Din numrul nsemnat de alele, doar cteva prezint valori mai ridicate: la Q. frainetto alelele 253 pb (51,5%) i 270 pb (14,4%), la Q. petraea alelele 246 pb (33,1%), 259 pb (20,4%) i 253 pb (20,1%), la Q. pubescens alelele 253 pb (37,2%) i 270 pb (15,9%), la Q. robur alelele 271 pb (21,3%), 259 pb (14,2%), respectiv 265 pb (11,7%). Restul alelelor au valori sczute (<10%), inclusiv alelele nule, 4 gsite la stejarul pufos i 5 la stejarul pedunculat.

4.2.2.6. Markerulul ZAG87 Pentru markerul ZAG87 au fost recenzate 37 de alele care respect motivul secvenei repetitive, fiind rspndite n intervalul de lungimi 99 195 pb. Dintre acestea, doar 16 alele s-au observat la Q. frainetto, jumtate din numrul alocat celei mai polimorfice specii la acest locus, Q. robur (32 de alele). Un numr ridicat de alele (36) a fost consemnat i de ctre Zeng et al. (2010) la dou specii asiatice de stejari, cu spectrul alelic situat ntre 97-185 pb. n schimb, Lepais et al. (2006), la 90 de exemplare de stejari albi europeni a identificat 18 alele n intervalul 101 141 pb. Pentru toate speciile de cvercinee analizate, la alela 113 pb se nregistreaz cele mai mari frecvene relative: 44,3% la Q. pubescens, 29,5% la Q. frainetto, 25% la Q. robur, respectiv 23,9% la Q. petraea. Astfel, aceast alel apare ntr-o proporie de 30% n zona studiat. Cea de-a doua alel ca importan la acest locus este cea de 115 pb (16%), iar restul alelelor au ponderi mai mici de 8% din total. Numrul de alele specifice la locusul ZAG87 este de 11 (7 la stejarul pedunculat, 3 la gorun i 1 la grni), dar cu frecvene foarte mici din ponderea global (0,1 - 0,3%).

38

Locusul ZAG87 a fost unul dintre locii care au realizat o discriminare a provenienelor ntr-un studiu asupra gorunului i stejarului pedunculat (Neophytou et al., 2010) i se presupune c se afl ntr-o regiune a genomului unde are loc codificarea proteinelor implicate n deschiderea mugurilor (Scotti-Saintagne et al., 2004b).

4.2.2.7. Markerul ZAG7 La markerul ZAG7, numrul de alele identificate a fost de 23, grupate n intervalul 117 173 pb, toate n concordan cu motivul secvenei repetitive. Un interval asemntor (117-169 pb) a fost comunicat de ctre Zeng et al. (2010) pentru dou specii asiatice, la care s-au observat 22 de alele. Mai puine alele (19) au fost recenzate de Guichoux et al. (2011) la Q. robur i Q. petraea, situate n intervalul 115-153 pb. n studiul hibridrii dintre Q. suber i Q. ilex, Ortego i Bonal (2010) au identificat doar 6 alele cu lungimi cuprinse ntre 110 i 122 pb. Un aspect interesant la acest locus l constituie lipsa unei alele dominante, att pentru ntreaga comunitate de cvercinee, ct i la nivel de specie. Totui, fiecare specie prezint un model propriu al frecvenelor alelelor, ceea ce ar putea indica o eventual discriminare interspecific la acest marker. La Q. frainetto exist trei alele (117, 129, 131 pb) care au frecvene relative cuprinse ntre 21 i 25%, pentru restul de 11 alele frecvenele sunt reduse (<8%). Cele mai multe alele la acest locus s-au observat la Q. petraea (22), dar una singur este ntr-o proporie mai mare de 10% (alela 117 pb cu 15%). La Q. pubescens, alelele 133 pb i 123 pb sunt cele mai bine reprezentate, cu 21%, respectiv 15 %, restul sunt ntr-o proporie mai mic de 10%. O situaie asemntoare se observ la Q. robur, unde alelele 137 pb (18%) i 133 pb (13%) sunt singurele ntr-o proporie mai mare de 10%. La locusul ZAG7 s-au observat doar dou alele private, ambele la gorun, dar cu frecvene sczute (2,1%, respectiv 0,1%).

4.2.2.8. Markerul ZAG20 La locusul microsatelitic ZAG20 au fost recenzate n total 21 de alele cu lungimi cuprinse ntre 155 i 199 pb, ceea ce l claseaz pe ultimul loc dintre microsateliii genomici, din punct de vedere al diversitii alelice. Un numr mai mare de alele (24) a fost comunicat de Ortego i Bonal (2010) la speciile Q. suber i Q. ilex cu spectrul alelic situat ntre 159 i 191 pb. ntr-un arboret mixt de Q. robur i Q. petraea s-au observat 19 alele n intervalul 160-200 pb (Guichoux et al., 2011). Asemenea locusui ZAG7, nici acest marker nu prezint o segregare pentru o anumit alel, cea mai des ntlnit n populaia global fiind alela 169 pb (20,6%). Totui, aceast constatare se datoreaz faptului c toate cele patru specii ating maximul frecvenelor relative la aceast alel, chiar dac valorile nregistrate nu sunt mari (n jurul proporiei de 20%). Cu excepia stejarului pufos, exist cte o alel privat pentru fiecare specie, dar cu valori modeste (0,1% la toate trei).

39

4.2.2.9. Markerul ZAG9 La markerul ZAG9 au fost identificate 23 de alele situate n spectrul 178 262 pb, care este foarte asemntor cu cel comunicat de Curtu et al. (2009) n acelai complex de cvercinee (179-259 pb). Dei diversitatea alelic este puin mai sczut la grni i stejarul pedunculat (13, respectiv 14 alele), la Q. cerris s-au identificat doar 9 alele n acelai arboret (Curtu et al., 2007a), cu lungimi mai mari (223 259 pb), dintre care alela 223 pb are o frecven de aproximativ 55%. Un numr de 16 alele cu lungimi mai mari la acest locus (237 276 pb) au fost recenzate i la dou specii endemice de stejari albi din California (SUA), Q. lobata i Q. douglasii (Craft et al., 2002). O situaie asemntoare a fost semnalat pentru specia Q. semiserrata, la care pe un eantion de 390 de arbori din Thailanda s-au identificat 15 alele cu lungimi de 235 274 pb (Pakkad et al., 2008). Interesant este c la acest locus s-au observat 26 de alele n intervalul 204-286 pb la specia asiatic endemic Q. aquifolioides, pe un eantion de 159 indivizi grupai n cinci populaii (Zhang et al., 2006). n schimb, la specia tropical de stejar rou Q. humboldii s-au identificat doar 5 alele cu lungimi ntre 250 i 256 pb (Fernandez et al., 2000) sau 241 253 pb (Fernandez i Sork, 2007), pe un eantion de 73, respectiv 146 de arbori. n acest studiu, cea mai frecvent alel n arboret (19,6%), cu lungimea de 194 pb, este cea mai des ntlnit la Q. robur i Q. petraea. La Q. frainetto cea mai mare proporie este atins la alela 198 pb, iar la Q. pubescens maximul este atins n dreptul alelei 186 pb. Totui, cu excepia alelei 184 pb la care exist o diferen de 10% ntre grni i celelalte trei specii, la celelalte alele frecvenele sunt asemntoare ntre speciile analizate, ceea ce se traduce printr-o difereniere interspecific redus la nivelul acestui locus. O alt situaie a fost semnalat de Curtu et al. (2006), care au remarcat la locusul ZAG9 apariia homoplaziei la unele alele lungi, ceea ce denot un mecanism evolutiv diferit ntre seciile Robur i Cerris. La nivelul alelelor specifice unui anumit taxon, din cele cinci observate, la nici una nu exist o pondere semnificativ, fiind mai ales alele de lungimi mari care apar doar n componena heterozigoilor.

4.2.2.10. Markerul GOT021 Din cele 13 alele recenzate la markerul GOT021 n intervalul 97 121 pb, una singur nu respect motivul de dou perechi de baze (alela 98pb), dar care apare la toate cele patru specii studiate. La dou specii de stejari roii, Q. rubra i Q. ellipsoidalis, Lind i Gailing (2013) au comunicat un spectru alelic mai redus, ntre 95 i 103 pb, cu doar 3 alele identificate. Pentru cele patru specii de cvercinee din Pdurea Bejan, cea mai des ntlnit alel la acest locus este cea cu lungimea de 97 pb, care se observ ntr-o proporie de 67,5% n genotipurile indivizilor analizai. La Q. frainetto acest microsatelit este aproape monomorf, deoarece frecvena relativ a alelei 97 pb este de 94%. O situaie asemntoare se observ la Q.

40

pubescens, unde aceast alel are o pondere de 89%. La Q. petraea cea mai mare frecven de apariie o au alelele 97 pb (59,7%) i 101 pb (31,2%). Q. robur, specia cu cele mai multe alele la acest locus (13), prezint o alel dominant (97pb, cu o frecven de 43,5%) i nc dou alele cu frecvene peste 10% (alelele 101 pb i 107 pb). De asemenea, la stejarul pedunculat s-au observat trei alele specifice dar puin importante ca pondere (<1%).

4.2.2.11. Markerul PIE040 Markerul PIE040 se caracterizeaz prin cea mai mare diversitate a alelelor ntre microsateliii de tipul EST, deoarece n intervalul 169 192 pb au fost identificate 22 de alele. Totui, aceast caracteristic a locusului PIE040 se datoreaz foarte probabil unor mutaii n regiunea flanc a microsatelitului, deoarece secvena repetitiv (TTC) are lungimea de trei perechi de baze, dar sunt alele care se abat de la acest model (14 alele). O diversitate mai sczut a alelelor a fost consemnat de Lind i Gailing (2013), care au identificat 8 alele cu lungimi cuprinse ntre 155 i 179 pb. Cea mai des ntlnit alel n arboretul studiat este cea cu lungimea de 180 pb (ntr-o proporie de 36,3%), deoarece la fiecare specie se atinge maximul n dreptul acesteia. Totui, exist anumite diferene ntre speciile studiate. Alela 180 pb are cea mai mare pondere la Q. frainetto (54%), dar are o frecven de doar 22% la Q. petraea. La grni, o alt alel important este 181 pb (15,6%). La gorun, alelele 182 pb i 183 pb au valori apropiate de cele ale alelei 180 pb (21,3%, respectiv 18,5%). La Q. pubescens, alela 180 pb are frecvena de 39,2%, iar cea cu lungimeaa de 183 pb doar 17,1%. Alela 180 pb este cea mai ntlnit i n cazul speciei Q. robur (46,1%), iar alelele 174 pb, 181 pb i 183 pb au frecvene cuprinse ntre 12% i 19%. De asemenea, s-au observat trei alele specifice la gorun i una singur la stejarul pedunculat, dar cu frecvene foarte reduse (0,1 0,2% din populaia de cvercinee analizat).

4.2.2.12. Markerul PIE215 Locusul microsatelitic PIE215 cuprinde 13 alele cu lungimi cuprinse ntre 190 i 223 pb. Toate alelele recenzate pstreaz motivul secvenei repetitive de trei perechi de baze, cu excepia alelei 198 pb care apare la Quercus petraea i Q. robur. ntr-un arboret cu 273 de arbori din speciile Q. petraea i Q. robur, Guichoux et al. (2011) au comunicat doar 6 alele n intervalul 188-206 pb. Alelele cu cele mai ridicate frecvene n arboretul studiat sunt cele cu lungimea de 196 pb (30%) i 205 pb (28%). La ambele alele se observ frecvenele cele mai ridicate pentru Q. frainetto i Q. robur, situate ntre 37% i 39%. La aceste dou specii, cu excepia alelei 208 pb (11,7%) la stejarul pedunculat i 202 pb (10%) la grni, toate celelalte alele au valori mai mici de 10%. La Q. petraea alela cu cea mai ridicat frecven este 196 pb (36%), urmat n ordine

41

descresctoare de alela 205 pb (21,4%) i 202 pb (15,3%). La Q. pubescens, pe lng alelele 205 pb (20,7%) i 208 pb (18,1%) care apar cu frecvene ridicate i la alte specii, atrag atenia alelele 214 pb (17,2) i 211 pb (11,6%) deoarece la celelalte specii au frecvene sczute (<5%). La acest locus s-a identificat o singur alel specific, respectiv alela 223 pb la gorun, dar care prezint o frecven foarte redus n arboretul studiat (0,6%).

4.2.2.13. Markerul PIE223 Pentru locusul PIE223 au fost recenzate toate cele 11 alele situate n intervalul de variaie 203 233 pb, secvena repetitiv avnd o lungime de 3 pb. ntr-un arboret mixt de stejar pedunculat i gorun au fost comunicate 9 alele cu lungimi de 197 221 pb (Guichoux et al., 2011). Alela 221 se gsete n cea mai mare proporie n arboretul studiat, cu un procent de 38,1%, iar celelalte alele au frecvene globale mai mici de 13%. De altfel, la aceast alel sunt observate frecvene de 58,8% ale indivizilor care aparin de Q. petraea, genotipai la acest locus. La Q. frainetto, alela 224 pb are cea mai mare pondere (36,9%), dar i alela 221 pb este destul de frecvent (30%). Totui, alela 221 pb este cea mai frecvent i n cazul speciei Q. pubescens (25,9%), iar alelele 212 pb i 224 pb au frecvene considerabile (19,8%, respectiv 13,4%). Spre deosebire de celelalte trei specii, la Q. robur nu se detaeaz o alel principal, ci sunt observate trei alele cu o pondere de 22 24% (alelele 212 pb, 209 pb i 221 pb). Interesant de consemnat e faptul c la acest locus nu s-a identificat nici o alel specific unui taxon.

4.2.2.14. Markerul PIE239 La microsatelitul PIE239 au fost genotipate 18 alele cu lungimi cuprinse ntre 80 pb i 108 pb. Secvena repetitiv are lungimea de 2 pb, ns s-au consemnat patru alele care nu respect acest model: alelele 87 pb, 89 pb, 91 pb, 97 pb. Interesant este faptul c n studiul dintr un arboret mixt de gorun i stejar pedunculat situat n Frana, Guichoux et al. (2011) au comunicat 11 alele cu lungimi situate n intervalul 70-83 pb, multe care nu respect modelul de 2pb. Cele mai frecvente alele n complexul de cvercinee analizat sunt cele cu lungimea de 84 pb (46,5%) i 86 pb (29,8%), iar la toate celelalte frecvenele sunt mai mici de 10%. Totui, dac ne raportm la specii, alela 84 pb este cea mai frecvent doar pentru Q. petraea (81%), iar alela 86 pb are cea mai mare pondere pentru Q. pubescens (57,8%) i Q. robur (53%). Pe de alt parte, alela 82 pb este caracteristic speciei Q. frainetto (45,5%), dar nu este alel privat deoarece apare cu frecvene reduse i la civa goruni (4,8%). Cu toate acestea, la acest locus alelele private sunt n numr consistent (8), repartizate astfel: dou la Q. petraea i cte trei la Q. frainetto i Q. pubescens, dar toate cu frecvene mai mici de 0,5%.

42

4.2.2.15 Markerul PIE227 Locusul microsatelitic PIE227 se caracterizeaz printr-un numr mic de alele, situate n intervalul 152 179 pb (figura 4.7), cele 10 alele respectnd fr excepie motivul secvenei repetitive n lungime de trei perechi de baze. La acest locus, Guichoux et al. (2011) a identificat doar 5 alele cu lungimi cuprinse ntre 156 177 pb, ntr-un arboret mixt de stejar pedunculat i gorun, cu un eantion de 273 de arbori.
0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 152 155 158 161 164 167 170 173 176 179 pb PIE 227 Figura 4.7. Frecvena relativ a alelelor pentru locusul PIE227 (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) Figure 4.31 Relative frequency of the alleles for the PIE227 (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur)

FRA PET PUB ROB

Alelele cu cele mai ridicate proporii n pdurea Bejan sunt cele cu lungimea de 158 pb (38,2%), 164 pb (27,3%) i 161 pb (21,6%), iar celelalte alele au frecvene globale mai mici de 4%. Cu toate acestea frecvenele acestor trei alele principale sunt diferite n funcie de specie. La alela 158 pb, speciile Q. frainetto i Q. pubescens prezint frecvene ridicate (67%, respectiv 66%), la Q. petraea valori moderate (29%), dar la Q. robur frecvenele sunt reduse (9%). n schimb, alela 164 pb prezint un maxim al frecvenelor pentru Q. robur (73%), la Q. petraea i Q. pubescens frecvene de aproximativ 15%, iar la Q. frainetto doar 5%. Q. petraea are cea mai ridicat frecven (38,7%) la alela 161 pb, unde Q. frainetto i Q. pubescens au 24,2%, respectiv 11,6%, iar Q. robur doar 3%.

