Analytical Biochemistry 3rd Ed - D. Holme, H. Peck (1998) WW-pages-Toata

Biochimie analitică
Ediția a treia
David J. Holme și Hazel Peck
-
Un imprint al Pearson Education
Harlow, Anglia - Londra - New York . Reading, Massachusetts - San Francisco Toronto - Don
Mills, Ontario - Sydney - Tokyo - Singapore - Hong Kong - Seul Taipei - Cape Town - Madrid -
Mexico City . Amsterdam - München - Paris - Milano
Pearson Education Limited
Edinburgh Gate
Harlow
Essex CM20 2JE Anglia
și companii asociate din întreaga lume
Vizitați-ne pe World Wide Web la:

http://www.pearsoneduc.com
© Addison Wesley Longman Limited 1998
Drepturile lui David J. Holme și Hazel Peck de a fi identificați

ca autori ai acestei lucrări au fost revendicate de către
în conformitate cu Legea din 1988 privind
drepturile de autor, desenele și modelele și
brevetele.
Toate drepturile sunt rezervate; nicio parte a acestei

publicații nu poate fi reprodusă, stocată într-un sistem
de recuperare sau transmisă sub nicio formă sau prin
niciun mijloc, electronic, mecanic, fotocopiere,
înregistrare sau în orice alt mod, fără permisiunea
scrisă prealabilă a editorilor sau fără o licență care să
permită o copie restricționată în Regatul U n i t ,
eliberată de Copyright Licensing Agency Ltd., 90
Tottenham Court Road, Londra WlP OLP.
Prima publicare 1983

Ediția a doua 1993
Această ediție 1998
ISBN 0 582 29438-X
Biblioteca Britanică Date de catalogare în publicație
O fișă de catalog pentru această carte este disponibilă la British Library
Biblioteca Congresului Catalogare în date de publicare

O înregistrare de catalog pentru această carte este disponibilă la Biblioteca
Congresului.
Tipărit de 55 în 10/12 Times

Produs de Pearson Education Asia (Pie) Ltd. Tipărit
în Singapore (COS)
10 9 8 7 6 5 4 3
05 04 03 02 01
Cuprins
Prefață la a treia ediție Vlll

Prefață la a doua ediție X
Prefață la prima edi(ie xi
Despre cutiile și întrebările de autotestare Xlll
1 Principii generale de biochimie analitică 1

Selectarea unei metode valide de analiză 2
Calitatea datelor 6
Producerea de rezultate 29
2 Spectroscopie 36
Interacțiunea radiațiilor cu materia 37
Absorbometrie moleculară 49
Proiectarea absorbțiometrului 60
Tehnici de fluorescență moleculară 73
Tehnici de spectroscopie atomică 76
Spectroscopia de rezonanță magnetică 85
3 Metode de separare 91
Principii ale tehnicilor de separare 92
Metode bazate pe polaritate 98
Metode bazate pe natura ionică 129
Metode bazate pe mărime 147
Metode bazate pe formă 164
4 Metode electroanalitice 168

Potențiometrie 169
Conductimetrie 181
Coulometrie 185
Voltarnmetrie 188
Biosenzori 191
V
vi Cuprins
5 Radioizotopi 196
Natura radioactivității 197
Detectarea și măsurarea radioactivității 201
Utilizarea biochimică a izotopilor 206
6 Metode automatizate de analiză 210

Analizoare discrete 212
Analiza fluxului 217
Robotică 224
7 Metode imunologice 227

Procese generale ale răspunsului imunitar 228
Reacții antigen-anticorp 234
Tehnici analitice - reacții de precipitare 238
Tehnici analitice - imunoanaliză 245
8 Enzime 257
Natura enzimelor 258
Metode de dozare enzimatică 273
Tehnici de monitorizare 282
Tratarea probelor pentru testul enzimatic 294
Metode de testare a substratului 297
Analiză automatizată 301
Enzime imobilizate 302
9 Carbohidrați 306
Structura și funcția generală 307
Metode chimice de analiză a carbohidraților 324
Metode enzimatice de analiză a carbohidraților 328
Separarea și identificarea amestecurilor de carbohidrați 335
10 Aminoacizi 342
Structură generală și proprietăți 343
Reacții generale 356
Analiză n-ternală 359
Reacții ale aminoacizilor specifici 362
Separarea amestecurilor de aminoacizi 366
Analizator de aminoacizi 373
11 Proteine 381
Structura proteinelor 381
Metode generale de cuantificare 386
Separarea proteinelor 396
12 Lipide 406
Acizi grași 407
Lipide simple 410
Lipide complexe 415
Cuprins vii
Structuri lipidice-proteice 421

Pregătirea și manipularea probelor 424
Metode cantitative 425
Separarea amestecurilor de lipide 429
13 Acizi nucleici 443

Compoziția și structura acidului nucleic 444
Izolarea și purificarea acizilor nucleici 449
Metode de analiză a acizilor nucleici 456
Vectori 465
Secvențierea ADN 468
Apendice: Numerotarea și clasificarea enzimelor 474

Întrebări pentru autotest: răspunsuri 479
Index 481
Prefață
LA A TREIA EDIȚIE
Tehnologia asociată cu analiza biochimică se schimbă rapid și se introduc
constant noi instrumente de laborator. Cu toate acestea, cu câteva excepții,
inovațiile nu se bazează pe noi principii de analiză, ci oferă beneficii analitice
adesea printr-o abordare de tip "mix and match". De exemplu, instrumentele
HPLC moderne pot utiliza coloane care combină diverse caracteristici pentru
a efectua separarea și oferă o gamă de opțiuni de detectare; limitele dintre
electroforeză și cromatografie devin neclare în tehnici precum cromatografia
capilară; iar spectrometria de masă, asociată anterior doar cu GLC, este acum
legată de o varietate mult mai mare de tehnici cromatice. Aceste instrumente
"de ultimă generație" sunt, în mod normal, controlate de microprocesoare,
oferă un anumit grad de automatizare și sunt concepute în mod atractiv pentru
a fi ușor de utilizat.
În acest context, poate că este tentant pentru analiști să subestimeze
importanța înțelegerii principiilor tehnicilor pe care le utilizează. În caz
contrar, este puțin probabil ca aceștia să poată selecta, optimiza și dezvolta
noi metode, să le depaneze pe cele existente și să fie încrezători în calitatea
rezultatelor lor. Având în vedere importanța din ce în ce mai mare atribuită
asigurării calității și acreditării laboratoarelor, pe lângă faptul că angajatorii
cer ca personalul lor să lucreze eficient, este vitală aprecierea principiilor
fundamentale ale analizei. Prin urmare, nu ne cerem scuze că ne concentrăm
din nou asupra acestora în această a treia ediție.
Am eliminat unele secțiuni care conțineau descrieri detaliate ale unor
tehnici rar întâlnite în laboratoarele moderne, menținând în același timp
referința la metodele clasice importante care constituie baza metodologiei
actuale. Au fost adăugate materiale noi pentru a aduce unele subiecte la zi,
printre care se numără o mai mare acoperire a calității, siguranței și acreditării
laboratoarelor, utilizarea kiturilor, spectrometria de masă și electroforeza
capilară. Au fost aduse multe alte modificări, nu în ultimul rând o prezentare
complet nouă a textului tipografic, cu zone casetate pentru a pune accentul pe
acestea. Sperăm că acest lucru va facilita înțelegerea și va face cartea mai
"ușor de utilizat". De asemenea, sunt incluse două tipuri de întrebări de
autotestare, care sunt concepute pentru a fi indicatori simpli ai înțelegerii
conceptelor de bază ale secțiunii și nu un test complet de cunoaștere a
subiectelor. Am decis să nu includem fotografii ale unor instrumente
particulare, deoarece acestea nu sunt adesea deosebit de informative, iar
modelele se schimbă atât de rapid. Dorim să le mulțumim Dr. Susan Laird și
Dr. Robert Smith pentru revizuirea capitolelor despre acizi nucleici și
imunologie.
viii
Prefață la a treia ediție ix
respectiv metode. De asemenea, le suntem recunoscători numeroșilor colegi

care ne-au împărtășit cunoștințele și experiența lor de-a lungul anilor și ale
căror sfaturi au fost de neprețuit.
Biochimia analitică este un subiect vast și atât conținutul real, cât și
echilibrul acoperirii într-o carte ca aceasta pot fi dezbătute. Ținând cont de
acest lucru, scopul nostru în fiecare ediție a fost acela de a oferi o prezentare
clară a principiilor subiectului, care să ajute la înțelegerea unei game largi de
cercetători care fie studiază pentru obținerea unei calificări, fie lucrează într-
un laborator, sau poate ambele. Listele de lectură de la sfârșitul fiecărui
capitol sugerează texte suplimentare pentru cititorii care au nevoie de mai
multe detalii despre anumite subiecte.
David J. Holme
Hazel Peck
Aprilie 1997
Prefață
LA CEA DE-A DOUA EDIȚIE
De la publicarea primei ediții în 1983, au fost publicate mai multe cărți de
specialitate care acoperă în detaliu o serie de tehnici specifice. Cu toate
acestea, capacitatea de a selecta o tehnică adecvată pentru o anumită
problemă analitică rămâne în continuare fundamentală, iar prima ediție a
acestei cărți s-a dovedit în mod evident utilă în acest sens. Astfel, obiectivul
principal al acestei a doua ediții rămâne neschimbat.
O mare parte din informații au fost actualizate pentru a doua ediție,
pentru a reflecta schimbările substanțiale din acest domeniu. Editarea unui
capitol despre acizii nucleici a fost considerată esențială și completează
capitolele originale despre natura chimică și metodele de analiză a altor
molecule biologice importante. Îi suntem recunoscători Dr. Susan Laird
pentru compilarea acestui capitol și, de asemenea, dlui Robert Smith pentru
actualizarea majoră privind imunoanalizele din capitolul privind metodele
imuno logice.
Am păstrat același echilibru de informații în noul capitol și, prin
urmare, nu sunt discutate detalii despre aplicații specifice ale tehnicilor, de
exemplu, amprentarea ADN. Acolo unde a fost cazul, am inclus titluri de cărți
care pun accentul pe aplicații în lista de lecturi suplimentare de la sfârșitul
fiecărui capitol. Aceste liste nu se doresc a fi pe deplin cuprinzătoare și nici
nu se face trimitere la capitole, deoarece considerăm că acest lucru este
inadecvat pentru nivelul potențialilor cititori.
Am primit numeroase rapoarte mulțumitoare cu privire la utilitatea
primei ediții într-o serie de laboratoare analitice, în domenii precum cel
farmaceutic, biotehnologie, agrochimie, biochimie clinică, biologie
moleculară etc. Propria noastră experiență și comentariile colegilor din alte
universități ne-au întărit scopul inițial de a scrie o carte pentru studenții de la
o serie de cursuri care includ aspectele analitice ale biochimiei. Prin urmare,
suntem încântați că această ediție softback este acum disponibilă, ceea ce va
încuraja un acces mai larg pentru uzul studenților.
Hazel Peck
David Holme
Universitatea Sheffield Hallam
Iulie 1992
X
Prefață
LA PRIMA EDIȚIE
Stimulentul inițial pentru scrierea acestei cărți a apărut din dificultățile
întâmpinate în recomandarea unui singur manual adecvat pentru studenții de
la cursurile în care aspectele analitice ale biochimiei reprezentau o
componentă majoră. Deși există multe cărți de chimie analitică în general și
de chimie clinică în special, multe dintre ele omit aspectele biochimice ale
analizei, cum ar fi enzimologia și imunologia, în timp ce altele nu acoperă
știința de bază a subiectului. Obiectivul a fost acela de a reuni într-o singură
carte acele subiecte pe care le considerăm esențiale pentru subiectul
biochimiei analitice.
În secțiunea introductivă a fiecărui capitol, există o scurtă explicație a
bazei științifice a subiectului și este urmată de o discuție despre metodele
analitice relevante. Deși nu se dorește ca această carte să fie o carte de
"rețete", sunt oferite detalii tehnice pentru multe dintre metodele descrise.
Acest lucru îi va ajuta pe cititorii fără experiență practică să aprecieze etapele
implicate în analiză, oferind în același timp suficiente detalii pentru ca metoda
să fie dezvoltată în practică. Se intenționează ca această carte să furnizeze
suficiente informații pentru a permite unui student să selecteze o tehnică sau o
serie de tehnici care ar fi adecvate pentru o anumită problemă analitică și să
fie capabil să dezvolte o metodă analitică validă și fiabilă.
Subiectele abordate în această carte se împart în trei grupe principale.
Tehnicile analitice, cum ar fi spectroscopia, cromatografia etc., sunt deosebit
de importante în biochimia analitică, precum și în chimia analitică în general.
Sunt explicate principiile fiecărei tehnici, iar domeniul de aplicare și
aplicațiile sunt discutate. Există capitole privind enzimele, anticorpii și
radioizotopii, subtanțe pe care poate fi necesar să le detectezi și să le măsori,
dar care, de asemenea, pot fi foarte utile într-o varietate de metode analitice.
Și în acest caz, teoria de bază este explicată înainte de a discuta aplicațiile lor
în biochimia analitică. În cele din urmă, există patru capitole care explică
natura chimică și metodele de analiză a principalelor grupe de compuși
importanți din punct de vedere biologic, și anume, carbohidrații, aminoacizii,
proteinele și lipidele. Deși se apreciază faptul că gama de compuși din această
ultimă secțiune ar putea fi extinsă considerabil, ea a fost limitată în mod
deliberat la acele grupuri pe care le considerăm a fi de o importanță
biochimică deosebită.
La sfârșitul fiecărui capitol, sunt enumerate mai multe cărți care pot fi
citite în continuare, dar se sugerează că următoarele cărți ar fi potrivite pentru
lectura suplimentară pe tema biochimiei aminoacizilor, carbohidraților,
proteinelor și lipidelor.
xi
xiiPrefață la prima ediție
J.W. Suttie, Introducere în biochimie. Holt, Rinehart and Winston, New

York, SUA.
H.R. Mahler și E.H. Cordes, Chimie biologică. Harper and Row, New York,
SUA.
A. White, P. Handler și E.L. Smith, Principii de biochimie. McGraw-Hill Book
Co., New York, SUA.
Dorim să mulțumim domnului Rodney Pollitt pentru lectura proiectului
de text și pentru comentariile sale neprețuite. În plus, am dori să mulțumim
colegilor care ne-au ajutat în diferite moduri și doamnei P. Holme pentru
dactilografierea manuscrisului.
David J. Holme
Hazel Peck
Sheffield City Polytechnic
Februarie 1982
Despre cutiile și
întrebările de
autotestare
Cartea conține note pe margine și două tipuri de casete, care sunt concepute
pentru a permite cititorului să identifice cu ușurință anumite tipuri de informații.
Casetele de pe margine evidențiază punctele importante din text cu o
scurtă declarație sau definiție pentru a oferi informații de bază despre subiect
sau trimit la alte secțiuni din carte care oferă informații suplimentare despre
subiect.
Casetele cu proceduri oferă detalii tehnice ale unor proceduri, fie pentru
a ilustra o tehnică, fie pentru a oferi detalii tehnice cititorilor care doresc să o
utilizeze.
Întrebările de autotestare se află la sfârșitul majorității secțiunilor, într-o
casetă. Cele patru întrebări sunt concepute pentru a testa înțelegerea
cititorului cu privire la principiile de bază ale subiectului, fără a intra în
detaliile acestuia. Există două tipuri de întrebări:
1. Întrebare cu alegere multiplă - orice număr sau niciuna dintre alternative
poate fi corectă.
2. Analiza relațiilor - constă în două afirmații unite prin cuvântul BECAUSE.
Fiecare afirmație trebuie analizată separat și identificată ca fiind
ADEVĂRATĂ sau FALSĂ. Dacă ambele afirmații sunt adevărate, atunci
întreaga propoziție trebuie analizată pentru a decide dacă, în ansamblu,
este corectă (DA) sau nu (NU), adică dacă cea de-a doua afirmație oferă o
explicație corectă pentru prima afirmație. Trebuie apreciat faptul că un
singur enunț scurt nu va oferi o explicație completă, dar propoziția în
ansamblu poate fi totuși adevărată.
Xlll
1 Principii generale de
biochimie analitică biochimie
• Selectarea unei metode valide de analiză

• Calitatea datelor
• Producerea de rezultate
Biochimia analitică implică utilizarea metodelor de laborator pentru a

determina compoziția probelor biologice și are aplicații în multe domenii
foarte diferite ale științei biologice. Informațiile obținute în urma unei analize
sunt prezentate, de obicei, sub forma unui raport de laborator, care poate
indica pur și simplu ce substanțe sunt prezente (un raport calitativ) sau poate
specifica cantitatea exactă a unei substanțe din eșantion (un raport cantitativ).
Un raport calitativ va indica adesea dacă o anumită substanță
sau un grup de substanțe este prezent fără a comenta poziția com completă a
eșantionului. În multe cazuri, raportul va specifica, de asemenea, membrii
individuali ai grupului de substanțe respectiv. De exemplu, ar putea, de
exemplu, să numească doar diferiții carbohidrați prezenți, deși proba conținea
și alte substanțe, de exemplu lipide și proteine. Este posibil, atunci când se
utilizează unele metode calitative, să se compare cantitatea de substanță din
eșantion cu cantitatea dintr-o probă de referință și să se raporteze prezența
unor cantități mai mari sau mai mici. Un astfel de raport se spune că este
semicantitativ. Metodele cromatografice și electroforetice dau adesea
rezultate care pot fi interpretate în acest mod.
Un raport cantitativ va indica cantitatea unei anumite substanțe
prezente în eșantion și este important ca unitățile de măsură să fie
semnificative și adecvate pentru a preveni neînțelegerile ulterioare. Atunci
când se raportează rezultatele cantitative, este de dorit să se indice fiabilitatea
acestora, o caracteristică care poate fi adesea evaluată statistic. În practică, s-
ar putea să nu fie necesar să se prezinte aceste informații la fiecare raport, dar
ele ar trebui să fie ușor de găsit pentru referință.
2 Principii generale de biochimie analitică
Pentru a putea alege o metodă analitică adecvată, este esențial să se cunoască

ceva despre proprietățile chimice și fizice ale substanței de testat (tabelul 1.1).
Deoarece relația dintre proprietate și cantitatea de substanță nu este
întotdeauna una simplă, unele metode sunt adecvate doar pentru detectarea
substanței (calitative), în timp ce altele pot fi cantitative. Pentru orice metodă
este important să se aprecieze natura relației dintre
Tabelul 1.1 Baza fizică a metodelor analitice

Proprietăți fizice care pot fi Exemple de proprietăți utilizate
măsurate cu ajutorul unor în cuantificarea
gradul de precizie Proteină Oxigen
Plum
b
Extensiv
Masa + +
Volum +
Mecanică
Densitate +
specifică +
Vâscozitate +
Tensiunea de suprafață
Spectrale
Absorbție + +
Emisiune
Fluorescență
Turbiditate +
Rotație
Conductivitate
electrică
Curent/tensiune +
Potențialul de semicelulă +
Radioactivitatea
nucleară
Proteinele sunt componentele majore în volum în multe probe biologice și, prin
urmare, cântărirea unei probe uscate ar trebui să ofere o estimare a cantității de
proteine prezente. În mod similar, soluțiile care conțin proteine prezintă valori ale
gravitației specifice și ale tensiunii superficiale care sunt într-un fel legate de conținutul
de proteine. Măsurătorile turbidității care rezultă din precipitarea proteinelor și
absorbția de radiații la anumite lungimi de undă au fost toate utilizate în mod cantitativ.
Conținutul de plumb al probelor biologice este de obicei foarte mic, ceea ce face ca
metodele gravimetrice să fie impracticabile, iar metodele s-au bazat adesea pe
formarea de complecși colorați cu o varietate de coloranți. Mai recent, dezvoltarea
spectroscopiei de absorbție care utilizează probe vaporizate a oferit o metodă
cantitativă sensibilă. Măsurătorile de oxigen cu ajutorul unor electrozi specifici oferă
un nivel de sensibilitate care nu poate fi obținut cu ajutorul analizei volumetrice a
gazelor.
măsurarea obținută și cantitatea de substanță din eșantion.

Cele mai multe metode analitice implică mai multe etape pregătitoare înainte
de a se putea face măsurarea finală și este posibil să se realizeze o diagramă
de flux care să reprezinte o metodă generalizată de analiză (tabelul 1.2). Nu
toate etapele pot fi necesare într-o anumită metodă și poate fi posibilă
combinarea a două sau mai multe etape printr-o alegere atentă a
instrumentarului. Este important ca, atunci când se selectează o anumită
metodă, să se ia în considerare nu numai validitatea sa analitică, ci și costul
analizei în ceea ce privește instrumentele și reactivii necesari și timpul
necesar.
Tabelul 1.2 Metoda generalizată de analiză
Etapele majore de
manipulare într-o metodă
generalizată de analiză
Purificarea substanței de testat
t
Dezvoltarea unei caracteristici
fizice prin formarea unui
derivat
t
Detectarea unui efect inerent
sau o caracteristică fizică
indusă
t
Amplificarea semnalului
t
Măsurarea semnalului
t
Calcul
t
Prezentarea rezultatului
1.1.1 Metode instrumentale

Cele mai convenabile metode sunt cele care permit identificarea și cuantificarea
simultană a substanței de testat. Din nefericire, acestea sunt relativ puține, dar
probabil că cele mai bune exemple sunt cele din domeniul spectroscopiei de
emisie și absorbție atomică, unde lungimea de undă a radiației poate fi utilizată
pentru identificarea elementului, iar intensitatea radiației poate fi utilizată pentru
cuantificarea acestuia.
În cazul în care un compus nu prezintă o caracteristică ușor de detectat,
poate fi posibilă modificarea chimică a acestuia pentru a produce un compus
care poate fi măsurat mai ușor. La începutul acestui secol, această abordare a
analizei
4Principii generale de biochimie analitică
a dus la dezvoltarea a numeroși reactivi complecși concepuți pentru a

reacționa în mod specific cu anumite substanțe de testare. În general, acești
reactivi au dus la formarea unei culori care poate fi măsurată cu ajutorul unor
comparatoare vizuale. Majoritatea acestor reactivi au fost înlocuiți de metode
instrumentale îmbunătățite, dar unele foarte fiabile sunt încă în uz. Aceștia au
fost adesea numiți după numele lucrătorilor asociați cu dezvoltarea lor, de
exemplu, reactivul lui Folin și Ciocalteu, descris inițial în 1920 pentru
detectarea compușilor fenoleici.
Interferența apare atunci când sunt detectate și alte substanțe, precum și
compusul de testat, ceea ce duce la creșterea eronată a valorilor. Ocazional,
efectele de interferență pot duce la suprimarea reacției de testare. Pentru orice
metodă, este important să se cunoască substanțele care pot cauza interferențe
și să se știe dacă este probabil ca vreuna dintre ele să fie prezentă în probă.
În cazul în care interferența reprezintă o problemă majoră, proba trebuie
purificată parțial înainte de analiză. Astfel, analiza se împarte în etape
pregătitoare și cantitative. Pentru a reduce dificultățile tehnice care rezultă din
astfel de metode în două etape, s-au depus multe eforturi pentru dezvoltarea
unor tehnici analitice, cum ar fi cromatografia în fază gazoasă și lichidă, în
care separarea și cuantificarea se realizează secvențial.
1.1.2 Metode fiziologice

Deși este posibil să se elaboreze metode cantitative de analiză pentru mulți
compuși biochimici, singura metodă practică de măsurare a altora este prin
efectele lor fiziologice. Un biotest implică măsurarea răspunsului unui
organism sau a unui organ țintă la compusul de testat și poate fi efectuat in
vivo, folosind animale vii, sau in vitro, folosind organe izolate sau preparate de
țesuturi. Multe dintre bioteste sunt cantitative, dar cele care dau doar un
rezultat pozitiv sau negativ sunt considerate a fi de natură cantitativă.
Un biotest satisfăcător necesită ca răspunsul animalului la substanță să
poată fi măsurat într-un mod destul de precis, dar trebuie reținut că animale
diferite răspund în moduri diferite la același stimul. Prin urmare, testele
biologice trebuie concepute astfel încât să țină seama de aceste variații și
trebuie efectuate măsurători repetate pe diferite animale. În toate testele, este
important ca factorii externi care pot influența răspunsul să fie cât mai mult
posibil standardizați. Vârsta și greutatea unui animal pot afecta răspunsul
acestuia, la fel ca și condițiile de mediu, calea de injectare și mulți alți factori.
În absența unei identificări chimice absolute, este adesea necesar să se
stabilească dacă probe diferite conțin aceeași substanță activă din punct de
vedere fiziologic. Acest lucru poate fi realizat prin compararea relației doză-
răspuns pentru ambele probe. Aceasta presupune măsurarea răspunsului la
diferite cantități din fiecare eșantion și demonstrarea faptului că panta relației
rezultate este aceeași în ambele cazuri. În astfel de metode grafice sau
statistice, poate fi necesar să se utilizeze logaritmul cantității pentru a obține o
linie dreaptă, mai degrabă decât o curbă. Este adesea necesar să se utilizeze o
astfel de tehnică pentru a confirma validitatea utilizării preparatelor sintetice
sau purificate ca etaloane în analizele cantitative.
Utilizarea de celule din țesuturi specifice cultivate în culturi, mai

degrabă decât proaspăt izolate, oferă o tehnică de testare biologică care reduce
necesitatea utilizării animalelor, cu toate implicațiile legate de resursele
costisitoare și de conflictele etice. Alternativ, există o gamă largă de linii
celulare disponibile de diferite origini tis sue (tabelul 1.3).
Tabelul 1.3 Bioteste care utilizează linii celulare

Hormon Sistem utilizat Parametru măsurat
Prolactină Celule de limfom de Creștere

Interleukina 1 (ILl) șobolan Celule de mielom celulară
Factorul de creștere uman Linie celulară Creștere
transformator f3 eritroleucemică celulară
(TGF/3) Inhibarea creșterii stimulate
de interleukina 5 (IL5) a
stimulat creșterea
Măsurarea activității catalitice a unei enzime este, de asemenea, un

bioas spune în ciuda faptului că metodele chimice pot fi folosite pentru a
măsura cantitatea de substrat de produs. Cu toate că utilizarea
radioimunoanalizelor poate permite determinarea concentrației molare a unei
enzime, rămâne încă problema relației dintre concentrația molară și efectele
fiziologice.
1.1.3 Kituri de testare

În ultimii ani, producătorii de reactivi sau de instrumente au dezvoltat
numeroase metode pentru o mare varietate de analiți, care sunt comercializate
sub formă de "kituri". Acestea variază de la teste colorimetrice relativ simple,
care necesită doar adăugarea soluțiilor chimice furnizate la proba de testare,
până la proceduri mai sofisticate care implică reactivi complecși, cum ar fi
anticorpii sau acizii nucleici marcați. Kiturile includ toate standardele și
componentele necesare pentru teste. Acestea pot fi concepute pentru a fi
utilizate în cadrul unei proceduri manuale sau, mai ales, pe un anumit
instrument automatizat. Sunt oferite protocoale complete de analiză, împreună
cu detalii privind compoziția tuturor reactivilor, orice date de risc asociate și
condițiile de depozitare specificate.
Disponibilitatea crescută a kiturilor a redus considerabil necesitatea ca
laboratoarele individuale să dezvolte propriile metode. Este obligatoriu ca
toate trusele să fie validate înainte de a putea fi vândute și ca detaliile privind
performanța analitică preconizată să fie incluse în produs. Cu toate acestea,
fiecare laborator este responsabil pentru propriile rezultate, iar personalul
trebuie să se asigure că instrucțiunile producătorului sunt respectate și că este
mulțumit de toate aspectele oricărui kit pe care îl utilizează. Acest lucru poate
necesita efectuarea de verificări privind performanța analitică menționată.
Secțiunea 1.1
1. Care dintre următoarele măsurători se spune că sunt spectrale?
(a) Culoare.
(b) Modificări de tensiune.
(c) Elasticitate.
(d) Fosforescență.
2. Care dintre următoarele se poate spune că este un rezultat cantitativ?

(a) Testul este pozitiv.
(b) Proba conține mai mult de 5 g de glucoză.
(c) Proba conține 0,3 g de glucoză.
(d) Proba conține atât glucoză, cât și lactoză.
3. Cântăritul unui eșantion este o metodă
calitativă PENTRU CĂ
Cântărirea unei substanțe nu va oferi identitatea substanței.
4. Mulți hormoni se pretează la teste biologice
PENTRU CĂ
bioanalizele implică măsurarea efectului substanței de testat asupra
celulelor vii.
Toate datele, în special cele numerice, sunt supuse erorilor din diverse motive,
dar, deoarece deciziile vor fi luate pe baza datelor analitice, este important ca
această eroare să fie cuantificată într-un anumit mod.
1.2.1 Variabilitatea datelor analitice

Rezultatele analizelor repetate ale aceluiași eșantion vor arăta, de obicei, o
anumită variație în jurul valorii medii și, dacă se face o singură măsurătoare,
aceasta va fi o aproximare a valorii reale.
Eroare aleatorie
Variația dintre măsurătorile repetate se poate datora unei varietăți de cauze,
cea mai previzibilă fiind eroarea aleatorie, care apare ca rezultat cumulativ al
unei serii de variații simple, nedeterminate. Acestea se datorează adesea
proiectării și utilizării instrumentelor, de exemplu, efectelor de frecare pe o
balanță, volumelor variabile furnizate de autopipetă din cauza uzurii și
deciziei operatorului la citirea semnalelor fluctuante. Astfel de erori dau
}PC: t\-}3 , fr ,1 -.-s- naștere unor rezultate care, cu excepția cazului în care valoarea lor medie se
apropie de zero, vor prezenta o distribuție normală în jurul mediei. Deși
f' .,:: - G eroarea aleatorie nu poate fi evitată, ea poate fi redusă printr-o tehnică atentă
:;iil Ei : ; ;:;::,) ::. și prin utilizarea unor instrumente de bună calitate.
Gat.U!iSlan
Sfi S ;.-------- Trasarea unei histograme este o modalitate convenabilă de a reprezenta
variația într-un astfel de set de măsurători repetate. Toate valorile obținute
dmsietrniutviosnt-o-ie6i:w1i':'lbe-------
. : : ... sunt împărțite inițial într-un număr convenabil de grupe uniforme, intervalul
fiecărui grup fiind cunoscut sub numele de intervalul de clasă. În figura 1.1
există 11 astfel de grupuri, iar intervalul de clasă este de 1,0 unități. Numărul
de măsurători care se încadrează într-un anumit interval de clasă este cunoscut
sub numele de frecvență (j) și este reprezentat sub forma unui dreptunghi în
care baza reprezintă intervalul de clasă respectiv, iar înălțimea reprezintă
frecvența măsurătorilor care se încadrează în acel interval. Intervalul de clasă
cu cea mai mare frecvență este cunoscut sub numele de clasă modală, iar
măsurarea care are loc cu cea mai mare frecvență este cunoscută sub numele
de mod. Media tuturor măsurătorilor este cunoscută sub numele de medie și,
teoretic, pentru a
Calitatea datelor 7
Frecvență 100
75
50
25
0
10 15
Intervalul clasei
Intervalul clasei Frecvență
10.0-10.9 5
11.0-11.9 18
12.0-12.9 32
13.0-13.9 55
14.0-14.9 86
15.0-15.9 95
Figura 1.1 Distribuția 16.0-16.9 83
17.0-17.9 53
normală a 18.0-18.9 35
măsurătorilor repetate 19.0-19.9 15
în jurul unei medii. 20.0-20.9 6
pentru a determina această valoare (µ.,), sunt necesare mai multe repetiții. În
practică, atunci când numărul de replici este limitat, media calculată (x) este o
aproximare acceptabilă a valorii reale.
Cel mai acceptabil mod de exprimare a variației care apare între
măsurătorile repetate este calcularea abaterii standard (s) a
date:
s= J2(x:x)2
unde x este o măsurătoare individuală și n este numărul de măsurători
individuale. O formulă alternativă, care este mai convenabilă pentru a fi
utilizată cu ajutorul calculatoarelor, este:
s J!,x2-
=
n-I
Calculul abaterii standard necesită un număr mare de replici.

cate. Pentru orice număr de replici mai mic de 30, valoarea pentru s este doar
o valoare aproximativă și funcția (n - 1) este utilizată în ecuație în loc de
(n). Această funcție (n - I) este, de asemenea, cunoscută sub numele de grade
de libertate (cf,) asociate cu media și este importantă atunci când se utilizează
teste de semnificație.
Cunoașterea abaterii standard permite să se facă o afirmație precisă cu
privire la distribuția măsurătorilor repetate în jurul valorii medii. Tabelul 1.4
enumeră relația dintre o abatere standard și pro-
Tabelul 1.4 Distribuția normală în jurul unei medii
Limite definite în jurul mediei în Procentul de măsurători totale care se

funcție de abaterea (abaterile) încadrează în limitele definite
standard
38.30
± 0.5 68.27
± 1.0 86.64
± 1.5 95.45
± 2.0 98.76
± 2.5 99.73
± 3.0 99.96 -
± 3.5 99.99
± 4.0
partea de măsurători care se încadrează în intervale definite. Două limite

convenabile utilizate adesea sunt ± ls și ± 2s din valoarea medie. Din 100 de
măsurători repetate, de exemplu, aproximativ 95 se vor încadra în intervalul
de ± 2s din valoarea medie. Acest lucru permite prezicerea probabilității ca o
singură măsurătoare să se situeze în limitele specificate ale valorii medii. De
exemplu, probabilitatea ca o singură măsurătoare să se încadreze într-un
interval de aproximativ ± 2s din valoarea medie ar fi de 0,95 (95%). Dacă în
locul unei singure măsurători se efectuează un număr limitat de repetări, în
locul unei singure măsurători, se poate acorda un grad mai mare de încredere
valorii medii rezultate. Această încredere poate fi exprimată ca eroare
standard a mediei (SEM), în care abaterea standard este redusă cu un factor
egal cu rădăcina pătrată a numărului de replici efectuate:
s
SEM =-
,jn
Prin urmare, există un avantaj considerabil în efectuarea unui număr

limitat de analize repetate, mai degrabă decât a unei singure analize, dar, în
practică, este necesar să se pună în balanță încrederea sporită care poate fi
acordată datelor cu timpul și efortul sporit pe care le implică.
Eroare sistematică
Erorile sistematice sunt specifice fiecărei metode sau fiecărui sistem în parte.
Ele au un caracter constant și, deși pot fi controlate într-o anumită măsură, nu
pot fi evaluate statistic. Un efect major al introducerii erorilor sistematice într-
o metodă analitică poate fi deplasarea poziției mediei unui set de citiri în
raport cu media inițială. Este posibil să nu afecteze în mod evident
Calitatea datelor 9
distribuția citirilor în jurul noii medii și, prin urmare, datele vor prezenta
valori similare pentru abaterea standard. Se spune că o astfel de metodă
prezintă o tendință fie pozitivă (o creștere a mediei), fie negativă (o scădere a
mediei), în funcție de direcția de deplasare.
Factori instrumentali
Instabilitatea instrumentelor contribuie la eroarea aleatorie descrisă mai sus,
dar uneori caracteristicile de proiectare a acestora, oboseala sau defectarea
componentelor pot avea ca rezultat citiri mai mici sau mai mari decât ar
trebui să fie. Acest lucru poate fi văzut uneori ca o derivă treptată pe
parcursul unei perioade de timp. Astfel de variații sunt considerate a fi de
origine sistematică și vor duce la rezultate distorsionate. Pentru a minimiza
pericolul unei astfel de erori sistematice, este esențial să se acorde o atenție
deosebită alegerii și utilizării instrumentelor analitice.
Erori de metodă
Este posibil ca baza chimică sau biologică a unei metode analitice să nu
permită o relație simplă și directă între valoarea citită și concentrația
analitului, iar lipsa de apreciere a limitărilor și constrângerilor unei metode
poate duce la erori sistematice semnificative. Carbohidrații pot fi cuantificați,
de exemplu, folosind o metodă bazată pe proprietățile lor reducătoare, dar
rezultatele vor avea tendința de a fi mai mari decât ar trebui să fie dacă în
probe sunt prezente și substanțe reducătoare care nu sunt carbohidrați.
De asemenea, este posibil ca o metodă analitică perfect valabilă să
devină mai puțin valabilă atunci când este utilizată în condiții diferite. De
exemplu, măsurarea poten tiometrică a pH-ului este dependentă de
temperatură, iar utilizarea soluțiilor de referință și a soluțiilor de testare la
temperaturi diferite, fără nicio compensare, va avea ca rezultat valori constant
mai mari sau mai mici decât ar trebui să fie.
1.2.2 Evaluarea metodelor analitice

Metodele analitice ar trebui să fie precise, exacte, sensibile și specifice, dar,
din motivele prezentate anterior, toate metodele nu reușesc să îndeplinească
pe deplin aceste criterii. Este important să se evalueze fiecare metodă pentru
aceste calități și trebuie să existe o coerență în definirea și utilizarea acestor
cuvinte.
Precizie
Precizia sau reproductibilitatea unei metode reprezintă măsura în care un
număr de măsurători repetate ale unui eșantion sunt în concordanță una
cu cealaltă și este afectată de eroarea aleatorie a metodei. Aceasta se
măsoară ca imprecizie, care este exprimată numeric în termeni de abatere
standard a unui număr mare de determinări repetate (adică mai mare de
30), deși, pentru simplificare, în calculul prezentat în procedura I. I se
utilizează doar un număr limitat de replici. Valoarea indicată pentru s este
o măsură a dispersiei măsurătorilor repetate în raport cu valoarea lor
medie și trebuie întotdeauna indicată în raport cu această valoare medie.
Semnificația oricărei valori menționate pentru abaterea standard nu
este imediat evidentă fără a se face referire la valoarea medie la care se
referă.
Coeficientul de variație sau abaterea standard relativă exprimă abaterea

standard ca procent din valoarea medie și oferă o valoare care permite o
apreciere mai ușoară a preciziei:
Coeficientul de variație (V) = _s_ X 100%.
medie
Este dificil de apreciat ce implică afirmația că o abatere standard de
1,43 g-11 , dar citarea acesteia ca un coeficient de variație de 10,3%
semnifică faptul că majoritatea rezultatelor replicilor (68%) sunt
dispersate într-un interval de ±: 10,3% din valoarea medie. În comparație cu
citarea valorilor pentru
Calitatea datelor 11
abaterea standard, implicațiile valorilor coeficientului de variație pentru două

metode analitice, de exemplu, de 5% și 10% sunt imediat evidente.
În timp ce valoarea coeficientului de variație este o declarație generală
despre imprecizia unei metode, numai valoarea deviației standard poate fi
utilizată în orice comparație statistică între două metode. Utilizarea
coeficientului de variație presupune o relație constantă între abaterea standard
și valoarea medie, iar acest lucru nu este întotdeauna adevărat (tabelul 1.5).
Tabelul 1.5 Un exemplu de abatere standard și

coeficient de variație pentru diferite valori medii
Medie (x) Experimental

(grl)
s V
(grl) (%)
50 4.0 8
100 5.0 5
150 7.5 5
200 12.0 6
Utilizarea coeficientului de variație (JI) arată că precizia

maximă în exemplul dat este obținută la valorile medii
ale concentrației, fapt care nu ar fi atât de evident dacă s-
ar cita doar abaterea (abaterile) standard.
Este posibil să se demonstreze un grad ridicat de precizie într-un set de

analize repetate efectuate în același timp și, într-o astfel de situație, imprecizia
în cadrul lotului ar fi considerată bună. Cu toate acestea, compararea
eșantioanelor de replică analizate în zile diferite sau în loturi diferite poate
arăta o variație mai mare, iar imprecizia între loturi ar fi considerată slabă.
În practică, acest lucru poate reflecta mai bine validitatea datelor analitice
decât imprecizia între loturi.
O comparație a impreciziei a două metode poate ajuta la alegerea uneia

dintre ele pentru utilizarea de rutină. Compararea statistică a valorilor pentru
abaterea standard cu ajutorul testului "F" (procedura 1.2) poate fi utilizată
pentru a compara nu numai diferite metode, ci și rezultatele obținute de
diferiți analiști sau laboratoare. Trebuie să se manifeste o anumită prudență în
interpretarea datelor statistice și, în special, în astfel de teste de semnificație.
Deși unele teste statistice sunt prezentate în această carte, se recomandă cu
insistență tuturor celor care intenționează să le utilizeze să citească un text
adecvat pe această temă.
Din cunoașterea impreciziei unei metode este posibilă evaluarea
numărul de cifre semnificative care trebuie menționate în orice rezultat

numeric. Există întotdeauna tentația de a implica un grad ridicat de precizie
prin citarea datelor numerice cu prea multe zecimale. Pe de altă parte, nu
trebuie să se permită ca eroarea datorată "rotunjirilor" zecimale să afecteze
precizia inerentă metodei. Un zero la sfârșitul unei serii de zecimale este
adesea omis, dar poate fi semnificativ. Este o regulă practică să nu se
raporteze date cu cifre semnificative mai mici de un sfert din abaterea
standard, de exemplu
s 1.43 g1-1
s
0.35 g1-1
4
Raportați datele la cea mai apropiată valoare de 0,5 g1-1 -
Precizie
Precizia este apropierea mediei unui set de analize repetate de valoarea reală a
eșantionului. În practică, cele mai multe metode nu reușesc să atingă o precizie
completă și ar trebui să se determine inexactitatea oricărei metode. Adesea,
este posibil să se evalueze acuratețea unei metode numai în raport cu o altă
metodă care, dintr-un motiv sau altul, se presupune că oferă o valoare medie
reală. Acest lucru se poate face prin compararea mediilor analizelor repetate
prin cele două metode, folosind testul "t". Un exemplu de astfel de comparație
este prezentat în procedura 1.3, cu mențiunea că se utilizează doar un număr
limitat de replici, exclusiv pentru a simplifica calculul.
Unii autori folosesc cuvântul "veridicitate" în loc de "acuratețe" pentru
a descrie apropierea mediei mai multor analize repetate de valoarea reală.
Astfel, cuvântul "acuratețe" poate avea un sens mai general, care se referă la
acuratețea sau diferența dintre un singur rezultat și valoarea adevărată, ca o
consecin- ță.
nsă, atât imprecizia (eroare aleatorie), cât și orice distorsiune (eroare

sistematică) a unei metode. Pe parcursul acestei cărți, cuvântul este utilizat așa
cum a fost definit inițial mai sus. Metoda studiată este comparată, de obicei, cu
o metodă de referință acceptată sau, în cazul în care aceasta nu este
disponibilă, cu o metodă care se bazează pe un principiu complet diferit. În
acest din urmă caz, este puțin probabil ca cele două metode să prezinte exact
același grad de părtinire și, dacă dau rezultate foarte asemănătoare, se poate
presupunem că niciuna dintre ele nu prezintă o
prejudecată semnificativă.
Formula pentru testul "t" descrisă în procedura 1.3 compară media

analizelor repetate ale unui singur eșantion, dar poate fi preferabil să se
compare precizia pe toată gama analitică a metodei. În acest scop, se poate
utiliza un test "t" perechi, în care eșantioane cu concentrații diferite sunt
analizate folosind ambele metode și se compară diferența dintre fiecare
pereche de rezultate. Un exemplu simplificat este prezentat în procedura 1.4.
O critică a unui astfel de test "t" împerecheat este că, pentru o gamă
largă de concentrații, diferența dintre perechi are aceeași semnificație,
indiferent de mărimea valorii numerice. Diferența dintre valorile 8 și 10, de
exemplu, este mai semnificativă decât diferența dintre 98 și 100, deși este
egală din punct de vedere numeric cu aceasta.
O abordare suplimentară pentru tratarea datelor pereche este evaluarea
gradului de corelație dintre perechi. Datele pot fi prezentate sub forma unui
grafic în care o axă este utilizată pentru rezultatele obținute printr-o metodă,
iar cealaltă axă pentru rezultatele acelorași eșantioane obținute prin cealaltă
metodă. În cazul în care fiecare eșantion analizat a dat un rezultat identic
prin ambele metode, atunci ar rezulta un grafic caracteristic [figura 1.2 litera
(a)]. Apropierea dintre toate punctele și
linia dreaptă poate fi evaluată cu ajutorul coeficientului de corelație (r). O

relație de corelație perfectă, așa cum este ilustrată în figura l .2(a), dă un
coeficient de corelație de 1. Un coeficient de O indică lipsa de corelație între
date; valorile cuprinse între 0 și l indică grade diferite de corelație. În general,
un coeficient de corelație mai mare de 0,9 indică o corelație bună sau slabă și,
împreună cu un rezultat acceptabil al testului "t" asociat, ar oferi dovezi solide
pentru un grad comun de precizie între cele două metode. Metoda de calcul a
coeficientului de corelație este ilustrată în procedura 1.5.
Este posibil ca două metode care diferă semnificativ în ceea ce privește

acuratețea lor să ofere o bună corelație a datelor, dar să eșueze la testul "t".
Reprezentarea datelor sub forma unui grafic de regresie ar arăta o divergență față
de modelul din figura l.2(a). Ar putea apărea multe variații complexe, dar două
variații destul de simple ar prezenta trăsături caracteristice. În cazul în care o
metodă a dat rezultate care au fost în mod constant mari sau mici cu o valoare
fixă (din cauza unei lipse de specificitate, de exemplu), ar rezulta un grafic
similar cu cel din figura l .2(b), în care intercepția nu este zero, ci corespunde
erorii fixe implicate. În mod similar, dacă o metodă ar arăta
(a) 100
100
(b)
N
"O
.s
0
<U
>,
..c
C:
0
-.:::1
"'
! :I
C:
<U
(.,)
C:
0u
00 100
(c) 100
100
Concentrația prin metoda 1
Figura 1.2 Graficul de regresie. Graficul (a) reprezintă datele obținute prin analizarea
probelor prin două metode care prezintă o corelație perfectă.
Metoda 2 din graficul (b) prezintă o deviație pozitivă constantă în comparație cu metoda
1.
În graficul (c), metoda 2 prezintă o deviație negativă care este proporțională cu
concentrația analitului.
o eroare sistematică care ar fi fost într-un fel proporțională cu concentrația

probei, panta ar fi fost diferită [figura l.2(c)]. Aceste valori pot fi calculate
folosind metoda de analiză a regresiei liniare (procedura 1.6). Folosind
această metodă statistică, se determină ecuația liniei drepte și se calculează
valoarea.
uri pentru panta și intercepția calculate. Dacă acestea diferă de 1,0 și,
respectiv, de zero, graficul diferă de cel caracteristic din figura l.2(a) și cele
două metode diferă în ceea ce privește precizia lor.
Sensibilitate
Sensibilitatea unei metode este definită ca fiind capacitatea acesteia de a
detecta cantități mici de substanță de testat. O anumită confuzie poate apărea
din cauza modului în care se măsoară sensibilitatea. Aceasta poate fi evaluată
prin citarea celei mai mici cantități de substanță care poate fi detectată; de
exemplu, cea mai mică citire după zero care poate fi detectată și măsurată în
mod constant. Panta graficului de calibrare este o modalitate convențională de
exprimare a sensibilității și este deosebit de utilă atunci când se compară două
metode. Este esențial ca, pentru o astfel de comparație, unitățile de măsură ale
ambelor axe să fie aceleași pentru fiecare metodă. Deși poate exista o
diferență semnificativă între valorile medii ale determinărilor repetate a două
eșantioane cu concentrații ușor diferite, este posibil să nu existe o diferență
semnificativă între analizele unice sau chiar duplicate ale acestor două
eșantioane. În astfel de cazuri, lipsa de precizie este mai semnificativă decât
sensibilitatea metodei, care nu poate fi mai bună decât precizia în cazul în
care se efectuează numai analize unice sau în dublu exemplar.
Specificitate
Specificitatea este capacitatea de a detecta numai substanța de testat. Lipsa de
specificitate va duce la rezultate fals pozitive dacă metoda este calitativă și la
distorsiuni pozitive în cazul rezultatelor cantitative. Natura oricărei substanțe
care interferează cu anumite metode va fi discutată în secțiunile
corespunzătoare, dar este important să se aprecieze faptul că specificitatea
este adesea legată de sensibilitate. Este posibil să se reducă sensibilitatea unei
metode, ceea ce are ca rezultat faptul că efectele de interferență devin mai
puțin semnificative, iar metoda este specifică, deși mai puțin sensibilă la
subzistența testului. Într-o astfel de situație, nu vor apărea falsuri pozitive
(substanțe care interferează), dar pot apărea false negative (concentrații
scăzute nedetectate) și este necesar să se decidă dacă este necesară o
sensibilitate sau o specificitate maximă.
1.2.3 Asigurarea calității în biochimia analitică

