Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
3958 Curs 14 Ingineria Genetica Si Biotehnologiile Moderne PDF
3958 Curs 14 Ingineria Genetica Si Biotehnologiile Moderne PDF
In tehnologia ADN recombinat un rol cu totul deosebit il are un set de enzime care au facut
obiectul unor decenii de cercetare privind metabolismul acizilor nucleici.
In tabelul nr.2.I sunt prezentate enzimele care intervin in metabolismul acizilor nucleici si care
sunt adevarate instrumente de cercetare in acest domeniu.
Dintre enzimele prezentate in tabelul nr.2.I, in mod particular, doua tipuri de enzime stau la baza
metodei generale de a izola si propaga o molecula de ADN recombinat.
1
Tabelul 2.I
In primul rand, endonucleazele de restrictie scindeaza (taie) molecula de ADN cand recunosc
anumite secvente specifice pentru a genera un set de fragmente de ADN mai mici.
In al doilea rand, fragmentul de ADN de clonat este izolat si legat de alt fragment de ADN care
este vectorul de clonare folosindu-se ADN ligaze.
Vectorul recombinat este apoi introdus intr-o celula gazda care il cloneaza pe masura ce celula
trece prin numeroase generatii de diviziune celulara.
2
3.2. ETAPELE TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINAT
Tehnologia ADN recombinat implica parcurgerea unor etape esentiale care sunt prezente in
continuare.
I. Obtinerea in vitro a unei plasmide himerice
Aceasta etapa presupune utilizarea unor metode specifice de pregatire atat a vectorului cat si a
genei de interes in vederea inserarii genei in vehicul.
Vectorul de clonare este izolat prin metode specifice si apoi clivat intr-un singur loc cu o enzima
de restrictie ( aceeasi endonucleaza folosita la izolarea genei). Clivarea produce deschiderea
vectorului (plasmidei) care este transformat dintr-o molecula circulara intr-o molecula liniara, avand
doua capete ce pot interactiona cu gena.
Gena de interes este izolata cu ajutorul enzimelor de restrictie sau sintetizata prin una din
metodele descrise mai sus.
Vectorul si gena astfel pregatite se asociaza spontan in vitro pe baza complementaritatii
capetelor coezive. Prin interventia unei ADN ligaze se restabileste continuitatea structurala
covalenta prin formarea de legaturi fosfodiesterice intre fragmentele de ADN. Rezultatul este
obtinerea unei plasmide himere, o structura circulara bicatenara in care este inserata gena de interes.
Eficienta cuplarii genei de vector poate fi marita prin modificari structurale ale vectorului si/sau
genei, ca de exemplu:defosforilarea vectorului, sinteza de capete coezive pe plasmida si pe
fragmentul ADN de inserat, atasarea de linkeri.
3
Multe metode sunt insa bazate pe utilizarea sondelor moleculare, ca de exemplu ARNm codat
de gena de interes, marcat radioactiv. Coloniile continand segmente de ADN neidentificate sunt
transferate pe filtre speciale (nitroceluloza) care au proprietatea de a fixa ADN. Celulele sunt lizate
in situ, ADN denaturat si filtrele sunt plasate in contact cu o solutie continand ARNm. Daca o
colonie contine plasmide asociate genei corespunzatoare, ARNm se ataseaza de ADN genei si
colonia astfel marcata este vizualizata prin autoradiografie (tehnica hibridizarii acizilor nucleici).
Tinand cont de complexitatea sintezei insulinei in pancreas, obtinerea insulinei umane cu ajutorul
bacteriilor reprezinta intr-adevar o realizare deosebita. Trebuie precizat ca insulina produsa de
bacteriile modificate este absolut identica cu insulina umana pancreatica.
Exista in momentul de fata doua procedee de obtinere a insulinei umane cu ajutorul bacteriilor
modificate prin tehnologia clonarii genelor.
Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei, sintetizate
chimic, iar al doilea pe clonarea ADNc corespunzator proinsulinei.
In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E.coli.
A. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic
Din structura insulinei mature s-a dedus structura genelor corespunzatoare in baza echivalentelor
dictate de codul genetic.
In acest fel s-a stabilit ca pentru catena A a insulinei sunt necesare 63 de nucleotide inlantuite in
mod specific, iar pentru catena B 90 de nucleotide cuplate. Proiectul sintezei celor doua gene a mai
4
prevazut atasarea la capetele lor a unor nucleotide care sa asigure, pe de o parte, cuplarea corecta a
genelor de vector si, pe de alta parte, prezenta semnalelor necesare pentru pornirea si oprirea exacta
a transcrierii genelor [50, 73, 74].
Pentru cuplarea corecta s-a prevazut adaugarea a 12 nucleotide, dintre care 6 asigura jumatate din
situsul enzimei de restrictie EcoRI, iar celelalte 6 nucleotide jumatate din situsul enzimei de
restrictie BamHI (figura nr.3.6).
