Teza Doctorat

Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.
prezent n stupinele din zona Transilvaniei
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII
Ing. chimist ANTONIA CRISTINA MARIA M. ODAGIU
TEZ DE DOCTORAT
CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I VALIDAREA
UNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI
VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA
TRANSILVANIEI
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCTOR TIINIFIC
Prof. univ. dr. AUGUSTIN VLAIC
CLUJ NAPOCA
2010
229
Teza de doctorat intitulat CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I

VALIDAREA UNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI VARROA
SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA TRANSILVANIEI i propune
dezvoltarea unei metode de identificare a genotipului cruia i aparine parazitul Varroa sp.
prezent n stupinele din Transilvania, precum i caracterizarea parametrilor de performan a
metodei n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a Animalelor al Universitii de
tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj Napoca, n vederea validrii procedurii.
INTODUCERE
Datorit importanei mierii ct i a produselor apicole secundare (polen, lptior de
matc, propolis, cear) tributar factorilor nutritivi pe care i conin precum i aciunii
terapeutice a acestora, prevenirea i combaterea bolilor albinelor constituie una dintre
preocuprile majore ale apicultorilor pe plan mondial (Bura M., 1996; Dezmirean D. i
colab., 2008; Mrghita L. Al., 2002).
Un alt factor ce contribuie la importana pstrrii strii de sntate a albinelor, l
constituie calitatea lor de vector n procesul de polenizare al plantelor, dar i de
perspectivele deschise de progresul biotehnologiilor care le transform n virtuali ageni de
vehiculare al transgenelor provenite de la plantele modificate genetic (Dezmirean D. i
colab., 2007; Rakosy-Tican Elena, 2005).
n acest context, o tot mai mare importan se acord factorilor genetici care sunt
implicai n rezistena natural a unor specii sau populaii de albine la ageni patogeni
specifici, sau parazii, dar i a paraziilor la aciunea produselor destinate combaterii lor.
230
CAPITOLUL I
ASPECTE PRIVITOARE LA COMPORTAMENTUL IGIENIC
AL APIS MELLIFERA L.
Bolile albinelor pot fi de natur necontagioas sau contagioas. Cele de natur
necontagioas au cauze fiziologice, pe cnd cele contagioase sunt provocate de ageni
bacterieni, virali, micotici, sau parazii (Mrghita L. Al., 2002).
Datorit efectelor sale extrem de nocive i rspndirii largi Varroa destructor
(jacobsoni) constituie o problem major pentru apicultorii din ntreaga lume. Varroa sp.
este un parazit ce face parte din regnul Animalia, ncrengtura Arthropoda, Clasa
Arachnida, Ordinul Acari, Familia Parasitidae, Genul Varroa, Specia destructor (Drees
B.M. i colab., 1999).
Combaterea eficient a parazitului constituie una dintre cele mai mari provocri ale
apicultorilor din ntreaga lume (Tew J. E., 2000; Moosbeckhofer R. i colab., 2003; Donz
G., 1998; Al-Abbadi A. i colab., 2003). Una dintre cele mai mari probleme ale apicultorilor
de azi const n rezistena parazitului la tratamentul cu Apistan (pesticid piretroid avnd
component activ tau fluvalinatul), una dintre substanele cu cea mai mare utilizare n
combaterea Varroa destructor, dar i la cele cu Amitraz i Cumafos (Pettis J. S., 2003).
Rezistena parazitului Varroa sp. la principalii produi de combatere, bazai pe
piretroizi s-ar putea explica prin mecanisme identificate la momentul de fa. Aceasta, ns,
n contextul mai larg al dezvoltrii rezistenei la pesticide att a plantelor ct i al altor
organisme (echinoderme, insecte, arahnide etc.), care se pare c sunt guvernate de procese
similare (Doyle K. i colab., 1991; Sibbesen O. i colab., 1995; Besten P.J., 1998; Valles
S.M. i colab., 2003; Tan J. i colab., 2005; Eleftherianos I. i colab., 2008, .a.).
Unul dintre ele este reprezentat de prezena anumitor esteraze (monooxigenazele),
care stau la baza unui mecanism metabolic de rezisten specific, mediat de acestea detoxifierea. n prezena monooxigenazelor piretroizii sintetici sunt oxidai, ceea ce conduce
la anihilarea activitii lor toxice asupra paraziilor (Sammataro Diana i colab., 2005).
Aceste monooxigenaze fac parte dintr-un grup mai extins (Lewis D. F.V., 2001) localizat n
reticulul endoplansmatic i este desemnat ca Citocrom P 450 (CYP sau P450). Acestea
231
aparin superfamiliei de proteine care conin cofactorul Hem (hemoproteine). Denumirea