Pentru a obține rezultate fiabile, toate metodele analitice trebuie să fie
proiectate cu atenție și trebuie să se determine precizia și acuratețea acestora.
Ar trebui investigată stabilitatea probelor și ar trebui controlată manipularea
ulterioară a acestora în mod
în mod corespunzător. Atitudinea personalului implicat este de o importanță

vitală: acesta trebuie să fie motivat să producă date valide și să fie mândru de
calitatea produsului final. Toți acești factori, împreună cu sistemul de
monitorizare a performanțelor, vor fi analizați cu atenție în cazul în care un
laborator solicită acreditarea oficială.
Controlul calității
Controlul calității se referă la o schemă internă care va avertiza atunci când
factori neprevăzuți determină o reducere a performanței analitice a metodei.
Acest lucru permite luarea unei decizii imediate cu privire la acceptabilitatea
sau respingerea rezultatelor testului. Acest lucru se face, de obicei, prin
analiza unui eșantion de control la fiecare lot de teste.
Probe de control
O probă de control este o probă pentru care se cunoaște concentrația analitului
de testat și care este tratată în mod identic cu probele de testare. În mod ideal,
acesta ar trebui să aibă o compoziție generală similară cu cea a probelor de
testare, pentru a prezenta caracteristici fizice și analitice similare. De exemplu,
în cazul în care se analizează conținutul de glucoză al probelor de ser, proba
de control trebuie să fie, de asemenea, ser cu o concentrație cunoscută de
glucoză. O probă de control va fi una dintre numeroasele părți alicotate ale
unei probe mai mari, depozitate în condiții adecvate și pentru care au fost
determinate media între loturi și abaterea standard a mai multor replici. Acesta
poate fi preparat în laborator sau achiziționat de la un furnizor extern. Deși
valorile sunt adesea indicate pentru eșantioane de control disponibile în
comerț, este esențial ca media și abaterea standard să fie determinate din
analize repetate în cadrul fiecărui laborator în parte.
Eșantioanele de control ar trebui analizate împreună cu eșantioanele de
testare, dar analistul nu ar trebui să știe care sunt eșantioanele de control.
Cunoscând valoarea medie pentru proba de control și precizia așteptată de la
metodă, este posibil să se prevadă limitele în care un singur rezultat de control
ar trebui să se încadreze în mod normal. La baza unui program de control al
calității stă ipoteza că, dacă un singur rezultat de control se încadrează în
aceste limite definite, metoda este sub control, iar rezultatele testelor produse
în același timp sunt valide. Dacă valoarea de control se situează în afara
limitelor definite, este probabil ca rezultatele testului să fie eronate și trebuie
respinse.
Diagrame de control
Este adesea util să se înregistreze rezultatele eșantioanelor de control într-o
manieră vizibilă, nu numai datorită impactului mai mare al unei afișări
vizuale, ci și pentru ușurința relativă cu care este posibil să se prevadă
tendințele. Au fost sugerate o varietate de stiluri de diagrame de control al
calității, dar cele mai frecvent utilizate sunt cele cunoscute sub numele de
diagrame Levey-Jennings sau Shewart, care indică dispersia rezultatelor
controlului individual în jurul valorii medii desemnate (procedura 1.7).
În grafic sunt incluse limite de control stabilite la ± 2s și ± 3s, care se
apropie de limitele de încredere de 95% și, respectiv, 99%. În cazul în care
un rezultat de control se situează în afara limitei de 95%, există doar o
probabilitate maximă de 0,05 (5%) ca rezultatul să se situeze într-o distribuție
normală în jurul mediei acceptate. La
cea mai evidentă implicație este că rezultatul ar putea fi greșit. Deducții

similare, cu un grad sporit de încredere, pot fi făcute cu privire la limitele de
control de 99%. Poziția exactă a limitelor de control poate fi stabilită în
funcție de cerințele situației și, în unele cazuri, poate fi necesar să se
stabilească niveluri de control mai stricte ::!: ls și ::!: 2s.
Limitele mai restrânse sunt cunoscute, de obicei, ca limite de

avertizare. Nerespectarea acestor limite implică faptul că metoda trebuie
investigată și că orice punct slab cunoscut, cum ar fi reactivii instabili,
controlul temperaturii etc., ar trebui să fie identificat. Cu toate acestea,
rezultatele obținute în același timp cu rezultatul controlului pot fi în
continuare acceptate. Probabil că primul pas într-un astfel de caz este
repetarea analizei de control. Dacă rezultatul inițial a fost un punct aleatoriu
valabil în legătură cu media, atunci rezultatul repetat ar trebui să fie mai
aproape de valoarea medie. Dacă analiza repetată nu arată nicio îmbunătățire
sau dacă rezultatul inițial al controlului se afla în afara limitelor de control mai
largi (cunoscute ca limite de acțiune), atunci trebuie să se presupună că toate
rezultatele sunt greșite. Metoda trebuie investigată, defecțiunea trebuie
remediată și analiza eșantioanelor și a controalelor trebuie repetată.
Graficul poate oferi informații suplimentare cu privire la orice
schimbare în acuratețea metodei. În mod normal, ar fi de așteptat ca o serie de
rezultate de control să prezinte o dispersie în jurul valorii medii. În cazul în
care punctele arată o tendință de a se situa într-o parte a mediei, dar în
continuare în intervalul acceptat, aceasta ar fi o indicație că metoda prezintă o
distorsiune într-o anumită direcție.
O metodă vizuală alternativă de prezentare a rezultatelor controlului
calității este cunoscută sub numele de graficul Cusum (sumă cumulativă).
Aceasta este deosebit de utilă atunci când nu sunt disponibile probe de control
(posibil din cauza lipsei de stabilitate a acestora) și, de asemenea, atunci când
se efectuează un număr mare de analize care dau o valoare medie constantă.
Valoarea medie pentru fiecare lot mare de analize va varia în cadrul unei
distribuții nor malare în jurul "mediei mediilor" calculate dintr-un număr mare
de loturi de-a lungul unei perioade de timp. Prin urmare, diferența dintre
media unui lot și "media mediilor" ar trebui să fie zero, iar suma cumulată a
acestor diferențe ar trebui să fie, de asemenea, zero. Se trasează un grafic al
sumei cumulate a diferențelor în funcție de data analizei sau de numărul
lotului (procedura 1.8). Pentru probele de control al calității, se trasează suma
cumulată a rezultatelor individuale în comparație cu valoarea medie calculată
anterior.
În multe cazuri, un grafic Cusum nu va arăta linia orizontală așteptată.
ci mai degrabă o linie cu o pantă mică, dar constantă, datorită faptului că
valoarea atribuită "mediei mediilor" este incorectă. Graficul este totuși
acceptabil și, în astfel de cazuri, o modificare a pantei va indica o schimbare
față de valoarea așteptată și posibilitatea unei erori. Unele dintre dificultățile
pe care le prezintă graficul Cusum sunt că variațiile sunt mai evidente
retrospectiv, că se pot obține puține informații dintr-un singur punct, iar
erorile sunt vizibile doar din mai multe puncte consecutive. Prin urmare, este
discutabil dacă acest tip de grafic poate fi clasificat ca un adevărat control al
calității.
Evaluarea calității
Pe lângă programele de control al calității, laboratoarele care efectuează o gamă
similară de analize pot coopera în cadrul unui program de grup. În cadrul unui
astfel de program de grup, aceleași probe de control sunt analizate de fiecare
laborator, iar rezultatele sunt comparate în cadrul grupului. Această formă de
evaluare este, de obicei, un proces retroactiv care permite menținerea sau
îmbunătățirea calității globale. Programele de grup nu necesită neapărat ca
probele de control să aibă o concentrație cunoscută, deoarece, chiar dacă se
utilizează probe necunoscute, comparațiile dintre analizele unice sau repetate,
precum și dintre valorile medii și abaterea standard (precizie) ale
grup poate fi făcută. Rezultatele sunt frecvent publicate în mod codificat,

astfel încât fiecare membru al grupului poate identifica rezultatul său și locul
pe care îl ocupă în profilul grupului, dar nu poate identifica rezultatele altor
membri ai grupului.
Acest tip de program extern este adesea administrat de o organizație
comercială, care distribuie eșantioanele și rezultatele tuturor participanților.
1.2.4 Acreditarea laboratoarelor

Acreditarea recunoaște în mod oficial faptul că un laborator este competent
pentru a efectua serviciul său analitic și este din ce în ce mai mult acceptată ca
o cerință necesară. Este o evaluare globală a performanței unui laborator și
acoperă calitatea managementului și a procedurilor organizaționale asociate,
precum și calitatea testelor. Acreditarea este un proces amplu, care necesită
un audit și o revizuire a calității asociate cu o serie de vizite ale organismului
extern de acreditare, căruia trebuie să i se plătească o taxă.
Au fost înființate diverse organisme, cum ar fi NAMAS (National
Measurement Accreditation Service) și CPA (Clinical Pathology
Accreditation), care funcționează în Regatul Unit. Standardele de calitate
adecvate unei game largi de activități organizaționale, de exemplu BS 5750,
seriile ISO 9000 și EN 45000 în Europa, împreună cu BPL (bunele practici de
laborator) recunoscute la nivel internațional, pot face parte din cerința de
acreditare. În SUA, CLIA'88 (Clinical Laboratory Improvement
Amendments, 1988), împreună cu Administrația Federală a Medicamentelor
și Agenția pentru Protecția Mediului din SUA sunt implicate în acreditarea
laboratoarelor.
Fiecare organism de acreditare elaborează documente detaliate care
prezintă toate cerințele și procesul de evaluare. Aceste documente pot include
următoarele aspecte: cerințe generale, organizare și management, sisteme de
calitate, auditul și revizuirea calității, personal, echipamente, trasabilitatea și
calificarea măsurătorilor, metode și proceduri de testare, spații și mediu de
laborator, manipularea elementelor de testare, înregistrări, rapoarte de testare,
tratarea reclamațiilor și a anomaliilor, subcontractarea testelor, servicii de
asistență externă și consumabile.
Mai multe aspecte specifice ale managementului laboratorului, care
sunt esențiale în procesul de acreditare, sunt discutate în secțiunile următoare.
Aceste aspecte de top sunt, de asemenea, foarte importante pentru
laboratoarele care nu doresc o acreditare formală, dar care sunt preocupate de
calitatea activității lor, de credibilitatea lor și de siguranța angajaților lor.
Sănătate și siguranță
Multe dintre substanțele chimice și multe dintre echipamentele utilizate în
laboratoare sunt potențial periculoase. Este esențial ca aceste pericole să fie
identificate în mod clar și să se definească proceduri de lucru adecvate,
împreună cu o formare adecvată a personalului și cu instalații ușor disponibile
pentru a face față efectelor oricărui accident posibil. Aceste aspecte ale
activității de laborator sunt reglementate în Regatul Unit de reglementările
COSHH (Controlul substanțelor periculoase pentru sănătate) și de OSHA
(Administrația pentru sănătate și siguranță în muncă) în SUA.
Fiecare activitate din laborator ar trebui să fie evaluată în ceea ce
privește potențialele pericole implicate și toate informațiile relevante ar trebui
prezentate într-un format standard cunoscut sub diferite denumiri, cum ar fi
formulare de risc de procedură sau date de securitate ale materialelor.
(fișe de date de securitate). Există mai multe etape în elaborarea unui astfel de
document de pericol (Procedura 1.9). Documentul ar trebui apoi aprobat de
către responsabilul cu securitatea laboratorului sau de către un echivalent, care
ar trebui să se asigure că există toate echipamentele, resursele și formarea
necesare pentru ca procedura să fie realizată.
Informațiile privind pericolele sunt disponibile din diverse surse.
Producătorii de substanțe chimice întocmesc fișe de date privind pericolele
pentru produsele lor, iar unele dintre marile companii produc baze de date
complete. Fiecare fișă de date conține informații privind descrierea fizică a
compusului, stabilitatea, pericolele, măsurile de prim ajutor, cerințele de
depozitare, transport și eliminare.
Pericolele chimice sunt clasificate în cinci categorii principale.

Exploziv
În laboratoarele generale există unii compuși care pot fi exploatate, de
exemplu acidul picric. Este important ca astfel de substanțe să fie depozitate
în condiții adecvate, de exemplu sub apă, și să fie inspectate periodic pentru a
menține aceste condiții. Utilizarea unor astfel de substanțe ar trebui să fie
controlată cu atenție și ar trebui să se utilizeze doar cantități mici.
Inflamabil
Lichidele și solidele inflamabile sunt subdivizate în funcție de punctele lor de
inflamabilitate, iar multe substanțe oxidante pot provoca incendii în contact cu
materiale combustibile. Depozitarea, manipularea și eliminarea sunt, în mod
evident, caracteristici majore de care trebuie să se țină seama atunci când se
utilizează astfel de substanțe.
Toxic
Substanțele sunt clasificate în funcție de gradul de toxicitate și de calea de
administrare, de exemplu, inhalare, înghițire sau contact, aceasta din urmă
fiind deosebit de importantă în proiectarea mediului de lucru. În unele cazuri,
este posibil să se specifice limite de expunere și, în astfel de cazuri,
monitorizarea mediului poate fi esențială.
Coroziv și iritant
Rezultatul contactului pielii cu substanțe corozive este de obicei evident, însă
efectele iritantelor sunt mai puțin evidente și, prin urmare, este posibil să fie
tratate cu mai multă ușurință. Îmbrăcămintea de protecție este esențială atunci
când se utilizează substanțe toxice sau iritante.
Radioactivitate
Aceste substanțe sunt supuse unui control foarte strict, iar laboratoarele trebuie
să fie autorizate să manipuleze diferitele categorii de radioactivitate.
Proceduri standard de operare (SOP)

Procedurile standard de operare oferă detalii scrise despre protocolul care
trebuie respectat pentru orice procedură particulară care se desfășoară.
Acestea nu se limitează la operațiunile de laborator, ci se aplică la o gamă
largă de activități dintr-o organizație și, ca atare, sunt legate de programul
general de calitate. În cadrul unui laborator, ele reprezintă o modalitate
convenabilă de a documenta, într-un format standard și lipsit de ambiguitate,
informațiile de care personalul are nevoie pentru a-și putea îndeplini sarcinile
în condiții de siguranță și în mod corespunzător. Dovezile de informații
actualizate de această natură sunt necesare pentru laboratoarele care doresc să
obțină acreditarea.
PSO includ detalii privind procedurile de colectare și manipulare a
probelor, de efectuare a analizei, de analiză, de stocare și de recuperare a
datelor și de întocmire a rapoartelor. Acestea conțin instrucțiuni privind
utilizarea, întreținerea, service-ul, calibrarea și repararea echipamentelor și
instrumentelor, inclusiv a computerelor. Sunt menționate pericolele asociate
cu protocolul general și sunt specificate practicile de lucru sigure. Sunt incluse
măsurile de asigurare a calității care trebuie respectate, împreună cu
instrucțiuni privind măsurile care trebuie luate în cazul în care metoda nu
funcționează conform specificațiilor. PSO primește un număr de serie și este
datat înainte de a fi semnat și păstrat pentru referințe viitoare. O copie, într-o
husă de protecție adecvată, trebuie să fie disponibilă la locul de lucru, iar
numărul de serie al PSO trebuie menționat în toate înregistrările referitoare la
utilizarea acestuia.
Multe informații privind modul de funcționare și de verificare a
performanțelor instrumentelor de laborator sunt adesea disponibile de la
producători sau furnizori într-o formă care poate fi încorporată într-un PSO.
Informatizare
Computerele au fost folosite pentru prima dată în laboratoare pentru a calcula
rezultatele și a genera rapoarte, adesea de la un instrument individual. Pe
măsură ce au fost dezvoltate analizoare automate, nivelul de informatizare a
crescut, iar calculatoarele joacă acum un rol major în laboratoarele moderne.
Ele sunt asociate atât cu aspectele ana litice, cât și cu cele organizatorice, iar
termenul de Sistem de gestionare a informațiilor de laborator (LIMS) este
adesea utilizat pentru a descrie această funcție globală. Sunt disponibile astfel
de sisteme care leagă diferitele operațiuni asociate cu producerea unui rezultat
validat al testului, de la primirea probei până la transmiterea electronică a
raportului către inițiatorul solicitării, care se poate afla într-un loc îndepărtat
de laborator. Alte utilizări includ controlul stocurilor, gestionarea resurselor
umane și bugetele.
Introducerea cu succes a unui sistem adecvat pentru un anumit laborator
este un proces de lungă durată care necesită consultări pe scară largă. Trebuie
să se țină seama de nevoile actuale și viitoare, precum și de cerințele oricărui
organism extern care poate specifica gradul de informatizare necesar.
pentru acreditare. Introducerea oricărui nou echipament informatic va necesita

formarea personalului și familiarizarea completă a acestuia cu sistemul. Ca și
în cazul tuturor celorlalte instrumente de laborator, trebuie redactate PSO care
să includă evaluări ale pericolelor și proceduri care trebuie urmate în caz de
defecțiune a sistemelor. Trebuie să se efectueze verificări periodice ale
performanțelor și trebuie păstrate înregistrări complete de service și
întreținere.
Buna practică de laborator

Bunele practici de laborator (BPL) reprezintă un set de proceduri în cadrul
cărora poate fi monitorizată performanța globală a unui laborator. Ea se aplică
la organizarea și funcționarea oricărui laborator, dar este deosebit de relevantă
pentru industria farmaceutică. Conformitatea cu BPL poate fi necesară pentru
acreditarea unui laborator de către o agenție de reglementare externă.
BPL implică toate aspectele organizației care sunt implicate în
generarea unui rezultat analitic, de la conducerea superioară până la lucrătorii
de pe bancă. Caracteristicile esențiale ale BPL pot fi rezumate după cum
urmează.
Personal. Toți membrii personalului trebuie să fie instruiți în mod
adecvat, cu responsabilități desemnate și calificări corespunzătoare.
Detaliile complete ale întregului personal trebuie păstrate timp de
zece ani.
Echipament. Acesta trebuie să fie la un standard adecvat și trebuie să se
păstreze o evidență completă a tuturor lucrărilor de întreținere și a
defecțiunilor timp de zece ani.
Proceduri. Toate metodele și procedurile trebuie să fie sub forma unui
PSO. Date. După finalizarea analizei, toate detaliile metodei, ale
echipamentului, ale PSO și ale rezultatelor brute trebuie să fie stocate
timp de zece ani.
ani.
1.2.5 Eșantioane pentru analize

Valabilitatea unui raport de laborator este afectată de alți factori, precum și de
cei legați de metoda analitică utilizată. De o importanță deosebită este
eșantionul în sine și modul în care acesta este colectat și depozitat înainte de
analiză.
Procedura de colectare ar trebui să fie concepută astfel încât să furnizeze
un eșantion reprezentativ al sistemului investigat și să nu afecteze negativ
procesul analitic. Condițiile corecte de depozitare a probei sunt vitale pentru a
păstra integritatea componentelor biologice (tabelul 1.6); în unele situații, se
asigură că morfologia celulară nu este afectată în mod semnificativ. Condițiile
optime de depozitare depind atât de natura probei, cât și de cea a analizei.
Mediul chimic și cel fizic sunt ambele importante, iar studiile de stabilitate pot
indica necesitatea adăugării de substanțe chimice, cum ar fi agenți
antimicrobieni, agenți anti coagulanți etc., precum și stocarea la o anumită
temperatură pentru o anumită perioadă de timp. Aceste condiții ar trebui să fie
menționate în mod clar în protocolul de laborator.
Pe lângă aceste considerente, raportul care este emis este, de asemenea,
afectat de procedurile care urmează analizei efective (post-analitice), inclusiv
calculele și transcrierile. Utilizarea computerelor, în special în asociere cu
containerele cu coduri de bare pentru probe, a îmbunătățit procedurile de
asigurare a identității corecte a probelor, de întocmire a listelor de lucru și de
prezentare a rezultatelor. Instrucțiunile referitoare la toate aspectele non-
analitice trebuie să fie specificate în PSO asociate metodei analitice.
Tabelul 1.6 Exemple de condiții de depozitare a probelor biologice
Posibilă modificare a eșantionului Exemple de metode de prevenire
Degradarea microbiană Adăugarea unui agent antimicrobian,

de exemplu, azidă de sodiu
A se păstra la temperaturi sub - 20°C
Denaturarea enzimelor A se păstra în glicerol 50% la temperaturi
scăzute A se păstra în azot lichid
Scurgerea componentelor intracelulareSeparați imediat celulele
A se păstra în mediu
izotonic De obicei, nu se
congelează.
Oxidare Adăugați un antioxidant, de exemplu 2-
mercaptoetanol, ditiotreitol.
Depozitați în întuneric
A se depozita sub azot sau hidrogen
Conversia enzimatică a A se adăuga un inhibitor enzimatic,
de exemplu fluorură A se depozita la
analitului Coagulare temperaturi sub -20°C A se adăuga
anticoagulant, de exemplu heparină,
Pierdere gazoasă acid etilendiamină tetraacetic (EDTA) A se
păstra sub ulei, de exemplu parafină lichidă.
Secțiunea 1.2
I. Analizele repetate ale unui eșantion au furnizat următoarele
informații. Valoarea medie 1,75 mg Abaterea standard 0,01
mg
Care dintre următoarele caracteristici ale metodelor analitice ar fi
cele mai relevante pentru aceste informații?
(a) Precizie.
(b) Precizie.
(c) Sensibilitate.
(d) Specificitate.
2. În cadrul unui program de asigurare a calității, controlul cu o valoare
medie de
10,5 mg și o abatere standard de 0,1 mg a fost analizată cu un lot de
probe de testare și a dat un rezultat de 10,0 mg. Care dintre următoarele
măsuri ar trebui luate?
(a) Respingeți toate rezultatele testelor.
(b) Acceptați toate rezultatele testelor.
(c) Reanalizați din nou controlul.
(d) Reanalizați din nou probele de testare.
3. Imprecizia unei metode poate fi evaluată prin determinarea
deviației standard a analizelor repetate.
PENTRU CĂ
precizia scade pe măsură ce crește eroarea aleatorie.
4. În cazul în care o probă de control dintr-un program de control al
calității dă o valoare care este mai mare decât valoarea medie a tuturor
probelor de control cu mai mult de 2 DS, aceasta sugerează că au fost
introduse erori în analiză DIN CAUZA CĂ
într-o distribuție normală a rezultatelor repetate, nu mai mult de
aproximativ 2,5% din valori ar trebui să depășească valoarea medie cu mai
mult de 2 DS.
Fiecare analiză este efectuată cu un motiv anume, iar rezultatele analizei ar

trebui să fie prezentate într-un mod lipsit de ambiguitate pentru a permite
formularea unor concluzii valide. Există anumite aspecte ale raportării
rezultatelor analitice care ar trebui luate în considerare.
1.3.1 Alegerea unităților

Utilizarea confuză și inconsecventă a unităților de măsură prezintă adesea
probleme, iar în 1960 a fost introdus Systeme International d'Unites (unități
SI). Acesta urmărea să producă un sistem universal de unități de măsură în
care se folosea o singură unitate pentru orice mărime fizică. De asemenea,
acesta asigură coerența între măsurătorile corespunzătoare și reduce la
minimum numărul de multipli și submultipli utilizați.
Tabelul 1.7 Unități de bază SI
Cantitatea fizică Unitatea de bază SI Simbol
Lungime Metru m
Masa Kilogram kg
Timp Al doilea s
Curent electric Amperi A
Temperatura termodinamică Kelvin K
Intensitatea luminoasă Candela cd
Cantitatea de substanță Alunița mol
Sistemul definește șapte unități de bază (tabelul 1.7), care sunt

independente una de cealaltă, dar care pot fi combinate în diverse moduri
pentru a oferi o serie de unități derivate (tabelul 1.8), fiecare dintre ele fiind
capabilă să descrie o cantitate fizică. Coerența este menținută în aceste unități
derivate, deoarece în acest stadiu nu sunt implicați factori de conversie, dar
pentru a furniza unități de dimensiuni convenabile pentru diferite aplicații, se
poate utiliza o serie de prefixe standard. Aceștia sunt multiplicatori utilizați cu
unități coerente pentru a obține unități de dimensiuni alternative, dar trebuie
utilizat doar un singur prefix la un moment dat (tabelul 1.9).
Tabelul 1.8 Unități derivate
Cantitatea fizică Unitate derivată Simbol Nume
Zona Metru pătrat m2

Volum Metru cubic m3
Viteză Metru pe secundă m s-1
Forța Kilogram pe metru cub kgm-3
de Kilogram metru pe secundă kg m s-2 Newton
densitat
e
pe secundă
Nm-2 Pascal
Substanță sub Newton pe metru pătrat
presiune Mol pe metru cub mol m-3
concentrație
Tabelul 1.9 Multiplii și submultiplii de unități
Factor Prefix Factor Prefix

Nume Simbol Nume Simbol
101 deca- da 10-1 deci- d

102 hecto- h 10-2 centi- C
103 k
kilo- 10-3 mili- m
106 mega- M 10-6 micro- µ,
109 giga- G 10-9 nano- n
1012 tera- T 10-12 pico- p
10-15 femto- f
10-18 atto- a
Anumite dificultăți apar atunci când se încearcă să se utilizeze numai

unități derivate coerente. În cazul măsurării masei, pentru care denumirea
unității de bază este kilogramul, este inacceptabilă utilizarea unor prefixuri
standard suplimentare, de exemplu mililogramul etc. Prin urmare, se acceptă
că, pentru a preveni confuzia, toți multiplii de masă ar trebui să fie citați în
termeni de gram și nu de kilogram, păstrând în același timp kilogramul ca
unitate de bază pentru masă. O problemă similară apare la măsurarea
volumului. În acest caz, unitatea de măsură a volumului este metrul cub (m3 ),
care este derivat din unitatea de bază pentru lungime, metrul. Litrul, utilizat
mai frecvent, este un volum mai convenabil și este egal cu decimetrul cubic
(dm3 ), care, deși este o unitate derivată acceptabilă, nu este coerentă din cauza
utilizării prefixului "deci". Din motive de comoditate, se acceptă termenul
litru și simbolul său (l), dar trebuie remarcat faptul că, indiferent de denumirea
și simbolul utilizate, este importantă coerența în utilizarea lor.
1.3.2 Calibrare
Pentru majoritatea metodelor cantitative, calibrarea implică analiza soluțiilor
care conțin o gamă de concentrații cunoscute (soluții standard) ale analitului
specificat în paralel cu probele de testare, determinarea relației dintre valoarea
citită și concentrația analitului standard și, pe baza acestei relații, calcularea
cantității de analit din probele de testare.
În majoritatea metodelor manuale de analiză, această relație este cel mai
ușor de exprimat sub forma unui grafic de calibrare, deși în multe sisteme
automate de analiză, ecuația relației este determinată de instrucțiuni. O etapă
foarte comună și importantă în determinarea acestei relații este pregătirea
unei serii de soluții standard.
Soluții standard
Punctul de plecare esențial în stabilirea unei analize cantitative este
capacitatea de a utiliza o probă cu o concentrație cunoscută a analitului. În
multe cazuri, acest lucru nu este foarte dificil, deoarece substanța poate fi
obținută într-o formă solidă pură și se poate prepara o soluție standard inițială
sau stoc prin cântărirea unei cantități cunoscute de substanță și dizolvarea
acesteia într-un volum fix.
de solvent. Cu toate acestea, în unele cazuri, un eșantion pur, solid al

analitului nu este disponibil ca standard primar și este necesar să se utilizeze
standarde secundare. Aceștia au fost analizați în prealabil cu ajutorul unei
metode recunoscute și li s-a atribuit o valoare. Acest tip de standard este
frecvent disponibil în comerț. Din stocul standard de ambele tipuri, se prepară
și se analizează o serie de diluții.
Există o varietate de moduri de a pregăti un set de diluții, dar cele două
cele mai frecvent utilizate sunt diluțiile procentuale și diluțiile în serie.
Diluții în serie
Inițial, trebuie să se ia o decizie cu privire la volumul de standard care va fi
necesar, de exemplu 5 ml. Se pipetează un volum de diluant egal cu volumul
selectat, adică 5,0 ml, în numărul necesar de tuburi și se adaugă un volum
egal de standard stoc în primul tub. Conținutul se amestecă și același volum,
adică 5,0 ml, se îndepărtează și se adaugă în al doilea tub, se amestecă și
același volum se îndepărtează și se adaugă în al treilea tub și așa mai departe.
Se obține astfel o serie de diluții, concentrația de analit din fiecare dintre
acestea fiind jumătate din cea din tubul precedent. De obicei, acestea sunt
descrise ca fiind 1 la (într-un total de) 2, 1 la 4, 1 la 8, 1 la 16 etc.
Această metodă prezintă mai multe dezavantaje, cel mai important fiind
intervalul tot mai mare dintre fiecare diluție succesivă, ceea ce face dificilă
determinarea unei relații exacte în intervalul de diluție tot mai mare. În plus,
unitățile de concentrație sunt mai greu de calculat. Dacă, de exemplu, soluția
stoc conținea 5,0 mg 1-1 , atunci diluția 1 la 16 ar conține 5,0/16 = 0,3125
mg1-1 . Cu toate acestea, tehnica este utilă în cazul în care este necesar să se
acopere o gamă largă de concentrații, eventual ca o etapă premergătoare
elaborării unei metode pentru utilizare de rutină.
Diluții procentuale
Ca și înainte, trebuie luată o decizie cu privire la volumul de standard necesar
pentru analiză. Se alege un volum convenabil pentru diluții, în mod ideal unul
pentru care se pot măsura cu ușurință intervale de 10%, de exemplu 1,0 ml,
5,0 ml, 10,0 ml, mai degrabă decât volume precum 3,0 ml. După ce s-a ales
un volum de lucru, se adaugă standardul stoc într-o serie de tuburi în volume
care cresc cu 10% din volumul ales. Dacă, de exemplu, volumul selectat este
de 5,0 ml, 10% din acest volum de soluție stoc se adaugă în primul tub, adică
0,5 ml, 20% în al doilea tub, adică 1,0 ml, 1,5 ml se adaugă în al treilea tub și
așa mai departe. Se adaugă apoi un diluant adecvat în fiecare tub pentru a
aduce volumul total la volumul selectat. Pentru primul tub din exemplu, se
adaugă 4,5 ml de diluant,
4,0 ml în al doilea tub și 3,5 ml în al treilea tub. Concentrația fiecărei diluții
este calculată din concentrația inițială a standardului stoc și din concentrația
gradul de diluție, de exemplu, o concentrație de 30% dintr-o soluție standard
de 5,0 ml 1-1 are o concentrație de 5,0 X 30/100 = 1,5 mg1-1.
Metoda poate fi utilizată așa cum este descrisă, oferind o gamă de
standarde la intervale de 10% sau, alternativ, se pot utiliza intervale de 20%,
oferind o gamă de cinci diluții. Aceasta este cea mai convenabilă metodă și
oferă o gamă regulată de standarde de lucru, valoarea fiecăruia fiind ușor de
calculat. Procedura l. 10 prezintă această metodă în practică, folosind
intervale de 20%.
1.3.3 Prezentarea grafică a datelor

Graficele produse în scopuri analitice cantitative trebuie să fie datate și să
includă informații adecvate privind metoda de analiză, de exemplu numărul de
serie al PSO, analitul și unitățile de măsură. Scara fiecărei axe trebuie să fie
aleasă cu atenție și nu trebuie să umple pur și simplu spațiul disponibil.
O dificultate majoră în desenarea graficelor constă în natura relației
dintre cele două variabile și este esențial un minim de cinci puncte pentru a
putea trasa cu încredere o anumită linie sau curbă. La întocmirea unui grafic
de calibrare, soluțiile etalon sau calibrator sunt de obicei analizate fie în dublu
exemplar, fie într-un număr limitat de replici, iar valoarea medie este utilizată
la întocmirea curbei. Deoarece este puțin probabil ca valoarea medie dintr-un
număr limitat de replici să fie adevărata medie, ar putea fi de ajutor la
întocmirea graficului dacă se trasează media și se trasează o bară pentru a
indica cea mai mare și cea mai mică valoare obținută în replici.
În multe cazuri, se știe că ar trebui să existe o relație liniară între două
seturi de date, dar lipsa de precizie face dificilă trasarea unei linii drepte prin
punctele de pe grafic. În astfel de situații, este recomandabil să se calculeze
ecuația liniei drepte care se potrivește cel mai bine cu datele, folosind analiza
regresiei liniare. Această tehnică poate fi utilizată pentru a obține ecuația care
descrie relația dintre citirea observată și concentrația probei. Ecuația este utilă
nu numai pentru a ajuta la desenarea unui grafic, ci este esențială pentru
configurarea unui program de calculator pentru calcularea rezultatelor testelor
dintr-un set de valori de calibrare.
Datele care dau naștere mai degrabă la curbe decât la linii drepte
prezintă anumite probleme nu numai în prezentarea lor grafică, ci și în orice
analiză statistică. O examinare atentă a principiului metodei poate dezvălui
faptul că variabila măsurată nu este cea fundamentală implicată, iar
prezentarea datelor într-o formă alternativă poate da o relație liniară. În cazul
metodelor care implică difuzia radială, de exemplu, o reprezentare grafică a
distanței în funcție de concentrație are adesea ca rezultat o curbă, în timp ce o
reprezentare grafică a suprafeței (sau a distanței la pătrat) ar trebui să dea o
linie dreaptă. Utilizarea valorilor reciproce ale unuia sau ale ambelor seturi de
date poate avea ca rezultat un grafic cu linie dreaptă, ca în cazul graficului
Lineweaver-Burk pentru constantele enzimatice. Multe măsurători prezintă
nave de relații logaritmice liniare, ca de exemplu în determinarea masei
moleculare relative prin cromatografie de permeabilitate pe gel, în timp ce
unele mai complexe pot fi liniarizate prin utilizarea logaritmilor:
logit x = loge _x_
1-x
Deoarece multe dintre aceste relații sunt doar aproximativ liniare, este adesea
de dorit să se determine linia mai degrabă statistic decât vizual.
1.3.4 Raport de laborator

Raportul oricărei măsurători trebuie să includă întotdeauna suficiente
informații pentru a evita neînțelegerile și trebuie să conțină detalii specifice
despre eșantion, așa cum se indică în tabelul 1.10. În raportarea preciziei
datelor, o valoare pentru abaterea standard implică faptul că rezultatul este
media analizelor repetate de
eșantionul. Utilizarea coeficientului de variație evită această problemă și este

probabil mai semnificativă ca o indicație generală a calității datelor.
Tabelul 1.10 Raportul de laborator
Tipul de informații Exemple
Sistem sau Sânge Făină de grâu

eșantion integral Zaharuri reducătoare
Componentă Glucoză Reducerea cuprului
Metoda utilizată Enzimatică (Benedict)
(glucoză-oxidază) g 1-1
mmo11-1
Unități de măsură 4.5
Valoare numerică 3.50 0.5
Precizie: (s) 0.10 10%
(V) 2%
Se poate argumenta că, în practică, o mare parte din informații sunt

evidente și nu este necesar să fie specificate. Este important să ne amintim că
și aceste date de rutină pot fi solicitate la o dată viitoare pentru referință, iar
lipsa acestor informații ar putea fi critică.
Secțiunea 1.3
1. Care dintre următoarele sunt unități SI acceptabile?
(a) Gram la 100 ml (g/100 ml).
(b) Mole pe secundă (mol s-1).
(c) Kilogram pe litru (kgl-1).
(d) Micromole pe minut (µmol min-1 ).
2. Care dintre următoarele este termenul corect pentru
milionimea de kilogram?
(a) Nanokilogramă.
(b) Micrograme.
(c) Miligram.
(d) Megagramă.
Miller, J.N. (1990) Statistics for analytical chemistry, ediția a 3-a, Horwood (Ellis),
UK.
Carson, P.A. și Dent, N. (eds) (1994) Bune practici de laborator și clinice: Techniques
for the quality assurance professional, Butterworth-Heinemann, Canada.
Campbell, R.C. (1989) Statistics for biologists, ediția a 3-a, Cambridge University
Press, Marea Britanie.
Callender, J.T. și Jackson, R. (1995) Exploring probability and statistics with spread
sheets, Prentice-Hall, UK.
Lecturi suplimentare 35
Young, J.A. (ed.) (1991) Improving safety in the chemical laboratory, ediția a 2-a, John
Wiley, UK.
Pritchard, E. (1995) Quality in the analytical chemistry laboratory, John Wiley, UK.
Gunzler, H. (ed.) (1996) Accreditare și asigurarea calității în chimia analitică,
Springer-Verlag, Marea Britanie.
2 Spectroscopie
• Interacțiunea radiațiilor cu materia

• Absorbometrie moleculară
• Proiectarea absorbțiometrului
• Tehnici de fluorescență moleculară
• Tehnici de spectroscopie atomică
• Spectroscopia de rezonanță magnetică
Spectroscopia este studiul absorbției și emisiei de radiații de către materie.

Cel mai ușor de apreciat aspect al absorbției radiațiilor este culoarea pe care o
prezintă substanțele care absorb radiații din regiunea vizibilă a spectrului.
Dacă se absorb radiații din regiunea roșie a spectrului, radiația transmisă sau
neabsorbită va fi din regiunea albastră, iar substanța va avea o culoare
albastră. În mod similar, substanțele care emit radiații prezintă o anumită
culoare dacă radiația se află în regiunea vizibilă a spectrului. Lămpile cu
sodiu, de exemplu, își datorează lumina galben-portocalie caracteristică
emisiei specifice a atomilor de sodiu la o lungime de undă de 589 nm.
Măsurarea intensității și a lungimii de undă a radiației absorbite sau
emise constituie baza unor metode sensibile de detectare și cuantificare.
Spectroscopia de absorbție este utilizată cel mai frecvent pentru cuantificarea
moleculelor, dar este, de asemenea, o tehnică importantă pentru cuantificarea
unor atomi. Spectroscopia de emisie cuprinde mai multe tehnici care implică
emisia de radiații fie de către atomi, fie de către molecule, dar variază în ceea
ce privește modul în care este indusă emisia. Fotometria reprezintă măsurarea
intensității radiației și este probabil cea mai frecvent utilizată tehnică în
biochimie. Pentru a utiliza corect instrumentele fotometrice și pentru a putea
dezvolta și modifica tehnicile spectroscopice, este necesar să se înțeleagă
principiile de interacțiune a radiației cu materia.
Radiația este o formă de energie și prezintă atât caracteristici electrice, cât și

magnetice, de unde și denumirea de radiație electromagnetică (figura 2.1). Ea
poate fi considerată ca fiind compusă dintr-un flux de grupuri separate de unde
electromagnetice, iar energia asociată cu radiația poate fi legată matematic de
forma de undă.
Lungime de undă
Figura 2.1 Radiația electromagnetică. O reprezentare a radiației electromagnetice cu

câmpul electric (E) și câmpul magnetic (M) în unghiuri drepte față de direcția de
mișcare a undei. Ambele câmpuri oscilează la aceeași frecvență.
Forma de undă poate fi definită în cel puțin două moduri diferite care
sunt relevante pentru măsurătorile spectroscopice. Lungimea de undă (X.) este
definită ca distanța dintre vârfurile succesive (figura 2.1) și se măsoară în
subunități de metru, dintre care cea mai frecvent utilizată este nanometrul (l 0-
9
m). Unitatea de angstrom (A) nu este acceptabilă în terminologia SI, dar este
totuși ocazional întâlnită și este de 10-10 m (adică 10 A = I nm). Frecvența
radiației (nu, v) se definește ca fiind numărul de vârfuri succesive care trec
printr-un punct dat în I secundă. Prin urmare, relația dintre aceste două unități
de măsură este:
I
V rx -
.,\
Regiunea vizibilă a spectrului se întinde aproximativ pe un interval de
lungime de undă de 4 700 nm, lungimile de undă mai scurte fiind extremitatea
albastră a spectrului, iar lungimile de undă mai lungi fiind extremitatea roșie.
Lungimile de undă cuprinse între 400 și 200 nm alcătuiesc regiunea ultravioletă
apropiată a spectrului, iar lungimile de undă de peste 700 nm până la aproximativ
2000 nm (2JLm) constituie regiunea infraroșie apropiată.
Energia asociată cu o anumită formă de undă este direct legată de
frecvența radiației și, prin urmare, invers legată de lungimea de undă. Ea
poate fi calculată cu ajutorul ecuației:
el
E=hv=-
A
unde h = constanta lui Planck (6,626 X 10-34 Js)
v = frecvența radiației
X. = lungimea de undă a radiației
c = viteza luminii(3.0 X 108ms-1 )
38 Spectroscopie
În timp ce energia asociată cu o formă de undă este legată de lungimea de

undă, intensitatea acestei radiații este legată de amplitudinea sa (figura 2.1).
Absorbția sau emisia de radiații de către materie implică un schimb de
energie și, pentru a înțelege principiile acestui schimb, este necesar să se
aprecieze distribuția energiei în interiorul unui atom sau al unei molecule.
Energia internă a unei molecule se datorează a cel puțin trei surse de
contribuție:
1. Energia asociată cu electronii.
2. Energia asociată cu vibrațiile dintre atomi.
3. Energia asociată cu rotația diferitelor grupuri de atomi din moleculă în
raport cu celelalte grupuri.
Aceste niveluri de energie pot fi modificate prin absorbția sau emisia de
energie sub formă de radiație și, deoarece orice atom sau moleculă poate
exista doar într-un număr limitat de niveluri de energie, aceste schimbări de
energie trebuie să fie în pachete definite sau cuante. Cantitatea exactă de
energie necesară pentru a produce o schimbare în moleculă de la un nivel
energetic la altul va fi dată de fotonii de o anumită frecvență care vor fi
absorbiți sau emiși în mod selectiv.
Un studiu al lungimii de undă sau al frecvenței radiației absorbite sau
emise de un atom sau de o moleculă va oferi informații despre identitatea
acesteia, iar această tehnică este cunoscută sub numele de spectroscopie
calitativă. Aceste informații sunt de obicei raportate ca lungime de undă a
radiației implicate și sunt cel mai ușor de reprezentat ca un spectru de
absorbție sau de emisie (figura 2.2). Măsurarea cantității totale de radiație va
oferi informații despre numărul de atomi sau molecule care absorb sau emit și
se numește spectroscopie cantitativă.
Absorbance 0.4.--...----.---.---.--
0.3
0.2
220 240 280 300

Lungime de undă (nm)
Figura 2.2 Spectrul de absorbție al adenozindifosfatului (ADP).
2.1.1 Absorbția de radiații

Creșterea de energie într-o moleculă care apare atunci când radiația este
absorbită poate fi adaptată în cele trei moduri deja descrise. Gama de energii
implicate este caracteristică fiecărui tip de modificare și este asociată cu o
regiune bine definită a spectrului electromagnetic (figura 2.3).
9:;
Raze X
Infraroșu
Undele radio
Figura 2.3 Gama de radiații electromagnetice. Toate radiațiile electromagnetice

circulă cu o viteză constantă de 3 X 108 ms- 1, dar energia asociată fiecărei forme de
undă este invers proporțională cu lungimea de undă. Energia necesară pentru diferite
tranziții atomice și moleculare este furnizată de radiații cu lungimi de undă diferite.
Absorbție atomică
Atomii individuali nu se pot roti sau vibra în același mod ca și moleculele și, prin
urmare, absorbția de energie este asociată doar cu tranziții electronice care sunt
limitate ca număr și asociate cu intervale foarte înguste de radiații sau linii de
absorbție. Lungimea de undă care este cel mai puternic absorbită corespunde, de
obicei, unei tranziții electronice de la starea fundamentală la cea mai joasă stare
excitată și este cunoscută sub numele de linie de rezonanță. Numărul limitat de
tranziții electronice pentru orice atom are ca rezultat faptul că atomii excitați,
atunci când revin la starea fundamentală, emit radiații cu aceeași lungime de undă
cu cea absorbită.
Absorbția moleculară - regiunea ultravioletă și vizibilă

Acesta este domeniul de cel mai mare interes pentru biochimia cantitativă și
depinde de structura electronică a compușilor de carbon. Absorbția radiației
în această regiune a spectrului determină tranziții ale electronilor de la
orbitalii de legătură moleculară la orbitalii moleculari de antilegătură cu
energie mai mare.
Structura electronică a atomului de carbon este desemnată ca ls2 , 2s2 ,
2p , 2p (figura 2.4) și aceasta înseamnă că pentru a umple toți orbitalii
disponibili
40 Spectroscopie
z
z
orbital p
Figura 2.4 Orbitalii atomici. Un orbital s este sferic și nu poate exista decât într-o
singură orientare, dar orbitalul p este direcțional și poate exista în oricare dintre cele
trei planuri (x, y și z), toate având același statut energetic. Toți orbitalii pot găzdui doi
electroni, cu condiția ca aceștia să fie de spin opus. Numărul de electroni dintr-un
anumit orbital este indicat ca un superscript la litera orbitalului, de exemplu 1s2 .
ar mai fi necesari încă patru electroni, câte unul în fiecare dintre orbitalii 2xp și
2py.
cu două în orbitalul 2pz neocupat. Aceste patru locuri vacante pentru electroni
nu sunt toate echivalente în energie sau în direcție și totuși cele patru valențe
ale atomului de car bon, așa cum se evidențiază în compușii organici, sunt
echivalente și simetrice (figura 2.5(a)). Această simetrie se datorează
combinării orbitalilor cu același nivel energetic de bază, adică 2s și 2p, pentru
a da orbitali hibrizi sp.
I
H
'-
H
sp3
(a) (b)
sp2
H
p
sp
Figura 2.5
Orbitalii atomici hibrizi ai p
carbonului. (c) (d)
Sunt posibile trei combinații diferite, în funcție de numărul de orbitali

implicați în hibridizare. Cei patru electroni externi existenți ai atomului de
carbon (doi în orbitalul 2s și câte unul în fiecare dintre orbitalii 2px și 2py)
sunt inițial dispersați, câte unul în fiecare dintre orbitalii disponibili (2s, 2px,
2py și 2p'-) și hibridizarea ulterioară a acestor patru orbitali dă naștere

orbitalului hibrid sp3 (adică un s și trei p) care are patru lobi simetrici (figura
2.5(b)). Combinațiile care includ doar doi dintre orbitalii p cu orbitalul s dau
naștere unui orbital hibrid sp2 , care are trei lobi simetrici și un orbital 2p
rezidual (figura 2.5(c)), în timp ce o combinație de one și un orbital p dă
naștere unui hibrid sp (figura 2.5(d)).
Atomii sunt legați pentru a forma o moleculă prin legături covalente,
care sunt rezultatul împărțirii electronilor din doi orbitali, câte unul de la
fiecare atom, umplând astfel efectiv ambii orbitali cu numărul maxim de doi
electroni. Formarea unei legături covalente între doi atomi de carbon care se
află în forma hibridă sp3 are ca rezultat o legătură simetrică (sigma, <T), care este
cunoscută și sub numele de legătură simplă sau saturată [figura 2.6(a)]. Cu
toate acestea, dacă cei doi atomi de carbon se află în forma hibridă sp2 , atunci
nu numai că se formează o legătură similară legăturii sigma între cei doi lobi
ai orbitalilor sp2 , dar orbitalii p reziduali se combină pentru a produce ceea ce
se numește o legătură pi ('rr) (figura 2.6(b)). Această legătură nu este simetrică
față de legătura sigma principală, ci este formată printr-o suprapunere laterală
a celor doi orbitali p, ceea ce face ca electronii legăturii pi să fie deplasați
deasupra și dedesubtul planului celor doi atomi de carbon. Aceștia sunt
cunoscuți sub denumirea de electroni delocalizați, iar legătura globală este
cunoscută sub denumirea de legătură dublă sau nesaturată.
I
/
'\
\ I
\ I
H H H H
\ I \ I
H-C- c-H C- C
Figura 2.6 Lipirea în
I \ I \H
H H H
compuși de carbon. (a) Legătura Sigma (b) Legătura Pi
obligație. În cazul în care se formează un sistem alternativ de legături sigma

și pi (un sistem conjugat), electronii delocalizați se combină pentru a forma
doi orbitali moleculari, unul deasupra și unul dedesubt pe întreaga lungime a
secvenței de legături (sau a inelului în cazul compușilor ciclici).
După cum s-a arătat mai devreme, toți electronii sunt capabili să existe
într-unul din mai multe niveluri de energie, iar trecerea de la un nivel la altul
implică un schimb de energie. Ușurința cu care un electron poate fi ridicat la
nivelul energetic imediat superior este legată de cantitatea de energie necesară
pentru o astfel de schimbare și, în cazul în care energia este furnizată prin radiație,
este legată de lungimea de undă a radiației. Modificările electronice pot fi
enumerate în ordinea creșterii ușurinței cu care poate avea loc tranziția, iar
aceasta este paralelă cu creșterea lungimii de undă care determină tranziția.
42 Spectroscopie
Tabelul 2.1 Maximele de absorbție ale hidrocarburilor
Compus Structura Tipul de tranziție Maximul de

absorbție (nm)
Etan C-C (T-4(T* < 180

Etilenă C=C 7T-47T* 190
Benzen Ciclic 1r-o>1r* ciclică 256
Naftalină Ciclică 7r-,,7r* 290
Antracen 1r-,,1r* ciclică 360
Moleculele care prezintă grade crescânde de conjugare necesită mai

puțină energie pentru excitare și, ca urmare, absorb radiații cu lungimi de
undă mai mari (tabelul 2.1). În plus, introducerea de grupe saturate (metil,
hidroxil etc.) într-un compus care absoarbe deja radiații poate duce la o
creștere a lungimii de undă a radiațiilor absorbite. Efectul conjuncției este
demonstrat cel mai dramatic de anumiți coloranți care, în formele reduse, sunt
incolori, dar care, în formele oxidate, prezintă o culoare caracteristică.
Caracteristicile de absorbție ale formei reduse a roșului de metil (figura 2.7)
se datorează a două sisteme conjugate separate care absorb radiația în
regiunea ultravioletă a spectrului și, prin urmare, nu sunt vizibile. Efectul
oxidării este acela de a uni cele două sisteme într-un mod care mărește gradul
de conjugare și deplasează lungimea de undă a radiației absorbite în regiunea
vizibilă a spectrului, dând o culoare compusului.
Fond redus - incolor
Figura 2.7
Efectele conjugării crescute
în colorant
roșu de metil. Fono oxidat - roșu
Vârfurile de absorbție găsite în spectroscopia ultravioletă și vizibilă

sunt mult mai largi decât cele găsite în spectroscopia în infraroșu. Acest lucru
se datorează efectelor suplimentare ale tranzițiilor vibraționale și rotaționale
care se suprapun peste tranziția electronică de bază (figura 2.8). Moleculele
existente într-o stare fundamentală electronică pot fi la niveluri energetice
vibraționale și rotaționale diferite și, ca urmare, vor necesita cantități totale
diferite de energie pentru a suferi o tranziție electronică. În mod similar,
molecula excitată finală poate exista la diferite niveluri energetice de vibrație
și rotație. Efectul general este acela că este absorbită o gamă de lungimi de
undă, iar spectrul indică
vârf larg caracteristic, care este util în studiile cantitative, dar nu la fel de util în
lucrările calitative.
V1'brat1' 0na Rotfa10na

nivelur nivelu
i de -- ri de
energi energi
e
"1/, Electronic Alternativă
I
e
1/, tranziție electronică
1/, E
'/
tranziții - Ealt -
I
Vibrațional Rotație
niveluri de
1/, - niveluri de
energie - -- energie
Absorbanța
Modificări
energetice
mai mică
mai mare... ---------
--------- Lungimea de undă
Figura 2.8 Gama de niveluri energetice asociate tranzițiilor electronice.

