Reactia Antigen-Anticorp

Foarte multe dintre tehnicile utilizate in

imunoIogie se bazeaz肴pe interactiunea dintre antigen?i

anticorp?i pe faptul ca aceast5 reactie nu va putea avea

loc decat dac肴anticoapul va recunoa?te扉lega antigenul

in mod specific. De?i specificitatea de interactiune este

fundamentala, Pentru tOate aCeSte metOde bazate pe
reactia antigen-anticorp, eXista?i alti factori care au un
efect semnificativ asupra sa, favoriz含nd sau inhiband

interactiunea dintre cele doua molecule.

Legarea dintre antigen?i anticorp se bazeaz着pe

COmPlementaritatea tridimensiona15 a celor dou肴

COmPOnente言ar acest aspect a fost demonstrat inclusiv

Prin studii de cristalografie. Aceasta potrivire recIPrOCa

Pemite maximizarea ariei de contact dintre cele dou着

発藍霊誓書器誓書葦諾。薯i
dintre o molecu15?i ligandul pe care i=eag着in mod
SPeCific. Interactiunea dintre o enzim着?i substratul ei se

bazeaz肴pe acela?i principiu, diferenta in acest caz

Particular fiind c着substratul este modificat de actiunea

enzimei, in timp ce anticoxpul nu induce modificをri ale

antigenului.
1. Leg轟uri implicate fn formarea complexului

antigen-anticorp

Leg沸urile care intervin in formarea complexului

antigen-anticorp sunt necovalente?i, Prin urmare, relativ

Slabe (figura l):
1. Leg沸urile electrostatice (ionice) se fomeaz狂ntre

grupむi ionice, Cu SarCini electrice de semn opus (de

言霊豊‡詑轟誓隷書器霊謹
dielectri(袖iar d este distanta dintre molecule. Deoarece

COnStanta dielectric着a apei este foarte mare, devine dQja

evident c各excluderea moleculelor de apa este de natura

S5 creasc肴foarte mult for!a de legare.

2. Leg洗urile de hidrogen se fomeaz狂ntre atomii

incむcati negativ ai unor molecule polare (CO2￣)?i ionii

de hidrogen?ncむcati pozitiv (H+) ai unor grup誼

hidro餌ice (’OH, NH2). Puntile de hidrogen sunt leg沸uri
Slabe ?i se bazeaza pe interactiuni electrostatice, de
aceea, eXCluzia moleculelor de apa este de natur肴s肴

CreaSC着 for!a de legare prin reducerea constantei

dielectrice.
3. Leg犯urile van der Waals sunt forte de atractie

Care aPar Ca umare a interactiunii dintre norii electronici

extemi ai moleculelor respective. Sunt cauzate de
Perturbむi electronice temporare care conduc la fomarea
unui dipo=a nivelul unei molecule, iar acesta induce o
Perturbare dipolar5 la nivelul moleculei pereche, Cu Care

誌蒜露盤霊昔盤請書誓書警
aceasta fo呼Va Cre?te raPid pe m肴sur着ce moleculele de

2
antigen?i anticorp se apropie tot mai mult unele de
celelalte.

4. Leg沸urile hidrofobe se formeaz着工ntre molecule

nonpolare, Pe m着sur肴ce acestea se apropie, elimin含nd in

CurSul acestui proces, mOleculele de ap肴dintre ele.

Procesul poate fi aseminat cu pic証urile de ulei care,

Plutind pe suprafa!a apei, Se uneSC P餌a cind se formeaz肴

O Pic沸ura unic肴. Explicatia e dat肴de faptul c肴moleculele

de apa nu pot foma punti de hidrogen cu moleculele

hidrofobe?i atunci se asociaz狂ntre ele.

Fig. 1 Tipuri de Ieg靴uI.i ce intervin in interactiunea Ag-Ac.

