Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cap6 - Ing Gen Drojdii
Cap6 - Ing Gen Drojdii
C A P. 6. T E H N I C I d e I N G I N E R I E G E N E T I C l a D R O J D I I
1
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii
LEU2
pBR322
ADN de drojdie
LEU2 LEU2
LEU2
pBR322 pBR322 pBR322
CEN
Fragment
ARS din plasmida 2 m
ARS
Vectori de clonare
A. Vectorii integrativi (YIp = Yeast Integrating plasmids) conin markeri selectabili pentru drojdii,
dar nu prezint secvene care s permit replicarea autonom a vectorilor n celula de drojdie.
Transformarea celulei de drojdie are loc n urma unui proces de integrare al plasmidei n genomul
drojdiei prin recombinare omoloag ntre o secven din cadrul plasmidei i regiunea corespunztoare
de la nivelul unuia dintre cromozomii drojdiei. Eficiena transformrii cu vectorii YIp este de numai 1
10 transformanig ADN.
n Fig. 6. 2 este reprezentat un vector din aceasta clas - YIp 5. Vectorul prezint:
- genele de rezisten la ampicilin i tetraciclin (ApR, TcR) care permit selecia transformanilor
(ampicilin rezisteni- tetraciclin sensibili);
- originea replicrii din plasmidul ColE1 (oriColE1) confer capacitate de replicare autonom n celula
bacterian;
- tulpinile de drojdie receptor sunt auxotrofe pentru uracil (ura3). Transformarea celulelor de drojdie
are loc prin integrarea vectorului la nivelul secvenei URA3 la locusul de omologie din cromosomul de
drojdie, celulele transformate revenind la starea de prototrofie pentru uracil.
ApR
ApR
TcR
TcR
YIp
YIp 55
5.5
5.5kb
kb
oriColE1
oriColE1
URA3
URA3
2
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
ori f1 (-)
ori f1 (+)
lac Z T3
Kpn I
ApR BssHII
MCS
Sac I
BssHII T7
URA3
oriColE1
ARS CEN
3
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii
fragment din
ApR
plasmida 2m
ori ColE1
YEp 24
7.7 kb
URA 3
TcR
Fig. 6. 4. Vectorul episomal YEp 24
Vectorii lineari (YLp) sunt prezeni ntr-o singur copie / celul i prezint la capete secvene
repetitive bogate n guanin de tipul 5(dG1-3dT)3, asemntoare secvenelor telomerice de la drojdii
sau ciliate. Aceti vectori sunt de aproximativ 100 ori mai puin stabili dect cromosomii obinuii, dup
10 generaii fiind prezeni n numai 20 40% dintre descendeni.
Civa dintre cei mai utilizai vectori de la drojdii sunt cuprini n Tab. 2.
4
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
Vectori de exprimare
Vectorii de exprimare permit transcrierea unui segment de ADN heterolog sub controlul unui
promotor aparinnd unei gene structurale. ntreaga regiune este alcatuit din:
secvenele reglatoare i un promotor puternic (fr codonul AUG de iniiere al traducerii);
situs pentru 1 - mai multe endonucleaze de restricie;
secvena terminator al transcrierii.
ADN heterolog poate fi clonat prin inserie n situsul pentru endonucleazele de restricie, fiind
astfel ncadrat ntre secvenele eseniale (promotor i terminator) ale unui proces de transcriere; n
urma procesului de transformare a unor celule de drojdie receptor cu vector recombinat, pot fi uor
obinute proteine heterologe.
Vectorii de exprimare sunt clasificai n funcie de tipul de promotor utilizat n:
1. vectori de exprimare cu promotori constitutivi;
2. vectori de exprimare cu promotori inductibili;
3. vectori de exprimare cu promotori hibrizi constitutivi/inductibili.