Nu toate moleculele dintr-un eșantion prezintă aceeași schimbare de energie (E) pentru
o anumită tranziție electronică, deoarece, deși toate moleculele se află la același nivel
de energie electronică, ele pot avea energii de rotație și vibrație diferite. Prin urmare,
acestea vor avea nevoie de cantități diferite de energie (£311 ) pentru a fi ridicate la nivelul
energetic electronic următor. Fiecare cantitate diferită de energie va fi furnizată de o
lungime de undă diferită a radiației, rezultând vârful de absorbție caracteristic.
Absorbția moleculară - regiunea infraroșu

Nu toți compușii organici absorb radiații în regiunile ultraviolete și vizibile
ale spectrului, dar aceștia prezintă absorbția radiațiilor infraroșii din cauza
modificărilor vibraționale. Tranzițiile vibraționale în cadrul unei molecule pot
fi realizate cu niveluri de energie asociate cu regiunea infraroșu apropiat a
spectrului, în timp ce modificările rotaționale ale energiei moleculare sunt
asociate cu regiunile infraroșu îndepărtat și microunde (figura 2.3).
Gama de lungimi de undă a radiației infraroșii se situează între 700 nm
și 1 X 106nm (1 mm), dar din cauza valorilor numerice mari implicate în ct.
44 Spectroscopie
în funcție de lungimea de undă, pozițiile benzilor de absorbție sunt, de obicei,

citate sub forma valorii undelor, care este reciproca lungimii de undă în
centimetri:
1 1 X 107
Numărul de undă ( c m - I) =
lungime de undă (cm) Lungimea de
undă (nm)
Cele două tipuri principale de vibrații moleculare asociate cu absorbția

radiației infraroșii implică întinderea și îndoirea legăturilor. Întinderea este o
mișcare de vibrație în care lungimea legăturii se modifică, iar cele două nuclee
se deplasează armonios unul față de celălalt. Pentru un compus care implică
doi atomi, există o singură legătură care poate fi întinsă și, în termeni generali,
se poate spune că pentru un compus care conține n atomi există (n - 1) efecte
de întindere posibile. Vibrațiile de încovoiere prezintă mult mai multe variații
posibile, numărul total fiind definit ca (2n - 4) pentru moleculele liniare și (2n
- 5) pentru moleculele neliniare.
Deși pentru orice moleculă este posibil un număr mare de modificări de
vibrație, nu toate vor avea ca rezultat absorbția de radiații. Un maxim de
absorbție în spectrul infraroșu al unui compus poate fi demonstrat doar atunci
când o vibrație are ca rezultat o modificare a dipolului moleculei, proces
pentru care este necesară energie. Dioxidul de carbon, de exemplu, are o
structură lin ear și poate suferi două vibrații de întindere (n -1) și două vibrații
de îndoire (2n - 4) (tabelul 2.2) (tabelul 2.2). O examinare a celor patru
modificări vibraționale posibile va arăta că un singur efect de întindere nu
duce la o schimbare în distribuția relativă a sarcinii asociate moleculei (dipol)
și, ca urmare, nu va prezenta un maxim de absorbție. Celelalte trei modificări
de vibrație au ca rezultat o modificare a distribuției globale a sarcinii și dau
maxime de absorbție în infraroșu. Cu toate acestea, cele două vibrații de
încovoiere sunt identice ca nivel energetic, deși se află într-un plan diferit, și,
prin urmare, prezintă același maxim de absorbție.
Tabelul 2.2 Vibrațiile fundamentale ale dioxidului de carbon
Structura Vibrații Absorbție maximă

(cm-1)
0-C--0 Nici unul Structură normală
o-c Întindere Nici unul
0..C-0 Întindere 2349
C Îndoire 667
o/ "'-o (plan orizontal)
Curbare 667
o-c--o (plan vertical)
Spectrele în infraroșu prezintă nu numai benzi de absorbție datorate vibrațiilor

fundamentale, ci și benzi suplimentare, de obicei mai slabe, datorate
multiplelor vibrațiilor fundamentale.
►
frecvențe mentale (supratonuri) și la combinarea efectelor vibraționale

fundamentale și a multiplelor acestora (benzi de combinație). Interpretarea
acestor spectre este complicată și mai mult de faptul că spectrul unei anumite
substanțe poate varia în funcție de solventul utilizat sau de metoda de
preparare a probei. Absorbția în infraroșu implică un număr mare de tranziții
destul de diferite, atât de vibrație, cât și de rotație, ceea ce duce la un spectru
compus dintr-un număr mare de vârfuri separate și înguste și este mai util în
analiza calitativă decât în cea cantitativă.
2.1.2 Emisia de radiații

Se spune că un atom sau o moleculă se află într-o stare excitată sau instabilă
atunci când absoarbe energie care are ca rezultat fie tranziții electronice, fie
tranziții vibraționale. Acesta va reveni la starea de bază foarte rapid, iar
energia poate fi pierdută în trei moduri:
1. Ca urmare a unei reacții chimice.
2. Prin disipare sub formă de căldură.
3. Prin emisie ca radiație.
Dacă atomul sau molecula pierde toată sau o parte din această energie
sub formă de radiație, vor fi emise fotone de energie care corespund diferenței
dintre nivelurile de energie implicate. Deoarece aceste niveluri sunt clar
definite pentru orice atom sau moleculă dată, radiația emisă va avea frecvențe
specifice și va apărea ca linii luminoase dacă lumina emisă este dispersată ca
un spectru.
Absorbanța Emisii
,(%)
1.5
{'
I II
I II
I I
II
I I
I I
I I
1.0 II 40
I II
IRL , I' I'

/I I I
I II I I
II I I
I II I \ /-\
I I/ I /
0.5
I
II V ,..,
\I
I1
1
I
20
I I
I
Absorbție Emisii \
,_,,,,
\
Figura 2.9
Spectrele de absorbție și 0 -------------------------------- 0
emisie ale antracenului 320 340 360 380 400 420 440 460
în soluție în dioxan.
46 Spectroscopie
Emisia atomică este prezentată de multe elemente, în special de metale,

care, după ce sunt excitate termic sau electric, emit un spectru discontinuu, ale
cărui linii cele mai puternice se datorează tranzițiilor care se termină în starea
fundamentală (linii de rezonanță). Emisiile moleculare sunt mai complexe
decât emisiile atomice, radiația emisă constând în benzi largi de radiație mai
degrabă decât în liniile înguste asociate cu emisia atomică și având ca rezultat
un spectru care este o imagine aproximativ în oglindă a spectrului de
absorbție al compusului (figura 2.9).
Emisiile moleculare se datorează tranzițiilor electronice din interiorul
moleculei, dar sunt modificate de variațiile în lungimea legăturii. Legătura
dintre doi atomi capătă o anumită lungime ca urmare a diferitelor forțe care
acționează asupra atomilor implicați. Forțele de atracție dintre electronii unui
atom și nucleul celuilalt atom sunt echilibrate de forțele de respingere ale
sarcinilor similare purtate de ambele nuclee. Curba Morse (figura 2.10)
descrie
Energia +
I
potențială I
I
I
I
II
I
II
\
I
\
\
'' ' ---------------------------Forțe de
Oi---+-----------------
respingere
Lungimea legăturii
Figura 2.10 Curba Morse. Forțele atractive și repulsive interatomice au ca rezultat

formarea unei lungimi de legătură cu un nivel energetic minim.
relația dintre aceste forțe și ilustrează faptul că, la o anumită lungime a

legăturii, energia asociată legăturii este minimă și se spune că molecula se
află în stare fundamentală. Cu toate acestea, acest lucru descrie doar forma
cea mai sta bilă și, prin urmare, cea mai frecventă a moleculei. Vor exista, de
asemenea, forme mai energetice, iar acestea sunt indicate de nivelurile de
energie mai ridicate din diagrama curbei Morse.
Este necesară o nouă curbă Morse pentru a descrie nivelurile de energie
asociate cu o moleculă excitată, iar aceasta este deplasată spre dreapta și
deasupra curbei inițiale. Excitarea unei molecule cu o anumită lungime a
legăturii are ca rezultat o moleculă excitată cu aceeași lungime a legăturii, dar
cu o energie internă mai mare, așa cum este ilustrat de noua curbă Morse
(figura 2.11). O moleculă excitată va reveni inițial la starea de energie
minimă pentru molecula excitată
Interacțiunea radiației cu materiar 47
Potențial +
energie
-
Figura 2.11 Curba Morse pentru o moleculă excitată. Energia necesară pentru
Lungimea
legăturii
excitație (A) se pierde pe măsură ce molecula revine la starea fundamentală, dar numai
energia pierdută între stări (C) poate fi emisă ca radiație. Pierderile de energie datorate
rearanjamentelor interne (B și D) sunt neradiative.
înainte de a reveni la starea fundamentală, astfel încât energia absorbită inițial

este pierdută în cel puțin trei etape (B, C + D) pe măsură ce molecula revine
la starea fundamentală. O parte din pierderile de energie se datorează
rearanjărilor interne ale fiecărei molecule.
dintre cele două forme moleculare și, ca atare, implică o pierdere de energie
care nu este radiantă: doar energia pierdută în timpul schimbului dintre cele
două forme moleculare poate fi emisă ca radiație. Orice energie pierdută prin
radiație
(C) trebuie să fie mai mică decât energia totală absorbită (A) și, prin urmare,
lungimea de undă emisă va fi mai mare decât cea care a fost absorbită inițial.
O moleculă în stare fundamentală are o pereche de electroni cu spin opus în
fiecare orbital molecular. La excitare, un electron este ridicat pe un orbital de
anti-legătură și, deoarece nu este restricționat de prezența unui alt electron, poate
exista fie cu spinul său inițial (o tranziție singlet), fie cu spinul inversat (o
tranziție triplet). În cazul în care revenirea la starea fundamentală implică o
cădere din tranziția singlet și se emite radiație, se spune că compusul este
fluorescent. Cu toate acestea, în cazul unei reveniri la starea fundamentală dintr-o
tranziție triplet, nu se va produce fluorescență, iar pierderea de energie va fi
probabil neradiativă. Intensitatea fluorescenței depinde de proporția din totalul
moleculelor care suferă tranziții singlet și, în principal, din acest motiv, diferiți
compuși prezintă diferite
48 Spectroscopie
grade de fluorescență. Unii compuși prezintă emisie radiativă în timpul tranzițiilor

triplet și se spune că acești compuși sunt fosforescenți. Cea mai demonstrabilă
diferență între aceste două tipuri de emisie este faptul că fluorescența apare în
aproximativ 1 X 10-s secunde și persistă doar timp de aproximativ 1 până la
1 X HP nanosecunde și este mult mai rapidă decât fosforescența, care persistă timp
de
până la 1 X 10-3 secunde, din cauza timpului necesar pentru ca schimbarea de
rotație să aibă loc.
Chemiluminescența este o altă formă de emisie moleculară în care tranziția
electronică inițială este cauzată de o reacție exergonică și nu de absorbția de
energie radiantă. Majoritatea reacțiilor de chemiluminescență sunt de tip oxidant,
iar cele care implică peroxidul de hidrogen sunt deosebit de utile din punct de
vedere biochimic. Luminolul (5-amino-2,3-dihidroftalazină-1,4-dionă), de
exemplu, emite lumină atunci când reacționează cu peroxidul de hidrogen și poate
fi utilizat pentru monitorizarea multor enzime oxidative, cum ar fi glucoza-
oxidază, aminoacizii-oxidază etc. Bioluminescența este un tip special de
chemiluminescență în care procesul de emisie de lumină este catalizat de o
enzimă. Enzima luciferaza, extrasă din licurici, utilizează ATP pentru a oxida
substratul luciferină cu emisie de radiație și poate fi utilizată pentru a măsura
concentrațiile de ATP. Enzima extrasă din surse bacteriene poate oxida aldehidele
alifatice cu lanț lung în prezența oxigenului, FMN și NADH, cu emisie de radiații.
Metodele de luminescență sunt foarte sensibile, putând fi detectate
cantități de numai 1 fem tomole de ATP și, deși măsurătorile pot fi efectuate
cu ajutorul contoarelor de scintilații, este satisfăcător un echipament mult mai
simplu, care nu necesită nici o sursă de radiații, nici un sistem monocromator.
Secțiunea 2.1
1 Ce descrie radiația cu o lungime de undă de 340 nm?
(a) Radiații ultraviolete.
(b) Radiația vizibilă.
(c) Radiația infraroșie apropiată.
(d) Radiații infraroșii îndepărtate.
2 Radiația ultravioletă va induce frecvent care dintre următoarele
tranziții moleculare?
(a) Tranziția electronică a învelișului interior.
(b) Tranziția electronică de valență.
(c) Tranziția vibrațională moleculară.
(d) Tranziția rotațională moleculară.
3 Un efect al unui nivel crescut de conjugare într-o moleculă este acela
de a deplasa maximul de absorbție la o lungime de undă mai mare.
PENTRU CĂ
creșterea nivelului de conjugare într-o moleculă reduce cantitatea de
energie necesară pentru a induce o tranziție electronică.
4 Procesul în care energia este emisă sub formă de radiație după o
tranziție electronică indusă chimic este cunoscut sub numele de
fluorescență.
PENTRU CĂ
în cazul fluorescenței, radiația emisă are întotdeauna o lungime de undă
mai mare decât cea care a indus inițial tranziția.
--
Măsurătorile fotometrice stau la baza majorității metodelor cantitative în

biochimie și sunt legate de cantitatea de radiație absorbită mai degrabă decât de
natura acestei radiații. Această relație este exprimată în două legi experimentale,
care oferă baza matematică pentru astfel de metode cantitative.
2.2.1 Relația Beer-Lambert

Legea lui Lambert afirmă că proporția de energie radiantă absorbită de o
substanță este independentă de intensitatea radiației incidente. Legea lui Beer
afirmă că absorbția energiei radiante este proporțională cu numărul total de
molecule din calea luminii. Legea lui Beer descrie relația de bază dintre
concentrația substanței absorbante și valoarea măsurată a radiației absorbite.
Legea lui Lambert are o importanță majoră în ceea ce privește modul în care
se efectuează măsurătorile, iar faptul că un eșantion dat absoarbe întotdeauna
aceeași proporție din radiația incidentă, indiferent de intensitatea acesteia,
simplifică foarte mult proiectarea instrumentelor.
Cantitatea de radiație absorbită de o substanță nu poate fi măsurată în
mod direct și se determină, de obicei, prin măsurarea diferenței de intensitate
dintre radiația care cade pe probă (radiația incidentă, /0 ) și radiația reziduală
care iese în final din probă (radiația transmisă, /) (figura 2.12).
Figura 2.12 Absorbția de Exempl

radiații. u
Folosind astfel de măsurători, legea Beer-Lambert poate fi exprimată

sub forma unei ecuații:
log101Io... Anghilă
unde c este concentrația substanței în grame de molecule pe litru, l este
drumul luminii în centimetri, iar E (epsilon) este cunoscut ca fiind coeficientul
de absorbție molară pentru substanță și este exprimat în litri pe mol pe
centimetru (1 mo1-1 cm-1).
50 Spectroscopie
Valorile pentru I și I0 nu pot fi măsurate în termeni absoluți, iar

măsurătorile se fac cel mai convenabil prin exprimarea lui I ca procent din I0 .
Această valoare este cunoscută sub numele de transmisie procentuală (D) și
prezintă o relație liniară cu concentrația substanței de testat numai dacă se
utilizează logaritmul reciprocului său. Prin urmare, este mai convenabil să se
raporteze măsura
mentul inițial ca funcție logaritmică a lui I și I0 , un parametru care este
cunoscut sub numele de absorbție (A):
Procentul de transmisie (D = .i. X 100
Io
100
A= log10 T
La multe instrumente, citirea aparatului de măsură este calibrată în unități
de absorbție.
. folosind o scală logaritmică, în timp ce alte instrumente păstrează confortul unei
scări liniare, dar convertesc semnalul de la detector în unul logaritmic prin
mijloace electronice sau mecanice. Este esențial, atunci când se utilizează un
instrument fotometric, să se știe dacă acesta este calibrat în unități de absorbție
sau de transmitanță.
2.2.2 Abateri de la legea Beer-Lambert

Presupunerea că diferența dintre radiația incidentă și cea transmisă este o
măsură a radiației absorbite de analit nu este complet adevărată, deoarece
acesta poate să nu fie singurul motiv pentru care radiația incidentă nu apare în
forma transmisă. O anumită cantitate de radiație va fi reflectată de suprafața
suportului de probă, de obicei o celulă de sticlă sau de plastic, sau absorbită de
materialul din care este compusă celula. Eșantionul poate fi, de asemenea,
dizolvat într-un solvent care poate, la rândul său, să absoarbă sau să reflecte
radiația:
incident (/0 ) = absorbit + transmis ([) + alte pierderi
Din acest motiv, se măsoară radiația transmisă de un eșantion gol și se
consideră ca fiind radiația incidentă efectivă. Acest martor trebuie să fie
identic cu proba de testare în toate privințele, cu excepția prezenței substanței
de testare:
citire în alb = I0 - alte pierderi Prin
urmare:
absorbit = blank - transmis ([)
Un factor important care influențează relația Beer-Lambert este gama
de lungimi de undă a radiației incidente. În mod ideal, radiația ar trebui să
furnizeze doar o anumită unitate de energie și nu o gamă de niveluri de
energie. O astfel de radiație specifică este cunoscută sub numele de radiație
monocromatică și poate fi produsă numai în condiții foarte limitate. Cel mai
bun rezultat care poate fi obținut adesea este o radiație cu o gamă foarte
limitată de lungimi de undă. În cazul în care radiația incidentă conține lungimi
de undă care nu sunt absorbite de substanța de testat, diferența dintre
intensitatea radiației incidente și cea transmisă nu va fi proporțională cu
concentrația substanței de testat. În astfel de cazuri, va exista o relație
neliniară, așa cum este ilustrat în figura 2.13. Această problemă este deosebit
de relevantă pentru instrumentele care utilizează filtre simple de sticlă, mai
degrabă decât sisteme monocromatice, cum ar fi prismele sau rețelele de
difracție.
►
Absorbanța 2.0
1.5
1.0
0.5
2 3
Cyanmethaemoglobină (g 1-1 )
Figura 2.13 Validitatea relației Beer-Lambert pentru diferite sisteme

monocromatice. Absorbția unor concentrații variabile de ciannethemoglobină a fost
măsurată la 540 nm cu ajutorul unui spectrofotometru (A) și al unui fotometru simplu (B) cu
un filtru de sticlă.
Modificările care pot apărea în natura moleculară a probei ca urmare a

schimbărilor de concentrație pot duce, de asemenea, la o abatere de la relația
Beer-Lambert. Moleculele pot avea tendința de a se asocia între ele atunci
când concentrația este ridicată sau, dimpotrivă, complexele pot avea tendința
de a se disocia în cazul concentrațiilor scăzute. Ambele tipuri de modificări
pot afecta caracteristicile de absorbție ale compusului și pot avea ca rezultat
grafice neliniare.
Măsurătorile cantitative se bazează pe ipoteza că singura radiație care
ajunge la detector a trecut prin eșantion, dar în practică este foarte dificil să se
proiecteze instrumente capabile să elimine în mod eficient toate radiațiile
străine. O mare parte din această radiație nedorită provine din împrăștierea
radiației incidente de către neregularitățile suprafețelor cauzate de defecte de
fabricație sau de zgârieturi etc. În cazul instrumentelor fotometrice, se iau de
obicei anumite măsuri de precauție generale pentru a reduce această lumină
străină, cum ar fi utilizarea unor suprafețe interioare de culoare neagră mată
pentru a asigura o absorbție maximă și introducerea de deflectoare și ferestre
pentru compartimentarea instrumentului. Căile optice de lumină ar trebui să
fie proiectate pentru a produce fascicule de lumină paralele și spectre bine
focalizate prin utilizarea de lentile și oglinzi colimatoare.
Imperfecțiunile din monocromatoare au ca rezultat prezența unei mici pro
porțiunea de lungimi de undă nedorite din radiația incidentă. O astfel de
lumină difuză duce la o abatere de la relația Beer-Lambert (figura 2.14), iar
efectul este că măsurătorile de absorbție sunt mai mici decât ar trebui să fie.
Este posibil să se evalueze proporția de lumină difuză prin măsurarea
cantității de radiație transmisă de eșantioane care sunt opac din punct de
vedere optic la lungimea de undă care urmează să fie evaluată, dar care
transmit radiații cu alte lungimi de undă. Instrumentul se reglează în mod
normal la zero și la 100 % transmisie, iar substanța opacă se introduce în
compartimentul de probă. Cantitatea de lumină transmisă de probă, măsurată
în transmisie procentuală, este
52 Spectroscopie
Absorbție 3.0
0,1% Lumină difuză
1,0% Lumină difuză

2.0
10% Lumină difuză

1.0
Concentrație
Figura 2.14 Efectul luminii paralele. În absența luminii parazite, eșantioanele de

concentrație crescândă au ca rezultat un traseu liniar față de valoarea măsurată a
absorbanței. Proporțiile crescânde de lumină difuză determină abateri de la această
relație liniară deasupra valorilor de absorbanță indicate ( ) .
Tabelul 2.3 Măsurătorile de lumină difuză pentru diferite instrumente măsurate la

370 nm
Sistem opticLumină difuză

(%)
Monocromator cu prismă cu un <0.02

singur fascicul Monocromator <0.02
holografic unic Monocromator <0.0002
holografic dublu Monocromator
holografic dublu
se citește ca fiind lumina dispersată la o anumită lungime de undă. La 220

nm, o soluție de iodură de sodiu (10 g 1-1) transmite mai puțin de 1 X 10-10 %
din radiația incidentă, dar transmite mai mult de 50 % la lungimi de undă mai
mari de 265 nm. Lumina dispersată la 340 nm poate fi măsurată cu ajutorul
unei soluții de nitrit de sodiu (50 g 1-1 ). Ca alternativă, sunt disponibile diverse
filtre care pot fi utilizate în mod similar, un filtru Vycor fiind opac la
radiațiile sub 220 nm. În tabelul 2.3 sunt prezentate exemple de măsurători
ale luminii parazite pentru diferite instrumente. Erorile sunt mai semnificative
în apropierea limitei lungimii de undă a unui instrument și pot duce la
înregistrarea unor vârfuri de absorbție "false", pe lângă valorile incorecte ale
absorbției.
......---
2.2.3 Măsurători cantitative

Măsurarea intensității radiației este indirectă, implicând generarea și
măsurarea unui curent electric, și este necesar să se standardizeze
instrumentele înainte de a se efectua citirile de testare. Metoda de
standardizare este, în principiu, aceeași pentru toate instrumentele, dar variază
în practică în funcție de proiectarea unui anumit instrument.
Procedura de bază implică stabilirea condițiilor minime și maxime ale
radiației transmise și reglarea sistemului de măsurare pentru a obține citirile
corespunzătoare. Pentru a seta transmitanța maximă se utilizează o probă albă
și se reglează instrumentul pentru a obține fie o citire de 100% transmitanță,
fie o absorbție zero. Transmitanța zero se stabilește atunci când toată lumina
care ajunge la detector este oprită cu ajutorul unui obturator opac, iar aparatul
de măsură este reglat pentru a obține o citire a transmitanței zero. Valoarea
corespunzătoare pentru absorbanță este infinită și, deoarece este dificil din
punct de vedere tehnic să se regleze la această valoare, metodele de reglare
variază de la un instrument la altul, dar sunt întotdeauna descrise în manualul
instrumentului.
Deși legea Beer-Lambert descrie relația cantitativă dintre absorbția
radiației și concentrația substanței absorbante, aceasta nu specifică lungimea
de undă exactă a radiației utilizate, deși am observat că, în mod ideal, radiația
ar trebui să fie monocromatică. Pentru a obține o sensibilitate maximă a
metodei, măsurătorile de absorbție pentru orice concentrație dată trebuie să fie
cât mai mari posibil și, de preferință, trebuie să se facă la maximul de
absorbție. Examinarea spectrului de absorbție al adenozindifosfatului (ADP)
(figura 2.2) arată că la maximul de absorbție de la 258 nm se obține o valoare
de absorbție de 0,22, în timp ce la 270 nm valoarea absorbției este de numai
0,14. Teoretic, oricare dintre lungimile de undă ar fi potrivită pentru
cuantificarea ADP, dar, evident, măsurarea efectuată la 258 nm ar oferi o
sensibilitate mai mare.
Metode absolute
Este posibil să se măsoare absorbanța unui eșantion de compus cunoscut la
maximul de absorbție al acestuia și să se calculeze concentrația reală a
compusului din eșantion folosind o valoare cunoscută pentru coeficientul de
absorbție molară (care poate fi obținută adesea din tabele spectrale publicate).
În figura 2.2, spectrul de absorbție al ADP arată o absorbanță de 0,22 la 258
nm. Valoarea citată pentru coeficientul de absorbție molară a ADP la această
lungime de undă este de 1,54 X 104 l mo1-1-1 cm-1 și, prin urmare, concentrația
de ADP din proba utilizată poate fi calculată din ecuația Beer-Lambert:
A = țipar
Prin urmare:
A
c- = 1,42 X 10-5 mol 1-1
Cu toate acestea, în practică, acest lucru nu este întotdeauna posibil din
diverse motive. În cazul în care proba este un amestec de mai mulți compuși
organici, valoarea absorbției măsurate va fi efectul cumulativ al tuturor
substanțelor care absorb la lungimea de undă selectată. În plus, valoarea
exactă a absorbției molare
54 Spectroscopie
depinde într-o anumită măsură de instrumentul special utilizat și, în mod

ideal, valorile constantei ar trebui mai degrabă determinate decât
acceptate din literatura de specialitate. Utilizarea coeficientului de
absorbție molară presupune că relația Beer-Lambert este valabilă pentru
toată gama de valori de absorbție măsurate și, deoarece acest lucru nu este
întotdeauna adevărat, este esențial ca această relație să fie întotdeauna
confirmată experimental cu ajutorul instrumentului în cauză.
Determinarea coeficientului de absorbție molară
Pentru a determina coeficientul de absorbție molară, trebuie să fie
disponibilă o probă pură și uscată a compusului. Puritatea este adesea
dificil de verificat într-un laborator analitic de rutină, dar uscăciunea poate
fi obținută prin deshidratare. Trebuie să se aibă grijă la alegerea
desicantului și a temperaturii utilizate, din cauza instabilității potențiale a
compusului chiar și la temperatura ambiantă sau a efectului luminii. Se
recomandă să se determine valoarea coeficientului folosind diferite probe
de compus și să se compare ulterior rezultatele.
O cantitate mică de substanță se cântărește cu precizie, se dizolvă și
se completează cu grijă într-un balon cotat până la un volum definit, de
exemplu 100 ml. Din masa moleculară relativă (RMM) cunoscută a
compusului se poate calcula concentrația molară a soluției:
. greutate 1000
Concentrația molară = --- Xmol 1-1
RMM volum (ml)
Concentrațiile în jurul valorii de 0,1 mol 1-1 sunt adesea

convenabile, dar, în mod evident, acestea depind de factori cum ar fi
cantitatea de substanță disponibilă, costul, solubilitatea, etc. Din această
soluție stoc, se prepară o serie de diluții precise folosind sticlărie
volumetrică, iar absorbția fiecărei diluții se măsoară într-o cuvă de 1 cm la
lungimea de undă de absorbție maximă pentru compus. O reprezentare
grafică a absorbanței în funcție de concentrație va da o indicație a
validității relației Beer-Lambert pentru compus, iar o valoare a
coeficientului de absorbție molară poate fi calculată din aceste măsurători
individuale sau din panta porțiunii liniare a graficului:
---abs-or-ba-nc-e
Coeficientul de absorbție molară = - 1 mo1-1-1
cm- I
concentrația molară
Metode comparative
În cazul în care utilizarea coeficientului de absorbție molară nu este
adecvată, poate fi suficientă utilizarea unei singure soluții de referință cu
concentrație cunoscută (cunoscută sub numele de soluție etalon sau
soluție de calibrare) și compararea absorbanței testului cu cea a acestui
etalon. Principiul de cuantificare este exact același ca înainte, cu excepția
faptului că coeficientul de absorbție molară este eliminat din calcul prin
măsurarea absorbției soluției de test și a soluției etalon la aceeași lungime
de undă și compararea valorilor absorbției acestora.
56 Spectroscopie
O soluție standard cu concentrația cs dă o valoare a absorbanței de As

în timp ce soluția de test dă o absorbanță de A1 - Prin urmare:
As = EC.I
și
A I = ECf
Prin urmare,
-i\ = CE.I cs
=
Ai ECt[ Cl
și concentrația testului
Al
c1 = cs X -
i\
Utilizarea unui singur etalon în acest mod presupune că relația Beer-
Lambert este valabilă în intervalul de absorbanță măsurat și, din nou, este
necesar să se confirme relația înainte de a utiliza metoda.
Pentru a valida relația Beer-Lambert, este necesară analiza unei serii de
concentrații cunoscute ale substanței de testat. În cazul în care graficul
valorilor absorbției în funcție de concentrație rezultă o linie dreaptă, se poate
utiliza oricare dintre cele două metode prezentate anterior. Cu toate acestea,
dacă graficul rezultat prezintă o curbă în loc de o linie dreaptă, atunci
înseamnă că valoarea reală a coeficientului de absorbție molară depinde într-o
anumită măsură de concentrația compusului și, prin urmare, ambele metode
sunt invalidate. În astfel de circumstanțe, va fi necesară o diagramă grafică
(curbă de calibrare).
Trebuie să se acorde atenție la prepararea soluțiilor standard, deoarece
un preparat pur al compusului de testat nu va fi supus acelorași efecte de
interferență ca și un eșantion brut sau amestecat. Pentru a compensa aceste
diferențe, poate fi necesar să se pregătească etalonul prin adăugarea unei
cantități cunoscute de component pur la proba reală și utilizarea creșterii
rezultante a absorbanței ca valoare a absorbanței pentru etalon.
Analiza amestecurilor
În cazul în care există mai mulți compuși care absorb radiații cu aceeași
lungime de undă, deși nu au neapărat aceleași maxime de absorbție, valoarea
absorbției măsurată este efectul cumulativ al tuturor compușilor absorbanți și
nu mai reflectă concentrația unui singur compus. Cea mai frecventă abordare
a unei astfel de probleme implică utilizarea unui reactiv chimic pentru a
modifica chimic unul dintre compuși și pentru a produce un nou compus cu
caracteristici de absorbție semnificativ diferite. Această tehnică este deosebit
de utilă dacă are ca rezultat o deplasare a maximului de absorbție din regiunea
ultravioletă în regiunea vizibilă a spectrului (figura 2.15).
Alternativ, absorbția amestecului poate fi măsurată la diferite lungimi
de undă (de obicei, una pentru fiecare compus prezent) și, cu condiția să fie
cunoscuți coeficienții de absorbție molară pentru fiecare compus la fiecare
lungime de undă, se poate calcula concentrația fiecărui compus. Procedura 2.2
ilustrează un astfel de calcul.
58 Spectroscopie
Absorbanța
I
I
I
I ,,,-,
I
/ ',
I II I
I / \
II / \
I / \
I / \
I / \
, \1I
\
\
'
\ '.B
\
\
'' ' ...
200 300 400 500 600 700

Figura 2.15 Modificarea caracteristicilor de absorbție ale unui compus. Salicilatul

are un maxim de absorbție la 290 nm (A). Complexarea cu nitrat feric într-un acid are
ca rezultat o deplasare a maximului de absorbție în regiunea vizibilă la 510 nm (A).
(B) și constituie baza unei metode de cuantificare.
Spectroscopie diferențială
Unele probe pot conține diferite forme ale aceleiași substanțe care prezintă
spectre de absorbție foarte asemănătoare și, prin urmare, fac ca detecția sau
măsurarea să fie foarte dificilă.
Absorbțiometrie moleculară 59
de unul destul de dificil. Această situație apare, de exemplu, la măsurarea

formelor oxidate și reduse ale citocromului c și la detectarea diferiților
derivați ai hemoglobinei din sânge. În aceste situații, poate fi utilă utilizarea
spectroscopiei diferențiale.
Spectroscopia de diferență necesită o soluție albă care să includă
substanța care interferează. Astfel, se obține un spectru de absorbție care
reprezintă o diagramă a diferenței de absorbție dintre substanța martor și
eșantion la fiecare lungime de undă. Compușii care sunt comuni atât pentru
martor, cât și pentru eșantion vor da o diferență zero în absorbție, iar orice
diferențe spectrale ușoare în eșantion vor fi prezentate fie ca vârfuri, fie ca
depresiuni (figura 2.16). Tehnica va demonstra mici diferențe în
caracteristicile de absorbție, dar sensibilitatea metodei este, în mod evident,
afectată în mod semnificativ de calitatea spectrofotometrului.
Absorbție 2.0 Diferența

II de absorbție
I
I
Nr-
I
1
I 0
I
.0
\ . /pH8.Y
01.-..J._ _. ._ . 1..,;::=
220 240 260 280 300 220 240 260 280 300
Lungime de undă (nm) Lungime de undă (nm)
(a) (b)
Figura 2.16 Spectroscopia diferențială. Fenobarbitona (a) prezintă maxime de

absorbție diferite la pH 13,0 (forma ceto) și la pH 8,3 (forma enol).
Un spectru de diferență a două soluții de fenobarbitonă cu concentrații identice, dar la
pH-uri diferite (b) (pH 13,0 ca referință și pH 8,3 ca probă) are un vârf pozitiv la 232
nm și un vârf negativ la 254 nm.
Diferența de absorbanță dintre vârf și minim poate fi utilizată ca o măsură directă a
concentrației, chiar și în prezența multor substanțe care interferează.
Secțiunea 2.2
I. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate despre absorbția
radiațiilor?
(a) Cantitatea de radiație absorbită este proporțională cu radiația
incidentă.
(b) Absorbanța este reciproca transmitanței.
(c) Legea Beer-Lambert este valabilă numai la maximul de absorbție.
(d) Absorbanța depinde de concentrația analitului.
2. Calculați concentrația molară a unei soluții de compus X, care are o
absorbanță de 1,2 la 350 nm. Coeficientul de absorbție molară al
compusului X este de 0,5 X I03 1 mo1-1 cm-I la 350 nm. Care
dintre următoarele este răspunsul corect?
(a) 2.4mmoll-1-
(b) 4.2 mmo11-1 -
(c) 6,0 mmol 1-1.
(d) 2,4 mol 1-1.
60 Spectroscopie
3. Este preferabil să se măsoare absorbția unui analit la

maximul de absorbție al acestuia.
PENTRU CĂ
metodele absorptiometrice sunt mai sensibile atunci când sunt
utilizate la maximul de absorbție al analitului.
4. Lumina difuză poate cauza abateri de la relația Beer-Lambert,
deoarece
gama de lungimi de undă a radiației incidente asupra unui eșantion nu
afectează validitatea relației Beer-Lambert.
Există o gamă largă de instrumente disponibile pentru măsurarea radiației

absorbite și este important să se aprecieze caracteristicile diferitelor
instrumente, precum și natura și calitatea rezultatelor care pot fi obținute. Un
fotometru este un instrument conceput pentru a măsura intensitatea unui
fascicul de lumină și, de obicei, face acest lucru comparând-o cu intensitatea
unei surse de radiație de referință. Un spectrometru este un instrument
capabil să împartă radiația incidentă într-un spectru și este utilizat pentru a
identifica lungimile de undă individuale prezente. Un spectrofotometru este
un instrument care combină aceste două funcții. Acesta este capabil să
producă radiații cu caracteristici definite ale lungimilor de undă dintr-o sursă
mixtă de radiații și să măsoare ulterior intensitatea acestor radiații.
Structura de bază a unui spectrofotometru este ilustrată în figura 2.17.
Lumina de la lampă trece printr-un dispozitiv monocromator, iar lungimea de
undă selectată, după ce trece prin eșantion, este măsurată de un detector
fotoelectric adecvat. Intensitatea radiației inițiale este controlată fie printr-un
atenuator, care este adesea un simplu sistem de obturator, fie prin variația
tensiunii de funcționare a lămpii. Geometria traseului luminii este controlată
de o serie de lentile sau oglinzi de focalizare. Gradul de sofisticare a
instrumentului (și, prin urmare, prețul acestuia) și calitatea rezultatelor depind
de componentele individuale și de designul optic, dar metoda de bază de
funcționare este similară pentru toate instrumentele.
Cele mai simple tipuri de instrumente fotometrice sunt concepute pentru
măsurători numai în regiunea vizibilă a spectrului și se bazează pe filtre colorate
și pe detectoare fotoelectrice simple. Denumirea de colorimetru este adesea
folosită pentru a descrie astfel de instrumente, deși acest lucru nu este neapărat
corect, iar acest cuvânt ar trebui probabil rezervat mai degrabă comparatoarelor
vizuale decât instrumentelor fotoelectrice.
Figura 2.17 Componentele Sursa de radiații Monocromant Detector Conto

unui spectrofotometru. dispozi container r
tiv
2.3.1 Surse de radiații

Lampa cu wolfram este o sursă fiabilă și ieftină de energie radiantă care se
utilizează în principal în regiunea vizibilă a spectrului. Nu este o sursă
satisfăcătoare de radiații ultraviolete sau infraroșii din cauza naturii emisiei și
a caracteristicilor absorbante ale învelișului de sticlă. Cu toate că poate fi
utilizat în regiunile ultraviolete și infraroșii apropiate (330 nm până la 3 µ,m),
cantitatea mare de lumină vizibilă emisă cauzează probleme tehnice, în special
în regiunea infraroșie.
Sursele obișnuite de radiație ultravioletă sunt lămpile cu hidrogen sau
deuteriu (acestea din urmă fiind de obicei preferate) sau lampa cu vapori de
mercur. Toate sursele de ultraviolete trebuie să fie prevăzute cu ferestre din
sticlă de cuarț sau de siliciu și niciuna dintre lămpile menționate nu emite
cantități semnificative de radiații peste 400 nm.
Ca surse de radiație infraroșie în intervalul 2-15 µ,m se utilizează
radiatoare negre, de exemplu, radiatorul Nernst, care constă într-o tijă goală
realizată din oxizi fuzionați de zirconiu, ytriu și toriu. Pentru utilizare, aceasta
este preîncălzită și, atunci când se aplică o tensiune, emite o radiație infraroșie
continuă intensă cu foarte puține radiații vizibile.
2.3.2 Monocromatoare
Capacitatea de a produce radiație monocromatică este o caracteristică foarte
dorită a instrumentelor fotometrice, deoarece relația Beer-Lambert este strict
adevărată doar pentru radiația monocromatică. Un spectrofotometru bun poate
furniza radiație cu o lungime de undă specificată cu o gamă sau o lățime de
bandă de numai 0,1 nm, dar se poate aprecia că nici măcar aceasta nu este
monocromatică atunci când se consideră că lățimea de bandă a liniei de emisie
a sodiului este de aproximativ 1 X 10-5 nm. Acest fapt oferă una dintre
problemele majore în proiectarea instrumentelor fotometrice, și anume
producerea așa-numitei radiații monocromatice.
Absorbanța
I
Transmisie
Figura 2.18
\JI
Spectrul de absorbție al 200 300 400 500 600
portocalei de metil.
62 Spectroscopie
Există diverse dispozitive concepute pentru a produce radiații cu o gamă

limitată de lungimi de undă, unele fiind extrem de eficiente, în timp ce altele
transmit o gamă considerabilă de lungimi de undă.
Tilturi colorate
Spectrul de absorbție al unui colorant prezintă nu numai un maxim de
absorbție în regiunea vizibilă a spectrului, ci și un minim de absorbție care
indică lungimile de undă ale radiației care sunt transmise de colorant (figura
2.18). Astfel de coloranți, sub formă de vitralii sau filtre de gelatină, oferă cea
mai simplă abordare a proiectării sistemelor monocromatice.
Evident, filtrele nu furnizează radiații monocromatice și, în multe
cazuri, lățimea de bandă poate fi de până la 100-150 nm (figura 2.19).
Creșterea concentrației colorantului poate reduce lățimea de bandă într-o
oarecare măsură, dar va reduce, de asemenea, cantitatea de radiație transmisă,
ceea ce va impune atunci o presiune asupra sistemului de detectare și asupra
sensibilității instrumentului.
Tiltări de interferență
Filtrele de interferență modifică intensitatea radiației transmise prin filtru,
sporind lungimea de undă necesară și suprimând lungimile de undă nedorite.
Transmitanță I 00
(%)
I II
/ I II
/I I I
I I
/ I I
I I
/ I I
I
'--I
I
I
I I I
I I
I I
I I
I
I I
I 'I
'I
I
I
Figura 2.19 I I
I
I I I
Caracteristicile de transmisie I I
I
ale diferitelor filtre. B 'c
500 700
Spectrum Filtru Culoare sau lungime de undă Lățimea

de bandă (nm)
A Sticlă Verde deschis 135

OGRI Verde mediu 68
B Sticlă 625 540 nm 14
C Interferențe
Lățimea de bandă este definită ca fiind gama de lungimi de undă transmise la jumătate din
transmitanța maximă.
Acestea dau spectre de transmisie cu lățimi de bandă considerabil reduse (10-

30 nm) în comparație cu filtrele colorate (figura 2.19) și pot fi utilizate în
gama spectrală care variază de la ultravioletul apropiat (350 nm) la infraroșu
apropiat (5 µm).
Filtrele de interferență constau din două bucăți de sticlă, fiecare oglindită pe
o parte, astfel încât jumătate din radiația incidentă să fie reflectată, iar restul să fie
transmisă. Ele sunt separate de un strat subțire de material transparent, adesea
Suprafețe
semisorizate
/
Radiația Transmisă
incidentă radiații ,..
...---
T
Figura 2.20
Un filtru de interferență.
fluorură de calciu sau de magneziu, a cărei grosime este factorul critic în

determinarea lungimii de undă a radiației transmise de filtru. Ca urmare a
reflexiilor interne, fasciculul de lumină care cade pe filtru va ieși ca o serie de
fascicule de lumină suprapuse, fiecare dintre ele fiind întârziat față de
fasciculul precedent de două ori grosimea filtrului (figura 2.20). Compoziția
lungimilor de undă a fasciculului transmis va fi aceeași cu cea a fasciculului
inci dent, dar acele lungimi de undă pentru care distanța 2T este un multiplu
întreg vor fi în fază în toate fasciculele transmise. Aceste lungimi de undă vor
fi întărite în fascicul prin interferență constructivă, în timp ce toate celelalte
lungimi de undă vor fi defazate fie complet, fie parțial și vor suferi
interferențe distructive într-o măsură mai mare sau mai mică (figura 2.21).
Indicele de refracție al materialului utilizat pentru a separa cele două
bucăți de sticlă afectează, de asemenea, procesul, iar lungimea de undă
consolidată va fi acea radiație care, în materialul utilizat, are o lungime de
undă de 2T. Lungimea de undă a radiației din aer care va fi întărită de un
astfel de filtru va fi:
>... = 2Tn
unde n este indicele de refracție al materialului și >... este lungimea de undă.
64
Spectroscopi
e
.....
Figura 2.21 Efecte de interferență. Combinarea formelor de undă (A) și (B) care, deși
au amplitudini diferite, au aceeași lungime de undă și sunt în fază una cu cealaltă, are
ca rezultat un efect constructiv, iar forma de undă finală (C) are o amplificare crescută.
Combinarea formelor de undă (D) și (E), care sunt defazate una față de cealaltă, are ca
rezultat o interferență distructivă, iar forma de undă finală (F) are o amplitudine redusă.
Deoarece orice lungime de undă pentru care 2Tn este un multiplu întreg va fi,
de asemenea, forțată, aceste filtre vor transmite, de asemenea, benzi de ordinul
al doilea, al treilea și al patrulea în care lungimea de undă transmisă va fi
jumătate, o treime și un sfert din cea originală. În unele cazuri, benzile de
ordinul al doilea și al treilea sunt preferate benzilor de ordinul întâi, în ciuda
scăderii intensității radiației transmise, deoarece lățimea de bandă a
transmisiunilor de ordin superior devine progresiv mai îngustă. Este relativ
simplu să se elimine benzile nedorite de radiație cu ajutorul unor filtre colorate
suplimentare, datorită diferențelor mari de lungime de undă.
Filtrele de interferență în formă de pană, care au o distanță din ce în ce
mai mare între cele două bucăți de sticlă, produc un spectru aparent datorită
gamei de lungimi de undă îmbunătățite constructiv. Acestea sunt extrem de
utile în proiectarea fotometrelor cu lungime de undă variabilă, dar gama de
radiații produsă nu este un spectru real și există încă o suprapunere
considerabilă între lungimile de undă.
Prisme
Indicele de refracție al unui material este diferit pentru radiații cu lungimi de undă
diferite și, prin urmare, dacă un fascicul paralel de lumină albă policromatică este
trecut printr-o prismă, diferitele lungimi de undă din care este compus vor fi curbate în
unghiuri diferite pentru a produce un spectru. Introducerea unei fante variabile în
traseul optic al luminii va permite selectarea unei anumite secțiuni a spectrului (figura
2.22). Pentru regiunea ultravioletă a spectrului sunt necesare prisme de siliciu sau de
cuarț. În timp ce sticla poate fi utilizată în regiunea vizibilă, prismele din sare gemă
sunt necesare pentru lucrul în infraroșu.
Prismele sunt aliniate astfel încât fasciculul de lumină care trece prin
prismă să fie paralel cu baza acesteia, astfel încât unghiul de deviație al
fasciculului care iese să fie minim și să ofere o rezoluție maximă între
lungimile de undă individuale. O montură Littrow este proiectată astfel încât
spectrul să fie focalizat pe un
,.J,i,
f
'S
Figura 2.22
q
Un monocromator cu
prisme.
o placă care include o fantă și care permite reglarea poziției prismei astfel
încât radiația din secțiunea selectată a spectrului să treacă prin fantă. Lățimea
fantei este, evident, un factor important în determinarea lățimii de bandă a
radiației transmise, dar geometria și indicele de refracție al prismei au, de
asemenea, un efect semnificativ.
Dispersia spectrelor produse de prisme variază în funcție de designul
prismei și, de asemenea, în funcție de regiunea spectrului în cauză. Dispersia
este mai mică la lungimi de undă mai scurte și mai mare la lungimi de undă
mai mari. Câteva valori tipice sunt:
Lungime de Dispersie liniară
undă 0,5 nm pe mm
250nm 5,5 nm pe mm
450nm 12,0 nm pe mm
600nm
Aceasta înseamnă că, dacă se utilizează o lățime fixă a fantei, radiația
transmisă va avea lățimi de bandă diferite în funcție de regiunea spectrului.
Eficiența mecanică a fantei mobile este, prin urmare, extrem de importantă în
ceea ce privește capacitatea de a selecta lungimi de undă specifice.
Rețele de difracție
În forma sa cea mai simplă, o rețea de difracție constă într-o serie de linii
opace paralele desenate pe o bucată de sticlă. Atunci când grătarul este ținut
într-un fascicul de lumină paralelă, fiecare spațiu liber acționează ca o sursă
de radiație [figura 2.23(a)]. Atunci când este privită din orice unghi (0),
radiația suprapusă de la toate fantele este compusă din toate lungimile de undă
ale luminii originale, dar radiația de la fiecare fantă este întârziată sau
avansată în raport cu radiația de la o fantă adiacentă cu distanța d sin 0, unde d
este distanța dintre fiecare fantă [figura 2.23(b)]. Aceasta înseamnă că numai
lungimile de undă pentru care d sin 0 este un multiplu întreg vor fi în fază una
cu cealaltă și vor fi consolidate constructiv, în timp ce toate celelalte lungimi
de undă vor suferi interferențe distructive într-o măsură mai mare sau mai
mică. Prin urmare, lungimea de undă a radiației produse la un unghi este
n'l\. = d sin 0
unde n este un număr întreg.
66 Spectroscopie
La orice unghi specificat, lungimile de undă care sunt multipli întregi ai

valorii d sin fJ vor fi îmbunătățite și sunt cunoscute ca spectre de ordinul întâi, doi
și trei. Lungimile de undă nedorite pot fi eliminate prin utilizarea unor filtre de
tăiere simple, așa cum s-a descris anterior pentru filtrele de interferență. De
exemplu, dacă o anumită grilă are 1000 de fante pe milimetru și este privită la un
unghi de 8,6°, lungimile de undă ale radiației îmbunătățite vor fi de 150 nm, 300
nm, 450 nm, 600 nm etc.
----1// //
,
--Dacă... dacă... dacă...
--1 ►
--1
(a)
Lumina incidentă
Lumina
difractată
\
(c)
Figura 2.23 Rețele de difracție. Fiecare linie dintr-o rețea acționează ca o sursă
separată de radiație (a), dar radiația transmisă la orice unghi 0 este întârziată în raport
cu radiația de la linia precedentă (b) cu distanța x. În radiația transmisă, unele lungimi
de undă vor suferi interferențe constructive, în timp ce majoritatea vor suferi efecte
distructive. Rețelele de reflexie (c) sunt utilizate frecvent, iar principiile de
monocromatizare sunt aceleași ca și în cazul rețelelor de transmisie.
Rețelele de difracție sunt, de obicei, de tip reflexie mai degrabă decât de tip
transmisie [figura 2.23(c)], în principal din cauza pierderii de radiație ultravioletă
care are loc în timpul transmiterii prin sticlă. Rețelele sunt uneori realizate prin
trasarea unei serii de caneluri paralele cu un diamant într-un strat de aluminiu
pregătit pe un blanc de sticlă, un proces dificil, deoarece pot exista până la 2000
de linii pe milimetru. Cu toate acestea, un grătar holografic este mult mai simplu
de realizat și se obține prin acoperirea unei bucăți de sticlă cu un strat subțire de
fotorezist, care este apoi expus la franjele de interferență paralele produse la
intersecția a două fascicule de lumină provenite de la lasere. Fotorezistul este
developat într-o soluție de gravură pentru a obține un model de suprafață cu
caneluri paralele și este apoi acoperit cu u n strat subțire de aluminiu pentru a
produce o rețea de reflexie.
Deoarece dispersia se datorează geometriei rețelei și nu este o proprietate a

materialului, așa cum se întâmplă în cazul prismelor, rețelele pot fi produse cu
caracteristici optice pentru anumite intervale spectrale. Astfel de spectre prezintă o
distribuție egală a lungimilor de undă în comparație cu cele produse de prisme,
ceea ce nu numai că simplifică proiectarea instrumentelor, dar înseamnă, de
asemenea, că valorile pentru dispersia liniară sunt valabile pentru întreaga gamă
de lungimi de undă a unui grătar, fiind adesea de numai 1 nm pe mm. Eficiența
monocromării poate fi îmbunătățită considerabil prin utilizarea unui
monocromator dublu, în care partea selectată a spectrului de la primul grătar poate
fi rezolvată în continuare de un al doilea grătar, ceea ce duce la lățimi de bandă de
până la 0,1 nm fără o reducere excesivă a intensității radiației.
2.3.3 Detectoare
Materialele și designul diverselor detectoare fotoelectrice disponibile sunt de
așa natură încât absorbția radiației are ca rezultat deplasarea electronilor și,
prin urmare, apariția unei diferențe de potențial între doi electrozi. Principalele
tipuri de detectoare fotoelectrice pot fi clasificate ca fiind fie fotovoltaice, fie
fotoconductoare (figura 2.24).
Fotovoltaic Fotoconductoare
Figura 2.24 Detectoare fotoelectrice. Detectoarele fotoelectrice măsoară fluxul de

electroni deplasat de absorbția radiației. Detectoarele fotoconductoare măsoară
modificările de conductivitate cauzate de absorbția de radiații.
Regiunea ultravioletă și vizibilă a spectrului

Dispozitivele fotovoltaice sunt cele mai utile în această regiune a spectrului, iar
stratul de barieră sau celula solară (figura 2.25) poate fi utilizat în fotometre
simple. Aceste celule sunt eficiente numai în regiunea vizibilă a spectrului și, deși
dau un răspuns liniar la intensitatea radiației pe o gamă limitată, ele prezintă un
efect de oboseală în care semnalul scade pe măsură ce radiația continuă să cadă pe
celulă. Curentul generat este foarte mic și este dificil de amplificat din cauza
rezistenței interne scăzute a celulei. Ca urmare, astfel de celule nu sunt foarte
sensibile. Evoluția celulelor fotoelectrice a dus la producerea de fotodiode.
Acestea sunt, în principiu, foarte asemănătoare cu celula cu strat de barieră
descrisă mai sus, dar seleniul este înlocuit cu produse din siliciu. Siliciul este un
semiconductor și, dacă se adaugă urme de bor sau de galiu, oligoelementul poate
accepta electronii deplasați din siliciu, lăsându-l încărcat pozitiv (siliciu p). În
schimb, urme de arsenic vor acționa ca donatori de electroni, conferind siliciului o
sarcină negativă (n-siliciu). Deplasarea electronilor din siliciu poate fi cauzată de
absorbția de radiații și, dacă dioda este proiectată în același mod ca și celula cu
strat de barieră, cu siliciu p ca placă frontală și siliciu n ca placă posterioară,
absorbția de radiații va avea ca rezultat un curent mic.
care curge între plăcile de siliciu.
68 Spectroscopie
Seleniu
Strat
transparent
Fier
Figura 2.25 Celula stratului de barieră. Radiația absorbită de semiconductor, adesea

seleni um, determină eliberarea de electroni și circula un mic curent care poate fi măsurat
cu ajutorul unui microampermetru.
Fotodiodele pot fi produse sub formă de dispozitive foarte mici, în stare

solidă, care sunt eficiente în gama de lungimi de undă de 200-1000 nm, iar
semnalele produse pot fi manipulate pe calculator. Acestea sunt produse
frecvent în unități în care un număr mare de diode sunt dispuse una lângă alta,
ceea ce formează ceea ce se numește o matrice de diode și, ca atare, pot fi
utilizate în spectrofotometre și în sisteme de monitorizare pentru
cromatografie.
Tuburile fotoemisive sunt necesare pentru lucrul în domeniul ultraviolet și
prezintă o sensibilitate și o precizie mai mare decât celulele fotoelectrice. Un tub
fotoemisiv simplu este format din doi electrozi în vid. Un catod de argint acoperit
cu un metal alcalin este menținut la o diferență de potențial de aproximativ 100 V
față de anod, care este un fir de argint simplu și servește la colectarea electronilor
[figura 2.26(a)].
Un fotomultiplicator este format dintr-o serie de electrozi (de obicei zece),
primul fiind un electrod fotoernisiv, iar restul fiind electrozi multiplicatori de
electroni [figura 2.26(b)]. Radiația care cade pe primul electrod are ca rezultat
eliberarea de electroni care sunt colectați de electrodul următor, care este menținut
la o sarcină ușor mai pozitivă. Acești electroni stimulează eliberarea de mai mulți
electroni de la acest electrod, mărind fluxul de electroni de un factor de patru sau
cinci. Electrozii succesivi sunt acționați la tensiuni care cresc în trepte de
aproximativ 100 V, iar întregul dispozitiv necesită o sursă de alimentare de înaltă
tensiune foarte stabilă. Amplificarea rezultată a curentului inițial este de câteva
milioane de ori mai mare, ceea ce face din tubul fotomultiplicator un dispozitiv
fotoelectric foarte sensibil.
Răspunsul spectral al tuburilor fotoemisive depinde de compoziția
catodului, iar utilizarea diferitelor amestecuri de elemente permite producerea
unei game largi de tuburi cu reactivitate variabilă (figura 2.27). Tuburile
fotomultiplicatoare pot fi utilizate pentru detectarea radiațiilor de intensitate
scăzută și chiar și în absența oricărei lumini vor genera totuși un curent mic
datorită diverselor emisii din materialul tubului etc. Acest "curent de întuneric"
trebuie să fie compensat în orice măsurători care se fac.
'< f-
Plasă de sârmă 1--1

anod
Radiații
(a)
Radiații Dynodes
5
2 4 6
Fotocatod Dynodes
(b)
Figura 2.26 Tuburi fotoemisive. Lumina intră într-un fototub simplu (a) și determină
eliberarea de electroni din aliajul fotoemisiv al catodului. Datorită diferenței de putere
dintre anod și catod, electronii sunt captați de anod, iar curentul rezultat poate fi
amplificat și măsurat. Tuburi fotomultiplicatoare
(b) reprezintă o dezvoltare a fototuburilor simple și au ca rezultat amplificarea internă
a curentului dezvoltat inițial la fotocatod.
Regiunea infraroșie a spectrului

Detectoarele fotoconductoare, cum ar fi sulfura de plumb, sunt utile în regiunea
spectrală de 800-4000 run (adică în infraroșu apropiat). Aceștia constau dintr-
un strat subțire de semiconductor depus pe sticlă sau pe un alt material izolator și
protejat împotriva deteriorării atmosferice fie de un vid, fie de o peliculă subțire
de lac. Absorbția radiației crește conductivitatea stratului prin deplasarea
electronilor. Dacă se aplică o diferență de potențial constantă peste strat,
curentul care circulă va crește semnificativ atunci când se absoarbe radiația.
Detectarea radiației infraroșii medii și îndepărtate necesită detectoare
termice, dintre care cel mai simplu este termocuplul, în care modificarea
temperaturii la o joncțiune a termocuplului are ca rezultat producerea unei mici
tensiuni. Cu toate că sunt simple din punct de vedere constructiv, termocuplele nu
sunt sensibile. Bolometrele sunt mai sensibile și se bazează pe faptul că, pe
măsură ce temperatura unui conductor
70 Spectroscopie
variază, la fel și rezistența sa. Un conductor adecvat (o placă de nichel sau un

termistor) este încorporat într-un circuit în punte Wheatstone prin care se trece un
curent constant. Atunci când radiația lovește elementul de detecție, rezistența
electrică se modifică și se poate măsura o modificare corespunzătoare a
curentului.
Curent generat
200 400 600 800

Figura 2.27 _ Răspunsul spectral al elementelor catodice din tuburile fotoemisive.

