UNIVERSITATEA „DUNĂREA DE JOS” DIN GALAȚI

FACULTATEA TRANSFRONTALIERĂ
SPECIALIZAREA INGINERIA MATERIALELOR AVANSATE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

ANALIZA MICROSTRUCTURALĂ A
MATERIALELOR PRIN MICROSCOPIE
ELECTRONICĂ DE BALEIAJ

Coordonator științific,
Ș.L. dr. ing. Alina CEOROMILA

Masterand,
Mihai POCOTILO

Galați
- 2022 -
 CUPRINS

Lista abrevierilor ............................................................................................................. 3

INTRODUCERE ……………………………………………………………………... 4
CAPITOLUL 1. Considerații teoretice ale microscopiei electronice de baleiaj
1.1. Evoluția microscopiei electronice de baleiaj ……………………………….. 5
1.2. Ce este un microscop SEM? ………………………………………………... 6
1.3. Bazele fizice ale microscopiei electronice de baleiaj ………………………. 6
1.4. Principiul constructiv al microscopului SEM ………………………………. 8
1.5. Principiul de funcționare al microscopului SEM …………………………... 8
1.6. Pregătirea probelor pentru investigare SEM ……………………………….. 11
1.7. Domenii de utilizare ale tehnicii SEM ……………………………………... 12
1.8. Avantaje și dezavantaje ale tehnicii SEM ………………………………….. 14
1.9. Alte tehnici de microscopie electronică …………………………………….. 15
CAPITOLUL 2. Microanaliza chimică SEM
2.1. Spectroscopia de radiații X după energii dispersive ………………............... 22
2.2. Principiul fizic al metodei EDX ……………………………………………. 22
2.3. Analiza cantitativă EDX ……………………………………………………. 23
2.4. Analiza calitativă EDX ……………………………………………………... 24
2.5. Aplicații …………………………………………………………………….. 25
CAPITOLUL 3. Aplicații ale microscopiei SEM în știința materialelor
3.1. Analiza materialelor metalice cu SEM …………………………………....... 27
3.2. Analiza materialelor polimerice cu SEM …………………………………... 29
3.3. Analiza materialelor ceramice și acoperirilor cu SEM ……………………... 32
3.4. Analiza materialelor geologice cu SEM ……………………………............. 33
CAPITOLUL 4. Aplicații ale microscopiei SEM în biologie și medicină
4.1. Etapele de pregătire a preparatelor biologice ……………………………..... 36
4.2. Microbiologie ……………………………………………………................. 38
4.3. Inginerie biomedicală ……………………………………………………..... 40
4.4. Culturi celulare și tisulare …………………………………………………... 41
4.5. Rezultate imagistice ale preparatelor biologice cu tehnica SEM …………... 43
CONCLUZII ȘI PROPUNERI……………………………………............................. 46
BIBLIOGRAFIE ……………………………………………………………………... 47
Anexe .............................................................................................................................. 48

2
 Lista abrevierilor

SEM - Microscopia electronică de baleiaj

TEM - Microscopia electronică de transmisie
STEM - Microscopia electronică de baleiaj prin transmisie
EDX - Spectroscopia de radiații X după energii dispersive
FEM - Microscopia electronică de baleiaj cu emisie în câmp
AFM - Microscopia de forță atomică

3
 INTRODUCERE

În ultimii 20 de ani, proliferarea cercetărilor în microscopie electronică de baleiaj (SEM) a

condus la îmbunătățiri ale performanței sistemului către o rezoluție mai mare la tensiuni mai
mici. Acest entuziasm este alimentat de nevoia de a înțelege structurile de suprafață și chimia lor,
datorită progreselor în domenii precum metamaterialele, materialele bidimensionale și fabricarea
dispozitivelor semiconductoare.
Imaginile cu tensiune de accelerare scăzută sunt atractive deoarece reduce cantitatea de
interacțiune din probă, permițând obținerea de informații sensibile la suprafață.
Tema lucrării este „Analiza microstructurală a materialelor prin microscopie electronică
de baleiaj”. Am ales această temă deoarece am vrut să însușesc mai multe cunoștințe despre
microscopie, diferite tipuri de microscoape, unde și cum le putem utiliza mai bine, în ce domenii
sunt mai utile și metodele de utilizare ale acestora.
În primul capitol intitulat ,,Considerații teoretice ale microscopiei electronice de baleiaj
(SEM)” am încercat să mă familiarizez cu noțiunea de microscopie, am aflat ce este un
microscop SEM, care sunt bazele fizice, ce principii se utilizează, cum se pregătesc probele, în
ce domenii se utilizează și care sunt avantajele și dezavantajele acestor microscoape.
În al doilea capitol denumit ,,Microanaliza chimică SEM” am descris spectroscopia de
radiații X după energii dispersive (EDX), analiza calitativă și cantitativă și am prezentat câteva
aplicații.
În al treilea capitol cu titlul ,,Aplicații ale microscopiei SEM în știința materialelor” am
descris etapele de pregătire a diferitelor materiale și am prezentat rezultate imagistice ale
materialelor metalice cu tehnica SEM.
În al patrulea capitol cu denumirea ,,Aplicații ale microscopiei SEM în biologie și
medicină” am enunțat importanța microscopiei SEM în domeniile biologiei și medicinei, și am
prezentat unele rezultate imagistice ale acestora.
În rubrica Concluzii și propuneri am efectuat o sinteză la tot ceea ce am analizat în
această lucrare, am expus dacă au fost atinse obiectivele propuse și dacă totuși am însușit bine
această temă care se adaugă în bagajul cunoștințelor.

4
CAPITOLUL 1. Considerații teoretice ale microscopiei electronice de baleiaj
(SEM)

1.1. Evoluția microscopiei electronice de baleiaj

Cu mai mult de 2.000 de ani în urmă, aproximativ un secol î.Hr., oamenii au descoperit că
o imagine mărită a obiectelor mici poate fi văzută folosind o „lentilă” transparentă sferică. Cu
toate că o singură lentilă convexă poate mări obiectele de mai mult de 10x, detaliile multor copii
nu sunt suficiente pentru ca oamenii să vadă clar ținta. La sfârșitul secolului al XVI-lea,
comercianții olandezi de divertisment Jansen și fiul său au introdus mai multe lentile într-un
cilindru și au constatat că obiectul poate fi mărit de foarte multe ori. Este primul prototip al
microscopului și telescopului modern. Pe baza acestei descoperiri întâmplătoare, Janssen a
dezvoltat și primul microscop compus din două lentile convexe care a fost asamblat. Conceptul
de microscop compus este că obiectele pot fi mărite secvenţial de două ori.
În secolele ce urmează, puterea de mărire, precum și calitatea imaginii unui microscop
compus au fost îmbunătățite semnificativ. Acest lucru s-a întâmplat, în special, după deschiderea
și utilizarea de noi lentile în ansamblu ce ar putea elimina sau minimiza aberații cromatice și alte
aberații optice. Comparativ cu microscoapele dezvoltate în secolul al XIX-lea, nici
microscoapele optice convenționale încă în uz nu diferă semnificativ deoarece microscoapele
optice au atins limita maximă în rezoluție spațială. Datorită gamei largi sau fluctuațiilor lungimii
de undă, este imposibil ca vreun instrument optic să creeze imaginea perfectă a unui obiect
natural, chiar dacă există defecte de formă. Producția de lentile optice a fost eliminată. Datorită
difracției, orice punct reprezentat pe obiect nu mai este un punct în planul imaginii, ci un punct
de difracție. Dacă cele două puncte de difracție sunt prea aproape unul de celălalt, atunci nu pot
fi deosebite. În astfel de cazuri, puterea de mărire a lentilelor microscopice nu poate crește și mai
mult rezoluția spațială a microscoapelor. Pentru microscoapele care folosesc surse de lumină cu
lungime de undă din domeniul vizibil, rezoluția lor spațială este limitată la 0,2 μm. Astfel, orice
structură mai mică de atât, nu poate distinsă cu acest tip de microscop.
În 1938, expertul german Manfred von Arden a construit primul microscop electronic cu
scanare (Anexa 1). Dar dispozitivul nu este asemănător unui microscop electronic de baleiaj
(SEM) modern deoarece pot fi vizualizate doar eșantioane foarte subțiri. Deci, acesta este mai
mult un microscop electronic de baleiaj cu transmisie (STEM). von Arden a adăugat un sistem
de baleiaj la microscopul electronic cu transmisie. Imaginile au fost înregistrate pe un tub de
imagine, dispozitivul fiind echipat cu un sistem de înregistrare pe un film plasat pe un tambur
rotativ. Un fascicul de electroni cu diametrul de 0,01 μm este transmis prin probă, iar electronii
transmiși iradiază filmul, care se deplasează simultan cu fasciculul de electroni.
Prima micrografie STEM captează cristale de oxid de zinc (ZnO) la o mărire de 8000x cu o
rezoluție de 50 - 100 nm. Imaginea a fost obținută dintr-un raster de 400 x 400 pixeli, iar
achiziția a durat 20 de minute. Microscopul avea două lentile electrostatice înconjurate de bobine
deflectoare.

5
 1.2. Ce este un microscop SEM?
Un microscop electronic de baleiaj (SEM) este un dispozitiv din categoria microscoapelor
electronice concepute pentru a obține imagini ale suprafeței unui obiect cu rezoluție spațială
mare (până la 0,4 nm), precum și informații despre compoziția straturilor superficiale, structură
și alte proprietăți. SEM-urile moderne permit operarea la o gamă largă de măriri de la 3 - 10x
(echivalentul unui obiectiv manual puternic) până la 1.000.000x.
Astăzi, microscopia electronică cu scanare este utilizată în aproape toate domeniile științei
și industriei, de la biologie la știința materialelor. Există un număr mare de modele și tipuri
diferite de SEM produse de mai multe companii și echipate cu diferite tipuri de detectoare. Bazat
pe lucrările lui Max Knoll și Manfred von Ardenne din anii 1930, un SEM constă dintr-un
fascicul de electroni care scanează și analizează suprafața unei probe și care reemite anumite
particule (semnale) ca răspuns. Aceste particule sunt analizate de anumiți detectori, care permit
reconstrucția unei imagini tri-dimensionale.

Studiile efectuate de Charles Oatley de la Universitatea din Cambridge, în anii 1960, au

contribuit în mare măsură la dezvoltarea tehnicii SEM și au dus la comercializarea primului tip
de microscop de baleiaj (Cambridge Instruments), în 1965. Astăzi, microscoapele electronice de
baleiaj sunt folosite în biologie și știința materialelor, iar mulți producători oferă echipamente
standard cu detectori de electroni secundari (0,4 - 20 nm).
Analiza SEM nu necesită metode complexe de pregătire a probelor și permite plasarea
probelor de volum mare. Se așteaptă ca proba să fie conductoare electric; în caz contrar, nu se va
obține o imagine clară. Conductivitatea se realizează, de obicei, prin depunerea în vid a unor
filme metalice (Au) cu o grosime de 50 - 100 Å (această grosime nu afectează în mod
semnificativ rezoluția detaliilor suprafeței). Cu toate acestea, dacă microscopul SEM poate
funcționa la o tensiune de accelerare cuprinsă între 1 și 3 kV, chiar și probele neconductoare pot
fi examinate fără a fi nevoie de o acoperire metalică.

1.3. Bazele fizice ale microscopiei electronice de baleiaj

Rezoluția (capacitatea de a distinge detaliile fine) a ochiului uman într-un microscop optic
este limitată de lungimea de undă a luminii vizibile (fotoni), precum și de calitatea lentilelor de
mărire. Cele mai puternice microscoape optice fac posibilă distingerea detaliilor cu dimensiuni
cuprinse între 0,1 și 0,2 microni. Pentru a observa detalii mai fine, trebuie de micșorat lungimea
de undă care luminează țintele. În cazul microscoapelor electronice, nu folosim fotoni, ci
electroni, ale căror lungimi de undă legate sunt mult mai mici.

6
 Figura 1.1. Reprezentarea schematică a microscopului electronic de baleiaj [1]

Interacțiunea dintre sonda de electroni și probă generează electroni secundari de energie

(Figura 1.1) scăzută care sunt accelerați către detectorul de electroni secundari care amplifică
semnalul. Fiecare punct de impact corespunde unui semnal electric. Intensitatea acestui semnal
electric depinde atât de natura probei în punctul de impact, care determină randamentul
electronilor secundari, cât și de topografia probei în punctul luat în considerare. Astfel, prin
trecerea fasciculului peste eșantion, putem obține o hartă a zonei scanate.
Sonda subțire de electroni este creată de un „tun de electroni” care acționează ca o sursă
redusă de „lentile de electroni” care îndeplinesc același rol pentru fasciculul de electroni ca
lentilele fotonice convenționale dintr-un microscop optic. Bobinele dispuse de-a lungul a două
axe, perpendiculare pe axa fasciculului și străbătute de curenți sincroni, permit sondei să fie
supusă aceluiași tip de scanare ca și televiziunea. Lentilele electronice, care sunt de obicei
lentile magnetice, și bobinele de scanare formează un ansamblu numit coloană de electroni.
SEM-urile moderne înregistrează electronii secundari digital, dar SEM-urile ar fi putut fi
dezvoltate încă de la începutul anilor 1960, cu mult înainte de apariția stocării pe computer,
datorită unui proces analogic care a constat, ca în diagrama din figură, să sincronizeze scanarea
fasciculului tuburile cu fascicul catodic cu scanare SEM prin modularea intensității tubului cu
un semnal secundar. Apoi imaginea probei a apărut pe ecranul fosforescent al tubului catodic și
a putut fi înregistrată pe film fotografic. Microscopul electronic cu scanare este compus în
principal dintr-un tun de electroni și o coloană de electroni, a căror funcție este de a crea o sondă
subțire de electroni pe probă, o etapă obiect pentru a muta proba în trei direcții și detectoare
pentru a capta și analiza radiația emisă de proba. În plus, dispozitivul trebuie să fie echipat cu un
sistem de pompă de vid.