1. Un exemplu de promotor constitutiv utilizat n obinerea de vectori de exprimare la drojdii este cel al
genei pentru gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaz, enzim implicat n calea metabolic a glucozei
(Fig. 6. 5). Bitter i colab. (1984) au inserat acest promotor ntr-un vector de tip YEp i l-au utilizat
pentru clonarea i exprimarea genei pentru 1-antitripsin, protein heterolog reprezentnd, n final,
pn la 5% din totalul proteinelor celulare. Gena a fost inserat la nivelul unui situs multiplu de clonare
restictat cu endonucleaza de restricie BamHI. Ca secven semnal pentru terminarea transcrierii i
pentru poliadenilare a fost folosit segmentul de la captul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinaz (Fig.
6. 6).
G lu c o z a
G lu c o z o 6 - fo s fa t
F ru c to z o 6 - fo s fa t
F ru c to z o 1 ,6 - b ifo s fa t
D ih id r o x ia c e to n a G lic e ra ld e h id 3 - fo s fa t
g lic e ra ld e h id 3 - fo s fa t d e h id ro g e n a z a
P ir u v a t
A c e ta ld e h id a
a lc o o ld e h id ro g e n a z a
E ta n o l
2. Exprimarea genelor clonate n vectorii de drojdii ce prezint inserai promotori inductibili este
dependent de concentraia n mediul de cretere a drojdiilor a factorului inductibil, reprezentat, spre
exemplu, de ionii de cupru sau de metanol.
Utiliznd regiunea promotoare 5' a genei CUP1, gena codificatoare a metalotioneinei din
drojdii, a crei activititate este indus de prezena n mediu a ionilor de cupru, s-a reuit clonarea i
exprimarea genei pentru antigenul de suprafa a virusului hepatitei B. Celulele de drojdii transformate
cu plasmide purttoare a acestei gene produc cantiti mari de protein viral ce poate reprezenta
aproximativ 1-2% din totalul proteinelor celulare. Creterea drojdiilor transformate n fermentatoare
mari a facut posibil obinerea a 50 - 100 mg protein viral / litru de cultur. Proteina recombinant
obinut are un grad nalt de omologie cu cea natural, avnd proprieti similare cu cea izolat de la
pacieni infectai i este utilizat n prezent la vaccinarea contra hepatitei B.
5
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii
Un alt promotor inductibil utilizat intens este cel pentru gena codificatoare a alcool (metanol)
oxidazei, enzim implicat n prima treapt de degradare a metanolului n peroxizomii drojdiilor
metilotrofe. Promotorul genei pentru alcool oxidaz este inhibat de prezena n mediul de cultur a
glucozei i etanolului, este derepresat de glicerol i indus de metanol. Prezena promotorului respectiv
permite obinerea unor cantiti mari de protein heterolog (pn la 35% din totalul proteinelor
celulare) de mare puritate.
PGPD
gena pentru
1 - antitripsina
ApR
capat 3' PGK
LEU 2
ori ColE1
fragment
din plasmida 2 m
(include ARS)
3. n unele cazuri proteinele heterologe obinute pot fi toxice pentru celula de drojdie determinnd rate
sczute de cretere. n scopul ameliorrii procesului de obinere a compuilor respectivi s-au construit
o serie de vectori care conin promotori hibrizi constituvi / inductibili a cror funcionare nu este
simultan.
Astfel, interferonul este toxic pentru celula de drojdie. Cu toate acestea a fost posibil
clonarea genei pentru interferon n drojdii i exprimarea ei cu ajutorul unor vectori ce prezentau un
promotor hibrid format din secvena 5' a promotorului genei pentru gliceraldehid-3-fosfat
dehidrogenaz n care a fost inclus secvena activatoare tip enhancer (UAS - upstream regulating
sequence) a genei GAL 10 ce codifica pentru galactoepimeraz (UASG) (Fig.6. 7). Funcionarea
UASG este indus de prezena n mediul de cultur a galactozei (nivelul de exprimare a genei crete
de aproximativ 1000 ori) i este inhibat de prezena glucozei, nivelul de exprimare a genei GAL 10
fiind de 1000 - 2000 ori mai mic n aceste condiii. Celulele de drojdie sunt crescute iniial pe mediu cu
glucoz ceea ce asigur obinerea unei densiti celulare mari, nivelul de exprimare a genei pentru
interferon fiind foarte sczut la fel ca i eventualul efect toxic al interferonului. n etapa urmtoare
celulele sunt trecute pe mediu cu galactoz ca surs unic de carbon, rezultatul fiind activarea UASG
i transcrierea genei pentru interferon , ajungndu-se, n final, la circa 2g interferon / litru de cultur.