Se remarc肴faptul c肴toate tipurile de legaturi

descrise mai sus depind de distanta dintre cele doua

molecule, Cu C釦 aCeaSta eSte mai mic着, mai multe

molecule de apa sunt excluse?i forta de legare cre?te. O

3
astfel de distan串mic乞"ntre norii electronici ai epitopului

?1 ParatOPului poate fi atinsa atunci c含nd exista o

COmPlementaritate a celor douえ structuri. Cu c含t

SuPrafata de contact (de ”POtrivire”) dintre antigen?i

anticorp este mai mare, Cu at含t forta de atractie este mai

Interventia exclusiv肴a leg沸urilor non-COValente

in procesul de asociere face ca reactia dintre antigen扉

anticoxp sa fie una reversib脱, Ceea Ce inseanm肴ca, Odata

format, COmPlexul antigen-antico岬se poate disocia.

Demonstratia reversibili印ii reactiei antigen-

anticoxp poate fi facut5 de o manier肴foarte simpl肴, Cu

句utorul unui experiment in care sunt folosite haptene

(molecule cu greut坤moleculare extrem de mici)?i un

SaC fomat dintr-O membran肴de dializ肴, Care Pemite

trecerea haptenelor, dar nu?1 a anticoapilor. Pe scurt, in

interiorul sacului de dializa sunt introduse haptene?l
anticorpi specifici pentru haptenele respective. Sacul este
mai intai scufundat intr-un lichid pan着Ia atingerea unei

Stむi de echilibru in care numむul de molecule de haptene

libere din犯ntrul sacului de dializa?i din afara lui se

egalizeaz肴. Apoi, lichidul din afara sacului va fi inlocuit

COntinuu, Ceea Ce inseamna c着 haptenele din acest

COmPartiment vor fi?ndep拙ate din sistem, Ceea Ce Va

duce la perturbarea echilibrului dintre moleculele aflate

in interiorul sacului?i cele din exterior. in aceasta
Situatie, mOleculele din interiorul sacului incearc肴sを

ating肴din nou starea de echilibru?i, O Parte dintre ele vor

traversa membrana de dializa. Dupa o perioada de timp

de inlocuire a lichidului din afara sacului, Se COnStata C肴

in interiorul acestuia nu numai c肴nu mai exist5 molecule

4
libere de haptena, dar nu mai exist肴nici molecule legate

la anticoapi. Acest lucru atesta faptul cあIeg沸ura dintre

anticorp?i antigen a putut fi desfacut5?i antigenul

eliberat (figura 2).

Fig. 2 Reprezentare schematic肴a experimentului efectuat cu

ajutorul unei membrane de dializ盃, Care demonstreaz着
reversibilitatea reactiei antigen-anticorp (adaptat dupa Delves
PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM, 2006).

Asocierea dintre un slngur ParatOP al unui

anticorp?i epitopul corespunz洗or seami南cu o reactie

Chimica?i poate fi definita printr-O eCuatie:

Ag+Ac ←→Ag-A c

Kinetica asocierii?i disocierii din cadrul reactiei

antigen-anticoap respect肴legea actiunii maselor?i poate

fi reprezentat5 prin ecuatia:

ka[Ag] [Ac]=kd[AgAc]

5
unde [Ag] !i [Ac] sunt concentratiile antigenului ?i
anticorpului liberi, [AgAc] este concentratia complexelor
Ag-Ac, iar ka 扉 kd Sunt COnStanta de asociere ?i,

respectiv, de disociere. Ecuatia de mai sus poate fi

rescris肴, Putandu-Se defini constanta de echilibru:

K=ka/kd=[AgAc]/[Ag] [Ac]

La un moment dat, reaCtia qjunge?n punctul de

echilibru in care o jum沸ate dintre moleculele de anticoap

(O jum沸ate dintre paratopi) sunt legate (deci se reg益esc

in complexele antigen-anticoxp)?i o jum沸ate sunt libere.