7
 1.4. Principiul constructiv al microscopului SEM
Natura ondulatorie a unui electron este utilizată în proiectarea unui microscop numit
microscop electronic. Puterea de rezoluție a unui microscop este invers proporțională cu
lungimea de undă a radiației utilizate pentru a ilumina obiectul studiat. O mărire mai mare,
precum și o rezoluție mai mare pot fi obținute folosind lungimi de undă mai scurte. Lungimea de
undă de Broglie a unui electron este mult mai scurtă (cu câteva mii mai scurtă) decât lumina
vizibilă utilizată în microscoapele optice. Ca rezultat, microscoapele care folosesc undele de
electroni de Broglie au o rezoluție mult mai mare decât cea a unui microscop optic.
Microscoapele electronice cu o mărire de peste 200.000 de ori sunt utilizate pe scară largă
în laboratoarele de cercetare. Un fascicul de electroni care trece printr-un câmp electric sau
magnetic organizat corespunzător suferă o divergență sau convergență, ceea ce permite
focalizarea fasciculului. Electronii emiși de sursă sunt accelerați de potențiale înalte. Fasciculul
este realizat paralel de o lentilă de condensare magnetică. Când fasciculul trece printr-o probă a
cărei imagine mărită se dorește, fasciculul poartă imaginea probei. Cu ajutorul unei lentile
magnetice si a unui sistem de lentile magnetice de proiector se obtine pe ecran o imagine marita.
Aceste microscoape electronice sunt folosite în aproape toate ramurile științei. Este format dintr-
un tun de electroni pentru a produce un fascicul de electroni de înaltă energie. O lentilă de
condensare magnetică este utilizată pentru a condensa fasciculul de electroni și o bobină de
scanare este plasată între lentila de condensare magnetică și probă. Un detector de electroni
(scintilator) este folosit pentru a colecta electroni secundari și poate fi transformat într-un semnal
electric. Aceste semnale pot fi introduse în CRO printr-un amplificator video.

1.5. Principiul de funcționare al microscopului SEM

La fel cum un microscop optic este o serie de lentile optice, un microscop electronic este o
serie de lentile electromagnetice. De fapt, în SEM vor fi lentile magnetice. Principiul este de a
forma un câmp magnetic de-a lungul axei optice a electronilor rapizi. Sub acțiunea forței
Lorentz, electronii se vor abate spre axa optică. O lentilă magnetică are caracteristicile de bază
ale unei lentile optice și, în esență, este posibil să se proiecteze calea electronilor pe o diagramă
de tip optic geometric. La fel ca și în cazul lentilelor optice, putem defini distanța focală pentru
lentilele magnetice, dar trebuie să fie pozitivă. Cu alte cuvinte, lentila magnetică converge
întotdeauna.
Este important de menționat că unul dintre avantajele acestor lentile se datorează faptului
că mărimea distanței focale este legată de valoarea câmpului magnetic din centrul lentilei. Acest
câmp este generat de bobină și valoarea acestuia poate fi schimbată cu ușurință prin schimbarea
curentului. Acest lucru oferă mai multă flexibilitate în configurarea și utilizarea SEM. Lentilele
magnetice suferă și ele de aberații, dintre care cele mai importante sunt aberațiile sferice și
aberațiile cromatice. Aberația sferică, datorită căreia razele incidente care formează un unghi
mare cu axa optică, sunt focalizate în fața punctului de imagine corespunzător fără aberații,
crește pe măsură ce cubul unghiului dintre fascicul și axa optică. Această aberație la
microscoapele standard este de așa natură încât, în practică, rezoluția microscoapelor
convenționale este limitată la câțiva angstromi, iar unghiurile utilizate în SEM sunt necesare

8
foarte puține (de obicei zece miliarde). De remarcat este dezvoltarea în ultimii ani a
corectoarelor de aberații care au revoluționat lumea SEM. În ceea ce privește aberația cromatică,
acesta este motivul pentru care electronii cu viteze diferite nu vor avea aceleași distanțe focale.
Aceasta este mai puțin restrictivă decât aberația de sfericitate.
În cele din urmă, rețineți că câmpul magnetic obținut în lentila obiectivului care conține
proba este de ordinul lui Tesla. Acest câmp se obține prin folosirea unor piese polare foarte
apropiate (de ordinul a 4 mm) la nivelul probei, ceea ce necesită mostre foarte subțiri și suporturi
pentru mostre. În plus, intensitatea câmpului magnetic nu permite observarea probelor
magnetice cu rezoluție bună, deoarece aceasta este direct legată de intensitatea câmpului
magnetic, care crește pe măsură ce deschiderea pieselor polare scade.

Interacțiunea electronilor cu substanța

Microscopia electronică așa cum este înțeleasă astăzi nu mai este o tehnică separată, dar o
varietate de diferite care oferă unic posibilitatea de a obține o imagine de ansamblu asupra
structurii, topologie, morfologie și compoziția unui material. Imagistica și diverse spectroscopii
reprezintă metodele care sunt un instrument important pentru caracteristicile tuturor tipurilor de
probe pe dimensiunea scară din ce în ce mai mică cu limita ultimă a unui atom. Pentru că
probele observate includ anorganice şi materiale organice, micro- și nanostructuri, minerale,
precum și obiecte biologice, influența microscopiei electronice asupra tuturor științelor este greu
de supraestimat.
O mulțime de informații, pot fi obținute prin diverse metode, datorită la o mulţime de
semnale care apar când electronii interacționează cu proba. Înțelegerea de bază a acestor
interacțiuni este o condiție prealabilă înainte introducere în microscopia electronică pot urma
metode. O anumită interacțiune a electronilor incidenți cu un eşantion este evident necesar,
deoarece fără generare de semnal, fără eșantionare proprietățile sunt măsurabile. Diferite tipuri
de electroni, desigur, stau la baza majorității metodelor de microscopie electronică. Când un
electron interacționează cu substanța, se pot genera diferite particule. Pentru sistematizare
interacțiunea este împărțită în două tipuri, și anume elastice și inelastice.
a) Interacțiuni elastice
În acest caz, nu se transferă energie din electron la probă. Prin urmare electronul care
părăsește proba încă mai are energia inițială. Desigur, nu se transferă energie dacă un electron
trece prin eșantion fără niciuna interacțiunile în general. Acești electroni contribuie la fascicul
direct care conține electroni ceea ce face ca proba să treacă în direcţia fascicului incident. Mai
mult, împrăștierea elastică are loc dacă electronul este deviat de la traiectoria sa de către
interacțiuna cu un potențial pozitiv în interior nor electronic. Astfel, primul electron nu pierde
energie sau, mai exact, doar o cantitate mică de energie.
b) Interacțiuni inelastice
Dacă energia este transferată dintr-un incident electroni la probă, apoi electronul energia
electronilor după interacțiunea cu proba este redusă. Energia transferată în probă poate provoacă

9
diverse semnale precum raze X, Auger sau electroni secundari, plasmoni, fononi, Quanta UV sau
catodoluminiscență. Interacţiunile inelastice ale unui electron cu materia produc semnale ale
căror metode sunt utilizate în principal microscopia electronică analitică.

Formarea imaginii SEM

Imaginea SEM este formată folosind un fascicul de electroni focalizat la câteva miliarde de
metru care scanează suprafața probei într-o serie de rânduri stivuite până când se formează un
model bidimensional complet. Când fasciculul lovește proba, electroni solizi sunt emiși din
probă și aceste particule sunt colectate pentru a forma o imagine. Imaginea din Anexa 2 se
numește așadar „imagine electronică secundară” și arată topografia materialului mărită de până
la 100.000 de ori.
Deoarece SEM folosește condiții de vid și folosește electroni pentru a forma imaginea,
trebuie efectuată o pregătire specială a probei. Toată apa trebuie îndepărtată din probe deoarece
apa se evaporă sub vid. Toate metalele sunt conductoare și nu necesită pregătire înainte de
utilizare. Toate nemetalele trebuie făcute conductoare prin acoperirea probei cu un strat subțire
de material conductiv. Acest lucru se face folosind un dispozitiv numit „sputtering”.
Dispozitivul de pulverizare folosește un câmp electric și gaz argon. Eșantionul este plasat într-o
cameră mică în care este vid. Gazul argon și câmpul electric fac ca electronul să scape din
argon, ceea ce face ca atomii să se încarce pozitiv. Ionii de argon sunt apoi atrași de folia de aur
încărcată negativ. Ionii de argon îndepărtează atomii de aur de pe suprafața foliei de aur. Acești
atomi de aur cad și se așează pe suprafața probei, formând un strat subțire de aur.

Rezoluția imaginii SEM

Un SEM nu este o cameră și detectorul nu formează continuu o imagine precum un CCD
sau un film. Spre deosebire de un sistem optic, rezoluția nu este limitată de limita de difracție,
de precizia lentilelor sau oglinzilor sau de rezoluția matricei de detectoare. Optica de focalizare
poate fi mare și brută, în timp ce detectorul SEM are dimensiunile unui pumn și detectează pur și
simplu curentul. În schimb, rezoluția spațială a SEM depinde de dimensiunea spotului de
electroni, care, la rândul său, depinde atât de lungimea de undă a electronilor, cât și de sistemul
electron-optic care creează fasciculul de scanare. Rezoluția este, de asemenea, limitată de
dimensiunea volumului de interacțiune, volumul materialului de probă care interacționează cu
fasciculul de electroni. Dimensiunea spotului și volumul de interacțiune sunt mari în comparație
cu distanțele dintre atomi, astfel încât rezoluția SEM nu este suficient de mare pentru a vizualiza
atomii individuali, așa cum este posibil cu un microscop electronic cu transmisie (TEM). Cu
toate acestea, SEM are avantaje compensatoare, inclusiv capacitatea de a imagini o zonă de
eșantion relativ mare; capacitatea de a imagini materiale în vrac (nu doar filme subțiri sau foi);
și varietatea de moduri analitice disponibile pentru a măsura compoziția și proprietățile unei
probe. În funcție de instrument, rezoluția poate fi între mai puțin de 1 nm și 20 nm. Începând cu
2009, SEM comun din lume (≤ 30 kV) poate atinge o rezoluție punctuală de 0,4 nm folosind un
detector de electroni secundar.

10
 Interpretarea imaginilor SEM
În mod obișnuit, atunci când un microscop electronic de baleiaj este instalat în laborator și
în cameră, bara de scară este calibrată pentru fiecare mărire de către administrator sau de către
personal. Calibrarea este de obicei efectuată în mod regulat. Deci, putem avea încredere în bara
de scară din partea de jos a imaginii. Dacă bara de scară nu este calibrată, trebuie făcută pentru a
afla dimensiunea obiectelor din imaginile SEM. Bara de scară se află în colțul din dreapta jos al
imaginii. De exemplu, dacă constau din 10 linii scurte, toate liniile înseamnă 30 µm. Deci,
putem afla dimensiunea unui obiect folosind această scară de 30 µm. 9,9 mm este distanța de
lucru. Distanța de lucru este distanța dintre obiectiv și eșantion.

1.6. Pregătirea probelor pentru investigare SEM

Pregătirea probei pentru investigare la microscopul electronic de baleiaj presupune mai
mulți pași:
 Pasul 1: fixarea primară cu aldehide (proteine):

- proteinele sunt reticulate cu glutaraldehidă și formaldehidă pentru a stabiliza

ultrastructura înainte de prelucrarea ulterioară;
 Pasul 2: fixarea secundară cu tetroxid de osmiu (OsO4) (lipide):
- membranele lipidice sunt fixate pentru a evita extracția cu solvent în timpul
deshidratării;
- depozitul de osmiu negru format în timpul acestui proces crește conductivitatea probei
și minimizează distorsiunea imaginii rezultată din încărcare.
 Pasul 3: o serie de deshidratări cu solvent (etanol sau acetonă):
- proba fixată este deshidratată prin incubare într-o serie de soluții de etanol sau acetonă;
- concentrația de solvent este crescută treptat, astfel încât apa să fie îndepărtată ușor fără
a provoca contracția probei.
 Pasul 4: uscarea:
- acetona sau etanolul să vor evapora de pe suprafața probei, altfel va introduce artefacte,
deoarece acești solvenți au o tensiune superficială relativ mare și vor crea micro-fisuri în
suprafață pe măsură ce sunt îndepărtați;
- pentru a evita acest lucru, solvenții de deshidratare sunt înlocuiți fie cu
hexametildisilazan (HMDS) fie cu CO2 lichid;
- HMDS poate fi utilizat în preparatele celulare și după o scurtă perioadă de incubare (3
min) este îndepărtat, și excesul se va evapor;
- pe de altă parte, CO2 lichid este aplicat țesăturilor într-un uscător cu punct critic unde
este adus la o temperatură și presiune critice la care se evaporă.
 Pasul 5: montarea prizei:

11
 - eșantionul este montat pe un suport metalic care are o bandă de carbon dublu adezivă,
cu scopul de a crește conductivitatea electrică. Substanța adezivă care conține particule
de argint poate fi folosită pentru o conductivitate și mai mare.
 Pasul 6: acoperire prin pulverizare conductivă:
- pentru a preveni acumularea de sarcină pe suprafața probei, aceasta este acoperită cu un
material conductor (Au);

- metalul este aplicat controlat într-un dispozitiv de acoperire prin pulverizare;

- este important ca stratul să fie suficient de gros (10 nm) pentru a preveni încărcarea, dar
nu atât de gros încât să ascundă detaliile suprafeței probei.

Calitatea imaginilor obținute folosind microscopia electronică de baleiaj depinde în mare

măsură de calitatea probei de analizat. În mod ideal, suprafața trebuie să fie curată, plană și să
conducă electricitatea pentru a putea evacua electronii. De asemenea, dimensiunile ar trebui să
fie de ordinul a 1-2 cm.
Prin urmare, toate aceste condiții necesită pregătire mecanică (pre-tăiere și lustruire).
Probele izolatoare (probe biologice, polimeri etc.) trebuie să fie și ele metalizate, adică acoperite
cu un strat subțire de C sau Au. Cu toate acestea, stratul de metal datorită grosimii sale, va
interfera cu detectarea detaliilor foarte fine. Prin urmare, se poate folosi un fascicul de electroni
cu energie mai mică, care va evita încărcarea probei (și, prin urmare, pierderea vizibilității),
atunci stratul metalic nu mai este necesar.