4.2.2.16. Markerul DHN3 Locusul genic DHN3 face parte din familia genelor dehidrine i este singurul din cei 16 utilizai n acest studiu la care genotiparea nu s-a realizat cu ajutorul electroforezei capilare, ci prin electroforez orizontal. n studiul de fa s-au observat doar 3 alele la acest locus, ale cror lungimi au fost estimate n raport cu scara BenchTop Markers (Promega) utilizat. Astfel, cele trei alele au lungimi estimate de 290 pb, 310 pb i 330 pb. Totui, ultima alel apare n frecvene foarte reduse (figura 4.8), fiind identificat la doar doi indivizi de Q. petraea i unul de Q. pubescens, n toate cazurile mpreun cu alela 310 pb. n aceste condiii, interesante sunt doar frecvenele celorlalte dou alele, care mpreun formeaz un model foarte bine conturat i propriu fiecrei specii.

43

1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 290 310 DHN 3 Figura 4.8 Frecvena relativ a alelelor pentru locusul DHN3 (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) Figure 4.32 Relative frequency of the alleles for the DHN3 locus (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) 330 pb

FRA PET PUB ROB

La Q. frainetto alela 290 pb este foarte frecvent (94%) iar alela 310 pb cu frecven sczut (6%). O situaie diametral opus se observ la Q. robur, unde alela 310 pb este cea mai frecvent (90%) iar alela 290 pb mai puin ntlnit (10%). La Q. petraea cele dou alele se gsesc n proporii relativ egale (48%, respectiv 51%). La Q. pubescens ambele alele sunt prezente, dar ntr-o pondere mai ridicat pentru alela 290 pb (72%) comparativ cu alela 310 pb (28%). Din aceste considerente, acest locus poate ajuta foarte mult la diferenierea interspecific a taxonilor de cvercinee.

4.2.3. Estimarea parametrilor genetici 4.2.3.1. Numrul mediu de alele (Na) Datorit evalurii diversitii genetice cu ajutorul unor markeri moleculari extrem de polimorfici, numrul de alele identificate a fost destul de mare. La nivelul ntregului eantion (492 arbori), la cei 16 loci genici analizai, s-au identificat 362 de alele, ceea ce nseamn o medie de aproximativ 23 de alele pe locus. Totui, la cel mai polimorfic locus (ZAG11) s -au observat 48 de alele, n timp ce la locusul DHN3 doar 3 alele. Cele mai mari valori medii ale acestui indice sunt atinse la Q. petraea (18,3), n timp ce la Q. frainetto sunt nregistrate cele mai reduse valori (12,8). De altfel, la gorun apar 81% din totalul alelelor identificate n suprafaa de cercetare intensiv, la stejarul pedunculat 72%, la stejarul pufos 70%, iar la grni doar 56%. n eantionul analizat s-au identificat 75 de alele private, dar cu o distribuie diferit ntre specii: cte 29 de alele private la Q. robur i Q. petraea iar la Q. pubescens i Q. frainetto doar 9, respectiv 8. 4.2.3.2. Numrul efectiv de alele (Ne) Acest parametru, care se bazeaz pe frecvena relativ a alelelor, ne indic cte alele sunt cu adevrat importante n caracterizarea unui locus, ntr-o anumit populaie.

44

Comparativ cu numrul mediu de alele pe locus, se observ o alt clasificare a speciilor: pe primul loc se afl Q. pubescens, care e devansat Q. petraea i Q. robur, dar Q. frainetto a rmas pe ultimul loc i la acest parametru. Dac se evalueaz procentul alelelor importante din totalul alelelor obervate ntr-o populaie, cel mai bine se situeaz tot Q. pubescens (41%), urmat de Q. frainetto (36%), Q. petraea (34%) i Q. robur (33%). Totui, la nivelul ntregului eantion, doar 30% dintre alelele identificate prezint frecvene semnificative. 4.2.3.3 Bogia alelic (AR) Acest indice (El-Mousadik i Petit, 1996) ne ajut s comparm cele patru populaii de cvercinee independent de mrimea eantionului, care variaz destul de mult ntre cele patru specii analizate. Rezultatele obinute pentru acest parametru sunt evideniate n tabelul 4.8.
Tabelul 4.8. Bogia alelic la cele patru specii de stejari din Pdurea Bejan Table 4.8. The allelic richness at the four oaks species from Bejan Forest Q. frainetto Q. petraea Q. pubescens Q. robur Bejan 6,95 6,52 9,04 16,00 12,75 18,86 20,58 22,19 12,27 20,95 18,67 19,94 16,26 19,20 19,15 16,68 20,28 24,23 28,63 28,34 15,59 19,36 18,90 25,60 22,15 13,86 19,40 16,99 18,08 19,17 13,95 16,51 15,49 12,10 16,82 7,97 11,55 10,36 9,03 10,99 10,97 9,91 9,90 9,41 10,24 12,98 14,34 16,13 12,58 14,78 13,98 14,00 14,10 9,77 14,47 28,00 32,92 22,89 24,22 31,32 4,86 7,50 6,46 11,93 10,12 10,86 7,63 9,31 6,31 9,65 5,91 7,83 8,10 7,50 8,56 2,00 2,59 2,55 2,00 2,35 12,63 14,43 13,93 14,04 15,74

Locus ZAG112 ZAG96 ZAG110 ZAG11 ZAG87 ZAG7 ZAG20 PIE215 PIE223 ZAG9 PIE040 ZAG39 GOT021 PIE 239 PIE 227 DHN 3 Media

Cele mai mari valori ale acestui parametru se nregistreaz la locusul ZAG39 pentru Q. frainetto (28,0) i Q. petraea (32,9), iar pentru celelalte dou specii la locusul ZAG11 (24,2 la Q. pubescens, respectiv 28,6 la Q. robur). Cele mai mici valori pentru toate speciile se observ la locusul DHN3. n clasamentul bazat pe media parametrului AR se afl pe primul loc Q. petraea, urmat de Q. robur i Q. pubescens (valori foarte apropiate), iar pe ultimul loc, la o distan destul de mare, este Q. frainetto. Acest clasament se explic prin faptul c la ase loci gorunul are cele mai mari valori, la cte patru loci stejarul pedunculat i stejarul pufos sunt pe primul loc, iar grnia doar la doi loci depete celelalte trei specii.

45

4.2.3.4. Heterozigoia observat (Ho) La specia Q. frainetto s-a observat c nivelul heterozigoiei a variat destul de mult, de la 0,106 la locusul GOT021, la 0,924 la ZAG96. La aceiai microsatelii se gsesc valorile extreme i la Q. pubescens (0,198, respectiv 0,940). La Q. petraea, un minim de 0,107 este atins la locusul PIE239, iar un maxim de 0,890 la ZAG39. n schimb, la Q. robur, cei mai muli heterozigoi se identific la ZAG11 (0,858), iar cei mai puini la DHN3 (0,193). Media heterozigoiei pentru cei 16 loci analizai, la cele patru specii de cvercinee, indic cea mai mare ponderere a heterozigoilor la stejarul pufos (0,738), iar cea mai sczut la grni (0,616). Acest clasament se suprapune perfect cu cel identificat la parametrul Ne, ceea ce subliniaz o legtur strns ntre numrul efectiv de alele la o specie i numrul de genotipuri heterozigote care rezult din combinarea lor. 4.2.3.5. Heterozigoia ateptat (He) Acest parametru este unul dintre cei mai utilizai pentru caracterizarea structurii genetice a populaiilor. Valorile acestui parametru pentru fiecare locus i specie, dar i valorile medii pe specie sau pe ansamblul complexului de cvercinee analizat sunt redate n tabelul 4.9.
Tabelul 4.9. Heterozigoia ateptat la cele patru specii de stejari din Pdurea Bejan Table 4.9. Expected heterozygosity at the four oaks species from Bejan Forest Locus Q. frainetto Q. petraea Q. pubescens Q. robur Bejan 0,237 0,327 0,801 0,835 0,642 ZAG112 0,908 0,913 0,938 0,426 0,910 ZAG96 0,715 0,858 0,822 0,714 0,813 ZAG110 0,697 0,804 0,823 0,907 0,890 ZAG11 0,779 0,877 0,761 0,880 0,864 ZAG87 0,823 0,926 0,898 0,905 0,931 ZAG7 0,856 0,892 0,890 0,850 0,900 ZAG20 0,700 0,788 0,857 0,693 0,802 PIE215 0,751 0,627 0,846 0,815 0,795 PIE223 0,886 0,879 0,890 0,853 0,885 ZAG9 0,673 0,844 0,793 0,713 0,813 PIE040 0,907 0,916 0,919 0,894 0,925 ZAG39 0,116 0,545 0,208 0,761 0,514 GOT021 0,713 0,335 0,602 0,630 0,681 PIE 239 0,484 0,736 0,535 0,451 0,729 PIE 227 0,114 0,505 0,410 0,188 0,503 DHN 3 Media 0,648 0,736 0,750 0,720 0,787 0,067 0,051 0,052 0,051 0,035 SE *SE: eroarea standard.

La Q. frainetto se poate observa c exist doi markeri (GOT021 i DHN3) la care se ateapt puini heterozigoi (11%). n schimb, la ceilali loci heterozigoia ateptat crete pn la un maxim de 91% la ZAG96 i ZAG39. Heterozigoia ateptat medie la aceast specie are cea mai mic valoare dintre cvercineele studiate.

46

Heterozigoia ateptat la Q. petraea se caracterizeaz prin faptul c la microsatelitul PIE239 prezint o njumtire a valorii comparativ cu celelalte specii, iar la locii PIE227 i DHN3 are cele mai mari valori dintre cvercineele analizate. La Q. pubescens se remarc o scdere a heterozigoiei ateptate la locusul GOT021 (21%), aceasta fiind o asemnare cu Q. frainetto. Deoarece majoritatea valorilor la ceilali loci au valori ridicate ale acestui parametru genetic, se observ c valoarea global este cea mai ridicat dintre speciile analizate. Locusul ZAG96 reprezint un tipar aparte pentru heterozigoia ateptat la Q. robur, deoarece la aceast specie exist o valoare njumtit a acestui parametru, comparativ cu celelalte trei specii. De asemenea, la locusul ZAG112 exist un procent mult mai ridicat al heterozigoilor la stejarul pedunculat i la stejarul pufos, comparativ cu valorile observate la gorun i grni.

4.2.3.6. Indicele de fixare (F) Indicele de fixare F poate fi considerat un parametru care msoar proporia abaterii de la echilibrul Hardy-Weinberg a heterozigoiei observate la un locus genic fa de heterozigoia ateptat. Pentru cele patru specii, la majoritatea locilor valorile acestui indice sunt apropiate de 0, ceea ce denot c ncrucirile s-au realizat n mod aleatoriu. Totui, exist o excepie, locusul PIE239, la care valorile sunt puternic pozitive. Deoarece s-au observat alele nule la acest locus, se presupune c acestea sunt motivul pentru aceste valori ridicate. Rezultatele indic faptul c ncrucirile nu prezint un nivel ridicat de ntmplare, ci respect o anumit afinitate pentru ncruciri intraspecifice, aspect care va fi discutat la analiza hibrizilor din Pdurea Bejan. 4.2.3.7. Recomandri pentru diferenierea interspecific i analizele de alocare genetic a indivizilor la specii Datorit faptului c microsateliii ZAG39, PIE040 i PIE239 nu se afl n echilibru Hardy-Weinberg la mai multe specii, la locii ZAG39 i PIE239 s-au identificat proporii importante ale alelelor nule i se observ valori mari ale indicelui de fixare la markerul PIE239, se recomand ca pentru analizele de difereniere interspecific i de alocare genetic a indivizilor la specii (engl. assignment) cei trei microsatelii cu probleme s fie eliminai. 4.2.4. Diferenierea interspecific Diferenierea genetic reprezint acumularea diferenelor n frecvenele alelelor dintre populaii complet sau parial izolate datorit forelor evolutive, n special al seleciei i driftului

47

genetic. n continuare se vor prezenta valorile detaliate pentru fiecare locus ale indicelui de difereniere (Dest) i ale indicelui de fixare (Fst). 4.2.4.1. Indicele de difereniere Dest Cea mai mare valoare a indicelui de difereniere Dest ntre Q. frainetto i Q. petraea este atins de ctre locusul ZAG7 (0,525). Acest microsatelit discrimineaz cel mai bine i perechea de specii Q. frainetto - Q. pubescens (0,530). De altfel, la cele dou perechi de specii, cei doi loci sunt singurii care au valori ale parametrului Dest mai mari de 0,50. n ceea ce privete perechea Q. petraea Q. pubescens cea mai important valoare a indicelui Dest este raportat la locusul ZAG11 (0,462). Cea mai bun difereniere ntre Q. robur i celelalte trei specii se realizeaz cu ajutorul markerilor ZAG96, ZAG11 i PIE227 care ating valori foarte ridicate. Astfel, ntre Q. robur i Q. frainetto, locusul ZAG96 are cea mai mare valoare (0,934) dintre toate cazurile analizate, iar locii ZAG11, DHN3 i PIE227 au valori n int ervalul 0,810,85. ntre Q. robur i Q. pubescens locusul ZAG96 are o valoare foarte mare a indicelui Dest (0,899), urmat de locii ZAG11, PIE227 i DHN3 cu valori cuprinse ntre 0,53 i 0,73. Speciile Q. robur i Q. petraea se difereniaz cel mai bine la nivelul locusului ZAG96 (0,75), dar i cu valori peste 0,50 la ZAG11 i PIE227. La nivel global, cea mai bun difereniere genetic pe baza celor 13 markeri se realizeaz ntre grni i stejarul pedunculat (0,520), dar i ntre stejarul pedunculat i stejar pufos, respectiv gorun. Cea mai sczut discriminare are loc ntre grni i stejarul pufos (0,143), ceea ce explic i justific i din punct de vedere genetic ncadrarea taxonomic a acestora n aceeai secie (Dascia). 4.2.4.2. Indicele de fixare Fst Cea mai mare difereniere dintre toate cazurile analizate este generat de locusul DHN3 ntre speciile Q. frainetto i Q. robur, la care s-a reuit cea mai bun difereniere la nivelul celor 13 markeri. De altfel, acest locus prezint cea mai mare difereniere i ntre speciile Q. frainetto i Q. petraea, respectiv Q. robur i Q. pubescens. Pentru perechile Q. petraea Q. pubescens i Q. frainetto i Q. pubescens cea mai mare valoare a acestui indice a fost atins la nivelul microsatelitului ZAG112. Un alt locus, PIE227, este rspunztor pentru cea mai mare difereniere dintre speciile Q. petraea i Q. robur. Indicele Fst calculat pe baza estimatorului Weir-Cockerham La ora actual, cel mai utilizat estimator al parametrului FST este cel calculat conform Weir i Cockerham (1984), notat cu ST n cele mai multe cazuri. Valorile pentru fiecare locus sunt mai mari dect cele raportate de indicele FST al lui Wright, la toate combinaiile posibile ntre specii