[AgAc]=[Ac], Ceea Ce arata C肴, dac着 afinitatea

anticorpului este mare pentru haptena specific紅ui, atunCi

necesita o cantitate mic着din acea haptena pentru a deveni

Saturat. Forta de legare dintre un epitop?i un paratop a

fost numita afinitate. Aceasta reprezinta suma fortelor
non-COValente, de atractie ?i de respingere, Care
Stabilizeaz肴complexul Ag-Ac?i este caracterizata printr-

O Particular肴constanta de afinitate, Ka, Care eSte egala cu

COnStanta de echilibru, K.
In mod similar, afinitatea poate fi definit串i dac着

este analizata desfacerea complexului antigen-anticoap.

Kd=[Ag] [Ac]/[AgAc]

unde Kd eSte COnStanta de disociere care indicを

Stabilitatea legaturii odata formate.

Valoarea Ka mai poate fi deteminat着?i de
diferenta de energie (△G) dintre antigen?i anticorp aflati

in stare libera, Pe de o parte si cea din starea complexata,

Pe de alt5 parte:

6
△G=-RT ln K。

unde R este constanta universala a gazelor, T este

temperatura absoluta, ln Ka este logaritmul natural al
constantei de afinitate.
Temenul de a鯖nitate descrie forta unei legaturi

monovalente, ParatOP-ePitop. in m砧oritatea situatiilor,

ins肴, antigenele sunt multivalente, PreZent含nd o mulfime

de epitopi diferiti. fn acest caz, 1egatura Ag-Ac poate fi

descris着corect prin ecuatia:

XAc + yAg = AcxAgy

Fo巧a care caracterizeaz肴o astfel de interactiune

este denumita aviditate. Aceasta fo呼este caracterizat5

de factori care tin de heterogenicitatea anticorpilor ce

leag肴∴fiecare epitop in parte, PreCum ?i de

heterogenicitatea deteminan珂or antigenici. La acestea

Se adauga un bonus oferit de cre?terea Cu Ordine de

mむime a fortei de legare ce caracterizeaz肴intregul

COmPlex.
Pentru a explica acest fenomen, apelam la ecuatia
Care descrie diferenta de energie dintre starea liber着si cea

COmPlexata, fiecare leg犯ur肴individuala epitop-ParatOP

Put合nd fi definita dupa cum umeaz着:

△Gl二〇RT ln Kl

△G2=一RT ln K2 etC.

7
 In situatia in care toate aceste leg沸uri au loc,

atunci diferenta globala de energie poate fi caracterizata

Prin ecuatia:

△G=△Gl + △G2 etc=一RT ln K「RT lnK2 = -RT (1n Kl

十lnK2)=-RT ln (KI XK2)

Dar, △G= 一RT ln K。vid, deci constanta de aviditate

Kav.d=KI X K2 etC.

Altfel spus, aViditatea nu este dat5 de suma

afinitdyilor fiecむei legaturi paratop-ePitop in parte, Ci de

PrOdusul acestor afinita±i, rePreZent含nd o manier肴mai

COreCt5 de caracterizare a capacitatii de legare a

anticoapilor in cadrul sistemelor bio萱ogice, COmParativ cu

afinitatea individual肴a situsurilor de legare. O aviditate

CreSCuta POate Chiar compensa pentru o afinitate scazuta,

iar exemplul cel mai elocvent este oferit de pentamerul
de IgM, Care, Chiar daca, adesea, PreZinta o afinitate
inferioara celei a IgG, datorita multivalentei poate lega
antigenul in mod eficient. in plus, aViditatea crescuta ce
rezulta din multiple legaturi epitop-ParatOP explic肴?i de

Ce un COmPlex antigen-anticorp fomat din mai multe

leg証uri este mai putin susceptibil la disociere.

2. Factori care in珊uenteaz肴interactiunea dintre

antigen?i anticorp

Fomarea unui complex antigen-anticorp depinde

de o serie de factori structurali?i fizico-Chimici.

8
2.1 Caracteristici structurale
Complementaritatea structurii tridimensionale
dintre un antigen ?i un anticorp reprezinta conditia
fundamentala pentru fomarea complexelor imune.

