UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII PENTRU INDUSTRIA ALIMENTARĂ

PROIECT

DISCIPLINA: BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE

Obţinerea pe cale biotehnologică a unor proteaze

București

2022

1
REZUMAT

Proteazele reprezintă un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care scindează

molecula proteică în fragmente polipeptidice formate din aminoacizi uniţi prin legături
peptidice.
Surse de proteaze cele mai des utilizate sunt microorganismele deoarece prezintă numeroase
avantaje.

Obţinerea preparatelor microbiene este un proces complex ce implică parcurgerea a trei etape:

1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea mecanică şi fizico chimică a materiilor

prime ce intră în compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această etapă presupune
operaţii de: dozare, mărunţire, solubilizare, sterilizare etc.

2. Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor starter intermediare şi a culturii de

producţie, urmată de etapa fermentativă prorpiu-zisă.

3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a enzimelor.

În cadrul etapei a doua din procesul de obţinere al preparatelor enzimatice ce conţin proteaze,
fermentaţia poate fi:

 de suprafaţă în care se utilizează un mediu solid pe care se cultivă microorganismul

(de regulă un mucegai filamentos)
 submersă, în care mediul este lichid şi se află într-un reactor unde toţi parametrii
fermentaţiei sunt perfect controlaţi. În cazul acesteia procesul poate fi:
 Procedeul nealimentat
 Procedeul alimentat
 Procedeul continuu

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea
acesteia de un support

Metodele de creştere a producţiei de proteaze sunt de mai multe feluri precum urmează:

• metode clasice de ameliorare a microoganismelor, prin tratament cu agenţi mutageni

• metode moderne, de inginerie genetică ce includ: fuziunea de protoplaşti şi tehnologia

ADN recombinant

Cuvinte cheie: proteaze, microorganisme, fermentaţie, agenţi mutageni, protoplaşti, ADN

recombinant

2
CUPRINS

1. Introducere.........................................................................................................................4
2. Aspecte generale privind proteazele................................................................................6

2.1. Definirea proteazelor

6

2.2. Clasificarea şi caracterizarea proteazelor

6

2.3. Utilizarea proteazelor în industrie

8

2.4. Surse de proteaze 9

3. Obţinerea pe cale biotehnologică a preparatelor enzimatice..........................................12

3.1. Tipuri de preparate enzimatice

12

3.2. Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimatice ce conţin proteaze

12

3.2.1.Pregătirea mediului de cultură 13

3.2.2.Etapa biologică 14

3.2.3.Separare, purificare şi standardizarea enzimelor 16

3.3. Imobilizarea enzimelor

18
4. Creşterea producţiei de proteaze.......................................................................................21

4.1. Creşterea producţiei de proteaze prin metodele clasice de ameliorare a

microoganismelor 21

4.2. Creşterea producţiei de proteaze prin inginerie genetică

21
5. Concluzii...........................................................................................................................23
6. Referințe bibliografice.....................................................................................................24

3
 1. Introducere

Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea industrială a diferitelor materii prime cu

ajutorul microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor agenţi biologici (microorganime,
enzime) adăugaţi în scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor procese tehnologice.
(Hoanţă, 2015)

Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor

exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de fructe, zahărului,
panificaţiei, etc.)(Hoanţă, 2015)

Proteazele sunt un grup de enzime la mare căutare datorită aplicațiilor biotehnologice largi și
diferite.(Chimbekujwo şi colab., 2020)

Proteazele, care provoacă scindarea legăturilor peptidice dintre resturile de aminoacizi din alte
proteine, sunt una dintre cele mai importante grupuri de enzime industriale, reprezentând mai
mult de 65% din vânzările totale ale enzimelor la nivel mondial ( Shankar și colab., 2011;
Sundararajan și colab., 2011; Annamalai și colab., 2014).

Proteazele bacteriene sunt cele mai semnificative în comparație cu proteazele de plante,

animale și fungi datorită naturii lor extracelulare, randamentului mare de producție, a spațiului
limitat și perioadei scurte de timp necesare cultivării lor și a fezabilității lor la manipulare
genetică (Breithaupt, 2001; Selvamohan şi Sherin, 2010; Hakim şi colab, 2018)

Aplicarea proteazei în industriile de producție a crescut semnificativ. Aceste enzime devin

acum importante pentru avantajele lor tehnice și economice. Obstacolul major în calea
utilizării proteolitice a enzimelor industriale este costul lor de producție, puritatea,
randamentul, stabilitatea și specificitatea, care a afectat în mod remarcabil randamentul
cantităților mari de proteaze(Chimbekujwo şi colab., 2020).

Aceste enzime hidrolitice sunt implicate în industria alimentară pentru creșterea valorii
nutriționale, a digestibilităţii, a palatabilităţii, a aromei și pentru reducerea compușilor
alergeni, precum și în gestionarea deșeurilor menajere și industriale. Sunt utile şi în în sinteza
și elucidarea structurală a proteinelor (Singh, 2016).

De asemenea, printre diferitele tipuri de proteaze, proteazele alcaline au aplicații largi în

diferite industrii, cum ar fi obţinerea de detergenți, în pielărie, în industria farmaceutică,
pentru prelucrarea proteinelor, obţinerea de alimente şi reactivi de diagnostic, procesarea

4
soiei, în industriile de sinteză a peptidelor, extracția argintului din filmele cu raze X uzate și
tratarea deșeurilor. (Shah și colab., 2010; Kumar și colab., 2014; Rathod și Pathak, 2016;
Yildirim și colab., 2017; Asha și Palaniswamy, 2018). Prin urmare, cererea pentru proteaze
alcaline foarte active importante din punct de vedere industrial, cu specificitate și stabilitate
ridicate a pH-ului, temperaturii și solvenților organici continuă să îmbunătățească căutarea de
noi enzime (Vijayaraghavan și colab., 2012).

Odată cu creşterea preocupării pentru ca oamenii să aibă o viaţă mai sănătoasă, , peptidele cu
efecte bioactive asupra antioxidării (Sui şi colab., 2011) și antihipertensiunii (Wang și colab.,
2013) câștigă popularitate. În consecință, mai multe cercetări s-au concentrat pe screeningul
tulpinilor cu producţii ridicate de proteaze pentru a îmbunătăți randamentele de obţinere al
peptidelor.(Hossain și colab., 2017).

Cu toate acestea, până în prezent, o mare parte din activitățile enzimatice bine definite încă nu
au o secvență de proteine asociată, în ciuda progresului imens al metodelor genomice și
bioinformatice pentru predicția funcției.(Lario şi colab., 2020)

5
 2. Aspecte generale privind proteazele

2.1. Definirea proteazelor

Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din aminoacizi, iar din punct
de vedere funcţional acţionează ca biocatalizatori biologici care au rolul de a permite
realizarea diverselor reacţii chimice cu o viteză mărită.