48

Totui, i la acest parametru, cea mai nsemnat difereniere se observ ntre Q. frainetto i Q. robur iar cea mai sczut ntre Q. frainetto i Q. pubescens. Acest lucru se datoreaz faptului c ntre stejarul pedunculat i grni exist 5 markeri care au o putere de discriminare mare (>0,20). O situaie asemntoare a fost comunicat n Pdurea Bejan i de ctre Curtu et al. (2007a) cu ajutorul a 6 microsatelii. 4.2.4.3. Valori globale ale indicelor de fixare i difereniere Pentru o imagine de ansamblu a diferenierii genetice dintre cele patru specii de cvercinee analizate, s-au centralizat valorile tuturor indicilor de fixare i difereniere utilizai n studiile genetice actuale (tabelul 4.10).
Tabelul 4.10. Indici de fixare i difereniere. Fst: indicele de fixare (Wright, 1965); Gst: estimatorul lui Nei pentru Fst (Nei, 1973); st: estimatorul Weir-Cockerham pentru Fst (Weir i Cockerham, 1984); G'stN: indicele Gst standardizat de Nei; G'stH, G''st: indici standardizai de Hedrick (2005); Dest: indicele de difereniere (Jost, 2008). Table 4.10. Fixation and differentiation indeces. Fst: fixation index (Wright, 1965); Gst: Neis Fst estimator (Nei, 1973); st: Weir-Cockerham Fst estimator (Weir and Cockerham, 1984); G'stN: Gst index standardized by Nei; G'stH, G''st: indeces standardized by Hedrick (2005); Dest: differentiation index (Jost, 2008). FRA - PET FRA - PUB FRA - ROB PET - PUB PET - ROB PUB - ROB 0,047 0,035 0,116 0,039 0,060 0,072 Fst 0,044 0,032 0,113 0,037 0,058 0,070 Gst 0,081 0,060 0,200 0,071 0,109 0,131 st 0,084 0,061 0,203 0,071 0,110 0,131 G'stN 0,236 0,170 0,574 0,254 0,375 0,454 G'stH 0,268 0,196 0,617 0,280 0,409 0,490 G''st 0,201 0,143 0,520 0,225 0,337 0,413 Dest

Aceste rezultate, deoarece sunt complementare i convergente, sugereaz c cea mai mare difereniere interspecific exist ntre Q. robur i Q. frainetto. De remarcat c o difereniere ridicat exist ntre Q. robur i celelalte dou specii analizate. O difereniere clasat la un nivel inferior s-a observat ntre Q. petraea i cele dou specii din secia Dascia, Q. pubescens i Q. frainetto. Totodat, ntre stejarul pufos i grni se observ i cea mai mic difereniere genetic la nivelului suprafeei de cercetare. 4.2.5. Testarea analizei genetice a gruprii exemplarelor studiate pe specii Programul STRUCTURE 2.3.3 (Pritchard et al., 2000) calculeaz, pe baza genotipurilor multilocus, probabilitatea ca un anumit individ s aparin unui grup genetic (engl. cluster). Dac aceast probabilitate este mai mare sau egal cu pragul Tq la un anumit cluster, atunci se consider c respectivul individ are o origine pur. Valoarea pragului Tq folosit n aceast tez pentru identificarea exemplarelor pure i hibride a fost calculat prin simulri. A fost investigat

49

un numr de 8 praguri pentru setul de 4900 genotipuri simulate aparinnd speciilor pure i categoriilor hibride. Practic, sunt patru perechi de praguri complementare care se aplic indivizilor hibrizi, respectiv puri din punct de vedere genetic. Cea mai bun difereniere ntre arborii puri i cei hibrizi, cu cea mai redus rat a clasificrii greite, s-a dovedit a fi atins cu ajutorul pragului Tq 0,050 pentru hibrizi (figura 4.9). S-a observat faptul c valorile medii ale eficienei i acurateei nu sunt maxime la acest prag, ns exist un compromis optim ntre aceti doi parametrii. Astfel, indivizii care au prezentat un coeficient de apartenen q 0,05 la un anumit grup genetic (cluster) au fost grupai ca indivizi hibrizi ntre speciile corespunztoare clusterelor cu cele mai mari procente, n timp ce indivizii la care nu exist un procent de 0,05 pentru cel puin dou clustere au fost etichetai n categoria speciilor pure. Hibrizii, inclusiv exemplarele introgresive, au fost catalogai la clasa hibrid alctuit din cele dou specii parentale, pentru care coeficientul de apartenen este cuprins n intervalul 0,05 q < 0,95.

100% 95% 90% 85% 80% 75% q 0,125 q 0,100 q 0,075 q 0,050 q 0,875 q 0,900 q 0,925 q 0,950 Figura 4.9. Determinarea pragului optim pentru programul STRUCTURE n funcie de performana global Figure 4.9. Determination of the optimal threshold for the STRUCTURE software based on the overall performance Eficiena Acurateea

4.2.6. Analiza alocrii arborilor din Pdurea Bejan la specii i hibrizi Programul STRUCTURE 2.3.3 (Pritchard et al., 2000) folosete metoda Bayesian pentru evaluarea probabilitii ca genotipurile multilocus analizate provin de la un anumit numr de populaii (K). Prin analiza de identificare a numrului de clustere s-a observat c valoarea maxim atins de parametrul K este n dreptul K=2, ceea ce indic faptul c n eantionul studiat exist 2 grupuri omogene din punct de vedere genetic. Totui, o probabilitate important este atribuit i cazurilor k=3 - 5. Trebuie remarcat faptul c pentru cazul k=4 majoritatea arborilor grupai genetic n clustere corespund n linii generale celor patru entiti determinate pe criterii morfologice. Din aceast cauz, pentru analiza gruprii arborilor pe specii s -a convenit ca s fie folosite rezultatele provenite de la cazul k=4. Ulterior s-a trecut la ordonarea arborilor n funcie de coeficienii de apartenen la specii, cu pragul Tq=0,05 pentru hibrizi. n continuare va fi prezentat situaia fiecrei specii n parte.

50

4.2.6.1. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus frainetto Cei 66 de arbori ncadrai dup caracterele morfologice la specia Q. frainetto au fost grupai la clusterul corespunztor astfel (figura 4.10): 35 de indivizi au prezentat un genom specific acestui taxon, iar un arbore prezint o probabilitate ridicat pentru clusterul Q. pubescens (arborele FRA-443); 30 de arbori prezint probabilitate de hibridare (45,5%) (figura 4.11), dintre care 14 hibrizi sunt ntre Q. frainetto i Q. petraea, 12 hibrizi sunt ntre Q. frainetto i Q. pubescens i un exemplar hibrid ntre Q. frainetto i Q. robur. Ali trei indivizi sunt hibrizi formai fr participarea major a speciei Q. frainetto: doi arbori hibrizi ntre Q. petraea i Q. pubescens (FRA-447 i FRA-517), respectiv un hibrid ntre Q. pubescens i Q. robur (FRA-020);

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 294 315 298 286 306 314 296 303 293 295 305 433 301 307 1 290 302 288 304 289 56 511 316 318 312 309 297 317 300 299 313 287 626 55 291 311 108 568 319 78 292 308 115 310 114 223 109 283 422 53 107 102 39 320 416 450 570 631 54 52 66 425 517 443 447 20 FRA PET PUB ROB

Figura 4.10. Ordonarea arborilor ncadrai morfologic la Q. frainetto dup coeficienii de apartenen la cele 4 clustere, cu pragul q0,05 pentru hibrizi (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) Figure 4.10. The ordering of the trees that are morphologically assigned to Q. frainetto according to the coefficients of membership for the 4 clusters, with the threshold q0,05 for hybrids (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur)

Q. frainetto 53,0% 1,5% 1,5% 3,0% 1,5% 18,2% 21,2% Q. pubescens Hib Fra - Pet Hib Fra - Pub Hib Fra - Rob Hib Pet - Pub Hib Pub - Rob

Figura 4.11. Repartizarea pe categorii de specii pure sau hibrizi a arborilor ncadrai morfologic la specia Q. frainetto. Hib a b= hibrid ntre speciile a i b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur Figure 4.11. The allocation in purebreeds or hybrids of the trees that are morphologically assigned to Q. frainetto species. Hib a b = hybrid between the species a and b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur

51

4.2.6.2. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus petraea Cei 190 de arbori ncadrai dup caracterele morfologice la specia Q. petraea au fost grupai pe considerente genetice astfel (figura 4.12): 109 arbori sunt goruni puri din punct de vedere genetic; 81 de indivizi (42,6%) sunt posibili hibrizi (figura 4.13) dintre care 24 hibrizi sunt ntre Q. frainetto i Q. petraea, 23 hibrizi sunt ntre Q. petraea i Q. pubescens i 31 de hibrizi ntre Q. petraea i Q. robur. De asemenea, s-a identificat cte un individ hibrid ntre perechile de specii Q. frainetto i Q. pubescens (PET-509), Q. frainetto i Q. robur (PET-118), respectiv Q. pubescens i Q. robur (PET-560). La ultimul arbore nu s-au consemnat urme genetice semnificative pentru clusterul gorunului, dar la primii doi arbori exist o probabilitate de apartenen la clusterul gorunului mai mare de 0,10, fiind a treia specie ca importan.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Figura 4.12. Ordonarea arborilor ncadrai morfologic la Q. petraea dup coeficienii de apartenen la cele 4 clustere, cu pragul q0,05 pentru hibrizi (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) Figure 4.38. The ordering of the trees that are morphologically assigned to Q. petraea according to the coefficients of membership to the 4 clusters, with the threshold q0,05 for hybrids (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB Q. pubescens, ROB Q. robur)

Figura 4.13. Repartizarea pe categorii de specii pure sau hibrizi a arborilor ncadrai morfologic la specia Q. petraea. Hib a b= hibrid ntre speciile a i b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur. Figure 4.39. The allocation in purebreeds or hybrids of the trees that are morphologically assigned to Q. petraea species. Hib a b= hybrid between the species a and b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur.

81 474 545 125 516 464 276 506 413 510 101 488 80 83 440 120 489 501 487 410 265 479 273 451 279 130 532 456 459 628 461 492 460 497 483 703 486 551 515 267 480 463 457 84 403 550 87 527 282 448 435 70 269 503 466 630 241 533 561 478 271 263 465 513 138 556 104 262 627 260 261 651 88 521 419 126 566 277 539 562 485 548 454 471 453 500 538 537 224 264 535 552 490 540 509
FRA PET PUB ROB

Q. petraea Hib Fra - Pet 57,4% 0,5% 0,5% 0,5% Hib Pet - Pub Hib Pet - Rob 16,3% 12,1% 12,6% Hib Fra - Pub Hib Fra - Rob Hib Pub - Rob

52

4.2.6.3. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus pubescens Cei 116 arbori ncadrai dup caracterele morfologice la specia Q. pubescens au prezentat urmtoarea grupare genetic (figura 4.14): 57 de indivizi au fost alocai stejarului pufos; 59 de arbori (50,9%) au fost catalogai hibrizi (figura 4.15), dintre care 22 ntre Q. frainetto i Q. pubescens, 18 hibrizi ntre Q. petraea i Q. pubescens, respectiv 16 ntre Q. pubescens i Q. robur. De asemenea, s-au identificat alte dou cazuri de hibridare la care ponderea principal a hibrizilor este alocat altor specii: doi hibrizi ntre Q. petraea i Q. robur (PUB-024 i PUB-111) i un hibrid ntre Q. frainetto i Q. petraea (PUB-058). Dac la hibrizii dintre gorun i stejarul pedunculat proporia clusterului Q. pubescens este mai sczut de 0,05, la arborele PUB-058 proporia acestui cluster este de 0,15, dar stejarul pufos este doar a treia specie ca importan din compoziia genomului.

100% 80% 60% 40% 20% 0% 782 76 603 32 255 234 625 29 605 62 257 643 445 31 231 57 17 637 641 28 284 228 802 635 247 251 13 105 638 4 254 74 25 30 60 600 238 75 26 16 246 237 73 253 619 618 27 59 801 634 227 5 128 587 58 19 646 111 FRA PET PUB ROB

Figura 4.14. Ordonarea arborilor ncadrai morfologic la Q. pubescens dup coeficienii de apartenen la cele 4 clustere, cu pragul q0,05 pentru hibrizi (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) Figure 4. 40. The ordering of the trees that are morphologically assigned to Q. pubescens according to the coefficients of membership to the 4 clusters, with the threshold q0,05 for hybrids (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur)

49,1% 1,7% 0,9% 13,8% 15,5% 19,0%

Q. pubescens Hib Fra - Pub Hib Pet - Pub Hib Pub - Rob Hib Fra - Pet Hib Pet - Rob

Figura 4.15 Repartizarea pe categorii de specii pure sau hibrizi a arborilor ncadrai morfologic la specia Q. pubescens. Hib a b= hibrid ntre speciile a i b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur Figure 4.41 The allocation in purebreeds or hybrids of the trees that are morphologically assigned to Q. pubescens species. Hib a b = hybrid between the species a and b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur

53

4.2.6.4. Analiza alocrii genetice a arborilor ncadrai morfologic la Quercus robur Cei 118 arbori ncadrai dup caracterele morfologice la specia Q. robur au prezentat urmtoarea grupare genetic (figura 4.16): 91 de arbori au fost alocai genetic speciei Q. robur; 27 de indivizi (22,9%) au fost catalogai hibrizi (figura 4.17), dintre care 7 ntre Q. frainetto i Q. robur, 6 hibrizi ntre Q. petraea i Q. robur, 14 ntre Q. pubescens i Q. robur i cte un exemplar hibrid ntre Q. frainetto i Q. petraea (ROB-050), respectiv Q. petraea i Q. pubescens (ROB-229). La ultimii doi arbori, dei stejarul pedunculat nu apare ca participant direct la hibridare, exist o probabilitate semnificativ (0,162, respectiv 0,152) ca arborii s aparin clusterului Q. robur.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 47 558 590 195 218 621 185 14 49 572 663 582 46 194 214 622 574 591 620 202 653 186 662 38 99 42 193 589 184 588 187 45 43 100 198 592 220 654 221 701 201 92 93 196 90 805 206 586 656 519 183 242 204 63 268 67 522 68 44 50 FRA PET PUB ROB

Figura 4.16 Ordonarea arborilor ncadrai morfologic la Q. robur dup coeficienii de apartenen la cele 4 clustere, cu pragul q0,05 pentru hibrizi (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur) Figure 4.42 The ordering of the trees that are morphologically assigned to Q. robur according to the coefficients of membership to the 4 clusters, with the threshold q0,05 for hybrids (FRA - Q. frainetto, PET - Q. petraea, PUB - Q. pubescens, ROB Q. robur)

77,1%

Q. robur Hib Fra - Rob Hib Pet - Rob Hib Pub - Rob Hib Fra - Pet Hib Pet - Pub

0,8% 0,8%

11,9%

5,1%

5,9%

Figura 4.17. Repartizarea pe categorii de specii pure sau hibrizi a arborilor ncadrai morfologic la specia Q. robur. Hib a b= hibrid ntre speciile a i b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur. Figure 4.43. The allocation in purebreeds or hybrids of the trees that are morphologically assigned to Q. robur species. Hib a b = hybrid between the species a and b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur.

54

4.2.6.5 Concluzii privind analiza alocrii genetice a arborilor din Pdurea Bejan Din cei 492 de arbori din complexul mixt Bejan-Deva, analizai cu ajutorul setului de 13 markeri moleculari, s-au identificat 293 de exemplare care prezint un genotip caracteristic unei anumite specii. Dintre aceti arbori, 292 (99,7%) au corespuns speciei la care au fost ncadrai prin caracterele morfologice, n timp ce un individ a fost alocat genetic unei alte specii. Astfel, cu aceste informaii genetice, se poate calcula structura pe specii a arborilor puri genetic n suprafaa de cercetare intensiv: 109 arbori Q. petraea, 91 de arbori Q. robur, 58 de exemplare Q. pubescens i 35 de exemplare de Q. frainetto. Pentru a evalua hibridarea natural ntre perechile de specii analizate trebuie determinate eantioanele efective ale acestora. Deoarece n acest studiu dispunem de constituia genetic a genomului la 13 markeri moleculari pentru fiecare individ analizat, se poate calcula mrimea eantionului unei specii pe criterii genetice. Astfel, fiecare arbore este alocat acelui taxon pentru care exist cea mai mare proporie din clusterul genetic. Mrimea eantioanelor celor patru specii de cvercinee analizate este raportat n tabelul 4.11.
Tabelul 4.11. Mrimea eantioanelor determinate genetic pentru fiecare specie de stejari Table 4.11. The size of the samples that are genetically determined for each oaks species Clusterul genetic Total Q. frainetto Q. petraea Q. pubescens Q. robur 1 1 0 56 58 4 4 3 181 192 5 2 2 108 117 1 6 3 115 125 10 9 8 5 32

Q. frainetto Q. petraea Q. pubescens Q. robur Numrul arborilor alocai genetic la alte specii comparativ cu ncadrarea morfologic

n suprafaa de cercetare, cu ajutorul markerilor moleculari, au fost identificai 199 de hibrizi (tabelul 4.12) ntre toate cele patru specii de cvercinee din complexul Bejan-Deva, ceea ce reprezint un procent de 40,4% din totalul arborilor analizai. Aceast valoare este puin superioar celor comunicate de Lepais et al. (2009) n trei arborete mixte de cvercinee din Frana, n care proporia hibrizilor a variat ntre 19,1 i 30,5%. De asemenea, ntr-un arboret din Italia alctuit din speciile Q. petraea, Q. pubescens i Q. frainetto, Viscosi et al. (2012) au identificat un nivel al hibridrii de 20,5%. La nivelul suprafeei de cercetare intensiv cei mai muli hibrizi s-au observat ntre speciile Q. petraea i Q. pubescens (22,1% din totalul hibrizilor) iar cei mai puini ntre Q. frainetto i Q. robur (4,5%). Totui, dac se dorete evaluarea nivelului hibridrii ntre perechile de specii, se extrage procentul hibrizilor din eantionul arborilor alocai genetic la perechea de specii constituente (tabelul 4.12), folosind datele din tabelul 4.11. Astfel, exist rate de hibridare ntre 4,9% (Q. frainetto i Q. robur) i 20,0% (Q. frainetto i Q. pubescens).