2.1.1 Specificitatea situsurilor de legare a antigenului

Deoarece un r肴spuns imun este declan鋒t de

int含lnirea cu un anumit antigen, anticoapii produ?i in

timpul acestui r着spuns sunt specifici pentru acel

Particular antigen (exista complementaritate structura15

intre anticorpi?i antigene). Spec描citatea anticoapilor

este data de ansamblul aminoacizilor care alc沸uiesc

ParatOPul, SeCVenta ?i distributia lor in spatiu fiind

deteminante pentru capacitatea de legare. Situsurile de
legare ale anticoIPilor sunt situate la nivelul regiunilor
hipervariabile ale lanturilor usoare?i grele, iar aceste
regiuni fomeaz着o serie de bucle care protruzioneaz着?i

Sunt in申pt responsabile pentru contactul intim?i legarea

epitopului. Acest concept de specificitate a fost denumit

”Sistem lac沸-Cheie”, unde lac沸ul se refer紅a paratop言ar
Cheia la epitop.

2. 1.2 Reactivitatea incruci?a脆

Se refer肴Ia o reactie imunoIogic肴in care

anticoxpii specifici reactioneaz為cu:

dou肴antigene diferite, dar care prezinta epitopi in

COmun;
un epitop diferit, dar cu o structur着extrem de

asemin沸oare cu a celui care a stimulat productia

anticorpilor;
un antigen heterofilのrovenind de la alte specii),

Care eSte eXtrem de asem祖沸or din punct de vedere

9
StruCtural・ Anticorpii care reactioneaz着incruci?at Cu

antigene heterofile sunt denumiti la randu=or anticorpi

heterofili.

2. 1.3 Accesibilitatea antigenic5

De?i legarea unui antigen la un anticoap necesita
COmPlementaritatea (SPeCificitatea) descrisa mai sus, eSte
la fel de important ca acel particular epitop s着fie扉

accesibil pentru paratop. Aceasta accesibilitate este

afectat肴de caracteristicile structurale ale moleculei de

anticorp, inclusiv ale po垂unii constante?i ale regiunii

balama, Capabile sa ofere flexibilitate anticorpului?i de

CapaCitatea sa de a se apropia si de a lega epitopii.

2. 1.4 Structura imunoglobulinelor

Numむul situsurilor de legare antigenica ale unei

molecule de anticorp are un efect direct asupra

dimensiunii complexului antigen-anticorp. Numむul de

monomeri de imunoglobulin5 depinde de isotip (clas着).

Astfel, IgA poate exista ca monomer sau dimer, Situatie

?n care are 4 situsuri de legare?l ar Putea fi capabilあs肴

lege 4 epitopi identici. IgM este secretat sub fom5 de

Pentamer, aStfel c着valenta sa teoretic肴este lO.

2.1.5 Valenta antigenelor

Dac肴un antigen are cel putin doi epitopi, atunCi

este considerat multivalent. Pe m肴sur5 ce un antigen

multivalent interactioneaz肴cu antico岬ii, aCeSte mOlecule

Se leag狂ncruci?at (cross-1inking) la antigen?i fomeaz肴

O retea tri-dimensionala care conduce, in vitro, la aparitia

unui precipitat (vezi?i Reactia de precipitare). O astfel de
reactie sta la baza multor metode imunoIogice care

10
folosesc precipitarea pentru detectia complexelor
antigen-antico甲. C含nd antigenul prezinta un smgur

epitop, fenomenul de legare incruci?ata nu POate aPare.

Daca antigenul este bivalent, Se POt forma fie lanturi
liniare, fie complexe circulare. Dac肴antigenul prezinta

epitopi multipli, atunCi apar leg犯uri incruci?ate multiple

?i se fomeaz肴un complex cu dimensiuni mari. Astfel,

mむimea complexului antigen-anticoap depinde de

Valenta antigenului.