La randul ei, pornirea este realizata de codonul ATG plasat la inceputul genei intre situsul
enzimei EcoRI si gena structurala; oprirea transcrierii este asigurata de doi codoni (TAA si TAG)
plasati intre capatul genei structurale si situsul enzimei de restrictie BamHI.
Gena A a fost obtinuta din 12 oligodeoxinucleotide sintetizate chimic prin metoda
fosfotriesterilor, iar gena B a fost obtinuta din 18 oligodeoxinucleotide diferite sintetizate prin
aceasi metoda chimica. Cele doua gene corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei mature au
fost apoi inserate independent de cate un vector de clonare genetica prevazut cu elementele de
control ale operonului lac.
Moleculele de ADN recombinat rezultate au fost utilizate pentru transformarea celulelor de
E.coli.
In celulele transformate ADN recombinat se replica. Sub controlul elementelor de reglaj ale
operonului lac se sintetizeaza complexul β-galactozidaza-catena A a insulinei in celulele
transformate cu ADN recombinat continand gena A si complexul β-galactozidaza-catena B in
celulele transformate cu ADN recombinat continand gena B a ainsulinei.
In final, cele doua catene ale insulinei sunt detasate de β-galactozidaza cu ajutorul unui reactiv
chimic (BrCN) care actioneaza asupra metioninei situata exact la locul de jonctiune dintre cele doua
componente [73.96].
Dupa purificare, cele doua catene se amesteca si, prin simpla oxidare cu aer, ele se cupleaza prin
legaturi disulfurice, dand nastere insulinei, care este identica atat structural cat si functional cu
insulina umana.
In figura nr.3.6 sunt prezentate schematic etapele principale privind obtinerea insulinei umane cu
ajutorul tehnologiei ADN recombinat folosind genele catenelor A si B sintetizate chimic.
5
5.FORMULARI FARMACEUTICE ALE INSULINEI UMANE RECOMBINATE
La inceput produsele cu insulina solubila au fost formulate in solutii de pH acid care din punct de
vedere chimic deveneau instabile. In aceste formulari vechi a fost identificat un proces de
dezamidare considerabil la nivelul asparaginazei din pozitia 21 a lantului A si a fost observata
pierderea activitatii biologice pe parcursul unei conservari prelungite in conditii de pH acid.
Eforturile facute pentru a ameliora stabilitatea chimica a acestor formulari solubile a dus la
conceperea solutiilor neutre, stabilizate cu zinc. In formularile simple (normale) neutre, insulina
este stabilizata chimic prin adaugarea de zinc (~0.4%) si conservanti fenolici.
Cuplarea acestor excipienti mareste stabilitatea insulinei prin inducerea formarii unor structuri
hexamerice specifice.
Formularile normale (simple) neutre numite INSULINA REGULAR prezinta o activitate maxima
a insulinei dupa 2-3 ore, cu o durata maxima de 6-8 ore.
Ca si in cazul altor formulari, variatiile intervenite in relatia timp-actiune pot fi atribuite factorilor
urmatori: doza, locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului.
In pofida starii solubile a insulinei, in aceste formulari s-a observat o intarziere a declansarii
actiunii. Aceasta intarziere a fost atribuita timpului necesar hexamerului pentru a disocia in dimeri
si/ sau monomeri inaintea absorbtiei prin membrane biologice. Aceasta disociere necesita
difuziunea conservantului si a insulinei de la locul de injectare, diluarea efectiva a proteinei si
deplasarea echilibrului de la hexameri la dimeri si monomeri (figura nr. 3.8).
Au fost elaborati analogi monomerici ai insulinei in scopul obtinerii unui raspuns mai natural la
cresterile post-prandiale ale concentratiei glucozei.
Elaborarea analogilor monomerici ai insulinei pentru tratamentul diabetului zaharat (diabetes
mellitus) dependent de insulina s-a facut cu scopul evitarii proprietatii de autoasociere a insulinei si
deci de a reduce intarzierea intervenita in relatia timp-actiune.
A fost elaborat un asemenea analog monomeric, INSULINA LISPRO care prezinta un profil mai
rapid al relatiei actiune-timp, avand o activitate maxima dupa aproximativ o ora .
In afara formularilor rapide mentionate mai inainte, fabricantii au conceput formulari solubile
care sa fie utilizate in pompe externe sau implantate. In majoritatea privintelor, aceste formulari
sunt foarte asemanatoare cu INSULINA REGULAR (simpla sau normala in cea ce priveste starea
de asociere hexamerica, conservantul si zincul); cu toate acestea in formularile respective pot fi
inclusi: agenti de tamponare si/sau surfactanti pentru a reduce agregarea fizica a insulinei care poate
determina astuparea tubului pompei.
In sistemele de pompare mai vechi s-a folosit pentru pompele externe o tubulatura permeabila la
gaz. In consecinta s-a incorporat in formulare un agent de tamponare in scopul de a reduce
modificarile de pH provocate de dioxidul de carbon dizolvat, care ar putea duce la precipitarea
insulinei.