atribuit acestui grup enzimatic se datoreaz localizrii celulare a acestora (cito), dar i
caracteristicilor spectrofotometrice (crom) cnd fierul din Hem este redus, P450 absoarbe
radiaiile luminoase cu lungimea de und carcteristic de 450 nm.
Reacia de baz prin care Citocromul P450 i manifest rolul catalitic, este tipic
monooxigenazelor (oxidare prin introducerea unui atom de oxigen ntr-un substrat organic
RH i reducere prin formarea apei cu participarea celuilalt atom de oxigen):
RH + O2 + 2H+ + 2e ROH + H2O
La echinoderme a fost evideniat dependena de P450 a metabolismului compuilor
piretroidici (Besten P. J. i colab., 1990; Besten P. J., 1998).
n cazul insectelor, a fost confirmat prezena oxidazelor din complexul enzimatic
microzomal P450, care utilizeaz sistemul NADPH/NADH pentru a cliva reductor
oxigenul atmosferic, conducnd la o funciune organic i o molecul de ap (Schuler Mary
A., 1996; Dong K., 2007; Soderlund D. M., 2008). Descrierea acestor mecanisme a facilitat
explicarea fenomenului de rezisten a parazitului Varroa sp. la piretroizi. Pe baza lor
tulpinile rezistente la produii de combatere i-au dezvoltat capacitatea de a detoxifica
insecticidele prin oxidare.
Cellalt mecanism al rezistenei poate fi explicat prin mutaiile punctiforme produse
la nivelul genei, care controleaz canalele sodiului. Canalele sodiului caracterizate de un
potenial electric sunt constituite integral din proteine transmembranare i sunt responsabile
de faza de cretere rapid a potenialului de aciune al celulei care face parte din categoria
celor cu excitabilitate ridicat. Insecticidele piretroide au efect de reducere a cineticii
activrii i dezactivrii canalului sodiului. Consecina direct este deschiderea prelungit a
canalelor individuale, ceea ce conduce la paralizia i n final moartea insectelor ce vin n
contact cu aceti compui (Wang R. i colab., 2002; Wang R. i colab., 2003; Wang, R. i
colab., 2003). Multe dintre insectele ce prezint rezisten la piretroizi au suferit mutaii
punctiforme la nivelul genei canalului sodiului. Teste efectuate asupra oocitelor de Xenopus
ce au exprimate canalele sodiului, au demonstrat c aceste mutaii reduc sensibilitatea
acestor canale la piretroizi, ceea ce confirm faptul c acesta reprezint mecanismul major
de rezisten la piretroizi la diverse specii de insecte (Soderlund D.M. i colab., 2003).
232
Wang R i colab. (2003) au reuit s evidenieze gena pentru canalul sodiului de la arahnide
gena VmNa i la Varroa destructor O. Izolarea integral a genei VmNa a reprezentat un
moment important pentru caracterizarea complet a modului de funcionare a acestui
mecanism de rezisten la produse pe baz de piretroizi.
Cel mai cunoscut mecanism de rezisten a albinelor la boli i duntori, pe baza
cruia se poate realiza selecia, este datorat comportamentului igienic al acestora, descris
iniial de
Park O.W. (1937), citat de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997. Acest
comportament complex const n dou activiti distincte desfurate n dou etape

successive (Lapidge K.L. i colab., 2002). Primul implic descpcirea celulelor n care se
afl larvele infestate, iar cel de al doilea const n eliminarea efectiv a corpului larvei din
celulele descpcite. Pornind de la constatrile lui Park (1937), Rothenbuhler (1964a,b)
presupune existena a dou mecanisme diferite care stau la baza controlului acestor
activiti. Conform acestei aseriuni, fiecare dintre aceste dou activiti este controlat de o
gen cu dou alele, iar comportamentul este transmis la descendeni conform mecanismului
mendeleean.
Spre exemplu, dac mperecherea se produce ntre un trntor a crui
comportament igienic este controlat de ambele alele recesive i o matc ce posed doar
cte o alel recesiv pentru fiecare tip de comportament, vor rezulta doar doi descendeni
(un trntor i o albin) ce posed ambele alele recesive (fig. 3).
Fig. 3. Transmiterea comportamentului igienic la Apis mellifera L.