55

Hibrizi observai ntre speciile Q. frainetto x Q. petraea Q. frainetto x Q. pubescens Q. frainetto x Q. robur Q. petraea x Q. pubescens Q. petrea x Q. robur Q. pubescens x Q. robur Total

Tabelul 4.12. Proporia hibrizilor n arboret i ntre specii Table 4.12. The percentage of hybrids in stand and between species Mrimea Proporia Hibrizi sau Proporia hibrizilor eantionului celor hibrizilor n indivizi n funcie de clasa dou specii eantionul celor introgresivi hibrid (%) determinate pe dou specii criterii genetice parentale (%) 40 20,1 250 16,0 35 17,6 175 20,0 9 4,5 183 4,9 44 22,1 309 14,2 39 19,6 317 12,3 32 16,1 242 13,2 199 100

Speciile cu cea mai mare pondere de participare la formarea hibrizilor sunt Q. petraea (31%) i Q. pubescens (28%), cei mai puin implicai taxoni fiind Q. frainetto (21%) i Q. robur (20%). Totui, pe baza genotipurilor multilocus i a programului STRUCTURE se observ urmtoarele procente ale abundenei relative a speciilor n fitocenoza studiat: 39% Q. petraea, 25,4% Q. robur, 23,8% Q. pubescens i 11,8% Q. frainetto. Din compararea acestor date cu proporiile de participare ale speciilor la formarea hibrizilor se pot trage urmtoarele concluzii: cele mai reprezentative specii din arboret, Q. petraea i Q. robur, formeaz hibrizi ntr-o proporie mai sczut dect procentul de participare n arboret, iar celelalte dou specii, Q. pubescens i Q. frainetto sunt mai bine reprezentate la formarea hibrizilor dect s-ar fi ateptat din abundena lor n arboret. Acest mecanism al hibridrii, n care speciile rare tind s fie mai bine reprezentate ntre hibrizi, a fost observat i de ctre Lepais et al. (2009). n concluzie, cu ajutorul datelor genetice s-a realizat o identificare a arborilor puri i a hibrizilor dintre cele patru specii de cvercinee, ale cror proporii de apariie n suprafaa de cercetare sunt afiate n figura 4.18. Deoarece arborii maturi eantionai au coordonatele geografice cunoscute, s-a realizat o hart care a nglobat proporia de participare a fiecrei specii n genomul acestor arbori (figura 4.19). 6,5% 7,9% 8,9% 1,8% 7,1% 8,1% 18,5% 11,8% 22,2% 7,1%

Q. frainetto Q. petraea Q. pubescens Q. robur Hib Fra - Pet Hib Fra - Pub Hib Fra - Rob Hib Pet - Pub Hib Pet - Rob Hib Pub - Rob

Figura 4.18 Proporia de participare a speciilor pure i a perechilor de hibrizi n suprafaa de cercetare Bejan -Deva. Hib a b= hibrid ntre speciile a i b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur. Figure 4.18. The percentage of participation of purebreeds and hybrid pairs in Bejan Deva study area. Hib a b= hybrid between the species a and b; Fra = Q. frainetto, Pet = Q. petraea, Pub = Q. pubescens, Rob = Q. robur

56

Figura 4.19. Distribuia spaial a arborilor eantionai n Rezervaia natural Bejan-Deva. Fiecare arbore este reprezentat de un cerc proporional cu diametrul trunchiului la nlimea de 1,30m. Arborii puri sunt reprezentai de o singur culoare, iar arborii hibrizi prezint cel puin dou culori, corespunztoare speciilor parentale Figure 4.46. Spatial distribution of sampled trees in the natural reservation Bejan-Deva. Each tree is represented by a circle that is proportional with the diameter of the trunk at the hight of 1,30 m. Purebreeds are represented in only one colour and hybrids are represented by at least two colours, corresponding to the parental species

4.2.6.6. Compararea analizei de grupare a indivizilor la specii n dou studii diferite Deoarece n Pdurea Bejan au fost analizai genetic, cu ajutorul a ase microsatelii, 268 de arbori comuni cu cei din acest studiu, de ctre Curtu et al. (2007b), s-a putut evalua gradul de convergen al rezultatelor obinute cu cele dou seturi de date moleculare. Compararea celor dou seturi de date prin analiza genetic a relevat o rezoluie mai bun a programului de alocare a arborilor poteniali hibrizi o dat cu creterea numrului de loci analizai n studiul de fa. Totui, o alt cauz a diferenei dintre cele dou studii este dat de utilizarea unor praguri diferite pentru alocarea genetic n cele dou studii.

4.3. Estimarea fluxului genic actual prin analize de paternitate

4.3.1. Identificarea arborilor donatori de polen Cu ajutorul genotipurilor la 10 loci microsatelitici a arborilor maturi i a programului Cervus 3.0 (Kalinowski et al., 2007) s-a ncercat identificarea arborilor donatori de polen pentru cele 313 ghinde recoltate de la 15 arbori din suprafaa de cercetare intensiv din rezervaia natural Bejan-Deva. Deoarece ghindele au fost recoltate de la suprafaa solului, sub coroana arborilor mam, s-au identificat cteva cazuri n care ali arbori din imediata vecintate sunt

57

adevraii arbori-mam pentru ghinde. Astfel, la ghindele recoltate de sub coroana arborelui 223 s-au identificat nc doi arbori-mam (224 i 539), la arborele 81 trei ghinde cu arborele-mam 82 iar la arborele 102 s-au identificat 11 ghinde cu arborele-mam 104. Totui, la arborii-mam 14, 40 i 558 exist un total de nou ghinde la care nu s-a raportat un arbore-mam din suprafaa de cercetare. Din aceast cauz aceste ghinde s-au eliminat din eantionul pentru analizele de paternitate. Astfel, pentru cele 304 ghinde rmase s-a rulat programul CERVUS i s-au analizat cei 492 de arbori maturi ca poteniali arbori donatori de polen. Un exemplu de polenizare al unui arbore-mam este redat n figura 4.20.

Figura 4.20. Proveniena grunciorilor de polen care au fecundat ovulele arborelui 487. Traiectoria grunciorilor de polen este redat de linii negre, ale cror grosime este proporional cu numrul de ghinde fecundate Figure 4.20. The provenience of the pollen grains that fertilized the eggs of the tree 487. The trajectory of the pollen grain is represented by black lines that have the thickness proportional with the number of the fertilized acorns

La cei 19 arbori-mam s-au identificat 80 de arbori donatori de polen diferii din suprafaa de cercetare intensiv (16%). Aceti arbori au polenizat 140 din cele 304 ghinde analizate (46,1%). Astfel, pentru toi arborii-mam, proporia ghindelor polenizate cu polen provenit din afara suprafeei de cercetare este de 53,9%. Aceast valoare este puin mai mare dect cea raportat de Curtu et al. (2009) n aceeai rezervaie natural, care la 8 arbori-mam i un total de 320 de ghinde au raportat o proporie de 48,4% polen provenit din exteriorul ariei determinat de cei 269 de arbori aduli eantionai. ntr-un studiu recent la care s-au utilizat analizele de paternitate ntr-un arboret cu patru specii de stejari albi (Lepais i Gerber, 2011), sau identificat 167 ghinde (26,1%) cu ambii prini din interiorul suprafeei de cercetare, deci fluxul genic din afara acestei suprafee este mai ridicat dect la cele dou cercetri din Pdurea

58

Bejan. n schimb, ntr-un arboret alctuit din Q. robur i Q. petraea, localizat n Danemarca, Jensen et al. (2009) au comunicat o proporie sczut a polenului provenit din exteriorul suprafeei cercetate: 11-13% la gorun, respectiv 23-27% la stejarul pedunculat. n anul recoltrii celor 304 ghinde eantionate (2012) s-au identificat 93 de cazuri de polenizare n suprafaa de cercetare. Majoritatea arborilor donatori de polen (87,5%) au polenizat un singur arbore-mam. Astfel, din cei 10 arbori donatori de polen care au polenizat mai muli arbori-mam, 8 s-au observat la cte doi arbori seminceri, iar arborii 226 (Q. petraea) i 232 (Q. petraea x Q. frainetto) au polenizat 3, respectiv 4 arbori-mam. Interesant este faptul c 7 din arborii eantionai au jucat att rolul de arbore-mam, ct i pe cel de arbore donator de polen, dar la nici unul nu s-a consemnat autofecundarea, spre deosebire de alte studii la cvercinee unde s-a raportat (Curtu et al., 2009; Jensen et al., 2009; Lepais i Gerber, 2011). Majoritatea arborilor donatori de polen identificai n suprafaa de cercetare (68,8%) au polenizat o singur ghind, 16,2% au polenizat dou ghinde, iar restul arborilor (15%) au polenizat ntre 3 i 11 ghinde din cele analizate. n schimb, Lepais i Gerber (2011) au comunicat c din cei 126 de arbori-tat identificai din suprafaa analizat, doar 11,9% au polenizat mai mult de dou ghinde.

4.3.2. Dispersia polenului Speciile din genul Quercus sunt anemofile, iar din aceast cauz se ateapt ca polenul s parcurg distane mari. n acest studiu, suprafaa de cercetare n care sunt localizai 490 de arbori eantionai are aproximativ 8,5 ha, iar 2 arbori sunt situai la liziera arboret ului, la aproximativ 380 m de marginea estic a perimetrului suprafeei de cercetare. n interiorul perimetrului determinat de arborii eantionai, diagonala pe direcia SV NE are lungimea de 505 m, iar diagonala pe direcia NV SE are lungimea de 330 m. Distana medie a dispersiei polenului n interiorul suprafeei de cercetare este redat n tabelul 4.13 pentru fiecare arbore-mam. Pentru toate cazurile de polenizare identificate, distana medie a dispersiei polenului n suprafaa de cercetare este de 71 m. Valorile medii observate au variat considerabil ntre arborii-mam, ntre 10 i 260 m. n literatura de specialitate s-au comunicat valori destul de diverse ale dispersiei polenului speciilor de cvercinee. Astfel, pentru stejarii europeni, distanele au variat ntre 18 64 m la arborii de Q. robur, respectiv ntre 22 58 m la arborii de Q. petraea (Streiff et al., 1999). La un arboret compus din aceleai dou specii, dar situat n Danemarca, Jensen et al. (2009) au relatat c distana medie dintre arborii-mam i polenizatorii identificai a fost de 57 m. O distan medie mult mai mare, de 283 m, a fost raportat recent de Chybicki i Burczyk (2013) ntr-un arboret regenerat artificial n Polonia. ntr-un arboret din Spania, distana medie de

59

polenizare a fost de 92 m pentru Q. petraea, respectiv 270 m la Q. pyrenaica (ValbuenaCarabana et al., 2005).
Tabelul 4.13. Dispersia polenului n suprafaa de cercetare studiat. Fra Q. frainetto, Pet Q. petraea, Pub Q. pubescens, Rob Q. robur; a arbore-mam identificat n ghindele de sub coroana arborelui 81, b arbore-mam identificat n ghindele de sub coroana arborelui 223, c arbore-mam identificat n ghindele de sub coroana arborelui 102 Table 4.13. Pollen dispersal in the study area. Fra Q. frainetto, Pet Q. petraea, Pub Q. pubescens, Rob Q. robur; a mother-tree identified in the acorns from under the crown of the tree 81, b mother-tree identified in the acorns from under the crown of the tree 223, c mother-tree identified in the acorns from under the crown of the tree 102 Numrul Intervalul Distana minim Proporia Distana Abaterea Apartenenarborilor de variaie a dispersiei polenului Arbomedie a standard a a donatori de al polenului din din exterireledispersiei dispersiei arboreluipolen din dispersiei exteriorul orul suprafemam polenului polenului mam suprafaa de polenului suprafeei de ei de cerce(m) (m) cercetare (m) cercetare (m) tare (%) 487 Pet 10 12 60 25,5 12,0 43 20,8 81 Pet 10 6 - 125 48,3 35,8 60 23,8 82a Pet 2 66 - 71 68,5 0,7 64 33,3 804 Pub 4 23 96 51,4 30,4 32 37,5 615 Pub 3 11 108 63,8 50,5 10 81,0 14 Rob 11 52 190 117,9 49,4 94 50,0 805 Rob 7 21 123 54,6 36,3 47 56,0 40 Rob 4 12 22 15,4 5,0 20 56,5 558 Rob 1 260 260,0 10 94,4 223 Fra x Pub 5 8 101 38,6 25,8 75 36,0 102 Fra x Pub 1 34 34,0 66 50,0 118 Fra x Rob 6 124 281 191,8 57,5 47 75,0 238 Pet x Pub 4 8 - 23 20,4 5,0 84 25,0 104c Pet x Pub 4 6 214 82,6 79,2 66 54,5 517 Pet x Pub 8 21 - 199 84,9 69,0 28 61,9 15 Pet x Pub 3 29 51 39,3 11,1 94 70,0 224b Pet x Rob 2 9 - 11 10,0 1,4 75 33,3 556 Pet x Rob 7 14 110 65,5 38,7 10 62,5

La specia cu cel mai ntins areal european (Q. robur) s-a studiat fluxul genic pentru dou populaii marginale cu origine strveche (relicte), situate n estul Munilor Ural la o distan de aproximativ 80 km de arealul continuu al speciei. Analizele au indicat faptul c cel puin 35% din polenizrile reuite provin de la arbori situai la mai mult de 80 km deprtare. Astfel, transportul pe distane mari al polenului contribuie la meninerea unei diversiti genetice ridicate, chiar i n populaiile izolate. 4.3.3. Analiza ncrucirilor din suprafaa de cercetare Cu ajutorul analizelor de paternitate efectuate asupra ghindelor eantionate s-au determinat arborii din suprafaa de cercetare care au polenizat arborii-mam. Cu ajutorul acestor informaii, dar i cu cel al alocrii genetice a arborilor aduli la specii sau categorii hibride (subcapitolul 4.2.6), se poate determina direct tipul de eveniment reproductiv dintre participanii la ncruciare. n funcie de apartenena arborelui-mam, se pot defini urmtoarele tipuri de evenimente reproductive: 60

1.

arbore-mam pur din punct de vedere genetic: o ncruciare intraspecific: prinii aparin aceleiai specii; o hibridare de generaia I (F1): prinii aparin la dou specii diferite; o retroncruciare: arborele donator de polen este un hibrid ntre dou specii, dintre care una este comun cu a arborelui-mam; o trihibridare: arborele donator de polen este un hibrid ntre dou specii diferite de cea a arborelui-mam; arbore-mam hibrid ntre speciile a i b: o hibridare de generaia a II-a (F2): prinii sunt din aceeai categorie hibrid; o retroncruciare: arborele donator de polen este alocat uneia dintre speciile a sau b; o trihibridare: arborele donator de polen este fie un arbore pur, alocat unei specii c, fie un arbore hibrid ntre speciile a sau b i o alt specie (de ex. c); o tetrahibridare: arborele donator de polen este un hibrid ntre dou specii diferite de cele ale arborelui-mam (de ex. c i d). Caracterizarea direct pentru cele 140 de cazuri de ncruciri din interiorul suprafeei

2.