Proteazele reprezintă un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care scindează

molecula proteică în fragmente polipeptidice formate din aminoacizi uniţi prin legături
peptidice.

Enzimele din categoria proteazelor hidrolizează majoritatea proteinelor comune de natură

vegetală şi animală, printre care se numără:

 caseina,
 hemoglobina,
 gelatina,
 albumina din ouă,
 glutenul,
 proteina din soia

Condiţiile în care are loc hidroliza precum şi randamentul operaţiei în sine depind de natura,
caracteristicile şi gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat.

2.2. Clasificarea şi caracterizarea proteazelor

Conform recomandǎrilor International Unit of Biochemistry, clasificarea enzimelor

proteolitice se face în şase familii ce se diferenţiază între ele prin secvenţele de aminoacizi
care alcătuiesc situsul activ. (Faludi, 1989) Acestea sunt prezentate sintetic în tabelul 2.2.1.
împreună cu reprezentanţii cei mai semnificativi.

Tabel 2.2.1. Familii de enzime proteolitice

Familia Proteaze reprezentative

Serin proteaze I Chimiotripsina, tripsina, elastaza, kalikreina,pancreatina

6
 Serin proteaze II Subtilizina
Cistein proteaze Papaina, actinidin, catepsina B şi H de la şobolan
Aspartic proteaze Penicilopepsin, renina, proteaze acide de la Rhizopus sp.
Metaloproteaze I Carboxipeptidaza A bovină
Metaloproteaze II Termolizina
(Sursa: https://doi.org/10.1068%2Fd070397)

Există şi alte enzime proteolitice identificate la diferite grupe de organisme care nu pot fi
încadrate încă în nici una dintre grupele de mai sus deoarece mecanismul lor de acţiune şi
situsul activ nu este cunoscut cu exactitate. Acesta este cazul colagenazelor şi
aminopeptidazelor.

Se remarcă faptul că serin proteazele includ două familii distincte în funcţie de provenienţa
lor:

 serin-proteaze provenite de la mamifere

 serin-proteaze de origine bacteriană

Deşi prezintă un mecanism enzimatic comun, cele două familii de serin proteaze diferă ca
secvenţă de aminoacizi şi ca structură tridimensională.

Metalopreoteazele sunt activate de ionii metalici legaţi de centrul activ al enzimei (Ca2+,
Zn2+, Mg2+, Fe2+) şi se impart în mod similar serin proteazelor (provenite de la mamifere şi
de la bacterii), pe baza originii lor, dar şi în funcţie de structura si activitatea lor chimică
(metaloproteaze neutre şi metaloproteaze alcaline).

Metaloproteazele neutre conţin de obicei Zn şi prezintă specificitate faţă de aminoacizii

hidrofobi implicaţi cu gruparea amino în legătura peptidică, iar metaloproteazele alcaline
conţin, de asemenea, un ion metalic implicat în mecanismul de reacţie catalitică.

Proteazele serinice au în centrul lor activ serină şi histidină şi cuprind alte 4 subgrupe:

• proteaze similare tripsinei care cuprind la rândul lor:

 Tripsină
 Chimotripsină
 enzime produse de specii de Streptomyces ce au ca trăsătură istinctivă specificitatea de
substrat pentru legăturile Arg22 – Gly23 şi Lys29 – Ala30 din lanţul β-insulinic
• proteaze alcaline (subtilizine sau subtilopeptidaze) sunt produse de bacterii, drojdii şi
fungi, fiind prezente şi în ţesuturile animale. Au acţiune specifică faţă de resturile de
aminoacizi aromatici sau hidrofobi care participă cu gruparea carboxil la legătura care se
scindează. În această sugrupă se încadrează:
 proteazele alcaline produse de unele tulpini de B.subtilis (bacilopeptidaze)
 proteazele fungice din Aspergillus oryzae

7
 • proteaze Myxobacter α-litice;
• proteaze stafilococice.

Bacilopeptidazele pot fi clasificate în două grupe:

• Bacilopeptidaze A care cuprind:
 subtilizina Carlsberg (protează alcalină produsă de tulpini de B.licheniformis)
 proteaza alcalină produsă de B.pumilis;
• Bacilopeptidaze B care include:
 subtilizina NOVO (protează alcalină sintetizată de B.subtilis NRRL B3411)
 subtilizina BNP (Bacterial Protease Nagarse),protează alcalină din B. subtilis var.
amylosacchariticus

Proteazele termofile (Salleh şi colab., 2006; Maruthiah şi colab., 2013; Elibol şi Moreira,
2003; Annamalai şi colab., 2014, Matpan Bekler şi colab., 2015) pot produce randamente
excepțional de ridicate ale produsului finit și sunt avantajoase în diverse aplicații, cum ar fi
utilizarea temperaturilor de procesare mai ridicate, viteze de reacție mai rapide, o creștere a
solubilității reactanților și produșilor negazoși și incidența redusă a contaminării microbiene
de la organisme mezofile (Kumar şi Swati, 2001; Haki şi Rakshit, 2003; Kikani şi Singh,
2012; Sookkheo şi colab., 2000).

2.3. Utilizarea proteazelor în industrie

Principalele domenii în care proteazele şi-au găsit utilizări sunt:

 La fabricarea de produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, în panificaţie,

în special în procesele de maturare
 În compoziţia detergenţilor;
 Industria textilă, hârtiei şi a furajelor pentru animale;
 Analiza alimentelor, diagnoză chimică şi terapie;
 În inginerie genetică;
 În sinteza și elucidarea structurală a proteinelor
 În industria farmaceutică
 În extracția argintului din filmele cu raze X uzate
 În bioremediere prin tratarea deşeurilor

Printre avantajele utilizării proteazelor în comparaţie cu catalizatorii chimici se numără:

 au capacitatea de a cataliza reacţiile chimice în condiţii blânde de temperatură, pH,

presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie şi nu necesită echipamente
scumpe rezistente la coroziune.
 enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc la
obţinerea de produşi de reacţie secundari nedoriţi. În aceste condiţii nu sunt necesare
cheltuieli mari privind rafinarea şi purificarea produsului ce urmează a fi fabricat.

8
  comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al mediului
compuşi biodegradabili care nu necesită costuri semnificative de epurare.
 anumite enzime nu sunt limitate numai la acţiunea în mediul apos, putând acţiona şi la
interfaţa dintre două faze, apă: solvent organic sau apă:ulei etc.

Cu toate acestea prezintă şi o serie de dezavantaje:

 au stabilitate limitată;
 de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singură dată.