1.7. Domenii de utilizare ale tehnicii SEM

Microscoapele electronice de baleiaj pot fi utilizate într-o varietate de aplicații industriale,
comerciale și de cercetare:
a) Știința materialelor
SEM-urile sunt utilizate în știința materialelor pentru cercetare, controlul calității și analiza
defectelor. În știința modernă a materialelor, cercetarea asupra nanotuburilor și nanofibrelor,
supraconductorilor la temperatură înaltă, arhitecturii mezoporoase și a rezistenței aliajelor depind
de utilizarea SEM pentru cercetare și dezvoltare. De fapt, aproape fiecare ramură a științei
materialelor, de la aerospațial și chimie la electronică și utilizarea energiei, a fost posibilă doar
prin intermediul microscopului electronic de baleiaj.
b) Nanofire pentru sensori de gaz
Cercetătorii explorează noi modalități de a utiliza nanofirele ca senzori de gaz,
îmbunătățind metodele de fabricație existente și dezvoltând altele noi. Microscopia electronică
este esențială pentru a caracteriza nanofirele și pentru a înțelege comportamentul lor sensibil la
gaz.
c) Controlul semiconductorilor

12
 Funcționarea fiabilă a semiconductorilor necesită informații topografice precise. Imaginile
SEM 3D de înaltă rezoluție oferă măsurători rapide și precise ale compoziției semiconductorilor.
Practic, în fiecare proces de fabricare a napolitanelor, SEM este unul dintre cele trei instrumente
principale de control al calității utilizate. În cazul testelor zilnice, repetate, de control al calității,
s-a dovedit că ecranele mai mari (19”) reduc oboseala vizuală a inspectorilor.
d) Montajul chip
Producția de microcipuri se bazează din ce în ce mai mult pe tehnica SEM pentru a ajuta la
înțelegerea eficienței noilor metode de producție și de fabricație. Cu o scară și materiale din ce în
ce mai mici și potențialul polimerilor complecși cu auto-asamblare, rezoluția înaltă și capacitățile
3D ale SEM sunt foarte utile pentru proiectarea și fabricarea micromatricelor. Pe măsură ce
Internetul lucrurilor (IoT) devine din ce în ce mai răspândit în viața de zi cu zi a consumatorilor
și producătorilor, SEM-urile vor continua să joace un rol important în dezvoltarea chipset-urilor
cu costuri și consum reduse pentru computere și dispozitive de rețea netradiționale.
e) Investigații judiciare
Investigațiile penale și criminalistice folosesc tehnica SEM pentru a descoperi indicii și
pentru a-și aprofunda cunoștințele criminalistice. Procedura include:
 analiza reziduurilor de praf de pușcă,
 recenzie de bijuterii,
 comparație de marcare a mingii,
 analiza scrisului de mână și tipăritului,
 examinarea autenticității bancnotelor,
 analiza particulelor și fibrelor de vopsea,
 demontarea lămpilor cu incandescenţă în accidente de circulație.
Deoarece SEM-urile permit examinarea unei game largi de materiale la mărire mare și
mică, utilizarea lor în știința criminalistică permite să se facă inferențe, să se determine originea
materialelor și să contribuie la colectarea de infracțiuni și probe juridice. Instrumentul de banc
Phenom GSR este conceput special pentru analiza automată a împușcăturilor.
f) Științe biologice
În științele biologice, SEM poate fi folosit pentru analiza insectelor și a țesuturilor animale,
bacteriilor și a virușilor. Utilizarea include:
 măsurarea impactului schimbărilor climatice asupra speciilor,
 detectarea de noi bacterii și tulpini virulente,
 teste de vaccinare,
 descoperi de noi specii,
 munca în genetică.
g) Prelevare de sol și rocă
Eșantionarea geologică cu ajutorul microscopului SEM face posibilă determinarea
proceselor de calamități și a morfologiei probelor. Imagistica cu electroni retroîmprăștiați poate

13
fi utilizată pentru a dezvălui diferențele de compoziție, iar compoziția elementară poate fi
determinată folosind microanaliza EDX. Utilizările permise includ:
 identificarea instrumentelor și a artefactelor umane timpurii,
 măsurarea calității solului pentru creșterea animalelor și agriculturii pornind de la
ruinele istorice,
 dovezi criminalistice - calitatea solului, toxine etc.
h) Științe medicale
Într-un sens larg, SEM-urile sunt folosite în medicină pentru a compara probe de sânge și
țesut, pentru a determina cauza bolii și pentru a măsura impactul tratamentului asupra pacienților
(ajutând la dezvoltarea de noi tratamente). Utilizarea obișnuită include:
 detectarea bolilor și a virușilor,
 testarea de noi vaccinuri și medicamente,
 compararea probelor de țesut de la pacienții din grupul de control și cei din grupul de
testare,
 probe de testare pe parcursul vieții pacientului.
i) Artă
Nu toate aplicațiile SEM sunt strict practice. Micrografiile SEM au fost folosite pentru a
crea imagini digitale. Imaginile 3D de înaltă rezoluție dintr-o varietate de materiale creează o
mare varietate de peisaje, scenele din imagini sunt atât străine, cât și familiare.
j) Instrument practic și util
În domeniile aplicațiilor industriale și ale cercetării, se acordă din ce în ce mai multă
atenție controlului calității la scară microscopică. Imagistica de înaltă rezoluție cu un microscop
SEM poate oferi o perspectivă asupra multor domenii, făcând SEM un instrument indispensabil
în multe domenii.

1.8. Avantaje și dezavantaje ale tehnicii SEM

Avantajele
Microscopia electronică de baleiaj presupune atât avantaje, cât și dezavantaje. Beneficiile
utilizării SEM pentru caracterizarea materialelor și analiza defecțiunilor:
 Rezoluția. Rezoluția digitală a imaginii este de 15 nm, oferind date utile pentru
caracterizarea microstructurilor, cum ar fi fracturile, coroziunea, grăunții și limitele de
grăunți cristalini;
 Standard de mărire calibrat. Deoarece toate imaginile sunt calibrate la un standard,
analize precum grosimea acoperirii, dimensiunea granulelor și dimensiunea particulelor
pot fi aplicate cu ușurință imaginilor înregistrate;
 Analiza chimică. SEM-urile oferă analiză elementară calitativă, analiză cantitativă
non-standard, scanare liniară cu radiații X și cartografiere. Aceste date pot fi folosite
pentru a studia defectele produsului, pentru a determina compoziția elementară a unor

14
 substanțe neidentificabile, pentru a evalua grosimile acoperirii și pentru a determina
granulația și dimensiunea particulelor;
 Creează imagini 3D și topografice detaliate;
 Ușurință de utilizare în timpul analizei;
 Soft ușor de utilizat;
 Scanări rapide (scanările BSE, EDS și SEI pot fi finalizate în câteva minute);
 Probele necesită pregătire în prealabil.

Dezavantajele
Deși este un test excelent pentru tipografia de suprafață și analiza chimică, unele modele
nu sunt potrivite pentru SEM. Iată câteva motive pentru a lua în considerare diferite tipuri de
analiză a materialelor.
 Mediu de vid. În cele mai multe cazuri, probele SEM ar trebui să fie solide și
compatibile cu vidul. Cu toate acestea, presiuni mai mari pot fi utilizate pentru a
vizualiza probe sensibile la vid care sunt neconductoare și volatile. Pentru mai multe
informații, citiți comparația noastră dintre SEM convențional, SEM cu presiune
variabilă (VPSEM) și SEM cu emisie de câmp (FESEM).
 Artefactele sunt posibile. Probele care sunt izolatori puternici trebuie să fie placate -
de obicei cu aur sau carbon - înainte de testare. Cu toate acestea, acest proces poate
duce la artefacte. Cu toate acestea, pregătirea și analiza într-un laborator SEM cu
experiență asigură că aceste artefacte au un impact minim asupra rezultatelor testelor.
 Scump de cumpărat și de pornit
 Mare (ocupă mult spațiu)
 Ar trebui să fie amplasat într-un mediu în care nu există interferențe electrice,
magnetice sau vibrații.
 Pentru pregătirea probelor și operarea microscopului este necesar un operator calificat
 Risc ridicat de expunere la radiații
 Limitat la mostre suficient de mici pentru a încăpea într-o cameră cu vid.
 Necesită apă proaspătă și tensiune constantă.

1.9. Alte tehnici de microscopie electronică

Există mai multe tipuri diferite de microscoape electronice, inclusiv microscopul
electronic cu transmisie (TEM), microscopul electronic de baleiaj prin transmisie (STEM) și
microscopul electronic de baleiaj de înaltă revoluție. Fiecare dintre aceste tipuri de microscop
electronic va fi descris mai detaliat în subcapitolele de mai jos, inclusiv beneficiile și
dezavantajele fiecăruia.

Microscopia electronică prin transmisie

Un microscop electronic cu transmisie (TEM) este un nou tip de microscop electronic
care direcționează un fascicul de electroni de înaltă tensiune către o probă pentru a o ilumina și a

15
produce o imagine mărită a probei. În Figura 1.2 este prezentată o secțiune transversală a unui
capilar cu globule roșii obținute prin microscopia electronică cu transmisie.

Figura 1.2. Secțiune transversală a unui capilar obținută prin TEM [2]

Tunurile de electroni sunt folosite pentru a genera fascicule de electroni. Pistolul este de
obicei echipat cu un catod cu filament de wolfram, care este sursa fasciculului de electroni.
Anodul este folosit pentru a accelera fasciculul de electroni, iar lentilele electrostatice și
electromagnetice ajută la focalizarea fasciculului de electroni. Pe măsură ce fasciculul de
electroni trece prin eșantion, acesta se împrăștie și produce o imagine a microstructurii probei,
care poate fi observată prin obiectivul microscopului. Modificările spațiale pot fi examinate prin
proiectarea imaginilor pe un ecran acoperit cu sulfură de zinc fluorescentă. O altă metodă care
poate fi folosită pentru a înregistra o imagine este plasarea filmului fotografic în fasciculul de
electroni unde va fi înregistrată imaginea. Camerele digitale pot fi, de asemenea, folosite pentru a
afișa imagini în timp real pe ecranul unui computer.
Aberația sferică a limitat în mod tradițional rezoluția microscopiei electronice de
transmisie. Cu toate acestea, evoluțiile recente au abordat această problemă prin creșterea
rezoluției folosind corecția hardware a aberației sferice. Ca rezultat, imaginile pot fi acum
obținute cu rezoluții sub 0,5 Å și măriri de peste 50 de milioane de ori. Cea mai semnificativă
limitare a microscopiei de transmisie este nevoia de mostre foarte fine, de obicei mai mici de 100
nm. Ca urmare, majoritatea probelor biologice trebuie să fie fixate chimic și deshidratate pentru
a fi plasate în rășină polimerică pentru a fi vizualizate cu TEM.
Microscopul electronic prin transmisie folosește un fascicul de electroni de înaltă
tensiune pentru a crea o imagine. Tunul de electroni din partea superioară a TEM emite electroni
care trec prin tubul cu vid al microscopului. În loc de o lentilă de sticlă care focalizează lumina
(cum este cazul microscoapelor optice), TEM folosește o lentilă electromagnetică care
focalizează electronii într-un fascicul foarte subțire. Acest fascicul trece apoi printr-o probă
foarte subțire, iar electronii se împrăștie sau lovesc un ecran fluorescent din partea de jos a
microscopului. Pe ecran apare o imagine a probei cu părțile corespunzătoare afișate în diferite
nuanțe, în funcție de densitatea acesteia. Microscopia electronică cu transmisie este, de
asemenea, o tehnică de spectroscopie electronică, dar are o rezoluție mai mare decât SEM.

16
Avantajele TEM față de SEM sunt o rezoluție spațială mai bună cu capacități suplimentare de
măsurare analitică. Puținele limitări ale acestei metode includ cerințele de vid ridicat, tăierea
probei subțiri și pregătirea eșantionului care necesită timp. Pregătirea probei este extrem de
importantă pentru a obține o imagine de înaltă calitate pentru informații despre eșantion.

Microscopia electronică de baleiaj prin transmisie

Un microscop electronic de baleiaj cu transmisie (STEM) este un tip de microscop
electronic cu transmisie (TEM). Ca și într-un microscop electronic cu transmisie convențional
(CTEM), imaginile sunt formate de electroni care trec printr-o probă suficient de subțire. Cu
toate acestea, spre deosebire de CTEM, în STEM fasciculul de electroni este focalizat într-un
punct subțire (cu o dimensiune tipică a punctului de 0,05-0,2 nm), care este apoi scanat peste
eșantion într-un sistem de iluminare raster proiectat astfel încât proba să fie iluminat în fiecare
punct, un punct cu o rază paralelă cu axa optică. Ditheringul fasciculului (un proces care
folosește zgomotul digital pentru a netezi culorile în grafica digitală și sunetele în audio digital)
prin eșantion face ca STEM să fie adecvat pentru tehnici analitice, cum ar fi imagistica în câmp
întunecat cu inel Z de contrast și cartografierea spectroscopică prin spectroscopie cu raze X cu
dispersie de energie (EDX) sau spectroscopie cu pierderi de energie a electronilor (EELS).
Aceste semnale pot fi achiziționate simultan, permițând corelarea directă a imaginilor și a datelor
spectroscopice.
Un STEM tipic este un microscop electronic de transmisie convențional, echipat cu
bobine de scanare suplimentare, detectoare și circuitele necesare, permițându-i să comute între
funcționarea ca STEM sau CTEM; cu toate acestea, sunt produse și STEM-uri speciale.
Microscoapele electronice cu scanare cu transmisie de înaltă rezoluție necesită condiții de
încăpere excepțional de stabile. Pentru imagistica cu rezoluție atomică în STEM, nivelul de
vibrație, fluctuațiile de temperatură, undele electromagnetice și undele acustice trebuie limitate
în camera în care este instalat microscopul.
Microscoapele TEM sunt folosite pentru a caracteriza structura probelor la scară nm și
atomică, oferind informații importante despre proprietățile și comportamentul materialelor și
celulelor biologice. Microscopia electronică cu transmisie de scanare a fost utilizată pentru a
caracteriza structura unei game largi de mostre de materiale, inclusiv celule solare, dispozitive
semiconductoare, oxizi complecși, baterii, pile de combustibil, catalizatori și materiale
bidimensionale.
Prima aplicație STEM a constat în vizualizarea moleculelor biologice (1971). Avantajul
analizei STEM a probelor biologice este contrastul ridicat al imaginilor inelare în câmp
întunecat, care permite vizualizarea probelor organice fără a fi nevoie de colorare. STEM este
utilizat pe scară largă pentru a rezolva o serie de probleme structurale din biologia moleculară.