(http://members.aol.com/queenb95/genetics.html)
233
CAPITOLUL II
BAZELE TEORETICE ALE METODOLOGIEI DE GENOTIPIOZARE A
PARAZITULUI VARROA SP.
Dup prelevarea i conservarea probelor n condiiile impuse de protocol, procedeul
implic: extracia ADN, amplificarea, restricia, migrarea n gel de agaroz i secvenierea.
Izolarea ADN trebuie s fie caracterizat de o eficien ct mai mare, precum i de
obinerea unei cantiti suficiente, de puritate corespunztoare, care mai apoi s poat fi
utilizat n scopul amplificrii, migrrii i eventual secvenierii atunci cd scopul final al
analizei o impune (Vlaic A., 1997; Vlaic A. i colab., 2005). Cea mai utilizat metod de
cuantificare a probelor de ADN se bazeaz pe spectrofotometria de absorbie molecular n
UV. Acizii dezoxiribonucleici dublu catenari prezint un maximum de absorbie la = 260
nm. Majoritatea probelor, ns, conin contaminani, respectiv proteine i ADN i/sau ARN
unicatenar, cu un maximum de absorbie la = 280 nm. O alt categorie de contaminani
specifici acestui tip de probe este reprezentat de fenoli i tiocianai, cu un maximum de
absorbie la = 230 nm. Reacia n Lan a Polimerazei - PCR se bazeaz pe caracteristicile
replicrii ADN-ului. Este o tehnic rapid, care permite obinerea n cantiti suficiente,
pentru scopuri analitice, a unor fragmente specifice de ADN aflate iniial n cantiti foarte
reduse. n studiul de fa s-a recurs la adoptarea tehnicii perfecionate de amplificare,
respectiv Real Time PCR (RT PCR). Principiul metodei se bazeaz pe faptul c fiecare
prob sufer o amplificare PCR n prezena unui fluorocrom prezent n amestecul de reacie,
care produce fluorescen doar atunci cnd produsul specific este recunoscut sau sintetizat.
Pragul de fluorescen rezult din analiza curbei de reacie i este determinat n partea
liniar a acesteia. El corespunde fazei n care se nregistreaz cea mai mare eficien a
amplificrii. Tehnica RFLP se bazeaza pe existena, n genomul organismului studiat
(Varroa sp. n cazul de fa), a unor situs-uri de restricie, asupra crora acioneaz specific
anumite enzime, numite enzime de restricie. n urma aciunii acestora, se produce tierea
macromoleculei de ADN i obinerea unor fragmente de diferite lungimi. Distribuia
situsurilor de restricie corespunztoare unei anumite enzime este specific pentru fiecare
specie (Vlaic A. i colab., 2008).
234
CAPITOLUL III
CONCEPTUL DE VALIDARE DE METODE
Procedura de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete
demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost
elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de
laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat. Principalii parametri care
fac obiectul validrii sunt: selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de
lucru, liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate,
incertitudine. Aceste criterii sunt prevzute i n normele ISO i ale IUPAC i, prin urmare,
i n nota explicativ a Comisiei de specialitate a Uniunii Europene.
CAPITOLUL IV
SCOPUL OBIECTIVELE I IMPORTANA CERCETRII
Scopul tezei de doctorat a vizat dou problematici n strns conexiune, respectiv
identificarea genotipului speciei care paraziteaz Apis mellifera carpatica L. n
Transilvania, precum i propunerea spre validare a metodei de genotipizare pe baz de
ADN provenit de la parazitul Varroa sp. n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a
Animalelor Domestice a USAMV Cluj Napoca, lund n considerare prezena i
importana comportamentului igienic al albinei melifere n rezistena la aciunea parazitului
Varroa.
Planul experimental al cercetrii a prevzut luarea n studiu a comportamentului
igienic al albinelor localizate randomizat n stupine din cele 10 judee din Transilvania
(Alba, Bistria - Nsud, Braov, Cluj, Covasna, Harghita, Hunedoara, Mure, Slaj i
Sibiu), precum i dezvoltarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. i
validarea acesteia n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a Animalelor
Domestice a USAMV Cluj - Napoca.
235
Importana cercetrii
La noi n ar, nu au fost efectuate studii moleculare asupra caracteristicilor
parazitului Varroa sp. i de asemenea, nu a fost ntreprins un studiu integrat ce vizeaz
implicarea comportamentul igienic al varietii autohtone de albine n rezistena la boli n
greneral i la Varroa sp. n particular.
Procedeul de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete
demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost
elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de
laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat (Kennedy S., 1997). n
validarea metodelor analitice principalii parametri care fac obiectul validrii sunt:
selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de lucru, liniaritate, limit de
detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate i incertitudine. Aceste criterii sunt
prevzute i n normele ISO i IUPAC .
Enunate fiind principiile generale care stau la baza procedeelor de validare, trebuie
subliniat faptul c acestea prezint caracteristici specifice pentru fiecare tip de analiz i, de
asemenea, sunt specifice i pentru laboratoarele n care sunt aplicate. n consecin,
implementarea acestora n laboratoarele de genetic molecular prezint o serie de
particulariti, trebuind s rspund unor exigene specifice (OECD, 2007; Jennings L. i
colab., 2009).
n acest context, prezentul studiu i aduce aportul la caracterizarea metodei analitice
de de izolare, cuantificare i amplificare a ADN din parazitul Varroa destructor O. Din
punct de vedere al performanelor analitice i totodat rezultatele obinute permnit
ncadrarea aacestora n categoria celor care pot parcurge cu succes exigenele procedeelor
de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele de biologie molecular (IUPAC,
ISO: 2005, 17025).
Genotipizarea are un potenial ridicat n depistarea tulpinilor aparinnd
Varroa sp. care au dezvoltat rezisten la tratamentul chimic i a cror existen a fost
demonstrat nc din anii 90 (ben Hamida T., 1997). n urma aplicrii genotipizrii i
confruntrii cu datele din literatur se pot evita cheltuieli inutile cu achiziionarea i
236
aplicarea tratamentelor cu Amitraz, Apistan, Cumafos .a. care se dovedesc ineficiente

i aplicarea direct a unor soluii diferite de combatere.
CAPITOLUL V
EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LA APIS MELLIFERA
CARPATICA L. DIN ZONA TRANSILVANIEI
Rezultatele obinute demonstreaz c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de