Un exemplu asemntor l reprezint cel al clonrii i exprimrii genei pentru factorul de
cretere epidermal necesar pentru regenerarea esuturilor. n acest caz, secvena activatoare UASG a
fost nlocuit cu promotorul genei ADR2, gena structural a alcooldehidrogenazei citoplasmatice ADH
II. Promotorul genei ADR2 este inactivat de concentraiile mari de glucoz din mediul de cultur i
este indus de scderea concentraiei acesteia. Dup creterea celulelor de drojdie pe mediu bogat n
glucoz i atingerea densitii celulare optime, odat cu consumarea glucozei din mediu, are loc
activarea promotorului ADR2 sub influena cruia are loc exprimarea genei pentru factorul de cretere
epidermal. Produsul obinut prezint o structur identic cu cea a hormonului izolat din celulele
umane.
6
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
UASG
PGPD
gena pentru
interferon
ApR
capat 3' PGK
LEU 2
ori ColE1
fragment
din plasmida 2 m
(include ARS)
Vectori de secreie
Drojdiile pot fi manipulate genetic pentru producerea de proteine care sunt secretate n mediu
utiliznd vectori de secreie. Polipeptidele secretate de celulele eucariote sunt sintetizate sub forma
unui precursor cu un capt amino-terminal extins, precursor care sufer mai multe modificri ce includ
procese de clivare proteolitic, formarea unor puni disulfurice i, eventual, O- sau N-glicozilri, n final
rezultnd forma matur a proteinei.
La drojdii s-au folosit diverse secvene semnal pentru direcionarea secreiei n mediu a
proteinelor heterologe. Dintre acestea amintim secvena semnal a factorului killer, cea a genei pentru
proteaz alcalin extracelular (XPR2) n cazul drojdiilor capabile s degradeze n-alcanii, i secvena
semnal (pre-prosegmentul precursorului) a factorului de mperechere. Aceasta din urm este
reprezentat de regiunea amino-terminal de 85 de aminoacizi a produsului genei MFa1 i se termin
cu un situs dibazic Lys-Arg recunoscut de endoproteaza numit kexin care cliveaz la acest nivel
produsul primar de traducere n cursul procesrii spre forma matur.
Proteinele heterologe secretate de celulele de drojdie manipulate genetic sunt proteine de
fuziune care ncep cu pre-prosecvena MF1 i continu cu proteina propriu-zis. n cele mai multe
cazuri polipeptida ce urmeaz a fi secretat flancheaz situsul dibazic de clivare, astfel nct n urma
aciunii kexinei se elibereaz proteina de interes.
7
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii
ori f1 ori f1
ori
ApR ARS2m ARS2m
p lacZ' URA3
URA3
URA3
HindIII
TcR
Componenta reaciei A B C D
Ap distilat steril 26 l 26 l 23 l 23 l
Tampon pentru Hind III 4 l 4 l 4 l 4 l
[10 X]
ADN plasmidial YEp24 6 l 6 l - -
[1,5 g ADN/l]
ADN plasmidial pBluescript SK+/- - - 10 l -
[2 g ADN/l]
ADN fag (dilutie 1:5) - - - 10 l
Hind III [10U/l] 2 l 2 l 3 l 3 l
Fosfataz alcalin [1U/l] 2 l - - -
Volum total: 40 l 40 l 40 l 40 l
8
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
probele de ADN restrictat, cte 5 l din probe reprezentate de ADN plasmidial de YEp24 i pBluescript
SK +/- nedigerat (folosite ca markeri pentru reaciile de restricie), 5 l ADN plasmidial E. coli V517
scala de plasmide. Restul de 20 l din probele de digestie vor fi folosii n etapa urmtoare ligarea
fragmentelor i obinerea noului vector pBY. Probele se las la migrat la un voltaj de 2.5 3 V/cm.