Microscopia de baleiaj de înaltă rezoluție

Microscopia de baleiaj de înaltă rezoluție (HRSEM) este o gamă de tehnici de
microscopie optică care permit unor astfel de imagini să aibă o rezoluție care depășește rezoluția

17
impusă de limita de difracție, care se datorează difracției luminii. Tehnicile de imagistică cu
rezoluție ultra-înaltă se bazează pe câmp apropiat (microscopie cu tunel fotonic, precum și pe
cele care utilizează superlensele Pendry și microscopia optică cu scanare în câmp apropiat) sau
în câmp îndepărtat. Printre metodele care se bazează pe acestea din urmă se numără cele care
îmbunătățesc doar puțin (aproximativ cu un factor de doi) rezoluția dincolo de limita de difracție,
cum ar fi microscopia confocală cu orificiu închis sau metodele de calcul precum deconvoluția
sau un detector bazat pe pixeli, rescanare a pixelilor, microscop 4Pi și tehnologii de microscopie
cu iluminare structurată, cum ar fi SIM și SMI.
Există două grupuri principale de tehnici de microscopie de baleiaj de înaltă rezoluție:
microscopia electronică de baleiaj cu emisie în câmp și microscopia de forță atomică. Acestea
vor fi descrise în subcapitolele ce urmează.

Microscopia electronică de baleiaj cu emisie în câmp

Microscopia electronică de baleiaj cu emisie de câmp (FESEM) oferă informații
topografice și elementare la măriri de la 10x până la 300.000x, cu adâncime de câmp nelimitată.
În comparație cu microscopia electronică de baleiaj convențională (SEM), FESEM oferă imagini
mai clare, cu mai puțină distorsiune electrostatică și rezoluție spațială de până la 0,5 nm, ceea ce
este de trei până la șase ori mai bună. Beneficiile microscopiei electronice de baleiaj cu emisie
în câmp includ:
 posibilitatea de a studia punctele de contaminare a zonei mai mici la tensiuni de
accelerare a electronilor compatibile cu spectroscopia cu dispersie după energii (EDX);
 pătrunderea redusă a sondelor de electroni cu energie cinetică scăzută mai aproape
de suprafața imediată a materialului;
 imagini de joasă tensiune de înaltă calitate, cu o încărcătură electrică neglijabilă a
eșantionului (tensiune de accelerare de la 0,5 la 30 kV);
 nu este necesar să se aplice acoperiri conductoare materialelor izolante.

Pentru imagini cu rezoluție mare, folosim tehnica FESEM. Aplicațiile FESEM includ:
 Analiza în secțiune transversală a dispozitivelor semiconductoare pentru lățimea
porții, oxizii sub poartă, grosimea filmului și detaliile de proiectare
 Detectare îmbunătățită a grosimii acoperirii și a uniformității structurale
 Geometria elementelor fine de poluare și măsurarea compoziției elementare

Principiul de funcționare constă în aceea că catodul de emisie de câmp din tunul de

electroni SEM oferă fascicule de sondă mai înguste la energii de electroni scăzute și mari, ceea
ce îmbunătățește simultan rezoluția spațială și minimizează încărcarea cu electroni și deteriorarea
probei. Pentru aplicațiile care necesită cea mai mare mărire posibilă, oferim și FESEM în lentilă.
Emițătorul de câmp Schottky
Emițătorul trimite electroni sub formă de fascicul la proba studiată. O caracteristică a
emițătorului de câmp Schottky este o definiție mai precisă a fasciculului deja în timpul emisiei.
Fasciculul de electroni poate fi mai bine focalizat, mai ales la tensiuni de accelerare scăzute.

18
(Tensiunea de accelerare: Câmpul electric necesar pentru a mișca/„accelera” electronii.) Sunt
necesare tensiuni de accelerare scăzute pentru a studia probele sensibile.
Detectoarele sunt folosite pentru a „captura” și afișa semnalele produse în timpul scanării.
Sunt „detectoare cu fascicul” pentru că sunt instalate în interiorul microscopului – în coloană.
Detectoarele convenționale sunt conectate la sistemul de microscop din exterior. Pe parcurs,
semnalele trebuie să ajungă la detector, ele sunt adesea distorsionate și dau rezultate mai slabe.
Cu detectoare încorporate în microscop, se poate obține un semnal mai mare, precum și imagini
de înaltă rezoluție. Pe planurile SE, contrastul este vizibil în relief; Imaginile ESB arată
contrastul material. Cu FE-REM, ambele imagini pot fi afișate în același timp cu o reprezentare
diferită a culorii, astfel încât să fie posibilă impunerea unor informații diferite.

Microscopia de forță atomică

Microscopia cu forță atomică este un tip de microscopie cu sondă de scanare bazată pe
interacțiunile Van der Waals dintre o sondă și o suprafață a probei. Principiul de funcționare al
unui microscop cu forță atomică (AFM) se bazează pe utilizarea forțelor legăturilor atomice care
acționează între atomii unei substanțe.

Figura 1.3. Schema generală a microscopului de forță atomică [3]

La distanțe mici intre doi atomi acționează forțele de respingere, iar la distanțe mari
acționează forțele atractive (Figura 1.3). Forțe absolut similare acționează între toate corpurile
care se apropie. Într-un microscop cu forță atomică cu scanare, aceste corpuri sunt suprafața
studiată și vârful alunecând peste ea. În mod obișnuit, instrumentul folosește ca sondă un ac cu o
zonă de vârf de unul sau mai mulți atomi, fixat pe un cantilever, care alunecă lin pe suprafața
probei. La capătul proeminent al cantileverului (deasupra vârfului), există o platformă oglindă
pe care cade fasciculul laser și din care se reflectă fasciculul laser. Pe măsură ce sonda coboară și
urcă peste neregularitățile suprafeței, fasciculul reflectat este deviat, iar această deviație este
înregistrată de un fotodetector, iar forța cu care vârful este atras de atomii din apropiere este
înregistrată de un senzor piezoelectric. Datele de la fotodetector și senzorul piezoelectric sunt

19
utilizate într-un sistem de feedback care poate furniza, de exemplu, o valoare constantă a forței
de interacțiune dintre microsondă și suprafața probei. Ca rezultat, este posibil să se construiască
un relief tridimensional al suprafeței probei în timp real. Rezoluția acestei metode este de
aproximativ 0,1-1 nm pe orizontală și 0,01 nm pe verticală.
Consolă - una dintre componentele principale ale microscopului cu sondă de scanare este
o bază dreptunghiulară masivă, de aproximativ 1,5 × 3,5 × 0,5 mm, cu un fascicul care iese din
ea (consola în sine), de aproximativ 0,03 mm lățime și 0,1 până la 0,5 mm. La capătul inferior al
cantileverului se află un ac care interacționează cu proba. Raza vârfului acului consolelor
industriale este de la 5 la 90 nm, laborator - de la 1 nm. Partea superioară a consolei deasupra
acului este reflectată pentru a reflecta fasciculul laser. In unele cazuri, pentru a îmbunătăți
reflectivitatea surplombei, pe aceasta se depune un strat subțire de aluminiu. În structura sa,
consola este cel mai adesea un singur cristal de siliciu sau nitrură de siliciu. Acul poate fi, de
asemenea, fabricat din siliciu, nitrură de siliciu sau diamant.
În funcție de distanța dintre ac și probă, sunt posibile următoarele moduri de funcționare
ale microscopului cu forță atomică:
 modul contact;
 modul fără contact;
 modul semi-contact (modul de atingere).
În modul de contact, distanța de la ac la probă este de ordinul câtorva zecimi de nm.
Astfel, acul este în contact fizic moale cu proba și este supus forțelor de respingere. În acest caz,
interacțiunea dintre ac și probă determină îndoirea cantileverului, urmând topografia suprafeței.
Imaginile topografice într-un microscop cu forță atomică sunt de obicei obținute în unul dintre
cele două moduri:
 modul de înălțime constantă
 modul de putere constantă.
În modul fără contact (modul de atracție), cantileverul oscilează deasupra suprafeței
studiate folosind un piezocristal cu o amplitudine de ~2 nm, care depășește distanța dintre sondă
și suprafață. Prin modificarea amplitudinii sau deplasarea frecvenței de rezonanță a oscilațiilor
în timpul scanării suprafeței, se determină forța de atracție și se formează o imagine a suprafeței.
Modul semi-contact este similar cu modul fără contact, cu excepția faptului că acul cantilever în
punctul cel mai de jos al oscilațiilor sale atinge ușor suprafața probei. Când se utilizează
microscopia cu forță atomică în nanolitografia, lucrul este efectuat în modul de contact cu
deplasarea controlată a vârfului sondei conform unui model dat. Prin utilizarea consolelor
speciale, este posibilă și studiul proprietăților electrice și magnetice ale suprafeței.
Principalele dificultăți tehnice în crearea unui microscop de forță atomică sunt:
 Crearea unui ac ascuțit la dimensiuni cu adevărat atomice.
 Asigurarea stabilității mecanice (inclusiv termică și vibrații) la un nivel mai
mare de 0,1 angstrom.
 Crearea unui detector capabil să detecteze în mod fiabil aceste mișcări mici.
 Crearea unui sistem de scanare cu un pas în fracțiuni de angstrom.

20
  Asigurarea unei convergențe line a acului cu suprafața.
Comparativ cu un microscop electronic cu scanare, un microscop cu forță atomică are o
serie de avantaje. Microscopia cu forță atomică face posibilă obținerea unei topografii a
suprafeței cu adevărat tridimensionale. În plus, suprafața studiată nu necesită aplicarea unui
înveliș metalic conductor, ceea ce duce adesea la o deformare vizibilă a suprafeței. Un
microscop electronic cu scanare necesită un vid pentru a funcționa corect, în timp ce majoritatea
modurilor de microscopie cu forță atomică pot fi efectuate în aer sau chiar în lichid. Această
împrejurare deschide posibilitatea studierii biomacromoleculelor și celulelor vii.

21
CAPITOLUL 2. Microanaliza chimică SEM

2.1. Spectroscopia de radiații X după energii dispersive

Spectroscopia cu raze X după energii dispersive (EDX) este spectroscopia cu raze X în
care energia fotonilor individuali este măsurată de un detector paralel și utilizată pentru a
construi o histogramă reprezentând distribuția razelor X în funcție de energie. Există două
moduri de a analiza spectrul de raze X. Una este analiza dispersivă a energiei și spectroscopia cu
fluorescență cu raze X cu dispersie energetică utilizată pentru aplicare în spectrometria de
fluorescență cu raze X, cealaltă fiind analiza dispersivă a lungimii de undă.
Fotonii de raze X sunt capturați de un detector în stare solidă, un semiconductor de siliciu
dopat cu litiu (Si(Li)) sau un detector de deriva de siliciu (SDD), răcit cu azot lichid sau folosind
efectul Peltier. Fotonii X provoacă ionizare într-un semiconductor, perechile electron-gaură
libere migrează sub acțiunea unui câmp electric de polarizare și provoacă impulsuri de curent, a
căror înălțime este proporțională cu energia fotonului. Putem separa impulsurile în funcție de
înălțimea lor folosind un discriminator și, prin urmare, numărăm fotonii incidenti în funcție de
energia lor. Acest tip de detector are o sensibilitate bună la fotonii cu energii de la 0,2 la 20 keV;
elementele sunt detectate din bor (Z = 5), dar eficiența este foarte scăzută deoarece fotonii de bor
sunt absorbiți de fereastra care protejează detectorul. Carbonul (Z = 6) este bine detectat.
Principala limitare a acestui sistem de analiză chimică se datorează lățimii mari de linie
(rezoluția sistemului este de 130 eV la vârful manganului, ceea ce corespunde la 60 eV pe
carbon), vârfurilor de azot și oxigen l (corespunzând energiilor liniilor Kα1: 0,40). keV și 0,53
keV) nu sunt complet separate. Dar complexitatea spectrelor crește în special atunci când liniile
dintr-o altă tranziție se suprapun, adică o serie de linii L de crom și linii K de oxigen. Pe de altă
parte, analiza este foarte rapidă, semnalul este colectat de pe mai multe canale în același timp
(1024 sau 2048 de canale, canalul corespunde unei diviziuni a scalei de energie, de exemplu, 10
sau 20 eV): analizează toate energiile simultan. Timpul de achiziție variază de la câteva secunde
la câteva minute. Numărul de impulsuri pentru fiecare canal este denumit „număr de impulsuri”,
iar rata de numărare este cunoscută ca „impulsuri pe secundă” (cps). Numărul de impulsuri este
proporțional cu numărul de fotoni care au trecut prin detector.

2.2. Principiul fizic al metodei EDX

Principiul de bază al metodei EDX este generarea de raze X de la nivelul probei cu ajutorul
unui fascicul de electroni. Razele X sunt generate în conformitate cu caracteristicile și natura
elementelor prezente în probă. Prin urmare, această tehnică poate fi folosită și pentru a măsura
energia razelor X emise. Această metodă oferă rezultate precise nu numai pentru identificarea
elementelor, ci și pentru determinarea concentrației acestora. Există trei componente principale
prezente în sistemele EDX: un detector de raze X, un procesor de impulsuri pentru măsurarea
tensiunii față de energia razelor X și un sistem digital. Detectorul de raze X este amplasat cu o
înclinație de 45° față de poziția probei. Razele X emise de probă sunt detectate de un detector de
raze X. Dacă razele X ajung pe detector, generează un semnal electric, care este apoi transformat
într-un impuls de tensiune. Pulsul de tensiune depinde de energia razelor X emise. Histogramele

22
acestor date pot fi reaplicate după măsurarea impulsului de tensiune peste 60 de secunde.
Această histogramă este un spectru de energie de raze X prin care se poate face analiza
elementară. Unele probe emit raze X de putere redusă, iar aceste semnale slabe pot fi
îmbunătățite prin utilizarea unui timp de achiziție mai mare. O altă caracteristică a metodei EDX
este cartografierea / distribuția elementelor individuale / faze de elemente pe aria scanată.
Deoarece toți fotonii unei linii au aceeași energie, linia ar trebui să arate ca o „baghetă” pe
spectru. Cu toate acestea, din cauza imperfecțiunii dispozitivului, acestea arată ca un vârf în
formă de clopot (profil Gaussian global). Astfel, unii fotoni de linie sunt detectați la amplitudini
ale pulsului ușor diferite de cele teoretice; pentru a lua în considerare toți fotonii, este necesar să
se țină cont de suprafața pură a vârfului (partea suprafeței de deasupra fundalului). În plus, unii
fotoni detectați provin din alte fenomene (în principal împrăștierea Rayleigh și împrăștierea
Compton a radiației tubului și, eventual, fotoelectron care formează un fundal continuu. Prin
urmare, este necesar să se definească o suprafață clară, adică suprafața deasupra liniei
zgomotului de fond, pentru a determina intensitatea.
În cazul analizei dispersive după energii, forma vârfului din spectru nu este constantă; cu
cât vârful este mai înalt, cu atât este mai lat. Prin urmare, nu este indicat ca prin analiza cu
dispersie după lungimea de undă să ne rezumam la măsurarea înălțimii. Ca urmare, această
metodă este mai sensibilă la separarea vârfurilor (interferența între linii), mai ales că vârfurile au
lățimea mai mare. Pentru a separa vârfurile, se pot folosi metode matematice de deconvoluție sau
de modelare a spectrului: spectrul este modelat pentru o probă fictivă având concentrații a priori,
iar concentrațiile sunt ajustate astfel încât spectrul simulat să fie cât mai aproape de spectrul
măsurat. Această abordare reprezintă metoda Rietveld utilizată în difracția cu raze X.