albine analizate nu au manifestat comportament igienic, procentul mediu de descpcire a
nregistrat valoarea maxim n judeul Cluj, maximumul nregistrat fiind de 78,72%, situat
mult sub limita de 91% de la care familiile de albine se consider c manifest rezisten
natural la boli i parazii ca urmare a comportamentului igienic.
Cea mai mic medie pentru procentul de descpcire a fost nregistrat n judeul
Harghita, 67,54%.
CAPITOLUL VI
REZULTATE PRIVIND DEZVOLTAREA METODEI DE GENOTIPIZARE A
PARAZITULUI VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA
TRANSILVANIEI
Acest demers constituie un proces laborios care implic o succesiune de etape (fig. 30).
237
Prelevarea probelor
Izolarea ADN
Purificarea ADN
Amplificarea ADN
Restricia produsului de amplificare
cu enzimele SacI i XhoI
Migrarea n gel de agaroz 2%
i vizualizarea gelului
Secvenierea
Identificarea genotipului
Fig. 30. Etapele procesului de genotipizare a parazitului Varroa sp.
n urma migrrii produsului de amplificare supus restriciei cu enzimele Xho I i
Sac I a rezultat profilul electroforetic al celor 10 migrri, fiecare corespunztoare unei zone
de colectare a paraziilor (fig. 36).
238
10
700 pb
X
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
n
X
400 pb
200 pb
150 pb
1- Alba, 2 Bistria Nsud, 3 Braov, 4 - Cluj, 5 - Covasna, 6 - Harghita,

7 - Hunedoara, 8 - Mure, 9 - Slaj, 10 Sibiu, X Xho I, S Sac I, n fragment nedigerat
Fig. 36. Profilul electroforetic al probelor de ADN provenit de la parazitul Varroa sp.
obinut n urma restriciei cu enzimele Sac I i Xho I (original)
Secvenierea a fost realizat de ctre compania Mycrosinth n Elveia. Rezultatele
secvenierii au evideniat structura de interes prezent n subunitatea I a genei mitocondriale
citocromoxidazei (CO I) a paraziilor aparinnd genotipului Varroa sp. recoltai din
stupine localizate n Transilvania. A rezultat urmtoarea secven (n format FASTA):
ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTATTATTTCTCAGTA
ATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGATAATTTACGCTATAATAACTATTG
GTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATATTTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATAT
TTTACTGCAGCTACAATAATTATTGCGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCAT
GGTTCTATAGTTAAATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGT
ATTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATGTAGTAGCACAT
TTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT
Compararea structurii secvenei izolate de noi din ADN provenit de la indivizi

Varroa sp. prezeni n stupinele din Transilvania, cu genotipurile existente n baza de date
NCBI, a crei rezultat a constat n suprapunerea de 100% cu secvenele cu numerele de
acces AF106900.1, AJ84872.1.i AY372063.1 (fig. 40), a condus la constatatrea c
genotipul Varroa existent n Transilvania coincide cu genotipul China 2, ce paraziteaz Apis
cerana n Asia.
239
Query
Sbjct
Query
61
Sbjct
61
Query
121
Sbjct
121
Query
181
Sbjct
181
Query
241
Sbjct
241
Query
301
Sbjct
301
Query
361
Sbjct
361
Query
421
Sbjct
421
atttattttgattttttggacacccagaagtttatattttaattttgcctggttttggta
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTA
ttatttCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTATTTCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA
60
60
120
120
TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT
180
TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG
240
CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA
300
AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTAtttttttATTTACTTTAGGGGGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGTA
360
TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG
TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT
180
240
300
360
420
420
458
458
Fig. 40. Secvenele genotipurilor originale China 2 (Anderson i Trueman, 2000; Ting Y. i
colab., 2004; Solignac M. i colab., 2005) obinute pentru Varroa destructor i a celor
obinute n stupinele din Transilvania
CAPITOLUL VII
VALIDAREA METODEI DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI
VARROA DESTRUCTOR O.
Pe baza testrii parametrilor de reacie implicai n procedeul de izolare a ADN din
parazitul Varroa destructor O., a fost elaborat un flux de operaii care au avut drept rezultat
dezvoltarea unei metode de izolare i cuantificare a ADN.
n urma caracterizrii parametrilor de performan ai metodei (selectivitate/
specificitate, precizie, exactitate, parametrii analizei de regresie liniar, liniaritate, domeniul
240
de lucru, test de liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare robustee, i

incertitudinea de msurare) a rezultat c procedeul are o capabilitate (proficiency)
corespunztoare i este n conformitate cu scopul pentru care a fost selectat (tabelul 25).
Tabelul 25
Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda spectrofotometric de
absorbie molecular UV-VIS dezvoltat n vederea cuantificrii ADN izolat din parazitul
Varroa destructor O.
Parametrul
Rezultat impus
Rezultat realizat
Selectivitatea
Obinerea
spectrului
de
absorbie molecular UV-VIS la

= 230 nm, = 260 nm i
respectiv = 280 nm, pentru
diferite cantiti de ADN (ng/l)
izolate de la parazitul Varroa
destructor O.
Tehnic specific
RSD% < 3,50
Precizia
Repetabilitate RSD% = 1,98%

Precizia intermediar RSD% = 1,64%
85% R 105%
Parametrii analizei de Curba

regresie liniar
de
etalonare
R = 99,60%
are
reprezentare liniar de forma

y = a + bx
o
y = 0,0675 + 0,0009x
Absorbana (Absorbance)
Exactitatea
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l

Quantity of DNA extracted from Varroa destructor O. mite, ng/l
241
Tabelul 25 continuare
Liniaritate
2
Dispersie redus a valorilor
individuale n jurul dreptei de
regresie
Cantitatea de ADN extras din

parazitul Varroa destructor O., ng/l
Quantity of DNA extracted from
Varroa destructor O. mite, ng/l
800
750
700
650
600
550
500
450
400
-0,58
-0,08
0,42
0,92
1,42
Domeniu de lucru
Testul
de
omogenitate
dispersiilor
PG = 1,484
Valoarea de ncercare PG < 5,35

Testul de liniaritate
Valoarea
abaterii
standard
reziduale
(0,8139) indic o dispersie redus a

valorilor individuale n jurul liniei de
regresie calculate.
Limita de detecie i Limita de cuantificare trebuie s
limita de cuantificare
fie superioar cu cel puin un
xLC = 0,002500 ng/l
ordin de mrime Limitei de
xLD = 0,000859 ng/l
detecie
Influena minim a variaiilor Metoda are un caracter robust, din
parametrilor metodei
punct de vedere a stabilitii n timp a
-Stabilitatea n timp a soluiei de soluiei de ADN (rproaapt, r48h i r96h).