Diferite combinații de elemente răspund în moduri diferite la anumite intervale de
lungimi de undă și sunt adecvate numai pentru regiunile spectrale specificate: calciu-
antimoniu (A); sodiu-potasiu-zahăr-antimoniu (B); argint-zahăr (C).
2.3.4 Materiale optice

Sticla normală va transmite numai radiații între aproximativ 350 nm și 3 µ,m
și, prin urmare, utilizarea sa este limitată la regiunile vizibile și infraroșii
apropiate ale spectrului. Materialele adecvate pentru regiunea ultravioletă
includ cuarțul și siliciul topit (figura 2.28). Alegerea materialelor pentru
utilizarea în regiunea infraroșie prezintă unele probleme și majoritatea sunt
halogenuri de metale alcaline sau halogenuri de metale alcalino-pământoase,
care sunt moi și susceptibile de a fi atacate de apă, de exemplu, sarea gemă și
bromura de potasiu. Probele sunt adesea dizolvate în solvenți organici
adecvați, de exemplu tetraclorură de carbon sau disulfură de carbon, dar,
atunci când acest lucru nu este posibil sau convenabil, se prepară un amestec
de probă solidă cu bromură de potasiu și se presează într-o pastilă în formă de
disc, care este plasată în calea luminii.
2.3.5 Sisteme optice

Un fotometru de bază (figura 2.17) este un instrument cu un singur fascicul în
care există un singur traseu de lumină, iar instrumentul este standardizat
folosind o soluție albă, care este înlocuită cu proba pentru a obține o citire.
Problema majoră a unui proiect cu un singur fascicul constă în faptul că
valoarea absorbției înregistrată pentru
Absorbanța I
I
I
\ I
\ 'i
\ IC
\ \
o\
''
\
' .....
\\' ,.. '""'":.=.:..
.
'--
-----.:.:::...-..:.--
Figura 2.28 Caracteristicile de transmisie ale diferitelor materiale optice: (A) sticlă,
(B) plastic, (C) sticlă de siliciu, (D) cuarț.
eșantion poate fi rezultatul altor factori, precum și al proprietăților absorbante

ale eșantionului. Fluctuațiile în intensitatea sursei de lumină sau instabilitatea
sistemului de detecție vor duce la erori, în timp ce faptul că absorbția
martorului alb variază la diferite lungimi de undă înseamnă că procedura de
reglare trebuie reluată de fiecare dată când se schimbă lungimea de undă.
Pentru a minimiza aceste erori potențiale și pentru a permite automatizarea
sau măsurarea absorbției la lungimi de undă variabile, este necesar să se
introducă un semnal de referință constant prin utilizarea unui sistem optic cu
fascicul dublu (figura 2.29).
Într-un instrument cu fascicul dublu, radiația este împărțită în două
fascicule, unul care trece spre detector prin eșantion și altul prin gol. Se poate
utiliza o serie de semisori, care permit ca ambele căi de lumină să funcționeze
simultan sau, alternativ, fasciculul poate fi "tăiat" mecanic, deviind un fascicul
de radiație alternativ de-a lungul fiecărei căi de lumină. Această ultimă
metodă este cea mai frecvent utilizată, deoarece se menține intensitatea
maximă a fasciculului incident și se realizează de obicei cu ajutorul unei
oglinzi rotative de sector. Detectorul primește impulsuri alternative de radiație
care au trecut prin gol și prin eșantion și produce semnale electrice alternative
care sunt direct proporționale cu intensitatea radiației transmise atât de gol cât
și de eșantion. Într-un sistem fotometru de înregistrare a raportului, acest
semnal este rezolvat electric în două tensiuni corespunzătoare semnalelor de
gol și de eșantion, iar prima este utilizată ca potențial de standardizare pentru
un potențiometru de înregistrare. Într-un fotometru optic de echilibrare a
nulului, curentul alternativ este utilizat pentru a alimenta un servomotor, care
acționează un atenuator în calea luminoasă a blank-ului până când intensitatea
fasciculului este exact aceeași cu cea a fasciculului de eșantion. Atenuatorul
este proiectat astfel încât distanța deplasată să fie proporțională cu absorbția
probei și este, de obicei, cuplat mecanic la un sistem de înregistrare cu pix.
72 Spectroscopie
În unele situații, se poate măsura radiația reflectată, mai degrabă decât

cea transmisă, pentru a evalua cantitatea de radiație absorbită de probă. Există
două moduri principale prin care radiația poate fi reflectată. Reflecția
speculară este similară cu reflecția printr-o oglindă și, pentru lucrări
cantitative, unghiurile radiației incidente și ale celei reflectate sunt importante.
Reflexia difuză provine din interiorul straturilor materialului, iar lumina
reflectată este dispersată pe o plajă de 180°. Acest tip de reflexie este măsurat
în cazul filmelor subțiri utilizate în sistemele de chimie uscată. Se folosește
adesea termenul de densitate de reflexie, care este definit într-un mod
comparabil cu absorbția: logaritmul raportului dintre lumina incidentă și cea
reflectată.
Lampă cu
tungsten
Figura 2.29 Diagrama optică a unui spectrofotometru cu fascicul dublu. Lămpile

interschimbabile sunt disponibile pentru lucrul în regiunile vizibilă și ultravioletă, iar
monocromația se realizează cu ajutorul unei rețele de difracție cu reflexie.
Componentele instrumentului sunt similare cu cele ale absorptiometriei,

dar pozițiile lor relative sunt modificate pentru a capta radiația reflectată. În
cele mai multe dintre aceste instrumente, în loc să se încorporeze un
monocromator, se utilizează o diodă emițătoare de lumină (LED) cu o anumită
lungime de undă pentru a produce radiația incidentă.
Principiile absorptiometriei au fost aplicate la măsurarea turbidității.
Suspensiile de particule împrăștie radiația incidentă și, în timp ce nu există o
absorbție a radiației de către substanța de analizat, reducerea radiației
transmise poate fi utilizată ca o măsură a gradului de turbiditate. Deoarece nu
este vorba de absorbție, nu este necesară monocromatizarea, dar faptul că
gradul de dispersie a luminii crește odată cu scăderea lungimii de undă a
radiației incidente explică faptul că unele instrumente încorporează un sistem
simplu de monocromare.
Sensibilitatea tehnicii este considerabil îmbunătățită prin măsurarea

cantității de lumină împrăștiată, mai degrabă decât a luminii transmise. În
astfel de instrumente, cunoscute sub numele de nefelometre, sistemul optic
este mai mult asemănător cu sistemele de reflectanță sau cu fluorimetrele
pentru a detecta mai degrabă lumina împrăștiată decât cea transmisă.
Utilizarea laserelor îmbunătățește considerabil performanțele acestor tehnici,
permițând o proiectare mult mai critică a traseelor de lumină ale
instrumentelor și reducând reflexiile nedorite din cuve etc., care reduc
sensibilitatea instrumentelor mai simple.
Secțiunea 2.3
1. Care dintre următorii factori influențează lungimea de undă a
radiației selectate atunci când se utilizează o rețea de difracție prin
reflexie?
(a) Distanța dintre linii.
(b) Unghiul dintre radiația incidentă și cea reflectată.
(c) Materialul grătarului.
(d) Grosimea grătarului.
2. Care dintre următoarele materiale sunt potrivite ca suporturi de
probe pentru absorbția în ultraviolete?
(a) Plastic.
(b) Sticlă.
(c) Sticlă de siliciu.
(d) Sare gemă.
3. O rețea de reflexie este cel mai potrivit sistem de monocromare
pentru radiațiile ultraviolete.
PENTRU CĂ
o rețea de reflexie va avea o lățime de bandă mai mică decât un filtru
de interferență.
4. Spectrofotometrele în infraroșu utilizează detectoare de tip
fotovoltaic pentru a măsura intensitatea radiației
PENTRU CĂ
electronii sunt deplasați într-o celulă fotovoltaică atunci când radiația
este absorbită.
Fluorescența moleculară implică emisia de radiații pe măsură ce electronii

excitați revin la starea fundamentală. Lungimile de undă ale radiației emise
sunt diferite de cele absorbite și sunt utile pentru identificarea unei molecule.
Intensitatea radiației emise poate fi utilizată în metodele cantitative, iar
lungimea de undă a emisiei maxime poate fi utilizată calitativ. Un număr
considerabil de compuși prezintă fluorescență și aceasta constituie baza unei
metode foarte sensibile de cuantificare. Compușii fluorescenți conțin adesea
sisteme de legături conjugate multiple cu electronii pi delocalizați asociați, iar
prezența grupărilor donatoare de electroni, cum ar fi amina și hidroxilul,
sporește posibilitatea apariției fluorescenței. Majoritatea moleculelor care
prezintă fluorescență au structuri rigide, plane.
74 Spectroscopie
2.4.1 Proiectarea instrumentelor

Radiația fluorescentă este emisă în toate direcțiile și se folosește acest fapt
pentru a evita dificultățile care pot fi cauzate de transmiterea radiației
incidente de către eșantion. Prin deplasarea sistemului de detecție în unghi
drept față de celulă (figura 2.30), se detectează numai radiația fluorescentă.
Unele instrumente sunt concepute pentru a măsura fluorescența "frontală",
adică radiația care este emisă de-a lungul unui traseu luminos sub un unghi
ascuțit față de radiația incidentă. Astfel de măsurători de fluorescență sunt
comparabile cu măsurătorile de reflectanță.
Sursa de Primar
-
monocromator Eșantion
W1
interesant
rad;,tio, t
1
'
,,O:/--- I /
Lumina
transmisă
/ I
/
/
I-
''
Ct>
/ I, ',,.
I
Lumina emisă
I
I
I
Monocromator secundar
Detector
Figura 2.30
Proiectarea fluorimetrului.
În pofida măsurării radiației emise prin aceste mijloace, este încă posibil
ca radiația incidentă împrăștiată sau reflectată să ajungă la detector. Pentru a
preveni acest lucru, fluorimetrele necesită un al doilea sistem monocromator
între eșantion și detector. Multe fluorimetre simple utilizează filtre ca
monocromatori primari și secundari, dar acele instrumente care utilizează
adevărați monocromatori optici pentru ambele componente sunt cunoscute
sub numele de spectrofluorimetre. Alte instrumente încorporează un sistem
simplu de filtre de tăiere pentru radiația emisă, păstrând în același timp
monocromatorul optic pentru radiația de excitație. Deoarece lungimile de
undă atât ale excitației, cât și ale emisiei sunt caracteristice moleculei, este
discutabil care monocromator este cel mai important în proiectarea unui
fluorimetru.
2.4.2 Metode fluorimetrice

Pentru a selecta condițiile de funcționare pentru orice metodă fluorimetrică,
trebuie determinate spectrele de excitație și emisie ale analitului. Figura 2.9
ilustrează faptul că un spectru de emisie este o imagine aproximativ în oglindă a
spectrului de excitație, acesta din urmă fiind similar cu spectrul de absorbție al
compusului. Principalul avantaj al tehnicilor de fluorescență este sensibilitatea lor,
fiind adesea posibilă măsurarea unor cantități de nanograme (10-9 g). Motivul
sensibilității crescute a fluorimetriei față de cea a spectrofotometriei de absorbție
moleculară constă în faptul că măsurătorile prin fluorescență utilizează o soluție
albă nefluorescentă, care dă un semnal zero sau minim din partea detectorului.
Măsurătorile de absorbție, pe de altă parte, necesită o soluție albă care transmite
cea mai mare parte a radiației incidente și determină un răspuns mare din partea
detectorului. Senzitivitatea măsurătorilor fluorimetrice poate fi crescută prin
utilizarea unui detector care
să măsoare cu precizie cantități foarte mici de radiații.
Măsurătorile de fluorescență sunt cotate în raport cu o intensitate
maximă standard de fluorescență și se obișnuiește să se standardizeze
instrumentul pentru fluorescența zero (blanc) și 100% fluorescență (standardul
cel mai înalt). Intensitatea fluorescenței tuturor standardelor intermediare și a
probelor de testare se măsoară apoi și se exprimă ca procent din cel mai înalt
standard. Pe un interval limitat de concentrație, intensitatea fluorescenței este
direct proporțională cu concentrația compușilor, dar în practică este
recomandabil să se realizeze o curbă de calibrare pentru fiecare test. Din mai
multe motive, tehnicile fluorimetrice prezintă adesea un grad mai mare de
specificitate decât tehnicile de absorbție comparabile. Mulți compuși care
absorb în ultraviolet nu sunt fluorescenți, iar prezența unor astfel de substanțe
ar putea interfera în analiza de absorbție a unui eșantion, dar nu ar interfera în
cazul unui test fluorimetric. Invers, prezența unei substanțe fluorescente într-o
analiză absorp tiometrică ar reduce absorbția aparentă cu cantitatea de
fluorescență care ajunge la detector. Aceasta este o problemă în cazul
spectrofotometrelor în care monocromatorul se află în fața probei, dar, în
practică, multe instrumente poziționează monocromatorul după probă și
înainte de detector. Probabil că principalul motiv pentru specificitatea
îmbunătățită a tehnicilor fluorimetrice este capacitatea de a identifica și selecta
lungimea de undă de emisie, ceea ce este deosebit de important în situațiile în
care compușii absorb la aceeași lungime de undă, dar prezintă spectre de
emisie diferite.
O dificultate majoră în fluorimetrie este faptul că o gamă largă de substanțe
și condiții pot suprima sau stinge emisia de radiație fluorescentă. Multe molecule
excitate au tendința de a-și pierde energia prin coliziuni moleculare mai degrabă
decât prin fluorescență, iar proporția celor care fac acest lucru crește odată cu
creșterea temperaturii. Probele congelate prezintă adesea o emisie mult mai
intensă decât probele lichide, iar controlul temperaturii în timpul măsurătorilor
este un aspect important. În mod similar, o scădere a pH-ului probei reduce
deseori intensitatea fluorescenței, din cauza legării protonilor de electronii
nelegate. Unele substanțe, în special cele care conțin grupe electrofile (de
exemplu, grupe carboxilice, azoice și halogenuri), pot stinge fluorescența, iar
prezența lor, chiar și în cantități infime, poate reduce semnificativ intensitatea
emisiei. Din această cauză, toate echipamentele trebuie să fie scrupulos de curate,
iar toți reactivii trebuie să fie de cea mai mare puritate.
76 Spectroscopie
Atomii anumitor metale, atunci când sunt încălziți, emit radiații și au fost
elaborate metode de analiză care utilizează lungimea de undă a emisiei pentru
analiza calitativă și intensitatea emisiei în cazul lucrărilor cantitative (tabelul
2.4). Spectroscopia de emisie este cel mai frecvent întâlnită ca fotometrie de
emisie de flacără, care se limitează aproape în întregime la regiunea vizibilă a
spectrului și la acele elemente care sunt ușor de excitat la temperatura unei
flăcări. Alternativ, excitarea poate fi realizată prin intermediul unui arc
electric de înaltă tensiune lovit între doi electrozi. Mai recent, au fost utilizate
temperaturi de până la 10 000 °C, produse de descărcări cu plasmă cuplată
inductiv (ICP), pentru a provoca excitarea atomilor și a oferi niveluri
îmbunătățite de senzitivitate. Fluorescența atomică este o variantă a
fotometriei de flacără în care atomii sunt excitați prin absorbția de radiații și
nu de energie termică. Instrumentele utilizate pentru astfel de măsurători
necesită sisteme optice similare cu cele utilizate în fluorimetria moleculară.
Cu toate acestea, în ciuda potențialului mare de creștere a sensibilității unei
astfel de metode, aceasta este limitată la câteva elemente pentru care sunt
disponibile sursele de radiație de excitație intensă necesare.
Tabelul 2.4 Liniile de emisie ale diferitelor

elemente
Element Alte linii Flăcări potrivite pentru:
Lungimea de undă cea mai potrivită
pentru:
Absorbție "Emisie Absorbție Emisia
atomică de atomică de
flacără flacără
Calciu 422.7 422.7 239 A-Ac N-Ac
Cupru 324.7 324.7 216, 222, 249, etc. A-Ac N-Ac
Fier 248.3 372.0 248,252,373 A-Ac N-Ac
Lantaniu 550.l 579.1 418.495, etc. N-Ac N-Ac
Plumb 283.3 405.8 217,261,368 A-Ac N-Ac
Litiu 670.8 670.8 323,610 A-Ac N-Ac
Magneziu 285.2 285.2 202 A-Ac N-Ac
Mercur 253.6 253.6 A-Ac N-Ac
Fosfor 213.6 526.0 213,214 N-Ac A-H
Potasiu 766.5 766.5 769,404 A-Ac A-Ac
Sodiu 589.0 589.0 589.6, 330 A-Ac A-Ac
Zinc 213.9 213.9 307 A-Ac N-Ac
Linia de emisie cu caractere îngroșate indică metoda aleasă. Cheia

pentru gaze: A, aer; Ac. acetilenă; N. protoxid de azot; H.
hidrogen.
În timp ce fotometria cu emisie de flacără se bazează pe excitarea

atomilor și pe emisia ulterioară de radiații, spectrometria de absorbție atomică
se bazează pe absorbția radiațiilor de către atomii neexcitați. Deoarece
proporția acestora din urmă este considerabil mai mare decât cea a atomilor
excitați, sensibilitatea potențială a tehnicii este, de asemenea, mult mai mare.
2.5.1 Fotometrie de emisie de flacără

Un fotometru cu flacără (figura 2.31) este conceput pentru a provoca
excitarea atomică a analitului și, ulterior, pentru a măsura intensitatea radiației
emise. Un sistem monocromatic este esențial pentru a face distincția între
emisia elementului de testat și alte radiații din flacără.
Flacăra combină atât sursa de radiație, cât și proba atomizată și, prin
urmare, trebuie să fie foarte stabilă pentru a se obține citiri constante.
Temperatura flăcării trebuie să fie suficient de ridicată pentru a excita atomii
care fac obiectul investigației; cu cât flacăra este mai fierbinte, cu atât mai
mare este proporția de atomi care vor fi excitați (tabelul 2.5). Cu toate
acestea, dacă este prea fierbinte, atomii pot fi ridicați la niveluri energetice
mai înalte și electronii pot fi eliminați cu totul, ceea ce duce la ionizare.
- Radiații
emise
Sampl_e_e_
7
I 11
Com
busti
Figura 2.31 Componentele bil Sistem monocromator
unui fotometru cu flacără.
Sursa de
radiații
Proba este transformată într-un aerosol într-un atomizor. Apoi trece

printr-o cameră de expansiune pentru a permite scăderea presiunii gazului și
pentru ca picăturile mari să se depună înainte de a trece în arzător, unde
solventul se evaporează instantaneu, atomii rămânând sub formă de gaz fin
distribuit. Atomii din eșantion care sunt legați în molecule ar trebui să se
descompună la temperatura flăcării atât de rapid încât să se obțină același
efect. În practică, doar o mică parte din eșantion (aproximativ 5%) este
efectiv atomizată, deoarece dimensiunea picăturilor din restul de 95% este
atât de mare încât apa nu este niciodată eliminată în mod eficient. În flăcările
la temperaturi scăzute, de exemplu, doar un atom de sodiu din aproximativ
60000 este excitat, dar, în ciuda acestei eficiențe aparent scăzute, tehnica este
foarte sensibilă.
Se poate utiliza oricare dintre sistemele monocromatice descrise
pentru absorptiometre, deși modelele mai ieftine de fotometre de flacără
folosesc de obicei sisteme de filtre. În aceste cazuri, interferența altor
elemente la nivelul undelor-
78 Spectroscopie
lungimile de undă apropiate de lungimea de undă de testare pot fi o problemă

reală, dar datorită intensității emisiei este posibilă reducerea lățimii de bandă
prin utilizarea unor filtre foarte dense. În multe instrumente, utilizarea filtrelor
de interferență îmbunătățește specificitatea analizei.
Tabelul 2.5 Combustibili pentru tehnicile spectroscopice de flacără
Combustibil Oxidant Observații Temperatura

(OC)
Propan Aer Flacără de temperatură scăzută

potrivită
Butan Aer pentru atomii ușor excitabili, cum ar 1900
fi
ca Na, Li, K și Ca
Acetilenă Aer Flacără de temperatură medie
potrivit pentru majoritatea emisiilor 2300
analize, de exemplu, Mg, Mn și Sr
Acetilenă Nitrous Este necesară flacăra de înaltă
temperatură
oxid pentru elementele mai retractile, 3000
De exemplu, p
Prezența unor concentrații mari de alte elemente în probă poate nu

numai să supună la stres sistemul monocromatic, ci și să provoace suprimarea
emisiei atomilor investigați, fenomen cunoscut sub numele de efect de matrice.
În astfel de situații, este adesea necesar să se pregătească soluții standard care
să conțină cantități echivalente de elemente perturbatoare. Efecte similare pot
rezulta, de asemenea, din diferențe semnificative de vâscozitate sau densitate
între eșantion și etalon, adesea cauzate de prezența proteinelor. Diferiți anioni,
cum ar fi fosfatul și aluminatul, pot complexa cationii care sunt măsurați și pot
da citiri fals scăzute. Acest lucru poate fi contracarat prin utilizarea agenților
chelați organici, de exemplu EDTA sau acidul citric, care, deși leagă cationii
înșiși, se descompun ușor în flacără în comparație cu fosfații și aluminatele
foarte stabile. Utilizarea clorurii de lantan și, mai puțin eficient, a clorurii de
stronțiu, este probabil cea mai convenabilă metodă de depășire a efectului unei
astfel de interferențe anionice. Acești cationi leagă anionii care interferează și
sunt eventual precipitați atunci când se formează aerosolul, lăsând cationii de
testare disponibili pentru excitare. În absența unor astfel de cationi protectori,
este posibilă descompunerea termică a complexelor de fosfat și aluminat prin
utilizarea flăcărilor la temperaturi mai ridicate, dar trebuie să se acorde atenție
acestei abordări, deoarece poate apărea o ionizare nedorită. Astfel de
interferențe anionice sunt adesea relevante pentru spectroscopia de absorbție
atomică.
Metodele cantitative care utilizează fotometria cu emisie de flacără nu
pot fi
absolută, deoarece o proporție necunoscută, deși relativ constantă, din eșantion
va ajunge la flacără, din care doar o proporție mică de atomi va fi efectiv
excitată și va emite ulterior radiații. Prin urmare, este esențial să se
construiască curbe de calibrare pentru orice analiză. Radiația emisă de flacără
atunci când se pulverizează solventul pur este utilizată pentru a pune la zero
instrumentul, iar citirea maximă este stabilită atunci când se pulverizează
standardul cu cea mai mare concentrație.
Se pulverizează apoi o gamă de soluții standard și se trasează un grafic de

calibrare. Ca și în cazul măsurătorilor de fluorescență, intensitatea emisiei este
raportată ca procent din emisia celei mai înalte soluții etalon, iar pe un interval
limitat de concentrație există o relație liniară între procentul de emisie și
concentrația atomilor (figura 2.32).
Procentul de emisie 100
Concentrația de ioni de calciu exprimată ca

procent din concentrația maximă
Figura 2.32 Fotometrie cantitativă de flacără. Liniaritatea relației dintre
concentrație și procentul de emisie devine mai bună pe măsură ce intervalul de
concentrație devine mai mic. Concentrațiile maxime pentru curbele de calibrare
sunt (A) 25 mmol 1-1, (B) 2,5 mmol 1-1 și (C) 0,25 mmol 1-1.
În plus față de emisia datorată elementului de testare, flacăra însăși

emite radiații. Această emisie de fond, împreună cu turbulențele din flacără,
determină fluctuații ale semnalului și împiedică utilizarea detectoarelor foarte
senzitive. Problema poate fi redusă în mod semnificativ prin introducerea în
eșantion a unei cantități constante de element de referință și prin utilizarea
unui fotometru de flacără cu două canale, care este capabil să înregistreze
simultan atât citirile de test, cât și cele de referință. Raportul dintre intensitatea
emisiei elementului de testat și cea a elementului de referință nu trebuie să fie
afectat de fluctuațiile flăcării, iar o linie de calibrare care utilizează acest
raport pentru diferite concentrații ale elementului de testat constituie baza
metodei cantitative. Sărurile de litiu sunt utilizate în mod frecvent ca element
de referință în analiza probelor biologice.
2.5.2 Spectroscopia de emisie în plasmă

Atomii pot fi excitați folosind nivelurile înalte de energie asociate cu plasma
cuplată inductiv (ICP) în locul unei flăcări. O astfel de metodă de excitare este
mult mai eficientă și permite analiza elementelor care depășesc domeniul de
aplicare al simplei
80 Spectroscopie
tehnicile de emisie de flacără, cum ar fi elementele refractare de bor, fosfor și

tungsten. Temperatura ridicată elimină multe dintre efectele de interferență,
iar instrumentul este proiectat cu o serie de tuburi fotomultiplicatoare setate
pentru diferite lungimi de undă de emisie ale unor elemente specifice, permițând
analiza multielementară a probelor. Metoda este foarte sensibilă și specifică.
Descărcarea ICP este cauzată de efectul unui câmp de radiofrecvență
asupra gazului argon care curge printr-un tub de cuarț. Frecvența de mare
putere provoacă o schimbare a câmpului magnetic în gaz, ceea ce are ca
rezultat un efect de încălzire. În acest mod se pot produce temperaturi de
9000-10000°C.
2.5.3 Spectrofotometrie de absorbție atomică

Atunci când atomii sunt dispersați într-o flacără, marea majoritate rămân în
starea fundamentală și doar o proporție foarte mică este excitată termic. Dacă
un fascicul de radiație policromatică este trecut printr-o astfel de flacără,
atomii în stare fundamentală vor absorbi lungimea de undă corespunzătoare
și, pentru fiecare element, se poate demonstra o serie de benzi de absorbție în
radiația transmisă. Aceste benzi de absorbție vor corespunde excitării
electronilor de valență și, deși energia necesară pentru o astfel de excitare
variază considerabil de la un element la altul, nivelurile de energie pentru un
singur element sunt foarte limitate și au ca rezultat benzi de absorbție foarte
înguste (de exemplu, 0,001 nm). Pentru atomii de metale sau semimetale,
energia poate fi furnizată de radiații în intervalul 200-900 nm, dar pentru toate
elementele neconductoare (izolatori) energia necesară este foarte mare și ar fi
nevoie de radiații din regiunile ultraviolete îndepărtate și cu raze X.
Proporția de radiație incidentă care este absorbită de atomii din flacără
(sau vapori) este măsurată și corelată cu numărul de atomi din flacără (figura
2.33) într-un mod direct comparabil cu spectrofotometria de absorbție
moleculară.
Proiectarea instrumentelor
Benzile de absorbție datorate atomilor sunt foarte înguste, iar utilizarea
luminii albe ca radiație incidentă ar sufoca chiar și cel mai bun sistem
monocromator cu radiație neabsorbită de o parte și de alta a benzii de
absorbție. Prin urmare, tehnica spectrofotometriei de absorbție atomică este
fundamentală pentru tehnica de absorbție atomică.
Monocromator Detector
Alimentarea
cu energie
Figura 2.33 Componentele electrică
Sursa de radiații
unui spectrofotometru de
absorbție atomică.
ca radiația incidentă să aibă lungimea de undă, lățimea de bandă și intensitatea

corecte. Această radiație este produsă de o lampă al cărei catod este acoperit
cu atomi ai elementului investigat și care emite radiații cu o lungime de undă
aproximativ identică cu cea care va fi absorbită de atomii neexcitați ai
aceluiași element din flacără.
Plic de sticlă
Fereastră de
material de
transmisie
adecvat
Figura 2.34
O lampă cu catod gol.
O lampă cu catod gol (figura 2.34) constă din doi electrozi sigilați într-
un înveliș de sticlă umplut cu un gaz inert, de obicei argon sau neon. Capătul
win dow al lămpii trebuie să fie dintr-un material adecvat pentru a transmite
radiația emisă și 1s fie cuarț, fie siliciu. Catodul lămpii, de obicei în formă de
cupă, este realizat fie din elementul al cărui spectru este necesar, fie este
acoperit cu acest element, iar aplicarea unui potențial cuprins între 300 și 400
V este de obicei necesară pentru a provoca excitarea atomilor și descărcarea
radiației corespunzătoare. Sunt disponibile lămpi cu catozi care conțin două
sau mai multe elemente cu linii de emisie ușor de distins. Acestea sunt
utilizate pentru analiza mai multor elemente fără a schimba lămpile, deși astfel
de lămpi cu mai multe elemente au tendința de a oferi performanțe mai puțin
satisfăcătoare decât lămpile cu un singur element. Pentru anumite elemente,
au fost proiectate lămpi cu descărcare fără electrozi (EDL), în care excitarea
atomilor se realizează prin frecvențe radio care induc efecte de rezonanță, iar
energia eliberată provoacă vaporizarea și excitarea elementului.
Spectrofotometrele de absorbție atomică cu fascicul dublu sunt
concepute pentru a controla variațiile care pot apărea în sursa de radiație, dar
nu sunt la fel de eficiente ca instrumentele de absorbție moleculară cu fascicul
dublu în reducerea variațiilor, deoarece în tehnicile cu flacără nu există o
probă albă.
Flacăra, pe lângă faptul că conține atomii neexcitați ai elementului, va
emite, de asemenea, radiații datorate excitării termice a unei mici proporții de
atomi și este esențial ca detectorul să fie capabil să facă distincția între radiația
identică transmisă de flacără și cea emisă de flacără. Acest lucru se realizează prin
introducerea unui semnal sau a unei modulații caracteristice în radiația inci
dentală cu ajutorul unei oglinzi segmentate rotative (chopper) sau a unui impuls
indus electric. Acest fascicul pulsat este detectat ca un semnal alternativ, care se
suprapune peste semnalul relativ constant generat de emisia de la flacără.
Diferența dintre cele două semnale este măsurată automat de instrument și se
înregistrează numai lumina emisă de flacără.
Atât designul capului arzătorului, cât și metoda de atomizare a probei
influențează sensibilitatea care poate fi obținută. Capul arzătorului este
proiectat pentru a oferi o flacără lungă și îngustă, astfel încât cât mai mulți
atomi posibil să fie prezenți în calea luminii. Acesta trebuie menținut
impecabil de curat pentru a reduce la minimum
82 Spectroscopie
emisia de fond, iar poziția pe traseul luminii trebuie reglată pentru a obține o
sensibilitate maximă, poziția exactă depinzând nu numai de gazele arse, ci și
de debitul acestora. Proporția dintre combustibil și oxidant modifică
caracteristicile flăcării, o proporție mare de combustibil ducând la o flacără cu
proprietăți reducătoare, în timp ce un exces de oxidant dă o flacără oxidantă.
Pentru fiecare element analizat trebuie determinate proporțiile optime.
Designul de bază al unui atomizor este același cu cel pentru spectroscopia
cu emisie de flacără (figura 2.35). Metoda de producere a unui aerosol presupune
pulverizarea probei în aer sau în gaz oxidant. Picăturile mai mari se precipită pe
deflectoarele din
Flacăr
Gaz
combust ă A...
ibil
j
le
t
Figura 2.35 gaz j
Un atomizor de Scurgere
pulverizare.
camera de expansiune și curgerea către deșeuri. Gazul combustibil este introdus și

componentele (combustibil, oxidant și eșantionul de aerosoli) sunt amestecate
înainte de a trece la arzător.
Sunt necesare sisteme monocromatice de înaltă calitate pentru a izola
linia de emisie necesară a elementului de liniile de emisie datorate gazelor
care sunt prezente în lampă. Din cauza lățimii de bandă foarte înguste a
liniilor de emisie atomică, nu este suficient să se selecteze pur și simplu
lungimea de undă dorită folosind scala monocromatorului, ci trebuie să se
aplice o procedură cunoscută sub numele de "peaking up". Lungimea de undă
a liniei de emisie necesară poate fi obținută din literatura de specialitate, iar
monocromatorul este setat inițial la această valoare. În timp ce lampa
funcționează, monocromatorul se reglează pentru a obține un răspuns maxim
din partea detectorului. În unele cazuri, din cauza prezenței unor elemente
perturbatoare, poate fi necesar să se utilizeze o altă linie de emisie decât linia
de rezonanță pentru elementul de testare, în ciuda pierderii de sensibilitate pe
care aceasta o provoacă. Spre deosebire de spectrofotometria de absorbție
moleculară, în spectrofotometria de absorbție atomică, specificitatea este mai
degrabă a sursei de radiație decât a sistemului monocromatic.
Tehnicile convenționale cu flacără prezintă probleme atunci când se
lucrează cu eșantioane mici sau solide și, pentru a depăși aceste probleme, a
fost dezvoltată tehnica de atomizare electrotermică. Atomizoarele
electrotermice, sau fără flacără, sunt dispozitive încălzite electric care produc
un abur atomic (figura 2.36). Un tip de cuvă constă într-un tub de grafit care
are un mic orificiu de injecție forat în suprafața superioară. Tubul este ținut
între electrozi, care furnizează curentul pentru încălzire și care sunt, de
asemenea, răciți cu apă pentru a readuce rapid tubul la o temperatură ambiantă
după atomizare.
---
Intrarea probei
Figura 2.36 Tub de grafit Suporturi din oțel

Un atomizor pentru
electrotermic. încălzire și
răcire
Proba se introduce în cuvă fie cu ajutorul unei micropipete, fie sub

formă de porție cântărită. Este evident că aceste manipulări reprezintă o sursă
potențială de erori și că trebuie să se acorde o atenție deosebită în această
etapă. Prima etapă a analizei este încălzirea probei (cenușare) pentru a elimina
solvenții și pentru a distruge matricea. Prezența oricărui material organic în
probă va produce fum sau particule de carbon și va interfera cu orice
măsurători de absorbție efectuate în același timp. Trebuie să se acorde atenție
alegerii temperaturii de incinerare pentru a se asigura că matricea probei este
distrusă și că fumul rezultat este eliminat fără a se pierde vreun element de
testare înainte de etapa analitică. Acest lucru este deosebit de important în
cazul elementelor mai volatile, cum ar fi mercurul și plumbul.
Când cenușa este completă, temperatura cuvei este ridicată rapid la
temperatura de atomizare, care este de obicei cu aproximativ 1000°C mai
mare decât temperatura de cenușare. Acest lucru provoacă vaporizarea probei
și o creștere tranzitorie (2-5 secunde) a absorbanței. Spectrofotometrele de
absorbție atomică trebuie să fie capabile să detecteze și să înregistreze această
valoare maximă a absorbanței (figura 2.37). Cuva este curățată după analiză
printr-o nouă creștere a temperaturii de câteva sute de grade. Atunci când
probele conțin o cantitate mare de proteine sau alte materii organice, pot fi
necesare încălziri repetate sau curățare mecanică.
Deși atomizoarele electrotermice prezintă anumite avantaje, acestea sunt
mai lente decât tehnicile cu flacără, în special atunci când trebuie analizat un
număr mare de probe, iar citirile tranzitorii care rezultă din astfel de metode
pot avea o precizie mai slabă decât citirile constante obținute prin aspirarea
probei.
Un sistem de microeșantionare cunoscut sub numele de cupa lui Delve
este un hibrid al tehnicilor cu flacără mică și cu flacără. Eșantionul este plasat
într-un creuzet mic, care este ținut în flacără cu ajutorul unei bucle de sârmă.
Proba este cenușată într-o parte mai rece a flăcării și apoi este mutată în
partea mai fierbinte pentru a provoca vaporizarea rapidă a elementului. Cupa
este ținută sub o deschidere a unui tub de nichel sau de aluminiu care se află
în calea luminoasă a instrumentului. Vaporii atomici
84 Spectroscopie
este reținut în tub pentru o perioadă scurtă de timp (până la 10 secunde) în timp
ce se efectuează măsurătorile de absorbție.
\ I
Gol I I I
Curățarea tuburilor
♦ Atomizați
I l Cen
I
::l
'
- ușă-
( Uscat
I
Figura 2.37 Analiza cromului prin spectrofotometrie de absorbție atomică
utilizând atomizarea electrotermică.
Secvența de analiză (monitorizare la 357,9 nm)
Uscat 200°c 25 s
Ash 1400°C 30 s
Întârziere 10 s
Atomizați 2950°C 5s
Întârziere 10 s
Curățarea tuburilor 3100°C 5s
Întârziere 10 s
Gol 2950°C 5s
(Reproducere cu permisiunea lui G. Murray, Clinical Chemistry Department, Doncaster

Royal Infirmary, Regatul Unit.)
Efecte de interferență
Spectroscopia de absorbție atomică este extrem de specifică și există foarte puține
cazuri de interferență din cauza liniilor de emisie similare de la elemente diferite.
Efectele generale de interferență, cum ar fi efectele anionice și de matrice, sunt foarte
asemănătoare cu cele descrise în cadrul fotometriei cu emisie de flacără și, în general,
au ca rezultat înregistrarea unor valori reduse ale absorbției. În mod similar, utilizarea
flăcărilor la temperaturi ridicate poate duce la reducerea valorilor de absorbție din
cauza efectelor de ionizare. Cu toate acestea, ionizarea unui element de testare poate fi
adesea redusă la minimum prin încorporarea unui exces de metal ionizabil, de
exemplu potasiu sau cesiu, atât în etaloane, cât și în probe. lbis va suprima ionizarea
elementului de testare și, de fapt, va crește numărul de atomi de testare în flacără.
Orice ioni care trebuie introduși într-o probă, fie pentru a preveni efectele de
ionizare sau de suprimare (de exemplu, un amestec de lantan și cesiu), fie ca
referință internă (de exemplu, litiu), sunt de obicei încorporați în lichidul de diluție
în care se prepară probele.
Metode cantitative
Relația dintre absorbanță și concentrația probei, așa cum este specificată în
ecuația Beer-Lambert, este valabilă doar într-un interval limitat de concentrație
și, în practică, un grafic de calibrare poate prezenta o anumită curbură.
Principalele motive pentru acest lucru sunt efectele de interferență și lumina
difuză prezentă.
►
Spectroscopia de rezonanță magnetică 85
cu tehnici de flacără datorită lățimii de bandă înguste a liniilor de emisie și a

lățimii de bandă largi a monocromatorului. Evident, alți factori, cum ar fi
instabilitatea flăcării și distribuția probei în flacără, joacă un rol important.
Se obișnuiește să se înregistreze datele în unități de absorbție și, deși o
relație de linie dreaptă este teoretic valabilă, intervalul liniar efectiv nu
depășește de obicei 1,0 unitate de absorbție și, în multe cazuri, poate fi de
numai 0,5 unități de absorbție. Pentru a crește versatilitatea unui instrument,
unii producători încorporează un mod de concentrare în care este posibilă
modificarea sensibilității instrumentului și, astfel, lucrul pe diferite intervale
de concentrație. În cazul în care se utilizează o citire directă a concentrației,
problema neliniarității devine mai gravă și, pentru a încerca să o depășească,
unele instrumente încorporează un dispozitiv de corecție a curburii.
Absorbția radiațiilor electromagnetice care determină tranziții moleculare nu

se limitează la regiunile ultraviolete, vizibile și infraroșii ale spectrului;
energia asociată cu lungimi de undă mai mari, adică microundele și undele
radio, poate fi absorbită și poate determina tranziții moleculare. Spectroscopia
de rezonanță magnetică nucleară (RMN) și spectroscopia de rezonanță de spin
electronic (ESR) sunt exemple de tehnici care depind de proprietățile
magnetice pe care le prezintă nucleele și electronii în anumite situații
moleculare. Acestea sunt instrumente utilizate în studiul structurilor
moleculare și al reacțiilor biochimice, cum ar fi cataliza enzimatică.
Proprietățile magnetice sunt manifestate doar de moleculele care au fie
atomi cu un număr impar de masă, fie un număr impar de electroni. Aceste
două caracteristici stau la baza tehnicilor spectroscopice RMN și ESR,
respectiv ESR. Nuclee cu un număr egal de protoni și neutroni vor avea o
distribuție uniformă a sarcinii, la fel ca și un orbital electronic ocupat de
complezența completă a doi electroni cu spini opuși. Un dezechilibru în
oricare dintre acestea va conferi atomului sau orbitalului un moment
magnetic, adică acesta va avea o secțiune încărcată pozitiv și una încărcată
negativ. În condiții normale, nu va exista o orientare preferată, dar dacă
molecula este plasată într-un câmp magnetic, aceasta va tinde să ocupe o
poziție care implică cea mai mică energie și, ca un ac de com pas, se va alinia
cu câmpul magnetic. În cele mai multe cazuri, singura altă orientare posibilă
este într-o poziție direct opusă câmpului magnetic, adică la 180° față de
poziția inițială. Tranziția între aceste două orientări, care se datorează
efectelor câmpului electric, va necesita cuante specifice de energie, care pot fi
furnizate de aspectele magnetice ale radiației electromagnetice într-un mod
comparabil cu absorbția în regiunea ultravioletă și vizibilă a spectrului.
Energia este furnizată de radiațiile din regiunile de microunde și unde
radioelectrice ale spectrului cu lungimi de undă în centimetri sau metri,
corespunzând unor frecvențe de gigahertzi (GHz) și megahertzi (MHz).
Acestea sunt asociate tranzițiilor electronice (ESR) și, respectiv, nucleare
(NMR).
Un nucleu cu momentele sale magnetice aliniate cu câmpul magnetic este
se spune că prezintă o aliniere "paralelă", în timp ce starea de tranziție cu energie mai mare se spune că este
"paralelă".
86 Spectroscopie
să fie "antiparalele". Pentru momentele magnetice ale electronilor, termenii

utilizați sunt "up-spin" și "down-spin", acesta din urmă fiind starea de energie
superioară.
Tabelul 2.6 Elemente importante în studiile RMN ale compușilor biologici
Grup de compuși Atomi relevanți Apariție

naturală (%)
Toate JH 100
13c l
Nucleotide
Fosfolipide 31p 100
Compuși fosforilați
Aminoacizi t4N 99.9

Peptide 15N 0.4
Proteine 33s 0.7
Înlocuitor pentru hidrogen 2H 0.2

19p
Există un număr apreciabil de elemente cu numere de masă atomică

impare, deși unele dintre ele sunt rare și au o frecvență naturală redusă. Cele
care sunt utile în aplicațiile biologice ale RMN sunt prezentate în tabelul 2.6.
Printre acestea se numără atomul de hidrogen (1H) și izotopul de carbon (13
C), ambele fiind aplicabile la toți compușii biochimici. Izotopii fosfo rusului
(31P) și ai azotului (15 N) sunt utili în studiul nucleotidelor și al aminoacizilor
sau al derivaților acestora. Nucleul de hidrogen este deosebit de util, dar
necesită, de obicei, ca studiile RMN să fie efectuate într-un solvent lipsit de
protoni, apa deuterată, D2 O, fiind cel mai frecvent utilizată. Cu toate acestea,
este posibil să se analizeze probe apoase prin saturarea semnalului datorat apei
prin aplicarea unui impuls lung (1-2 s) de radiație la frecvența apei. Acest
lucru echilibrează nucleele de hidrogen între diferitele lor niveluri de energie
și, după ce radiația de saturație este oprită, dar înainte ca atomii de hidrogen să
revină la starea lor fundamentală (relaxare), proba este scanată cu un impuls
scurt de radiație. Numărul de molecule cu orbitali cu un singur electron, și
deci
adecvată pentru ESR, este limitată din cauza caracteristicii de partajare a
electronilor din legătura covalentă obișnuită. Acest lucru tinde să limiteze
utilizarea sa la compușii care conțin metale de tranziție și la reacțiile care
implică radicali liberi. Totuși, acest lucru face ca ESR să fie foarte utilă pentru
monitorizarea reacțiilor care implică metaloenzime sau radicali liberi.
2.6.1 Instrumentație
Tehnica de bază a spectroscopiei de rezonanță magnetică presupune plasarea
probei într-un câmp magnetic generat între polii unui magnet permanent sau
ai unui electromagnet. Energia pentru tranziție este produsă de un generator
de radiofrecvență, iar intensitatea semnalului este măsurată de un receptor
radio (figura 2.38). Detectarea semnalelor radio nu necesită
Spectroscopia de rezonanță magnetică
87
un traseu de lumină optică, ca în spectroscopia ultravioletă/vizibilă, iar în

unele instrumente, aceeași sondă (antenă/aer) este utilizată atât ca emițător, cât
și ca receptor, cu schimbări foarte rapide de la o funcție la alta.
Tub de probă
Bobină Bobine de solenoid

emițător/rec
eptor
Figura 2.38 Diagrama unei sonde RMN. Bobinele solenoidale de pe fețele polare ale
magnetului produc câmpul magnetic variabil. Direcția câmpului magnetic prin eșantion
este indicată cu M.
Energia necesară pentru a provoca o tranziție depinde nu numai de

caracteristicile moleculare/atomice ale substanței de testat, ci și de intensitatea
câmpului magnetic care trebuie depășit în timpul tranziției. În cazul în care
tehnica ar fi direct comparabilă cu spectroscopia ultravioletă/vizibilă,
caracteristicile de absorbție ar fi monitorizate odată cu creșterea frecvenței
radio. Cu toate acestea, în practică, din cauza dificultăților tehnice legate de
generarea și detectarea unui semnal cu frecvență variabilă, frecvența este
menținută constantă, iar absorbția este monitorizată pe măsură ce se modifică
câmpul magnetic.
Magneții generează un câmp magnetic constant, iar variația necesară este
introdusă de bobine montate pe fețele polare ale magnetului; curentul aplicat
bobinelor constituie baza axei x a spectrului rezultat, a d i c ă e s t e comparabil cu
lungimea de undă într-un spectru de absorbție vizibil. Toți magneții prezintă o
anumită variație a câmpului magnetic pe fața magnetului și, pentru a elimina
efectele acestor diferențe, proba este rotită rapid în câmp. Scanarea RMN este
practic o serie de impulsuri și întârzieri. Un impuls scurt de radiație este aplicat
probei în timp ce câmpul magnetic este scanat. Dacă semnalul datorat apei trebuie
suprimat, există un semnal inițial de saturație la frecvența apei, așa cum s-a
descris anterior. Înainte de a se putea efectua o altă scanare de testare, trebuie să
se lase eșantionul să se relaxeze și, în această perioadă, se poate realiza o nouă
saturație a semnalului apei și se poate repeta procesul. Secvența de evenimente și
colectarea de date sunt automatizate.
88 Spectroscopie
2.6.2 Spectrul
Este posibil din punct de vedere tehnic, dar foarte dificil, să se măsoare
frecvența exactă a unui semnal radio și, în practică, frecvența energiei
absorbite de un compus de testare (denumită de obicei frecvență de rezonanță)
este măsurată în raport cu cea a unui compus de referință. Acest compus de
referință poate fi amestecat cu proba (referință directă) sau, în cazul în care
contaminarea probei nu este de dorit, poate fi plasat într-un recipient separat în
tubul de probă (referință externă). În RMN de protoni și13 C, compusul de
referință utilizat de obicei este TMS (tetra metil silan) sau derivatul său solubil
în apă DSS (acid 2,2-dimetil-silapentan-5-sulfonic). Acești compuși dau un
vârf de protoni ascuțit în partea dreaptă a unui spectru RMN tipic (figura
2.39).
Diferența dintre vârful testului și vârful de referință este cunoscută sub
numele de "deplasarea chimică" a testului. Aceasta este o scală de frecvență
normalizată pentru a da vârfului de referință o valoare zero.
Deplasarea chimică = -sampl-e fr-equen-cy - -ref-ere-nce-fre-quency X 106

frecvența de referință
OH CH2
6 5 4 3 2 0
6 5 4 3 2 0
Deplasarea chimică (ppm)
Figura 2.39 Spectrul RMN al etanolului (CH3 CH2 OH). Cele trei vârfuri se datorează
celor trei grupe din compus, care pot fi împărțite în mai multe vârfuri folosind o
rezoluție er ridicată. Vârful cu deplasare chimică zero se datorează compusului de
referință, DSS.
Spectroscopia de rezonanță magnetică
89
Această valoare, fiind un raport, nu are unități de măsură, iar factorul 106
o face să fie o cifră care poate fi îmbătrânită. Prin urmare, valorile deplasării
chimice sunt raportate ca fiind "părți pe milion" (ppm).
Proprietatea de absorbție a unui nucleu este afectată de efectele
magnetice ale nucleelor adiacente. Acest lucru are ca rezultat ceea ce este
cunoscut sub numele de "divizare spin-spin" a
vârful inițial de rezonanță. În general, dacă există n nuclee similare adiacente,
vârful va fi împărțit în n + 1 componente și acest lucru poate oferi informații
despre
modul în care nucleele sunt dispuse în moleculă.
Figura 2.39 prezintă un spectru RMN de protoni al etanolului, un
compus care are trei tipuri diferite de nuclee de hidrogen, cele din CH3 , cele
din CH2 și cel din grupa OH. Aceste trei tipuri de nuclee absorb energia la
frecvențe diferite și, ca urmare, dau trei vârfuri de rezonanță în spectru.
Suprafața integrată sub fiecare vârf este proporțională cu numărul de protoni
din grup, iar poziția vârfului de rezonanță pe scală (deplasarea chimică) este
caracteristică mediului molecular special în care se găsesc protonii, adică
grupului specific. Vârful din partea dreaptă a spectrului cu deplasarea chimică
zero este vârful de referință al DSS.
Atunci când se produce un spectru cu rezoluție mai mare, unele vârfuri
sunt împărțite în mai multe vârfuri. Protonii de metil, fiecare dintre ei având
aceeași deplasare chimică, sunt
toate afectate de cei doi protoni metilenici, rezultând trei vârfuri față de cel
inițial (adică n + 1). În mod similar, cei doi protoni ai metilenului
ene sunt afectate de cei trei protoni din gruparea metil, ceea ce duce la
divizarea în patru a vârfului metilenic unic.
2.6.3 Aplicații
Aplicațiile biologice ale RMN includ studiul structurii macromoleculelor, cum ar
fi proteinele și acizii nucleici, precum și studiul membranelor și al reacțiilor
enzimatice. Metodele și instrumentele mai noi au depășit, în mare măsură,
dificultățile tehnice întâlnite în cazul probelor apoase, iar analiza fluidelor
corporale este posibilă, permițând determinarea atât a conținutului, cât și a
concentrației multor metaboliți din urină și plasmă. RMN nu este o tehnică foarte
sensibilă și este adesea necesară concentrarea probei, fie prin liofilizare și
dizolvare într-un volum mai mic, fie prin metode de extracție în fază solidă.
Principiile spectroscopieiESR sunt foarte asemănătoare cu cele ale
spectroscopiei RMN, dar tehnica oferă informații despre delocalizările de electroni
mai degrabă decât despre structura moleculară și permite studierea reacțiilor de
transfer de electroni și formarea de intermediari paramagnetici în astfel de reacții.
În anumite situații, se pot obține informații privind structura moleculară atunci
când grupările protetice adecvate fac parte dintr-o moleculă, de exemplu FMN
(mononucleotidă de flavină) în anumite enzime sau gruparea hem din
hemoglobină. Uneori este posibil să se atașeze grupuri adecvate la molecule
pentru a permite monitorizarea reacțiilor acestora prin tehnici ESR. Aceste "mărci
de spin", așa cum sunt denumite, sunt de obicei radicali nitroxizi de tipul
90 Spectroscopie
Secțiunile 2.4/5/6
l. Care dintre următoarele tehnici spectroscopice implică măsurarea
radiației absorbite?
(a) Fluorescență.
(b) Spectroscopia de emisie de flacără.
(c) Spectroscopia de absorbție atomică.
(d) Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară.
2. În care dintre următoarele tehnici are importanță relația Beer-
Lambert?
(a) Fluorescență.
(b) Spectroscopia de emisie de flacără.
(c) Spectroscopia de absorbție atomică.
(d) Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară.
3. Un fluorimetru trebuie să aibă o sursă de radiație
ultravioletă, pentru că
fluorescența implică întotdeauna emisia de radiații ultraviolete.
4. Tehnica spectroscopiei de absorbție atomică are nevoie de o sursă
de radiație monocromatică, cum ar fi o lampă cu catod gol, pentru
că
flacăra în spectroscopia de absorbție atomică conține numai atomi de
analit neexcitați care absorb radiația.
Willard, H.H., Merritt, L.L., Dean, J.A. și Settle, F.A. (1988) Instrumental methods of
analysis, ediția a 7-a, Wadsworth Publishing Co., SUA.
Metcalfe, E. (1987) Atomic spectroscopy and emission spectroscopy, John Wiley, UK.
Hollas, J.M. (1996) Modern spectroscopy, ediția a 3-a, John Wiley, Regatul Unit.
Abraham, R.J., Fisher, J.P. și Loftus, P. (1992) Introduction to NMR spectroscopy,
John Wiley, Regatul Unit.
Harris, D.A. și Bashford, C.L. (eds) (1987) Spectroscopy and spectrofluorimet,y- a
practical approach, IRL Press, UK.
Thomas, M.J.K. (1996) Ultraviolet and visible spectroscopy, John Wiley, UK.
3 Metode de separare
• Principii ale tehnicilor de separare

