Metode de analiză a amidonului,

enzimelor și hidrolizatelor de amidon

Cercetător post-doctorand
Dr. Ing. Monica MIRONESCU
Tutore
Prof. Dr. Biol. Letiția OPREAN
Obţinerea produşilor de bioconversie
enzimatică a amidonului
Surse de amidon:
Cartof, porumb, grâu
...
Reziduuri alimentare

Amidon

Gelatinizare

Lichefiere Enzime de lichefiere

Bioconversia
Amidon lichefiat / Maltodextrine enzimatică
Enzime de zaharificare

Zaharificare

Hidrolizate de amidon (siropuri de glucoză, maltoză)

Enzime de inversie

Siropuri de fructoză
Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon

Metode de analiză a amidonului
• Determinarea caracteristicilor fizico-chimice;

– Umiditatea, pH-ul, conținutul amidon, proteine, lipide, cenușa,

caracterul reducător;

– Determinarea capacităţii de îmbibare (de reținere a apei) a

amidonului;

– Determinarea solubilităţii amidonului la diverse temperaturi;

• Comportamentul reologic a amidonului și determinarea capacităţii

amidonului de formare a gelului;

• Analiza cromatografică a amidonului;

• Analiza microscopică a granulei de amidon

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor
12 8

porumb 7 porumb
10
cartof 6 cartof
8
5

6 4
%

3
4
2
2
1

0 0
Umiditate, % pH la 20°C
 Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor
91 0,4

porumb porumb
90,5 0,35

cartof cartof
90 0,3

89,5 0,25

89 0,2
%

%
88,5 0,15

88 0,1

87,5 0,05

87 0
Amidon, % Cenuşă, %
 Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor
1,2

porumb
1
cartof

0,8

0,6
%

0,4

0,2

0
Caracter reducător, %
Capacitatea de îmbibare a amidonurilor
Capacitatea de îmbibare, %
Amidon
50oC 60oC 80oC 90oC

Porumb 2,2 ± 0,2 2,9 ± 0,16 11,9 ± 0,12 15,3 ± 0,18

Cartof 3,0 ± 0,15 18,0 ± 0,15 36,5 ± 0,14 100 -0,08

Comportamentul reologic
• Curba de viscozitate
104 100

103 90

80
102
III V
70
101 IV
η, T, °C
Pa. 60
s 100
II
50
10-1
40

10-2
I
30

10-30 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
20
Time, s
Curbe de viscozitate pt. amidon porumb Cerestar C*Gel
3
10 80

°C

Pa·s 75

2
10 70

65
Cerestar 25% 75°C 30s-1 1

ST 24
1
10 60
η Viskosität

T Temperatur
55
Cerestar 25% 75°C 30s-1 2

ST 24
0
η 10 50 T η Viskosität

T Temperatur

45 Cerestar 25% 75°C 30s-1 3

ST 24

-1 η Viskosität
10 40
T Temperatur

35

-2
10 30

25

-3
10 20
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 s 1.000
Zeit t

Anton Paar GmbH

Curbe de viscozitate pt. amidon porumb Cerestar C*Gel

4
10 80

°C
Pa·s
75
Cerestar 25% 75°C 30s-1 2
3
10 ST 24
70
η Viskosität

T Temperatur

2 65 C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1

10
ST 24

η Viskosität
60
T Temperatur
1
10 C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 2
55
ST 24
η T
η Viskosität

50 T Temperatur
0
10 C*Gel 50% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1

ST 24
45
η Viskosität

-1 T Temperatur
10 40
C*Gel 50% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 2

ST 24

35 η Viskosität
-2 T Temperatur
10

30

-3
10 25
0 200 400 600 800 s 1.000
Zeit t
Anton Paar GmbH
Măsurători dinamice de viscozitate Rheoplus

2 3
10 10

Pa

1
10 Pa·s

0 2
10 10

C*Tex 40% freq sweep winkel 0,5 2

-1 CP 50-2
10
G' Speichermodul

G'' Verlustmodul

-2 | η*| Betrag(Viskosität)
10 10
Remy B7 40% freq sweep winkel 0,5 1

CP 50-2
G'
-3
G' Speichermodul
10 |η*|
G'' Verlustmodul
G''
| η*| Betrag(Viskosität)

C*Gel 50% freq sweep winkel 0,5 7

-4
10 1
CP 50-2

G' Speichermodul

G'' Verlustmodul
-5
10 | η*| Betrag(Viskosität)

-6
10 0,1

-7
10

-8 -2
10 10
-2 -1 0 1 2
10 10 10 10 1/s 10
Kreisfrequenz ω

Anton Paar GmbH

 SEC

Analiza cromatografică a amidonului prin SEC

- Coloana umplută cu un material (faza statică)
- Eluentul (faza mobilă)
- Proba (Componente cu M diferite)

Separare după volumul

hidrodinamic

Vh = f( Masa moleculară,
conformaţie)
Vh = [η]*M

Detaliu separare
SEC a amidonului de porumb
100

80 1b

60
RI output signal (volt)

40
Ib
20

0
IIb
-20 IIIb
IVb

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Elution time, min.
Caracteristicile metodei: eluent DMSO; vol. injecţie 50 µl; temperatura 60oC; rata
de curgere eluent 0,4 ml/min (Mironescu, 2007)
Analiza microscopică a amidonului

Granule de amidon de cartofi Granule de amidon de porumb

Analiza microscopică a amidonului
30oC 60oC 70oC

90oC
Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon

Metode de analiză a enzimelor
amilolitice
• Metode de det. a activităţii enzimatice
– Principiul general de determinare: dozarea
substratului rămas sau a produşilor formaţi
Activitatea enzimatică
• UI =numărul de micromoli de substrat transformat sau de
produs rezultat pe minut în condiţii bine definite.