de cercetare este raportat n tabelul 4.14. Arborii-mam alocai speciilor pure sunt n principal fertilizai de polenul provenit de la arbori conspecifici: 71% din evenimentele reproductive identificate la aceti indivizi sunt ncruciri intraspecifice. De asemenea, retroncrucirile sunt frecvente deoarece 19% din polenul primit de aceti arbori-mam provine de la indivizi hibrizi al cror genom conine o pondere pentru specia comun cu arborele semincer. O proporie mai sczut este corespunztoare hibridrilor din generaia I (F1), deoarece exist doar 6 cazuri de ncruciare ntre specii pure diferite (7,6%). ncrucirile de tipul trihibridrilor sunt rare i reprezint doar 2,5% pentru arborii-mam puri. ntr-o suprafa de cercetare situat n aceeai Pdure Bejan, Curtu et al. (2009) au comunicat o proporie a ncrucirilor intraspecifice de 64%, rata hibridrii la generaia ghindelor fiind 36%. Totui, hibridrile ntre arbori puri din punct de vedere genetic sunt relativ rare (8,4%). O situaie asemntoare pentru arbori-mam puri genetic a fost relatat ntr-un studiu recent de Lepais i Gerber (2011), unde la cei 6 arbori seminceri au predominat ncrucirile intraspecifice (63%), urmate de retroncruciri (23%) i hibridri F1 (9%). n ceea ce privete ncrucirile la care au fost implicai arborii-mam hibrizi, cea mai mare proporie s-a observat pentru retroncruciri (38%), ceea ce denot o afinitate pentru polenul arborilor puri, alocai uneia dintre speciile parentale ale arborelui-mam. ncrucirile ntre hibrizi de acelai tip genetic dein o pondere de 31%. Astfel, nsumnd procentele anterioare se observ o preferin a arborilor-mam hibrizi (69%) pentru polenul provenit de la arbori care au n comun una sau ambele specii parentale ale acestora. Totui, exist o proporie

61

important (28%) a ncrucirilor care imprim o informaie genetic de la trei specii diferite (trihibridare), n timp ce tetrahibridrile sunt puin importante (3%). Rezultate relativ diferite au fost comunicate de Lepais i Gerber (2011) la 10 arbori-mam hibrizi, deoarece proporia retroncrucirilor este mult mai mare (68%) iar evenimentele de tipul hibridrii F2 i trihibridrilor sunt mai puin frecvente (13%, respectiv 19%).
Tabelul 4.14. Tipuri de evenimente reproductive identificate n suprafaa de cercetare. Fra Q. frainetto, Pet Q. petraea, Pub Q. pubescens, Rob Q. robur; a arbore-mam identificat n ghindele de sub coroana arborelui 81, b - arbore mam identificat n ghindele de sub coroana arborelui 223, c - arbore mam identificat n ghindele de sub coroana arborelui 102. Eveniment reproductiv: Intrasp= ncruciare intraspecific; F1= hibridare din prima gneraie; F2= hibridare din a doua generaie; Bc= retro -ncruciare; Trihib= trihibridare; Tetrahib= tetrahibridare. Table 4.14. Types of reproductive events identified in the study area. Fra Q. frainetto, Pet Q. petraea, Pub Q. pubescens, Rob Q. robur; a mother-tree identified in the acorns from under the crown of the tree 81, b mother tree identified in the acorns from under the crown of the tree 102. Reproductive event: Intrasp= intraspecific mating; F1= hybridisation from the first generation; F2= hybridisation from the second generation; Bc= backcrossing; Trihib= trihybridisation; Tetrahib= tetrahybridisation. Evenimentul reproductiv AparteNumrul arborilor Numrul Arborele nena donatori de polen ghindelor cu Tri Tetra Intrasp F1 F2 Bc -mam arboreluidin suprafaa de ambii prini hib hib mam cercetare identificai 487 Pet 10 19 16 0 0 3 0 0 81 Pet 10 16 12 1 0 3 0 0 82a Pet 2 2 2 0 0 0 0 0 804 Pub 4 5 0 0 0 5 0 0 615 Pub 3 4 3 0 0 1 0 0 14 Rob 11 11 4 5 0 0 2 0 805 Rob 7 11 8 0 0 3 0 0 40 Rob 4 10 10 0 0 0 0 0 558 Rob 1 1 1 0 0 0 0 0 Total 79 56 6 0 15 2 0 Specii pure % 70,9 7,6 0,0 19,0 2,5 0 223 Fra x Pub 5 16 0 0 11 1 2 2 102 Fra x Pub 1 3 0 0 3 0 0 0 118 Fra x Rob 6 6 0 0 0 6 0 0 238 Pet x Pub 4 9 0 0 0 3 6 0 104c Pet x Pub 4 5 0 0 0 5 0 0 517 Pet x Pub 8 8 0 0 1 2 5 0 15 Pet x Pub 3 3 0 0 1 1 1 0 556 Pet x Rob 7 9 0 0 2 5 2 0 b 224 Pet x Rob 2 2 0 0 1 0 1 0 Total 61 0 0 19 23 17 2 Hibrizi % 0,0 0,0 31,1 37,7 27,9 3,3 Total global 140 56 6 19 38 19 2 % 40,0 4,3 13,6 27,1 13,6 1,4

Totalul global, pentru cei 18 arbori-mam, indic faptul c cele mai multe ncruciri sau realizat ntre arbori conspecifici (40%). O proporie important este observat pentru retroncruciri (27%), iar ncrucirile mai complexe (hibridare de ordinul 2 i trihibridare)

62

dein o pondere de aproximativ 14% fiecare. Pe de alt parte, ncrucirile ntre specii pure (F1) dein o pondere limitat (4%), iar tetrahibridrile sunt cele mai rar ntlnite (1%). Din aceast cercetare se poate observa c n Pdurea Bejan arborii hibrizi sunt polenizatori de succes, ceea ce confirm faptul c produc polen viabil. Rezultate similare au fost comunicate n alte studii (Salvini et al., 2009; Lepais i Gerber, 2011) privind viabilitatea polenului i proporia de germinare a hibrizilor din complexul de stejari albi europeni. 4.3.4. Sintez comparativ a analizelor de paternitate i a datelor fenologice Deoarece n acest studiu dispunem de date fenologice ale deschiderii mugurilor i ale nfloririi, dar i de analize de paternitate ale ghindelor i date ale apartenenei genetice ale arborilor parentali, se poate realiza o comparaie a acestora pentru a determina n ce clase fenologice se gsesc arborii parentali. Totui, deoarece observaiile fenologice ale nfloririi sunt limitate la un numr redus de arbori, s-au utilizat doar informaiile fenologice provenite de la studiul deschiderii mugurilor foliari cu scopul de a estima procentul suprapunerilor intervalelor fenologice. Trebuie menionat faptul c intervalele n care a avut loc deschiderea mugurilor foliari s-au mprit n trei intervale de timp egale, dup cum urmeaz: o anul 2011 (22 zile): I (3 apr. 9 apr.), II (10 apr. 17 apr.) i III (18 apr. 24 apr.); o anul 2012 (27 zile): I (6 apr. 14 apr.), II (15 apr. 23 apr.) i III (24 apr. 2 mai); o anul 2013 (12 zile): I (18 apr. 21 apr.), II (22 apr. 25 apr.) i III (26 apr. 29 apr.). Rezultatele analizei au relevat c 62,2% din arborii care au participat la polenizare sunt din aceeai categorie fenologic cu arborele-mam n cei trei ani n care s-au realizat observaiile fenologice. Totui, ncadrarea fenologic a ncrucirilor analizate poate fi influenat de delimitarea celor trei intervale ale fenofazei deschiderea mugurilor foliari. Deoarece ghindele utilizate la analizele de paternitate s-au recoltat din arboret n anul 2012, se poate presupune c n acel an procentul arborilor donatori de polen aflai n aceeai categorie fenologic cu arboriimam este mai mare. Totui, analiza pentru anul 2012 a indicat un procen t de 60,8% pentru aceti arbori. Chiar dac datele fenologice pentru anul 2012 sunt mai reduse, acestea pot fi deosebit de importante deoarece ne pot indica decalajul n zile calendaristice dintre arborii-mam i cei donatori de polen. Cu toate c la majoritatea arborilor polenizatori s-a observat debutul deschiderii mugurilor foliari n zile apropiate de cele observate la arborii-mam, s-au realizat ncruciri ntre indivizi cu diferene ale debutului acestei fenofaze de 9 sau 10 zile. Astfel, aceste observaii confirm corelaia semnificativ dintre fenofazele deschiderea mugurilor foliari i nflorire (subcapitolul 4.1) i indic o comasare a intervalului nfloririi.

63

5. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUII ORIGINALE. DISEMINAREA REZULTATELOR. DIRECII VIITOARE DE CERCETARE

5.1. Concluzii finale 5.1.1. Concluzii rezultate din efectuarea observaiilor fenologice Referitor la obiectivul 1 - evaluarea fenologiei deschiderii mugurilor foliari i nfloririi ntr-un arboret mixt de stejari albi: n cei trei ani consecutivi ai observaiilor asupra deschiderii mugurilor foliari s-a

remarcat c specia Q. petraea prezint un avans temporal fa de celelalte trei specii simpatrice, comportament explicabil prin cerinele ecologice fa de temperatur ale gorunului, coroborate cu faptul c acesta se afl n zona studiat la limita inferioar a arealului altitudinal; Corelaia existent ntre deschiderea mugurilor foliari i nflorire, dei este de intensitate medie, permite desemnarea cu suficient acuratee a categoriei fenologice de nflorire (care este dificil de evaluat direct) prin intermediul observaiilor privind deschiderea mugurilor, dar mai ales prezint utilitate pentru aprecierea nivelului de suprapunere a fenofazei de nflorire la nivelul metapopulaiei analizate; Observaiile efectuate pentru cele dou fenofaze n ani consecutivi indic o mai puternic corelaie a categoriilor fenologice referitoare la deschiderea mugurilor foliari, deoarece dinamica nfloririi este mult mai accentuat i poate fi influenat mult mai mult dect nfrunzirea de condiiile climatice specifice din ani consecutivi; Observaiile fenologice au subliniat dependena fenofazelor deschiderea mugurilor foliari i nflorire de temperaturile ridicate din timpul primverii. Astfel, condiiile climatice dintr-un anumit an pot determina creterea posibilitii hibridrii prin suprapunerea perioadelor de nflorire; Deoarece intervalele n care a avut loc nflorirea celor patru specii de cvercinee analizate n rezervaia natural Bejan-Deva se suprapun, nseamn c nu exist bariere prezigotice pentru mpiedicarea fenomenului de hibridare natural i, ca atare, exist premisele necesare realizrii acestui fenomen. Astfel, pentru aceste patru specii de cvercinee din Pdurea Bejan, fenologia nu deine un rol semnificativ n izolarea reproductiv.

64

5.1.2 Concluzii rezultate din evaluarea hibridrii arborilor maturi Referitor la obiectivul 2 - estimarea diversitii i diferenierii genetice n interiorul i ntre speciile de cvercinee i identificarea hibrizilor interspecifici pentru arborii maturi din arboret: n aceast cercetare de evaluare a hibrizilor ntr-o fitocenoz forestier cu patru specii de cvercinee cu potenial ridicat de hibridare s-a folosit un set de markeri moleculari caracterizai printr-un nivel ridicat de variaie genetic intra- i interspecific. Dintre aceti markeri se remarc locusul funcional DHN3, utilizat n premier pentru a diferenia patru specii diferite din cadrul genului Quercus, subgenul Lepidobalanus; S-au identificat cele mai mari diferene genetice ntre speciile Q. frainetto i Q. robur i cele mai mici ntre Q. frainetto i Q. pubescens. Totui, aceste rezultate trebuie interpretate cu atenie deoarece eantioanele speciilor conin i indivizi hibrizi; S-a observat existena unei corelaii ntre numrul de hibrizi i intensitatea diferenierii interspecifice, deoarece cei mai muli hibrizi se observ ntre Q. frainetto i Q. pubescens iar cei mai puini ntre Q. frainetto i Q. robur; Pragul optim de difereniere a speciilor pure de indivizii provenii din hibridri, n cadrul programului STRUCTURE, a fost determinat statistic prin evaluarea performanei setului de markeri moleculari ntr-un scenariu de hibridare artificial. S-a utilizat criteriul genetic pentru identificarea speciilor, aadar nu s-a recurs la nici o alt informaie n afara genotipului arborilor; n suprafaa de cercetare intensiv din Pdurea Bejan majoritatea arborilor care au fost ncadrai genetic la specii pure au respectat clasificarea pe criterii morfologice; S-a reuit identificarea unor hibrizi sau indivizi introgresivi ntre toate combinaiile posibile de specii, ceea ce indic faptul c nu exist bariere reproductive stricte ntre cele patru specii de cvercinee; Proporia hibrizilor n eantionul studiat (40,4%) se afl la limita superioar observat n diferite studii genetice la speciile din genul Quercus, ceea ce demonstreaz c hibridarea este un fenomen frecvent n rezervaia natural studiat; S-a consemnat o variaie a tipurilor de hibrizi dependent de participarea mai intens la ncrucirile interspecifice a taxonilor mai puin abundeni n zona studiat. Acest comportament sugereaz faptul c rezultatul hibridrii naturale este influenat de condiiile locale; Prin analize comparative s-a observat c o utilizare a unui set de microsatelii cu un nivel mai ridicat de difereniere interspecific produce o identificare mai detaliat a indivizilor cu urme mai fine de introgresie n genotipul lor. 65

5.1.3. Concluzii rezultate din evaluarea fluxului genic actual Referitor la obiectivul 3 - estimarea fluxului genic actual cu ajutorul analizelor de paternitate: Fluxul genic actual, care poate indica prezena fenomenului de hibridare ntr-o anumit suprafa cercetat, a fost estimat prin analiza genotipic a ghindelor recoltate de sub coroana arborilor-mam, alocai genetic unei specii sau unei categorii hibride; Cunoscnd genotipurile tuturor stejarilor eantionai n suprafaa de cercetare, s-a realizat o analiz de paternitate pentru a aloca fiecrei ghinde un tat compatibil din punct de vedere genetic. Astfel, s-a putut creiona o imagine instantanee de ansamblu a comportamentului de reproducere a unui numr limitat de stejari; Pentru lotul de ghinde eantionate s-a identificat o proporie important a arborilor donatori de polen din suprafaa de cercetare i s-a confirmat polenizarea pe distane relativ mari (circa 71 m) a arborilor-mam din Pdurea Bejan. Totui, o proporie important (54%) a polenului a provenit din exteriorul suprafeei de cercetare, dinamic observat n general la speciile de cvercinee; Pe baza analizelor de alocare genetic a arborilor la specii sau hibrizi i a analizelor de paternitate s-au determinat direct tipurile de evenimente reproductive dintre participanii la ncruciare. S-a estimat faptul c la nivelul suprafeei de cercetare cele mai frecvente evenimente reproductive sunt ncrucirile intraspecifice, urmate de retroncruciri. Proporii importante sunt observate i la hibridrile mai complexe (hibridri F2 i trihibridri); n suprafaa de cercetare hibridrile F1 (ntre dou specii parentale diferite, pure genetic) sunt puin frecvente (5%). Totui, aceti hibrizi, o dat formai, vor constitui sursa de meninere a efectivului arborilor hibrizi din arboret; Raportarea analizelor de paternitate la observaiile fenologice n ani consecutivi de observaii a indicat c o proporie important (aproximativ 2/3) din participanii la ncruciare se afl n aceeai categorie fenologic; n concordan cu rezultate anterioare care au artat c hibrizii nu sunt limitai la prima generaie, cercetrile din aceast tez confirm fertilitatea hibrizilor din complexul de cvercinee analizat. Arborii-mam hibrizi prefer polenul provenit de la speciile parentale sau de la hibrizi de acelai tip, ceea ce demonstreaz meninerea parial a barierelor reproductoare la aceti arbori.