2.4. Surse de proteaze

Sursele utilizate în fabricarea preparatelor enzimatice ce conţin proteaze precum şi

dezavantajele şi avantajele utilizării acestora sunt prezentate în tabelul 2.4.1..

Tabel 2.4.1. Surse de proteaze

Dezavantajele
Sursa Proteaze extrase Avantajele utilizării sursei
utilizării sursei
ţesuturi  producţia
animale/ limitată,
subprodusele  apariţia unor
din industria boli
cărnii (encefalopatia
(ficat, pancreas, chimozină (renina) ▬ spongiformă la
inimă, bovine)
rinichi,creier,
mucoasă
stomacală şi
intestinală)
 prezenţa
unor
substanţe
potenţial
ţesuturi vegetale
 papaina, dăunătoare
(seminţe
sănătăţii
germinate sau  ficina
omului (ex.
negerminate,  bromelina, ▬
compuşii
rădăcini, fructe,  complexul enzimatic fenolici)
sevă, latexuri, din malţ  prezenţa
frunze)
unor
compuşi
toxici de
comtaminare
microorganisme  microorganismele se  substanţe

9
 pot obţine în cantităţi toxice sau
mari (biomasă) prin potenţial
cultivare în instalaţii toxice (cum
speciale pe medii de sunt şi
cultură ieftine (tărâţă antibioticele)
de grâu, extract de
porumb, melasă,
şroturi de soia sau
floarea soarelui, zer),
 ciclul de dezvoltare
al microorganismelor
este foarte scurt faţă
de cel al plantelor sau
animalelor;
 producţia de enzime
de către
microorganisme
poate fi mărită prin
selectarea şi
utilizarea de tulpini
mutante, înalt
( în special
performante
bacteriile din
(productive) şi prin
genurile Bacillus
stabilirea condiţiilor
si Streptomyces)
optime fizice şi
chimice pentru
producerea de
enzime
 proprietăţile
enzimelor şi
specificitatea de
acţiune diferă cu
natura
microorganismelor
producătoare, astfel
industrial se pot
obţine preparate care
corespund întocmai
scopului dorit.
 preparatele
enzimatice obţinute
pot avea activităţi
diferite cu
predominanţa unei
activităţi.

După cum se observă şi în tabelul anterior, bacterii din genul Bacillus sunt o sursă foarte
utilizată, producând cantități mari de protează extracelulară în timpul fazelor de creștere post-
exponențială și staționară în mediul de cultură (Lin şi colab., 2015, Ahmetoglu şi colab.,

10
2015). Dintre acestea, Bacillus licheniformis este utilizat pe scară largă în fermentarea
enzimelor industriale, biopolimerilor și metaboliților (Zhang şi colab., 2021; Sánchez-Leóna
şi colab., 2020; Guo şi colab., 2015). În ultimii ani, a atras atenția din ce în ce mai mult
datorită faptului că în general e recunoscut ca fiind sigur (GRAS) și a capacității sale de a
secreta eficient produse în mediul extracelular (Mathew şi Gunathilika, 2015, Zhou şi colab.,
2021)

Astfel, tipuri de proteaze produse de bacili precum şi speciile producătoare sunt sintetizate în
tabelul 2.4.2..

Tabel 2.4.2. Tipuri de proteaze produse de bacili şi speciile producătoare

Enzima Tipul enzimei Specia producătoare

B. subtilis
B. pumillus
Proteaze alcaline Extracelulare
B. amylosacchariticus
B. licheniformis
B.subtilis
B. amyloliquefaciens
B. thermoproteolyticus
Proteaze neutre Extracelulare
B. amylosacchariticus
B. stearothermophilus
B. cereus
(Sursa: http://ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/capitolul5.pdf)

11
 3. Obţinerea pe cale biotehnologică a preparatelor enzimatice
3.1. Tipuri de preparate enzimatice

Preparatele enzimatice se comercializează sub diverse forme şi grade de purificare, acestea

fiind:

 Preparate enzimatice solide:

 Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, obţinute prin uscarea şi

măcinarea mediului fermentat;

 Preparate sub formă cristalizată, enzime pure utilizate preponderent în chimia

analitică şi ingineria genetică;

 Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în amestec cu substanţe

crioprotectoare, care sunt urcate în vacum la temperaturi de -20......-50°C.

 Preparate enzimatice lichide

 Preparate enzimatice brute, formă sub care se livrează enzimele extracelulare

(eliberate de către microorganisme în mediul de cultură în timpul fermentaţiei).

 Preparate parţial purificate, în care se adaugă conservanţi pentru a le mări

stabilitatea în timp.

3.2.Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimatice ce conţin proteaze

Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimatice se bazează pe avantajele pe care le oferă

utilizarea microorganismelor ca sursă biologică, precum şi de proprietăţile enzimelor
microbiene.

Aceasta implică o serie de operaţii (fig. 3.2.1.) din care rezultă preparate enzimatice ce pot fi
sub formă de:

 preparate enzimatice brute-uscate;

 preparate enzimatice brute – lichide concentrate;
 preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv şi uscate.

12
 Figura 3.2.1. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice

(Sursa: https://vdocuments.mx/culturi-starter-de-microorganisme.html)

Obţinere a preparatelor microbiene este un proces complex ce implică parcurgerea a trei

etape:

1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea mecanică şi fizico chimică a materiilor

prime ce intră în compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această etapă
presupune operaţii de: dozare, mărunţire, solubilizare, sterilizare etc.
2. Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor starter intermediare şi a culturii de
producţie, urmată de etapa fermentativă prorpiu-zisă.
3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a enzimelor.

3.2.1. Pregătirea mediului de cultură

Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultură

Materiile prime trebuie să furnizeze principalii nutrienţi necesari dezvoltării

microorganismelor în timpul fermentaţiei prin asigurarea:

 Sursei de carbon (sursei de energie) constituită de glucide, sub formă de glucoză,

fructoză, galactoză care sunt uşor asimilabile, sau maltoză, zaharoza şi lactoza dacă
microorganismele cultivate posedă enzime capabile să le transforme în monoglucide.
În reţetele mediilor industriale se folosesc:
 Melasele care provin de la rafinarea zahărului,
 Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obţinut din industria
amidonului după ce suferă o concentrare până la 50% S.U.
 Leşiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a transformării masei
lemnoase în pulpă celulozică sub acţiunea bisulfitului de calciu.