2.3. Analiza cantitativă EDX

Rezultatele analizei cantitative cu raze X pot fi obținute cu o precizie de 1%. Acest tip de
lucru necesită o analiză atentă și trebuie efectuată cu referire la standardele pentru toate
elementele analizate. În timp ce majoritatea software-ului de difracție cu raze X funcționează cu
„cuantizare fără standarde”, aceasta nu duce întotdeauna la o cuantizare fiabilă.
Cea mai comună metodă de cuantificare este cunoscută sub numele de „ZAF – Three
Correction Method”. Această metodă constă în măsurarea semnalului de raze X al unui element
dintr-o probă necunoscută, apoi compararea datelor obținute cu semnalul de vârf pentru același
element dintr-o probă de referință. Cu toate acestea, există o serie de „corecții ale matricei” care
trebuie făcute deoarece elementul în cauză din proba necunoscută este înconjurat de atomi
diferiți, adică are o matrice de identificare ușor diferită de cea a unei probe pure. Factorii de
corecție sunt: corecția numărului atomic, corecția absorbției, corecția fluorescenței. Cuantificarea
poate fi rezumată după cum urmează:
(1)
unde: Cs este concentrația elementului din eșantion,
Cr concentrația elementului conform tabelului,

23
 Z este corecția numărului atomic,
A este corecția de absorbție,
F - corecția fluorescenței,
Is este semnalul de radiații X provenit de la un element din probă,
Ir este semnal de radiații X de la element.
Valorile reale ale Z, A și F pentru un anumit element și matrice pot fi calculate folosind
programe matematice bazate pe traiectoria electronilor, absorbția de raze X și datele de
fluorescență de raze X. Este foarte important să avem informații corecte, inclusiv distanța de
lucru a detectorului, înclinarea, unghiul de ieșire și datele detectorului. Este important de
menționat că orice metodă de analiză cantitativă presupune că proba este plată și uniformă în
volumul excitat de raze X. Dacă razele X sunt emise dintr-o zonă cu compoziție variată sau de
pe o suprafață neuniformă, absorbția și fluorescența corecțiilor pot fi foarte inexacte. În
majoritatea cazurilor, metodele analitice, cum ar fi EMF, numără numărul de atomi și, prin
urmare, raportează procentul atomic al unui element dintr-o probă, dar unele programe de
calculator pot converti rezultatele în procente în greutate. Este important să știm ce metodă a
fost folosită.

2.4. Analiza calitativă EDX

Analiza calitativă este identificarea punctelor critice (vârfuri). Vârfurile caracteristice de
raze X pot fi determinate folosind tabele. Majoritatea programelor de analiză cu raze X au, de
asemenea, un software automat de identificare a vârfurilor. Identificarea vârfurilor ar trebui să
fie întotdeauna verificată și ar trebui luată în considerare posibilitatea unor factori de eroare
menționați anterior. Trebuie avut în vedere faptul că, odată ce un element a fost identificat cu
acuratețe conform liniei sale cele mai puternice, vor fi prezente și linii secundare. De exemplu,
să presupunem că un defect având un element W este identificat pe baza vârfurilor liniei Lα și
liniei Lβ la 8,40 keV și 9,67 keV. Un alt vârf de aproximativ 1,75 keV ar putea fi identificat în
mod plauzibil drept Si. Cu toate acestea, vârful W Mα la 1,77 keV ar trebui să fie și el prezent în
spectru, iar acest vârf poate fi ușor confundat cu vârful Si Kα la 1,74 keV.
Când luăm în considerare un spectru complet necunoscut, este util să rețineți că vârfurile
liniei K tind să fie mai ascuțite decât celelalte vârfuri și apar întotdeauna în perechi Kα/Kβ.
Înălțimea vârfului Kβ este puțin mai mare în energie cu aproximativ 10% din vârful Kα. Pentru
elementele ușoare, cum ar fi Si, perechea Kα/Kβ nu poate fi rezolvată prin SDD-uri
convenționale, dar vârful combinat rezultat pare a fi oarecum înclinat către energia Kβ ridicată.
Vârful din seria L și seria M sunt în general mai largi, iar razele X din seria M au multe vârfuri
mici datorită numărului mare de tranziții electronice posibile. Numărul de numărări într-un vârf
de raze X va fi în general proporțional cu cantitatea de element din probă, astfel încât vârfurile
mari vor fi constituenți majori și vârfurile mici minore. Cu toate acestea, mulți factori afectează
dimensiunea vârfului (corecții pentru absorbanță, fluorescență și sensibilitatea detectorului) și,
prin urmare, ar trebui să se acorde atenție când se estimează compoziția materialului doar pe
baza dimensiunii vârfului.

24
 În dispozitivele electronice, chiar și o singură particulă străină poate afecta grav
performanța. EDX oferă capacitatea de a controla procesul de fabricație, precum și de a analiza
dispozitivele finite pentru a găsi defecte, cum ar fi contaminarea, particulele străine, stratul
anormal, încălcarea stratului de barieră, suprafața de contact defecte, concentrația locală de
dopant. Inspecția poate fi efectuată la toate nivelurile de producție și poate detecta erori legate,
de exemplu, de tratarea suprafeței sau laminare. Analiza elementară oferă capacitatea de a
localiza defecțiunea, precum și cheia pentru înțelegerea apariției problemei. De la începuturi și
până în prezent, EDX a fost metoda cea mai standard și de încredere în domeniul microscopiei
electronice analitice și este utilizată pe scară largă.

2.5. Aplicații
Spectroscopia de radiații X cu dispersie după energii determină compoziția chimică
elementară a materialelor analizate la microscopul SEM pentru toate elementele cu numărul
atomic mai mare decât al B.
Exemple de aplicații ale metodei EDX:
 Evaluarea și identificarea materialului;
 Poluanti;
 Principalele profiluri de difuzare;
 Conținutul de fosfor în timpul vitrificării;
 Analiză în mai multe puncte a zonelor cu diametrul 1 μm - 10 cm;
 Analiza defectelor;
 Identificarea contaminării;
 Identificarea unui material necunoscut;
 Localizarea și identificarea nămolului;
 Controlul calității;
 Verificarea materialului.
Când un fascicul de electroni baleiază suprafața unei probe se va emite un semnal de raze
X de la atomii componenți, prin fenomenul de fluorescență de raze X (XRF). Energia fiecărui
foton X este caracteristică elementului care l-a emis. Sistemul de microanaliză EDX colectează
razele X, le sortează și le afișează în funcție de energie, identifică și etichetează automat
elementele responsabile de picurile formate, în această distribuție a energiei. De obicei, datele
EDX sunt comparate cu standardele cunoscute sau computerizate pentru a obține o cuantificare
completă care arată compoziția eșantionului. În final, se obțin spectre care indică concentrația
fotonilor X colectați la fiecare energie. De asemenea, pot fi create hărți de distribuție a
elementelor în zonele de interes și tabele cu valori ale concentrației elementelor.

25
Figura 2.1. Imagine SEM și spectrul EDX pentru analiza benzii de carbon (instrument de fixare
și conductivitate electrică a probelor în timpul analizei la microscop) - mărire 10.000x;
Banda conține C și O (valori tabelate). Cartografierea elementelor componente .

26
CAPITOLUL 3. Aplicații ale microscopiei SEM în știința materialelor

3.1. Analiza materialelor metalice cu SEM

Știința materialelor se bazează pe relația dintre proprietățile, morfologia, structura și
procesul de sinteză a materialelor care alcătuiesc obiectele din jurul nostru (metale, polimeri,
semiconductori, ceramică, compozite) [4]. O atenție deosebită este acordată studiului
principalelor caracteristici ale materialelor, precum și proprietăților lor mecanice, chimice,
electrice, termice, optice și magnetice. Știința materialelor se află în centrul multor mari revoluții
tehnologice: electronică (calculatoare, playere CD și DVD), auto (motoare, caroserie, faruri),
aeronautică, energie regenerabilă (panouri solare), nanoștiințe, nanotehnologii etc.
Proprietățile metalelor și aliajelor sunt determinate de compoziția lor chimică, structura
cristalină și microstructură. Microscopul SEM poate analiza gradul de distrugere a metalului/
aliajului și componentelor asociate, analiza elementelor de difuzie și incluziune, căutarea
materialelor de contact etc. Microscopul SEM poate corela structura metalică cu analiza
compoziției chimice, iar informațiile sunt utile pentru analiza fracturilor metalice datorită
adâncimii mari de câmp și a percepției tri-dimensionale a imaginii electronice.
Datorită rezoluției limitate a microscopului optic, observarea microstructurii metalice are
unele limitări, dar atunci când utilizăm un microscop electronic SEM pentru analiza
microstructurii probei, avantajele sunt numeroase.

Etapele de pregătire a materialelor metalice

Pregătirea probelor metalografice / metalurgice include următorii pași:
 selectarea unui eșantion de material reprezentativ pentru a caracteriza în mod
corespunzător microstructura sau caracteristicile de interes. De exemplu, măsurătorile
dimensiunii particulelor sunt efectuate în secțiune transversală, în timp ce evaluarea
globală a microstructurii este efectuată în secțiune longitudinală. Prin urmare, este
important ca beneficiarul să transmită informații despre orientarea sau direcția de rulare a
probei înainte de a pregăti proba.
 tăierea probei la o dimensiune adecvată astfel încât se evită modificarea sau distrugerea
structurii materialului. Astfel, dacă se folosește un ferăstrău abraziv, este important să se
răcească proba cu un lubrifiant sau lichid de răcire. Cu toate acestea, poate să apară o
ușoară deformare pe suprafața probei. Această distorsiune trebuie eliminată în timpul
etapelor ulterioare de pregătire a probei.
 înglobarea probei în rășină pentru o manipulare mai ușoară în timpul etapelor de
șlefuire și lustruire. Mediul de montare trebuie să fie compatibil cu proba în ceea ce
privește duritatea și rezistența la abraziune.
 șlefuirea cu o roată abrazivă lubrifiată cu apă până la o suprafață plană, netedă, fără
zgârieturi. Acest pas este necesar pentru a rectifica deteriorarea suprafeței cauzate de
tăiere. Procedura de măcinare implică utilizarea unei serii de boabe abrazive progresiv
mai fine.

27
  lustruirea probelor metalografice – se îndepărtează ultimul strat subțire de metal
deformat pentru a obține o suprafață reflectorizantă netedă. Se examinează
caracteristicile negravate (conținutul de incluziuni, porozitatea).
 gravarea într-o soluție acidă sau alcalină pentru a scoate în evidență detaliile
microstructurii probei (limitele dintre grăunții cristalini, nucleerea).

Rezultate imagistice ale materialelor metalice cu SEM

Microscopia SEM nu numai că face posibilă observarea morfologiei probei, dar și
observarea structurii microscopice a unei anumite zone. Următoarea imagine este o imagine
electronică a unui aliaj monotectic Cu-Pb (Fig. 3.1).

Figura 3.1. Imagini SEM ale aliajului monotectic Cu-Pb mărire 100x (a) și 500x ori (b) [5]

Imaginile SEM evidențiază structura matriceală (zona gri) și structura alb strălucitor este
cea de-a doua fază; există rare structuri de segregare. Zona încercuită din Fig. 3.1a reprezintă
detaliu în Fig. 3.1b. Suprafața este omogenă, matricea este netedă și plată și nu există cavități de
contracție; microstructura fazei a doua este uniformă.

Figura 3.2. Imagini SEM ale compozitelor Cu-Si-Mg, mărire 100x (a) și 500x (b) [5]
Fig. 3.2 reprezintă imaginea SEM a aliajului Cu-Si-Mg. Conform Fig. 3.2a, se poate
observa că partea negru-gri este structura matriceală, structura vermiculară alb-gri este a doua
fază, iar pe suprafața matricei există o structură de bloc bombată - a treia fază. Selectarea unei
microarii cu aceste trei faze (cercul alb din Fig. 3.2a este detaliul din Fig. 3.2b).
Deci, imaginile SEM pot determina preliminar ce faze există în aliaj și selectarea piesei
adecvate pentru următoarea analiză de fază spectroscopia EDX.

28
 a) b)

Figura 3.3. Aspecte microscopice ale shpan-ului (56x, 3000x)

a) b)

Figura 3.4. Aspecte microscopice ale suprafeței de oțel deformată termic cu fascicul laser (56x,
800x)

3.2. Analiza materialelor polimerice cu SEM

Materialele polimerice s-au dezvoltat și integrat rapid în aplicațiile biologice. Materialele
polimerice sintetice au proprietăți atractive: mono-dispersitatea, biocompatibilitatea, compoziția
și lungimea lanțului controlate și proprietăți chimice controlate. În plus, polimerii sintetici cu
grupări funcționale multiple sunt ușor accesibili, reduc complexitatea procesului de modificare a
fluoroforilor cu pH diferit și oferă mai multe opțiuni pentru selectarea coloranților adecvați.
Majoritatea materialelor polimerice sintetice nu sunt sensibile la variația pH-ului, cu excepția
cazului în care sunt concepute special pentru măsurarea pH-ului.
După cum s-a descris mai sus, pentru a vedea detalii mai mici decât lungimea de undă a
luminii vizibile, trebuie folosit un microscop electronic. Fasciculul de electroni necesită un
mediu de vid înaintat pentru a proteja filamentul, iar electronii trebuie să poată interacționa
adecvat cu proba. Polimerii sunt de obicei lanțuri lungi de unități repetate, compuse din elemente
„mai ușoare” (număr atomic mai mic) cum ar fi, C, H, N și O. Aceste elemente ușoare
interacționează slab cu fasciculul de electroni, rezultând un contrast slab; astfel adesea este
necesară acoperirea metalică pentru a vizualiza probele de polimer. Imaginile SEM necesită o
suprafață conductivă, astfel încât marea majoritate a polimeri sunt acoperite cu metale (Au) prin
pulverizare.