66

5.2. Contribuii originale S-a realizat primul studiu fenologic la scar redus, n ani consecutivi de observaii, al cvercineelor din Romnia, ntr-o suprafa intensiv conspecific, prin care se analizeaz implicaiile fenofazelor de primvar asupra realizrii hibridrii naturale. Caracterul de noutate al cercetrilor n aceast direcie rezult i din corelarea datelor fenologice cu cele climatice de mare precizie preluate din fitocenoza studiat cu un senzor de temperatur i umiditate; 2. S-au calculat corelaiile multianuale dintre fenofazele deschiderea mugurilor foliari i nflorire i s-a determinat relevana utilizrii primei fenofaze, care este mai uor de evaluat, pentru estimarea nfloririi; 3. S-a constituit banca de ADN pentru 492 de arbori maturi i 313 ghinde recoltate din suprafaa de cercetare localizat n rezervaia natural Bejan-Deva, care a devenit astfel o baz de date cu ridicat nivel de investigare genetic din Romnia, cu utilitate pentru etapele viitoare de cercetare; 4. S-au realizat optimizri metodologice pentru markerii moleculari utilizai, n vederea reducerii costurilor de analiz genetic; 5. S-a prezentat o metod simpl, eficient i cu costuri reduse, bazat pe dou reacii de polimerizare n lan de tip multiplex, pentru realizarea analizelor de paternitate ale cvercineelor; 6. S-a utilizat n premier markerul molecular DHN3, provenit dintr-o poriune informativ a genomului stejarilor, pentru diferenierea, alocarea genetic i identificarea hibrizilor dintr-o fitocenez forestier cu patru specii de cvercinee simpatrice; 7. S-a realizat n premier o sintez comparativ ntre analizele de paternitate i datele fenologice, fiind utilizate de asemenea i analizele de alocare genetic pentru arborii participani la ncruciri n suprafaa de cercetare.

1.

5.3. Diseminarea rezultatelor A. Lucrari publicate n reviste ISI: 1. Curtu, A.L., Moldovan, I.C., Enescu, C.M., Crciunesc, I., ofletea, N., 2011: Genetic Differentiation between Quercus frainetto Ten. and Q. pubescens Willd. in Romania. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, Vol. 39, Nr. 1: 275282;

67

B. Lucrri publicate n reviste indexate n baze de date internaionale (BDI): 1. Crciunesc, I., Ciocrlan, E., ofletea, N., Curtu, A.L., 2011: Genetic diversity of pedunculate oak (Quercus robur L.) in Prejmer Natural Reserve. Bulletin of the Transilvania University of Braov, Seria a II-a, Vol. 4 (53), Nr. 1: 15-20; 2. ofletea, N., Moldovan, I.C., Enescu, M.C., Crciunesc, I., Curtu, A.L., 2011: Consideraii privind identificarea hibrizilor ntre speciile autohtone de cvercinee. Revista Pdurilor anul 126, Nr. 1: 6-11; 3. Crciunesc, I., ofletea, N., Curtu, A.L., 2013: Identification of hybrids between oak species. Proceedings of the Biennial International Symposium, Forest and Sustainable Development, Braov, Romania, 19-20th October 2012: 51-56; C. Lucrri prezentate la simpozioane i conferine naionale sau internaionale: 1. Crciunesc, I., Curtu, A.L., ofletea, N., (prezentare): Structura fenologic de primvar n complexul de cvercinee Bejan-Deva i implicaiile acesteia n producerea hibridrilor interspecifice. Simpozionul: Stadiul actual i perspective n dezvoltarea dendrologiei, Academia de tiine Agricole i Silvice Gheorghe Ionescuieti, Secia de Silvicultur, Bucureti, 13 septembrie 2012; 2. Crciunesc, I., Enescu, M.C., ofletea, N., Curtu, A.L., (poster): Floral phenology in a mixed species, natural oak forest of Romania. Conferina IUFRO Genetics of Fagaceae and Nothofagaceae, Bordeaux (Frana), 9-12 octombrie 2012; 3. Crciunesc, I., ofletea, N., Curtu, A.L., (prezentare): Identification of hybrids between oak species. Conferina Biennial International Symposium Forest and Sustainable Development, Braov, 15-16 octombrie 2012; 5.4. Direcii viitoare de cercetare Pentru a analiza existena unei posibile selecii mpotriva sau n favoarea exemplarelor hibride aprut ntre stadiul de ghind i cel de plantul este nevoie de evaluarea procentului hibrizilor pe eantioane de puiei stabilii sub coroana arborilor-mam la care s-au realizat analize de paternitate. Totodat, ar fi util testarea comportrii descendenilor hibrizi n cultur/culturi instalate n condiii de mediu uniforme. ntruct n viitorul apropiat datele privind genomul cvercineelor vor deveni tot mai accesibile, se va putea realiza o amprentare genetic cu ajutorul locilor funcionali pentru a evalua diferenierea speciilor i a populaiilor intraspecifice, dar i pentru identificarea genelor implicate n izolarea reproductiv dintre specii. n acest mod se pot identifica trsturile importante pentru anumite adaptri la condiiile de mediu locale.

68

BIBLIOGRAFIE

1.

2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

12. 13.

14. 15.

16.

17. 18.

Aitken, S.N., Yeaman, S., Holliday, J.A., Wang, T.L., Curtis-McLane, S., 2008: Adaptation, migration or extirpation: climate change outcomes for tree populations. Evol. Appl.1: 95111; Alberto, F., Niort, J., Derory, J., Lepais, O., Vitalis, R., Galop, D., Kremer, A., 2010: Population differentiation of sessile oak at the altitudinal front of migration in the French Pyrenees. Molecular Ecology 19: 26262639; Aldrich, P.R., Michler, C.H., Sun, W., Romero-Severson, J., 2002: Microsatellite markers for northern red oak (Fagaceae: Quercus rubra). Molecular Ecology Notes 2: 472-474; Aldrich, P. R., Jagtap, M., Michler, C.H., Romero-Severson, J., 2003: Amplification of North American Red Oak Microsatellite Markers. Silvae Genetica 52 (3-4): 176-179; Anderson , E., 1949: Hybridization of the habitat. Evolution 2: 1 9; Arnold, M.L., 1997: Natural hybridization and evolution. Oxford University Press, Oxford; Ashley, M.V., 2010: Plant Parentage, Pollination, and Dispersal: How DNA microsatellites have altered the landscape. Critical Reviews in Plant 29(3): 148-161; Axelrod, D. I., 1983: Biogeography of oaks in the Arcto-Tertiary province. Ann. Missouri Bot. Gard. 70: 629657; Bacilieri, R., Roussel, G., Ducousso, A., 1993: Hybridization and mating system in a mixed stand of sessile and pedunculate oak. Ann. Sci. For. 50: 122127; Bacilieri, R., Labbe, T., Kremer, A., 1994: Intraspecific genetic structure in a mixed population of Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Q. robur L. Heredity 73 (2): 130-141; Bacilieri, R., Ducousso, A., Kremer, A., 1995: Genetic, morphological, ecological and phenological differentiation between Quercus petrea (Matt.) Liebl. And Quercus robur L. in a mixed stand of Nortwest of France. Silvae Genetica, vol.44, nr.1: 1-10; Bacilieri, R., Ducousso, A., Petit, R. J., Kremer, A., 1996a: Mating system and asymmetric hybridization in a mixed stand of European oaks. Evolution 50: 900908; Bacilieri, R., Ducousso, A., Kremer, A., 1996b: Comparison of morphological characters and molecular markers for the analysis of hybridization in sessile and pedunculate oak. Annals of Forest Science, nr.53: 79-91; Bakker, E. G., 2001: Towards molecular tools for management of oak forests. Tez de doctorat. Alterra,Wageningen, Olanda; Barreneche, T., Bodenes, C.,Lexer, C.,Trontin, J.-F., Fluch, S., Streiff, R., Plomion, C., Roussel, G., Steinkellner, H., Burg, K., Favre, J.-M., Glssl, J., Kremer, A., 1998: A genetic linkage map of Quercus robur L. (pedunculate oak) based on RAPD, SCAR, microsatellite, minisatellite, isozyme and 5S rDNA markers. Theoretical and Applied Genetics 97: 1090-1103; Barreneche, T., Casasoli, M., Russell, K., Akkak, A., Meddour, H., Plomion, C., Villani, F., Kremer, A., 2004: Comparative mapping between Quercus and Castanea using simplesequence repeats (SSRs). Theoretical and Applied Genetics 108: 558566; Blnic, T., Tomescu, A., 1953: Dare de seam asupra observaiilor fenologice forestiere efectuate n anul 1949. Analele ICAS 13 (1): 71-80; Bird, C.E., Karl, S.A., Smouse, P.E., Toonen, R.J., 2011: Detecting and measuring genetic differentiation. In: Phylogeography and Population Genetics in Crustacea, pag. 31-55. CRC Press;

69

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25. 26.

27.

28.

29.

30. 31. 32.

33.

34. 35.

Bodns, C., Joandet, S., Laigret, F., Kremer, A., 1997: Detection of genomic regions differentiating two closely related oak species Quercus petraea (Matt.) Liebi. and Quercus robur L. Heredity 78: 433444; Bodns, C., Chancerel, E., Gailing, O., Vendramin, G.G., Bagnoli, F., Durand, J., Goicoechea, P.G., Soliani, C., Villani, F., Mattioni, C., Koelewijn, H.P., Murat, F., Salse, J., Roussel, G., Boury, C., Alberto, F., Kremer, A., Plomion, C., 2012: Comparative mapping in the Fagaceae and beyond with EST-SSRs. BMC Plant Biology 12: 153; Brewer, S., Cheddadi, R., Beaulieu, J.L., Reille, M., 2002: The spread of deciduous Quercus throughout Europe since the last glacial period. Forest Ecology and Management 156: 27-48; Bruschi, P., Vendramin, G.G., Bussotti, F., Grossoni, P., 2000: Morphological and molecular differentiation between Quercus petraea (Matt.) Liebl. And Quercus pubescens Willd. (Fagaceae) in Northern and Central Italy. Annals of Botany 85: 325-333; Buiteveld, J., Bakker, E.G., Bovenschenl, J., de Vries, S.M.G., 2001: Paternity analysis in a seed orchard of Quercus robur L. and estimation of the amount of background pollination using microsatellite markers. Forest Genetics 8(4): 331-337; Burgarella, C., Lorenzo, Z., Jabbour-Zahab, R., Lumaret, R., Guichoux, E., Petit, R.J., Soto, A., Gil, L., 2009: Detection of hybrids in nature: application to oaks (Quercus suber and Q. ilex). Heredity 102: 442-452; Burger, W.C., 1975: The species concept in Quercus. Taxon 24: 45-50; Chesnoiu, E.N., ofletea, N., Curtu, A.L., Toader, A., Radu, R., Enescu, M., 2009: Bud burst and flowering phenology in a mixed oak forest from Eastern Romania. Annals of Forest Research 52: 199- 206; Chybicki, I.J., Burczyk, J., 2010: Realized gene flow within mixed stands of Quercus robur L. and Q. petraea (Matt.) L. revealed at the stage of naturally established seedling. Molecular Ecology 19: 21372151; Chybicki, I.J., Burczyk, J., 2013: Seeing the forest through the trees: comprehensive inference on individual mating patterns in a mixed stand of Quercus robur and Q. petraea. Annals of Botany, acces online de la www.aob.oxfordjournals.org; Coart, E., Lamote, V., De Loose, M., Van Bockstaele, E., Lootens, P., Roldn-Ruiz, I., 2002: AFLP markers demonstrate local genetic differentiation between two indigenous oak species [Quercus robur L. and Quercus petraea (Matt.) Liebl.] in Flemish populations . Theor. Appl. Genet. 105: 431439; Cockerham, C.C., 1969: Variance of gene frequencies. Evolution 23: 7284; Cockerham, C.C., 1973: Analyses of gene frequencies. Genetics 74: 679700; Coelho, A. C., Lima, M. B., Neves, D., Cravador, A., 2006: Genetic diversity of two evergreen oaks [Quercus suber (L.) and Quercus ilex subsp rotundifolia (Lam.)] in Portugal using AFLP markers. Silvae Genetica 55 (3): 105-118; Conte, L., Cotti, C., Cristofolini, G., 2007: Molecular evidence for hybrid origin of Quercus crenata Lam. (Fagaceae) from Q-cerris L. and Q-suber L. Plant Biosystems 141 (2): 181-193; Coyne , J. A., 1994: Ernst Mayr and the origin of species. Evolution 48: 19 30; Craft, K.J., Ashley, M.V., Koenig, W.D., 2002: Limited hybridization between Quercus lobata and Quercus douglasii (Fagaceae) in a mixed stand in central coastal California . American Journal of Botany 89 (11): 17921798;

70

36.

37.

38. 39.

40.

41.

42.

43. 44. 45. 46. 47.

48. 49. 50.

51.

52.

Crciunesc, I., Ciocrlan, E., ofletea, N., Curtu, A.L., 2011: Genetic diversity of pedunculate oak (Quercus robur L.) in Prejmer Natural Reserve. Bulletin of the Transilvania University of Braov, Seria a II-a, Vol. 4 (53), Nr. 1: 15-20; Crciunesc, I., ofletea, N., Curtu., A.L., 2013: Identification of hybrids between oak species. Proceedings of the Biennial International Symposium, Forest and Sustainable Development, Braov, Romania, 19-20th October 2012: 51-56; Curtu, A. L., 2006: Patterns of genetic variation and hybridization in a mixed oak (Quercus spp.) forest. Cuvillier Verlag, Gttingen, Germania, 159 p; Curtu, A.L., Gailing, O., Leinemann, L., Finkeldey, R., 2007a: Genetic variation and differentiation within a natural community of five oak species (Quercus spp.). Plant Biology 9: 116126; Curtu, A.L., Gailing, O., Finkeldey, R., 2007b: Evidence for hybridization and introgression within a species-rich oak (Quercus spp.) community. BMC Evolutionary Biology 7: 218; Curtu, A.L., Gailing, O., Finkeldey, R., 2009: Patterns of contemporary hybridization inferred from paternity analysis in a four-oak-species forest. BMC Evolutionary Biology, vol.9: 284, disponibil online la http://www.biomedcentral.com/1471-2148/9/284; Curtu, A.L., Moldovan, I.C., Enescu, C.M., Crciunesc, I., ofletea, N., 2011: Genetic Differentiation between Quercus frainetto Ten. and Q. pubescens Willd. in Romania. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 39 (1): 275-282; Davis, M.B., Shaw, R.G., 2001: Range shifts and adaptive responses to Quaternary climate change.Science292: 673679; DEmerico, S., Bianco, P., Medagli, P., Schirone, B., 1995: Karyotype analysis in Quercus ssp. (Fagaceae). Silvae Genet 44:6670; Denk, T., Grimm, G.W., 2010: The oaks of western Eurasia: Traditional classifications and evidence from two nuclear markers. Taxon 59: 351366; Dodd, R.S., Kashani, N. 2003: Molecular differentiation and diversity among the California red oaks section Lobatae. Theoretical and Applied Genetics 107: 884-892; Dow, B.D., Ashley, M.V., Howe, H.F., 1995: Characterization of highly variable (GA/CT)n microsatellites in the bur oak, Ouercus macrocarpa. Theor. Appl. Genet. 91: 137-141; Dow, B. D., Ashley, M. V., 1998: High levels of gene flow in bur oak revealed by paternity analysis using microsatellites. Journal of Heredity 89: 6270; Dumitriu Ttranu, I., 1960: Arbori i arbuti forestieri i ornamentali cultivai n R.P.R. Editura Agro-Silvic, Bucureti, 810 p; Dumolin, S., Demesure, B., Petit, R.J., 1995: Dumolin, S., Demesure, B., Petit, R.J., 1995: Inheritance of chloroplast and mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR method. Theor. Appl. Genet. 91: 12531256; Dumolin-Lapgue, S., Demesure, B., Fineschi, S., Le Corre, V., Petit, R.J., 1997: Phylogeographic Structure of White Oaks Throughout the European Continent. Genetics 146: 1475-1487; Durand, J., Bodns, C., Chancerel, E., Frigerio, J.M., Vendramin, G., Sebastiani, F., Buonamici, A., Gailing, O., Koelewijn, H.-P., Villani, F., Mattioni, C., Cherubini, M., Goicoechea, P.G., Herrn, A., Ikaran, Z., Caban, C., Ueno, S., Alberto, F., Dumoulin, P. Y., Guichoux, E., de Daruvar, A., Kremer, A., Plomion, C., 2010: A fast and cost-effective approach to develop and map EST-SSR markers: oak as a case study. BMC Genomics 11: 570, disponibil online la www.biomedcentral.com/1471-2164/11/570;

71

53. 54.

55.

56.

57. 58.

59.

60.

61. 62. 63.

64.

65.

66. 67.

68.