13
  Sursei de azot cu rol anabolic, participând la biosinteza proteinelor structurale, a
enzimelor şi acizilor nucleici. Aceasta poate fii constituită din:
 azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de
diamoniu,
 azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia, carne etc.
 Sursei de ioni anorganici care reprezintă circa 8% din substanţa urcată a a celulelor
microbiene. Trebuie să fie prezenţi în mediul de cultură ca:
 macronutrienţii (azot, fosfor, sulf, potasiu, şi magneziu)
 micronutrienţii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru, mangan, nichel
şi seleniu).
 Sursei de factori de creştere utilizaţi în cantităţi mici, având un rol catalitic sau
structural pentru microorganisme. Printre aceştia se numărăr:
 vitaminele( biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina),
 purine şi pirimidine,
 nucleotide şi nucleozide,
 aminoacizi,
 acizi graşi,
 steroli
 poliamide.

Tratamentul termic al mediilor de cultură

Presupune o sterilizare corectă a mediului de cultură, dar şi asigurarea unei temperaturi de

incubare propice dezvoltării microorganismului utilizat.

3.2.2. Etapa biologică

Obţinerea culturilor starter de producţie

Pentru a obţine culturile starter necesare producerii enzimelor trebuiesc urmărite o serie de
aspect:

 trebuie pregătită o cantitate suficientă de inocul necesară inoculării unor volume de

aproximativ 150 – 250 de mc de mediu
 cultura folosită drept inocul trebuie să fie în faza exponenţială de creştere
 la microorganismele care au viteză de creştere redusă, se recomandă să se folosească
o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniţieirii fermentaţiei
 cultura starter de producţie trebuie să conţină celule active, adaptate la mediul
industrial pentru ca fermentaţia să se declanşeze rapid
 în cazul utilizării de inocule sporifere, specific fermentaţiilor desfăşurate pe mediul
solid, se recomandă să se asigure prin inoculare de concentraţii de 105-106 spori pe g
mediu
 în cazul inoculelor submerse cultura starter de producţie trebuie să fie de circa 10%
din mediul de cultură.

14
Astfel, este necesară optimizarea parametrilor de producție pentru a obține un randament
maxim și utilizarea economică a resurselor disponibile în timpul producției de enzime.
(Suberua şi colab., 2019)

Tehnici de fermentaţie

Pentru producţia de preparate enzimatice de origine microbiană se poate aplica două tehnici
de bază :

 Fermentaţia de suprafaţă în care se utilizează un mediu solid pe care se cultivă

microorganismul (de regulă un mucegai filamentos), avantajul tehnicii fiind că mediul
de cultură va deveni un mediu bogat în activitate enzimatică ;
 Fermentaţia submersă, în care mediul este lichid şi se află într-un reactor unde toţi
parametrii fermentaţiei sunt perfect controlaţi, fiind o tehnică superioară primei
metode din punct de vedere tehnologic şi biochimic..

La sfârşitul fermentaţiei microorganismul trebuie distrus cu condiţia păstrării intacte a

activităţii enzimatice.

În ceea ce priveşte tipurile de culturi submerse, ne putem situa în unul din următoarele cazuri:

 Procedeul nealimentat, în care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt

pregătite în fermentator la pH-ul şi temperatura dorită înainte de a introduce inocului.
După introducerea inoculum, fermentaţia principală începe şi finalizarea ei se
urmăreşte prin prelevarea de probe, în mod steril, care arată :
 creşterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea mediului) ;
 concentraţia în enzimă (activitatea enzimatică a mediului) ;
 consumul de glucide ;
 nivelul de proteine.

La procedeul nealimentat se pot monta diferiţi senzori care arată :

 pH-ul – care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;

 temperatura – care se poate reglată prin debitul de circulaţie al apei reci în
mantaua fermentatorului sau în serpentina din interiorul fermentatorului ;
 nivelul de spumă – care se poate combate cu un antispumant aflat într-un
rezervor ataşat fermentatorului;
 presiunea – care se reglează prin supape care se deschid la presiuni de 1 până
la 3 bar ;
 coeficientul respirator (QR) – care se măsoară prin cantitatea de CO2 produsă
faţă de cantitatea de oxigen consumată ;
 nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenţilor.

 Procedeul alimentat, în care se începe cu un volum de 10 – 30% de substrat în care

se introduce inocului, după care fermentatorul se alimentează cu restul de mediu, iar
oprirea fermentaţiei se face după un anumit timp fixat experimental. Acest procedeu se

15
 aplică în cazul în care sinteza enzimelor ar fi reprimată de concentraţiile ridicate într-
unul din nutrienţii mediului de cultură sau în cazul când creşterea microorganismelor,
în funcţie de concentraţia în unul din componenţii mediului, ar provoca creşterea
vâscozităţii, care trebuie să fie reglată în timp. Alimentarea fermentatorului poate fi
repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje (evacuări) programate, dar întotdeauna
trebuie lăsat în fermentator un volum ≤ 30%, care serveşte în acest caz drept cultură
de productie.

 Procedeul continuu unde este necesară alimentarea continuă a fermentatorului cu

mediu şi folosirea unei culturi concentrate de microorganisme. În acest
caz,bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor este cuplat la o unitate de
micro sau ultrafiltrare. Avantajele şi dezavantajele procedeului sunt prezentate în
tabelul 3.2.2.1..

Tabel 3.2.2.1. Avantajele şi dezavantajele utilizării procedeului continuu

Procedeu continu
Avantajele Dezavantaje
 se poate detoxifica mediul de cultură prin  costurile energetice sunt destul de ridicate;
eliminarea produsului de inhibare ;  chiar şi la densităţi mari de celule, la sfârşitul
 celulele reciclate devin perfuzate ; ciclului de dezvoltare este posibilă o oarecare
 celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la liză a celulelor, ceea ce face necesară o
concentraţii relativ mari; evacuare a bioreactorului prin unitatea de
 aceste concentraţii mari de celule se constituie ca ultrafiltrare, fapt care conduce la micşorarea
o barieră eficace faţă de contaminarea exterioară vârstei medii a celulelor care rămân în sistem.
 retenatul poate fi evacuat şi el periodic, fiind
constituit din biomasă care conţine enzime
intracelulare, după care este trecut la prelucrare
ulterioară (extracţie) ;
 permeatul de la ultrafiltrare, care conţine enzime
nu mai are celule microbiene şi poate fi, deci,
stocat sau dirijat direct la o operaţie de purificare
sau concentrare.

3.2.3. Separare, purificare şi standardizarea enzimelor

Extracţia

Procedeul de extractie este stabilit în funcţie de natura enzimelor produse, acestea putând fii
extracelulare sau intracelulare, şi de forma sub care se doreşte a se prezenta preparatul obţinut
în final.

În cazul procedeului discontinuu (nealimentat) şi a celui alimentat, după încheierea

fermentaţiei are loc separarea parţii solide, insolubile, reprezentată de celule şi produse
insolubile, de partea lichidă care conţine enzimele.