Componenta reaciei L1 L2 L3 L4
ap distilat steril 3 l 11 l 2 l 2 l
tampon de ligare (10X) 2.5 l 2.5 l 1 l 1 l
Reacia A 10 l - - -
(YEp24/Hind III + AP)
Reacia B - 5 l - 5 l
(YEp24/Hind III)
Reacia C 5 l 2 l 5 l -
(pBlue/Hind III)
ATP (10 mM) 2.5 l 2.5 l 1 l 1 l
ADN ligaz de fag T4 2 l 2 l 1 l 1 l
(diluie 1 :2 n tamponul de ligare)
Volum total 25 l 25 l 10 l 10 l
9
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii
Protocol de lucru
Tulpina receptor folosit este S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2)
Vector shuttle utilizat pentru transformare: YEp24
Se realizeaz o cultur de S. cerevisiae Ts5 n YPG lichid i se incubeaz 18 ore la 28oC. 1,5
ml cultur se centrifugheaz 5 minute la 6500 rpm. Supernatantul se arunc, iar sedimentul celular se
resuspend n 1 ml soluie TELI , pH 8.0 i se incubeaz 30 minute la 30oC. Din suspensia format se
repartizeaz cte 200 l n 5 tuburi Eppendorf (de 1,5 ml). n fiecare dintre cele 5 tuburi se adaug
cte 20 l ADN carrier. n 4 dintre tuburi se adaug i cte 40 l extract vector (tubul nr.5 va fi notat ca
Martor). Se incubeaz 30 min la 30oC. Dup agitare la vortex, n fiecare dintre cele 5 tuburi se adaug
cte 200 l soluie TELI-PEG. Se incubeaz 20 minute la 30oC, apoi 10 minute la 42oC.
Din fiecare tub se nsmneaz pe cte 2 placi Petri (100 l/plac) cu mediu YNB-leu-
glucoza i se incubeaz 48 ore la 28oC.
Medii i soluii
Mediu YPG
Mediu YNB-leu-glucoza : yeast nitrogen base 0.67 % ; sulfat amoniu 0.5 % ; glucoza 2.0 % ;
agar 2.0 % ; leucin 3 mg/l
soluie TELI - pH 8.0 : Tris 10 mM; EDTA 1 mM ; LiCl 50 mM
soluie TELI-PEG : 25 ml soluie TELI + 40 % polietilenglicol 6000
Protocol de lucru
Tulpina receptor utilizat este Saccharomyces cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2).
ADN transformant este reprezentat de ADN vector YEp24
10
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
1,5 ml cultur de S. cerevisiae Ts5 n mediu YPG, n faz logaritmica de cretere (18 ore) se
centrifugheaz 6 minute la 6000 rpm. Sedimentul se resuspend n 1,5 ml soluie glicerol 20%, se
citete la spectrofotometru absorbana la = 650 nm i se calculeaz densitatea celular. Se
determin concentraia ADN de YEp 24 prin citirea A260.
Pentru electroporare se realizeaz 10 probe folosind camere de electroporare de 2 mm3,
fiecare prob fiind format din : 200 l suspensie celular i 20 l ADN transformant. Se realizeaz i
un Martor care are aceeai compoziie ca probele dar nu este supus curentului electric. Cele 10 probe
sunt suspuse electrotransformrii la diverse intensiti ale cmpului electric (kV/cm): 0.250; 0.500;
0.750; 0.870; 1.000; 1.125; 1.250; 1.375; 1.500; 1.625. Pentru toate probele curentul electric este
reprezentat de pulsuri bipolare de cte 10 sec, cu pauze de cte 10 sec, durata total a trenului
fiind de 22 msec. Dup electroporare, din fiecare cuv se iau 100l i se aduc 1000 l cu YPG, se
incubeaz 2 ore la 30oC. Se realizeaz diluii zecimale n funcie de densitatea celular a suspensiei
citit iniial i din ultimele 2 diluii se nsamneaz 0.1 ml pe plci cu YNB suplimentat cu leucin .
Dup incubarea plcilor 72 ore la 30oC, se numr coloniile de electrotransformani i se
calculeaz frecvenele i eficienele de transfomare pentru cele 10 probe. Ca martor sunt nsmnate
celulele ce nu au fost supuse electroporrii, pe mediu complet (YPG). Eficiena transformrii este
estimat prin raporarea numrului de celule transformate la numrul de celule martor.