Dzialuk, A., Chybicki, I., Welc, M., Sliwinska, E., Burczyk, J., 2007: Presence of Triploids among Oak Species. Annals of Botany 99: 959964; Earl, D. A., vonHoldt, B. M., 2012: STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources vol. 4 (2): 359-361; El Mousadik, A., Petit R.J., 1996: High level of genetic dierentiation for allelic richness among populations of the argan tree [Argania spinosa (L.) Skeels] endemic to Morocco. Theor. Appl. Genet. 92: 832839; Enescu, C.M., 2012: Evaluri morfologice i genetice n populaii autohtone de cvercinee din secia Dascia, seria Lanuginosae. Tez de doctorat, Universitatea Transilvania din Braov; Evanno, G., Regnaut, S., Goudet, J., 2005: Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14: 2611-2620; Excoffier, L., Smouse, P.E., Quattro, J.M., 1992: Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479491; Faivre Rampant, P., Lesur, I., Boussardon, C., Bitton, F., Bodns, C., Le Provost, G., Bergs, H., Fluch, S., Kremer, A., Plomion, C., 2011: Analysis of BAC end sequences in oak, providing insights into the composition of the genome of this keystone species. BMC Genomics 12: 292; Fernndez, J.F., Sork, V.L., Gallego, G., Lopez, J., Bohorques, A., Tohme, J., 2000: Crossamplification of microsatellite loci in a neotropical Quercus species and standardization of DNA extraction from mature leaves dried in silica gel. Plant Molecular Biology Reporter 18: 397a-397e; Fernndez, J.F., Sork, V.L., 2007: Genetic variation in fragmented forest stands of the andean oak Quercus humboldtii Bonpl. (Fagaceae). Biotropica 39(1): 72-78; Ferris, C., Oliver, R.P., Davy, A.J., Hewitt, G.M., 1993: Native oak chloroplasts reveal an ancient divide across Europe. Molecular Ecology 2: 337344; Fortini, P., Viscosi, V., Maiuro, L., Fineschi, S., Vendramin, G.G., 2009: Comparative leaf surface morphology and molecular data of five oaks of the subgenus Quercus Oerst (Fagaceae). Plant Biosystems 143, Nr. 3: 543-554; Franji, J., Liber, Z., kvorc, ., Idojti, M., otari, R., Stani, Z., 2006: Morphological and molecular differentiation of the Croatian populations of Quercus pubescens Willd. (Fagaceae). Acta Societatis Botanicorum Poloniae 75 (2): 123 130; Franjic, J., Sever, K., Bogdan, S., Skvorc, Z, Krstonosic, D., 2011: Phenological asynchronization as a restrictive factor of efficient pollination in clonal seed orchads of pedunculate oak (Quercus robur L.). Croatian Journal of Forest Engineering 32 (1): 141156; Georgescu, C.C., Moraru, I., 1948: Monografia stejarilor din Romnia. Editura Universul, Bucureti, 36 p; Gerber, S., Mariette, S., Streiff, R., Bodns, C., Kremer, A., 2000: Comparison of microsatellites and amplified fragment length polymorphism markers for parentage analysis. Molecular Ecology 9: 10371048; Gmry, D., Schmidtova, J., 2007: Extent of nuclear genome sharing among white oak species (Quercus L. subgen. Lepidobalanus (Endl.) Oerst.) in Slovakia estimated by allozymes. Pl. Syst. Evol. 266: 253264;

72

69.

70. 71. 72.

73. 74. 75.

76.

77.

78. 79. 80. 81.

82. 83.

84.

85.

Gonzlez-Rodrguez, A., Arias, D.M., Valencia, S., Oyama, K., 2004: Morphological and RAPD analysis of hybridization between Quercus affinis and Q. laurina (Fagaceae), two mexican red oaks. American Journal of Botany 91(3): 401409; Goudet, J., 2002: FSTAT: a program to estimate and test gene diversities and fixation indices. Version 2.9.3.2. Disponibil la: http://unil.ch/izea/softwares/fstat.html; Govaerts, R., Frodin, D., 1998: World checklist and bibliography of Fagales (Betulaceae, Corylaceae, Fagaceae and Ticodendraceae). Kew, Royal Botanic Gardens; Guichoux, E., Lagache, L., Wagner, S., Leger, P., Petit, R.J., 2011: Two highly validated multiplexes (12-plex and 8-plex) for species delimitation and parentage analysis in oaks (Quercus spp.). Molecular Ecology Resources 11: 578-585; Hedrick, P.W., 1999: Highly variable loci and their interpretation in evolution and conservation. Evolution 53: 313318; Hedrick, P.W., 2005: A standardized genetic differentiation measure. Evolution 59: 1633 1638; Howard, D.J., Preszler, R.W.,Williams, J., Fenchel, Boecklen, S., 1997: How discrete are oak species? Insights from a hybrid zone between Quercus grisea and Quercus gambelii. Evolution 51: 747755; Isagi, Y., Suhandono, S., 1997: PCR primers amplifying microsatellite loci of Quercus myrsinifolia Blume and their conservation between oak species. Molecular Ecology 6: 897899; Ishida, T.A., Hattori, K., Sato, H., Kimura, M.T., 2003: Differentiation and hybridization between Quercus crispula and Q. dentata (Fagaceae): insights from morphological traits, amplified fragment length polymorphism markers, and leafminer composition. American Journal of Botany 90(5): 769776; Jensen, J., Larsen, A., Nielsen, L.R., Cottrell, J., 2009: Hybridization between Quercus robur and Q. petraea in a mixed oak stand in Denmark. Ann For Sci 66: 706717; Johnson, P.S., Shifley, S.R., Rogers, R., 2009: The Ecology and Silviculture of Oaks, 2nd Edition. MPG Books Group, Bodmin, UK; Jost, L., 2008: GST and its relatives do not measure differentiation. Molecular Ecology 17: 40154026; Kalinowski, S.T., Taper, M.L., Marshall, T.C., 2007: Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology 16: 1099-1006; Kampfer, S., Lexer, C., Glossl, J., Steinkellner, H., 1998: Characterization of (GA)n microsatellite loci from Quercus robur. Hereditas 129: 183-186; Kelleher, C.T., Hodkinson, T.R., Douglas, G.C., Kelly, D.L., 2005: Species Distinction in Irish Populations of Quercus petraea and Q. robur: Morphological versus Molecular Analyses. Annals of Botany 96: 12371246; Kremer, A., Casasoli, M., Barreneche, T., Bodns, C., Sisco, P., Kubisiak, T., Scalfi, M., Leonardi, S., Bakker, E., Buiteveld, J., Romero-Severson, J., Arumuganathan, K., Derory, J., Scotti-Saintagne, C., Roussel, G., Bertocchi, M.E., Lexer, C., Porth, I., Hebard, F., Clark, C., Carlson, J., Plomion, C., Koelewijn, H.-P., Villani, F., 2007: Fagaceae Trees. n: Kole C. (ed) Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants, Vol 7, Forest Trees. Springer, Berlin: 161-187; Lepais, O., 2008: Dynamique d'hybridation dans le complexe d'espces des chnes blancs europens. LUniversit Bordeaux 1, Frana;

73

86.

Lepais, O., Leger, V., Gerber, S., 2006: Short Note: High Throughput Microsatellite Genotyping in Oak Species. Silvae Genetica 55 (4-5): 238-240; 87. Lepais, O., Petit, R.J., Guichoux, E., Lavabre, J.E., Alberto, F., Kremer, A., Gerber, S., 2009: Species relative abundance and direction of introgression in oaks. Molecular Ecology 18: 22282242; 88. Lepais, O., Gerber, S., 2011: Reproductive patterns shape introgression dynamics and species succession within the European white oak species complex. Evolution, Vol. 65, issue 1: 156-170; 89. Lesur, I., Durand, J., Sebastiani, F., Gyllenstrand, N., Bodns, C., Lascoux, M., Kremer, A., Vendramin, G.G., Plomion, C., 2011: A sample view of the pedunculate oak (Quercus robur) genome from the sequencing of hypomethylated and random genomic libraries. Tree Genetics & Genomes 7: 12771285; 90. Lexer, C., Kremer, A., Petit, R.J., 2006: Shared alleles in sympatric oaks: recurrent gene flow is a more parsimonious explanation than ancestral polymorphism. Molecular Ecology 15: 20072012; 91. Lexer, C., Widmer, A., 2008: The genic view of plant speciation: recent progress and emerging questions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 363: 3023-3036; 92. Lind, J.F., Gailing, O., 2013: Genetic structure of Quercus rubra L. and Quercus ellipsoidalis E. J. Hill populations at gene-based EST-SSR and nuclear SSR markers. Tree Genetics & Genomes 9: 707722; 93. Lopez-Aljorna, A., Bueno, M. A., Aguinagalde, I., Martin, J. P., 2007: Fingerprinting and genetic variability in cork oak (Quercus suber L.) elite trees using ISSR and SSR markers. Ann. For. Sci. 64: 773779; 94. Lumaret, R., Jabbour-Zahab, R., 2009: Ancient and current gene flow between two distantly related Mediterranean oak species, Quercus suber and Q. ilex. Annals of Botany 104: 725736; 95. Mallet, J., 2005: Hybridization as an invasion of the genome. Trends in Ecology and Evolution Vol.20, Nr. 5: 229-237; 96. Manos, P.S., Doyle, J.J., Nixon, K.C., 1999: Phylogeny, Biogeography, and Processes of Molecular Differentiation in Quercus Subgenus Quercus (Fagaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, Vol. 12, Nr. 3: 333349; 97. Manos, P.S., Stanford, A.M., 2001: The historical biogeography of Fagaceae: Tracking the tertiary history of temperate and subtropical forests of the Northern Hemisphere. Int. J. Pl. Sci. 162: S77S93; 98. Mariette, S., Cottrell, J., Csaikl, U.M., Goikoechea, P., Knig, A., Lowe, A.J., Van Dam, B.C., Barreneche, T., Bodns, C., Streiff, R., Burg, K., Groppe, K., Munro, R.C., Tabbener, H., Kremer, A., 2002: Comparison of Levels of Genetic Diversity Detected with AFLP and Microsatellite Markers within and among Mixed Q. petraea (MATT.) LIEBL. and Q. robur L. Stands. Silvae Genetica 51, 23: 72-79; 99. Matsumoto, A., Kawahara, T., Kanazashi, A., Yoshimaru, H., Takahashi, M., Tsumura, Y., 2009: Differentiation of three closely related Japanese oak species and detection of interspecific hybrids using AFLP markers. Botany 87, Nr. 2: 145-153; 100. Menitsky, Y. L., 2005: Oaks of Asia. Science Publishers; 101. Mir, C., Jarne, P., Sarda, V., Bonin, A., Lumaret, R., 2009: Contrasting nuclear and cytoplasmic exchanges between phylogenetically distant oak species (Quercus suber L.

74

102.

103. 104. 105.

106. 107. 108.

109. 110. 111.

112.

113.

114.

115. 116. 117. 118.

and Q. ilex L.) in Southern France: inferring crosses and dynamics. Plant Biology 11: 213226; Moldovan, I.C., 2011: Evaluarea variabilitii genetice a stejarului pedunculat (Quercus robur L.) i a gorunului [Quercus petraea (Matt.) Liebl.] n populaii din estul Romniei cu ajutorul markerilor ADN. Tez de doctorat, Universitatea Transilvania din Braov. Moran, E.V., Willis, J., Clark, J.S., 2012: Genetic evidence for hybridization in red oaks (Quercus sect. Lobatae , Fagaceae). American Journal of Botany 99(1): 92100; Muir, G., Fleming, C.C., Schltterer, C., 2000: Species status of hybridizing oaks. Nature 405: 10161016; Muir, G., Schltterer, C., 2005: Evidence for shared ancestral polymorphism rather than recurrent gene flow at microsatellite loci differentiating two hybridizing oaks (Quercus spp.). Molecular Ecology 14: 549561; Muller, C. H., 1952: Ecological control of hybridization in Quercus: A factor in the mechanism of evolution. Evolution 6: 147161; Mullis, K. B., Faloona, F. A., 1987: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155: 335; Nakanishi, A., Tomaru, N., Yoshimaru, H., Manabe, T., Yamamoto, S., 2005: Interannual genetic heterogeneity of pollen pools accepted by Quercus salicina individuals. Molecular Ecology 14: 4469-4478; Nei, M., 1973: Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 33213323; Nei, M., 1987: Molecular Evolutionary Genetics. New York, Columbia University Press; Neophytou, C., Aravanopoulos, F.A., Fink, S., Dounavi, A., 2010: Detecting interspecific and geographic differentation patterns in two interfertile oak species (Quercus petraea (Matt.) Liebl. And Q. robur L.) using small set of microsatellite markers. Forest Ecology and Management 259: 20262035; Neophytou, C., Dounavi, A., Fink, S., Aravanopoulos, F.A., 2011a: Interfertile oaks in an island environment. I. High nuclear genetic differentiation and high degree of chloroplast DNA sharing between Q. alnifolia and Q. coccifera in Cyprus. A multipopulation study. European Journal of Forest Research 130: 543555; Neophytou, C., Aravanopoulos, F.A., Fink, S., Dounavi, A., 2011b: Interfertile oaks in an island environment. II. Limited hybridization between Quercus alnifolia Poech and Q. coccifera L. in a mixed stand. European Journal of Forest Research 130:623635; Nielsen, E.E., Bach, L.A., Kotlicki, P., 2006: HYBRIDLAB (version 1.0): a program for generating simulated hybrids from population samples. Molecular Ecology Notes 6: 971 973; Nyarady, E.I., et al., 1952: Flora Republicii Populare Romne Vol. I. (red. T. Svulescu). Editura Academiei Republicii Populare Romne, pag. 224-256; Olrik, D.C., Kjaer, E.D., 2007: The reproductive success of a Quercus petraea Q. robur F1-hybrid in back-crossing situations. Ann. For. Sci. 64: 3745; Ortego, J., Bonal, R., 2010: Natural hybridisation between kermes (Quercus coccifera L.) and holm oaks (Q. ilex L.) revealed by microsatellite markers. Plant Biology 12: 234238; Pakkad, G., Ueno, S., Yoshimaru, H., 2008: Genetic diversity and differentiation of Quercus semiserrata Roxb. in northern Thailand revealed by nuclear and chloroplast microsatellite markers. Forest Ecology and Management 255: 10671077;

75

119. Pealoza-Ramrez, J.M., Gonzlez-Rodrguez, A., Mendoza-Cuenca, L., Caron, H., Kremer, A., Oyama, K., 2010: Interspecific gene flow in a multispecies oak hybrid zone in the Sierra Tarahumara of Mexico. Ann. Bot. 105: 389399; 120. Peakall, R., Smouse, P.E., 2006: GenALEx 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6 (1): 288-295; 121. Peakall, R., Smouse, P.E., 2012: GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. Bioinformatics 28: 2537-2539; 122. Petit, R.J., Kremer, A., Wagner, D.B., 1993: Geographic structure of chloroplast DNA polymorphisms in European oaks. Theor. Appl. Genet. 87: 122128; 123. Petit, R. J., Pineau, E., Demesure, B., Bacilieri, R., Ducousso, A., Kremer, A., 1997: Chloroplast DNA footprints of postglacial recolonization by oaks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 999610001; 124. Petit, R.J., El Mousadik, A., Pons, O., 1998: Identifying populations for conservation on the basis of genetic markers. Conserv. Biol. 12: 844-855; 125. Petit, R.J., Csaikl, U., Bordacs, S., Burg, K., Coart, E., Cottrell, J., van Dam, B., Deans, D., Dumolin-Lapegue, S., Fineschi, S., Finkeldey, R., Gillies, A., Glaz, I., Goicoechea, P. G., Jensen, J. S., Konig, A. O., Lowe, A. J., Madsen, S. F., Matyas, G., Munro, R. C., Olalde, M., Pemonge, M.-H., Popescu, F., Slade, D., Tabbener, H., Taurchini, D., de Vries, S. G. M., Ziegenhagen, B., and Kremer, A., 2002a: Chloroplast DNA variation in European white oaks. Phylogeography and patterns of diversity based on data from over 2600 populations. Forest Ecology and Management 156, 526; 126. Petit, R.J., Brewer, S., Bordcs, S., Burg, K., Cheddadi, R., Coart, E., Cottrell, J., Csaikl, U. M., Van Dam, B., Deans, D. J., Espinel, S., Fineschi, S., Finkeldey, R., Glaz, I., Goicoechea, P. G., Jensen, J. S., Knig, A. O., Lowe, A. J., Madsen, S. F., Mtys, G., Munro, R. C., Popescu, F., Slade, D., Tabbener, H., De Vries, S. G. M., Ziegenhagen, B., De Beaulieu, J. L., Kremer, A., 2002b: Identification of refugia and post-glacial colonisation routes of European white oaks based on chloroplast DNA and fossil pollen evidence. Forest Ecology and Management, 156: 4974. 127. Petit, R. J., Bodenes, C., Ducousso, A., Roussel, G., Kremer, A., 2004: Hybridization as a mechanism of invasion in oaks. New Phytologist 161:151164; 128. Pluess, A.R., Sork, V.L., Dolan, B., Davis, F.W., Grivet, D., Merg, K., Papp, J., Smouse, P.E., 2009: Short distance pollen movement in a wind-pollinated tree, Quercus lobata (Fagaceae). Forest Ecology and Management 258:735744; 129. Pospkov, M., Dostlek, J., 2009: Impact of forest management on genetic diversity of Quercus petraea populations: a case study from the Krivoklatsko Protected Landscape Area (Czech Republic). Biodiversity, Research and Conservation 13: 37-42; 130. Preuhsler, T., 1999: Manual on methods and criteria for harmonized sampling, assessment, monitoring and analysis of the effects of air pollution on forests. Part IX. Phenological observations. UNECE, 35 p; 131. Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P., 2000: Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155: 945959; 132. Raymond, M., Rousset, F., 1995: GENEPOP Version 1.2: population genetics software for exact tests and ecumenicism. J. Hered. 86: 248-249; 133. Rdulescu 1938: Observaiuni fenologice la speciile lemnoase din Bucureti, fcute n sezonul de vegetaie 1937. Analele ICAS, Vol. 4, Nr.1: 231-247;