16
Separare poate avea loc prin:

 centrifugare,
 filtrare frontal
 microfiltrare

Soluţia sterilă obţinută este apoi ultrafiltrată pentru a concentra enzimele.

În cazul în care enzimele sunt destinate a intra în compoziţia unui preparat comercial lichid,
ultrafiltratul se stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) şi/sau săruri (NaCl, MgSO4),
respective se adaugă bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).

În cazul în care enzimele intră în compoziţia unui preparat sub form de pulbere ,
ultrafiltratul se suplimentează cu un suport (amidon, dextrin) şi se usucă prin atomizare.
Înainte de atomizare mai poate fi realizată o filtrare sterilă. De asemenea, se va controla
granulometria şi umiditatea (∼ 6%), fiind necesar ca suportul să fie higroscopic pentru a se
evita formarea de cocoloaşe.

În preparatele comerciale pulbere, microgranulate sau lichide, conţinutul de enzimă este redus
raportat la suport şi de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, în
comparaţie cu nivelul de enzimă conţinut.

Pentr preparatele comerciale microgranulate, ultrafiltratul se amestecă cu un suport (sare,

amidon solubil, maltodextrine etc.). Amestecul respectiv este pulverizat împreună cu un agent
liant care reprezintă 0,1% până la 0,5% faţă de masa suportului. Picăturile pulverizate sunt
uscate într-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90°C.

Preparatele comerciale lichide sunt realizate în general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se
utilizează în proporţie de 20 – 50% faţă de preparatul lichid. La aceste formulări se adaogă o
substanţă bacteriostatică (de exemplu benzoat de sodiu în proporţie de 0,1 – 0,2%).

Pentru a obţine şi enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separată de partea

lichidă, este supusă lizei. Liza poate fi realizată prin:

 enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc biomasa

 folosirea de preparate exogene( lizozimul din albuşul de ou, preparate enzimatice
exogene complexe de natură bacteriană care conţin chitinază, mananază, α- 1,6–
glucanază, proteaze, câteodată în combinaţie cu adaosul de metabisulfit)
 şoc osmotic dacă enzima este periplasmică
 liză mecanică (folosire de presiuni mari de 600 – 1000 bar, urmată de detenta brutală)
 ultrasunete cu frecvenţe mai mari de 20 MHz

17
 3.3. Imobilizarea enzimelor

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea
acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească următoarele condiţii :

 să fie insolubil în apă ;

 să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea
de acţiune
 să asigure acţiunea enzimei la un pH şi temperatură optime, apropiate de cele ale
enzimelor libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele :

 creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca activitate catalitică. Această stabilitate este

în legătură cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecinţă
asupra variaţiilor de conformaţie a enzimei (se diminuează aceste variaţii). Imobilizarea
conduce şi la creştere a concentraţiei locale a protein-enzimei care are un efect
stabilizant;
 se poate lucra în flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar şi din
punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru;
 enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează în cursul catalizei enzimatice;
 se poate modula micromediul în care acţionează enzima imobilizată (concentraţia
substratului, încărcarea suportului cu enzimă, grupările hidrofile);
 refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi cantitate de enzimă se poate transforma o
cantitate mai mare de substrat;
 se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu, putându-se automatize procesul, ceea
ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru;
 are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat şi
al concentraţiei acestuia;
 se poate stopa reacţia enzimatică la momentul dorit şi se evită trecerea enzimei în
produsul transformat;
 costurile globale de producţie sunt mai mici în comparaţie cu procedeele în care se
folosesc enzime libere;
 se pot folosi şi enzime care nu sunt trecute în liste GRAS (Generally Reconized as Safe);

Există şi dezavantaje, cum ar fi:

 costuri privind imobilizarea;

 pierderi ale activităţii enzimatice,
 o investiţie iniţială în utilaje mai mare,
 un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi o supraveghere mai atentă;
 utilizarea numai a unor substraturi solubile.

18
Prin urmare, factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la folosirea enzimelor imobilizate
sunt:

 eficienţa economică a imobilizării determinate de : costul enzimei, costul

suportului, costul tehnicii de imobilizare ;
 activitatea enzimei imobilizate care este influenţată de : tehnica de
imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a
substratului la enzimă şi a produsului (lor) de transformare ;
 caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;
 stabilitatea enzimei care trebuie menţinută activă un timp cât mai
îndelungat
 contaminarea microbiologică a sistemului enzimă/suport în timpul utilizării
reactorului respectiv.

Metodele de imobilizare a enzimelor pot fii de mai multe tipuri:

a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport prin intermediul

legăturilor slabe sau relativ puternice (legături Van der Waals, legături de hidrogen,
interacţiuni proteină – proteină, legături ionice).
Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi :
- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoză modificată,
polistiren modificat, răşini schimbătoare de ioni ;
- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă (bentonită, montmonirolită etc.),
ceramică, hidroxiapatită, sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi metalice cu TiCl4).
-prin includere într-un suport (gel, microincapsulare, fibre), în care caz se pot include şi
microorganisme

Adsorbţia se realizează prin contactul dintre o soluţie apoasă de enzimă cu suportul solid şi
va fi influenţată de : pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionică,
calitatea enzimei, temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea
se face prin amestecul dintre soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu agitator sau prin
trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în care suportul este menţinut sub forma unui pat.
Adsorbţia enzimei de suport poate fi îmbunătăţită prin ataşarea de suport a unor cofactori,
cum ar fi piridoxalfosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.
Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa şi volumul suportului, mărimea
particulelor, raportul dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.

b) Metode chimice în care caz imobilizarea se face prin:

 intermediul legăturilor covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări
reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii chimice. Aceasta se poate realiza la
rândul ei prin diverse metode precum:
 fixare de un suport insolubil, dar trebuie să se ţină seama de gruparea funcţională
care poate reacţiona cu protein-enzima şi de caracteristicile fizicochimice ale
suportului. Adesea este necesar să se creeze, pe cale chimică, funcţii reactive pe
suport;
 prin coreticulare utilizând agenţi bi- sau polifuncţionali. Cel mai mult utilizată pentru
reticulare este glutaraldehida.

19
  copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv
 legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi intermoleculară a
enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifunctional

Astfel, fiecare metode de imobilizare prezintă caracteristicile sale care conferă avantaje şi
dezavantaje în ceea ce priveşte plicarea acesteia, precum este expus şi în tabelul 3.3.1..