11
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii
Lucy (1984) a presupus ca evenimentul central n procesul de fuziune membranar este interaciunea
i fuziunea bistraturilor lipidice ale celor dou membrane, proces n care proteinele nu intervin. PEG i
Ca2+ determin deshidratarea membranelor i schimbarea permeabilitii datorit dezorganizarii locale
a bistraturilor lipidice. Prin reducerea repulsiei electrostatice i a forelor de hidratare a lipidelor apare
un contact strns ntre bistraturile lipidice. Lipidele celor dou bistraturi se unesc, fapt ce implic
pierderea temporar a configuraiei bistratificate n punctul de fuziune. n final, cele dou bistraturi
fuzioneaz i se produce restabilirea structurii normale a plasmalemei. Conform altor cercetatori, ionii
Ca2+ intervin n fuziune prin creterea intracelular a concentraiei Ca2+ i activarea unor enzime ce
determin dezorganizarea lipidelor. Astfel, s-a presupus c n cazul fuziunii mioblastelor, spre
exemplu, ionii Ca2+ activeaz fosfodiesteraza ce determin ruperea bistraturilor lipidice (Fig. 6.11
c,d).
Electrofuziunea reprezint o alt tehnic de fuziune a protoplatilor. n esen, metoda const
n expunerea protoplatilor unui cmp electric pulsatoriu de intensitate nalt i de scurt durat. n
aceste condiii, se realizeaz o rupere local a membranelor care devin astfel permeabile. Procesul
este reversibil. n timpul fuziunii se formeaz ntre membranele celor dou celule puni lipidice, astfel
nct cele dou membrane se refac mpreun n zona de contact. Punile formate determin apariia
unor pori cu diametrul foarte mic, fapt care are ca rezultat apariia unei tensiuni de suprafa foarte
nalt. Etapa urmtoare const n fuziunea celulelor ntr-o sfer.
n realizarea fuziunii, se pornete, de regul, de la tulpini de laborator ce prezint markeri
biochimici de auxotrofie, fapt ce uureaz izolarea ulterioar a produilor de fuziune. Prin fuziunea de
protoplati sunt depite barierele sexuale ce mpiedic realizarea ncrucirilor ntre tulpinile de
drojdii ce aparin aceluiai tip de mperechere ( x , a x a). Fenomenul de reversie a protoplatilor de
drojdii presupune parcurgerea a dou etape: (1) formarea unui nou perete celular i (2) realizarea
mitozei i citochinezei i repetarea ciclului celular. S-a pus problema dac peretele celular este
sintetizat de novo sau este necesar existena unui model supramolecular (resturi ale peretelui celular
iniial), primer pentru sinteza noului perete. Cercetrile de microscopie electronic utiliznd tehnici de
fluorescen i criodecapaj, au adus dovezi n sprijinul ipotezei privind sintetizarea de novo a peretelui
celular. Reversia la starea celulei iniiale este un proces gradat, determinat genetic, ce presupune
existena ctorva generaii de revertani. Iniierea reversiei este marcat de desfurarea primei
citochineze care se realizeaz imediat ce peretele celular a fost complet regenerat. Regenerarea
protoplatilor la drojdiile din genul Saccharomyces se realizeaz pe medii solide cu gelatin, agar sau
polietilenglicol (Fig. 6.11 - d).
n ceea ce privete produii de fuziune, descendena hibrizilor selecionai pentru
complementaia markerilor de auxotrofie sau pentru markeri de rezisten, poate fi caracterizat
pentru confirmarea originii hibride prin: (1) sporulare i segregare meiotic sau segregare mitotic, (2)
stabilirea fuziunii nucleare - formarea de heterocarioni sau homocarioni, (3) stabilirea gradului de
ploidie.