76

134. Rieseberg, L., Wendel, J., 1993: Introgression and its consequences in plants. In R. Harrison [ed.], Hybrid zones and the evolutionary process, 70 109. Oxford University Press, New York, USA; 135. Rieseberg, L. H., Carney, S. E., 1998: Plant hybridization. New Phytologist 140: 599 624; 136. Rieseberg, L.H., Church, S.A., Morjan, C.L., 2004: Integration of populations and differentiation of species. New Phytologist 161: 5969; 137. Romero-Severson, J., Aldrich, P., Mapes, E., Sun, W., 2003: Genetic mapping in northern red oak (Quercus rubra L.). Plant & Animal XI Genome Conf., San Diego; 138. Rousset, F., 2008: Genepop'007: a complete reimplementation of the Genepop software for Windows and Linux. Molecular Ecology Resources 8: 103-106; 139. Rushton, B.S., 1993: Natural hybridization within the genus Quercus L. Annals of Forest Science, nr. 50: 73 -90; 140. Salvini, D., Bruschi, P., Fineschi, S., Grossoni, P., Kjr, E.D., Vendramin, G. G., 2009: Natural hybridisation between Quercus petraea (Matt.)Liebl. and Quercus pubescens Willd. within an Italian standas revealed by microsatellite fingerprinting. Plant Biology 11: 758765; 141. Samuel, R., 1999: Identification of hybrids between Quercus petraea and Q. robur (Fagaceae): results obtained with RAPD markers confirm allozyme studies based on the Got-2 locus. Pl. Syst. Evol. 217: 137-146; 142. Sanda, V., Baraba, N., tefnu, S., 2004: Atlas Florae Romaniae III Genus Quercus. Editura Ion Borcea, Bacu, 174 p; 143. Schuelke, M., 2000: An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnol. 18(2): 233-234; 144. Schwarz, O., 1937: Monographie der Eichen Europas und des Mittelmeergebietes I. Textband. Dahlem, Berlin; 145. Scotti-Saintagne, C., Mariette, S., Porth, I., Goicoechea, P.G., Barreneche, T., Bodns, C., Burg, K., Kremer, A., 2004a: Genome scanning for interspecific differentiation between two closely related oak species [Quercus robur L. and Q. petraea (Matt.) Liebl.] . Genetics 168: 16151626; 146. Scotti-Saintagne, C., Bodns, C., Barreneche, T., Bertocchi, E., Plomion, C., Kremer, A., 2004b: Detection of quantitative trait loci controlling bud burst and height growth in Quercus robur L. Theor Appl Genet 109: 16481659; 147. Sharp, W.M., Chisman, H.H., 1961: Flowering and fruiting in the white oaks. I. Staminate flowering through pollen dispersal. Ecology 42: 365-372; 148. Sharp, W.M., Sprague, V.G., 1967: Flowering and fruiting in the white oaks. Pistillate flowering, acorn development, weather and yields. Ecology 48(2): 243-251; 149. Stanciu, A., 1997: Cercetri taxonomice, morfologice i ecologice privind hibrizii genului Quercus din rezervaia tiinific Bejan-Deva, judeul Hunedoara. Tez de doctorat, Universitatea Transilvania din Braov, 140p; 150. Stnescu, V., ofletea, N., Stanciu, A., 1991: Oak tree hybrids in the Bejan forest Deva. Reactualization and genetic prospections. Bulletin of the Agricultural and Forestry Science 21: 217225; 151. Stnescu, V., ofletea, N., Popescu, O., 1997: Flora forestier lemnoas a Romniei. Editura Ceres, Bucureti, 451 p; 152. Stebbins, G.L., 1950: Variation and evolution in plants. Columbia University Press, New York, USA;

77

153. Steinhoff, S., 1993: Results of species hybridization with Quercus robur L and Quercus petraea (Matt) Liebl. Ann. Sci. For. 50: 137143; 154. Steinkellner, H., Fluch, S., Turetschek, E., Lexer, C., Streiff, R., Kremer, A., Burg, K., Glssl, J., 1997a: Identification and characterization of (GA/CT)n- microsatellite loci from Quercus petraea. Plant Molecular Biology 33: 10931096; 155. Steinkellner, H., Lexer, C., Turetschek, E., Glssl, J., 1997b: Conservation of (GA)n microsatellite loci between Quercus species. Molecular Ecology 6: 1189-1194; 156. Streiff, R., Labbe, T., Bacilieri, R., Steinkellner, H., Glssl, J., Kremer, A., 1998: Withinpopulation genetic structure in Quercus robur L. and Quercus petraea (Matt.) Liebl. assessed with isozymes and microsatellites. Molecular Ecology 7: 317328; 157. Streiff, R., Ducousso, A., Lexer, C., Steinkellner, H., Gloessl, J., Kremer, A., 1999: Pollen dispersal inferred from paternity analysis in a mixed oak stand of Quercus robur L. and Q. petraea (Matt.) Liebl. Molecular Ecology 8: 831-841; 158. ofletea, N., Curtu, L., 2007: Dendrologie. Editura Universitii Transilvania, Braov, 472p; 159. ofletea, N., Moldovan, I.C., Enescu, M.C., Crciunesc, I., Curtu, A.L., 2011: Consideraii privind identificarea hibrizilor ntre speciile autohtone de cvercinee. Revista Pdurilor anul 126, Nr. 1: 6-11; 160. Teodosiu, M., Mateescu, E., 2005: Fenologia dezvoltare i perspective. O sintez. Bucovina Forestier 12 (1-2): 47-68; 161. Teodosiu, M., Guiman, G., Bujil, M., Fril, E., Coand, C., Hru, O., Dorog, S., 2005: Observaii fenologice la specii forestiere n sezonul de vegetaie 2004. Analele ICAS 48 (1): 73-83; 162. Tomescu, A., Florescu I.I., Mihalache, A., trimbei, M., Avramescu, C., 1967: Cercetri fenologice la principalele specii forestiere autohtone din RSR Sinteza pentru perioada 1956-1965. Centrul de documentare tehnic pentru economia forestier, Bucureti, 221 p; 163. Tovar-Snchez, E., Oyama, K., 2004: Natural hybridization and hybrid zones between Quercus crassifolia and Quercus crassipes (Fagaceae) in Mexico: morphological and molecular evidence. American Journal of Botany 91(9): 13521363; 164. Ueno, S., Tsamura, Y., 2008: Development of ten microsatellite markers for Quercus mongolica var. crispula by database mining. Conserv. Genet. 9: 10831085; 165. Vh, J.-P., Primmer, C.R., 2006: Efficiency of model-based Bayesian methods for detecting hybrid individuals under different hybridization scenarios and with different numbers of loci. Molecular Ecology 15: 6372; 166. Valbuena-Carabana, M., Gonzalez-Martinez, S.C., Sork, V.L., Collada, C., Soto, A., Goicoechea, P.G., Gil, L., 2005: Gene flow and hybridisation in a mixed oak forest (Quercus pyrenaica Willd. and Quercus petraea (Matt.) Liebl.) in central Spain. Heredity 95: 457-465; 167. Valbuena-Carabaa, M., Gonzalez-Martinez, S.C., Hardy, O.J., Gil, L., 2007: Fine-scale spatial genetic structure in mixed oak stands with different levels of hybridization. Molecular Ecology 16: 12071219; 168. Van Oosterhout, C., Hutchinson, W.F., Wills, D.P.M., Shipley, P., 2004: MICROCHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4(3): 535538; 169. Van Valen, L., 1976: Ecological species, multispecies, and oaks. Taxon 25: 233-239;

78

170. Vendramin, G.G., Hansen, O.H., 2005: Molecular markers for characterising diversity in forest trees. In: Conservation and management of forest genetic resources in Europe, pag. 337-368. Editura Arbora, Zvolen; 171. Viscosi, V., Antonecchia, G., Lepais, O, Fortini, P., Gerber, S., Loy, A., 2012: Leaf shape and size differentiation in white oaks: assessment of allometric relationships among three sympatric species and their hybrids. Int. J. Plant Sci. 173(8): 875884; 172. Vornam, B., Gailing, O., Derory, J., Plomion, C., Kremer, A., Finkeldey, R., 2011: Characterisation and natural variation of a dehydrin gene in Quercus petraea (Matt.) Liebl. Plant Biology 13: 881887; 173. Weir, B.S., Cockerham, C.C., 1984: Estimating Fstatistics for the analysis of population structure. Evolution 38: 13581370; 174. Williams, J.H., Boecklen, W., Howard, D.J., 2001: Reproductive processes in two oak (Quercus) contact zones with different levels of hybridization. Heredity 87: 680-690; 175. Whittemore, A.T., Schaal, B.A., 1991: Interspecific gene flow in sympatric oaks. Evolution Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 88: 2540-2544; 176. Wright, S., 1965: The interpretation of population structure by Fstatistics with special regard to systems of mating. Evolution 19: 395420; 177. Wu, C. I., 2001: The genic view of the process of speciation. J. Evol. Biol. 14: 851865; 178. Yucedag, C., Gailing, O., 2013: Morphological and genetic variation within and among four Quercus petraea and Q. robur natural populations. Turkish Journal of Botany 37; 179. Zane, L., Bargelloni, L., Patarnello, T., 2002: Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology 11: 1-16; 180. Zanetto, A., Kremer, A., 1995: Geographical structure of gene diversity in Quercus petraea (Matt.) Liebl. I. Monolocus patterns of variation. Heredity 75: 506517; 181. Zeng, Y.-F., Liao, W.-J., Petit, R.J., Zhang, D.-Y., 2010: Exploring Species Limits in Two Closely Related Chinese Oaks. Plos One 5(11): accesat online de la www.plosone.org; 182. Zeng, Y.-F., Liao, W.-J., Petit, R.J., Zhang, D.-Y., 2011: Geographic variation in the structure of oak hybrid zones provides insights into the dynamics of speciation. Molecular Ecology 20: 49955011; 183. Zhang, W., Korpelainen, H., Li, C., 2006: Microsatellite variation of Quercus aquifolioides populations at varying altitudes in the Wolong Natural Reserve of China. 184. Zhang, Y., Fang, Y.M., Yu, M.K., Li, X.X., Xia, T., 2013: Molecular characterization and genetic structure of Quercus acutissima germplasm in China using microsatellites. Mol Biol Rep 40: 40834090.

79

REZUMAT
Nivelul de hibridare natural ntr-un complex de patru specii de cvercinee a fost evaluat cu ajutorul unui set de 13 markeri moleculari. De asemenea, pentru investigarea barierelor fenologice n calea realizrii acestui fenomen, s-au efectuat observaii fenologice ale deschiderii mugurilor foliari i ale nfloririi care au indicat posibilitatea producerii hibridrilor interspecifice n rezervaia natural Bejan-Deva. Indicii de difereniere genetic a speciilor au scos n eviden cea mai ridicat difereniere ntre perechea de specii Quercus frainetto Q. robur, respectiv cea mai redus ntre speciile Q. frainetto i Q. pubescens. Analizele de alocare genetic pentru cei 492 de arbori eantionai n suprafaa de cercetare intensiv (8,5 ha) au indicat un procent ridicat al hibridrii (40,4%). Analizele de paternitate efectuate pentru 304 ghinde recoltate de la 18 arbori-mam au surprins o proporie de 46% a polenizrilor datorate unui numr de 80 de arbori situai n suprafaa de cercetare. Din totalul ncrucirilor identificate n interiorul suprafeei de cercetare, cele mai numeroase au fost cele intraspecifice (40%), urmate de retroncruciri (27%). O sintez comparativ ntre analizele de paternitate i observaiile fenologice a indicat c 62,2% din arborii participani la ncruciri sunt n aceeai categorie fenologic cu arborelemam. Arborii hibrizi s-au dovedit fertili i au indicat o meninere parial a barierelor reproductoare asupra polenului provenit de la alte specii.

ABSTRACT
The natural hybridization level within a complex of four oak species was assessed with the help of a set of 13 molecular markers. Moreover, for the investigation of the phenologic barriers for the accomplishment of this phenomenon, phenological observations of the foliar buds burst and flowering were made. These observations indicated the possibility of interspecific hybridization production in the Natural Reserve Bejan-Deva. The genetic differentiation indeces of the species highligthed the highest differentiation between the Quercus frainetto Q. robur species pair, respectively the most reduced differentiation between the Q. frainetto and Q. pubescens species. The genetic assignment analysis for the 492 sampled trees in the intensive study area (8,5 ha) indicated a high hybridization rate (40,4%). The paternity analysis accomplished for 304 acorns cropped from 18 mother-trees highlighted a percentage of 46% of the pollinations due to a number of 80 trees situated in the study area. Out of the total of the crosses identified inside the study area, the most numerous were the intraspecific ones (40%), followed by backcrosses (27%). A comparative synthesis between the paternity analysis and the phenological observations indicated that 62,2% of the trees participant in crosses are from the same phenological category as the mother-tree. The hybrids proved to be fertiles and indicated a partial keeping of the reproductive barriers for the pollen from other species. 80

CURRICULUM VITAE

Date personale Nume: CRCIUNESC Prenume: Iacob Adresa: str. Vilelor, nr.2, Petroani, jud. Hunedoara Data i locul naterii: 22.01.1985, Petroani, jud. Hunedoara Cetenie: romn Starea civil: necstorit Telefon: 0724384209 E-mail: iacob.craciunesc@unitbv.ro

Educaie 2004-2009: Facultatea de Silvicultur i Exploatri Forestiere, Universitatea Transilvania din Braov. Diplom de inginer. 2000-2004: Liceul Teoretic Mihai Eminescu Petroani, specializarea matematic-informatic. Diplom de bacalaureat.

Publicaii A. Lucrri publicate n reviste ISI: 1 (coautor) B. Lucrri publicate n reviste indexate n baze de date internaionale (BDI): 3 (2 ca prim autor) C. Lucrri publicate n proceeding-urile conferinelor internaionale: 1 (prim autor) D. Lucrri prezentate la simpozioane i conferine naionale sau internaionale: 3

81

CURRICULUM VITAE

Personal data Name: CRCIUNESC First name: Iacob Address: 2, Vilelor Street, Petroani, Hunedoara County Date and place of birth: 22nd of January 1985, Petroani, Hunedoara County Nationality: Romanian Marital status: unmarried Phone: 0724384209 E-mail: iacob.craciunesc@unitbv.ro

Education 2004-2009: Faculty of Silviculture and Forest Engineering, Transilvania University of Braov. Diploma of Forest Engineer 2000-2004: Theoretical Highschool Mihai Eminescu Petroani, Matematics-Informatics. Baccalaureate Diploma

Publication A. Papers published in ISI journals: 1 (coauthor) B. Papers published in BDI journals: 3 (2 as first author) C. Papers published in proccedings of international conferences: 1 (first author) D. Papers presented at national or international conferences and symposia: 3

82