Tehnici speciale de microscopie Aceast lucrare urm rete studierea metodelor de observare a preparatelor ce nu pot fi vizualizate cu ajutorul microscopului

n transmisie sau n reflexie. I. N oiu n i teoretice Metodele clasice de m icroscopie nu pot pune n eviden detaliile preparatelor atunci cnd acestea au dimensiuni foarte mici (sub 1 m ) sau nu prezint un contrast bun (detaliile au aceeai culoare ca i restul preparatului). n aceast situaie, la dispoziia observatorului stau metodele de colorare a preparatului sau tehnicile speciale de microscopie. Tehnicile de colorare (ce se vor studia n cadrul disciplinei de H istologie) prezint n anum ite situaii cteva dezavantaje: necesit o cantitate mare de timp, manopera i substane chim ice; nu pot fi observate celule sau organism e vii; im aginea obinut difer m ai m u lt sau m ai puin de structura real. Pentru nlturarea acestor deficien e pot fi utilizate tehnicile speciale de microscopie. Dintre acestea amintim: - Microscopia de imersie - Microscopia n ultraviolet (UV) - Microscopia de cmp ntunecat - Microscopia de polarizare - M icroscopia de fluorescen - Microscopia de contrast de faz - Microscopia electronic 1. Microscopia de imersie Cele dou tehnici de microscopie prezentate (transm isie i reflexie) nu perm it o m rire m ai m are de 1000 de ori deoarece apare fenom enul de difracie a lum inii pe detaliile preparatului. Pentru a permite observarea unor detalii m ai fine una din soluii este introducerea ntre obiect i obiectiv a unui lichid omogen, transparent i izotrop cu indice de refracie ct mai mare, numit lichid de imersie. De obicei, se utilizeaz ulei de cedru (n= 1.3 -1.5) sau compui sintetici (n=1.3-1.6). n acest mod se poate crete m rirea pn la cca. 2000 de ori fr s apar fenom enul de difracie. Un alt avantaj al folosirii im ersiei este m rirea luminozitatii imaginii:
E E0 (1 2h ) d h n 2 1

unde: E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie

E0 - iluminarea imaginii n absena lichidului h - distana obiectiv-obiect d - diametrul obiectivului n - indicele de refracie al lichidului de imersie E=(1.2-4)E0 n cazul utilizrii tehnicii de imersie este necesar ca preparatul s fie acoperit cu o lam el pentru ca lichidul de im ersie s nu m odifice structura acestuia. D e asem enea, se utilizeaz obiective speciale (de im ersie) ce sunt inscripionate A po caracterizate prin distan focal mic, avnd totodat posibilitatea de a culisa, n scopul evitrii contactului brutal dintre obiectiv i lamel. A u fost studiate aproape toate tipurile de bacterii. P erform anele m icroscoapelor cu lum in vizibil m erg pana la m rim i de ordinul 2000 -3000 de ori (=0.25m). 2. Microscopia de ultraviolet O alt m odalitate de a crete puterea separatoare este m icorarea lungimii de und a radiaiei folosite pn n domeniul ultraviolet UV (610-10, 3.810 -7)m. n acest mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 0,15m, atingndu-se o m rire de 6000 -7000 de ori. n cazul folosirii radiaiei U V este necesar ca toate com ponentele optice ale m icroscopului s fie realizate din cuartz deoarece sticla com un este o pac la acest tip de radiaii. Im aginea final va fi obinut pe un ecran de proiecie acoperit cu o substana fluorescent. n cazul folosirii radiaiei U V este obligatorie folosirea ochelarilor i a ecranelor de protecie deoarece retina este foarte sensibil n acest dom eniu de lungim i de und. 3. Microscopia de cmp ntunecat Tehnica de cmp ntunecat este utilizat pentru observarea preparatelor transparente i se bazeaz pe m prtierea lum inii pe detaliile preparatului. O rice neom ogenitate din preparat va determina o m odificare a direciei razelor de lum in . D in punct de vedere constructiv se utilizeaz un condensor special alctuit dintr-o oglind concav i una convex (figura 3.1) astfel nct doar razele de lumina m prtiate pe neom ogenitile preparatului s ajung n obiectiv.

Figura 3.1. Microscopia de cmp ntunecat.

C ondensoarele de cm p ntunecat ofer nclinri diferite razelor de lumina trimise spre preparat. Cnd se dorete observarea detaliilor foarte fine, se folosesc condensoare ce produc nclinri m ari fascicolului incident, fiind necesar n acelai tim p m rirea intensitii luminoase, deoarece fluxul de lum in ce ptrunde n obiectiv este foarte m ic. A taate la m icroscop, condensoarele de cmp ntunecat trebuiesc centrate foarte bine pe axul optic al microscopului, n caz contrar obinndu -se imagini cu um bre. 4. Microscopia de polarizare M icroscopia de polarizare se utilizeaz n evidenierea i observarea substanelor optic active ce se gsesc n preparat. Substanele optic active au proprietatea de a roti planul luminii polarizate.