29
 Înainte de a vizualiza o probă de polimer la SEM trebuie să cunoaștem aspectele de
interes - caracteristici sau molecule individuale mai mari de 100 nm. Pentru caracteristici mult
mai mici, TEM poate da rezultate mai bune, dar necesită o pregătire complet diferită a probei.

Etapele de pregătire a materialelor polimerice

Pregătirea materialelor polimerice pentru SEM presupune câteva etape:
 acoperire prin pulverizare - un dispozitiv de pulverizare care depune straturi de Au,
Au-Pd, W, Cr, Pt, Ti sau alte metale, cu grosimi de câțiva nm.
 stratul de acoperire - straturile polimerice sunt depuse folosind un tambur care rotește
substratul (adesea sticlă) și picăturile de lichid polimeric sunt distribuite uniform pe
suprafața substratului.
 Colorare - coloranții tipici pentru polimeri sunt: tetroxidul de osmiu (OsO 4), tetroxidul
de ruteniu (RuO4), acidul fosfotungstic (H3PW12O40), hidrazina (N2H4) și sulfura de argint
(Ag2S).

Rezultate imagistice ale materialelor polimerice cu SEM

Caracteristicile polimerilor termoplastici și studiul proprietăților lor constau în aceea că
aceste materiale au o structură chimică foarte liniară și interacțiuni slabe intermoleculare.
Legăturile se rup ușor atunci când polimerul este încălzit, determinând deformarea materialului.
Au o bună rezistență la temperaturi ridicate, precum și o mare inerție chimică și o rezistență bună
la abraziune. Polimerii termoplastici pot fi supuși la diferite procese industriale precum
imprimare sau extrudare, obținând un material ideal pentru obiecte cu geometrii complexe.

Figura 3.5. Imaginea SEM a unei fibre suflate în topitură [6]

Diametrul fibrei poate fi măsurat cu ușurință la această mărire (200x) . Pentru a da câteva
exemple de aplicații ale acestora, polimerii termoplastici sunt utilizați pe scară largă la fabricarea
fibrelor, a pieselor electrice și electronice, a foliilor de ambalare și a obiectelor uzuale, cum ar fi
vasele de copt. Imaginile SEM pot fi folosite pentru a studia proprietățile și calitatea acestora,
precum și pentru a îmbunătăți procesele și a studia modul în care tensiunea afectează aceste
materiale.

30
 Figura 3.6. Imaginea SEM a cerii [6]
Prin metoda SEM-EDX a fost investigată distribuția și compoziția particulelor dispersate
în matricea polimerică. După un test de abraziune, analiza atentă a suprafeței polimerului poate
dezvălui efectele tensiunii aplicate materialului. Acest lucru permite dezvoltarea ulterioară a
materialelor sau verificări de calitate la sfârșitul lanțului de producție. În acest caz, sunt de
interes metode de analiză a rugozității folosind reconstrucții stereoscopice care permit
cercetătorilor să măsoare adâncimea zgârieturilor din material.

Figura 3.7. Imaginea SEM a unui iepure imprimat 3D [6]

Tehnica SEM a fost folosită pentru a investiga obiectul în vederea identificării defectelor.
SEM poate fi, de asemenea, utilizat pentru a explora noi procese de fabricație populare, cum ar fi
imprimarea 3D, în care un polimer este extrudat și prelucrat pentru a crea o versiune reală a unui
model digital 3D (Fig. 3.7). Rezoluția și calitatea imprimării pot fi măsurate și examinate pentru
a îmbunătăți performanța dispozitivului.
Când se analizează distribuția particulelor într-un film, cunoașterea compoziției chimice a
diferitelor faze poate ajuta la îmbunătățirea procesului de dispersie (metoda EDX), cea mai
utilizată tehnică microanalitică disponibilă pe SEM. În câteva secunde, compoziția chimică a
probei analizate este afișată pe ecran. Fasciculul de electroni bombardează suprafața probei la o
tensiune foarte mare. Pe de altă parte, curentul ar trebui redus pentru a nu deteriora proba. În
plus, proba analizată trebuie să fie într-un spațiu închis sub vid înalt. Acest lucru poate avea mai
multe consecințe asupra materialului în funcție de rezistența sa chimică și fizică.

31
 Problema principală este acumularea de electroni pe suprafața probei, numită și efect de
încărcare. Această problemă poate fi evitată prin crearea unei punți conductoare care conectează
suprafața materialului de partea dispozitivului cu legare la masă. O alternativă mai simplă ar fi
modificarea nivelului de vid în microscop în funcție de specificațiile materialului. O ultimă
opțiune este dispozitivul de acoperire prin pulverizare, care poate acoperi materialul cu un strat
subțire de material conductor.

3.3. Analiza materialelor ceramice și acoperirilor cu SEM

Acoperiri refractate și acoperiri cu rol de barieră termică pentru aplicații la temperaturi
înalte, comunicații radio și TV, dispozitive mobile portabile, ustensile de uz casnic, convertoare
catalitice în mașini, lentile pentru camere, traductoare, filtre, senzori, proteze de șold sau aplicații
dentare – toate acestea înseamnă o lume a ceramicii. Clasificată în mod tradițional ca ceramică,
sticlă silicată și ciment, ceramica avansată de astăzi se referă la materiale compuse din carburi,
oxizi puri, nitruri sau sticlă fără silicați. Ceramica poate fi, de asemenea, utilizată în asociere cu
metale sau polimeri pentru a crea compuși și compozite cu proprietăți îmbunătățite.
Filtrele cu membrană ceramică cu dimensiuni ale porilor de până la câțiva nm trebuie
examinate în secțiune transversală pentru analiza structurii porilor. Porii mai mici prezintă un
interes deosebit. În majoritatea cazurilor, metodele convenționale de măcinare nu pot fi utilizate
pentru a rezolva astfel de probleme, deoarece structura porilor va fi distorsionată. Acest lucru se
aplică în special porilor de ordinul nm. Pe de altă parte, studiul acestui material cu SEM este
extrem de dificil, deoarece structurile de interes pentru noi sunt la limita rezoluției, iar ceramica
ca izolator limitează chiar rezoluția. Folosind tăierea în pantă, se poate obține o secțiune
transversală a întregii structuri a stratului, care este apoi examinată la SEM.

Etapele de pregătire a materialelor ceramice și acoperirilor

Ca și în cazul celorlalte materiale, materialele ceramice și acoperirile implică parcurgerea
unor etape, în dependență de scopul experimentului:
 Dacă proba este suficient de conductivă, atunci nu necesită acoperire.
 Pentru analiza dimensiunii granulelor, este nevoie de imaginea suprafeței, iar pentru
analiza grosimii granulelor, este nevoie de imaginea suprafeței în secțiune.
 Dacă eșantionul este o probă sinterizată, atunci nu trebuie gravată.
Cu toate acestea, dacă suprafața de analizat a suferit un tratament mecanic, cum ar fi
lustruirea, atunci trebuie gravată. Moduri de gravare a probelor din ceramică:
a) gravare termică (cu câteva grade sub temperatura tratamentului termic). Cu toate
acestea, s-ar putea să nu fie o alegere bună dacă proba este sensibilă la căldură, ceea ce îi
poate schimba faza și structura.
b) gravare chimică prin utilizarea unui acid tare, HF. Nu se recomandă pentru ceramice
comune.

32
 Rezultate imagistice ale materialelor ceramice și acoperirilor cu SEM
În Fig. 3.8 sunt redate imagini SEM ale unei ceramice cu rol de barieră termică, după
caracterizarea nedistructivă cu un microscop Zeiss XRM; al treilea cadran conține imagine 3D
redată prin culori care prezintă goluri și fisuri interne.

Figura 3.8. Imagini SEM cu materiale ceramice și acoperiri [6]

Ceramica tehnică poate fi împărțită în următoarele grupe: ceramică cu oxizi (care conțin
materiale formate în principal din oxizi metalici, cum ar fi alumina, zirconia, beriliul și ceria);
ceramice neoxidice (materiale pe bază de carburi, nitruri, boruri și silicați) și ceramică compozită
(ceramică armată cu particule și fibre, precum și combinații de oxizi și ceramică neoxidată).

3.4. Analiza materialelor geologice cu SEM

Materialele geologice sunt materiale naturale (cimenturi, betoane), eterogene, acre conțin
defecte de diferite dimensiuni și sunt slab rezistente la tensiuni înalte. Comportamentul lor este
dificil de prezis în diferite rate de deformare și condiții de stres datorită eterogenității lor, naturii
multifazice și defectelor inerente, fisurilor, fracturilor și îmbinărilor. Există materialele geologice
care se comportă ca fluide la viteze mari de deformare sau în condiții care provoacă pierderea
rezistenței la forfecare (lichefiere). În alte cazuri, ele prezintă un comportament fragil. Datorită
acestor proprietăți și dezavantaje, materialele geologice sunt fundamental diferite de metale,
polimeri și celelalte materiale. Aceste aspecte includ independența energetică a țării, impactul
asupra mediului și dezvoltarea de noi materiale pentru siguranță și durabilitate.
Analiza texturii și distribuția mineralelor într-o rocă este esențială pentru a descrie cu
acuratețe aspectele fizice și chimice ale unui sistem de rocă. Determinarea mineralogică
automată bazată pe metoda SEM-EDX s-a impus ca o metodă populară pentru imagistica de
înaltă rezoluție și cartografierea chimică în industria minieră și de prelucrare.

Etapele de pregătire a materialelor geologice

Scopul pregătirii probei este de a obține o zonă omogenă a probei care să fie
reprezentativă pentru materialul prezentat laboratorului. Pregătirea corectă a probei oferă
microarii reprezentative, care formează baza pentru analiza calitativă. Pregătirea probei este
esențială pentru izolarea elementelor de interes, pentru eșantionarea reprezentativă și pentru a
reduce efectele dimensiunii particulelor. Respectarea strictă a protocoalelor de manipulare,

33
siguranță și calitate asigură îndeplinirea standardelor de calitate în timpul pregătirii probelor.
Alegerea procedurilor reale de preparare a probei depinde de tipul și dimensiunea probei, de
mineralogie și de cerințele analitice și bugetare ale clientului.
Vasul deschis la presiunea atmosferică este o abordare comună pentru pregătirea probelor
pentru analiza geochimică. Pentru fermentarea acidă deschisă sunt utilizate diferite metode de
încălzire, cum ar fi utilizarea plitelor de încălzire pentru sistemele de fermentare acizilor întregi
cu grafit. Sistemele cu acid sunt utile pentru reducerea contaminării cu metale. Acestea pot ține
24 de vase și se încălzesc până la 250°C. Această metodă implică utilizarea acizilor clorhidric,
azotic și sulfuric, inclusiv acizii mai periculoși, cum ar fi acidul fluorhidric și acidul percloric şi
lichide inflamabile. Un amestec de multi-acizi (HNO 3, HF, HCl și HClO 4) este foarte eficient
pentru degradarea completă a majorității probelor geologice. Totuși, în timpul pregătirii pot
apărea pierderi de elemente volatile (B, As, Pb, Ge, Sb), iar unele minerale refractare (în special
minerale oxidate) sunt doar parțial măcinate. În general, mediile acide în vase deschise dizolvă
cu succes probele mafice. Totuși, această metodă nu poate realiza dizolvarea completă a probelor
felsice din cauza prezenței mineralelor refractare, cum ar fi zirconul. În timpul digestiilor,
îndepărtarea/eliminarea completă a carbonului organic (în cazul sedimentelor terestre și marine)
este importantă pentru a evita interferențele, cum ar fi cele cauzate de procesele de transfer de
sarcină în plasma de argon care pot fi critice pentru elemente precum As, Hg, I, P, Se și Te.

Rezultate imagistice ale materialelor geologice cu SEM

Imaginile cu contrast de încărcare sunt stabile după obținere, dar sunt sensibile la
condițiile de funcționare (inclusiv tensiunea de accelerare, rata de scanare, presiunea gazului în
cameră și distanța de lucru). Micile modificări ale condițiilor de funcționare pot modifica drastic
echilibrul sensibil dintre fluxul de ioni pozitivi și emisia de electroni și pot provoca inversarea
contrastului în anumite condiții. Inversarea contrastului a fost observată de Doehne (1998), care
a sugerat că un contrast de fază mai mare este obținut la viteze de baleiaj mai mari.
Zirconiul (ZrSiO4) este un mineral obișnuit în multe roci de crustă și conține adesea
structuri interne complexe, cum ar fi zonarea de creștere oscilativă concentrică, întinderi
rotunjite și neconformități datorate dizolvării sau abraziunii, mai multe etape de creștere a
cristalelor, texturi de recristalizare. Cantități suficiente de U și Pb pentru datarea izotopică sunt
prezente în zirconiu, iar imagistica detaliată a complexităților interne (folosind
catodoluminiscența CL, imagistica BSE, cartografierea cu raze X sau gravarea HF cuplată cu
microscopia cu lumină reflectată) combinată cu geocronologia cu microsondă ionică permite
datarea zonelor înguste de 10–20 µm în cadrul monocristalelor.

34
 Figura 3.9. Imagini de contrast de încărcare ale zirconului (50 µm)[11]

Figura 3.10. Imagini de catodoluminiscență ale zirconului [11]

Imaginea CL are o rezoluție mai mare și sunt vizibile caracteristici liniare luminoase de
20–30 µm.