ADN izolat din parazitul Varroa
destructor O.
Robusteea
r = 0,9833

- izolat ADN proaspt -
242
3
r = 0,9827

- izolat ADN la 48 ore dup preparare
r = 0,9759

- izolat ADN la 96 ore dup preparare
-Influena temperaturii
Metoda are un caracter robust dac se

lucreaz
la
temperatura
ambiental
normal 15 - 200C i se evit variaiile de

temperatur (tabelul 21).
msurare
de Stabilirea
bugetului
de Cea mai mare contribuie le bugetul de
incertitudini.
incertitudini este adus de volumul total de

soluie supus cuantificri (soluie tampon
+ ADN izolat).
u_absorban (ADN)
u_volum (Tips)
u_volum (Total)
0,025
Tipul incertitudinii (Type of incertitude)
Incertitudinea
u_volum (Ap pur)
0,1318
u_volum (Nonidet)
u_volum (tampon)
u_volum (Eppendorf)
4,391795
0,74767
0,407738
3,2363877
3,21066
0,0086592
5
Valoarea (Value)
243
u_puritate (Tris)
Tabelul 32
Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda de amplificare a
fragmentului de ADN mitocondrial localizat la nivelul genei CO-I a parazitului
Varroa destructor O.
Parametrul
Rezultat impus
Rezultat realizat
Limita de detecie
Amplificarea
devine
vizibil
dup un numr redus de cicluri
Ct =16,83
de amplificare (< 21)

Reproductibilitatea
Nu
exist
diferene
ntre
500 pb
rezultatele obinute de analiti

diferii
care
amplificarea
realizeaz
n
400 pb
acelai
150 pb
Termocycler
700 pb
400 pb
150 pb
Precizia
Valoare
deviaiei
ct
mai
standard
redus
pentru
amplificarea aceleiai probe n
s = 0,638
20 de repetiii
Sensibilitatea
Cantitate ct mai redus de

ADN ce poate fi amplificat
(< 1 g)
244
500 ng
Dispersie redus a valorilor

Media valorilor CT
The average of CT values
Liniaritatea
individuale n jurul dreptei de

regresie
Log din cantitatea de ADN

Log of DNA quantity
Robusteea
Influena minim a variaiilor -n

parametrilor metodei
condiile
prezervrii
probelor
condiii corespunztoare, au fost obinute
-Stabilitatea n timp a soluiei de geluri identice.

ADN izolat din parazitul Varroa
700 pb
destructor O. (amplificare ADN:

izolat proaspt - a, dup 48h - b
500 pb
i dup 96h - c)
150 pb
700 pb
500 pb
700 pb
500 pb
c
-Influena
temperaturii
ataare a primerilor
de
Metoda are un caracter robust dac se

lucreaz la temperatura de ataare a
primerilor de 500C.
245
1
Incertitudinea
2
de Stabilirea
msurare
bugetului
de Cea mai mare contribuie le bugetul de
incertitudini.
incertitudini este adus de volumul total de

soluie supus amplificrii (soluie tampon
Tipul incertitudinii (Type of incertitude)
+ ADN izolat).
2,1606608
0,2000003
0,2700263
0,3184415
0,1001278
0,015
0,0375
0,025
1,1859058
0,0086592
0,5
1,5
2,5
Valoa
Aceste constatri permit ncadrarea metodei de izolare i cuantificare i amplificare a

ADN din parazitul Varroa destructor O. n categoria celor care pot parcurge cu succes
exigenele procedeelor de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele de
biologie molecular (IUPAC, ISO: 2005, 17025).
CONCLUZII
Datorit faptului c finalitatea tezei de doctorat a vizat o abordare complex a
problematicii dezvoltrii i validrii unei metode de genotipizare a parazitului Varroa
sp. n stupinele din zona Transilvaniei, n conexiune cu particularitile albinei
melifere (Apis mellifera L.) din punctul de vederea al aspectelor etologice i al
mecanismelor de rezisten la boli i parazii, concluziile formulate debuteaz cu
aceste aspecte.
Privitor la studiul comportamentului igienic al Apis mellifera L., n stupinele din
Transilvania, rezultatele studiului concretizate n nregistrarea valorilor medii ale
procentului de descpcire cuprinse n intervalul 67 78% (cu valoarea medie
minim de 67,54% nregistrat n judeul Harghita i maxim de 78,72% n judeul
246
Cluj) au demonstrat c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine

analizate nu au manifestat comportament igienic, limita de la care familiile de albine
se consider c manifest rezisten natural la boli i parazii ca urmare a
comportamentului igienic fiind de 91%.
Genotipul identificat n urma studiului nostru n stupinele din Transilvania,
corespunde numrului de acces n Banca de Gene AF 106900 este genotipul China 2
(Anderson i colab., 2000), unul dintre cele dou genotipuri Varroa din cadrul
varietii extreme de largi prezente n Asia capabile s paraziteze i Apis mellifera L.
Acesta se suprapune 100% cu genotipurile evideniate de Ting Z. si col. (2004) n
China, avnd numarul de acces n baza de date NCBI - AY372063.1 i n Europa, de
Solignac M. i colab. (2005) avnd cu numrul de acces n baza de date NCBI
AJ84872.1
Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de amplificare a ADN din
parazitul Varroa destructor O. enumerai mai sus i analiza rezultatelor obinute,
confirm faptul c aceasta corespunde scopului pentru care a fost selectat i n
consecin poate fi validat.
RECOMANDRI
Pentru combaterea eficient a parazitului Varroa destructor O. este necesar aplicarea
unui management specific rezistenei la duntori, inndu-se cont de faptul c orice
organism, n condiii de constrngere, caut s gseasc soluii de supravieuire. Acest
tip de management trebuie s includ tehnici legate de: bune practici n managementul
stupului, meninerea unui grad redus de infestare, dar i aplicarea produselor de
combatere n cantitile omologate i de calitate ecologic.
Identificarea rezistenei parazitului Varroa destructor O. la Apistan i cuantificarea
acesteia, constituie premisa pentru elaborarea unor strategii eficiente pentru combaterea
parazitului. Cunoscndu-se genotipul Varroa sp., precum i faptul c rezistena se
datoreaz apariiei unei mutaii punctiforme la nivelul genei canalului sodiului, prin
247
aplicarea secvenierii se poate dezvolta un sistem de diagnoz eficient, bazat pe

diferenele genetice ntre formele rezistene i cele sensibile.
Este necesar implementarea, la nivel naional, a unui sistem de monitorizare a formrii
i dezvoltrii rezistenei parazitului Varroa destructor O. la tratamentul cu ageni de
combatere piretroidici, dar i a celor pe baz de compui organofosforici sau antibiotice,
dei, alturi de o metodologie competent pentru diagnoza acesteia, utilizarea lor este
din ce n ce mai rar datorit efectelor de remanen.
Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de genotipizare a parazitului
Varroa destructor O. (prin aplicarea direct la etapele de de izolare, cuantificare i
amplificare a ADN) i analiza rezultatelor obinute, n condiiile Laboratorului Zonal de
enotipizare a Animalelor Domestice, confirm faptul c aceasta poate fi propus spre
validare, contribuind de aceast manier la sporirea competenei laboratorului.
248
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1.
Andersen C.L., J.L. Jensen and T. F. rntoft, 2004, Normalization of Real-Time

Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance
Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to
Bladder and Colon Cancer Data Sets, Cancer research, No. 64, 5245 5250
2.
den Besten P.J. 1998, Cytochrome P450 monooxygenase system in echinoderms,

Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and
Endocrinology, Vol. 121, No. 1 - 3, 139 146
3.
Brown, T.A., 2002, Genomes, 2nd Edition, BIOS Scientific Publishers Ltd., 101, 121,
122
4.
Bruneau E., Jacobs F., and Trouiller J., 1997, Rsultats de la campagne dedtection
de la rsistance de Varroa aux pyrthrinodes en Belgique - 1997. Abeilles et
Compagnie, No. 60, 5 6
5.
Bura M., Creterea intensiv a albinelor, 1996, Editura Helicon, Timioara
6.
Bura M., Silvia Ptruic, V.A. Bura, 2005, Tehnologie Apicol, Ed. Solnes,
Timioara
7.
Burkardt H. J., Standardization and quality control of PCR analyses, Clin. Chem.
Lab. Med, 2000, Vol. 38, No. 2, 87 91
8.
Cuia Eliza, 2006 - 2008, Determinarea rezistenei naturale la boli a populaiilor

de albine (A. M. Carpatica) din Romania pe baza unor teste specifice i
realizarea unei metodologii optime de ameliorare pentru acest character, Proiect
CEEX, Modulul II, EP
9.
Colton T., 1974, Statistics in Medicine, Little Brown Publishers, 372 pag.
10.
Coier Viorica, A. Vlaic, 2007, Abordarea practic a problemelor de genetic

animal, Editura Todesco, Cluj - Napoca
249
11.
Defilando Baker M. D., 1988, Variability and biotypes of Varroa jacobsoni

Oudemans, American Bee Journal, Vol. 128, No. 8, 567 568
12.
Dezmirean S. Daniel, L. Al. Mrghita, Graia I. Dezmirean, G. Dini, O.Bobi, L.