• Metode bazate pe polaritate
• Metode bazate pe natura ionică
• Metode bazate pe mărime
• Metode bazate pe formă
Una dintre dificultățile majore în analiza probelor biologice este prezența

unor substanțe care pot fi confundate cu cea care face obiectul
investigației. Acest lucru înseamnă că este adesea necesar fie să se izoleze
substanța de testat, fie să se elimine substanța care interferează înainte de a
putea continua analiza. Chiar și prezența unor substanțe care sunt foarte
diferite de cea care face obiectul investigației poate afecta adesea calitatea
rezultatelor analizei. Din acest motiv, multe metode includ o etapă
preliminară de separare. Proteinele sunt substanțe care interferează
frecvent în probele biologice, iar acestea pot fi îndepărtate prin tehnici
precum dializa, ultrafiltrarea și cromatografia pe gel. Alternativele includ
precipitarea proteinei cu concentrații mari de săruri, acizi organici sau
solvenți sau prin încălzire (tabelul 3.1). Proteina precipitată poate fi
ulterior eliminată fie prin filtrare, fie prin centrifugare. Deoarece multe
molecule nepolare mici sunt solubile prin legarea la proteine, acestea vor
fi, de asemenea, îndepărtate împreună cu proteina și, pentru a cuantifica
aceste substanțe, este necesar să se rupă aceste complexe, adesea prin
extracție într-un solvent organic, înainte de a îndepărta proteina
precipitată.
Deși eliminarea substanțelor care interferează este o aplicație
importantă a metodelor de separare, acest capitol se referă mai mult la
utilizarea acestor proceduri pentru a izola, identifica sau cuantifica o anumită
substanță sau un grup de substanțe în prezența altor substanțe foarte
asemănătoare. Cuantificarea unui aminoacid în prezența altor aminoacizi este
doar un exemplu de astfel de problemă analitică.
92Metode de separare
Tabelul 3.1Precipitanți proteici
Agent de precipitareConcentrația
finală în amestec
Anionic
Acid percloric Acid 1.0 mo! 1-1
picric Acid 10 g 1-1
25 g 1-1
salicilsulfonic Acid
tricloroacetic Acid 10 g ,-1
tungstic Tungstat de sodiu 10 g 1-1 ,
acid sulfuric 0.05 mo! 1-1
Cationic
Hidroxid de zinc Sulfat de zinc 10 g 1-1 ,
hidroxid de sodiu 0,05 mo! 1-1
Tungstat de Sulfat cupric 5,0 g 1-1 ,
tungstat de sodiu 2,5 g 1-1
cupru
Neutru
Sulfat de sodiu
(și alte săruri)
Solvenți organici
Acetonă 63% (v/v)
Cloroformă 25% (v/v)
Etanol Metanol 70% (v/)
75% (v/v)
Toate procedurile de separare depind în primul rând de anumite caracteristici

fizice ale compușilor. Este relativ ușor de separat substanțe care au
caracteristici fizice semnificativ diferite prin tehnici simple, cum ar fi extracția
cu solvent. Cu toate acestea, în cazul în care diferiții compuși sunt similari
între ei, este esențial să se exploateze orice diferențe ușoare dintre ei pentru a
realiza separarea. Tabelul 3.2 enumeră principalele proprietăți fizice care stau
la baza procedurilor de separare.
Este posibil să se exagereze orice diferențe prin repetarea de mai multe
ori a unei manipulări, de exemplu, în cazul extracțiilor secvențiale cu solvent.
Cromatografia pe hârtie este un exemplu de procedură de separare în care se
produce un număr mare de echilibre de par tiție între un solvent organic și apa
din celuloză.
Polaritatea unei molecule este o caracteristică care afectează în mod
semnificativ multe dintre proprietățile sale, în special solubilitatea și
volatilitatea acesteia. Se spune că moleculele sunt polare dacă au un dipol.
Acesta este definit ca fiind o distribuție inegală a electronilor în moleculă,
cauzată de diferențele de electronegativitate ale atomilor implicați. Apa este o
substanță polară deoarece oxigenul prezintă o electronegativitate mai mare
decât hidrogenul și tinde să dezvolte o ușoară sarcină negativă, lăsând atomii
de hidrogen cu o ușoară sarcină pozitivă.
Datorită acestei naturi parțial ionice sau polare, moleculele de apă tind
să se asocieze între ele pentru a forma o structură de rețea stabilizată de aceste
interacțiuni ionice. Alte molecule care prezintă, de asemenea, această natură
parțial ionică se vor integra mai ușor în structura rețelei decât moleculele
nepolare și se vor dizolva în apă. Această atracție între două molecule polare
are și alte efecte în afară de a afecta solubilitatea substanței. În cazul în care
una dintre substanțe este un solid, legarea celorlalte substanțe polare este
cunoscută sub numele de adsorbție, iar puterea legăturilor de adsorbție
reflectă interacțiunile ionice dintre cele două molecule. Tehnicile de separare,
cum ar fi cromatografia gaz-lichid, cro matografia lichidă și cromatografia de
adsorbție, toate depind în mare măsură de interacțiunile polare, iar ușoarele
diferențe de polaritate pot fi utilizate pentru a facilita separarea.
Posibila formare a unui dipol este o caracteristică a legăturii covalente,
dar este evident că o legătură ionică are ca rezultat o distribuție inegală a
electronilor în interiorul moleculei, iar astfel de molecule (sau ioni) sunt
extrem de polare. Cu toate acestea, faptul că poartă o sarcină definită permite
aplicarea unor tehnici suplimentare de separare. Viteza de migrare într-un
câmp electric (electroforeză) și afinitatea pentru ionii de sarcină opusă
(cromatografie de schimb ionic) sunt tehnici extrem de valoroase în separarea
speciilor ionice.
Moleculele care variază în mod semnificativ în ceea ce privește
dimensiunea lor pot fi separate prin ultrafiltrare sau dializă, în timp ce
moleculele care sunt doar puțin diferite ca dimensiune pot fi adesea separate
prin cromatografie cu permeabilitate în gel. Tehnicile de ultracentrifugare,
deși aparent separă pe baza dimensiunii, sunt strict vorbind mai mult
influențate de masa și densitatea moleculei și, într-o măsură mai mică, de
forma acesteia.
Multe molecule prezintă o afinitate definită pentru o altă moleculă pe
baza unei relații de formă, de exemplu enzimele și substraturile lor, anticorpii
și substraturile lor
Tabelul 3.2 Clasificarea tehnicilor de separare
Caracteristica Propriet Tehnica de separare

moleculară atea
fizică
Polaritate Volatilitate Cromatografie gaz-lichid
Solubilitate Cromatografie lichid-lichid
Adsorbtivitate Cromatografie lichid-solid
Ionică Încărcare Cromatografie de schimb de ioni
Electroforeză
Dimensiune Difuzie Cromatografie cu permeabilizare
pe gel
(masă) Dializă
Sedimentare Ultracentrifugare
Formă Legarea ligandului Cromatografie de afinitate
antigene, iar astfel de relații stau la baza unor metode de separare extrem de
utile și specifice, cunoscute în general sub numele de cromatografie de
afinitate.
Clasificarea tehnicilor de separare, așa cum este prezentată în tabelul
3.2, este concisă și ușor de reținut, dar este, de asemenea, simplistă, deoarece
pare să implice faptul că în fiecare tehnică este implicat un singur factor. În
practică, eficacitatea oricărei metode este o combinație de mai mulți factori,
cel indicat în tabel fiind de obicei cel mai semnificativ. Unele dintre evoluțiile
în procedurile de separare exploatează această gamă de factori implicați în
orice tehnică de separare prin utilizarea unor condiții sau reactivi concepuți
pentru a minimiza unul sau a maximiza altul. În consecință, tehnicile și
instrumentarul metodelor de separare sunt în continuă schimbare, dar
principiile fundamentale rămân aceleași și trebuie să fie înțelese pentru a
aprecia utilitatea și limitele oricărei tehnici particulare.
3.1.1 Metode generale de separare

Mișcarea analitului este o caracteristică esențială a tehnicilor de separare și
este posibil să se definească în termeni generali forțele care determină această
mișcare (figura 3.1). Dacă se aplică o forță unei molecule, mișcarea acesteia
va fi împiedicată de o forță de întârziere de un anumit tip. Acest lucru poate fi
la fel de simplu ca și efectul de frecare al deplasării pe lângă moleculele de
solvent sau poate fi efectul adsorbției pe o fază solidă. În multe metode,
intensitatea forței utilizate nu este importantă, dar variațiile forței nete
rezultate pentru diferite molecule constituie baza separării. Cu toate acestea,
în unele cazuri, intensitatea forței aplicate este importantă, iar în tehnicile
ultracentrifugale nu numai că se poate realiza separarea, dar se pot determina
și diverse constante fizice ale moleculei, de exemplu masa moleculară relativă
sau coeficientul de difuzie.
În principiu, există trei moduri în care se pot performa metodele de
separare. Acestea sunt cel mai ușor de descris în legătură cu cromatografia,
dar sunt relevante și pentru alte metode, cum ar fi electroforeza și
ultracentrifugarea.
Metode zonale
În metodele zonale (figura 3.2), proba este aplicată sub formă de bandă sau
zonă, iar separarea are loc într-un sistem de solvenți adecvat, ceea ce duce la
separarea componentelor individuale ale probei în benzi separate. Procesul de
separare poate avea loc în întregime în condiții uniforme (dezvoltare
normală), dar poate fi de dorit să se modifice condițiile în timpul procedurii
pentru a schimba forțele de împingere sau de întârziere pe o bază prestabilită.
O astfel de evoluție a gradientului poate implica modificări treptate ale
condițiilor, cum ar fi pH-ul sau temperatura. În cazul separării zonale,
componentele individuale ale probei sunt separate unele de altele și este
adesea posibil să se utilizeze metoda în mod pregătitor pentru a obține
preparate pure din fiecare componentă, ca în unele forme de cromatografie,
electroforeză și ultra centrifugare.
Metode frontale
Analiza frontală nu implică utilizarea unor sisteme de solvenți separați, ci
separarea are loc în interiorul probei lichide, de obicei ca urmare a unei
componente.
FORȚĂ MOTRICE /
Gravitațională (ultracentrifugare)
Electrocinetică (electroforeză)
Hidrodinamică (cromatografie)
AA6CE
Tehnici
I \
Tehnici cu
monofazate două faze
/4frecare Ads
molecula Solubilitate
ră Solubilitate
Legătură
Electrostatic Interacțiunea ionică
Figura 3.1
O reprezentare a unora
dintre factorii implicați
în tehnicile de separare.
nent care se deplasează mai repede decât altul (figura 3.2). Rezultatul este că
se dezvoltă o serie de limite de con centrație, fiecare dintre ele fiind datorată
unui component al amestecului. Deși numai o mică parte din componenta cea
mai rapidă poate fi obținută efectiv într-o formă pură, mișcarea fiecărei limite
este caracteristică componentei și este posibil să se studieze o componentă,
deși nu se poate avea niciodată un preparat pur. Această tehnică este utilizată
în ultracentrifugare pentru determinarea masei moleculare relative și a
coeficientului de sedimentare.
Metode de deplasare
În unele tehnici cromatografice, componentele unui amestec prezintă afinități
diferite pentru o fază solidă și pot fi îndepărtate din acea fază doar de alte
molecule care au o afinitate mai mare pentru aceasta. Acestea sunt tehnici
zonale, deoarece proba este aplicată sub forma unei benzi sau a unei zone, dar
separarea se realizează cu ajutorul unei soluții de solut de deplasare, mai
degrabă decât cu ajutorul solventului pur (figura 3.2). Solutul este cel care
contează mai degrabă decât solventul. Aceste tehnici
Zonal Deplasare Frontală
Figura 3.2 Trei metode principale în cromatografie. Cea mai comună formă de
cromatografie implică introducerea unui volum mic de probă pe o coloană și este
cunoscută sub numele de cromatografie zonală. Mișcarea în josul coloanei este
efectuată de faza mobilă, care poate fi pur și simplu un solvent (A) care permite
împărțirea moleculelor de analiză între faza staționară și cea mobilă. Alternativ, faza
mobilă poate fi un solvent care conține molecule de solut (B), care deplasează în mod
activ moleculele de test din faza staționară. O metodă mai puțin frecvent utilizată,
cunoscută sub numele de separare frontală (C), nu implică o fază mobilă separată, dar
se lasă un volum mare de probă să treacă prin coloană și, pe măsură ce diferitele
componente se separă, se dezvoltă fronturi de concentrație, a căror mișcare poate fi
monitorizată.
poate fi utilizat într-un mod normal de dezvoltare (adică fără a modifica

compoziția soluției de eluare) sau într-un mod de gradient în care compoziția
soluției de eluare este modificată progresiv.
În timp ce componentele individuale ale amestecului pot fi separate
unele de altele, toate vor fi contaminate într-o anumită măsură cu solutul
de eluat. Tehnici precum cromatografia de schimb de ioni ș i diferite tipuri
de adsorbție ș i cromatografie de afinitate sunt exemple de metode de
dislocare.
3.1.2 Metode generale de detectare

Unele proceduri de detectare implică pierderea probei: de exemplu, în cazul
detectoarelor cu ionizare de flacără utilizate în cromatografia în fază gazoasă,
proba este arsă, în timp ce în cromatografia în fază lichidă adăugarea unui
reactiv colorat va duce, de asemenea, la pierderea probei. Pentru ca astfel de
metode să fie utilizate în cadrul unei analize pregătitoare
este necesar să se împartă fluxul efluent din coloană, testând o parte în mod
normal și colectând restul până când se cunoaște identitatea sau poziția
fiecărui component. În mod normal, în acest scop se utilizează un colector de
fracții. În cazul tehnicilor în strat subțire ș i electroforetice, metodele
distructive de localizare, cum ar fi reactivii coloranți ș i coloranții, pot fi
utilizate în mod pregătitor, fie prin mascarea unei părți a cromatogramei, fie
prin tăierea acesteia în felii ș i colorarea doar a unei părți, restul fiind păstrat
pentru utilizare ulterioară.
Există o serie de metode fizice nedistructive pentru monitorizarea
efluentului dintr-o coloană. Mulți compuși absorb radiații în regiunea
vizibilă sau ultravioletă a spectrului, în timp ce unii sunt fluorescenți. În
absența unor metode de monitorizare specifice, modificările în compoziția
unei soluții pot fi adesea detectate potențiometric, datorită modificărilor de
rezistență, grad de ionizare etc. Modificările concentrației unei soluții tind,
de asemenea, să modifice diverse caracteristici generale, de exemplu,
indicele de refracție.
În cazul în care compusul nu prezintă nicio caracteristică intrinsecă
convenabilă, este posibil să se dezvolte o caracteristică detectabilă prin
modificare chimică și, în special în cazul cromatografiei în strat subțire și al
electroforezei, sunt disponibili numeroși reactivi de localizare care sunt
specifici pentru diferite grupuri de compuși. -
Includerea unui colorant fluorescent în plăcile în strat subțire poate fi
utilizată pentru a detecta substanțele care îi sting fluorescența și, astfel, rezultă
zone întunecate atunci când cromatograma este examinată sub radiații
ultraviolete. Autoradiografia poate fi utilizată, de asemenea, în cromatografia
în strat subțire și în electroforeză, atunci când probele sunt marcate prin radio.
Secțiunea 3.1
1 Care sunt proprietățile pe care le afectează polaritatea unei molecule?
(a) Solubilitate.
(b) Volatilitatea.
(c) Difuziune.
(d) Adsorbție.
2 Care dintre metodele generale de separare pot fi utilizate în
mod pregătitor?
(a) Zonal.
(b) Deplasare.
(c) Frontal.
3 Alcoolul metilic (CH3 0H) este un compus
polar PENTRU CĂ
atomul de hidrogen al unei grupări OH este mai electronegativ decât
oxigenul.
4 Tehnicile cromatografice care utilizează anticorpi pentru a lega analitul
sunt cunoscute sub numele de cromatografie de afinitate.
PENTRU CĂ
anticorpii se leagă în mod specific de antigenul lor corespunzător.
Figura 3.3 prezintă similitudinile dintre acele metode în care polaritatea

diferitelor substanțe de testare este un aspect important. Toate aceste
metode sunt, în esență, cromatografice, un cuvânt inventat inițial de
Tswett în 1906, care în prezent implică separarea componentelor unui
amestec printr-un sistem care implică două faze, dintre care una staționară
și cealaltă mobilă.
POLARITATE
(afinitatea moleculelor asemănătoare între ele)
SEPARARE ÎNTRE DOUĂ FAZE
Solid/Lichid Lichid/Lichid Lichid/Va pour
UN FACTOR IMPORTANT ÎN SEPARARE ESTE
Adsorbție Solubilitat
e
IAR METODELE IMPLICĂ
Adsorbante Două lichide O soluție și

solide imiscibile vaporii săi
METODELE SUNT CUNOSCUTE ÎN GENERAL SUB NUMELE DE
,,,,bas-lichid
, c :hfomatografie
Figura 3.3 Metode de separare în care polaritatea moleculei de testat joacă un rol
important.
Gama de aplicații a diferitelor metode cromatografice depinde în

principal de numărul de faze alternative disponibile. Cromatografia în strat
subțire este limitată la foarte puține faze staționare, dar are la dispoziție o
gamă largă de faze mobile. În cazul cromatografiei gaz-lichid (GLC), există
un număr mare de faze staționare disponibile, în timp ce în cazul
cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) există o gamă largă de
faze staționare și mobile.
►
3.2.1 Cromatografie lichid-solid (adsorbție)

Atunci când o soluție a unui compus polar intră în contact cu un solid fin
divizat, cum ar fi cărbunele sau siliciul, are loc o adsorbție destul de amplă pe
suprafața solidului. Majoritatea adsorbanților sunt polari, fie acizi (de
exemplu, silice), fie bazici (de exemplu, alumină), iar pentru a avea loc un
grad semnificativ de adsorbție este necesară o suprafață mare.
Cărbunele este un adsorbant nepolar care va lega moleculele mari sau
nepolare dintr-o soluție apoasă, dar efectele sale nu sunt foarte previzibile. Cu
toate acestea, au fost dezvoltați mai mulți adsorbanți nepolari sintetici,
cunoscuți sub numele de rășini XAD, care sunt polimeri sintetici, adesea pe
bază de polistiren. Acestea sunt utilizate în principal ca medii pregătitoare
pentru extragerea substanțelor din probe care, după spălarea rășinii, pot fi
eluate din aceasta cu un solvent organic polar.
Efectele de adsorbție ale adsorbanților polari se datorează adesea prezenței
grupărilor hidroxil și formării de legături de hidrogen cu moleculele de solut.
Puterea acestor legături și, prin urmare, gradul de adsorbție crește odată cu
creșterea polarității moleculei de solut. Pentru a separa solutul de adsorbant, este
necesar să se utilizeze un solvent în care solutul se va dizolva și care are, de
asemenea, capacitatea de a deplasa solutul de pe adsorbant. Solvenții care sunt
prea polari vor anula efectele de adsorbție și vor duce la eluția simultană a tuturor
componentelor unui amestec. Tabelul 3.3 enumeră diferite clase de compuși și
unii solvenți obișnuiți în ordinea polarității.
În timp ce se utilizează în mod obișnuit doar un număr mic de
adsorbanți, care sunt toți relativ nespecifici (tabelul 3.4), versatilitatea
cromatografiei de adsorbție se datorează gamei de amestecuri de solvenți care
pot fi utilizate.
Tabelul 3.3 Polaritatea unor solvenți și solvenți selectați
Solut Energia de Solvent Rezistența

adsorbție la solvenți
Hidrocarburi 0.07 c
-i::
Hexan 0.01
Derivați halogenați 1.74 0"'
Benzen 0.32
Aldehide 4.97 0. Cloroform 0.40
00
Esteri 5.27 .5 Acetonă 0.55
Alcooli 6.50 ""'' Piridină 0.71
-
t)
Acizi/baze 7.60 r:: Metanol 0.95
Energia de adsorbție este o măsură a afinității unui solut pentru un adsorbant și variază
de la un adsorbant la altul. Datele de mai sus sunt relevante pentru silice ca adsorbant.
Puterea solventului este o măsură a afinității unui solvent pentru adsorbant. Listele
complete sunt cunoscute sub numele de serii eluotropice și includ amestecuri de
solvenți, precum și solvenții puri de mai sus.
Metode de cromatografie de adsorbție

Separările pot fi realizate utilizând coloane cu dezvoltare zonală, o tehnică
foarte utilă în scopuri preparative și calitative și în HPLC.
oferă un nivel ridicat de selectivitate. Cu toate acestea, tehnicile în strat

subțire sunt deosebit de populare datorită confortului și vitezei lor și sunt
deosebit de utile în analiza calitativă.
Tabelul 3.4 Câteva exemple de adsorbanți și aplicații posibile
Adsorbant Putere Aplicații
Acid silicic (gel de Puternic Steroizi, aminoacizi, lipide

silice) Cărbune de Puternic Peptide, carbohidrați Steroizi,
lemn Puternic esteri, alcaloizi Porfirine
Oxid de aluminiu Puternic Proteine, polinucleotide
Carbonat de magneziu Mediu Proteine
Fosfat de calciu Mediu
Celuloză Slab
Plăcile în strat subțire constau dintr-un strat de adsorbant întins pe un

suport inert, plat, de obicei sticlă, aluminiu sau folie de plastic rigid. Stratul
este, de obicei, stabilizat prin încorporarea în amestec a unui liant, cum ar fi
ghipsul de Paris ( l0%). Plăcile se prepară prin agitarea unui amestec de
adsorbant și agent de legare cu un volum corespunzător de apă. Se întinde un
strat uniform din această suspensie pe plăci curate și se lasă să se întărească.
Plăcile se usucă apoi într-un cuptor și se depozitează într-un desicator.
Variațiile în uniformitatea stratului au ca rezultat diferențe în modelele de
separare, iar plăcile preparate în comerț sunt folosite în general datorită
calității și comodității lor.
Probele se aplică sub formă de pete discrete sau de dungi cu ajutorul
unor capilare sau rnicropipete, în volume cuprinse între 1 și 20 J.Ll. Trebuie
evitată deteriorarea suprafeței pentru a obține un model regulat al
componentelor separate. Trebuie aplicate amestecuri de referință adecvate pe
aceeași placă ca și probele pentru a ajuta la identificarea componentelor
testate.
După ce probele au fost aplicate și uscate, placa este plasată într-un
rezervor care conține solventul (la o adâncime de 0,5-1 cm). Este deosebit de
important, atunci când se utilizează solvenți volatili, ca atmosfera din rezervor
să fie saturată cu vapori de solvent. Acest lucru previne atât evaporarea de pe
suprafața plăcii, cât și modificarea compoziției solventului datorită pierderii
componentelor volatile.
Atunci când solventul a ajuns în partea superioară a plăcii (l 0-20 cm)
sau, de preferință, la o linie care a fost trasată de-a lungul plăcii la
aproximativ 1 cm de marginea superioară (figura 3.4), placa se îndepărtează
și se usucă rapid. Benzile separate pot fi vizualizate cu ajutorul unui reactiv
adecvat sau prin vizualizare la lumină ultravioletă, iar pozițiile lor pot fi
marcate.
Punctele de testare pot fi identificate prin compararea migrării lor cu
cea a probelor de referință, împreună cu dovezi suplimentare, de exemplu,
prin utilizarea unui reactiv de culoare specifică. Valoarea Rp (rata de curgere)
este o măsură a mișcării unui compus în comparație cu mișcarea solventului:
Rp= distanța la care s-a deplasat compusul față de
origine distanța la care s-a deplasat solventul
față de origine
În mod ideal, această valoare ar trebui să fie aceeași pentru un anumit compus
care utilizează același solvent, indiferent de distanța parcursă de solvent. Cu
toate acestea, este dificil să se standardizeze condițiile cromatografice, iar
variațiile care pot
Suprafața plăcii
se marchează
pentru a
îndepărta stratul
de suprafață
y Componente individuale
după separare
X
... Linie slabă de creion pentru

aplicarea soluțiilor de
probă și de referință
Figura 3.4 Cromatografie în strat subțire. Viteza de curgere (RF) pentru analitul
indicat
este x/y. Valorile RF pentru celelalte componente pot fi calculate în mod similar,
valoarea y fiind aceeași în fiecare caz.
Structura și grosimea stratului, cantitatea de apă rămasă și efectul agentului de

legare, toate acestea contribuie la nereproșabilitatea valorilor Rp.
Demonstrarea unor valori Rp identice nu este o dovadă concludentă a
identității testului. Dovada poate fi întărită prin demonstrarea unor valori Rp
identice pentru compușii de test și de referință într-o gamă de solvenți. În
plus, se poate analiza un amestec de eșantion și de compus de referință și,
dacă cele două substanțe sunt identice, ar trebui să rezulte un singur punct
după cromatografie. Această ultimă tehnică este cunoscută sub numele de
intercromatografie.
3.2.2 Cromatografie lichid-lichid

Împărțirea unui solut între două faze lichide imiscibile constituie baza
tehnicilor simple de extracție cu solvent. Polaritatea atât a solutului, cât și a
solventului sunt factori importanți în determinarea solubilității solutului, iar
soluții polari se vor dizolva mai ușor în solvenți polari decât în solvenți
nepolari.
În forma sa cea mai simplă, cromatografia lichid-lichid implică doi
solvenți care nu sunt miscibili. Cu toate acestea, multe medii dezvoltate recent
constau dintr-un lichid (faza staționară) care este ferm legat de un suport
solid. Ca urmare, este posibil să se utilizeze un al doilea solvent (faza mobilă)
care, în condiții normale, ar fi miscibil cu primul solvent. Cel de-al doilea
solvent poate să se deplaseze într-o singură direcție de-a lungul fazei
staționare pentru a facilita procesul de separare. Prezența unui mediu suport
introduce unele probleme în sistem și, în teorie, acesta ar trebui să fie complet
inert și stabil, fără a prezenta nicio interacțiune cu soluții din probă. Cu toate
acestea, acest lucru nu este întotdeauna valabil și, uneori, afectează procesul
de separare, ducând la o separare deficitară.
Cromatografie pe hârtie
Cea mai simplă formă de cromatografie lichid-lichid este cromatografia pe
hârtie (sau pe plăci de celuloză în strat subțire preparate în comerț) în care
apa legată de celuloză acționează ca fază staționară (polară), iar faza mobilă
(mai puțin polară) poate fi un amestec de diverși solvenți organici, butanol,
cloroform etc.
Eficiența oricărei tehnici cromatografice depinde de numărul de
separări sau echilibre secvențiale care au loc, care, în cazul cromatografiei
hârtiei, se datorează numărului mare de "compartimente" de apă legată de
celuloză. Soluții de testat sunt transportați pe hârtie dizolvați în faza mobilă și
întâlnesc compartimente succesive de apă. La fiecare dintre acestea, are loc o
separare rapidă între cele două faze, lăsând faza mobilă să transporte solutul
rezidual către următorul compartiment de apă și un alt efect de separare.
Solutul, care este dizolvat în apă și, prin urmare, nu a fost transportat în sus pe
hârtie, se prezintă acum cu un solvent proaspăt care urcă pe hârtie și este din
nou redistribuit între cele două faze.
Numărul extrem de mare de fenomene de separare exagerează foarte
mult diferențele dintre solubilitățile relative ale soluanților și duce la
separarea efectivă a componentelor. Acei soluturi care prezintă o solubilitate
mai mare în faza staționară se vor deplasa mai puțin rapid pe hârtie decât acei
soluturi care prezintă o solubilitate mai mare în faza mobilă.
Într-un sistem cromatografic tipic, probele se aplică pe o bandă de
hârtie de filtru, se usucă și apoi se plasează într-un rezervor care conține
un solvent adecvat, care este lăsat să urce pe hârtie prin acțiune capilară.
Pentru cursele cromatografice Jong (care depășesc 20 cm), se poate folosi
o tehnică descendentă în care hârtia este atârnată de rezervor, solventul
curgând pe hârtie.
Celuloza este de natură polară și poate provoca o anumită adsorbție,
ceea ce poate duce la "închiderea" zonelor. Cu toate acestea, în unele cazuri,
acest efect de adsorbție poate contribui la procesul de separare, iar utilizarea
unei faze mobile polare poate spori și mai mult acest efect, de exemplu,
separarea aminoacizilor folosind o soluție apoasă de amoniac ca fază mobilă.
Combinația dintre partiție și adsorbție influențează, în general, separările pe
plăci de celuloză în strat subțire, care au înlocuit cromatografia pe hârtie în
majoritatea cazurilor și care oferă o viteză și o rezoluție sporite.
Cromatografie lichidă de înaltă performanță

Tehnicile cromatografice pe coloană au fost folosite inițial ca instrumente de
preparare, dar de-a lungul anilor au avut loc progrese majore. HPLC este în
prezent o tehnică foarte dezvoltată și este disponibilă o gamă largă de faze
staționare. Acestea permit realizarea de cromatografii de partiție, adsorbție,
permeabilitate pe gel, afinitate și schimb de ioni.
Pentru separări eficiente, este esențial să se dispună de medii de
susținere foarte mici și de formă regulată, de o alimentare cu fază mobilă
pompată la o presiune adecvată pentru a asigura un debit constant
corespunzător prin coloană și de un sistem de detecție convenabil și eficient.
Pentru toate tipurile de faze staționare, aparatura necesară constă din cinci
componente de bază (figura 3.5), fiecare dintre acestea fiind disponibilă în
grade diferite de sofisticare.
Sistemul de livrare a solventului include o pompă care livrează
solventul adecvat dintr-un rezervor la o viteză preselectată. Utilizarea
coloanelor cu particule fine și debitele mari cerute necesită presiuni relativ
mari.
Supapa de injecție a
probei
□-'-+---------------------------------------'
Recorder Detector
Figura 3.5 Pompă Rezervor

de
O reprezentare a
solvenți
componentelor unui
sistem HPLC.
Coloana
de solvent, uneori până la 35 MN m-2 (5000 lb-2 ), deși, în mod mai

obișnuit, aproximativ 10 MN m-2 (1500 lb-2 ). Pe lângă capacitatea de a
produce aceste presiuni și pentru a obține un semnal de bază constant de la
detector, este necesar să se elimine fluctuațiile grosiere de presiune care
rezultă adesea de la pompele simple. Pentru a obține această pompare
"fără impulsuri" este necesar fie să se încorporeze sisteme de amortizare a
impulsurilor, fie să se utilizeze pompe mai sofisticate cu doi pistoane.
Utilizarea unui singur solvent este cunoscută sub numele de sistem
izocratic (cu putere egală), dar este adesea de dorit să se poată modifica
compoziția amestecului de solvenți în timpul operației cromatografice, proces
cunoscut sub numele de eluție gradată. Gradientul poate fi la fel de simplu ca
o schimbare treptată de la un amestec de solvenți preparat anterior la un alt
amestec de solvenți, în orice moment dat în timpul separației. Cu toate
acestea, mai frecvent și mai satisfăcător, producerea gradientului este
controlată de un microprocesor.
Faptul că solventul este livrat sub presiune necesită un dispozitiv
adecvat de injectare a probei, de obicei sub forma unei supape de
eșantionare, care să ofere o bună precizie. Supapa tipică cu șase orificii (figura
3.6) include o buclă de volum specificat (de la 10 µJ la 2 ml), care se umple
cu ajutorul unei seringi normale de joasă presiune înainte ca proba să fie
introdusă în coloană prin comutarea fluxului de aerisire a solventului prin
această buclă.
Bucla Bucla
POZIȚIA DE ÎNCĂRCAREPOZIȚIA DE INJECTARE
Figura 3.6 Diagrama unei supape de injecție a eșantioanelor cu șase orificii. În poziția
de încărcare, bucla poate fi umplută cu proba cu ajutorul unei simple seringi. Atunci
când supapa este rotită în poziția de injectare, proba este spălată în coloană.
Este necesar un detector de monitorizare continuă cu o sensibilitate

ridicată, iar cele care măsoară absorbția în ultraviolet sunt probabil cele mai
populare. Acestea pot funcționa la lungimi de undă fixe selectate prin filtre de
interferență, dar instrumentele cu lungime de undă variabilă cu
monocromatoare sunt mai utile. Se utilizează frecvent lungimi de undă
cuprinse între 190 și 350 nm, ceea ce înseamnă, evident, că o fază mobilă nu
trebuie să absoarbă la aceste lungimi de undă.
Detectoarele spectroscopice convenționale pot monitoriza doar la o singură
lungime de undă selectată, dar dezvoltarea detectării cu matrice de diode
permite monitorizarea continuă și simultană a efluentului coloanei pe orice
interval de lungime de undă selectată în regiunea ultravioletă și vizibilă a
spectrului. O matrice de diode constă dintr-un număr mare de rnicrodiode
(uneori până la 500) dispuse astfel încât spectrul de la o rețea holografică să
fie focalizat asupra lor. Fiecare diodă va înregistra apoi variațiile de intensitate
a radiației dintr-o anumită sectiune a spectrului (figura 3.7). Datele provenite
de la toate diodele sunt prelucrate de un calculator și pot fi prezentate ca o
cromatogramă tradițională, dar cu avantajul că se poate obține un spectru de
absorbție pentru orice punct al cromatogramei sau că datele pot fi manipulate
în orice mod adecvat de către calculator.
Matrice de diode
grătar
Figura 3.7 Detectorul cu matrice de diode. Lumina de la lampă trece prin celula de
curgere și printr-o rețea de reflexie holografică, iar spectrul rezultat este focalizat pe
rețeaua de diode. Detectoarele au frecvent o gamă spectrală de 190-800 nm și pot oferi
lățimi de bandă de până la 1,0 nm.
Se pot utiliza, de asemenea, detectoare de fluorescență și, deși

sensibilitatea lor poate fi mai mare, acestea sunt mai puțin aplicabile pe scară
largă din cauza numărului mai mic de compuși fluorescentrici. Refractometrele
diferențiale detectează modificările indicelui de refracție al solventului datorate
prezenței solutaților și, deși sunt mai puțin senzitive decât ceilalți detectori și,
adesea, nu pot fi utilizate în mod eficient cu tehnicile de eluție în gradient,
sunt capabile să detecteze prezența oricărui solut.
Sistemele de detecție electrochimică sunt din ce în ce mai populare.

Deși au fost studiate majoritatea metodelor electrochimice, de exemplu,
potențiometrice, conductometrice, coulometrice etc., cele mai frecvent
utilizate sunt cele amperometrice (figura 3.8). În aceste detectoare, un
electrod de lucru și unul de referință sunt menținute la o diferență de potențial
selectată, determinată de potențialul de descărcare al analitului. Se măsoară
curentul care rezultă din reacția de oxidare/reducere a unei mici părți din
moleculele de analiză la electrodul de lucru și, în anumite condiții, este
proporțional cu concentrația molară a acestora. Selectarea atentă a tensiunii de
lucru poate permite determinarea selectivă a unui analit în prezența altui analit
care necesită o tensiune de lucru mai mare. Unii detectori oferă o selectivitate
sporită prin încorporarea mai multor electrozi de lucru, fiecare dintre ei fiind
setat la o tensiune de lucru diferită.
(a) Detector amperometric
(b) Detector coulometric
Intrar
ea
soluției.
Electrod
de lucru
Figura 3.8 Detectoarele amperometrice (a) măsoară curentul care circulă între
electrodul de lucru, de obicei un electrod de carbon sticlos, și un electrod de referință,
la o tensiune fixă, de obicei apropiată de potențialul de descărcare pentru compus.
Detectoarele coulometrice (b) sunt mai puțin frecvente și sunt proiectate cu o celulă de
curgere din carbon poros, astfel încât tot analitul reacționează în celulă, cantitatea de
curent consumată în timpul procesului fiind proporțională cu cantitatea de substanță.
Atunci când se utilizează sisteme de detecție electrochimică, este

esențial ca fazele mobile utilizate să fie conductoare de electricitate, dar să
producă doar un curent de fond scăzut la tensiunea selectată. Volumele
celulelor sunt de ordinul a 1 µl, iar controlul debitului, pH-ului și temperaturii
este esențial pentru o detecție fiabilă.
Celula de curgere pentru detecția spectroscopică trebuie să fie fabricată
dintr-un material care să transmită radiația cu lungimea de undă necesară și
este important ca volumul celulei să fie suficient de mic pentru a oferi o
rezoluție bună între două componente ale probei care sunt apropiate. În
general, volumul unei celule de curgere trebuie să fie de aproximativ o
zecime din volumul vârfului, care poate fi calculat din debitul de solvent și
din baza de timp a vârfului. Problemele apar atunci când bulele de aer rămân
blocate în celula de curgere și este important
că ar trebui să fie conceput pentru a elimina bulele de aer în cazul în care

acestea apar. Cu toate acestea, această apariție poate fi redusă substanțial dacă
solvenții au fost în prealabil "degazați", proces care poate fi necesar pentru a
îmbunătăți calitatea separării. Cea mai simplă metodă de degazare constă în
agitarea energică a solventului într-un balon mare, sub vid. Metode alternative
includ ultrasunetele și barbotarea azotului prin solvent.
Cel mai frecvent, coloanele sunt realizate din tuburi de oțel inoxidabil
lustruite în interior, cu un diametru intern de aproximativ 4 mm și o lungime
de 25 cm, deși, pentru lucrările pregătitoare, dimensiunile pot fi mărite. Este
important ca spațiul neocupat de mediul de susținere (volumul mort) să fie
menținut la un nivel minim absolut pentru a preveni diluarea excesivă a
probei de către faza mobilă. Se pot utiliza coloane microbore cu diametre
interne cuprinse între 0,5 și 2 mm pentru a reduce considerabil consumul de
solvent și pentru a îmbunătăți rezoluția. Cu toate acestea, sunt necesare
sisteme de detecție special concepute, precum și pompe speciale concepute
pentru a furniza volume de ordinul a 10 µJ pe minut. Astfel de sisteme au
avantajul de a putea fi cuplate direct la un spectrometru de masă.
Dimensiunile materialului de împachetare sunt importante pentru
obținerea unor separări eficiente, iar modelul de curgere în jurul particulelor
determină amestecarea solutului și a solventului și sporește efectele de diluție,
contribuind la fenomenul cunoscut sub numele de "lărgire a benzii" (figura
3.9). Materialele de împachetare peliculară sunt
Concentrație
"Dop" de Vârful rezultat

eșantion
injectat
(a)
Distanța de-a lungul
coloanei
Concentrație
17
I I
I I
I
I Distanța de-a lungul
(b)
coloanei
Figura 3.9 Lărgirea benzii. Limitele clare ale probei injectate sunt estompate din
cauza difuziei pe măsură ce aceasta este transportată în coloană (a). În cazul în care
există o cantitate mare de spațiu mort, efectul de difuzie devine excesiv, rezultând un
vârf foarte larg care nu este foarte util din punct de vedere analitic (b).
nuclee solide cu un diametru de aproximativ 40 µm, cu un strat de suprafață

poros de aproximativ 2 µ,m grosime și sunt foarte utile atunci când sunt
necesare presiuni ridicate sau polarități extreme ale solventului. Garniturile de
microparticule constau din particule total poroase, de obicei cu diametrul de
numai 5-10 µmin, și au performanțe mult mai bune decât materialele
peliculare. Coloanele de materiale peliculare pot fi pregătite prin tehnici de
împachetare uscată, în timp ce materialele microparticulare necesită pomparea
unei suspensii într-un solvent adecvat sub presiuni ridicate pentru a obține o
împachetare uniformă.
Evaluarea eficienței coloanei

Numeroși factori contribuie la calitatea separării componentelor individuale
dintr-o probă și este necesar să se dispună de un mijloc definit de evaluare și
comparare a eficienței procesului în condiții diferite.
Capacitatea unui proces cromatografic de a separa sau de a rezolva doi
compuși similari (figura 3.10) se măsoară ca indice de rezoluție (Rs).
Figura 3.10 Evaluarea eficienței coloanei

2(tB -tA)
Indice de rezoluție (R,) = ---
1R-)2
WAWa +
Numărul de plăci teoretice (N) = 5,54 (-)
Wv,
unde Wv, este lățimea vârfului la jumătatea înălțimii vârfului.
Indiferent de orice considerente cantitative, prezența a două vârfuri separate în

cromatogramă indică gradul de rezoluție și poate fi cuantificată cu ajutorul
următoarei ecuații:
de două ori distanța dintre cele două vârfuri
Indice de rezoluție (Rs)
suma lățimii de bază a celor două vârfuri
=
2(tB - !A)
WA+ Wa
Cu cât valoarea lui Rs este mai mare, cu atât mai bună este rezoluția
celor două comenzi. Cu toate acestea, valorile mari ale lui Rs indică o
diferență de timp semnificativă între cele două vârfuri, iar valorile Rs de
aproximativ 1,5 sunt ideale.
Teoretic, injectarea probei va avea ca rezultat o zonă cu latură pătrată
care va fi lărgită prin amestecarea cu solventul pentru a produce o urmă care
se apropie de o distribuție gaussiană în jurul mediei. Presupunând că baza
zonei originale a probei este mică, amploarea acestei lărgiri a vârfului poate fi
exprimată ca varianță (<r), iar baza curbei (W) va fi egală cu 4u (figura 3.l0).
Conceptul d e placă teoretică se bazează pe numărul de echilibre care ar
fi putut avea loc în timpul procesului de separare, iar acest număr este legat de
numărul de ori în care volumul efectiv al unei coloane este mai mare decât
volumul de vârf. Varianța (<r) pentru vârf este o măsură a lărgirii volumului
de injecție, în timp ce pătratul timpului de retenție
Ui) este o măsură a volumului efectiv al coloanei pentru compusul respectiv.
Prin urmare,
numărul de plăci teoretice (N) poate fi calculat din următoarea ecuație:
N= =(:r
Utilizând informațiile din dimensiunile vârfului (figura 3.10), această
ecuație poate fi convertită în diferite forme, de exemplu::
N= 16(t)2
Deoarece este adesea dificil să se măsoare cu precizie lățimea bazei
(W), este probabil mai bine să se utilizeze lățimea vârfului la jumătatea
înălțimii vârfului, despre care se știe că este egală cu 2,355u (figura 3.10)
pentru o distribuție gaussiană. Prin urmare:
=N ( 2.355 X tR )2
lățimea vârfului la jumătatea înălțimii vârfului
=( distanța de retenție )2X

5_54
lățimea la jumătatea înălțimii
vârfului
Numărul teoretic de plăci (N) este invers proporțional cu gradul de

extindere a zonei care are loc într-o coloană. Cu cât valoarea N este mai mare,
cu atât coloana este mai eficientă, dar diferențele mai mici de 25% nu sunt
foarte semnificative.
Înălțimea echivalentă cu o placă teoretică (HETP) poate fi calculată pe
baza valorii lui N și a lungimii coloanei:
HETP= lungimea coloanei
N
În timp ce valoarea pentru N este utilă pentru a compara eficiența relativă a
diferitelor coloane, valoarea HEfP este utilă pentru a evalua eficiența variabilă a
aceleiași coloane în condiții diferite. Valoarea scade pe măsură ce crește eficiența
coloanei, o caracteristică care este în general mai bună pentru suporturile cu
particule mici și fluidele mai puțin vâscoase. Pentru a evalua eficiența coloanei
independent de
dimensiunea particulelor, se utilizează uneori înălțimea redusă a plăcii (h).

HETP
h=
diametrul particulelor (JLm)
Figura 3.11 ilustrează efectul variației debitului fazei mobile asupra
eficienței procesului de separare și oferă o metodă standard de determinare a
debitului optim pentru un sistem specific de coloană și fază mobilă.
HETP 3
(mm)
o, -----,----....,..=-----,....,,.------.c ----------- ,
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Debit (ml min-1)
Figura 3.11 Efectul debitului de solvent asupra eficienței coloanei. Se determină

HETP-ul coloanei pentru compusul de testare la diferite debite de solvent. Debitul care
are ca rezultat cea mai mică valoare pentru HETP oferă cea mai eficientă separare.
Analiza calitativă
Distanța (sau timpul) de retenție este utilizată în mod normal pentru a ajuta la
identificarea unui component al unui amestec, cu condiția ca un eșantion
cunoscut al componentului să fi fost supus separării în condiții identice. Din
cauza variațiilor care pot apărea în timpul de retenție din cauza unor factori
tehnici, de exemplu fluctuațiile debitului, starea coloanei, factorul de retenție
sau de selectivitate relativă
(a) este uneori utilizată. Aceasta exprimă timpul de retenție al testului ca
raport cu timpul de retenție al unui alt component sau compus de referință
atunci când ambele sunt injectate ca amestec:
--tes-t re-te-ntio-n
Retenție relativă = -tim-e
timpul de retenție de referință
De exemplu, timpul de retenție relativ pentru fenobarbitonă față de barbitonă
în procedura 3.1 se calculează după cum urmează:
-4
Re1ati.ve retenti.on = .4 =1 3.
3.4
Analiza cantitativă
Deși răspunsul detectorului este de obicei proporțional cu concentrația
substanței de testat, această relație poate varia și este esențial să se măsoare
răspunsul la o serie de soluții standard și să se determine un factor de calibrare
sau o curbă.
Relația dintre concentrația solutului și vârful produs în cromatogramă
este, strict vorbind, valabilă numai pentru măsurătorile suprafeței vârfului, dar
în majoritatea cazurilor este mai convenabil să se măsoare înălțimea vârfului.
Astfel de măsurători ale înălțimii vârfurilor trebuie utilizate numai atunci când
toate vârfurile sunt foarte înguste sau au lățimi similare. Plictiseala și lipsa de
prețiozitate asociate cu metodele neautomatizate de măsurare a suprafeței
vârfurilor pot fi depășite cu ajutorul integratorilor electronici, care sunt
caracteristici ale majorității instrumentelor moderne.
Variația volumului probei este factorul care afectează cel mai mult
precizia măsurătorilor cantitative, iar utilizarea unei supape de injecție
poate depăși acest aspect și permite utilizarea de standarde externe. Cu
toate acestea, este încă de dorit să se utilizeze o procedură de standardizare
internă, deoarece aceasta va reduce efectele oricărei variații a reacției
detectorului pe parcursul unei perioade de timp.
Pentru standardizarea externă, se injectează etaloane replicate cu
JI!'. în :extemal ;Standard concentrație cunoscută de substanță pură și se măsoară înălțimea vârfurilor
; :(fi.: :;
rezultate. Se injectează apoi proba și înălțimea vârfului se compară cu cea a
rata: a:1¥ :!rom t /- standardelor pentru a calcula concentrația testului. În cazul în care se
test<sampte.::::
utilizează această tehnică, trebuie efectuate injecții repetate atât ale
standardelor, cât și ale testului. În cazul în care precizia oferită de tehnica
standardelor externe nu este adecvată,
este necesar să se utilizeze un standard intern. În cadrul acestei proceduri, se
introduce în probă o cantitate cunoscută de substanță de referință, care nu este
prezentă inițial. Acest lucru va duce la apariția unui vârf suplimentar în
cromatograma probei modificate, iar orice variație a volumului de injecție va
afecta în mod egal standardul și compușii de testat.
Deoarece un detector poate răspunde diferit la substanța de testat și la
standardul intern, este necesar să se determine factorul de răspuns (R) al
detectorul pentru fiecare substanță de testat în raport cu standardul intern.