Tabel 3.3.1. Avantajele şi dezavantajele metodelor de imobilizare a enzimelor

Metodă de imobilizare Avantaje Dezavantaje

•Simplicitate în execuţie (incubarea
enzimei cu suportul, agitare câteva minute,
enzima care rămâne în soluţie fiind
eliminată prin spălare).
Adsorbţie
• Absenţa reacţiilor chimice (numai dacă
nu se formează punţi metalice).
• Posibilitatea de regenerare a complexului
enzimă/suport.
• Reacţiile de polimerizare sau gelificare
sunt bine cunoscute
• Reacţiile chimice dintre suport şi enzimă
sunt limitate (enzima este inclusă în geluri
naturale)
Incluziune • Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi
la amestec de enzime)
• Se pot folosi suporturi cu forme diferite :
filme, fibre, bile.
• Riscul de “evadare” a enzimei este redus
prin reticularea suportului după imobilizare
• Stabilitate mărită datorită faptului că
legăturile covalente sunt cele mai puternice
dintre toate legăturile menţionate anterior
• Varietatea mare a suporturilor : sticlă,
Prin legături silice, ceramică, celuloză, polimeri sintetici
covalente etc.
• Posibilitatea de a efectua imobilizarea în
prezenţa unui substrat pentru a • Este necesar ca enzima să fie
se evita inactivarea (protecţia situsului
activ).
• Stabilizare slabă.
• Riscul de desorbţie a enzimei de
către : fluxul de substrat, variaţie
lejeră de pH, forţa ionică, temperatură
• Anumite polimerizări necesită agenţi
denaturanţi sau radicalici
• Se pun probleme de transfer de masă
(inaccesibilitatea unor substraturi la
enzimă)
• Riscul de evadare al enzimei prin
micropori
• Proprietăţile mecanice ale gelurilor
sunt nesatisfăcătoare
• Trebuie realizate reacţii chimice,
adesea complexe
• Etapa de activare a suportului este
lungă
• Randamentul de fixare este < 100%
• Există riscul modificării chimice a
enzimei (pierdere de activitate)
purificată în prealabil
• Investiţia (costul) este importantă

Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea

enzimelor sunt:
 polizaharide : agaroză, celuloză şi derivaţi, alginaţi, carageenani, dextrani ;
 poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;
 polistiren (bile şi tuburi) ;
 silicea şi sticla poroasă.

20
 4. Creşterea producţiei de proteaze

Datorită avantajelor prezentate de utilizarea enzimelor în diverse domenii ale industriei a

apărut necesitatea creării de microorganisme capabile să producă proteze mult mai stabile în
diferite condiţii experimentale şi în cantitate mai mare.

Metodele prin care se pot obţine astfel de rezultate sunt de mai multe feluri precum urmează:

 metode clasice de ameliorare a microoganismelor, prin tratament cu agenţi mutageni

 metode moderne, de inginerie genetică ce includ:
 fuziunea de protoplaşti
 tehnologia ADN recombinant

4.1. Creşterea producţiei de proteaze prin metodele clasice de ameliorare a

microoganismelor

Cele mai bune rezultate au fost obţinute în urma tratării microorgaismelor cu următorii
mutageni:

 nitrosometiluree
 nitrosoguanidina
 dietilsulfatul
 agenţi fizici (radiaţii X sau γ)

De asemenea, în ultimii ani, ultrasunetele ecologice, de joasă intensitate au fost disponibile pe

scară largă în industria fermentației, iar fermentația asistată cu ultrasunete (UAF) a fost
aplicată cu succes pentru a promova creșterea celulelor și pentru a scurta perioada de
fermentație (Dai şi colab., 2017; Ruan şi colab., 2020; Thimyphuc şi colab., 2009; Li şi
colab., 2021)

În urma aplicării unor astfel de tehnici s-a remarcat nivelului de biosinteză a crescut de până
la aproximativ 8-10 ori.

4.2. Creşterea producţiei de proteaze prin inginerie genetică

Fuziunea de protoplaşti

Protoplaştii sunt stucturi celulare, sferice, ce şi-au pierdut peretele celular în urma aplicării
unor procese asupra acestora. Aceştia îşi păstrează capacitatea de creştere şi diviziune şi pot
fuziona.

În ceea ce piveşte obţinerea protoplaştilor, principiul metodei constă în disocierea celulelor şi

degradarea peretelui celular, concomitent cu deshidratarea parţială a citoplasmei, protoplaştii fiind recuperaţi
prin centrifugare şi spălare.

21
Pentru a obţine o fuziune eficientă este necesar să se lucreze cu un număr mare de protoplaşti viabili. Fuziunea
este în general indusă prin incubarea într-o concentratie mare de PEG (polietilena glicol) şi un pH relativ
crescut ori prin electrofuziune realizată cu ajutorul dextranului şi a stimulilor electrici.

Tehnologia ADN recombinant

Tehnologia ADN recombinant se referă la realizare "in vitro" a unor molecule de ADN noi
prin îmbinarea de fragmente provenite fie din genomul unor specii biologice diferite, fie de la
aceeași specie.

Îmbinarea respectivelor fragmente se realizează într-o ordine diferită de cea naturală, astfel
încât elementele genetice utilizate capătă o structură aparte, conferind organismului în care
sunt introduse proprietăți noi pe care nu le-ar dobândi pe cale naturală.

Această tehnică implică:

 Extracția materialului genetic
 Purificarea acizilor nucleici extraşi
 Obținerea fragmentelor de ADN
 Separarea fragmentelor de ADN prin electroforeză
 Identificarea fragmentelor de interes
 Clonarea fragmentelor care prezintă interes într-un vector de clonare
 Introducerea ADN recombinant într-o gazdă specifică
 Identificarea clonelor de interes
 Analiza moleculelorde ADN de interes

Majoritatea tulpinilor superproducătoare de proteaze care prezintă anumite caracteristici s-au

obţinut prin inginerie genetică.

Mecanismele reglatoare complexe care au un rol cheie în ceea ce priveşte producerea de

proteaze sunt strâns legate de sistemul DegS-DegU precum şi de factorii de
reglare DegR and DegQ (Nagami şi Tanaka, 1986; Tanaka şi colab., 1987; Ogura şi colab.,
1994).

De asemenea, se remarcă şi influenţa genelor proB (ce codifică sinteza γ-glutamil kinazei) şi
proA (codifică sinteza glutamil-γ-semialdehid dehidrogenaza) ale căror produşi par a fi
implicaţi în sporirea capacităţii de biosinteză a exoproteazelor la o tulpină de B.subtilis.

Prin urmare, cele două gene au fost clonate într-un vector e clonare (pLC1) şi apoi introduse,
împreună cu un alt vector (pNC61) ce conţine gena reglatoare prtR (degR) într-o tulpină de
B.subtilis. Culturile bacteriene obţinute în urma unor astfel de transformări au prezentat o
activitate proteolitică mai mare decât a tulpinii parentale.