1. Segregarea meiotic i mitotic. La tulpinile de drojdii ce prezint sporulare i meioz (S.
cerevisiae MAT a/) se poate realiza analiza tetradic i, implicit, stabilirea constituiei genetice a
descendenei produilor de fuziune. n experimentele de fuziune de protoplati s-au utilizat ns, i
tulpini de laborator de S. cerevisiae heterotalice de acelai tip de mperechere (fuziuni de tipul a x a,
sau x ), sau tulpini industriale ce nu prezint sporulare i meioz. Urmrind capacitatea de
sporulare i mperechere a produilor de fuziune / sau a/a, s-a constatat c acetia sunt deficitari n
sporulare, dar prezint capacitate normal de mperechere (a/a x /), iar descendenii, dup
sporulare, pot fi analizai genetic. n absena capacitii de sporulare se poate iniia pierderea
cromozomilor n mitoz (haploidizare) cu acriflavin, radiaii ultraviolete, nitrosoguanidin, etc. Prin
aceast metod a fost indus seregarea parentalilor i a recombinanilor la Saccharomyces
cerevisiae, Candida tropicalis i Hansenula polymorpha, fapt ce a permis analiza ulterioar a
descendenilor i, implicit, caracterizarea produilor de fuziune.
2. Formarea heterocarionilor i a homocarionilor. n urma fuziunii de protoplati se pot obine
heterocarioni, heteroplasmoni sau hibrizi. Prima etap ce urmeaz fuziunii protoplatilor aparinnd la
dou tulpini diferite de drojdii este formarea heterocarionilor multinucleai. S-a stabilit ca la S.
cerevisiae, n urma fuziunii de protoplati apar cu o frecven mare celule poliploide. De asemenea,
este posibil s se obin produi de fuziune pornind de la trei parentali haploizi diferii. Aceste rezultate
demonstreaz c produsul de fuziune conine 2 sau mai multi nuclei. n aceast faz se realizeaz
ns, intermixarea citoplasmatic i, probabil, fuziunea unora dintre nuclei. Numrul de nuclei per
produs de fuziune poate fi determinat prin colorare cu acridin orange, DAPI sau Giemsa.
3. Gradul de ploidie al produilor de fuziune poate fi determinat prin metode diferite. La
drojdiile ce sporuleaz, de tipul S. cerevisiae a/, se poate aplica analiza tetradic. O alt metod
const n stabilirea gradului de ploidie prin msurarea cantitii de ADN din celul. La unele drojdii,
12
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator
ploidia poate fi estimat i prin msurarea dimensiunii celulei. Se poate aprecia gradul de ploidie i pe
baza viabilitii sporului, innd cont de faptul ca triploizii produc spori cu o viabilitate scazut.
Prin combinarea acestor metode de analiz s-a demonstrat ca produii de fuziune de la S.
cerevisiae, provenii de la dou sau mai multe tulpini haploide sunt predominant diploizi, dar pot s
apar cu frecven mare i triploizi sau tetraploizi. De asemenea, au fost identificai i produi
aneuploizi. Apariia acestora demonstreaz faptul c, ntre nucleii heterocarionului se poate realiza
transferul unor cromosomi individuali, ntr-o manier similar cu cele observate n producerea de
citoductani (Fig.6.11).
Parte experimental
Pentru fuziunea de protoplati se folosesc urmtoarele perechi de tulpini de drojdii :
A B
S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) x S.cerevisiae D-585-11c (a lys)
S.cerevisiae 17/17 ( his) x S.cerevisiae 9744 ( leu2)
R
S.ellipsoideus Ni (Ni 7mM) x S.cerevisiae SMR4 CdR (Cd 0.8 mM)
R
H.polymorpha Ni (Ni 7mM) x H.anomala CdR (Cd 0.8mM)
a b c
d
e
Fig. 6.11. Aspectul celulelor de drojdie n timpul protoplastizrii, fuziunii si reversiei protoplatilor
a. ultrastructura celulei de S. cerevisiae (25000 x); b. ultrastructura protoplatilor de S. cerevisiae (24600 x) ; c. aglutinri ale
2+
protoplatilor de S. cerevisiae induse de PEG n prezena Ca (20500 x) ; d. diferenierea unor puni citoplasmatice ntre
protoplati adiaceni la S. cerevisiae (31500 x) ; e. aspectul celulelor de S. cerevisiae dup reversia protoplatilor (17600 x).
13