2. 1.6 Concentratia de antigene?i anticorpi

fn plus卸をde factorii descrisi anterior, Cantitatea

(COnCentra車a molarる relativり anticoapilor ?i a
moleculelor de antigen, impreuna cu valenta celor doua
COmPOnente, influenteaz狂n mod semnificativ fomarea

COmPlexelor imune. O propo巾e optim肴(COnCentra卓e

molara) intre cei doi reactanti va asigura fomarea
leg犯urilor incruci?ate intre antigenul multivalent ?i

anticorpii specifici. Zona de echivalenやeste definit5 ca

acea zona a curbei de precipitare in care raportul

COnCentratiei molare antigen/anticorp este perfect?i astfel
toate moleculele de antigen扉anticorp sunt complexate

(vezi?i Reactia de precipitare).

Prozona este acea por互une a curbei de precipitare

Care CaraCterizeaza excesul de anticorp?1 Care detemina

aparitia de complexe Ag-Ac solubile. Postzona este
CaraCterizat5 de un exces de antigene, absenta raportului
ideal dintre antigene ?i anticorpi impiedicand ?i ?n
aceasta situatie fomarea unui complex mare, Care S肴

PreCipite.

間
2.2 Factori fizico-Chimici care afecteaz肴Iegarea dintre

antigen?i anticorp

Fortele fizice care sunt responsabile pentru

formarea legaturii antigen-anticoxp au fost descrise
anterior, la fel ca si notiunile de afinitate?i aviditate.

2.2.1 Factori de mediu

a) concentratia ionilor de hidrogen
Modificむile in pH-ul mediului de reactie pot determina

ionizarea aminoacizilor, iar aceasta poate induce

mod綿cむi confomationale, PreCum ?i modificarea
constantei de afinitate.
b) temperatura
AnticoIPi precum cei din isotipul IgG necesita o

話語g‡諾:乍a嵩芸豊富詰n霊
afectate at会t moleculele de antigen, C釦?i cele de

anticoIP, Prin alterarea confomatiei lor?i chiar prin

denaturarea proteinei, iar un antico叩denaturat s-ar Putea

S着nu mal POSede deloc situsurile de legare. Cre?terea

temperaturii scade stabilitatea complexului antigen-

anticorp?i detemin肴disocierea lui.

2.2.2 Concentratia?n sむuri (fo坤ionicり

O concentratie scazut5 de sむuri favorizeaz肴o

legare specific着 a anticorpilor la antigene. Aceasta

Observatie a condus la dezvoltarea unor metode de

laborator care utilizeaz肴produ?i cu fo呼ionic肴scazut肴

Sau COnCentratii scazute de sare (in special in bincile de

Sange), tOCmai p町tru a promova formarea complexelor

antigen-anticorp. In cazul unor concentratii crescute de

12
Sむuri, Se POate PrOduce pierderea (neutralizarea)

Situsurilor active ale moleculelor care interactioneaz5,

Ceea Ce COnduce la scnderea afinita±ii dintre antigen?i

anticorp sau chiar inhibarea completa a legむii. De aceea,

in metodele care se bazeaz肴pe reactia antigen-anticorp,

trebuie evitata evaporarea probelor, tOCmai pentru a

PreVeni cre?terea COnCentratiei sむurilor.

2.2.3 Potentialul zeta

Suprafata anumitor antigene particulate poate

PreZenta O SarCina electric着. Un exemplu important se

refer紅a hematii. Cind astfel de antigene sunt suspendate

in solutii saline (mediu de reactie) se fomeaza un

POtential electric intre astfel de particule, denumit zeta,
care le impiedic肴s肴se aprople una de alta. in acest fel,

reactia de aglutinare a eritrocitelor incarcate negativ de

C沸re anticorpii de clasa IgG se produce cu dificultate.

Acest fenomen este explicat?i prin aceea c肴po坤unile

Fab ale IgG sunt prea scurte pentru a putea surmonta
POtentialul zeta a doua hematii.

13