De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizării bacteriilor din genul

Streptomyces pentru clonarea unor gene cu origine diferită şi pentru producerea proteinelor
corespunzătoare (Erpicum şi colab., 1990). În plus, metaboliţii secundari ai acestor bacterii

22
oferă avantajul exprimării (sintezei) prelungite a unui produs şi după faza iniţială de creştere a
culturii (Gardner şi Cadman, 1990).

5. Concluzii
Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor
exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de fructe, zahărului,
panificaţiei, etc.)(Hoanţă, 2015)

Proteazele reprezintă un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care scindează

molecula proteică în fragmente polipeptidice formate din aminoacizi uniţi prin legături
peptidice.
Acestea pot fi obţinute din:

 ţesuturi animale/ subprodusele din industria cărnii (ficat, pancreas, inimă,

rinichi,creier, mucoasă stomacală şi intestinală)
 ţesuturi vegetale (seminţe germinate sau negerminate, rădăcini, fructe, sevă, latexuri,
frunze)
 microorganisme ( în special bacteriile din genurile Bacillus si Streptomyces

Dintre aceste surse cele mai des utilizate sunt microorganismele deoarece prezintă numeroase
avantaje.

Obţinerea preparatelor microbiene este un proces complex ce implică parcurgerea a trei etape:

 Pregătirea mediului de cultură

 Etapa biologică.
 Etapa de separare, purificare şi standardizare a enzimelor.

În cadrul etapei a doua din procesul de obţinere al preparatelor enzimatice ce conţin proteaze,
fermentaţia poate fi:

 de suprafaţă în care se utilizează un mediu solid pe care se cultivă microorganismul

(de regulă un mucegai filamentos)
 submersă, în care mediul este lichid şi se află într-un reactor unde toţi parametrii
fermentaţiei sunt perfect controlaţi. În cazul acesteia procesul poate fi:
 Procedeul nealimentat
 Procedeul alimentat
 Procedeul continuu

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea
acesteia de un support

Metodele de creştere a producţiei de proteaze sunt de mai multe feluri precum urmează:

• metode clasice de ameliorare a microoganismelor, prin tratament cu agenţi mutageni

23
• metode moderne, de inginerie genetică ce includ: fuziunea de protoplaşti şi tehnologia
ADN recombinant

6. Referințe bibliografice

1. Ahmetoglu, N., Matpan Bekler, F., Acer, O., Guven, R.G., Guven, K. (2015)
Production, purification and characterisation of thermostable metallo-protease from newly
isolated Bacillus sp. KG5 , EurAsian Journal of BioSciences 9, 1-11
2. Annamalai, N., Rajeswari, M.V., Balasubramanian, T. (2014) Extraction, purification
and application of thermostable and halostable alkaline protease from Bacillus alveayuensis
CAS 5 using marine wastes, Food and Bioproducts Processing 92, 335-342
3. Asha, B., Palaniswamy, M. (2018) Optimization of alkaline protease production by
Bacillus cereus FT 1 isolated from soil, Journal of Applied Pharmaceutical Science 8 (02),
119-127
4. Breithaupt, H. (2001) The hunt for living gold, EMBO Reports 2 (11), 968-971
5. Chimbekujwo, K.I., Ja’afaru, M.I., Adeyemo, O.M. (2020) Purification,
characterization and optimization conditions of protease produced by Aspergillus brasiliensis
strain BCW2, Scientific African 8
6. Clapco, S., Bivol, C., Ciloci, A. (2013) Procedee de sinteză orientată a enzimelor
proteolitice de către tulpina fungică Fusarium gibbosum, Integrare prin cercetare şi
inovare.Ştiinţe naturale, exacte şi inginereşti, Chisinau, Republica Moldova
7. Dai, C., Xiong, F., He, R., Zhang, W., Ma, H. (2017) Effects of low-intensity
ultrasound on the growth, cell membrane permeability and ethanol tolerance of
Saccharomyces cerevisiae, Ultrasonics Sonochemistry 36, 191–197
8. Elibol, M., Moreira, A.R. (2003) Production of extracellular alkaline protease by
immobilization of the marine bacterium Teredinobacter turnirae, Process Biochemistry 38,
1445-1450
9. Erpicum, T., Granier, B., Delcour, M., Lenzini, V.M., Nguyen–Distèche, M., Jean
Dusart, J., Frère, J.M. (1990) Enzyme production by genetically engineered Streptomyces
strains: Influence of culture conditions, Biotechnology & Bioengineering 35, 719-726
10. Faludi, A. (1989) Planning According to the ‘Scientific Conception of the World’: The
Work of Otto Neurath, Environment and Planning D Society and Space 7(4), 397-418
11. Gardner, A.R., Cadman, T.W. (1990), Product deactivation in recombinant
Streptomyces, Biotechnology & Bioengineering 36 , 243-251
12. Guo, J., Cheng, G., Gou, X.Y., Xing, F., Li, S., Han, Y.C., Wang, L., Song, J.M.,
Shu, C.C., Chen, S.W., Chen, L.L. (2015) Comprehensive transcriptome and improved
genome annotation of Bacillus licheniformis WX-02, FEBS Lett. 589
13. Haki, G., Rakshit, S. (2003) Developments in industrially important thermostable
enzymes: a review, Bioresource Technology 89, 17-34
14. Hakim, A., Bhuiyan, F.R., Iqbal, A., Emon, T.H., Ahmed, J., Azad, A.K. (2018)
Production and partial characterization of dehairing alkaline protease from Bacillus subtilis