Progresele facute in domeniul formularilor au dus la rezolvarea acestei probleme.
6
Initialele NPH se refere la „ Neutral Protamine Hagedorn”, nume care vine de la inventatorul
acestui preparat de insulina H.C.Hagedorn si este o suspensie cristalina neutra care este preparata
prin co-cristalizarea insulinei cu protamina.
Ambele formulari permit obtinerea unor profile prelungite privind relatia timp-actiune prin faptul
ca necesita dizolvarea unei forme precipitate si/ sau cristaline a insulinei. Aceasta dizolvare este
considerata a fi faza sau treapta care limiteaza viteza de biodiponibilitate a insulinelor cu actiune
intermediara si lunga.
In consecinta, profilul timp-actiune al formularilor este prelungit prin intarzierea ulterioara a
disocierii hexamerului in dimeri si monomeri. Protamina reprezinta un grup de proteine cu caracter
bazic puternic, grup de substante strans inrudite care sunt obtinute din sperma de peste.
In general, protamina este caracterizata printr-un numar de aproximativ 30 aminoacizi, dintre
care arginina este in proportie de 65-70% [16,20].
Folosind metodologiile de cristalizare propuse de Krayenbühl si Rosenberg se pot prepara in mod
corespunzator, din protamina si cristale de insulina, cristale de INSULINA NPH de forma
tetragonala cu volume curpinse intre 1 si 20 mm³. Astfel aceste formulari au concentratii foarte mici
de insulina solubila si protamina.
Conditia la care in solutie nu mai exista protamina sau insulina masurabila, dupa cristalizare, este
denumita ca fiind punctul de „isophane”. De aceea INSULINA NPH se mai numeste INSULINA
„ISOPHANE”.
INSULINA NPH are o declansare a actiunii cuprinsa intre1-2 ore, o activitate maxima cuprinsa
intre 6-12 ore si o durata a activitatii de 18-24 ore.
Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate la relatia timp-actiune sunt datorate unor factori
cum ar fi : doza, locul injectarii, temperetura si activitatea fizica a pacientului.
INSULINA NPH poate fi amestecata usor cu INSULINA REGULAR fie ex tempore, de catre
pacient, fie in forma in care se obtine de la fabricant, respectiv sub forma unei formulari
preamestecate.
Insulina preamestecata, de exemplu NPH/REGULAR in raportul 70/30 sau 50/50, ofera
pacientului o ameliorare a exactitatii la dozare si, in consecinta, o ameliorare a controlului
glicemiei.
Au fost solutionate si controversele privind imunogenitatea la protamina. Astfel, pacientii care au
prezentat sensibilitate la protamina in cazul formularilor NPH au fost trecuti pe tratament cu
preparate de INSULINA LENTE sau INSULINA ULTRALENTE pentru a se putea controla
concentratiile bazale ale glucozei.
INSULINA LENTE este o suspensie de zinc-insulina care a fost conceputa pentru o singura
injectie zilnica. Ea este un amestec constituit din doua forme insolubile de insulina, 70% cristale
romboedrice de zinc-insulina (componenta ultralente) si 30% particule de insulina amorfa
(componenta semilente).
Formularea aceasta este un preparat neutru care contine tampon pe baza de acetat si un exces de
zinc. Surplusul de zinc se leaga la suprafata hexamerului insulinei, reducand astfel solubilitatea
insulinei si, in felul acesta, se produce o incetinire a profilului timp-actiune.
Volumul componentei cristaline ultralente este cuprins in mod obisnuit intre 200 si 1 000 mm³.
INSULINA LENTE are o declansare a actiunii dupa 1-3 ore, activitatea maxima este intre 6-12
ore si durata actiunii revine la 18-24 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate in ceea
ce priveste profilul timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii,
temperatura si activitatea fizica a pacientului.
Capacitate de amestecare a INSULINA LENTE cu INSULINA REGULAR este limitata la
amestecurile ex tempore care sunt utilizate imediat dupa preparare.
7
In mod curent singura insulina cu actiune prelungita disponibila este INSULINA
ULTRALENTE, care este o suspensie de insulina cristalizata. Cristalele au fost identificate ca fiind
romboedrice cu un volum cuprins intre 200 si 1 000 mm³. Formularea contine un agent de
tamponare cu valoare neutra a pH-ului si un surplus de zinc.
INSULINA ULTRALENTE are o declansare a actiunii la 4-6 ore, o activitate maxima curpinsa
intre 8-20 ore si o durata actiunii situata intre 24-48 ore. Ca si celelalte formulari, variatiile
profilului timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii, temperatura,
activitatea fizica a pacientului.
Amestecarea preparatului INSULINA ULTRALENTE cu INSULINA REGULAR este limitata
la amestecarea ex tempore si utilizarea imediata.