Laslo, A. Moise, Antonia Odagiu, A. Fiiu, I. Paca, C. Bojan, Simona Brsan, O.
Maghear, C. Coroian, M. Man; 2007, Reccomandations regarding prophylaxis of
honey contamination during primary processing, Apicultura de la tiin la
agribusiness i apiterapie, 82-84
13.
Dezmirean D., L. Al. Mrghita, Oltica Giorgiana Stanciu, Otilia Bobi, Laura Laslo,
Adela Moise, O.Maghear, Cristina Bojan, 2008, Mineral composition of honeydew
honey
produced
in
Transylvania
determined
by
Atomic
Absorbtion
Spectrometry, Bulletin USAMV-CN, Vol. 65, No.1 - 2, 233-237

14.
Gonccalves M.C., M. M. Klerks, M. Verbeek, J. Vega, J. F. van den Heuvel, 2002,

The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection
of Sugarcane Yellow Leaf Virus, European Journal of Plant Pathology No. 108,
401407
15.
de Graaf D.C., W. Ritter, F. J. Jacobs, Marleen Brunian, H. Inberechts, K. Mintiens,

Y. Van der Stede, B. Verheyden, A.K. Fauske, P. Boujon, Gabriela Chioveanu, D.
Dezmirean, G. Formato, F. Mutinelli, H.-J. Roest, D. Titera, S.F. Pernal, Katia
Knapen, 2009, Lessons from the first international proficiency test for the
detection of spores from the honey bee pathogen Paenibacillus larvae,
Accreditation Quality Assurance, No. 14, 273-276
16.
Martin S. J., 2004, Acaricide (pyrethroid) resistance in Varroa destructor, Bee

World, No. 85, 67 - 69
17.
Mrghita L. Al., 2003, Albinele i produsele lor, Editura Ceres, Bucureti
18.
Mrghita L. Al., D. Dezmirean - Coordonatori, 2007, Apicultura de la tiin la

agribusiness i apiterapie, Editura AcademicPres, Cluj - Napoca
19.
Milani N., G. Della Vedova, 2002, Decline in the proportion of mites resistant to
fluvalinate in a population of Varroa destructor not treated with pyrethroids,
Apidologie, No. 33, 417 - 422
250
20.
Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, I. Cornoiu, Laura Laslo,

2007, Research into the hygienic behaviour of honeybees in Transylvania,
Proceedings of the 42nd Croatian&2nd International Symposium on Agriculture, 13-16
February, 302 306
21.
Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, 2007, The hygienic

behavior testing honeybee colonies from Transylvanian area, n Apicultura
de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al., D. Dezmirean Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 17 - 19
22.
Odagiu Antonia., A.Vlaic, L. Al. Mrghita, I. Oroian, D. Dezmirean, Dana Pusta,

2008, The Validation of the DNA Extraction Method from Apis mellifera L.,
Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Animal
Science and Biotechnologies, Vol. 65, No.1 - 2, 387 390
23.
Odagiu Antonia, I. Oroian, A. Vlaic, Al. Mrghita, P. Mazzone, E. Caprio, D.

Dezmirean, 2009, Assessing Linearity of the Parasite Varroa destructor DNA
Amplification, ProEnvironment/ProMediu, Vol. 2, No. 4, 226 229 (319 322)
24.
Patti Elzen and D. Westervelt, 2004, A scientific note on reversion of fluvalinate

resistance to a degree of susceptibility in Varroa destructor, Apidologie, No. 35,
519 520
25.
Peirson S. N., J. N. Butler, and R. G. Foster, 2003, Experimental validation of

novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis,
NucleicAcid Res., Vol. 31, No. 14, 118 125
26.
Peters I. R., C. R. Helps, E. J. Hall, and M. J. Day, 2004, Real-time RT-PCR:

considerations for efficient and sensitive assay design, J. Immunol. Methods, Vol.
286, Nos. 1- 2, 203217
27.
Ponchel F., C. Toomes, K. Bransfield, F. T. Leong, Susan Douglas, Sarah Field,

Sandra Bell, Valerie Combaret, A. Puisieux, A.J. Mighell, P. A. Robinson, C. F.
Inglehearn, J. D. Isaacs and A. F. Markham, 2003, Real-time PCR based on SYBRGreen I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative
quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene
deletions, BMC Biotechnology, Vol. 3, No. 18, 1 13
251
28.
Rakosy - Tican Elena, 2005, Inginerie genetica vegetala: note de curs, Casa Crii de
tiin, Cluj-Napoca
29.
Rakosy Tican Elena, L. Al. Mrghita, 2007, The bees as vehicles for transgene
transfer from genetically moddified plants to other organisms theoretical
issues, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al.,
D. Dezmirean - Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 184 188
30.
Rieu I. and S. J. Powers, 2009, Real - Time Quantitative RT-PCR: Design,

Calculations, and Statistics, Plant Cell, No. 21, 1031 1033
31.
Soderlund D. M., 2008, Pyrethroids, knockdown resistance and sodium channels,

Pest Management Science, Vol. 64, No. 6, 610 - 616
32.
Solignac M., D. Vautrin, E. Baudry, F. Mouguel, A. Loiseau and J-M Cornuet, 2004,
A Microsatelitte-Based Linkage Map of the Honeybee, Apis mellifera L.,
Genetics, No. 167, 253 - 262
33.
Spivak M., and G. S. Reuter, 2001, Varroa destructor infestation in untreated

honey bee (Hymenoptera: Apidae) colonies selected for hygienic behavior, Journal
of Economic Entomology, Vol. 94, No. 2, 326 331
34.
Tnase I. Gh., G. L. Radu, Al. Pan, Mihaela Buleandr, 2007, Validarea metodelor
analitice. Principii teoretice i studii de caz, Editura PRINTECH, Bucureti
35.
Vlaic A., 1997, Inginerie genetic, realizri, sperane, neliniti, Editura Promedia
Plus
36.
Vlaic A., T. Oroian, Simona Pacalu, 2001, Genotypization of bulls used for
artificial insemination at k-casein and -lactoglobulin locus, Bulletin USAMVCN, Vol. 55 56, 112 117
37.
Vlaic A., T. Oroian, 2004, Elemente de genetic pentru zootehniti, Editura