24
AKAL7 and Exiguobacterium indicum AKAL11 by using organic municipal solid wastes,
Heliyon
15. Hoanţă, M. (2015) Biotehnologia Obţinerii Preparatelor Enzimatice - Culturi Starter
de Microorganisme, Universitatea „Lucian Blaga” din Sibiu, România
16. Hossain, M. I., Sadekuzzaman, M., Ha, S.D. (2017) Probiotics as potential alternative
biocontrol agents in the agriculture and food industries: A review, Food Research
International 100, 63–73
17. Kikani, B.A., Singh, S.P. (2012) The stability and thermodynamic parameters of a
very thermostable and calcium-independent α-amylase from a newly isolated bacterium,
Anoxybacillus beppuensis TSSC-1, Process Biochemistry 47, 1791-1798
18. Kumar, H.D., Swati, S. (2001) Modern concepts of microbiology, Vikas Publishing
House Private Limited, India
19. Kumar, R.S., Ananthan, G., Prabhu, A.S. (2014) Optimization of medium composition
for alkaline protease production by Marinobacter sp. GA CAS9 using response surface
methodologyea statistical approach, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 3 (2), 191-
197
20. Lario, L.D., Pillaca-Pullob, O.S., Setted, L.D., Convertie, A., Casatia, P.,
Spampinatoa, C., Pessoa, A. (2020) Optimization of protease production and sequence
analysis of the purified enzyme from the cold adapted yeast Rhodotorula mucilaginosa
CBMAI 1528, Biotechnology Reports 28
21. Li, Y., Ruan, S., Zhou, A., Xie, P., Azam, S.M.R., Ma, H. (2021) Ultrasonic
modification on fermentation characteristics of Bacillus varieties: Impact on protease activity,
peptide content and its correlation coefficient, LWT - Food Science and Technology 154
22. Maruthiah, T., Esakkiraj, P., Prabakaran, G., Palavesam, A., Immanuel, G. (2013)
Purification and characterization of moderately halophilic alkaline serine protease from
marine Bacillus subtilis APMSU 6, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 2, 116-119
23. Mateescu, R., Cornea, C.P., Grebenişan, I., Câmpeanu, G. (2017) Aplicaţii
biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces şi Bacillus, Universitatea din
Bucureşti, România
24. Mathew, C.D., Gunathilika, R.M.S. (2015) Production, purifcation and
characterization of a thermostable alkaline serine protease from Bacillus licheniformis,
International Journal of Biotechnology and Molecular Biology Research 6(3), 19-27
25. Matpan Bekler, F., Acer, Ö., Güven, K. (2015) Production and purification of novel
thermostable alkaline protease from Anoxybacillus sp. KP1, Cellular & Molecular Biology 61
(4), 113-120
26. Nagami, Y., Tanaka, T. (1986) Molecular cloning and nucleotide sequence of a DNA
fragment from Bacillus natto that enhances production of extracellular proteases and
levansucrase in Bacillus subtilis, Journal of bacteriology 166(1),20-8
27. Ogura, K., Wicky, C., Magnenat, L., Tobler, H., Mori, I., Müller, F., Ohshima, Y.
(1994) Caenorhabditis elegans unc-51 gene required for axonal elongation encodes a novel
serine/threonine kinase, Genes & Development 8, 2389-2400
28. Pokorny, M., Vitale, L. (1980) Enzymes as by-products during biosynthesis of
antibiotics, Industrial and Clinical Enzymology, Ed. Vitale, L., Simeon, V., Pergamon Press
Oxford,13-25

25
29. Rathod, M.G., Pathak, A.P. (2016) Optimized production, characterization and
application of alkaline proteases from taxonomically assessed microbial isolates from Lonar
soda lake, India, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 7, 164-173
30. Ruan, S., Luo, J., Li, Y., Wang, Y., Huang, S., Lu, F., Ma, H. (2020) Ultrasound-
assisted liquid-state fermentation of soybean meal with Bacillus subtilis: Effects on peptides
content, ACE inhibitory activity and biomass, Process Biochemistry 91, 73–82
31. Salleh, A.B., Abdul Rahman, R.N.Z.R., Basri, M. (2006) New Lipases and Proteases,
Nova Science Publishers, Inc. New York
32. Sánchez-Leóna, E., Bello-Moralesab, R., López-Guerreroab, J.A., Povedac, A.,
Jiménez-Barberocd, J., Gironèsab, N., Abrusci, C. (2020) Isolation and characterization of an
exopolymer produced by Bacillus licheniformis: in vitro antiviral activity against enveloped
viruses, Carbohydrate Polymers 248
33. Selvamohan, T., Sherin, S. (2010) Optimization of protease production from Bacillus
cereus using different substrates, Plant Archives (An International Journal of Plant Research)
10 (2), 651-656
34. Shah, K., Mody, K., Keshri, J., Jha, B. (2010) Purification and characterization of a
solvent, detergent and oxidizing agent tolerant protease from Bacillus cereus isolated from the
Gulf of Khambhat, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 67 (1), 85-91
35. Shankar, S., Rao, M., Laxman, R.S. (2011) Purification and characterization of an
alkaline protease by a new strain of Beauveria sp., Process Biochemistry 46 (2)
36. Sookkheo, B., Sinchaikul, S., Phutrakul, S., Chen, S.T. (2000) Purification and
characterization of the highly thermostable proteases from Bacillus stearothermophilus
TLS33, Protein Expression and Purification 20, 142-151
37. Suberua, Y., Akandea, I., Samuela, T., Lawalb, A., Olaniranc, A. (2019) Optimization
of protease production in indigenous Bacillus species isolated from soil samples in Lagos,
Nigeria using response surface methodology,Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 18
38. Sui, X., Jiang, L., Li, Y., Liu, W. (2011) Antioxidant activity of soybean peptides,
Advanced Materials Research 233-235, 854–865
39. Sundararajan, S., Kannan, C.N., Chittibabu, S. (2011) Alkaline protease from Bacillus
cereus VITSN04: potential application as a dehairing agent, Journal of Bioscience and
Bioengineering 111 (2)
40. Tanaka, H., Kuroda, A., Marusawa, H., Hatanaka, H., Kino, T., Goto, T., Hashimoto,
M., Taga, T. (1987) Structure of FK506, a novel immunosuppressant isolated from
Streptomyces, Journal of American Chemical Society 109
41. Thimyphuc, N., Yuankun, L., Zhou, W. (2009) Stimulating fermentative activities of
bifidobacteria in milk by highintensity ultrasound, International Dairy Journal 19 (6–7), 410–
416
42. Vijayaraghavan, P., Vijayan, A., Arun, A., Jenisha, J.K., Vincent, S.G.P. (2012) Cow
dung: a potential biomass substrate for the production of detergent-stable dehairing protease
by alkaliphilic Bacillus subtilis strain VV, SpringerPlus 1
43. Wang, H., Zhang, S., Sun, Y., Dai, Y. (2013) ACE-inhibitory peptide isolated from
fermented soybean meal as functional food, International Journal of Food Engineering 9(1),
1–7

26
44. Yildirim, V., Baltaci, M.O., Ozgencli, I., Sisecioglu, M., Adiguzel, A., Adiguzel, G.
(2017) Purification and biochemical characterization of a novel thermostable serine alkaline
protease from Aeribacillus pallidus C10: a potential additive for detergents, Journal of
Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 32 (1), 468-477
45. Zhang, G., Chen, Y., Li, Q., Zhou, J., Li, J., Dub, G. (2021) Growth-coupled evolution
and high-throughput screening assisted rapid enhancement for amylase-producing Bacillus
licheniformis, Bioresource Technology 337
46. Zhou, C., Yang, G., Zhang, L., Zhang, H., Zhou, H., Lu, F. (2021) Construction of an
alkaline protease overproducer strain based on Bacillus licheniformis 2709 using an
integrative approach, International Journal of Biological Macromolecules 193

27