Acest lucru se poate face prin injectarea de soluții care conțin cantități
cunoscute de substanță de test și de etalon intern:
--test p-eak-heig-ht -xR=--tes-t c-on-cen-tra-tio-n -
înălțimea standard a vârfului concentrația
standard
Un standard intern poate fi utilizat în două moduri, de obicei în funcție

de natura probei. În forma sa cea mai simplă, metoda utilizează ecuația pentru
calcularea factorului de răspuns. Se introduce în probă o cantitate constantă
cunoscută de standard intern și se injectează o parte aliometrică din amestec.
Cunoscând concentrația etalonului intern (Cs) și factorul de răspuns al
substanței de testat (R), concentrația compusului de testat este:
_ înălțimea vârfului de încercare

CT - ------ "-----'"--- X Cs X R
înălțimea standard a vârfului
Această metodă presupune că factorul de răspuns este constant pe o

gamă de concentrații și este adesea mai acceptabil să se determine factorul de
răspuns pentru o gamă de concentrații de testare. În această metodă, se produce
o curbă de calibrare prin încorporarea unei cantități fixe de standard intern în
probe care conțin cantități cunoscute de compus de testat. Pentru fiecare
concentrație, se determină raportul înălțimii vârfurilor și se trasează în funcție
de concentrație (procedura 3.2). Pentru cuantificarea unei probe de test, se
introduce aceeași cantitate de standard intern în mod obișnuit și se utilizează
raportul înălțimilor vârfurilor pentru standard și necunoscut pentru a
determina concentrația necunoscutei din curba de calibrare.
Această din urmă metodă este utilizată în principal atunci când se
determină o singură substanță dintr-un eșantion, dar atunci când analiza
implică cuantificarea mai multor sau a tuturor componentelor eșantionului, de
exemplu, într-un analizor de aminoacizi, prima metodă este cea mai potrivită.
Un standard intern trebuie întotdeauna introdus în eșantion înainte de a
se efectua orice procedură de extracție sau purificare, deoarece acesta va
compensa pierderile din analiză ca urmare a acestor procese.
Alegerea materialelor coloanei

Tehnicile HPLC au fost inițial dezvoltate ca metode cromatografice lichid-
lichid, iar dificultățile legate de menținerea fazei staționare au fost rezolvate
prin legarea chimică a acesteia de suportul de particule. Ulterior, a fost
dezvoltată o întreagă gamă de materiale pentru coloane care permit utilizarea
instrucțiunilor de bază HPLC pentru principalele tehnici cromatografice.
La selectarea unui material de coloană pentru separarea unei anumite

substanțe, este necesar să se decidă ce caracteristică fizică a moleculei poate fi
utilă (tabelul 3.5). Prima considerație majoră pentru moleculele mici este, de
obicei, polaritatea moleculei. Se poate alege apoi între cromatografia cu
schimb de ioni pentru speciile ionice, cromatografia de adsorbție pentru
moleculele care prezintă grade moderate de polaritate și cromatografia de
partiție, care poate fi aplicabilă majorității moleculelor. Pentru moleculele
mari, ar trebui să se ia în considerare cromatografia de permeabilitate pe gel,
utilizând geluri necompresibile care sunt eficiente la presiunile utilizate.
Legarea ciclodextrinelor la silice a oferit o gamă de medii cunoscute
sub numele de faze staționare chirale (CSP), care sunt capabile să
Tabelul 3.5 Mediile cromatografice
Denumirea mediului Grupa de suprafață Cromatografic

aplicații
Adsorbție
Partisil Siliciu Steroizi Alcooli
LiChrosorb Si60 Siliciu Alcooli Acizi
Nucleosil Siliciu organici
LiChrosorb Alox Siliciu Vitamine
Spherisorb A Alumină Pesticide
Alumină
Partiție (fază normală)

Partisil PAC Ciano-amino
LiChrosorb NH2 Amino Zaharuri
\
Nucleosil NO2 Nitrit Conservanți
LiChrosorb Diol alimentari Hidroxil
Partiție (fază inversă)

Partisil ODS Octadecilsilan Barbiturice
LiChrosorb RPB Eteri de otil , eteri
LiChrosorb RP18 Octadecil Aromatice
LiChrosorb RP2 Silan Steroizi
Schimbător de
ioni Partisil SulfonatAminoacizi
SCX , baze azotate
Sulfonat Nucleotide
LiChrosorb KAT Nucleotide cu amoniu cuaternar
Partisil SAX Dimetilamină
Nucleosil N(CH3 )2 Acizi
organici
Permeabilizarea
gelului
LiChrospher Si Silice poroasă rigidă
Macrogel Polistiren semirigid Polimeri
Sephacryl S
sinteticiDextran-acrilamidă
separarea unor diastereoizomeri. Ciclodextrinele au structuri rigide, foarte

bine definite și sunt capabile să formeze complexe de incluziune cu o serie
de compuși. Structura ciclodextrinei este adesea de așa natură încât un
stereoisomer poate încăpea cu ușurință în moleculă, dar celălalt izomer nu
poate. Prin urmare, cel din urmă izomer este eluat primul din coloană.
Astfel de CSP-uri oferă o metodă alternativă la producerea de derivați
FLEC pentru separarea stereoizomerilor (figura 3.12). De obicei, metoda
este adecvată numai pentru compușii care conțin o grupare aromatică în
apropierea centrului chi ral, dar dezvoltarea de noi medii chirale extinde
continuu gama de aplicații.
FLEC
NH,CH- COOH + H CH- CH

3
01,)H CH-CH3
I I I
R 0-C-Cl 0-C- NH-CH-COOH
II a I
0 0 R
*Indică un carbon chiral
Figura 3.12 FLEC reacționează cu alcoolii și aminele fără racemizare a probei inițiale
pentru a produce diastereoizomeri foarte fluorescenți care pot fi separați prin
cromatografie în fază inversă.
Mediile legate chimic oferă atât faze staționare polare, cât și nepolare
pentru metodele de separare. Tehnicile care utilizează o fază staționară
nepolară cu o fază mobilă polară sunt cunoscute sub denumirea de sisteme
cu fază inversă, spre deosebire de cromatografia în fază normală, care
utilizează o fază mobilă nepolară. Deoarece faza staționară este legată
chimic de un mediu de suport, este împiedicată eluția lichidului de către
faza mobilă. Este totuși necesar să se evite pH-urile extreme pentru a
preveni pierderile datorate reacțiilor hidrolitice sau altor reacții de scindare.
Cel mai frecvent mediu suport pentru metodele de separare este siliciul, de
care faza staționară este legată fie printr-o legătură Si-C, fie, mai frecvent,
printr-o reacție cu un organoclorosilan (R3 SiCI) și o grupare silanol de
suprafață (SiOH) pentru a obține -Si-O-SiR3 - Variațiile în natura acestei
grupe R dau naștere la o gamă de faze staționare cu diferențe considerabile
de polaritate.
Cea mai populară și mai versatilă fază legată este octadecilsilanul
(ODS), n-C18H37, o grupare nepolară și utilizată pentru separări în fază inversă.
Octilsilanul, cu lungimea sa de lanț mai scurtă, permite o difuzie mai rapidă a
solutaților
iar acest lucru duce la o simetrie îmbunătățită a vârfurilor. Alte grupuri sunt
atașate la fazele polare pro vide și, prin urmare, realizează separări de fază
normale. Printre acestea se numără grupările ciano, eter, amină și diol, care
oferă o gamă largă de polarități. Atunci când se utilizează faze staționare
legate, se pierde distincția clară între cromatografia de adsorbție și cea de
partiție, iar principiile de separare sunt mult mai complexe.
Faza mobilă
Marea versatilitate a HPLC constă în faptul că stabilitatea fazelor staționare
legate chimic utilizate în cromatografia de partiție permite utilizarea unei
game largi de lichide ca fază mobilă fără ca faza staționară să se piardă sau să
se distrugă. Acest lucru înseamnă că este mai puțin necesar un număr mare de
faze staționare diferite, așa cum se întâmplă în cazul cromatografiei în fază
gazoasă. Faza mobilă trebuie să fie disponibilă într-o formă pură și, de obicei,
necesită degazare înainte de utilizare. Alegerea fazei mobile (tabelul 3.6) este
influențată de mai mulți factori.
Tabelul 3.6 Solvenți pentru cromatografia lichidă de înaltă performanță
Solvent Rezistența la Vâscozitate Limita de

solvenți tăiere în
ultraviolete
(nm)
Pentan 0 0.24 200
Eter de petrol 0.01 0.30 226
Hexan 0.01 0.31 200
Tetraclorură de carbon 0.18 0.97 263
Toluen 0.29 0.59 284
Benzen 0.32 0.65 278
Eter dietilic 0.38 0.24 218
Cloroform 0.40 0.58 245
Diclorometan 0.42 0.43 245
Diclorură de etilenă 0.49 0.79 228
Metiletil cetonă 0.51 0.42 329
Dioxan 0.56 1.44 215
Acetonă 0.56 0.30 330
Acetonitril 0.65 0.34 190
Etanol 0.88 1.2 210
Metanol 0.95 0.55 210
Apă Mare 1.00 200
Compatibilitatea cu faza staționară

Faza mobilă nu trebuie să reacționeze chimic cu faza staționară sau să rupă
legătura care o leagă de materialul suport. Din acest motiv, trebuie evitate în
mod normal pH-urile extreme și agenții oxidanți puternici. Intervalul de pH
de lucru al unui mediu va fi indicat de către furnizor.
Compatibilitatea cu sistemul de detecție
În orice analiză cromatografică, metoda de detecție este determinată de natura
analitului, iar faza mobilă utilizată nu trebuie să interfereze cu acest sistem.
Utilizarea sistemelor de detecție prin absorbție în ultraviolete este foarte
frecventă, dar solvenții utilizați nu trebuie să absoarbă semnificativ la
lungimea de undă utilizată. De exemplu, absorbția la 280 nm este frecvent
utilizată pentru detectarea proteinelor, dar unii solvenți, de exemplu acetona,
absorb la această lungime de undă. În mod similar, utilizarea gradienților de
concentrație în faza mobilă poate prezenta probleme în cazul sistemelor de
detecție cu indice de refracție și electrochimice.
Considerații privind presiunea
Mediile cu particule mici, cu suprafețele lor mari, necesită presiuni relativ
mari pentru a obține un debit realist de solvent. Pe măsură ce vâscozitatea
a solvenților va afecta în mod apreciabil această relație dintre presiune și debit,

trebuie ales un solvent care să realizeze separarea dorită fără a necesita
presiuni prea mari pentru sistem.
Polaritate
Polaritatea unui solvent se exprimă prin puterea de dizolvare (tabelul 3.6),
care este o măsură a capacității solventului de a rupe legăturile de adsorbție și
de a elua un solut dintr-un absorbant. Valorile ridicate indică o polaritate
ridicată. Factorul principal în selectarea unei faze mobile pentru separările
bazate pe partiție sau adsorbție este polaritatea analitului. Polaritatea fazei
mobile ar trebui să fie astfel încât să existe o partiție efectivă a analitului între
cele două faze, adică între faza staționară și faza mobilă, și nu o afinitate
completă pentru una singură. În cazul în care o probă de analiză conține mai
mult de un component, așa cum se întâmplă de obicei, este posibil să nu se
poată realiza o separare completă folosind o singură fază mobilă (separare izo
cratică). În astfel de cazuri, este necesară o eluție în gradient, în care forța
solventului din faza mobilă este modificată treptat în timpul procesului de
separare prin modificarea proporției de solvenți din amestec.
Cromatografia în fază inversă este utilizată în principal pentru separarea
substanțelor neionice, deoarece compușii ionici și, prin urmare, puternic
polari, prezintă o afinitate foarte mică pentru faza staționară nepolară. Cu toate
acestea, ionizarea acizilor slabi (sau a bazelor slabe) poate fi suprimată în
solvenți cu valori scăzute (sau ridicate) ale pH-ului. Efectul unei astfel de
reduceri a ionizării este acela de a face com poundul mai solubil în faza
staționară nepolară, dar pH-ul solventului nu trebuie să depășească intervalul
permis pentru fazele lipite, adică pH 2-8.
În timp ce tehnica de suprimare ionică (sau de control al ionizării)
este eficientă numai în cazul speciilor slab ionice, cromatografia cu perechi
de ioni a fost dezvoltată pentru speciile puternic ionice și utilizează din nou
cromatografia în fază inversă. Dacă pH-ul solventului este astfel încât
moleculele de solut se află în stare ionizată și dacă un ion (contra-ionul) cu o
sarcină opusă ionului testat este incorporat în solvent, cei doi ioni se vor asocia
pe baza sarcinilor lor opuse. În cazul în care contra-ionul are un lanț sau o
coadă nepolară, perechea de ioni astfel produsă va prezenta o afinitate
semnificativă pentru faza staționară nepolară.
Printre contra-ionii care sunt frecvent utilizați se numără fosfatul de
tetrabutilamoniu pentru separarea anionilor și acidul hexan-sulfonic pentru
cationi. Contra-ionii adecvați sunt încorporați în solvent, de obicei la o
concentrație de aproximativ 5 mmol 1-1 , iar separarea se efectuează pe medii
obișnuite cu fază inversă. Această capacitate de a separa speciile ionice,
precum și moleculele nepolare, sporește considerabil valoarea cromatografiei
în fază inversă.
Produse derivate
Procesul de modificare chimică a moleculelor de testare înainte de procedura
de separare este cunoscut sub denumirea de preparare a derivaților sau
derivatizare pre-columna. În cromatografia lichidă, acest lucru se face pentru
a permite ca moleculele de testat să fie detectate mai ușor după separare și
pentru a crește sensibilitatea sistemului de detecție și, mai rar, pentru a
modifica procesul de separare.
Majoritatea derivaților sunt formați prin introducerea în molecula de
test a unei grupări care conferă fie o caracteristică de absorbție, de obicei în
ultraviolet, fie o proprietate fluorescentă, facilitând astfel detecția (tabelul
3.7).
Tabelul 3.7 Derivați utilizați în cromatografia lichidă (HPLC)
Derivat Potrivit pentru Detecție

analiți
Metoda Lungime de
undă (nm)
p-Nitrobenzil Acizi carboxilici Absorbanța 254
p-Nitrobenzoil Alcooli Absorbanța 254
p-Bromofenacil Acizi carboxilici Absorbanța 260
3,5-Dinitrobenzoil Alcooli Absorbanța 254
Amine
Dansyl Amine Fluorescență 360/510
Peptide
Fenoli
O aplicație în cromatografia lichidă care modifică procesul de separare

este utilizarea unei serii specifice de derivați pentru a permite separarea
formelor chirale (izomeri optici) de alcooli, amine și aminoacizi prin separare
în fază inversă. FLEC este disponibil în cele două forme chirale: (+)- 1-(9-
fluorenil) cloroformiat de etil și (- )--1-(9-fluorenil) cloroformat de etil (figura
3.12). Reacția a doi stereoizomeri ai unui compus de testat (de exemplu, T+ și
T-) cu un singur izomer al reactivului de derivare (de exemplu, R+) va duce la
formarea a două tipuri de produse, T+R+ și T- R+. Este posibil să se separe
acești doi compuși prin cromatografie în fază inversă.
Derivații de FLEC se formează fără racemizare a probei, iar derivații
- -- -i,ti ;';$
formelor D și L ale moleculelor de test sunt eluate succesiv din coloanele cu
t J:,:11. t :. fază inversă. Derivații FLEC sunt fluorescenți, având un maxim de excitație la
260 nm și un maxim de emisie la 315 nm și sunt deosebit de utili în analiza
aminoacizilor.
3.2.3 Cromatografie gaz-lichid

GLC (figura 3.13) depinde de împărțirea unui solut între două stări sau faze
fiziologice, adică gazoasă și lichidă (soluție). Prin urmare, în GLC există
Controlul
presiunii Detector
gazului
Cupt
or
Figura 3.13
Comenzile
O reprezentare a cuptorului
componentelor unui Alim
cromatograf cu gaz. entare
a cu
gaz
doar un singur solvent, faza staționară, care este ținută imobilă într-un tub
îngust înfășurat sau într-o coloană.
În coloana încălzită se introduce o soluție de compuși de testat și este
suflată prin coloană de către gazul purtător. La contactul inițial al solutului cu
faza staționară lichidă, se stabilește rapid un echilibru între cantitatea de solut
care se dizolvă în faza lichidă și cantitatea de solut care rămâne sub formă de
vapori. Poziția exactă a echilibrului este o caracteristică a solutului și a
solventului în cauză, dar echilibrul se va deplasa întotdeauna spre faza de
vapori dacă temperatura coloanei este ridicată.
Fracțiunea de vapori a solutului este deplasată în josul coloanei de către
gazul de transport, iar echilibrul dintre cele două faze este distrus. Cu toate
acestea, în încercarea de a restabili echilibrul, moleculele de solut părăsesc
faza lichidă, restabilind presiunea parțială deasupra soluției. Vaporii de solut
care s-au deplasat în josul coloanei se întâlnesc cu solventul proaspăt și se
stabilește un nou echilibru.
Vaporii probei sunt detectați pe măsură ce părăsesc coloana, iar vaporii
care ies primii au fie cea mai mică solubilitate în faza staționară, fie cea mai
mare volatilitate. Răspunsul detectorului este afișat pe un înregistrator și se
obține o urmă sau o cromatogramă.
Forța motrice în GLC este fluxul de gaz purtător prin coloană. Gazele
utilizate cel mai frecvent sunt azotul, argonul și heliul. Gazele variază în
funcție de vâscozitate, iar gazele mai vâscoase, de exemplu dioxidul de
carbon, necesită presiuni mai mari pentru a menține debitul, dar, în comparație
cu gazele mai puțin vâscoase, de exemplu azotul, restricționează gradul de
difuzie și, prin urmare, au tendința de a produce vârfuri mai clare. Este
esențial ca toate gazele utilizate să fie pure și uscate și să fie inerte din punct
de vedere chimic față de soluturi și fazele lichide utilizate.
Coloanele utilizate pentru GLC au o lungime de câțiva metri și sunt, de
obicei, înfășurate pentru a economisi spațiu în cuptor. Inițial, coloanele erau
umplute cu particule dintr-un mediu inert de susținere (derivați de pământ de
diatomee, polimeri poroși și, ocazional, bile de sticlă) care au fost acoperite cu
o peliculă de fază staționară. Acest lucru oferă o suprafață foarte mare și
permite o împachetare strânsă, astfel încât există foarte puțin spațiu mort în
care moleculele de solut nu sunt în contact direct cu lichidul.
În prezent, acestea au fost înlocuite de coloanele capilare, care oferă o
eficiență de separare mult îmbunătățită. Se utilizează tuburi capilare din silice
topită, care au diametre interne cuprinse între 0,1 mm (alezaj mic) și 0,53 mm
(alezaj mare), cu lungimi tipice de peste 20 m. În cazul coloanelor cu tub deschis
acoperit cu perete (WCOf), suprafața internă a tubului este acoperită cu faza
lichidă (staționară) și nu este necesar niciun mediu de susținere cu particule. O
formă alter nativă de coloană este coloana tubulară deschisă cu strat poros
(PLOT), care are un strat intern de adsorbant, cum ar fi alumina (oxid de
aluminiu) și diverse acoperiri. Cu aceste coloane capilare se utilizează volume de
probă de microlitri, iar portul de injecție include, de obicei, u n separator de flux.
Procedura analitică
Cromatograma obținută prin cromatografie în fază gazoasă (procedura 3.2) este
comparabilă cu cea obținută prin HPLC și toate considerațiile referitoare la
înălțimea și aria vârfurilor, precum și la standardele interne și externe sunt
relevante.
necesitatea de a utiliza standardizarea internă și factorii de răspuns pentru

lucrările cantitative este mai importantă din cauza instabilității unor detectoare și
a impreciziei asociate cu injectarea unor volume foarte mici de probe relativ
volatile.
Componenții individuali sunt identificați prin timpul de retenție,
măsurat de obicei de-a lungul axei timpului de pe hârtia grafică, dar
reproductibilitatea timpilor de retenție este afectată în mod semnificativ de
modificări ale debitului de gaz și ale temperaturii coloanei. Nu este adecvat să
ne bazăm pe valorile cotate pentru timpii de retenție, ci este necesar să
determinăm valorile la intervale frecvente, folosind condiții experimentale
identice pentru teste și compuși de referință.
Detectoare
Detectorul de conductivitate termică sau katharometrul este cel mai simplu
detector, dar nu este utilizat în mod obișnuit în prezent. Acesta măsoară variațiile
de rezistență ale unui conductor electric solid (o lungime de sârmă de platină) care
sunt induse de schimbările de temperatură. Firul este suspendat în coloană și
încălzit electric și, în condiții stabile, va atinge o temperatură constantă în funcție
de curentul care circulă și de pierderea de căldură prin radiație și conducție
termică (figura 3.14). Orice variație în compoziția gazului care înconjoară firul va
duce la o schimbare a temperaturii acestuia și, prin urmare, la o schimbare a
rezistenței sale.
Semnal de Semnal
testare de
referință
t
Fluxul de
t
Gaz
gaz purtător
din coloana doar
Figura 3.14 Un katharometru. O tensiune constantă este aplicată filamentelor

detectorului, iar curentul rezultat produce un efect de încălzire. În coloana de referință
(numai gaz purtător), deoarece pierderile de căldură din filament sunt constante,
rezistența acestuia va fi, de asemenea, constantă. Cu toate acestea, pierderile de căldură
din filamentul de testare variază în funcție de compoziția gazului, iar modificările de
rezistență rezultate pot fi monitorizate.
Rezistența firului este comparată cu rezistența unui fir similar dintr-o

coloană de referință (care conține doar gazul purtător) prin intermediul unui
aranjament de punte Wheatstone, astfel încât să se poată monitoriza variațiile de
rezistență.
Un detector de conductivitate termică va răspunde la toți compușii și

este capabil să detecteze aproximativ 1 X 10-7 mol de substanță în gazul
purtător, dar nu prezintă un răspuns liniar bun la cantități din ce în ce mai mari
de substanțe de testat. Detectorul de ionizare a flăcării este utilizat în mod
obișnuit și depinde de energia termică a unei flăcări care provoacă o anumită
ionizare a moleculelor din flacără. Ionii sunt colectați de o pereche de
electrozi polarizați, iar curentul produs este amplificat și înregistrat (figura
3.15). Pentru o anumită compoziție de gaze, va exista un grad constant de
ionizare, dar pe măsură ce compoziția amestecului de gaze se modifică
datorită prezenței componentelor de testare, gradul de ionizare se va modifica.
O sursă de hidrogen și oxigen este alimentată la
detectorul pentru a produce flacăra.
Hidrogen-
1
Transportator și
gaze de încercare
Figura 3.15 Un detector de ionizare cu flacără. Hidrogenul și oxigenul sunt introduse

în amestecul de gaze în momentul în care acesta iese din coloană pentru a-i permite să
fie ars în detector. Unele molecule sunt ionizate în flacără și determină trecerea unui
curent între cei doi electrozi polarizați. Gradul de ionizare variază în funcție de
compoziția amestecului de gaze, iar modificările de curent care rezultă pot fi
monitorizate.
Detectoarele de ionizare cu flacără sunt capabile să detecteze practic toți

compușii organici și prezintă o limită inferioară de detecție de aproximativ 1
X 10-9 mol. De asemenea, prezintă o bună liniaritate a răspunsului, iar faptul
că nu răspund la oxizi de carbon sau de azot sau la apă îi face deosebit de
convenabili pentru probele apoase. Cu toate acestea, au dezavantajul că
probele sunt distruse, cu excepția cazului în care este încorporat un dispozitiv
de separare a fluxului.
O modificare a detecției prin ionizare în flacără presupune introducerea
în flacără a atomilor unuia dintre metalele alcaline, de exemplu potasiu,
rubidiu
sau cesiu. Un astfel de dispozitiv, cunoscut sub numele de detector de

ionizare cu flacără alcalină (AFID), oferă un răspuns îmbunătățit la
compușii care conțin azot sau fosfor, detectând niveluri de până la 1 X 10-10
mol.
Detectorul cu captare de electroni depinde, de asemenea, de
ionizarea gazelor purtătoare, dar utilizează un izotop emițător de beta ca
mijloc de ionizare (figura 3.16). Izotopul, de obicei63 Ni sau 3H, este ținut pe o
folie în camera de ionizare prin care trec gazele emergente. Ionizarea gazului
purtător are ca rezultat eliberarea de electroni și, prin urmare, un curent va
circula între doi electrozi polarizați. Cu toate acestea, în cazul în care sunt
prezenți compuși electrofilici (adică cei care conțin oxigen, azot, sulf sau un
halogen), aceștia vor capta electronii liberi, reducând într-o oarecare măsură
curentul.
- Anod
Radioactivitate -- - Izolarea pereților

folie de aluminiu
------------ 1 ,1 -s
Difuzare
/scree_n
- Catod
t
Debitul de
gaz din
coloană
Figura 3.16 Un detector de captare a electronilor. Gradul de ionizare a gazelor

emergente, cauzat de emisia unui radioizotop, este monitorizat ca modificări ale
curentului rezultat.
Detectoarele de captare a electronilor sunt extrem de sensibile (1 X 10-12

mol), dar sunt specifice pentru compușii electrofilici. Cu toate acestea, ei pot fi
utilizați în paralel cu detectoarele de ionizare cu flacără pentru a identifica
vârfuri specifice într-o cromatogramă.
Faza staționară
Principalul considerent în selectarea unei faze staționare (lichide) este
polaritatea acesteia în raport cu compușii de testat. O fază staționară nepolară
va avea tendința de a reține soluturi nepolari, în timp ce un lichid polar va
prezenta o afinitate mai mare pentru soluturi polari. În sistemele nepolare,
deoarece nu există legături de hidrogen, eluția soluanților din coloană se face
de obicei în ordinea punctelor de fierbere. Legătura de hidrogen se va produce
în grade diferite în cazul sistemelor polare și va modifica în mod semnificativ
ordinea de eluție, deoarece moleculele implicate în legăturile hidrogenice vor
fi întârziate.
Este dificil de clasificat solvenții în funcție de polaritatea lor, iar
conceptul de selectivitate a unui solvent a fost dezvoltat inițial de Kovats și
ulterior de McReynolds, al cărui sistem de clasificare este în prezent cel mai

popular. Acesta se bazează pe conceptul lui Kovats de atribuire a unui indice
de retenție ([) pentru seria de hidrocarburi n-parafinice, selectate ca și
compuși de referință datorită stabilității și ușurinței de purificare a acestora.
Pentru o anumită fază staționară, o reprezentare a logaritmului timpului de
retenție în funcție de numărul de atomi de carbon rezultă într-un grafic cu linie
dreaptă. Aceasta poate fi utilizată pentru a atribui o valoare a indicelui de
retenție oricărui compus pe baza unui număr de carbon aparent determinat din
timpul de retenție al compusului respectiv. Pentru comoditate, numărul de
carbon determinat din grafic se înmulțește cu 100 pentru a elimina zecimalele.
Această metodă implică o cromatografie izotermă, dar nu este neobișnuit ca,
în cazul unor aplicații specifice, datele privind indicele de retenție să fie
determinate prin separări cu gradient de temperatură programat.
McReynolds a utilizat indicele de retenție al anumitor soluturi pentru a
compara diferite faze staționare și pentru a evalua selectivitatea acestora în
comparație cu o fază lichidă de referință, squalanul. Squalanul este considerat
nepolar și orice creștere a indicelui de retenție a solutului selectat pe coloana
de testare în comparație cu squalanul poate fi considerată ca fiind datorată
polarității mai mari a acestui solvent. Constantele lui McReynolds au fost
determinate pentru toate fazele staționare folosind o serie de soluturi cu
polaritate variabilă (tabelul 3.8) și pot fi utilizate pentru a ajuta la selectarea
unei faze staționare adecvate.
Constanta McReynolds =/lichidul de probă- I ,qualane
O examinare a unui tabel cu aceste constante pentru diferite faze
staționare și un solut care este cel mai asemănător cu substanța de testat va
indica cea mai potrivită fază staționară. În cazul în care se dorește separarea a
doi solvenți de polaritate diferită, trebuie selectat un solvent care prezintă o
diferență semnificativă în ceea ce privește constantele pentru cei doi solvenți
de referință cei mai potriviți.
Tabelul 3.8 Fazele staționare pentru cromatografia gaz-lichid
Faza lichidă ExempleConstantele McReynolds pentru compușii de testare selectați
Benzen Butanol Pentanonă Nitropropan Piridină
Squalane Faza de referință 0 0 0 0 0

Uleiuri de parafină Nujol 9 5 2 6 11
Unsoare Apiezon APL 32 22 15 32 42
Hidrocarburi fluorurate Fluorolube 51 68 114 144 118
Succinat de dietilenglicol DEGS 492 733 581 833 791
Polietilenglicol PEG 600 350 631 428 632 605
Carbowax 1000 347 607 418 626 589
Siliconi, metil OVI 16 55 44 65 42
Silicone, fenil OV17 119 158 162 243 202
Silicone, fluoro OV210 146 238 358 468 310
Siliconi, ciano OV275 629 872 763 1106 849
Benzenul reprezintă aromaticele și olefinele. Pentanona reprezintă compușii ceto și esterii.

Butanolul reprezintă alcoolii și acizii slabi. Nitropropanul reprezintă compușii nitro și nitrilici.
Piridina reprezintă N-heterocilii.
Condiții de coloană
Eficiența unei coloane poate fi evaluată într-un mod similar cu cel descris
pentru HPLC și se pot calcula, de asemenea, valorile pentru indicele de
rezoluție a doi solvenți, numărul de plăci teoretice și înălțimea echivalentă cu
o placă teoretică. Deși este mai ușor să se măsoare presiunea gazului, în
investigațiile de evaluare a coloanei ar trebui să se utilizeze fluxul real de gaz,
care este afectat de dimensiunea particulelor și de compresia garniturii.
În multe cazuri, probele conțin componente cu o gamă largă de
volatilități și poate fi dificil să le separați rapid și eficient la o temperatură
fixă; se poate utiliza un gradient de temperatură. Separarea este inițiată la o
temperatură mai scăzută pentru o anumită perioadă de timp, în funcție de
timpul de retenție al componentelor mai volatile. Ulterior, temperatura
coloanei este crescută cu o rată specifică pentru a accelera eluția
componentelor mai puțin volatile. O astfel de programare a temperaturii poate
cauza unele probleme, dar acestea sunt, de obicei, rezolvate la proiectarea
instrumentului. Pe măsură ce temperatura crește, debitul de gaz va scădea din
cauza creșterii contrapresiunii în coloană și, de obicei, este necesar un sistem
care să regleze presiunea gazului pentru a menține debitul._În plus, creșterea
temperaturii poate provoca, de asemenea, pierderea solventului (sângerare)
din coloană, ceea ce duce la o creștere a liniei de bază care trebuie luată în
considerare la măsurarea înălțimii vârfurilor. Nu trebuie utilizate temperaturi
mai mari decât cea maximă specificată pentru faza staționară, deoarece
coloana se va deteriora rapid.
Produse derivate
Multe substanțe nu sunt inițial adecvate pentru cromatografia în fază gazoasă
din cauza punctelor de fierbere relativ ridicate sau a insolubilității lor. În astfel
de cazuri, este adesea posibil să se modifice chimic compusul și să-l facă mai
ușor de separat. În unele cazuri, modificarea chimică este utilizată pentru a
permite o detectare mai ușoară a compusului, de exemplu, introducerea unui
halogen pentru utilizarea cu detectoare cu captare de electroni.
Există o mare varietate de reacții de derivatizare, dar cele mai frecvent
utilizate sunt indicate în tabelul 3.9.
Tabelul Derivați pentru cromatografia în fază gazoasă

3.9
Reacție Produse derivate Reactivi Compuși
format folosit tratat
Silylation Trimetilsilicil BSTFA Acizi utilizați pe scară

largă,
R-OH R-0Si(CH3 h TMS fenoli, alcooli
Acilare Trifluoroacetil TFAA Amine, fenoli,
Heptafluorobutiril alcooli
Alchilare Metil, etil sau butil TMAH Acizi grași, diverși
droguri
BS1FA, bis(trimetilsililil)-trifluoroacetamidă; TMS, trimetilclorosilan; TFAA, anhidridă trifluoroacetică; TMAH,

hidroxid de trimetilililiu.
3.2.4 Spectrometrie de masă

Spectrometria de masă este o tehnică utilizată pe scară largă ca detector pentru
GLC și HPLC. Este un instrument puternic pentru identificarea și
cuantificarea rapidă chiar și a unor cantități de analit de femtograme. De la
începutul anilor 1980, tehnica și instrumentele asociate au cunoscut o
dezvoltare considerabilă, iar îmbunătățirile sunt în mod constant introduse.
Evoluții deosebit de importante au fost asociate cu aspectele informatice ale
spectrometriei de masă, cu mijloacele de producere a ionilor din specii neutre
și cu specificațiile generale de proiectare, inclusiv producția de instrumente
"de masă". Utilizarea spectrometriei de masă a fost extinsă în prezent la
analiza moleculelor mari, de exemplu a proteinelor, ceea ce a dus la extinderea
considerabilă a aplicațiilor sale în domeniul biochimic. Acest lucru se
datorează în mare parte utilizării pe scară largă a spectrometriei de masă cu
electrospray și a spectrometriei de masă "time of flight" (TOF). În plus,
introducerea spectrometriei de masă/spectrometriei de masă (MS/MS) sau a
MS în tandem, care sunt independente de un proces de separare
cromatografică, a deschis un domeniu complet nou de aplicații analitice.
Există multe tipuri de spectrometre de masă, fiecare având caracteristici
speciale de proiectare, unele oferind moduri de analiză foarte sofisticate, iar
aceste detalii nu vor fi descrise aici. În schimb, sunt abordate principiile
fundamentale și aspectele instrumentale asociate cu tehnica în general.
Informații mai detaliate sunt disponibile în cărți de specialitate sau în
publicațiile producătorilor de instrumente.
Spectrul de masă
Producerea de ioni din compuși neutri și examinarea modului în care acești
ioni se fragmentează ulterior este fundamentală pentru spectrometria de masă.
Moleculele neutre ale probei pot fi ionizate printr-o varietate de procese. Cel
mai important dintre acestea pentru producerea de specii încărcate pozitiv este
îndepărtarea unui electron sau adăugarea unuia sau mai multor protoni pentru
a da fie "ioni moleculari" (M+-), fie "specii moleculare protonate" (M +nttr+).
Această etapă inițială de ionizare este adesea urmată de o fragmentare pentru a
produce fragmente ionizate, "ioni de fragment".
Măsura în care se continuă cu alte căi de fragmentare și, prin urmare,
modelul de fragmentare care se produce, este caracteristic pentru comuna
respectivă. Spectrometrul de masă este conceput pentru a separa și măsura
masa ionilor folosind raportul dintre masa și sarcina lor (m/z). Ionii se
formează de obicei cu o singură sarcină pozitivă (z = 1) și, în această situație,
m/z dă masa ionului. În spectrul de masă care este produs, cantitățile relative
ale ionilor sunt afișate ca abundență relativă a acestora pe axa y și valorile m/z
ale acestora pe axa x (figura 3.17).
Aceste informații sunt reprezentate de calculator în moduri alternative și
este important ca analistul să fie conștient de modurile în care funcționează
sistemul de date. În metoda normalizată sau a abundenței relative procentuale
(%RA), care este utilizată în mod obișnuit, înălțimea fiecărui vârf este prezentată
ca procent din cel mai mare vârf din spectru. Curentul ionic total (TIC) este suma
tuturor răspunsurilor detectorului pentru fiecare scanare, reprezentată în funcție de
timp, și este echivalentă cu o urmă GLC. Aceste informații sunt deosebit de utile
în analiza cantitativă.
mlz
Fragment Masa Abundența relativă
CH 13 0.7
CH2 14 2.4
CH3 15 13
OH 17 I
co 28 6.3
CHO 29 64
CH2O 30 3.8
CH3O 31 I 00 (vârf de bază)
CH3OH 32 66 (ion molecular)
Figura 3.17 Spectrul de Cel mai puternic vârf se numește vârful de bază și este setat să citească I00. Semnalul
masă al metanolului. de la molecula ionizată nefragmentată nu este de obicei foarte puternic și uneori lipsește
complet.
Instrumentație
Există o varietate de instrumente cu design diferit, dar toate au aceleași
caracteristici esențiale (figura 3.18).
Ion Separarea Detectare Înregistrarea și
Intrare
sursa ionilor a prelucrarea datelor
ionilor
Figura 3.18 Reprezentarea schematică a componentelor unui tromometru de

spectrometrie de masă. Adesea, proba este introdusă prin orificiul de intrare sub
formă de vapori și este supusă bombardamentului cu electroni. Produsele acestui proces
sunt separate printr-o varietate de mijloace și detectate la ieșirea din sistem.
Intrări și surse de ioni

Spectrometria de masă este în mod tradițional o tehnică în fază gazoasă pentru
analiza probelor relativ volatile. Efluenții de la cromatografele în fază gazoasă
sunt deja într-o formă adecvată, iar alte probe ușor de vaporizat ar putea fi
adaptate destul de ușor. Cu toate acestea, cuplarea spectrometriei de masă la
fluxuri lichide, de exemplu HPLC și electroforeza capilară, a ridicat o nouă
problemă, iar în prezent sunt utilizate mai multe metode diferite. Acestea
includ metodele de pulverizare menționate mai jos și bombardarea cu atomi
(bombardament atomic rapid, FAB) sau ioni (spectrometrie de masă cu ioni
secundari, SIMS). Partea instrumentului în care are loc ionizarea moleculelor
neutre se numește sursă de ioni. Cea mai comună metodă de
ionizarea se face prin ionizarea electronică sau prin impactul electronic (El) al
unei probe volatile într-o cameră de ionizare menținută în vid. Aceasta
produce ioni încărcați pozitiv. Energia electronilor face ca un electron să fie
expulzat din moleculă, formând un ion molecular și ioni de fragment. Această
tehnică este utilizată în mod obișnuit pentru GC-MS.
Mai multe metode de ionizare se bazează pe utilizarea câmpurilor
electrice. În cazul electrospray (ES), un lichid este pompat printr-un capilar
din oțel inoxidabil menținut la un potențial de câteva mii de volți. Rezultă o
pulverizare de picături foarte încărcate. Picăturile sunt uscate cu ajutorul
căldurii și/sau al unui flux de gaz, iar după evaporare, sarcinile sunt reținute
de moleculele probei. Acest lucru face din electrospray o metodă de ionizare
adecvată pentru cromatografia lichidă/spectrometria de masă (LC/MS).
Aplicabilitatea sa la proteinele RMM mari rezultă din faptul că în
electrospray ionii formați sunt adesea multiplu încărcați și, prin urmare,
valorile lor m/z se încadrează în capacitățile instrumentelor convenționale.
Separarea ionilor
Instrumente sectoriale
Separarea ionilor în funcție de raportul m/z al acestora se realizează cu
ajutorul câmpurilor electrice și/sau magnetice în mai multe moduri.
Traiectoriile ionilor care se deplasează în astfel de câmpuri sunt determinate
de valorile m/z ale acestora, iar acestea pot fi monitorizate pentru a se stabili
masa lor. Instrumentele cu dublă focalizare utilizează efectele combinate ale
câmpurilor electrice și magnetice pentru a efectua separarea (figura 3.19).
Într-un instrument tipic, după ce ionii au fost accelerați departe de sursa de
ioni
Fantă de monitorizare
Sectorul magnetic
Sectoru
l
electri
c
Câmpul
magnetic
Figura 3.19
Diagrama schematică a unui
spectrometru de masă sectorial. Detector
printr-un potențial de câțiva kilovolți, acestea trec prin fante pentru a reduce
răspândirea. Fasciculul de ioni trece apoi printr-un sector electric, format prin
aplicarea unui potențial între două plăci. Acest lucru are ca efect devierea
fasciculului într-un arc electric, concentrând ionii de energii similare,
indiferent de raportul masă/încărcare, la fanta de monitorizare. Separarea
maselor se realizează în sectorul magnetic sub forma
raportul dintre masă și sarcină va determina curbura traseului parcurs de ioni.

Unele instrumente utilizează o matrice de dispozitive de detecție multiple
pentru a înregistra simultan ionii cu mai multe rapoarte m/z diferite, în timp
ce, mai frecvent, altele scanează câmpul magnetic pentru a înregistra câte un
m/z pe rând pe un detector punctual.
Instrumente cuadripolare
Ionii sunt propulsați de la sursa de ioni în analizorul cuadripolar (figura 3.20)
pri ntr - o tensiune de accelerare mică, de numai câțiva volți. Aceștia intră în
spațiul
Figura 3.20
Reprezentarea
Intr
are
,.- ;-
;=i:r
schematică a unei
----------------------------------- {)
n
tJ
--
Ion Focalizare ionică

sistem de sursa electrozi Analizator de Detector
spectrometru de masă
cuadripolar
masă cuadripolar.
între patru sau mai multe tije paralele care sunt poziționate cu precizie și care
au o tensiune continuă și un potențial de radiofrecvență asociat fiecărei
perechi opuse. Sub influența câmpurilor electrice combinate, ionii oscilează și
urmează traiectorii complexe prin tije. Separarea ionilor în funcție de masă
poate fi realizată prin modificarea tensiunii continue și a tensiunii de
radiofrecvență, menținând constant raportul dintre cele două. Cu toate că acest
tip de instrument are o res oluție mai mică decât instrumentele cu sector
magnetic, este robust și este disponibil în modele de banc, iar tensiunile tijelor
pot fi modificate cu ușurință pentru a se concentra pe anumiți ioni (SIM). Acest
lucru îl face foarte util pentru lucrări cantitative.
Un instrument care stochează ioni și apoi îi ejectează pe cei cu mase
selectate se numește capcană de ioni. Ca și analizoarele cuadripolare, aceste
instrumente utilizează câmpuri electrice pentru a efectua separarea și se
bazează pe o tehnologie similară. Astfel de sisteme pot fi considerate ca
alternative la SM în tandem.
O altă abordare a separării ionilor se bazează pe diferențele de viteză ale
acestora după accelerarea printr-un potențial. Masa este legată de timpul
necesar pentru a ajunge la detector. Această metodă este cunoscută sub
numele de TOF-MS.
Spectrometrie de masă în tandem (MS/MS)

Acest lucru înseamnă, în principiu, că două instrumente au fost legate între
ele. Primul analizor poate înlocui etapa tradițională de separare
cromatografică și este utilizat pentru a produce ioni cu valori m/z alese.
Fiecare dintre ionii selectați este apoi fragmentat prin coliziune cu un gaz, iar
analiza de masă a acestor ioni produși este efectuată în cel de-al doilea
analizor. Spectrul de masă rezultat este utilizat pentru identificarea acestora.
Combinațiile potențiale ale diferitelor instrumente cu sector magnetic și
cuadripolare pentru a forma astfel de sisteme cuplate sunt considerabile.
Capcanele de ioni pot funcționa, de asemenea, în modul MS în tandem.
Computer
Spectrometrele de masă moderne sunt controlate în totalitate de un calculator
pentru toate aspectele legate de funcționare, inclusiv scanarea automată,
procesarea semnalului și colectarea datelor,
cuantificarea și, pentru identificare, căutarea în biblioteci. Această ultimă

funcție implică compararea spectrului obținut cu cel al compușilor cunoscuți
din baza de date a computerului.
Cuantificare
Standardele interne sunt utilizate în activitatea cantitativă într-un mod similar
cu GLC. Aceștia sunt, de obicei, omologi sau analogi marcați izotopic ai ana
litului, de exemplu deuteriu (2H).
Secțiunea 3.2
1. Care dintre următorii solvenți este cel mai polar?
(a) Cloroform.
(b) Benzen.
(c) Metanol.
(d) Acetonă.
2. În GLC, dacă se utilizează o fază staționară cu o constantă
McReynolds de valoare mică, care dintre următoarele substanțe vor
fi eluate rapid din coloană?
(a) O moleculă polară.
(b) O moleculă nepolară.
(c) O moleculă RMM mare.
(d) O moleculă cu un punct de fierbere scăzut.
3. O coloană cu un număr mare de plăci teoretice este susceptibilă să
ofere o bună rezoluție a probelor.
PENTRU CĂ
numărul teoretic de plăci este o măsură a lărgirii benzii care apare în
timpul unei separări.
4. Este necesar să se utilizeze un factor de răspuns numai atunci când se
lucrează cu standarde externe.
PENTRU CĂ
un detector poate răspunde diferit la substanța de testat și la standard.
Grupurile ionizabile dintr-o moleculă îi conferă acesteia un caracter ionic și,

ca urmare, în anumite condiții, aceasta va purta o sarcină. Cu toate acestea,
intensitatea acestei sarcini și, în cazul multor molecule, semnul (pozitiv sau
negativ) depind de pH-ul și de compoziția soluției. Aceste proprietăți stau la
baza mai multor metode de separare, și anume cromatografia cu schimb de
ioni și electroforeza (figura 3.21).
3.3.1 Cromatografie de schimb de ioni

Deși fenomenul schimbului de ioni a fost apreciat de mulți ani, dezvoltarea
de către D' Alelio în 1942 a mediilor sintetice de schimb de ioni pe bază de
rășini de polistiren a fost cea care a extins utilizarea schimbului de ioni ca
instrument analitic.
NATURA
IONICĂ
este afectat de
numărul și natura grupărilor ionizabile

pH-ul mediului înconjurător
prezența altor ioni
asocierea de ioni cu mișcare într-un câmp

sarcini opuse electric
10N;E eyj l--.,-:-

CHR 'l'9(i .,
Figura 3.21 Metode de Direcția și viteza de

separare în care natura Concurența pentru locurile deplasare depind de
de legare ionică pe o rășină semnul și intensitatea
ionică a moleculei de testat
sarcinii ionice
joacă un rol important.
O rășină schimbătoare de ioni constă într-o matrice insolubilă, poroasă,

care conține un număr mare de o anumită grupare ionică, capabilă să lege ioni
cu sarcină opusă din soluția înconjurătoare. Prin urmare, o rășină
schimbătoare de cationi conține anioni fixi, iar cationii mobili pot fi orice
cationi din soluție. Cromatografia schimbătoare de ioni este, în esență, o
tehnică de deplasare în care ionii din probă sau din tampon deplasează ionii
mobili existenți asociați cu ionii fixați ai rășinii (figura 3.22).
Rășinile schimbătoare de ioni sunt polimeri reticulați, de obicei pe bază
de polistiren, celuloză sau agaroză. Polistirenul este de natură hidrofobă și
este util pentru ionii anorganici și moleculele mici, în timp ce celuloza și
agaroza sunt hidrofile și mai utile pentru moleculele mai mari, importante din
punct de vedere biologic,
de exemplu, proteine și acizi nucleici, care fie ar fi afectați în mod negativ de
un mediu hidrofob, fie nu ar putea avea acces la structura porilor mici.
Gradul de reticulare a rășinii este semnificativ în sensul că sporește
rigiditatea și insolubilitatea rășinii, dar reduce, de asemenea, dimensiunea
porilor, ceea ce nu este de dorit atunci când se lucrează cu macromolecule.
Reticularea polistirenului este exprimată ca procent de divinilbenzen (grupul
de reticulare) preambulat în preparatul original și se situează de obicei între 8
și 10%.
Deși, teoretic, orice grup ionic poate fi utilizat într-o rășină
schimbătoare de ioni, în practică numărul acestora este limitat (tabelul 3.10).
Pentru ca schimbul de ioni să aibă loc, grupul legat de rășină trebuie să fie
ionizat, iar capacitatea sa de a face acest lucru este legată de puterea sa (sau
de capacitatea de disociere). Disocierea acizilor slabi este suprimată de
prezența unor concentrații doar puțin crescute de i o n i d e hidrogen, în
timp ce forma ionică a unei baze slabe (forma sa
----0
.g
0 0
G
0
-p
". .". .
0 Q
C )
-----0
0
-s
C:
-0p
08
G
-
u 0 0
----0
0 0
,--------A ------ ,
Rășină și Anioni
cationi mobili
imobili
Figura 3.22 Cromatografie de schimb de ioni. Ionii mobili intră în competiție pentru
ionii imobili fixați în rășină. Principalii factori care influențează procesul sunt
concentrația molară a ionilor și sarcina pe care o poartă aceștia.
acidul conjugat) se disociază odată cu creșterea pH-ului:

NH2 H+ "" NH2 + H+
Prin urmare, o rășină schimbătoare de ioni nu poate fi utilizată la un pH

care suprimă ionizarea grupului, iar rășinile schimbătoare de anioni slabi, de
exemplu, sunt eficiente numai în intervalul de pH 2-8. Cu toate acestea, acizii
și bazele mai puternice pot fi utilizate în aproape toată gama de pH-uri.
Principalul considerent în selectarea unei rășini este sarcina purtată de
ionii de testare. În cazul ionilor anorganici necomplecși, aceasta este relativ
constantă, dar pentru multe molecule, ea poate fi modificată considerabil prin
variații ale pH-ului.
Există trei factori majori care determină legarea ionilor într-un astfel de
sistem competitiv. Mărimea încărcăturii purtate va face ca ionii divalenți să
prezinte o afinitate mai mare pentru rășină decât ionii monovalenți.
Intensitatea sarcinii este, de asemenea, semnificativă, iar ionii monovalenți
mici, de exemplu hidrogenul, vor prezenta o afinitate mai mare decât ionii
monovalenți mari, de exemplu potasiul. La aceste două considerente se
suprapune efectul concentrației ionilor, care este demonstrat de faptul că o
concentrație mare a unui ion cu afinitate scăzută este capabilă să înlocuiască o
concentrație scăzută a unui ion cu afinitate mai mare pentru rășină. Controlul
atent al acestor trei factori este cel care asigură selectivitatea în separările prin
schimb de ioni (figura 3.22).
Metode în cromatografia de schimb ionic

Cromatografia de schimb de ioni poate fi utilizată fie pentru purificarea unui
component individual, fie pentru fracționarea unui amestec. Pentru a izola o
anumită componentă
Tabelul 3.10 Mediile schimbătoare de ioni
Mediu Natura Interval Aplicații

de pH
eficient
Schimbătoare de anioni Acizi puternici, de exemplu,

Amoniu cuaternar Puternic 2-11 nucleotide Acizi slabi, de
Amoniu terțiar Intermediar 2-7 exemplu, acizi organici Puțin
Dietilaminoetil1 Slabă 3-6 polianionici, de exemplu, proteine
Schimbători de cationi
Sulfonat Puternic 2-11 Baze puternice, de exemplu,
Carboxilat Intermediar 6-10 aminoacizi Cationi slabi, de
Carboximetil1 Slabă 7-10 exemplu, peptide Poliacationi
slabi, de exemplu, proteine
dintr-un amestec, acesta poate fi reținut în mod selectiv pe o rășină, în timp ce

componentele nedorite, care, în condițiile analizei, ar trebui să fie neîncărcate sau
să poarte aceeași sarcină ca și rășina, vor fi eluate. Ulterior, componenta necesară
poate fi ea însăși eluată într-un volum mic de tampon adecvat. Invers, rășina poate
fi selectată astfel încât compusul necesar să nu se lege, dar i o n i i nedoriți să se
lege, iar proba să poată fi eluată rapid din coloană fără ionii contaminanți.
Compușii neutri se pretează la această tehnică în care un pat de rășini mixte de
anioni și cationi poate elimina ionii nedoriți și îi poate înlocui cu apă (H+ și OH-).
Tehnica de fracționare este utilizată pentru probele care conțin amestecuri de ioni
similari și permite separarea și cuantificarea fiecărui component, diferitele
componente fiind eluate secvențial pe măsură ce se schimbă poziția solventului.
Sub această formă, cromatografia cu schimb de ioni este utilizată ca tehnică
HPLC.
Rășina trebuie pregătită pentru utilizare prin spălarea ei cu o soluție care
conține o concentrație mare de un ion care are o afinitate mare pentru rășină, de
exemplu acid clorhidric sau soluție de hidroxid de sodiu (1,0 mol 1-1 ). Ionii de
hidrogen și de hidroxil vor deplasa toți ceilalți ioni prezenți din mediile de schimb
de cationi și, respectiv, de anioni. După spălarea în apă sau în soluție tampon
pentru a elimina excesul de acid sau de alcalin, se spune că rășina se află în forma
de hidrogen, respectiv de hidroxil. Pentru anumite aplicații poate fi necesară
transformarea ei într-o formă ionică diferită, de exemplu forma de sodiu, care are
o afinitate pentru rășină comparabilă cu cea a ionului de testat. Rășina se
echilibrează în final cu tamponul ales, al cărui pH trebuie ales cu grijă pentru a
asigura ionizarea corectă atât a ionilor de test, cât și a rășinii.
Se aplică un volum mic de probă pe coloană, iar componentele
amestecului sunt eluate cu ajutorul tamponului. În funcție de complexitatea
probei, se poate utiliza un singur tampon (separare izocratică) sau o tehnică de
gradient. Eluția în gradient implică, în mod normal, fie modificări ale pH-ului
(care determină modificări ale afinității ionilor pentru rășină), fie modificări
ale concentrației tamponului (care determină deplasarea ionilor de testare).
3.3.2 Electroforeză
Electroforeza este termenul dat migrației particulelor încărcate sub influența
unui curent electric continuu. Este un sistem monofazat și depinde de
mobilitățile relative ale ionilor în condiții electrice identice.
Tehnicile electroforetice cu limite mobile, demonstrate inițial de