– când substratul este amidon (cu MM nedefinită), se produce

un amestec de oligozaharide

UI : numărul de micromoli de legături

hidrolizate pe minut.
Det. numărului grupărilor reducătoare
• A- metode colorimetrice;
• B- metode cromatografice;
• C- metode enzimatice;
• D- metode fizice;
• E- metode de dozare volumetrică.
Det. numărului grupărilor reducătoare
prin metode colorimetrice
• Metode ce folosesc 3 reactivi:
– cupru alcalin
– fericianură alcalină
– 3,5 dinitrosalicilat alcalin (Metoda Miller)

• Tb. specificat sustratul folisit pt. det. activităţii enzimei:

– amidon nativ, amidon solubil, amiloză, dextrine limită
– compuşi speciali: pentazaharidul substituit la ambele capete cu
indol şi naftalen (INdp5)
Det. numărului grupărilor reducătoare
prin metode colorimetrice
• Determinarea activităţii enzimatice la α-amilaze
cu micrometoda cu cupru 2,2” bicinchoninate
(Yook and Robyt, 2002)

– Substrat: amidon
– Citirea absorbţiei la 570 nm
– Etalon: maltoza
– UI: µl de legături glucozidice rupte pe minut
Det. numărului grupărilor reducătoare
prin metode colorimetrice
• Determinarea activităţii α-amilazei exprimată în
Kilo Novo unit (KNU) (Legin,1998)
– Substrat: p-nitrofenil α-D–glucopiranozid (pNPG)

– măsurarea la 405 nm a p-nitrofenolului (pNP) eliberat de către

enzimă.

– O unitate de activitate α-glucozidazică = cantitatea de

enzimă care eliberează un µmol de pNP pe minut.
Det. numărului grupărilor reducătoare
prin metode fizice
• Determinarea numărului de legături hidrolizate prin
măsurări de osmolaritate (Marchal,1999)
– Echivalentul de Dextroză (DE) :
DE= MMglucoză x 100 / MMmedie_ hidrolizat de amidon

– DE teoretic: DE= 0,18 x100/(dwkgapă / osm)

– Măsurarea osmometrică:
18(osmm − osmo )(1 − dw0 )
DE =
dw0 + 18 ⋅10 −3 (osmm − osm0 (1 − dw0 ))
Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon

Metode fizice de analiză a amidonurilor
Siropuri de hidrolizate de amidon Unghiul de rotaţie
cu valori DE diferite specifică
15,1 162,8
18,8 168,3
25,2 159,8
32,8 152,6
36,7 146,8
41,8 139,9
48,8 130,0
55,2 105,8
67,2 97,0
Met. chimice de analiză a amidonurilor
• Determinarea echivalentului dextroză DE
folosind metoda Luff -Schoorl

2Cu2+O + R – CHO Cu+2O + R - COOH

2Cu2+SO4 + 4KI- 2 Cu+I + I02 + 2K2SO4

l02 + 2 Na2S-42O3 2 Na2S-64O6 + 2 NaI-

Metode cromatografice de analiză a
amidonurilor: SEC
1,0 D-Glucoza
D-Maltoza
Saccharose
Zaharoza
D-Glucose

DOC-Detektorsignale
Dextran 5x103 Da
Condițiile de lucru: 0,8 D-Maltose

semnalului
Dextran 5x104 Da
Dextran 5000
Dextran 1,5x105 Da
Dextran 50.000
‒eluent apa+tampon fosfat; 0,6 Dextran 106 Da
Dextran 150.000
Pullulan 106 Da
Dextran Blau

DOC
Xanthan 1,2x106 Da
Pullulan
Pullulan
‒rata curgere 0,1 ml/min; Intensitatea
Xanthan
0,4

‒coloană TSK 50S

0,2
‒Vol. injecție 100 µl
0,0
0 5 10 15 20 25 30 35
Elutionsvolumen in mL
Timpul de eluţie, min.

Cromatograma obţinută la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi

monozaharide cu mase moleculare diferite. (Mironescu şi colab., 2004)
 SEC
5,0E+03
A B
1,1E+06

4,0E+03
8,5E+05
Masa moleculară. Da

Masa moleculară, Da
3,0E+03
6,5E+05

2,0E+03
4,5E+05

y = -575376x + 8E+06 y = -1430,7x + 29132

2 1,0E+03 2
2,5E+05 R = 0,8684 R = 0,9899

5,0E+04 0,0E+00
11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21

Timpul de retenţie, min. Timpul de retenţie, min.

Curbele etalon obţinute la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi
monozaharide cu mase moleculare diferite. A) Compuşi cu masă moleculară mare.
B) Compuşi cu masă moleculară mică (Mironescu şi colab., 2004)
 DP2
Det. DE și DP prin HPLC
• DE = DP1 + 0,63.DP2 + DP3
DP4+
0,4.DP3 + 0,18.DP4+

DP1

Caracteristicile metodei: eluent apă; vol. injecţie 100 µl; temperatura 96oC; rata
de curgere eluent 0,5 ml/min (Mironescu et al., 2007)