Figura 3.2. Microscopia de polarizare.

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar s se ataeze la m icroscop un polarizor i un analizor, ambele confecionate din Spat de Islanda, ce au proprietatea de a lsa s treac doar razele de lumin ce au un anumit unghi de polarizare. Aceasta tehnic se utilizeaz att n m icroscopia de transm isie ct i n m icroscopia de reflexie. n cazul m ontrii corecte a po larizorului i a analizorului doar razele de lum ina ce strbat zonele din preparat ce conin substane optic active vor ajunge la observator. 5. Microscopia de fluorescen Fluorescena este proprietatea anum itor substane de a em ite lum in (radiaie vizibil) atunci cnd sunt excitate cu radiaie U V . D eoarece m ulte substane de interes m edical prezint fluorescen (acizi nucleici, proteine) aceast tehnic este foarte utilizat n practica de laborator i de cercetare m edical. F iecare substan ce prezint fluorescen este caracterizat de o lungim e de und de excitaie (n U V ) i de o lungim e de und de em isie (n vizibil), astfel nct tehnica poate nu doar pune n evident dar

i identifica substanele respective. n acest scop, se utilizeaz filtre optice i de UV pentru selectarea radiaiei de excitaie i de emisie a substanei ce urm eaz a fi observat. Filtrele se dispun ca n figura 3.3.

Figura 3.3. Microscopia de flu o rescen .

n cadrul acestei tehnici, pentru observarea substanelor ce nu prezint fluorescen n m od direct, se utilizeaz markeri de fluore-scen, substane ce au urm toarele proprieti: - fluorescen intrinsec - aditivitate foarte mare - deterioreaz m inim structura (substana) de care se fixeaz C ele m ai utilizate sunt substanele din clasa flavinelor. 6. Microscopia de contrast de faz Este o tehnic ce se utilizeaz n special pentru observarea celulelor i organismelor vii atunci cnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite. Metoda pune n eviden diferena de drum optic pe care o face lumina trecnd prin diferite zone ale preparatului (reamintim c drumul optic este produsul dintre drumul geometric i indicele de refracie al m ediului pe care l parcurge raza de lum in ). Deci aceast tehnic pune n eviden att diferene de grosime ntre diferitele zone ale preparatului ct i diferene de indice de refracie ntre acestea. Sunt utilizate obiective speciale (inscripionate C f) care au dispuse n planul focal o placa de faz, ce defazeaz lumina cu o semilungime de unda (n + se num ete contrast de faz pozitiv sau n contrast de faz negativ), i un inel parial absorbant. De asemenea, condensorul prezint o fanta inelar ce este specific fiecrui obiectiv folosit. Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special cu ajutorul cruia se pot observa sim ultan att inelul parial absorbant ct i fanta inelar n scopul suprapunerii acestor dou imagini. II. P arte exp erim en tal Materiale necesare:

1. Microscop de cercetare MC9 2. Microscop Biorom 3. Condensoare de cmp ntunecat 4. Polarizor, analizor 5. Obiective de imersie 6. Obiective de contrast de faz 7. Lame cu diferite preparate

Modul de lucru: A. Observarea nucleilor celulelor -se aeaz lama cu preparat pe masua microscopului i se fixeaz cu ajutorul clreilor; -se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) i se localizeaz zona cu preparat; -se coboar m sua m icroscopului fr a deplasa preparatul; -se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00; -se aplic o pictur de lichid de imersie pe preparat (n dreptul obiectivului); -cu foarte m are atenie se coboar obiectivul p na ce se imer-seaz n lichid; -privind prin ocular se pune la punct imaginea. B. Determinarea depozitelor glucidice -se m onteaz la microscopul MC9 polarizorul i analizorul; -se fixeaz preparatul pe m su; -se pune la punct imaginea; -se deplaseaz n plan orizontal preparatul pe m su pn cnd se gsete o zona liber; -se rotete ncet polarizorul pn n momentul n care imaginea este maxim de ntunecat; -se aduce din nou preparatul n cmpul vizual; zonele lum inoase reprezint zonele n care se gsesc substane optic active. C. D eterm inarea ncrcturii biologice a apei -se m onteaz la m icroscopul B iorom condensorul i obiectivele de contrast de faz; -se nlocuiete un ocular cu ocularul de punere la punct; -din uruburile de punere la punct se centreaz sistem ul astfel nct inelul parial absorbant din obiectiv s corespund cu fanta inelar a condensorului; -se monteaz din nou ocularul m icroscopului; -pe o lam curat se pune o pictur de ap sttut (24h); -se fixeaz lam a la m icroscop i se caut observarea germenilor existeni n ap att prin tehnica de microscopie clasic ct i prin cea de contrast de faz.