AcademicPres, Cluj Napoca
38.
Vlaic A., Viorica Coier, Antonia Odagiu, T. Oroian, V. Blteanu, 2005, Analysis of
genetic diversity in five cattle breeds from Romania, Bulletin USAMV-CN, Seria
ZB, Vol. 61, 332
252
39.
Vlaic A., V. A. Blteanu, F. D. Pop, Anda Raluca Rusu, 2008, Molecular methods
used for detection of cattle milk in buffalo, ewe and dairy products, Lucrri
tiinifice, seria Zootehnie, Iai, Vol. 51, 1016 - 1021
40.
Ting Z., L. Anderson, Z. Y. Huang, S. Huang, J. Yao, T. Ken, Q. Zhang, 2004,

Identification of Varroa mites (Acari: Varroidae) infesting Apis cerana and Apis
mellifera in China, Apidologie, No. 35, 645 - 654
41.
***, 1993, ISO 3534 - 1/VIM, International Vocabulary of Basic and General
Terms in Metrology, International Standards Organization, Geneva, Switzerland,
IInd Edition
42.
***, 1995, SR 13 434, ISO/GUM, Guide to the expression of uncertainty in

measurement, International Standards Organization, Geneva, Switzerland
43.
***, 2001, IUPAC Recommendations, Selectivity in analytical chemistry, Pure

Applied Chemistry, Vol. 73, No. 8, 1381 - 1386
44.
***, 2003, Validation of analytical procedures: Methodology, International

Conference on Harmonization Federal Register, Vol. 60, 27463
45.
***, 2003, Ghidul ILAC-G17 privind incertitudinea de msurare, SR ENV

13005, International Standards Organization, Geneva, Switzerland
46.
***, 2005, Standardul SR EN ISO/CEI 17025 : 2005, International Standards

Organization, Geneva, Switzerland
253

Teza Doctorat

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Teza Doctorat

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.

prezent n stupinele din zona Transilvaniei

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

Ing. chimist ANTONIA CRISTINA MARIA M. ODAGIU

Teza de doctorat intitulat CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I

aparin superfamiliei de proteine care conin cofactorul Hem (hemoproteine). Denumirea

comportament complex const n dou activiti distincte desfurate n dou etape

Spre exemplu, dac mperecherea se produce ntre un trntor a crui

Fig. 3. Transmiterea comportamentului igienic la Apis mellifera L.

aplicarea tratamentelor cu Amitraz, Apistan, Cumafos .a. care se dovedesc ineficiente

Rezultatele obinute demonstreaz c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de

1- Alba, 2 Bistria Nsud, 3 Braov, 4 - Cluj, 5 - Covasna, 6 - Harghita,

Compararea structurii secvenei izolate de noi din ADN provenit de la indivizi

de lucru, test de liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare robustee, i

absorbie molecular UV-VIS la

Repetabilitate RSD% = 1,98%

Parametrii analizei de Curba

reprezentare liniar de forma

Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l

Cantitatea de ADN extras din

Valoarea de ncercare PG < 5,35

(0,8139) indic o dispersie redus a

fie superioar cu cel puin un

xLC = 0,002500 ng/l

ordin de mrime Limitei de

xLD = 0,000859 ng/l

punct de vedere a stabilitii n timp a

-Stabilitatea n timp a soluiei de soluiei de ADN (rproaapt, r48h i r96h).

Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l

- izolat ADN proaspt -

Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l

- izolat ADN la 48 ore dup preparare

Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructor O., ng/l

- izolat ADN la 96 ore dup preparare

Metoda are un caracter robust dac se

normal 15 - 200C i se evit variaiile de

de Cea mai mare contribuie le bugetul de

incertitudini este adus de volumul total de

Tipul incertitudinii (Type of incertitude)

u_volum (Ap pur)

dup un numr redus de cicluri

de amplificare (< 21)

rezultatele obinute de analiti

amplificarea aceleiai probe n

Cantitate ct mai redus de

Dispersie redus a valorilor

individuale n jurul dreptei de

Log din cantitatea de ADN

Influena minim a variaiilor -n

condiii corespunztoare, au fost obinute

-Stabilitatea n timp a soluiei de geluri identice.

destructor O. (amplificare ADN:

Metoda are un caracter robust dac se

de Cea mai mare contribuie le bugetul de

incertitudini este adus de volumul total de

Tipul incertitudinii (Type of incertitude)

Aceste constatri permit ncadrarea metodei de izolare i cuantificare i amplificare a

Cluj) au demonstrat c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine

aplicarea secvenierii se poate dezvolta un sistem de diagnoz eficient, bazat pe

Andersen C.L., J.L. Jensen and T. F. rntoft, 2004, Normalization of Real-Time

den Besten P.J. 1998, Cytochrome P450 monooxygenase system in echinoderms,

Bura M., Creterea intensiv a albinelor, 1996, Editura Helicon, Timioara

Cuia Eliza, 2006 - 2008, Determinarea rezistenei naturale la boli a populaiilor

Coier Viorica, A. Vlaic, 2007, Abordarea practic a problemelor de genetic