35
CAPITOLUL 4. Aplicații ale microscopiei SEM în biologie și medicină

4.1. Etapele de pregătire a preparatelor biologice

Astăzi, microscopia SEM este utilizată nu numai în știința materialelor, științe chimice și
fizice, ci și în diverse domenii, cum ar fi medicina și biologia. Rezoluția spațială mare a SEM îl
face unul dintre cele mai versatile și puternice instrumente disponibile pentru cercetare,
analizând o gamă largă de caracteristici microstructurale ale probelor la scară nm - μm.
Microscopia electronică de baleiaj folosește o sondă de electroni focalizată pentru a extrage
punct cu punct informații structurale și chimice dintr-o regiune de interes dintr-o probă.
Materialele biologice sunt țesuturi vii și constau în principal din elemente ușoare cu aproape
99% compoziție chimică Z=1-20 și includ elemente majore (H, C, N, O) și elemente minore (Na,
Mg, Si, P, S, CI, K, Ca). Restul de 1% constă în principal din Z = 24-30 și include oligoelemente
Cr, Co, Cu, Fe, Mn, Zn și I, care sunt importante pentru diferite metaloenzime și coenzime. Apa
este o componentă esențială a probelor biologice vii, precum și a macromoleculelor organice
complexe, cum ar fi proteinele, lipidele și carbohidrații. Diverse elemente care alcătuiesc o
celulă: 59% H, 24% O, 11% C, 4% N, 2%, altele (P, S).
Colectarea probelor de țesut este efectivă pentru rezultatele finale. Este important să
încercăm să colectăm o probă reprezentativă de țesut viu. La colectarea probelor biologice,
disecția tisulară trebuie efectuată cu atenție. De exemplu, atunci când secționează o mică bucată
de țesut în scopuri de diagnostic, chirurgul trebuie să fie atent când apucă și disecă.
Pregătirea preparatelor biologice presupune parcurgerea a mai multor etape:
1. Fixarea. Prima și cea mai importantă etapă după prelevarea de probe pentru cercetarea
țesuturilor vii este metoda lor rapidă și convenabilă de fixare. Înainte ca descompunerea
celulară să înceapă imediat după moartea organismului, asistentul trebuie să fixeze
celulele pentru a preveni modificările structurale, ca urmare a degradării. Fixarea
convențională implică reticularea chimică a proteinelor (pentru a preveni acțiunea
enzimatică și digestia) și îndepărtarea apei pentru a denatura în continuare proteinele din
celulă. Natura chimică a agentului de fixare va împiedica declanșarea proceselor celulare
și va menține proba cât mai aproape de starea sa naturală. Caracteristicile unui bun
fixativ sunt: pătrunde ușor în celule și acționează rapid, este ireversibil și nu provoacă
artefacte de fixare.
2. Deshidratarea. Microscopia electronică de baleiaj convențională necesită ca apa și
fluidele corporale să fie fie îndepărtate din probe, fie imobilizate înainte de a fi
examinate și analizate. Strict vorbind, termenul „deshidratare” este folosit pentru a
descrie eliminarea apei. Deoarece materialele biologice sunt în mare parte apă,
deshidratarea este un proces potențial foarte distructiv, care provoacă artefacte din cauza:
a. Extragerii moleculelor cu un solvent desicant,
b. Precipitarea moleculelor din cauza pierderii apei,
c. Contracția eșantionului din cauza pierderii de apă:
- contracția este o consecință inevitabilă a deshidratării deoarece pierderea
solventului apos care înconjoară macromoleculele le face mai dense. Prin urmare,

36
 probele trebuie deshidratate pentru a le permite să se micșoreze treptat și să nu se
prăbușească din cauza pierderii rapide de apă. În acest scop, sunt utilizate multe
metode diferite, cum ar fi uscarea cu aer și deshidratarea chimică. Cele mai
frecvent utilizate desicanți sunt metanolul, etanolul și acetona. Etanolul și acetona
sunt fluide desicante comune pentru a păstra structura originală a probelor
biologice, cum ar fi țesutul peritoneal. Procesul de deshidratare se realizează prin
trecerea țesutului printr-o serie de alcooli de concentrație crescândă. Blocurile de
țesut sunt transferate succesiv la 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% și 100%
alcool. Blocurile sunt apoi plasate într-o a doua soluție de etanol 100% pentru a
se asigura că toată apa a fost îndepărtată. Rețineți că etanolul este higroscopic și
absoarbe vaporii de apă din aer. Etanolul absolut este absolut numai dacă se
acordă grijă ca apa să nu fie absorbită. Din acest motiv, deshidratarea este de
obicei începută cu 15-30% solvent în apă și concentrația de solvent este crescută
la 100% în trepte de 15-20%. Este important să se facă distincția între
deshidratare și deshidratare. În niciun caz țesăturile nu trebuie să fie uscate la aer.
Deshidratarea presupune înlocuirea lentă a apei din țesuturi cu un solvent organic.
Deshidratarea trebuie făcută relativ rapid pentru a evita supra-extracția compușilor
solubili în alcool și acetonă, dar suficient de lent pentru a evita plasmoliza.
d. Măcinarea probei la interfața solvent-aer.
3. Uscarea. Multe probe biologice conțin lichide, majoritatea fiind apă. Evaporarea
lichidului poate afecta negativ funcționarea mașinii. Prin urmare, cel mai bine este să ne
asigurăm că proba este uscată înainte de a o introduce în camera de probă a
microscopului electronic de baleiaj. După terminarea seriei de deshidratare, solventul
însuși trebuie îndepărtat din țesut fără a introduce tensiune superficială/artefacte de
uscare în eșantion. Acest lucru se realizează prin utilizarea unui lichid de tranziție, cel
mai frecvent uscare în puncte critice, liofilizare sau CO2 lichid, sau a unei game de
solvenți precum hexametildisilazan (HMDS), Freon 113, tetrametilsilan (TMS) și
PELDRI II, care sunt uneori utilizați pentru uscare cu aer, deoarece reduc forțele de
tensiune superficială ridicată care provoacă prăbușirea și contracția celulelor și
caracteristicile lor de suprafață. Artefactele precum contracția și distrugerea structurilor
de suprafață din cauza efectelor tensiunii superficiale pot deveni o problemă dacă probele
biologice sunt uscate la aer după deshidratare. Forțe semnificative sunt generate în
cavitățile mici atunci când este prezentă o interfață lichid/gaz și, pe măsură ce proba se
usucă, această interfață se deplasează prin țesuturi, distrugând cavitățile pe măsură ce
progresează. Acest fenomen poate duce chiar la distrugerea completă a probelor goale.
Orice deformare care apare poate fi confundată cu o caracteristică naturală a probei sau
cu efectul unui anumit tratament.
4. Montarea probelor biologice. Eșantioanele trebuie instalate pe suporturi pentru SEM
special utilizat. Majoritatea suporturilor pentru probe sunt fabricate din aluminiu sau
alamă, deși alama este mai scumpă decât aluminiul și nu oferă niciun beneficiu
suplimentar. Probele sau lamele cu material adeziv pot fi atașate la capacele de capăt
folosind colorant de argint coloidal, pastă de argint coloidal, colorant de carbon coloidal,
bandă de carbon sau bandă cu două fețe. Dacă se folosește bandă cu două fețe, vopseaua
sau pasta conductivă ar trebui să formeze o punte între tijă și suprafața probei, deoarece

37
 banda este un izolator. Lamelele sunt și izolatoare, așa că ar trebui să fie manipulate în
același mod. Diverse paste și vopsele trebuie să se usuce înainte de a fi introduse în
camera de probă a unui SEM convențional cu vid înalt, altfel degazarea purtătorului
materialului conductor va împiedica generarea unui vid adecvat.
5. Acoperirea prin pulverizare sau conductivitatea suprafeței. Mostrele de acoperire
servesc două scopuri principale:
a. Pentru a face probele conductoare electric, astfel încât electronii în exces capturați
de atomii din eșantion să poată fi atrași de pământ și
b. Pentru a introduce contrast ca să fie vizibile la microscop.
- după cum s-a menționat mai devreme, țesuturile biologice tind să fie buni
izolatori, rezultând artefacte de imagine cauzate de încărcare în SEM. Odată ce
probele s-au uscat, acestea trebuie montate pe știfturi, acoperite și examinate cât
mai curând posibil. Dacă probele urmează să fie depozitate, acestea trebuie
plasate în camere uscate pentru a minimiza rehidratarea datorată umidității
atmosferice. În special, o probă acoperită este supusă unei deteriorări a calității
imaginii dacă proba se umflă higroscopic și apar microfisuri în învelișul metalic
subțire depus pe ea pentru a crește conductivitatea. În SEM-urile convenționale
cu vid înalt, curentul fasciculului de electroni primar nu poate atinge potențialul
de masă, așa că dacă întregul curent al eșantionului nu este condus la masă, apare
distorsiunea imaginii atunci când proba acumulează o sarcină negativă din
fascicul și fasciculul este respins de negativ. a probei. încărca. Incinerarea
probelor poate fi o problemă în regiunile producătoare de sarcină, așa cum tocmai
s-a descris. Cu excepția carbonului, stratul conductiv electric al probelor SEM,
STEM, TEM, metalele grele sunt folosite pentru a face acoperiri pentru
microscopia biologică. Metalele grele sunt folosite atât pentru a furniza
conductivitate electrică, cât și ca sursă de electroni secundari pentru SEM.
Depunerea unui strat subțire la scară nm de metale grele permite electronilor să
părăsească proba și să meargă la pământ fără a afecta semnificativ proprietățile de
suprafață ale probei. Aplicarea unui strat de metal dens în electroni pe probele
compuse în principal din elemente ușoare, cum ar fi carbonul și azotul, ajută, de
asemenea, la îmbunătățirea semnalului reflectat de la mostrele de elemente
luminoase, oferind contrast și detalii ale suprafeței mai mari. Probele biologice
din SEM sunt de obicei placate cu platină, aur sau aur-paladiu datorită
dimensiunii granulelor fine necesare pentru SEM convențional.

4.2. Microbiologie
Ingineria biomedicală este aplicarea principiilor și metodelor de inginerie pentru
rezolvarea problemelor din biologie și medicină. Acest lucru este evident în toate domeniile
asistenței medicale, de la diagnostic și analiză până la tratament și recuperare, și a intrat în
conștiința publicului prin proliferarea dispozitivelor medicale implantabile, cum ar fi
stimulatoarele cardiace și șoldurile artificiale, până la tehnologii mai futuriste, cum ar fi ingineria
celulelor stem și Imprimarea 3D a organelor biologice. Ingineria în sine este un domeniu
inovator, care generează idei care duc la orice, de la automobile la aerospațial, de la zgârie-nori

38
la sonar. Ingineria biomedicală se concentrează pe progresele care îmbunătățesc sănătatea
umană și îngrijirea sănătății la toate nivelurile.
Un microscop este absolut esențial într-un laborator de microbiologie: majoritatea
microorganismelor nu pot fi văzute fără microscop, cu excepția unor ciuperci. Și, desigur, există
microbi care nu pot fi văzuți nici măcar la microscop, decât dacă este un microscop electronic,
cum ar fi virușii. Este esențial să înțelegem cum să utilizăm un microscop în mod eficient și cum
să utilizăm diferitele tipuri de microscopie: câmp luminos, contrast de fază și întuneric.
Microscopia cu contrast de fază și câmp întunecat sunt utilizate pentru lamele umede, în timp ce
microscopia cu câmp luminos poate fi utilizată atât pentru lamele umede, cât și pentru probele
colorate. Această colorare trebuie să fie simplă folosind un singur colorant. Totul de pe
diapozitiv va fi de aceeași culoare, dar vom putea distinge formele, dimensiunile și locația
bacteriilor.
Un biofilm (biopeliculă) este o comunitate complexă de una sau mai multe specii
microbiene, formată de obicei ca mucilagiu atașat la o suprafață datorită formării unei substanțe
extrapolimerice (EPS) care se atașează la o suprafață sau la o interfață între suprafețe (de
exemplu, între aer și apă). În natură, biofilmele sunt numeroase și adesea ocupă nișe complexe
în ecosisteme. În medicină, biofilmele pot acoperi dispozitivele medicale și pot exista în
interiorul corpului. Deoarece au caracteristici unice, cum ar fi rezistența crescută la sistemul
imunitar și la antimicrobiene, biofilmele prezintă un interes deosebit pentru microbiologi și
clinicieni. Deoarece biofilmele sunt groase, ele nu pot fi observate foarte bine la microscopie cu
lumină; tăierea biofilmului pentru a crea o probă mai subțire poate ucide sau perturba
comunitatea microbiană. Microscopia confocală produce imagini mai clare ale biofilmelor,
deoarece se poate concentra pe un plan z la un moment dat și poate produce o imagine
tridimensională a unei probe groase. Coloranții fluorescenți pot fi utili pentru identificarea
celulelor dintr-o matrice.

Figura 4.1. Specii de bacterii dezvoltate într-un biofilm pe suport din oțel inoxidabil [7]

Microscopia electronică poate fi folosită pentru a observa biofilmele, dar numai după ce
proba a fost deshidratată, ceea ce provoacă artefacte nedorite și distorsionează proba. În plus
față de aceste abordări, fluxul de apă prin formele de biofilm (cum ar fi conurile și ciupercile)
poate fi monitorizat folosind imagini video ale mișcării celulelor acoperite cu substanță
fluorescentă (Fig. 4.1).

39
 Un microscop obișnuit are lentila obiectiv orientată în jos și captează lumina care este
transmisă printr-o probă biologică fixată pe o lamă de microscop. Acesta este diferit de un
microscop destinat studiului culturilor de țesuturi, care este conceput special pentru a vizualiza
culturile de celule crescute în cutii Petri. Acest tip de microscop are obiective inversate, sub
cutia Petri și orientate către cutiile Petri unde cultura începe să crească. Ambele folosesc
microscopia cu lumină transmisă.
Alte metode pentru vizualizarea bacteriilor și a frotiurilor de cultură pot include utilizarea
unui microscop cu contrast de fază. De la apariția microbiologiei odată cu descoperirea
bacteriilor, s-a dezvoltat și o nouă eră a tehnicii microscopice. Pentru că este imposibil de
observat cu ochiul liber niște structuri atât de mici precum bacteriile. Microscoapele folosite
anterior au fost cele simple, microscoapele optice. Pentru că erau dificil de observat particulele
submicronice la microscopul optic, după apariția microscopiei electronice, acesta a permis
identificarea componentei nucleare a celulelor bacteriene. După aceea, o tehnică mai avansată
numită microscopia AFM a depășit toate limitările existente deja în studierea structurilor
ultrafine ale celulelor bacteriene, deoarece putea oferi informații morfologice cantitative in situ
în timp real. Cele mai recente metode de microscopie sunt microscopia cu epifluorescență și
microscopia laser cu scanare confocală. Diferența dintre diferitele metode de microscopie se
bazează pe sursa de transmisie către proba de studiat.

4.3. Inginerie biomedicală

Tehnicile imagistice moderne sunt necesare pentru a oferi un diagnostic precis, în același
timp cât mai inofensiv pentru pacient. La microscopia și imagistica biomedicală, mulți
cercetători lucrează în acest scop: îmbunătățesc procedurile de diagnostic stabilite, folosesc
procese fizice complementare pentru noi metode și concepte în imagistica medicală și
microscopie și optimizează metodele existente pentru diverse scopuri medicale. Mai mulți
oameni de știință microscopia și imagistica biomedicală explorează, de asemenea, metode care
combină imagistica medicală cu radioterapia.
Ingineria biomedicală aplică principiile și conceptele ingineriei în medicină și biologie.
Această abordare interdisciplinară combină ingineria cu cercetarea biologică pentru a îmbunătăți
diagnosticul medical, monitorizarea și procedurile terapeutice. Una dintre provocări este de a
înțelege modul în care suprafețele materialelor interacționează cu țesuturile biologice, cum ar fi
reducerea la minimum a reacțiilor de respingere asociate implanturilor. Cu o abordare
multidisciplinară, nevoile de microscoape și soluții de microscopie acoperă o gamă extrem de
largă, de la microscoape stereo pentru sarcini de pregătire și procesare a obiectelor mici.
Utilizarea microscoapelor ușoare pentru examinarea materialelor pentru a înțelege suprafața și
compoziția metalelor și compușilor care sunt în contact direct cu materialele biologice. Când
trebuie să înțelegem interacțiunile funcționale și procesele din interiorul celulelor, microscoapele
fluorescente detectează semnale de la proteinele fluorescente. Microscoapele electronice oferă
informații de înaltă rezoluție despre suprafața materialelor, precum și informații la nivel
subcelular.

40
 Vizualizarea imaginilor este o parte importantă a dispozitivelor medicale. Această zonă
este explorată de medici, permițându-le să se uite direct sau indirect la lucruri care sunt în mod
normal invizibile (datorită dimensiunii sau locației lor). Aceasta poate include utilizarea
ultrasunetelor, magnetismului, UV, radiațiilor radio și alte mijloace. RMN-ul (imagistica prin
rezonanță magnetică) este un exemplu de aplicare a imagisticii de diagnostic în ingineria
biomedicală. Tehnologia imagistică este foarte adesea un diagnostic medical necesar. De obicei,
cea mai sofisticată tehnică se găsește în spital, incluzând: fluoroscopia, imagistica prin rezonanță
magnetică (RMN), tomografia cu emisie de pozitroni (PET), proiecția cu raze X precum X și
tomografia computerizată, ecografiile, microscopia optică, microscopia electronică.

Figura 4.2. Imagini SEM ale unui suport celular artificial. Adaptat din [8]

Un studiu privind leziunile scheletice și ingineria țesuturilor efectuat în Polonia a evaluat

utilizarea schelelor de titan în ingineria țesuturilor. Este posibilă înlocuirea pierderii osoase cu
schele de titan personalizate care susțin structurile de zăbrele create prin fabricarea aditivă. Este
foarte important de eliminat acești aditivi în timpul tratamentului chimic folosit pentru lustruirea
lemnului. Efectul acestei lustruiri chimice asupra porozității și morfologiei armăturilor a fost
studiat la SEM. Mărimea particulelor chimice a fost determinată folosind software-ul
ParticleMetric, iar morfologia înainte și după lustruire a fost prezentată folosind o imagine SEM
ulterioară. Studiul a fost realizat cu succes folosind software-ul PoroMetric, cu ajutorul căruia
cercetătorii au vizualizat și măsurat efectul lustruirii chimice asupra porilor cadrului.

4.4. Culturi celulare și tisulare

Cultura celulară păstrează în principal celule care rezultă din sursă într-un mediu
artificial. În sistemele de cultură celulară, celulele care se află într-un câmp tridimensional în
țesuturi vor fi cultivate și examinate prin furnizarea unor circumstanțe adecvate în condiții .
Există spații de utilizare foarte frecvente în culturile celulare. Putem întâlni aceste tipuri de
căutare în aproape toate zonele. Zonele utilizate în care se utilizează cultura celulară poate fi
calculată ca o producție de anticorpi monoclonali, vaccinuri, enzime, hormoni, interleukin și
anumiți factori de creștere. În plus, studiile privind celulele culturale servesc prea multe zone,
cum ar fi studiile de toxicologie, dezvoltarea de noi medicamente, precum și metodele de
tratament celular sau celulele Stem. În plus, în prezent, în paralel, în paralel, cu îmbunătățirea
experimentată a celulei de tulpină și în domeniul geneticii, studiul celulelor culturale a fost un

41
loc important în domeniul biotehnologiei, al terapiei celulare și a medicamentelor de regenerare,
fie că lucrează cu culturi celulare primare, culturi secundare sau linii celulare, toate au multe
dintre aceleași probleme: creșterea lentă, diferențierea spontană, evaporarea, poluarea și multe
alte probleme care necesită depanare. Ca rezultat, studiile de celule de cultură au nevoie de
condiții speciale de lucru, de echipamente speciale și de angajați cu experiență.
Cercetătorii care lucrează la structuri auto-asamblate în științe biologice sau nanostructuri
în știința materialelor sunt interesați de imagistica de înaltă rezoluție. Unele structuri auto-
asamblate ocupă un interval de dimensiuni în care limita teoretică de rezoluție a microscopiei
optice de aproximativ 160 nm este insuficientă pentru a le imagine. Celula formează mai multe
tipuri de proeminențe. Filopodia este o extensie subțire, înclinată a citoplasmei, cu o lățime
medie de 50-100 nm. Filopodiile sunt deosebit de dificil de vizualizat deoarece se pot extinde la
>160 nm la bază, unde se integrează cu restul citoplasmei. În timp ce porțiuni mai mari de
structuri sunt adesea folosite pentru a estima abundența filopodiilor pe celule, numărul mai mare
de structuri poate lipsi din imaginea vizualizată de LM. Astfel, imagistica LM oferă rezultate
inexacte și înșelătoare. Pentru a evalua cu precizie prevalența lor, filopodia trebuie vizualizată
cu un instrument sau o modalitate de înaltă rezoluție. Filopodia este doar un exemplu de
structură a suprafeței celulare care se află la sau dincolo de granița LM. Caracteristici
suplimentare, cum ar fi microvilozitățile, gropile acoperite, caveolele și stereociliile folosesc
procese de auto-asamblare pentru a crea structuri sub-LM.
Studiul insectelor

a) b)

c) d)

Figura 4.3. Imagini SEM ale diverselor structuri la albină: a) și b) ochi fațetat; c) și d) tricoame
pe suprafața antenelor

42
 4.5. Rezultate imagistice ale preparatelor biologice cu tehnica SEM
Principiile fizice de bază ale imagisticii cu raze X în radiologie nu s-au schimbat prea
mult de când Roentgen a descoperit razele X în urmă cu peste o sută de ani. Abordarea
tradițională se bazează pe atenuarea razelor X ca singură sursă de contrast și ignoră cealaltă sursă
de contrast suplimentară. Pe de altă parte, tehnicile de imagistică cu contrast de fază oferă
modalități de a crește sau de a suplimenta degradarea standard a contrastului prin includerea
informațiilor de fază. În ultima perioadă, studiile au permis utilizarea radiografiei cu contrast de
fază pentru viitoare aplicații clinice în radiografie și tomografie computerizată.

Figura 4.4. Imagini SEM cu aplicații în medicină [9]

Imagistica opto-acustică sau imagistica foto-acustică este insensibilă la împrăștierea

fotonilor în țesutul biologic, spre deosebire de metodele convenționale de imagistică optică, și
face posibilă vizualizarea optică de înaltă rezoluție în adâncimea țesutului. Progresele recente în
tehnologia laser, strategiile de detectare și tehnicile de inversare au condus la îmbunătățiri
semnificative ale capacităților sistemelor opto-acustice. O caracteristică cheie de abilitare este
dezvoltarea imaginilor multispectrale cu viteză video în 2D și 3D, care oferă diferențierea rapidă,
spectrală a modalităților de absorbție a fotografiilor.
Există o provocare privind reprezentarea mediului înconjurător în creierul nostru, cu
scopul de a ne permite să interacționăm eficient cu factorii din jur. Creierul ar putea reprezenta
mediul înconjurător, genera comportament și adapta la condițiile în schimbare prin creerea de
hărți codificate. Prof. Ruben Portugues, specializat pe funcția și disfuncția circuitului cerebral, a
propus o soluție folosind larva de pește zebra ca organism model. În comparație cu oamenii, care
au creier cu 100 de miliarde de neuroni, peștele-zebră are creier mic (100.000 de neuroni).
Dimensiunea mică și transparența acestor vertebrate le permit cercetătorilor să-și monitorizeze
activitatea neuronală la microscop folosind indicatori fluorescenți. Pentru a explora modul în
care schimbările din mediu afectează activitatea neuronală, cercetătorii creează un mediu de
realitate virtuală cu reguli adaptabile pentru pești. Apoi monitorizează activitățile neuronale ale
peștilor în timp ce schimbă regulile. În plus față de tehnica microscopică, echipa de cercetare
folosește o mare varietate de metode, de la electrofiziologie in vivo și optogenetică până la
analiza metadatelor pentru a răspunde la întrebări biologice și neurofiziologice fundamentale.

43
 Figura 4.5. Imagini SEM cu aplicații în medicină [10]

„Imagistica morfo-moleculară bazată pe țesuturi și caracterizarea multi-parametrică

profundă a devenit o problemă fundamentală a îngrijirii individualizate a pacientului. Integrarea
histologiei cu informații moleculare, cum ar fi rezultatele de secvențiere sau datele de
spectrometrie de masă, permite o înțelegere mai profundă a afecțiunilor și, astfel, abordări
terapeutice adaptate. Acest lucru este important în domeniul oncologiei, unde astfel de seturi de
date integrate cu „imagini” multi-parametrice dictează deja deciziile terapeutice și permit
aplicarea de noi medicamente care prelungesc în mod substanțial supraviețuirea pacientului.
Pentru a exploata noul set de informații despre boli morfo-moleculare, trebuie aplicate noi
metode de bio-informatică și de învățare asistată de calculator pentru înțelegerea adevăratei
naturi a bolii.
Biomarkerii imagistici prin rezonanță magnetică permit o caracterizare cuprinzătoare a
țesutului care oferă informații funcționale, fiziologice, metabolice, celulare și moleculare dincolo
de structurile anatomice. În ultimii ani, tehnicile de hiperpolarizare au permis creșterea
sensibilității scăzute inerente a rezonanței magnetice cu mai mult de patru ordine de mărime,
deschizând noi aplicații, de la urmărirea reacțiilor chimice în timp real până la monitorizarea
directă a proceselor metabolice in vivo. O altă tehnică RMN funcțională care s-a arătat deja
promițătoare în caracterizarea țesutului în studiile clinice este RMN-ul ponderat prin difuzie
(DW-MRI). Acesta permite evaluarea cantitativă a coeficientului de difuzie aparent care
depinde de proprietățile microstructurale ale țesutului, inclusiv de densitatea de celule și
compoziția matricei intercelulare. Echipa coordonată de prof. Portugues a dezvoltat molecule
hiperpolarizate sensibile și tehnici avansate de RMN cu difuzie, cu scopul de a oferi noi
biomarkeri imagistici pentru caracterizarea funcției țesuturilor.

44
 a) b)

Figura 4.6. Imagini SEM ale grăuncioarelor de polen de mac Papaver somniferum

a) b)

Figura 4.7. Imagini SEM ale aripii de fluture Lepidoptera (culoarea, forma și orientarea solzilor
identifică specia de fluture)

45
CONCLUZII ȘI PROPUNERI

● Utilizarea tehnicii microscopiei electronice de baleiaj SEM, care în prezent este în

continuă dezvoltare, prezintă un beneficiu foarte important lumii, și anume exploatarea
domeniului ultrastructural al materiei, care cuprinde toate cunoștințele fundamentale din
domeniile clasice (biologie, fizică, chimie, zoologie, morfologie etc.).
● Tehnica SEM permite investigații multiple pornind de la unitatea celulară până la nivel
de moleculă sau atom, facilitează înțelegerea (auto)organizării ansamblurilor moleculare
în structuri mai ample, a proceselor biochimice care au loc şi a funcționalității acestora.
● Rezultatele obținute prin aplicarea tehnicii SEM contribuie la obținerea unei corelații
între structură și proprietățile materialelor, de la nivel micrometric până la nivel atomic.
● În domeniul nanotehnologiei, tehnica SEM este utilizată pentru diagnosticarea și analiza
chimică a diferitelor tipuri structurale cum ar fi, analiza punctelor de topire a
nanocristalelor sau determinarea unor parametri mecano-electrici ai elementelor
nanostructurate.

46
BIBLIOGRAFIE

1. Enciclopædia Britannica
2. https://www.newworldencyclopedia.org/entry/Electron_microscope
3. Binig G, Rohrer H, Gerber C, Weibel E. Surface studies by scanning tunneling
microscopy. Phys Rev Lett 1982 ; 49 : 57-61.
4. F.C. Nicolls, G. de Jager, şi B.T. Sewell, “Use of a general imaging model to achieve
predictive autofocus in the scanning electron microscope“, Publicat în
“Ultramicroscopy“, 69(1):25–37, August 1997.
5. Dai Y K 2017 Application of scanning electron microscopy in the production and
research of bimetallic laminated composites Wire and Cable (4)
6. D.M. Holburn şi K.C.A. Smith, “Topographical analysis in the SEM using an automatic
focusing technique“, Publicat în “Journal of Microscopy“, 127(1):93–103, Iulie 1982.
7. Lawrence Firestone, Kitty Cook, Kevin Culp, Neil Talsania, şi Jr. Kendall Preston,
“Comparison of autofocus methods for automated microscopy“, Publicat în “Cytometry“,
12(3):195–206, 1991.
8. Studiul clinic și studiul in vitro care compară eficacitatea tratării leziunilor osoase cu
alogrefele față de grefele osoase xenogeneice sintetice sau foarte prelucrate Kubosch et
al. BMC Musculoskeletal Disorders (2016)
9. Rafael C. Gonzalez şi Paul Wintz, “Digital Image Processing“, Publicat în
“AddisonWesley Publishing Company“ , Reading, Massachusetts, 1977.
10. Frans C.A. Groen, Ian T. Young, şi Guido Ligthart, “A comparison of different focus
functions for use in autofocus algorithms“, Publicat în “Cytometry“, 6:81– 91, 1985.
11. D’Lemos, R.S., Kearsley, A.T., Pembroke, J.W., Watt, G.R., and Wright, P. (1996)
Istoricul creșterii cuarțului în granit a fost dezvăluit prin tehnicile de catodoluminiscență
de scanare. Geological Magazine, 134, 549–552

47
 Anexe

Anexa 1. Primul SEM al lui M. Von Ardenne

48
Anexa 2. Imagine electronică secundară

49