Tiselius în 1937, utilizează un tub în formă de U, în care proba ocupă partea
inferioară a U-ului, iar cele două membre sunt umplute cu grijă cu un
electrolit tamponat, astfel încât să se mențină limite clare cu proba. Electrozii
sunt scufundați în electrolit și se trece curent continuu între ei. Viteza de
migrare a probei în câmpul electric se măsoară prin observarea mișcării
limitei în funcție de timp. În cazul probelor incolore, diferențele de indice de
refracție pot fi utilizate pentru a detecta limita. Astfel de tehnici de deplasare a
limitei mobile sunt utilizate în principal fie în studiile privind caracteristicile
fizice ale moleculelor, fie în procesele de preparare în masă.
Tehnicile zonale sunt cea mai frecvent utilizată formă de electroforeză
și implică aplicarea unui eșantion ca o zonă mică pe o suprafață relativ mare
de mediu inert de susținere care permite detectarea ulterioară a zonelor
separate de eșantion. A fost dezvoltată o gamă largă de medii de susținere, fie
pentru a elimina dificultățile cauzate de anumite medii (de exemplu, efectele
de adsorbție ale hârtiei), fie pentru a oferi caracteristici suplimentare (de
exemplu, efectele de cernere moleculară ale gelului de poliacrilamidă).
Deși efectele de frecare moleculară împiedică mișcarea moleculelor
printr-un lichid, efect care crește odată cu mărimea moleculei, factorii
principali în electroforeză sunt sarcina purtată de moleculă și tensiunea
aplicată. Natura încărcăturii (pozitivă sau negativă) va determina direcția de
migrare, în timp ce mărimea încărcăturii va determina viteza relativă.
Această sarcină, deși inițial se datorează efectelor de ionizare mediate
de pH-ul tamponului, va fi modificată în mod semnificativ de alte
caracteristici ale compoziției tamponului. Pentru o particulă coloidală în
suspensie, de exemplu o proteină, suprafața sa încărcată este înconjurată de un
strat de ioni cu sarcină opusă proveniți din soluție (figura 3.23). Există un strat
imobil, fix, de ioni adsorbiți pe suprafață și un strat difuz, mobil, care devine
mai mobil odată cu creșterea distanței față de suprafața coloidului. Sarcina
dezvoltată de moleculă se datorează naturii sale chimice și pH-ului
tamponului și este cunoscută sub numele de potențial electrochimic. În cazul
coloizilor, acesta se reduce pe măsură ce crește concentrația de sare din
tampon, datorită efectului de neu-- tralizare parțială a stratului de ioni adsorbit.
Sarcina netă rezultată este cunoscută sub numele de potențial zeta și este
factorul determinant al mobilității electroforetice. Efectul combinat al
straturilor fix și mobil de ioni crește, de asemenea, dimensiunea particulei și
reduce și mai mult mobilitatea acesteia.
Mobilitatea electroforetică a unui ion este invers legată de tăria ionică a
tamponului, mai degrabă decât de concentrația molară a acestuia. Forța ionică
(µ.,) a unui tampon este jumătate din suma produsului dintre concentrația
molară și valența la pătrat pentru toți ionii prezenți în soluție. Factorul de o
jumătate este necesar deoarece numai jumătate din totalul ionilor prezenți în
tampon poartă o sarcină opusă coloidului și sunt capabili să modifice sarcina
acestuia:
1
µ, = 2'i, ct2
Viteza de deplasare a unei particule încărcate este, de asemenea, legată
de gradientul de tensiune aplicat pe mediul de susținere, care este exprimat în
volți pe centimetru (adică distanța dintre electrozi). Curentul generează
căldură,
+ +
+ +
+
+
+
+
+ +
+
+ +
Sarcina Strat mobil de

netă a ioni atrași de
molecule coloid care îi
i măresc
datorată dimensiunea
grupărilo Stratul efectivă și îi
r adsorbit de reduc astfel
ionizabil ioni are ca mobilitatea
e rezultat o
sarcină
redusă
POTENȚIAL ZETA
ELECTROCHIMI POTENȚIAL
C
Figura 3.23 Sarcina pe un coloid. Sarcina purtată de un coloid din cauza compoziției
sale chimice și a pH-ului soluției (potențialul electrochimic) este redusă prin adsorbția
ionilor din soluție, iar sarcina rezultată este cunoscută sub numele de potențial zeta.
ceea ce determină o creștere a conductivității soluției de electrolit, ceea ce

duce la o creștere suplimentară a curentului. Această creștere a temperaturii va
provoca o anumită evaporare a soluției tampon, care, în cantitatea mică
menținută în mediul de susținere, va duce la o creștere a concentrației
acesteia. Acest lucru va afecta atât potențialul zeta al coloidului, cât și
conductivitatea tamponului. Din cauza acestor efecte, este necesar să se
controleze într-un fel sau altul temperatura sistemului și să se aleagă între
utilizarea unei tensiuni fixe și a unui curent fix. Unele surse de energie au
posibilitatea de a selecta o putere de ieșire fixă, ceea ce reprezintă, de fapt, o
poziție de compromis.
O problemă suplimentară cu unele medii de susținere este fenomenul de
electroendosmoză, în care tamponul însuși se mișcă datorită unui efect
electroforetic și, prin urmare, maschează mișcarea solutului într-o anumită
măsură. Cu toate acestea, această caracteristică este exploatată în anumite
situații pentru a facilita separarea. Electroendosmoza este cauzată de prezența
grupărilor cu sarcină negativă pe
---
pe suprafețele unor medii de suport, de exemplu hârtie, agar, iar acestea induc
o sarcină opusă în soluția tampon. Ca urmare, în condiții alcaline, tamponul se
deplasează spre catod, viteza fiind mai mare în cazul concentrațiilor mai mici
de tampon.
Este disponibilă o gamă largă de echipamente electroforetice și, deși
acestea variază considerabil în ceea ce privește aspectul, există un design de
bază comun (figura 3.24). Un rezervor bine conceput ar trebui să includă un
capac pentru a preveni orice evaporare semnificativă din mediul de susținere,
iar un sistem de răcire eficient este necesar atunci când se utilizează geluri sau
tehnici de înaltă tensiune. Acesta se află de obicei în
Electrod Electrod
Electrolit Mediu de
Figura 3.24
tamponat susținere
Un rezervor de îmbibat în
electroforeză. tampon
sub forma unei baze din plastic sau metal izolate electric pentru suportul medi
um, prin care circulă apă rece. Este necesară o sursă de tensiune stabilizată, iar
dispozitivele de siguranță de pe întregul echipament sunt esențiale pentru a
preveni accidentele, în special dacă se utilizează tensiuni înalte.
Suport media
În cazul în care suportul este o foaie sau o membrană, acesta este îmbibat în
electrolit tamponat, excesul fiind îndepărtat înainte de aplicarea probei.
Alternativ, se poate prepara un gel, cum ar fi agar sau poliacrilamidă, în
tampon și se poate folosi o placă sau o coloană pentru procesul de separare.
Hârtia de filtru a fost un mediu extrem de util și convenabil timp de
mulți ani și, în comparație cu unele dintre cele mai recente medii cu
membrană, este capabilă să manipuleze un volum relativ mare de probă, de
exemplu 10 µ1. Cu toate acestea, structura ran dom a hârtiei are tendința de a
produce neregularități în modelele de separare, iar natura relativ polară a
celulozei prezintă unele efecte de adsorbție, ceea ce determină un grad
semnificativ de "coadă" a zonelor. În plus, volumul mare de tampon din
hârtie, deși reprezintă un avantaj din punct de vedere al conductivității și al
evaporării, din cauza timpilor de separare relativ lungi (12-18 ore), are ca
rezultat o difuzie semnificativă și, prin urmare, o lărgire a zonelor.
Membrana din acetat de celuloză (CAM) a fost dezvoltată cu scopul de a
reducerea naturii polare a hârtiei prin acetilarea grupărilor hidroxil și
obținerea unei structuri de pori mai regulat definite. Din aceste motive, are
avantaje considerabile față de hârtie și prezintă efecte adsorbante minime la
viteze de separare crescute (1-2 ore), dar prezintă în continuare efecte
electroendosmotice. Trebuie să se acorde o atenție deosebită manipulării
membranei, care este
foarte fragilă atunci când este uscată, dar este mult mai rezistentă atunci când
este umedă. Pe membrana de acetat de celuloză se poate aplica mai puțin
eșantion decât pe hârtie, fiind obișnuite volume de 1-2 /LI. După localizarea
benzilor separate, membrana poate fi făcută transparentă pentru densitometrie
prin înmuiere fie într-un ulei, fie într-un amestec de solvenți organici
specificat de producător.
O varietate de geluri a fost utilizată pentru tehnici de preparare și pentru
a elimina unele dintre dezavantajele mediilor de suport solide. Se utilizează
agar purificat la o concentrație de IO g1-1 într-un electrolit tamponat, iar
probele sunt introduse într-o mică fântână sau jgheab tăiat în gel. Acesta
prezintă un grad apreciabil de electroendosmoză și, datorită naturii sale
polare, determină precipitarea unor substanțe, în special a lipoproteinelor. În
astfel de situații, utilizarea agarozei (5-8 g 1-1), o fracțiune mai puțin polară de
agar, elimină practic orice efect electroendosmotic și oferă un efect de cernere
moleculară cu molecule mari, cum ar fi proteinele și acizii nucleici.
Efectul de cernere moleculară poate fi crescut considerabil prin
utilizarea gelurilor cu o structură poroasă mai mică. Gelul de amidon se
prepară prin hidroliza parțială a amidonului de cartof; cu cât gradul de
hidroliză este mai mare, cu atât fragmentele sunt mai mici și, prin urmare, cu
atât dimensiunea porilor gelului rezultat este mai mică. Într-un astfel de
mediu, moleculele mai mari sunt împiedicate de structura porilor și, prin
urmare, nu se mișcă la fel de rapid ca moleculele mai mici cu aceeași sarcină
(figura 3.25).
Figura 3.25 Electroforeza în gel de amidon a proteinelor serice umane. Probele 1 și

2 sunt normale, în timp ce probele 3, 4 și 5 prezintă o bandă suplimentară
adiacentă albu minului normal, care se datorează prezenței bis-albuminei. Proba 7
conține o proteină de mielom care a rămas în apropierea originii. (Fotografie
realizată cu permisiunea Dr. D. Brocklehurst, Departamentul de chimie clinică,
Doncaster Royal Infirmary, Marea Britanie).
Gelul se prepară prin încălzirea unei suspensii de amidon în tamponul

adecvat (150 g 1-1 ) într-o baie de apă clocotită până când amestecul devine
translucid. Se aplică un vid în balon pentru a elimina bulele de aer și se
adaugă gelul.
se toarnă rapid într-o tavă încălzită și se lasă să se răcească pentru a forma

un gel de aproximativ 5 mm grosime. În timpul electroforezei, gelul
trebuie răcit în mod corespunzător pentru a preveni topirea sa, iar
separările pot dura până la 6 ore la aproximativ 150 V. Aceste geluri sunt
extrem de fragile, iar metoda de hidroliză este complet arbitrară; este
dificil de reprodus dimensiunea porilor în preparate succesive.
Poliacrilamida prezintă multe avantaje față de gelul de amidon ca
mediu pentru electroforeza de înaltă rezoluție și, datorită naturii sale
sintetice, dimensiunea porilor poate fi controlată mai ușor. Gelul se
formează prin polimeerizarea celor doi monomeri, acrilamida și un agent
de reticulare, N, N-metilen-bis-acrilamida (figura 3.26). Proporția celor
doi monomeri și nu concentrația totală a acestora este factorul principal în
deter minarea dimensiunii porilor, aceasta din urmă având un efect mai
mare asupra elasticității și a
Acrilamidă
CH2= CH-C-NH2
II
0
Metilen-bis-acrilamidă
CH2 = CH - C- N- CH2 - N- C- CH = CH2
II I I 11
0 H H 0
Poliacrilamidă ,,
-CH2-CH- i CH2-CH-
I I
C=O C=O
I I
NH2 NH2
-CH2-CH- CH2-CH-
I " I
C=O C=O
I I
NH2 NH2
Figura 3.26 Poliacrilamidă.

Prepararea gelului
Se prepară un amestec care conține:
1 volumul tamponului selectat,
2 volume din amestecul de monomeri selectat, I
volum de TEMED (3,0 g 1-1).
Oxigenul dizolvat (care tinde să inhibe reacția) este eliminat sub vid. Se adaugă
patru volume de persulfat de amoniu (3,0 g 1-1) și se amestecă ușor înainte de a se
turna în matriță. Amestecul se acoperă cu un strat subțire de apă pentru a exclude
aerul și se lasă să se polimerizeze (aproximativ 30 de minute). Trebuie purtate
mănuși de protecție, iar prepararea gelului trebuie să se facă într-o vitrină de fum,
deoarece monomerii sunt toxici.
transparența gelului. O concentrație totală minimă de aproximativ

Pentru formarea gelului sunt necesare 20 g 1-1 , deși se folosesc frecvent
concentrații de 70 g 1-1. Dimensiunea porilor gelului scade odată cu
creșterea proporției de bis-acrilamidă, o valoare limită de aproximativ 5%
din total dând dimensiunea minimă a porilor. Pentru electroforeza
proteinelor, se folosesc adesea geluri care conțin 2,5% din agentul de
reticulare.
Polimerizarea gelului poate fi realizată fie prin fotoactivare cu
ultraviolete cu riboflavină, fie, de preferință, folosind persulfatul de
amoniu ca și catalizator. Este necesar să se includă un inițiator pentru
reacție, TEMED (tetrametiletilendiamină) fiind utilizat în mod obișnuit.
Electroforeza cu gel de poliacrilamidă (PAG) se realizează fie în
tuburi de sticlă cilindrice, fie în paturi plate (figura 3.27). Metoda este
comparabilă cu alte tehnici de electroforeză, dar trebuie să se aibă grijă să
se mențină curentul la un nivel scăzut pentru a preveni orice efect
semnificativ de încălzire.
Figura 3.27 Electroforeza pe gel de gradient de poliacrilamidă a pro teinelor

serice umane. Proteinele sunt separate într-un gel care are un gradient de concentrație
în creștere, cu o scădere paralelă a dimensiunii porilor, ceea ce limitează mișcarea
moleculelor mai mari. Observați numărul mare de benzi proteice diferite care pot fi
evidențiate. (Fotografie realizată cu permisiunea Dr. D. Brocklehurst, Departamentul
de chimie clinică, Doncaster Royal Infirmary, Regatul Unit).
Electroforeza PAG este o tehnică importantă în multe domenii. În

secvențierea ADN-ului, aceasta oferă o metodă fundamentală de separare, iar
în studiul proteinelor este importantă atât în forma descrisă aici, cât și în
combinație cu detergentul dodecil sulfat de sodiu (SDS), oferind o metodă
valoroasă de evaluare a masei moleculare relative a unei proteine.
3.3.3 ls lectric focusare

Electroforeza depinde în primul rând de sarcina purtată de o moleculă, dar la
pH-ul său izoelectric (pl) o moleculă nu va migra într-un câmp electric. Dacă
electroforeza este efectuată într-un electrolit care are un gradient de pH,
moleculele vor migra spre punctul în care pH-ul soluției este același cu pH-ul
lor izoelectric și vor rămâne acolo atâta timp cât gradientul și diferențele de
potențial sunt menținute. Aceasta este baza tehnicilor de focalizare izo-
electrică (figura 3.28).
0
Electrolit catodic
ow ow ow pH
10
9
0
0 0
B
l O
01 0
l 8
0l 7
o I t t 5
Ofo 00
A 4
0 0 0
3
t t t 2
H+ H+ H+H+ H+
H+
0
Electrolit anodic
Figura 3.28 !a focalizare so-electrică. O proteină care are un pH izoelectric de 6, în

poziția A în gradientul de pH, se află pe partea acidă a pH-ului său izoelectric și va
purta o sarcină pozitivă (H+). Aceasta va migra prin electroforeză spre catod. În
poziția B, sarcina proteinei va fi negativă și va migra spre anod. În ambele cazuri,
mișcarea se face spre poziția sa de pH izoelectric, unde va rămâne.
Gradienții artificiali de pH nu pot fi produși în același mod ca și

gradienții de concentrație, ci pot fi formați numai pe cale electroforetică.
Dacă se utilizează un acid ca electrolit anodic și un alcalin ca electrolit
catodic, atunci când se aplică un voltaj, ionii de hidrogen și hidroxil se vor
deplasa unul spre celălalt. Un gradient de pH format în acest mod ar fi extrem
de fragil și trebuie să fie stabilizat cu agenți tampon corespunzători. Aceștia
vor migra, de asemenea, electroforetic spre punctele lor de pH izoelectric și,
deoarece nu vor avea sarcină la
acel punct poate, de asemenea, să nu prezinte conductivitate electrică,

perturbând astfel procesul electroforetic. Utilizarea acizilor poliamino-
policarboxilici, care prezintă o conductivitate electrică semnificativă la
valorile lor pl, permite formarea unui gradient de pH stabil. Acești compuși
sunt disponibili în comerț, adesea sub denumirea comercială de ampoliți
purtători de amfolină.
-CH2-r-(CH2)x-7-CH2-
(CH2)x (CHz)x
I I
NR2 COOR
unde R = Hor -(CH2)x-COOH și
x = 2 sau 3
Amfolinele sunt disponibile cu o gamă largă de valori pl, ca urmare a

naturii lor chimice precise, ceea ce permite formarea de gradienți de pH care
variază de la 2,5 la 11 sau în intervale de pH mai restrânse. Ele au mase
moleculare relative sub 1000 și, prin urmare, pot fi separate cu ușurință de
macromoleculele probei după electroforeză, fie prin dializă, fie prin tehnici de
permeabilitate a gelului. Aceștia prezintă toate calitățile necesare pentru
tehnicile de focalizare izoelectrică, adică o capacitate de tamponare ridicată, o
solubilitate ridicată și o conductivitate bună, deși minimă, la valorile lor pl. În
general, nu au efecte toxice asupra celulelor sau sistemelor enzimatice și nici
nu prezintă efecte antigenice, iar aceste caracteristici sunt adesea importante
atunci când se lucrează cu probe biologice.
Un gradient de pH este produs prin încorporarea unui amestec de
amfoline cu valori pl corespunzătoare fie într-o placă, fie într-o coloană de
poliacrilamidă. Se utilizează un acid la anod și un alcalin la catod, pH-ul
acestora fiind aproximativ același cu valorile pl ale celor două extreme ale
intervalului de amfoline. Acidul fosforic ș i hidroxidul de sodiu sunt adecvate
pentru separări cu interval larg, în timp ce pentru intervale intermediare de pH
se folosesc diverș i electroliți amino sau carboxilici.
Amestecul de amfoline va prezenta inițial un pH care este aproximativ
media tuturor valorilor lor, dar aplicarea unei tensiuni va face ca fiecare dintre
ele să migreze spre unul dintre electrozi, dar, datorită gradientului de pH care
se dezvoltă, fiecare amfolină se va opri din mișcarea electroforetică la pH-ul
său izoelectric. Gradientul va fi menținut atâta timp cât tensiunea este aplicată,
dar este necesară stabilizarea acestuia folosind fie un gel, fie un gradient de
concentrație de zaharoză în tehnicile de coloană lichidă.
Majoritatea bazinelor de electroforeză cu platformă sunt adecvate pentru
focalizarea izoelectrică, cu condiția să fie posibilă o susținere și o răcire
adecvată a gelului. Tehnicile mai recente tind să utilizeze tensiuni relativ
înalte (1-2 kV), dar se pot obține separări satisfăcătoare folosind tensiuni mai
mici, de 400-500 V, deși timpul de separare va fi mai lung (3-4 ore).
Gelul de amfolină preparat se așează în rezervor, iar benzile groase de
hârtie de filtru se îmbibă cu electrolit anodic sau catodic și se plasează de-a
lungul marginii corespunzătoare a gelului. Probele pot fi aplicate fie pe mici
pătrate de hârtie de filtru așezate pe suprafața gelului, fie, pentru lucrări de
pregătire în masă, încorporate în gel. Tensiunea corespunzătoare este aplicată
prin intermediul unor terminale atașate la electrozii de muștiucă și, după
aproximativ 30 de minute, poate fi oprită pentru a permite îndepărtarea
hârtiilor de filtru pentru probe înainte de a continua separarea.
Este dificil de știut când separarea este completă, dar dacă două probe
de proteine colorate, de exemplu hemoglobina, sunt plasate una lângă
cealaltă, dar în poziții diferite pe gel, vor forma în cele din urmă benzi clare la
nivelul
5. .. _J_ . .. _.
0 2 3 4 5
Distanța de la origine (cm)
Figura 3.29 Focalizarea izoelectrică a variantelor de hemoglobină și a

derivaților. Cele două separări exterioare sunt ale unui amestec de markeri proteici
colorați cu o gamă de valori cunoscute ale p/. Aceștia sunt utilizați pentru a calibra
gradientul de pH format în mediul de focalizare izoelectrică și permit astfel
determinarea valorii p/ a proteinelor de test. Cele trei modele de separare interioară
reprezintă diferiți derivați ai hemoglobinei și ilustrează valoarea analitică a tehnicilor
de focalizare izoelectrică.
aceeași poziție, ceea ce indică finalizarea procesului. Atunci când separarea

este completă, este esențial să se fixeze proteina în gel cât mai curând posibil,
de obicei prin imersie în soluție de acid tricloroacetic 5% sau în alt agent de
precipitare adecvat, urmată de o metodă de colorare adecvată (figura 3.29).
3.3.4 lsotacoforeză
Izotacoforeza sau electroforeza de deplasare, așa cum este numită uneori, este
o dezvoltare recentă a unui principiu descris în 1920. În această tehnică,
electrolitul dintre electrozi nu este o soluție unică uniformă, ci o secvență
continuă de soluții electrolitice diferite (figura 3.30), ai căror ioni migrează cu
aceeași viteză. În condiții identice de con centrare și tensiune, diferiți ioni au
mobilități electroforetice diferite și, pentru a determina toți ionii să se
deplaseze cu aceeași viteză, este necesar un gradient de tensiune diferit pentru
fiecare grup de ioni. Aceste gradienți diferiți se dezvoltă spontan în timpul
procesului electroforetic.
Cădere de tensiune de-a lungul tubului
Figura 3.30 Izotacoforeza. Dezvoltarea spontană a unor gradienți de tensiune diferiți

în cele două soluții electrolitice are ca efect faptul că ambele tipuri de anioni migrează
cu aceeași viteză.
În practică, izotacoforeza este, de obicei, realizată în tuburi înguste cu

electrozi la fiecare capăt și reprezintă o formă de electroforeză capilară.
Pentru separarea unui anumit tip de ioni, de exemplu a unui anion, se
selectează două soluții electrolitice tamponate care au anioni diferiți, dar un
cation comun cu capacitate de tamponare. Unul dintre anioni (numit electrolit
conducător) ar trebui să prezinte o mobilitate mai mare decât celălalt anion și
să ocupe capătul anodic al
tubul. Anionul mai lent (electrolitul terminal) ocupă capătul catodic al

tubului, cu o graniță clară care separă cele două soluții. Prin aplicarea unei
diferențe de potențial pe tub, cationul tampon comun migrează spre catod, iar
cei doi anioni spre anod. Situația imposibilă a unui decalaj ionic care rezultă
din mobilitățile diferite ale celor doi anioni este prevenită prin dezvoltarea
spontană a unei căderi de tensiune discontinue de-a lungul tubului (figura
3.30), cu un gradient mai mare care se dezvoltă de-a lungul electrolitului
terminal decât de-a lungul electrolitului conducător, menținând astfel aceeași
viteză pentru toți ionii.
Dacă se introduce un eșantion care conține diverși anioni între
electrodul de plumb și electrolitul terminal, diferiții ioni se vor deplasa cu o
viteză care depinde de mobilitatea lor ionică și de gradientul de tensiune. Un
ion de testare care se află în electrolitul terminal se va deplasa rapid din cauza
tensiunii mai mari, dar când se va deplasa în electrolitul conducător va
încetini din cauza gradientului de tensiune mai mic. În consecință, ionii se vor
deplasa în zone în ordinea descrescătoare a mobilității lor ionice și se va
dezvolta un model de tensiune de-a lungul tubului pentru a menține o viteză
constantă a tuturor ionilor. Acest lucru stă la baza formei calitative sau
pregătitoare a izozoforezei.
În plus față de acest aspect calitativ, izoacoforeza poate fi utilizată și din
punct de vedere cantitativ. Odată ce zonele de eșantionare s-au dezvoltat,
conductivitatea fiecărei zone și, prin urmare, căderea de tensiune prin aceasta
va fi legată de concentrația ionilor și, pentru a menține o conductivitate
uniformă, concentrația (adică volumul ocupat de fiecare component) se va
modifica. Prin urmare, la equi librium, nu numai că componentele unui
amestec vor fi separate unele de altele.
UV-abs. UV-abs.
(254 nm) (254 nm)
Acid /acid Acid ascorbic
ascorbic soascorbic
(a) (b)
Figura 3.31 Izotacoforeza analitică. Acidul ascorbic (vitamina C) este prezent în mod
natural în multe alimente și este adesea adăugat în altele. Ocazional, se folosește
izomerul mai ieftin, acidul izoascorbic, care nu are acțiune vitaminică, și care se poate
distinge de izomerul natural prin multe metode analitice. (a) prezintă analiza unei
probe de suc de fructe comercial, în timp ce (b) prezintă același suc de fructe la care s-a
adăugat o cantitate cunoscută (4 nmol) de acid izoascorbic. (Reproducere cu
permisiunea Ll(B, Stockholm, Suedia).
celelalte, dar volumul ocupat de fiecare component va fi proporțional cu

concentrația sa inițială în probă (figura 3.31). Detectoare similare celor
descrise pentru HPLC pot fi adecvate, dar izotacoforeza este o tehnică
specializată și este necesară o instrumentație specială (figura 3.32). Aceasta
seamănă acum cu cea utilizată pentru alte tipuri de electroforeză capilară.
Curent constant
sursa de
alimentare
Electrolit Electrolit de
de frunte terminare
Termic și UV Compartiment
termostatat
5:lilllll :1= zi!l!!!!m1-" "iif-- =l:!!!+:l::!-- i:- ,- ::r!:ll. -t 4m -Eșantionul

I I injecție
I
I ,.. .a l v e :
V I
I
I I
Figura 3.32 I
I
I
I
Diagramă schematică a I
I
RUN :
aparat de I -------------- Umpleți și clătiți - ------------------------ '
izozofoză. INJECTARE
3.3.5 Electroforeză capilară

Electroforeza capilară (EC) este o familie de tehnici înrudite care a început să
câștige popularitate la sfârșitul anilor 1980, când a devenit disponibilă
instrumentația comercială. Aceasta utilizează capilare de silice topită cu alezaj
îngust (20-100 JLm), acoperite la exterior cu plastic (poliimidă) pentru o
durabilitate sporită, pe lungimi de 10-100 cm. (Figura 3.33). Deși se utilizează
tensiuni înalte (până la 30 000 V), căldura este disipată rapid datorită
suprafeței relativ mari și, în mod normal, nu este necesară răcirea.
Computer
=====C=ap=il=lar=y====I
Detector
-------- Tensiune înaltă t--------
Figura 3.33 Electroforeza capilară. Proba este introdusă prin intrare, spălată cu un
tampon de spălare și apoi separată sub influența unei diferențe de potențial între cei doi
electrozi. Zonele sunt monitorizate pe măsură ce trec prin detector, iar datele sunt
captate și calculate.
Proba este de obicei introdusă în capilar prin scufundarea acestuia în

flaconul de probă și aplicarea unei ușoare presiuni pozitive. Astfel, un volum
mic de probă intră în capilar. În funcție de presiune și de
timp, cantitatea poate fi controlată cu atenție. Eșantionul este apoi deplasat în

capilar ca o zonă, iar intrarea în capilar este curățată în același timp prin
extragerea unui volum stabilit de tampon de spălare. Printre tehnicile
alternative se numără sucțiunea, sifonarea și o tehnică electrocinetică, dar
toate obțin același rezultat. Benzile care se separă sunt detectate în timp ce se
află încă în capilar, de obicei prin absorbție, fie în regiunea ultravioletă, fie în
cea vizibilă a spectrului, uneori cu ajutorul unei rețele de diode. Alternativ, se
pot folosi detectoare de fluorescență sau de indice de refracție, iar unele
instrumente conectează capilarul la un spectrometru de masă.
S-a demonstrat că electroforeza capilară are mai multe avantaje față de
alte tehnici de separare și, de la introducerea sa, numărul aplicațiilor descrise
pentru aceasta a crescut rapid. Se pretează la analiza unei game largi de
molecule ionice și neutre de dimensiuni și forme diferite. Timpii de analiză
sunt asemănători cu cei pentru HPLC, fiind de obicei mai mici de 30 de
minute, dar eficiența separării este adesea superioară, iar numărul teoretic de
plăci este de obicei mai mare de 1 X 106 . Se utilizează volume de probă de
nanometre, un aspect de mare importanță atunci când sunt disponibile cantități
limitate. Costurile reactivilor sunt reduse, deoarece pentru fiecare analiză sunt
necesare doar volume de microlitri. Cap ilarele trebuie să fie condiționate sau
regenerate în mod corespunzător înainte de utilizare și trebuie spălate cu apă
și aer pentru depozitare. Instrumentele moderne pot fi programate pentru a
efectua toate etapele analizei, de la introducerea probei până la interpretarea
rezultatelor, care sunt prezentate sub forma unei serii de vârfuri pe un
înregistrator grafic, și pregătirea capilarului pentru proba următoare.
Există mai multe moduri de funcționare a CE care se bazează pe variații
ale principiilor de separare electroforetică.
Electroforeza în soluție liberă (electroforeză în zonă capilară).

Acesta a fost primul tip de electroforeză capilară care a fost dezvoltat.
Migrarea analiților printr-o soluție tampon, care uneori conține aditivi chimici
pentru a îmbunătăți separarea, este influențată de sarcina netă a acestora și de
fluxul elec troendosmotic. Amploarea efectului electroendosmotic se
datorează grupărilor silanolice încărcate negativ de pe peretele capilar, care
atrag ionii încărcați pozitiv din soluția tampon, iar efectul general este
deplasarea soluției tampon către catod. Endosmoza este deosebit de evidentă
în cazul tampoanelor cu pH ridicat și concentrație scăzută. O varietate de
acoperiri polimerice interne pot fi aplicate pe capilare pentru a modifica
efectul electroendosmotic și pentru a extinde astfel aplicațiile metodei.
Cromatografia capilară electrocinetică micelară (MEKC sau MECC)

Aceasta este utilizată pentru a măsura moleculele mici neutre sau încărcate și
se aplică unei game largi de analiți, inclusiv medicamente, nucleozide, peptide
și vitamine. În soluția tampon se adaugă surfactanți, cum ar fi dodecil sulfatul
de sodiu (SOS), pentru a produce agregate anionice numite miceli. Agenții de
suprafață au cozi hidrofobe cu lanț lung (între 10 și 50 de unități de carbon) și
capete hidrofile care, atunci când sunt legate în micelă, sunt îndreptate spre
exterior în soluție. Separarea depinde de interacțiunea analiților cu aceste
micelii încărcate, care le modifică mobilitatea electroforetică. Atunci când
se utilizează agenți tensioactivi încărcați negativ, cum ar fi SDS, analiții

cationici sunt puternic atrași de micelii într-un mod care poate fi comparat cu
situarea în cromatografia cu perechi de ioni, iar sarcina negativă globală a
micelii este redusă.
Anionii și analiții neîncărcați tind să petreacă mai mult timp în
soluția tamponată și, prin urmare, mișcarea lor este legată de aceasta. Deși
acestea sunt generalizări utile, diverși factori contribuie la ordinea de
migrare a analiților. Aceștia includ natura anionică sau cationică a
suprafeței, influența electroendosmozei, proprietățile tamponului,
contribuțiile interacțiunilor electrostatice față de cele hidrofobe și
mobilitatea electroforetică a analitului nativ. În plus, modificatorii
organici,
de exemplu, metanol, acetonitril și tetrahidrofuran sunt utilizate pentru a
îmbunătăți separările, iar acestea cresc afinitatea analiților mai hidrofobi
pentru lichid decât pentru faza micelară. Efectul de chiralitate al analitului
asupra interacțiunii sale cu micela este utilizat pentru a separa
enantiomerii care fie sunt deja prezenți într-o probă, fie au fost produși
chimic. O astfel de derivatizare precapilară a fost utilizată pentru a
produce aminoacizi chirali pentru electroforeza capilară. O abordare
alternativă a separărilor chirale este încorporarea de aditivi, cum ar fi
ciclodextrinele, în soluția tampon.
Electroforeza pe gel capilar

Această tehnică este utilizată pentru analiza moleculelor mari, cum ar fi
proteinele și acizii nucleici. Proprietatea de filtrare moleculară a gelurilor este
importantă în procesul de separare. Termenii "gel chimic" și "gel fizic" sunt
adesea utilizați pentru a descrie matricile de gel. Gelurile chimice sunt
reticulate, cu o vâscozitate relativ mare și au o structură definită a porilor.
Poliacrilamida face parte din această categorie. Gelurile fizice sunt soluții de
polimeri încâlciți,
de exemplu, alchilceluloze. Acestea au o vâscozitate relativ scăzută, iar
conținutul capilarului poate fi eliminat cu ușurință după utilizare. Concentrația
și lungimea lanțului de polimeri liniari determină caracteristicile de separare
ale soluției de gel.
Procedurile capilare oferă mai multe avantaje, inclusiv viteza, rezoluția,
sensibilitatea și simplitatea tehnică, în comparație cu metodele tradiționale pe
care se bazează. Un avantaj în plus pentru focalizarea izoelectrică în capilare
este faptul că poate fi efectuată fără gel, dar de obicei este necesar un strat pe
suprafața internă a capilarului pentru a reduce electroendoscopia. În mod
similar, izotacoforeza poate fi realizată în mod convenabil în aparatele de
electroforeză capilară.
Electrocromatografie capilară (CEC)

Aceasta este o tehnică dezvoltată mai recent, care este un hibrid între
HPLC și electroforeza capilară. Capilarele sunt umplute cu mediu HPLC,
iar fazele mobile sunt soluții tampon apoase. Se aplică o tensiune pentru a
genera un flux electroendosmotic, iar analiții se separă prin interacțiunea
cu faza staționară și forțele electroforetice, fără a fi necesară o pompă ca
în cazul HPLC. Au fost raportate eficiențe de separare îmbunătățite.
Metode bazate pe mărime 14 7
Secțiunea 3.3
l. Care dintre următoarele medii schimbătoare de ioni ar putea fi utilizate
în mod eficient la pH 5?
(a) Schimbător puternic de cationi.
(b) Schimbător de cationi slabi.
(c) Schimbător puternic de anioni.
(d) Schimbător de anioni slab.
2. Care dintre următoarele medii electroforetice prezintă efecte de
cernere moleculară?
(a) Membrană din acetat de celuloză.
(b) Agar gel.
(c) Gel de poliacrilamidă.
(d) Gel de agaroză.
3. În focalizarea izoelectrică, un analit nu se va deplasa dintr-o
poziție în care pH-ul tampon este același cu pH-ul său izoelectric
PENTRU CĂ
o moleculă are o sarcină pozitivă atunci când se află la un pH mai
mare decât pH-ul său izoelectric.
4. O moleculă va fi deplasată dintr-un mediu schimbător de ioni de o altă
moleculă cu sarcină opusă.
PENTRU CĂ
legarea unei molecule de un mediu schimbător de ioni depinde de
sarcina pe care o poartă.
Separarea macromoleculelor prezintă probleme majore, iar tehnici precum

dializa permit doar separări destul de grosiere. Cu toate acestea, dezvoltarea
cromatografiei cu permeabilitate în gel a introdus o metodă extrem de
valoroasă prin care moleculele pot fi separate unele de altele pe baza
dimensiunii lor (figura 3.34). O gamă largă de dimensiuni moleculare poate fi
separată prin această metodă, dar pentru un anumit gel, gama este relativ
îngustă și există un număr mare de geluri diferite disponibile în comerț.
Tehnicile ultracentrifugale separă strict pe baza masei și nu a
dimensiunii particulelor. Există o varietate de tehnici ultracentrifugale
disponibile și adecvate pentru diferite probleme analitice. Tehnicile de
preparare implică, în general, ultracentrifugarea de izo-densitate sau de viteză
maximă, în timp ce este posibilă investigarea masei moleculare relative, a
caracteristicilor de difuzie și a formei unei molecule cu ajutorul unei
ultracentrifuge analitice și a tehnicilor de echilibru sau de viteză maximă.
3.4.1 Dilații și ultrafiltrare

Dializa este o tehnică de separare a macromoleculelor de moleculele de solut
mai mici. Cuvântul se referă la difuzia moleculelor de solut prin intermediul
unei
DIMENSIUNE
afectează rata de
SEDIMENTAȚIE
Mișcările datorate acestora pot

fi
Redus Maximal
Limitat de Echilibra
de în
dimensi t unul
mare solvenți
unea de
solvenți cu
porilor celălalt
de densitat
densitate e redusă
Dimensi Variabilă Izodensitate Viteză

unea fixă Dimensiunea porilor
Figura 3.34 Metode de a porilor de difuzie
separare în care
dimensiunea moleculei
joacă un rol
Permeabilizar
important. ea gelului
membrană care, datorită mărimii porilor săi, limitează mișcarea moleculelor

mari. Trecerea moleculelor mici se datorează exclusiv unui gradient de
concentrație de-a lungul membranei. În cazul ultrafiltrării, solventul și solutul
sunt forțați să treacă prin membrană sub presiune, iar mișcarea moleculelor
mari este din nou restricționată de dimensiunea porilor.
Celofanul este utilizat frecvent pentru dializă și are o dimensiune a
porilor de aproximativ 4-8 µm, ceea ce îl face impermeabil la moleculele cu o
masă moleculară relativă mai mare de aproximativ 10 000. Dezvoltarea unei
varietăți de materiale membranare în care dimensiunea porilor este mult mai
riguros controlată, a dus la aplicații mai largi ale ultrafiltrației (tabelul 3.11).
Sunt disponibile diverse membrane din celuloză și policarbonat cu dimensiuni
ale porilor de până la 5 nm, care sunt capabile să excludă moleculele cu o
masă moleculară relativă de aproximativ 50. Structura internă a acestor
membrane, precum și dimensiunea porilor, determină domeniul de excludere
a acestora și, ca urmare, specificațiile precise ale mem branelor variază de la
un producător la altul.
Tabelul 3.11 Aplicații ale ultrafiltrării
Dimensiune Particule Aplicație

a
particulelor
(nm)
0.1-1.0 Săruri, Purificarea apei

l-100 monomeri Fracționare, desalinizare
100-1000 Proteine, viruși Sterilizare
Bacterii
3.4.2 Cromatografie cu permeabilizare pe gel

Cromatografia de permeabilitate pe gel este cunoscută și sub denumirea de
cromatografie de filtrare pe gel și cromatografie de excludere a dimensiunii
moleculare. Structura gelului conține pori cu diametrul variabil până la o
dimensiune maximă. Moleculele de testat sunt spălate printr-o coloană de gel,
iar moleculele mai mari decât cei mai mari pori din gel sunt excluse din
structura gelului. Cu toate acestea, moleculele mai mici pătrund în gel într-o
măsură variabilă, în funcție de mărimea lor, ceea ce le întârzie trecerea prin
coloană. Prin urmare, eluția are loc în ordinea descrescătoare a mărimii
(figura 3.35).
Diagrama
structurii
porilor
cu acces complet la
matricea de gel
Moleculele mari,
excluse din
matricea gelului,
ocupă
volum gol
Figura 3.35
Separarea prin
cromatografie de
permeabilitate pe gel.
Există o varietate de produse disponibile pentru cromato grafia de

permeabilitate în gel (tabelul 3.12) și acestea sunt de obicei clasificate în
funcție de limita de excludere, adică de masa moleculară relativă peste care
toate moleculele sunt excluse din structura gelului. Sephadex, mediul
original, se bazează pe dextran (un polimer de glucoză liniar) care este
modificat pentru a da diferite grade de reticulare, ceea ce determină
dimensiunea porilor materialului. Este un polimer puternic hidrofil care se
umflă considerabil în apă și, înainte de a pregăti o coloană, gelul trebuie să fie
complet hidratat cu un volum mare de lichid.
Perlele de poliacrilamidă sunt, de asemenea, disponibile cu o gamă
largă de dimensiuni ale porilor și sunt preparate în comerț într-un mod similar
cu cel descris pentru poli-
electroforeza cu acrilamidă. De asemenea, sunt hidrofile și se umflă

semnificativ în soluții apoase, dar sunt mai stabile din punct de vedere chimic
decât gelurile dextranice. Gelurile de agaroză sunt deosebit de utile atunci
când sunt necesari geluri cu pori foarte mari. Aceștia sunt, de asemenea,
hidrofili, dar sunt de obicei vânduți în formă umflată. O problemă majoră este
faptul că se înmoaie la temperaturi mai mari de 30 °C. Sunt disponibile geluri
mixte de poliacrilamidă și agaroză, în care poliacrilamida asigură o structură
tridimensională care susține gelul de agaroză interstițial.
Gelurile de polistiren sunt hidrofobe și, prin urmare, sunt utilizate în
principal cu solvenți neacvatici și pentru aplicații chimice organice, mai
degrabă decât cu probe biologice.
Tabelul 3.12 Gama de medii de permeabilitate cu gel
Denumirea Natura chimică Intervalul de

comercială și fracționare
producătorul (RMM)
Pharmacia
Sephadex G I0 Dextrane reticulate Până la 700
la
G200 5000-800 000
Sefarose 6B Agaroză Până la 4 X 106
la
2B Până la 40 X 106
Sefarose Cl -6B Până la4X!06
la
Cl-2B Până la 40 X 106
Biorad
Biogel P2 Poliacrilamidă reticulată 200-2500
la
P300 I00 000-400 000
Biogel A 0,5 Agaroză 10 000-500 000
la
A 150 I X 106- 150 X 106
Biobeads S X I Polistiren 600-14 000

la
S X 12 Până la 400
LKB
Ultragel AcA22 Agaroză și poliacrilamidă 100 000-1.2 X 106
la
AcA54 5000-70 000
Condiții de coloană
Coloanele pentru cromatografia de permeare a gelului trebuie să aibă atât un
volum minim de spațiu mort la ieșire, pentru a preveni lărgirea zonelor
dezvoltate în timpul separării, cât și un suport de pat adecvat, de exemplu, o
plasă de nailon, care să rețină gelul fără a se bloca. Lungimea coloanei
influențează rezoluția,
în timp ce diametrul influențează cantitatea de probă care poate fi aplicată fără

a reduce rezoluția. Gelurile cu o dimensiune mică a bilelor au ca rezultat
coloane cu volume de goluri mai mici (figura 3.35) și, prin urmare, o rezoluție
îmbunătățită. Cu toate acestea, coloanele cu bile mici oferă o rezistență mare
la curgerea lichidului, ceea ce duce la separări mai lente. Prin urmare, pentru
lucrările de preparare, sunt preferabile bilele mai mari.
Dificultatea tehnică majoră în cromatografia de permeabilitate pe gel
constă în împachetarea atentă a coloanei pentru a asigura o structură uniformă
și este absolut esențial ca nivelul solventului să nu scadă niciodată sub nivelul
gelului, în caz contrar având loc o întrerupere a patului de gel. În plus,
deoarece majoritatea gelurilor sunt compresibile, trebuie să se aplice doar o
presiune minimă absolută pentru a preveni modificarea caracteristicilor
porilor. În practică, nu ar trebui să se utilizeze presiuni hidrostatice mai mari
de 30-40 cm, iar pompele ar trebui să fie utilizate numai cu geluri
necompresibile.
Parametrii de eluție
Volumul efluentului este cel mai convenabil parametru de măsurat în
cromatografia de permachiere pe gel, deoarece debitele sunt adesea variabile,
ceea ce face ca utilizarea timpilor de retenție să fie nepotrivită. Prin urmare,
secvența diferitelor substanțe solubile care ies dintr-o coloană va fi raportată
ca volum total de solvent care a ieșit din coloană în momentul în care
substanța apare în efluent (Ve).
Moleculele mai mari decât limita de excludere a gelului vor fi eluate
atunci când un volum de solvent egal cu volumul gol0 (V ) părăsește coloana și
Absorbanța
Injectare Molecule Molecule de

a probei excluse testare
Figura 3.36 Cromatograma de permeabilitate a gelului. Toate moleculele mai mari

decât limita de excludere
limita de saturație a gelului apare0 la V (volumul gol). Moleculele care pot avea acces
la structura gelului în grade diferite sunt eluate în ordinea descrescătoare a dimensiunii.
în mod similar, acele molecule care pot avea acces la toate părțile matricei de
gel vor avea un volum efluent egal cu volumul total al patului (Vt). Moleculele
cu o dimensiune moleculară intermediară vor fi eluate în volume cuprinse între0
Vt și V (figura 3.36).
Măsurarea volumului de efluent nu este foarte fiabilă din cauza efectului
geometriei și a caracteristicilor de umplere ale oricărei coloane. Este adesea
mai utilă utilizarea unui parametru redus, cum ar fi V.,JV
0
, care nu depinde atât
de mult de caracteristicile coloanei și este comparabil cu calculul valorilor Rp

în cromatografia în strat subțire.
Este posibil să se calculeze o constantă de partiție (Kd) pentru un solut în
termeni de
a accesului obținut la matricea de gel:
Ve = V0 + Kd X Vi
unde Vi este volumul interior al gelului. Prin urmare,
- Ve- Vo
Kd-
Vi
Cu toate acestea, deoarece este dificil de măsurat cu precizie Vi, ecuația poate
fi modificată pentru a determina partea "disponibilă" a rășinii, Kav:
K= Ve- Vo
avVt - Vo
Pentru a separa în mod satisfăcător doi solvenți, valorile Kav trebuie să fie
semnificativ diferite unul față de celălalt.
Aplicații ale cromatografiei de permeabilitate pe gel

Cromatografia de permeabilizare pe gel este utilizată în mod obișnuit pentru
fracționarea amestecurilor de substanțe care variază în ceea ce privește masa
lor moleculară relativă și este extrem de utilă pentru moleculele labile, cum ar
fi enzimele.
Volumul de eluție al unui solut este determinat în principal de masa sa
moleculară relativă și s-a demonstrat că volumul de eluție este aproximativ o
funcție liniară a logaritmului masei moleculare relative. Este posibil să se
determine masa moleculară relativă a unei molecule de testare folosind o
curbă de calibrare pregătită din volumele de eluție ale mai multor substanțe de
referință cu masă moleculară relativă cunoscută. Acest lucru ar trebui să se
facă folosind aceeași coloană și aceleași condiții (figura 3.37) și, în practică,
este posibil să se calibreze coloana și să se separe substanța de testat în același
timp prin încorporarea compușilor de referință în probă. O astfel de metodă
este rapidă și ieftină și nu necesită o probă foarte purificată, cu condiția să
existe o metodă specifică de detectare a moleculei în eluat.
Soluții cu masă moleculară relativă mică pot fi eliminați din preparatele
de macromolecule, ceea ce se numește adesea desalinizare, folosind o coloană
mică de gel care exclude macromoleculele, dar reține soluții mici.
Macromoleculele vor fi eluate în volumul gol, care, în cazul unei coloane
mici, va fi de numai 2-3 ml.
Un gel uscat poate fi, de asemenea, utilizat pentru a concentra o soluție
apoasă diluată a unei macromolecule. Atunci când este adăugat la soluție, se va
umfla pe măsură ce absoarbe apa, dar va exclude moleculele mai mari. Prin
urmare, după sedimentare, lichidul supranatural va conține macromolecula,
lăsând majoritatea apei în porii gelului. O astfel de tehnică este mai rapidă și
mai eficientă decât dializa.
-§
§
Absorbanța
(206 nm)
§
0
--
§ "§ -0')
''
-
00
lf "l
iiUl
=:-= lf "l "
-..:t r--
.-=s §
C
.s -a
§
.
>,
0.06 ei -;:
-a § 5
.J:J
,. 8
0 :, 0
:J
.J:J
ix:
.J:J 0
' :J
> >, <c..
'§i
u
- ..
:J \ 00
-..:t 0
0.04 -a
=;: _0
,2l
< 0
0
c..
0.02
0.00
4 6
Timp de eluție (ore)
Volumul de eluție
(ml) 20
15
10 Fibrinogen
3:--------4L--------',-5 ------------------ l6
logRMM
Figura 3.37 Determinarea masei moleculare relative prin cro matografie de

permeabilitate în gel. Un amestec de proteine (aproximativ 10 µ,g din fiecare) a fost
separat pe o coloană UltroPak TSK SW, iar volumul de eluție pentru fiecare proteină a
fost comparat cu logaritmul masei sale moleculare relative (RMM).
(Text reprodus cu permisiunea LKB, Stockholm, Suedia.)
3.4.3 Ultracentrifugare
Deși utilizarea unor viteze mari ale rotorului nu este întotdeauna necesară,
cele mai multe ultracentrifuge sunt proiectate pentru a funcționa în siguranță
la viteze ale rotorului de până la 60 000 sau 100 000 rpm. În ciuda utilizării
vitezei mari, forțele de sedimentare implicate sunt foarte mici și tehnica este
extrem de delicată, oferind o metodă valoroasă pentru separarea moleculelor
sau particulelor mari și labile. Ultracentrifugarea preparatorie utilizează
rotoare cu capacități relativ mari pentru a separa diverși componenți ai unui
amestec, în timp ce ultracentrifugarea analitică implică
măsurarea vitezelor de sedimentare în volume mici în condiții atent

controlate.
Deoarece particulele se sedimentează într-un tub în timpul centrifugării,
se poate părea că o forță acționează radial spre exterior, deși, de fapt, nu există
o astfel de forță. Orice particulă care se rotește într-un cerc va avea
întotdeauna tendința de a se îndepărta pe o tangentă la cerc și, pentru a preveni
acest lucru, trebuie să se aplice o forță spre centrul de rotație. Aceasta este
cunoscută sub numele de forță centripetă și este asigurată într-o centrifugă de
brațele rotorului și de ax. Particulele suspendate în soluție, atunci când sunt
rotite într-un tub de centrifugă, nu sunt conectate la axa de rotație și, prin
urmare, au tendința de a se deplasa tangent la cerc. Cu toate acestea, mișcarea
lor în raport cu tubul de centrifugare este radială în josul tubului și pare să fie
determinată de o forță egală și opusă forței centripete (figura 3.38).
Forța
centripetă
Figura 3.38 Efecte centrifuge. Traiectoria unei particule care nu este împiedicată de
efectele de frecare este tangentă (A) la cercul descris de rotația tubului de centrifugare.
Atunci când este împiedicată de frecare, traiectoria sa (B) seamănă mai mult cu o
mișcare circulară cu o rată redusă de sedimentare în tub.
Prin urmare, în ultracentrifugare este convenabil să se presupună că

această mișcare într-un tub aparent staționar se datorează forței centrifuge și să
se compare această forță cu cea datorată gravitației, citând intensitatea forței
centrifuge în raport cu cea a gravitației. Acest lucru este cunoscut sub numele
de forță centrifugă relativă (FCR) și permite compararea rapidă și simplă a
forțelor aplicate de diferite centrifuge și rotoare. Forța centrifugă efectivă
poate fi calculată astfel:
F = Mw2 r
unde M este masa particulei, w este viteza unghiulară în radiani pe secundă și
r este raza de rotație în centimetri.
Efectul centrifugării depinde, prin urmare, de masa particulei, iar

utilitatea utilizării forței centrifuge relative constă în faptul că valoarea masei
particulei este eliminată din ecuație, permițând comparații mai generale ale
performanțelor centrifuge:
J; Mw2 r
RCF = = --
2
= w r X g-
1
i
lg Mg
De obicei, viteza unei centrifuge se monitorizează mai degrabă în rotații
pe minut (rpm) decât în radiani pe secundă. Prin urmare:
RCF =( 2'TTrpm)2 r X g-1

60
La compararea forței centrifuge relative dezvoltate de diferite cen trifuge
este important să se aprecieze că valoarea variază considerabil de la partea
superioară la partea inferioară a unui tub de centrifugare (figura 3.39).
Graficul de viteză/RCF
g30
X25 1----t-l----ial''-:.,,._-t---t----t---t--t--t-----t-----t--+---lll:Iik
W 11:-:c:ec:M
5 + + + 1 + + +- f + + + <
R. Av. 77,1 mm
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3 R. Max. 107,3 mm
RCF(x 1000)
Figura 3.39 Forța centrifugă relativă. Forța centrifugă relativă dezvoltată de orice rotor poate fi calculată, dar va varia
în funcție de distanța față de centrul de rotație.
Pentru ca o particulă să se sedimenteze, trebuie să deplaseze un volum

egal de sol vent de sub ea. Acest lucru poate fi realizat prin centrifugare numai
dacă masa particulei este mai mare decât masa solventului deplasat. Prin
urmare, atât densitatea, cât și masa, reprezintă un aspect important și explică
fenomenul particulelor cu densitate scăzută care plutesc în loc să se
sedimenteze în timpul centrifugării.
Atunci când o particulă este în mișcare, va fi necesar să treacă moleculele de
solvent care privesc mai puțin direcția de mișcare, iar efectele fiicționale rezultate se
vor opune întotdeauna mișcării. Acest efect este proporțional cu viteza moleculei și
este influențată de mărimea și forma sa, precum și de vâscozitatea mediului:

Frecarea = fv
unde f este coeficientul de frecare al particulei în solvent, iar v este viteza
particulei.
Din cauza forței centrifuge, o particulă va accelera, viteza sa crescând
până când forța de frecare va fi egală cu forța centrifugă. În aceste condiții,
forța netă care acționează asupra particulei este zero, iar particula nu va mai
accelera, ci va atinge o viteză maximă:
Forța netă= (Mp - Ms)uh - fv
unde MP este masa particulei și Ms este masa unui volum egal de solvent.
Este convenabil să se clasifice particulele în funcție de rata de
sedimentare a acestora pe unitate de câmp centrifugal, un parametru cunoscut
sub numele de coeficient de sedimentare (s), care are unități de secunde. O
unitate Svedberg (S) este definită ca un coeficient de sedimentare de 1 X 10-13
secunde.
Metode de determinare a vitezei maxime

Viteze ale rotorului suficient de mari pentru ca toate particulele de testare să
atingă viteza maximă.
imum de viteză sunt utilizate în separările preparative și analitice.
Ultracentrifugare cu graniță mobilă

Se umple un tub de centrifugare cu proba și se centrifughează la o viteză
suficient de mare pentru ca toate componentele probei să atingă viteza
maximă. Componentele încep să se separe, lăsând un solvent limpede
(supernatant).
0
0 0
Inițial 0
0
0
poziția 0 0 0 0
0 0
Intermediar 0
0
0
poziția 0
0 0
g:i
.
g
i::
<I) 0 0 0
u
i::
0
0
u0 0 0
0 0
X X
Figura 3.40 Ultracentrifugarea cu graniță mobilă. Particulele mai grele (o) se

sedimentează mai rapid decât particulele mai ușoare (X) și, ca urmare, se dezvoltă
limite de concentrare pe măsură ce lichidul supranatant este curățat de particule.
Monitorizarea mișcării unei limite va permite determinarea coeficienților de
sedimentare.
în partea superioară a tubului și se dezvoltă o serie de limite de concentrație

în funcție de numărul de componente din probă (figura 3.40). Mișcarea unei
limite este caracteristică particulei din masa soluției din fața limitei și, deși nu
este posibil să se purifice un component particular prin această tehnică, este
posibil să se măsoare rata de sedimentare a acestuia prin urmărirea mișcării
limitei.
Separarea în componente poate fi realizată numai prin oprirea
procesului atunci când a avut loc sedimentarea componentei dorite.
Sedimentul este apoi resuspendat în solvent proaspăt și centrifugat la o viteză
mai mică, când particulele mai grele se sedimentează, lăsând componenta în
suspensie. O astfel de metodă este cunoscută sub numele de sedimentare
diferențială și este utilizată în special pentru fracționarea componentelor
celulare. Metoda descrisă în procedura 3.3 este simplă și este concepută
pentru a separa patru fracțiuni celulare principale, și anume: nucleară,
mitocondrială, microsomală și solubilă.
Ultracentrifugare în zonă mobilă

Un strat sau o zonă a probei se suprapune peste solventul din tubul de
centrifugare și, din nou, sub influența forței centrifuge, particulele se
sedimentează și se formează zone sau benzi discrete în funcție de
mobilitatea relativă a fiecărei particule (figura 3.41). Pe măsură ce
centrifugarea continuă, astfel încât fiecare zonă se va aglutina pe fundul
tubului în mod succesiv, rezultând în final o granulație mixtă.
Centrifugarea este oprită înainte ca acest lucru să se întâmple, iar zonele
diferite pot fi îndepărtate. Tehnicile zonale sunt aproape exclusiv
pregătitoare, iar rezoluția zonelor va fi menținută mai eficient dacă se utilizează
un gradient de densitate ușor.
Tehnicile zonale pot fi utilizate pentru separarea unei game largi de
particule și macromolecule, de exemplu mitocondrii, nuclee, ribozomi și
proteine. Tehnica poate fi utilizată pentru lucrări de pregătire în masă, folosind
un rotor zonal care este umplut cu un gradient de solvent în timp ce rulează la
o viteză redusă. Se introduce în mod similar eșantionul, iar viteza rotorului
este apoi mărită până la valoarea dorită. După terminarea centrifugării,
conținutul se extrage în timp ce rotorul funcționează încet, prin înlocuirea
acestuia cu o soluție mai densă.
Poziția
inițială
I :I )
)
00
I
Poziție 0 0
intermediară 0
00
Figura 3.41 Ultracentrifugarea în zonă mobilă. Zonele se dezvoltă în timpul

centrifugării, cele inferioare fiind particule mai grele.
Metode de izodensitate
Indiferent de viteza rotorului și de viteza maximă, sedimentarea (sau flotația)
nu se va produce într-o soluție cu densitate egală cu cea a probei. Metodele de
densitate "so-densitate" utilizează această lipsă de mișcare într-un mod
comparabil cu un gradient de pH în tehnicile de focalizare izoelectrică.
Metodele sunt o combinație de sedimentare și flotare, realizată prin utilizarea
unui gradient de densitate care se află la jumătatea densității particulelor în
cauză. La centrifugare, particulele sedimentează până când ajung într-o zonă
de solvent cu aceeași densitate. Astfel, se creează o zonă pentru fiecare tip de
particule prezente în eșantion.
Gradiente de densitate preformate
Tubul de centrifugare este umplut cu un solvent într-un interval de
concentrații gradat, preparat din amestecuri de două soluții stoc diferite care
determină limitele gradientului. Deși este posibil să se producă un gradient în
trepte prin suprapunerea cu grijă a concentrațiilor descrescătoare ale soluției,
este preferabil să se producă un gradient uniform cu ajutorul unui formator de
gradient. De obicei, se folosesc soluții de zaharoză sau de clorură de cesiu, iar
eșantionul este așezat pe suprafața acestuia și centrifugat. Sub influența forței
centrifuge, fiecare component se va deplasa către o zonă de izodensitate,
particula cea mai rapidă nefiind neapărat cea mai densă.
Tehnicile de gradient de densitate sunt deosebit de utile pentru separarea
componentelor celulare și a macromoleculelor, dar, în general, nu sunt la fel
de eficiente ca sedimentarea diferențială. Tabelul 3.13 indică ordinea de
separare a organitelor celulare după ultracentrifugare până la echilibru pe un
gradient de densitate de zaharoză, de la o densitate ridicată de l.25p la fundul
tubului până la o valoare minimă de l.lOp în partea superioară. Extractul de
celule se prepară într-o soluție de zaharoză cu o densitate de 1,05p și se așează
deasupra gradientului. Unele organite, cum ar fi mitocondriile, prezintă valori
de densitate destul de constante, dar altele variază considerabil în funcție de
sursa celulară și de modul de preparare a extractului. Valorile densității pentru
reticulul endoplasmatic dur variază considerabil în funcție de proporția de
ribozomi densi prezenți.
Tabelul 3.13 Ultracentrifugarea în gradient de densitate a organitelor

subcelulare
OrganeUe Densitate (p)
Membrana plasmatică 1.14
j j
Reticulul endoplasmatic dur 1.16
Mitocondrii 1.17
Lisosomi 1.20
Un extract de celule a fost separat pe un gradient de zaharoză de la 1,1Op în partea

superioară la I.25p în partea inferioară și centrifugat până la echilibru.
Gradiente de densitate de echilibru

Aceasta este o metodă de separare a moleculelor cu densități foarte asemănătoare
și depinde de formarea unui gradient de densitate prin efectul forței centrifuge
asupra moleculelor de solut, dar, din cauza masei reduse a acestora, tehnica
necesită o perioadă lungă de centrifugare, de exemplu 2-3 zile. Compușii de
testat sunt
suspendate inițial într-o soluție cu o densitate selectată, determinată de obicei

printr-o tehnică preliminară de gradient preformat. Gradientul se formează și
moleculele se separă în wnes simultan în timpul perioadei lungi de centrifugare.
Materialele utilizate de obicei pentru a produce astfel de gradienți sunt
sărurile metalelor alcaline grele, clorura de cesiu fiind cea mai frecvent
utilizată. Această sare are o solubilitate ridicată, iar masa sa moleculară
relativă scăzută permite o difuzie rapidă, ceea ce permite formarea
gradientului într-un timp rezonabil de scurt. Se pot folosi concentrații de sare
de până la aproximativ 2 g m1-1 și se aleg pe baza informațiilor privind
densitatea particulelor sau macromoleculelor de testat. Tehnica este utilizată
frecvent pentru separarea particulelor virale și a acizilor nucleici.
Metode de echilibru
Centrifugarea unei suspensii de macromolecule la viteze relativ mici nu va
duce la sedimentarea completă, din cauza efectului de difuzie, dar se va
produce un gradient de concentrație datorită echilibrului dintre sedimentare și
difuzie. Un astfel de gradient poate fi studiat în cen trifuga analitică, iar
măsurătorile rezultate pot fi utilizate pentru a determina masa moleculară
relativă a moleculei. Nu este o tehnică pregătitoare și necesită perioade foarte
lungi de centrifugare pentru ca echilibrul să fie stabilit.
Viteza
Vacuum rotorului
Temperatura
Indicatorul--+--
....._ se aprinde
Figura 3.42
O ultracentrifugă.
Instrumentație
Diferența majoră dintre o ultracentrifugă preparatorie și una analitică constă
în proiectarea rotoarelor și în necesitatea unui sistem de monitorizare optică în
cazul celei din urmă. Caracteristicile de bază ale unei ultracentrifuge sunt
ilustrate în figura
3.42 iar aspectele legate de siguranță reprezintă un aspect major în proiectarea
acestora. Este necesar un vid pentru a minimiza efectele de frecare ale rotației
de mare viteză, iar un sistem de răcire este esențial pentru a proteja rulmenții
de mare viteză etc. și orice materiale labile care sunt studiate.
În general, rotoarele sunt fabricate din aluminiu sau titan, acestea din
urmă fiind mai durabile și mai sigure la viteze mari. Acestea sunt protejate de
o peliculă anodizată dură pentru a preveni coroziunea, dar au o durată de viață
limitată din cauza oboselii metalului și trebuie să se țină o evidență atentă a
utilizării lor. Rotoarele de preparare pot fi de tip "swing out" sau cu unghi fix
(figura 3.43), cu o capacitate variabilă a probei. Rotoarele de capacitate mare
au o viteză maximă de siguranță mai mică, iar capetele de tip swing out au
limite mai mici decât rotoarele corespunzătoare cu unghi fix. Tuburile de
centrifugare sunt cilindrice și, de obicei, fabricate din polipropilenă sau
policarbonat, cu un dispozitiv de închidere sau de etanșare. Este esențial ca
tuburile să fie umplute la capacitate maximă pentru a preveni colapsul și să fie
echilibrate cu grijă înainte de centrifugare.
Figura 3.43 Tipuri de rotoare preparative. (Fotografie realizată prin amabilitatea

MSE Ltd, Crawley, Sussex, Regatul Unit.)
Rotoarele analitice sunt, de obicei, solide, cu găuri în care sunt introduse

celulele care conțin probele, cel mai simplu tip de rotor încorporând celula
împreună cu o referință. Aceste celule sunt, de obicei, fabricate din cuarț sau
safir și au formă de sector pentru a preveni deformarea limitelor care se
formează în timpul sedimentării.
Sistemul optic necesar pentru a monitoriza mișcarea limitei în timpul

centrifugării prezintă probleme de proiectare în ceea ce privește menținerea
vidului în centrifugă, monitorizând în același timp celula de eșantionare care
se rotește rapid. Absorbția radiației ultraviolete poate fi utilizată pentru a
detecta zonele de proteine, acid nucleic etc., zonele fiind detectate fie
fotografic, fie prin absorbție. Este necesară o celulă de referință pentru a
compensa absorbția de către solvent.
Variațiile de concentrație care se produc pe măsură ce se dezvoltă o
limită au ca rezultat modificări ale indicelui de refracție pe lungimea celulei.
În cazul opticii de interferență Rayleigh, un model de franjuri produs prin
suprapunerea a două raze de lumină paralele este distorsionat de o modificare
a indicelui de refracție. Gradul de distorsiune este proporțional cu modificarea
indicelui de refracție și, prin urmare, cu modificarea concentrației. Sistemul
optic Schlieren utilizează același fenomen, dar are ca rezultat o urmă care
reprezintă modificarea gradientului indicelui de refracție și arată limita ca un
vârf.
În timp ce fracțiunile sau eșantioanele pot fi extrase din tuburile de
centrifugare cu ajutorul unei pipete, este posibil, cu ajutorul unui echipament
adecvat, să se străpungă baza unui tub de plastic pentru a permite scurgerea
lentă a conținutului. Alternativ, conținutul tubului poate fi deplasat prin
injectarea lentă a unei soluții dense pe fundul tubului (figura 3.44) sau prin
perforarea tubului în poziția corespunzătoare și retragerea benzii dorite cu o
seringă.
Aer Densitate
--soluție
Figura 3.44
Metode de prelevare a t Eșantion
probelor din tuburi de Piercing pentru tuburi Deplasare
centrifugă din plastic.
Determinarea masei moleculare relative
În timpul ultracentrifugării, atunci când forța de frecare este egală cu forța
centrifugă și particula atinge viteza maximă, masa moleculară relativă
a particulei poate fi reprezentată prin ecuația Svedberg:

M= R_T X
(1 - Vp) D
underes este coeficientul de sedimentare, R este constanta gazelor, T este

temperatura absolută, D este coeficientul de difuzie, p este densitatea
solventului și
V este volumul specific parțial al solutului.
Volumul specific parțial reprezintă creșterea volumului unei soluții
cauzată de prezența unui solut și se definește ca fiind volumul ocupat de 1 kg
de solut în 100 kg de soluție. Această valoare poate fi calculată folosind
densitățile atât a solventului (p), cât și a soluției (ps):
100 (100- n)
V= _P_s P
n
unde n este concentrația procentuală a solutului în solvent (p/p).

Valoarea volumului parțial specific pentru proteine este de aproximativ
0,7, în timp ce pentru acizii nucleici valoarea variază în jurul valorii de 0,5.
Coeficientul de sedimentare poate fi determinat prin măsurarea vitezei
particulei la o viteză fixă de centrifugare (w, în radiani pe secundă) și, dintr-o
serie de observații, prin reprezentarea logaritmului distanței parcurse (x) în
funcție de timpul în secunde (t). Relația este exprimată prin ecuația:
s= lnx= 2.303 logwx
ult w2t
iar valoarea lui s poate fi calculată din panta graficului rezultat. Deși masa
moleculară relativă poate fi calculată cu ajutorul ecuației Svedberg, calculele
sunt complicate de dificultățile legate de determinarea coeficientului de
difuzie și de corecția diferențelor de vâscozitate și temperatură. Din aceste
motive, coeficientul de sedimentare al unei particule este adesea utilizat în
locul masei sale, cele două fiind proporționale între ele.
Reducerea meniscului este o metodă alternativă pentru determinarea
masei moleculare relative. Dacă o probă omogenă este centrifugată la o viteză
suficient de mare pentru ca particulele să se îndepărteze de menisc, ceea ce
duce la o concentrație de solut egală cu zero la menisc și produce un gradient
de concentrație datorat solutului, masa moleculară relativă este proporțională
cu panta unui grafic al logaritmului concentrației în raport cu distanța la
pătrat. Această relație nu este absolută și depinde de măsurătorile efectuate la
începutul procesului și presupune că densitatea soluției este constantă în toată
soluția, în ciuda gradientului de concentrație foarte mic care se dezvoltă.
Concentrația de solut poate fi determinată pe baza abruptului franjelor de
interferență formate într-un model Rayleigh.
Masa moleculară relativă (RMM) poate fi apoi calculată cu ajutorul
ecuației:
.60-6R-T log concentrație
RMM = 4
- x '=
distanța2
(1V-p)w2
Baza multor procese biochimice din cadrul unei celule constă în relațiile de
formă care există între moleculele care reacționează, de exemplu, un situs
activ al unei enzime și substratul său. Afinitatea și specificitatea pe care aceste
molecule le prezintă una față de cealaltă stau la baza unor metode cum ar fi
imunoanalizele și pot fi, de asemenea, exploatate în cromatografia de afinitate.
3.5.1 Cromatografia de afinitate

O moleculă de legare (sau ligand) este legată de un polimer insolubil în așa fel
încât afinitatea ligandului pentru molecula sa complementară să nu fie
modificată semnificativ. Polimerul este utilizat ulterior într-un mod
comparabil cu mediile de adsorbție sau de schimb de ioni, dar are avantajul
suplimentar al specificității. Procedeul poate fi, de asemenea, utilizat în mod
invers, prin insolubilizarea moleculei complementare și utilizarea acesteia
pentru a separa o moleculă de legare specifică,
de exemplu, izolarea anticorpilor specifici dintr-un antiserum. Anticorpii
furnizează probabil cea mai mare sursă de molecule de liganzi, dar sunt
utilizate și enzimele, pro teinele de transport și receptorii membranari.
Metode de insolubilizare
Au fost utilizate o varietate de tehnici, variind de la simpla adsorbție până la
captarea într-o matrice polimerică, dar cea mai comună metodă este legarea
covazantă a ligandului de un polimer adecvat, cum ar fi dextranul, agaroza sau
poliacrilamida.
Polimerul trebuie să fie hidrofil și să aibă o dimensiune a porilor suficient
de mare pentru a permite accesul moleculelor de testare. În cazul în care grupul
ligand este strâns legat de coloana vertebrală a polimerului, este posibil ca
interferența sterică să afecteze capacitatea de legare a acestuia.
Polimer Legătu Ligand

<)
Moleculă
insolubil ra moleculă complementară
braț
UNELE GRUPURI DE LEGĂTURĂ

- NH - (CH2)4 - NH - NH - Ligand
- NH- (CH2)6 -NH- CO -0-N = N - Ligand
Figura 3.45 -NH-0- N=N-0-0-0-N = N- Ligand

Cromatografie de
afinitate.
Metode bazate pe formă 165
și este de dorit ca în reacția de legătură să se utilizeze un braț distanțier relativ

lung (6-8 atomi) (figura 3.45).
Au fost descrise mai multe reacții de legare, dar cele două exemple
comune implică amândouă grupările amino aromatice din polimer. Acestea
pot fi transformate în grupe diazo reactive prin acțiunea acidului azotic și vor
reacționa subsecvent cu grupele amino libere din proteinele ligand. Alternativ,
acestea pot fi convertite în grupări izotiocianat de către tiofosgen și vor
reacționa apoi cu reziduurile de tirozină și histidină din proteine (figura 3.46).
Alte grupări funcționale din polimer pot fi utilizate într-un mod similar. În
comerț este disponibilă o gamă de geluri preparate, iar cel mai bun gel pentru
o anumită situație trebuie determinat prin încercări și erori.
Rășină
C(Cl2)
¢
S/- NH2 HN02
¢ ¢
Rășină / Rășină
-+LAVARE +
NCS N;
Rășină Rășină
¢ NH 0N
II
cI=s N
Figura 3.46 Exemple de

reacții utilizate pentru
insolubilizarea proteinelor
cu ajutorul aro- Reacția diazo
rășini amino matice. Reacția de izotiocianat
Metode de cromatografie de afinitate

Tehnicile de cromatografie de afinitate nu sunt în general adecvate pentru
fracționarea amestecurilor din cauza afinității foarte pozitive și specifice dintre
moleculele de ligand și de solut. Separarea poate fi realizată într-o coloană în

care moleculele de solut se leagă de matrice și, după spălare pentru a elimina
substanțele nedorite, substanța de testat poate fi eluată. Alternativ, se poate
utiliza o procedură discontinuă în care mediul de afinitate se amestecă cu
soluția de eșantionare și se lasă să reacționeze. Complexul în fază solidă este
apoi îndepărtat din soluția de masă prin filtrare sau centrifugare și, după
spălare, solutul purificat este separat de complex.
Pentru a elua moleculele care sunt puternic legate de grupul ligand, este
necesar fie să se reducă afinitatea lor una față de cealaltă, fie să se introducă
molecule care sunt mai puternic legate sau în concentrație mai mare și care,
prin urmare, vor fi capabile să deplaseze moleculele testate. În general, se
preferă metodele nespecifice, care implică modificarea fie a puterii ionice, fie
a pH-ului tamponului. Acestea vor determina modificări de conformație ale
proteinelor și, prin urmare, ale caracteristicilor lor de legare. Modificările
constantei dielectrice a solventului cauzate de introducerea de solvenți
organici vor avea ca rezultat modificarea legăturii hidrofobe și, din nou, vor
contribui la disocierea complexului. Este posibil să se utilizeze agenți specifici
care concurează pentru situsurile de legare, cum ar fi substraturi alternative și
inhibitori pentru enzime.
Aplicații
Natura legăturii dintre ligand și molecula sa complementară limitează
cromatografia de afinitate la un anumit tip de compus biologic, iar câteva
exemple sunt prezentate mai jos.
l. Enzime. Specificitatea unei enzime pentru substratul, coenzima sau
inhibitorul său competitiv constituie baza pentru multe separări
cromatografice de afinitate. Enzimele pot fi extrase și purificate folosind
substraturi, coenzime sau inhibitori insolubilizați. Mai rar, enzimele sunt
utilizate ca liganzi.
2. Anticorpi. Reacția dintre un anticorp și antigenul său nu duce la
modificarea chimică a antigenului, în comparație cu acțiunea unei enzime,
și oferă baza pentru producerea de medii cromatografice capabile să
selecteze moleculele complementare. Fie antigenul este insolubilizat și
utilizat pentru a izola și purifica anticorpii corespunzători, fie, odată cu
creșterea disponibilității anticorpilor monoclonali, se utilizează procedeul
invers.
3. Lectine. Unele proteine extrase din anumite semințe sunt capabile să lege
compuși care conțin grupe de carbohidrați. Aceste proteine sunt cunoscute
sub numele de fitohemaglutinine sau lectine. Mediile cromatografice de
afinitate care utilizează astfel de lectine au fost utilizate pentru a investiga
structurile membranelor celulare și pentru a ajuta la studiul interacțiunilor
celulare. Ele sunt, de asemenea, utilizate împreună cu metodele cantitative
de cromatografie pe coloană și în unele separări electroforetice ale
proteinelor bogate în carbohidrați.
4. Proteine receptoare. Hormonii acționează asupra celulelor prin
intermediul unor receptori membranari specifici și pot fi folosiți pentru a
purifica acești receptori din omogenatele celulare. Receptorii pentru
compuși precum insulina, estrogenii și acetilcolina, printre altele, au fost
purificați în acest mod.
5. Acizi nucleici. Polinucleotidele imobilizate pot fi utilizate pentru a extrage
proteinele de legare a acizilor nucleici, precum și șirurile complementare de
acizi nucleici.
Secțiuni 3.4/5
1. Care dintre următoarele tehnici pot fi utilizate pentru a determina
masa moleculară relativă?
(a) Cromatografie de afinitate.
(b) Cromatografie cu permeabilitate pe gel.
(c) Centrifugare zonală.
(d) Centrifugare cu viteză maximă.
2. Care dintre următoarele elemente afectează viteza de sedimentare a
unei particule într-o ultracentrifugă?
(a) Raza brațului rotorului.
(b) Gravitatea.
(c) Masa particulei.
(d) Temperatura.
3. În cromatografia de permeabilitate pe gel, moleculele mai mari
sunt eluate din coloană ultimele.
PENTRU CĂ
dimensiunea porilor restricționează accesul moleculelor mai mari decât
limita de excludere a mediului în cromatografia de permeabilitate pe
gel.
4. Două particule cu aceeași masă, dar cu densități diferite, nu pot fi
separate una de cealaltă prin ultracentrifugare fără a folosi un
gradient de densitate
PENTRU CĂ
dacă densitatea unei particule este mai mică decât densitatea
solventului, particula va pluti în loc să se sedimenteze.
Dean, P.D.G., Johnson, W.S. și Middles, F.A. (1985) Affinity chromatography - a

practical approach, IRL Press, UK.
Rickwood, D. (ed.) (1993) Preparative centrifugation - a practical approach, IRL
Press, UK.
Rickwood, D., Ford, T. și Steensgaard, S. (1994) Centrifugare: Date esențiale,
Wiley-Liss Inc., SUA.
Stock, R., Rice, C.B.F., Braithwaite, A. și Smith, F.J. (1995) Chromatographic meth
ods, ediția a 5-a, Blackie Academic and Professional, Marea Britanie.
Johnstone, R.A. și Rose, M.E. (1996) Mass spectrometry for chemists and bio-
chemists, ediția a 3-a, Cambridge University Press, Marea Britanie.
Katz, E. (ed.) (1995) High performance liquid chromatography, John Wiley, UK.
Grant, D.W. (1995) Capillary gas chromatography, John Wiley, UK.
Baker, D.R. (1995) Capillary electrophoresis, John Wiley, UK.
4 Metode electroanalitice
• Potențiometrie
• Conductimetrie
• Coulometrie
• Voltammetrie
• Biosenzori
Subiectul electrochimiei se referă la studiul interacțiunii chimice dintre

electricitate și materie în general, dar interacțiunea cu soluțiile este deosebit
de valoroasă în biochimia analitică. Proprietățile electrice ale unei soluții
depind atât de natura componentelor, cât și de concentrația acestora și permit
metode de analiză calitativă și cantitativă.
..---- V t----
\e I
e
Absorbți Eliberar
a de ea de
electro electro
ni ni
Figura 4.1 O celulă electrolitică Curentul care circulă între electrozi depinde nu
numai de tensiunea care este aplicată, ci și de proprietățile electrice ale soluției.
Potențiometrie 169
dezvoltat. Aceste proprietăți electrice ale soluțiilor sunt măsurate cu ajutorul

unor electrozi în dispozitive cunoscute sub numele de celule electrochimice.
Există două tipuri principale de celule electrochimice:
I. Celule electrolitice. Atunci când se aplică o diferență de potențial între doi

electrozi care se scufundă într-o soluție, un curent va circula între ei (figura
4.1). Cantitatea de curent care circulă depinde de tensiunea aplicată și de
proprietățile electrochimice ale soluțiilor. Acest lucru constituie baza
pentru metodele de analiză conductimetrică și polarografică. În mod
similar, cantitatea totală de schimbare chimică care are loc la o electrodulă
este legată de cantitatea totală de curent. Aceasta constituie baza metodelor
de analiză coulo-metrică.
2. Celule voltaice sau galvanice. În unele celule, natura chimică a curentului
elec
trode și soluții are ca rezultat o reacție chimică care are loc la nivelul
electrozilor cu producerea de energie electrică (baterii), dar fără a fi nevoie
de o tensiune externă (figura 4.2). Acest tip de celulă este utilizat în
metodele poten tiometrice în care nu se aplică nicio tensiune la celulă și,
deși nu circulă efectiv niciun curent între electrozi (despre care se spune că
sunt nepolarizați), aceștia dezvoltă un potențial în raport cu soluția datorită
naturii electrozilor și a soluției. Acest potențial poate fi măsurat și poate fi
legat de concentrația ionilor din soluție.
M N
Figura 4.2 O celulă galvanică O reacție care are loc la electrozi are ca rezultat o
diferență de potențial între ei și, în unele cazuri, un curent măsurabil va trece între ei.
Potențialul dezvoltat de un singur electrod într-o soluție este cauzat de

tendința soluției fie de a dona, fie de a accepta electroni și poate fi
170Metode electroanalitice
calculată cu ajutorul ecuației Nemst:
E=
Eo
- -2,3-02-6R- l
X oga
T
nF
unde E este potențialul electrodului la concentrația specificată,
£0 este potențialul electrodului standard,
R este constanta gazelor,
T este temperatura absolută,
n este numărul de electroni implicați,
F este constanta Faraday,
a este activitatea ionului.
Pentru măsurătorile efectuate la 25°C, ecuația se simplifică astfel:
E= Eo - 0,059 loga
n
Nu poate exista nicio reacție chimică într-un astfel de sistem fără un
donator sau un acceptor de electroni complementar pentru a finaliza procesul.
Fiecare dintre aceste sisteme de electrozi este cunoscut sub numele de
semicelulă, iar potențialul dezvoltat de o semicelulă nu poate fi măsurat în
termeni absoluți, ci doar comparat cu cel al unei alte semicelule. Reacția
chimică care are loc la fiecare semicelulă este cunoscută sub numele de semi-
reacție.
Un electrod activ este format dintr-un element (M) în stare
necombinată, care este capabil să stabilească un echilibru cu o soluție care
conține ionii săi:
Ionizarea atomilor sau a moleculelor are ca rezultat dezvoltarea unui

potențial de către un astfel de electrod, intensitatea potențialului fiind legată
de concentrația ionilor. Concentrația efectivă a ionilor (cunoscută sub numele
de activitate a ionilor) este mai semnificativă decât concentrația molară.
Valorile pentru activitate și concentrație sunt identice doar în cazul soluțiilor
foarte diluate.
Electrozii inerți, cum ar fi argintul, platina și carbonul, sunt folosiți doar
pentru a realiza contactul electric cu soluția și reflectă doar potențialul
soluției. Aceștia sunt utilizați pentru a măsura potențialul soluțiilor care conțin
amestecuri de ioni care au tendința de a transfera electroni între ei, de
exemplu, ioni ferici și fericiți:
Fe3+ + e- = Fe2+
Astfel de reacții sunt cunoscute ca reacții redox și, în acest caz,
potențialul dezvoltat de sistemul de electrozi depinde de tendința ionilor ferici
de a dona un electron în comparație cu tendința ionilor ferici de a accepta
unul.
Potențialul standard de electrod al unui element este definit ca fiind
potențialul electric al acestuia atunci când este în contact cu o soluție molară
de ioni ai acestuia. În cazul sistemelor redox, potențialul redox standard este
cel dezvoltat de o soluție care conține concentrații molare ale ambelor forme
ionice. Orice semicelulă va fi capabilă să oxideze (adică să accepte electroni
de la) orice altă semicelulă care are un potențial de electrod mai mic (tabelul
4.1).
Potențiometrie 171
Tabelul 4.1 Potențialele electrozilor standard pH 7,0

la
Reacție la jumătate E'0
Oxigen/apă 0.81
Ferice/feroase 0.77
Ferocianură/ferrocianură 0.36
Oxigen/peroxid de hidrogen 0.30
Citocrom c feric/feroasă 0.22
Acid dehidroascorbic/acid ascorbic 0.08
Piruvatenactat -0.19
FAD/FADH2 -0.22
NAD+fNADH -0.32
2W/H2 -0.42
Feroviar/fier -0.44
Este imposibil să se măsoare direct potențialul unei semicelule și trebuie

să se utilizeze o semicelulă de referință pentru a completa circuitul. Electrodul
de hidrogen (figura 4.3) este electrodul de referință standard față de care se
măsoară toate celelalte semicelule și căruia i se atribuie în mod arbitrar un
potențial de electrod standard de zero la pH 0. Deoarece este dificil de
preparat și incomod de utilizat, electrodul de
-Hidrogen gazos
0
0
0 0
0
0
0 0
0 --++-- Soluție
standard HCI
Electrod de platină
Figura 4.3 Electrodul de hidrogen. Un electrod din folie de platină, acoperit cu
negru de platină, se scufundă într-o soluție de acid clorhidric (1,0 mol 1-1 ). Hidrogenul
gazos la o presiune de I atm (IOI kPa) este barbotat peste electrod și este absorbit de
negrul de platină. Semi-reacția pentru electrod poate fi reprezentată astfel::
2H+ + 2e- = H2
În schimb, se utilizează frecvent un electrod de calomel saturat. Acesta are un

potențial de electrod standard de +0,242 V în raport cu electrodul de hidrogen.
Acesta constă dintr-un electrod de mercur în echilibru cu ionii de mercur din
sarea ușor solubilă, clorura de mercur (figura 4.4). O concentrație ridicată de
ioni de clorură este menținută prin utilizarea unei soluții saturate de clorură de
potasiu, care asigură, de asemenea, un mijloc de a asigura contactul electric cu
orice altă semicelulă utilizată.
Fir de platină
Pastă de
mercur
Clorură de potasiu saturată
Figura 4.4 Electrodul de calomel saturat. Un fir de platină realizează contactul

electric cu un electrod compus dintr-o pastă de mercur metalic, clorură de mercur
(calomel) și clorură de potasiu. O soluție saturată de clorură de potasiu com pletează
semicelul și asigură contactul electric prin intermediul unui dop poros.
4.1.1 Măsurători potențiometrice

Sensibilitatea instrumentelor care utilizează circuite cu rezistență mică este
determinată în primul rând de sensibilitatea galvanometrului (figura 4.5).
Sistemele de electrozi care au o rezistență mare, de exemplu electrozii de sticlă,
necesită un voltmetru de mare impedanță, care transformă potențialul generat în
curent care poate fi amplificat și măsurat. Astfel de instrumente sunt cunoscute în
mod obișnuit sub numele de pH-metre, dar pot fi utilizate pentru multe măsurători
potențiometrice, altele decât pH-ul.
Titrările pot fi adesea urmărite în mod convenabil prin potențiometrie și, în
multe cazuri, nu valoarea reală a potențialului electrodului este importantă, ci
modelul de schimbare a potențialului pe măsură ce variază compoziția soluției -
măsurătorile de pH și redox sunt deosebit de potrivite pentru astfel de metode. În
multe cazuri, punctul de echivalență va fi indicat de o schimbare semnificativă a
potențialului (figura 4.6), dar uneori schimbarea la punctul de echivalență este
dificil de observat.
Potențiometrie 173
detecta și ar putea fi mai convenabil să se utilizeze un grafic derivat. În loc să se

reprezinte grafic potențialul (E) în funcție de volumul de titrant (V), se trasează un
grafic al variației potențialului pentru o variație unitară a volumului !:,.El!::,.V în
funcție de volum. O astfel de diagramă a primei derivate (figura 4.7) indică
punctul de echivalență sub forma unui vârf sau a unei vârfuri.
-+
Rezistență variabilă
Galvanometru
Test și
- referință +
electrozi
Figura 4.5 Circuitul unui potențiometru Tensiunea din circuitul de testare este
echilibrată cu o tensiune cunoscută prin intermediul unei rezistențe variabile, folosind
un galvanometru pentru a indica poziția în care nu circulă curentul în nici o direcție.
pH 14
Exces de titrant
12
2 Echivalență
punct
0 ---+--- -- - --
0 2 4 6 8 10
Volum NaOH (ml)
Figura 4.6 O curbă de titrare. Acidul acetic (10 ml dintr-o soluție de 0,1 mol 1-1 ) a
fost titrat cu o soluție de hidroxid de sodiu (0,2 mo11-1 ), iar pH-ul soluției rezultate a
fost trasat în funcție de cantitatea de alcalin adăugată.
17 4Metode electroanalitice
Figura 4.7
Un grafic al primei
derivate a unei curbe de
titrare potențiometrică.
Volumul de
titrant
Dacă doi electrozi identici sunt plasați în soluții separate care sunt
similare din toate punctele de vedere, cu excepția concentrației ionilor de
testare, potențialul dezvoltat între electrozi va fi legat de raportul dintre cele
două concentrații, de exemplu, electrozi Ag-AgCl în soluții care conțin ioni de
clorură. O curbă de calibrare a potențialului dezvoltat într-o serie de
concentrații cunoscute de ioni de testare poate fi utilizată în analiza probelor
necunoscute. Adesea, este recomandabil să se traseze graficul ca potențial în
funcție de logaritmul concentrației pentru a obține o relație rectilinie, așa cum
indică ecuația lui Nemst. Este necesar să se adauge o cantitate constantă de o
concentrație mare de electrolit care nu reacționează pentru ca toate soluțiile
testate să aibă aceeași forță ionică. Acest lucru se datorează faptului că
potențialul depinde mai degrabă de activitatea ionilor decât de concentrație.
Figura 4.8 Membrana de

sticlă
Electrodul de sticlă.
4.1.2 Măsurarea pH-ului

Electrodul de sticlă este cel mai frecvent utilizat pentru măsurarea de rutină a
pH-ului, deoarece utilizarea electrodului de hidrogen este impracticabilă
(figura 4.8). Acesta este format dintr-un electrod de clorură de argint-argint
într-o soluție de referință de clorhidric.
Potențiometrie 175
acid (de obicei 0,1 mo11-1 ) conținut într-o membrană de sticlă. Membrana
este fabricată dintr-o sticlă specială, de obicei un aluminosilicat hidratat care
conține ioni de sodiu sau calciu. Aceasta este permeabilă selectiv la ionii de
hidrogen, iar potențialul care se dezvoltă de-a lungul membranei depinde de
concentrația de ioni de hidrogen din soluția de testare în comparație cu soluția
acidă de referință din interiorul electrodului. Acest potențial poate fi măsurat în
raport cu un electrod de referință din calomel cu ajutorul unui voltmetru de
înaltă impedanță. Pentru ușurința funcționării, electrodul de sticlă este adesea
combinat cu un electrod de referință din calomel într-o singură sondă (figura
4.9). Electrozii de sticlă trebuie depozitați în apă între utilizări pentru a
menține membrana de sticlă complet hidratată.
Există o relație aproape liniară între potențial și pH în intervalul de pH
2-10, dar la valori extreme ale pH-ului trebuie utilizați electrozi de sticlă
speciali. Etalonarea instrumentelor este esențială și poate fi realizată fie cu
soluții tampon al căror pH a fost măsurat anterior cu ajutorul unui electrod de
hidrogen, fie cu soluții de substanțe chimice foarte pure, preparate în
concentrații specifice,
De exemplu, o soluție de hidrogenoftalat de potasiu (0,05 mo11-1 ) are un pH
de 4,00 la 15 °C. Pentru măsurători pe o gamă de valori de pH, este necesar
să se stan dardizeze instrumentul pe cel puțin două soluții tampon standard
care să acopere gama necesară, asigurându-se că se utilizează setarea corectă a
temperaturii.
....+t-- Electrod de calomel

--Porous plug
"Hr--Solid KCI
Clorură de argint-argint -...;...;...-
.s:1:..:
electrod
Figura 4.9
Soluție HCI de referință -----.-
Un electrod de pH
combinat. Membrană de sticlă ----
4.1.3 Electrozi selectivi de ioni

Membrana electrodului de sticlă utilizat pentru măsurarea pH-ului este
permeabilă în mod selectiv la ionii de hidrogen și, pornind de la acest concept
de bază, a fost dezvoltată o întreagă gamă de electrozi selectivi pentru ioni.
Variația compoziției membranei de sticlă poate modifica permeabilitatea
sticlei și mai multe electrozi sensibili la cationi
electrozi au fost dezvoltați în acest mod (tabelul 4.2). Deși astfel de electrozi
pot fi descriși ca fiind specifici pentru ioni precum Na+, K+, Ca2+ și NH4 +,
aceștia sunt de fapt doar selectivi și nu specifici și prezintă adesea interferențe
semnificative din partea altor ioni, în special a ionilor de hidrogen. În toate
cazurile, designul de bază al electrodului este același (figura 4.10), dar natura
membranei selective de ioni variază.
-1-+-- Referință internă

electrod
--+-++----Soluție
electrolitică de
referință
Figura 4.10
Structura de bază a -- Membrană
unui electrod selectiv selectivă de
de ioni. ioni
Tabelul 4.2 Electrozi selectivi de ioni
Test ion Material membrană Ioni perturbatori majori
Electrozi în stare solidă

Fluorură LaF 1- Br- c1-
Clorură AgCI/Ag2 s- 1-
Bromură S s- i-
Bromură AgBr/Ag2 s-
Iodură S Agl/Ag2
Sulfură S Agl/Ag2 Hg+ Ag+
Cupru S Ag2 Hg+ Ag+
Plumb S/CuS Ag2 Hg+ Ag+
Cadmiu S/PbS Ag2 Hg+Ag+ Cu2+
Argint S/CdS
Electrozi cu membrană Ag2S
lichidă Potasiu
Valinomicină în eter difenilic
Amoniu Calciu Macrotetrolide în fosfat de tris(2-etilhexil) Fosfat de
Calciu calciu în dialkilfosfat de calciu în dioctilfenilfosfonat
Calciu/magneziu Acid dialchilfosforic în alcool alifatic
Potențiometrie 177
Electrod
Soluție de argint de
referință
)' '\
Ioni de argint în soluție
Figura 4.11 Un electrod în stare solidă care prezintă un răspuns de ordinul întâi.
Un electrod conceput pentru a măsura activitatea ionilor de argint utilizează o
membrană cristalină de sulfură de argint. Un echilibru între ionii de argint mobili din
membrană și ionii de argint din soluții are ca rezultat dezvoltarea unei diferențe de
potențial de-a lungul membranei.
Electrod
Argint de referință
REACȚIE
I
Ioni de clorură în soluție
Figura 4.12 Un electrod în stare solidă care prezintă un răspuns de ordinul doi.
Electrodul prezentat în figura 4.11 poate fi modificat prin încorporarea de clorură de
argint în membrană pentru a permite măsurarea activității ionilor de clorură dintr-o
probă. O reacție de suprapunere între ionii de clorură din test și ionii de argint din
membrană modifică activitatea acestora din urmă, ceea ce duce la o modificare a
diferenței de potențial pe membrană.
Anion de testare ..., Cation de membrană
În cazul electrozilor în stare solidă, membrana este un disc solid dintr-un

material cristalin relativ insolubil, care prezintă o mare specificitate pentru un
anumit ion. Membrana permite mișcarea ionilor în cadrul structurii rețelei
cristaline, iar acei ioni care perturbă cel mai puțin structura rețelei sunt cei mai
mobili. Aceștia au, de obicei, cea mai mică sarcină și cel mai mic diametru.
Prin urmare, numai acei ioni care sunt foarte asemănători cu ionii mobili
interni pot avea acces la membrană din exterior, o caracteristică care conferă
membranelor cristaline specificitatea lor ridicată. Atunci când electrodul este
scufundat în soluția de probă, se stabilește un echilibru între ionii mobili din
cristal și ionii similari din soluție, iar potențialul rezultat creat de-a lungul
membranei poate fi măsurat în mod obișnuit.
Cele mai simple membrane de stare solidă sunt concepute pentru a
măsura ionii de testare, care sunt, de asemenea, ionii mobili ai cristalului
(răspuns de ordinul întâi) și sunt de obicei cristale monosubstanțiale (figura
4.11). Alternativ, substanța de testat poate fi implicată în una sau două reacții
chimice pe suprafața elec trodului care modifică activitatea ionului mobil din
membrană (figurile 4.12 și 4.13). Astfel de membrane, care sunt adesea
amestecuri de substanțe, se spune că prezintă răspunsuri de ordinul doi și trei.
În timp ce doar un număr limitat de ioni pot avea acces la o anumită
membrană, un număr mai mare de substanțe vor putea reacționa la suprafața
membranei. Ca urmare, selectivitatea electrozilor care prezintă răspunsuri de
ordinul doi și trei este redusă.
Electrozii cu membrană lichidă constau dintr-un material selectiv de ioni
dizolvat
Electrod
Argint de referință
Ioni de cadmiu în soluție
Figura 4.13 Un electrod cu stare solidă care prezintă un răspuns de ordinul trei.
O modificare alternativă a electrodului descris în figura 4.11 va permite măsurarea
ionilor de cadmiu în soluție. Membrana este compusă dintr-un amestec de sulfuri de
argint și de cadmiu. Reacția de suprafață dintre ionii de cadmiu din soluția de testare
și ionii de sulfură din membrană va afecta echilibrul dintre ionii de sulfură și ionii de
argint din membrană.
Test cationi Membrană anion Membrană cationi
Potențiometrie 179
Electrod
Soluție de referință
de ioni
Testul ionilor în soluție
Figura 4.14 Structura de bază a unui electrod cu membrană lichidă. Împărțirea

ionilor din probă în solventul imiscibil al membranei va determina o modificare a
potențialului pe membrană. Efectul poate fi îmbunătățit prin legarea ionilor de testare
de o substanță selectivă de ioni care poate fi încorporată în membrană.
într-un solvent care nu este miscibil cu apa. Lichidul este ținut într-o
membrană poroasă, inertă (adesea din plastic) care permite contactul între
soluția de testare pe o parte și electrolitul de referință pe cealaltă parte. Ionii
din soluția de referință se vor împărți între cei doi solvenți nemiscibili (faza
apoasă și cea organică}, dând electrodului un potențial special. Prezența
ionilor de testare în probă afectează activitatea ionilor de referință din
membrană, ceea ce duce la o modificare a diferenței de potențial pe
membrană. În timp ce solventul este ales pentru a oferi cele mai bune efecte
de partiție pentru un anumit ion, specificitatea și sensibilitatea procesului
(figura 4.14) pot fi îmbunătățite considerabil prin încorporarea unei substanțe
chelatare sau selective de ioni specifice. Acestea sunt adesea contra-ioni mari
față de ionii de testare și au o solubilitate scăzută în apă, având tendința de a
forma complexe nedisociate cu ionii de testare.
Electrozii selectivi de ioni sunt adesea încorporați în analizoarele
automate, în special pentru măsurarea sodiului și a potasiului. Electrozii pot fi
amplasați în interiorul instrumentului sau pot fi disponibili sub formă de
miniatură de unică folosință (figura 4.15)
Utilizarea electrozilor selectivi de ioni

Deoarece măsurătorile potențiometrice reflectă mai degrabă activitatea unui
ion decât concentrația acestuia, este de obicei necesar să se calibreze sistemul
cu soluții standard de activitate cunoscută. Este posibil să se calculeze
concentrația unui
într-un eșantion dacă se cunoaște valoarea coeficientului de activitate pentru

a
ionul respectiv: log -= log -y
C
unde a este activitatea ionului,
c este concentrația ionului,
-y este coeficientul de activitate.
Ecuația este probabil mai utilă sub forma log c =
log a - log -y
Punte de
hârtie
Membrană Membrană
selectivă de selectivă de
ioni ioni
(valinomicină) (valinomicină)
Strat de referință Strat de referință

intern intern
(KCI saturat) (KCl saturat)
AgCl AgCI
Ag Ag
Electrod indicator Electrod de referință
Figura 4.15 Reprezentarea lamei de unică folosință pentru măsurarea potas siului cu
ajutorul sistemului Vitros Chemistry System. Diferența de potențial dintre cele două
semicelule, una care primește proba și cealaltă o soluție de referință cu o concentrație
cunoscută de ioni de potas siu, este convertită matematic pentru a obține concentrația
de ioni de potas siu din probă.
Adesea este mai convenabil să se raporteze direct citirea

potențiometrului la concentrație prin ajustarea puterii ionice și, prin urmare, a
activității atât a etaloanelor, cât și a probelor, la aceeași valoare cu un exces
mare de soluție de electrolit care este inert în ceea ce privește electrodul
utilizat. În aceste condiții, potențialul electrodului este proporțional cu
concentrația ionilor de testat. Utilizarea unor astfel de soluții, cunoscute sub
numele de TISAB (tampoane de reglare a tăriei ionice totale), permite, de
asemenea, controlul pH-ului, iar compoziția acestora trebuie să fie concepută
pentru fiecare test în parte, iar proporția de tampon față de probă trebuie să fie
constantă.
Electrozii selectivi de ioni sunt deosebit de utili pentru monitorizarea
dispariției unui ion în timpul unei titrări. În multe cazuri, nu este necesară
calibrarea instrumentului, deoarece există adesea o schimbare semnificativă a
potențialului la punctul final al unei titrări. Cu toate acestea, unii electrozi au un
timp de răspuns lent și trebuie să se aibă grijă ca titrarea să nu fie efectuată prea
repede.
Conductimetrie 181
În afară de interferențe, cea mai mare problemă în utilizarea electrozilor

selectivi de ioni este cea a contaminării. Orice material insolubil depus pe
suprafața electrodului va reduce semnificativ sensibilitatea acestuia, iar
peliculele de ulei sau depunerile de proteine trebuie îndepărtate prin spălare
frecventă și temeinică. Este posibil să se șteargă membranele cu un țesut
moale, dar acestea se pot deteriora ușor. Membranele în stare solidă sunt mai
rezistente, dar nu trebuie utilizate în nicio soluție care ar putea reacționa cu
materialul membranei.
Secțiunea 4.1
1. Dacă semicelul A are un potențial de electrod de 0,2 V, iar semicelul B
are un potențial de electrod de -0,1 V, care dintre următoarele afirmații
sunt adevărate?
(a) A poate reduce B.
(b) B poate reduce A.
(c) A poate oxida B.
(d) B poate oxida A.
2. Care dintre următorii factori vor afecta măsurarea pH-ului
folosind un electrod de sticlă?
(a) Temperatura.
(b) Valența ionilor prezenți.
(c) Prezența sărurilor.
(d) Prezența de proteine.
3. Potențiometria implică utilizarea unor sisteme de electrozi cunoscuți
sub numele de celule voltaice.
PENTRU CĂ
în metodele potențiometrice, se aplică o tensiune între doi electrozi.
4. Electrodul de sticlă este un exemplu de electrod selectiv pentru
ioni, deoarece
un electrod selectiv de ioni încorporează o membrană care
restricționează în mod preferențial fluxul tuturor ionilor, cu excepția
ionului de analit.
Cea mai simplă aplicație a unei celule electrolitice este măsurarea

conductibilității. Dacă se aplică o tensiune fixă la doi electrozi care se scufundă
într-o soluție de testare, în funcție de conductivitatea soluției, va trece un curent
între ei. Deși măsurătorile conductivității nu oferă i n f o r m a ț i i despre natura
ionilor din soluție, ele pot fi utilizate cantitativ. Cu toate acestea, ele sunt utilizate
mai frecvent pentru a monitoriza schimbarea compoziției unei soluții în timpul
unei titrări.
Curentul care trece între cei doi electrozi este purtat de ionii din soluție
(figura 4.16) și este legat de numărul celor prezenți, care este rezultatul atât al
concentrației molare a compusului, cât și al gradului de ionizare a acestuia.
Anionii donează electroni către anod, în timp ce cationii acceptă
electroni de la catod. Acest transfer de electroni este cel care determină

cantitatea de curent care circulă, iar contribuția fiecărei specii ionice este
determinată de mobilitatea (viteza) ionică a acesteia.
Din cauza naturii reacției prin care moleculele se disociază în ioni, nu
există întotdeauna o relație simplă între creșterea conductibilității și creșterea
concentrației molare și adesea se atinge o valoare limită. De exemplu,
concentrațiile crescânde de acid sulfuric duc la creșterea conductivității până
la o concentrație de aproximativ 35% (v/v), peste care conductivitatea scade.
Curentul care circulă printr-un conductor este definit de legea lui Ohm
astfel:
tensiunea aplicată
curent ([) = (V)
rezistență (R)
sau în termeni de conductanță (C)
I= CXV
Conductanța specifică (K) a unei soluții se definește ca fiind conductanța
(S) pe centimetru dintr-o soluție care are o suprafață a secțiunii transversale de
1 cm2 , și se măsoară în S cm-1 (sau în unități non-SI ca n-1.cm-1). Conductanța
molară
(A) este conductanța specifică a unei soluții corectată în funcție de
concentrația ionilor din soluție. A = K X volumul soluției care conține 1 gram
mol. În mod normal, valoarea lui K va scădea pe măsură ce concentrația
soluției se reduce.
scade, dar valoarea pentru A va crește din cauza disocierii sporite a
moleculelor în soluțiile diluate. O valoare pentru conductanța molară la diluție
infinită (A0 ) poate fi determinată prin reprezentarea grafică a valorilor
calculate pentru A în funcție de concentrația molară a soluției utilizate și prin
determinarea valorii de platou pentru A. Din astfel de investigații este posibil
să se determine mobilitățile ionice ale ionilor (tabelul 4.3) și să se calculeze
conductanța molară a unei soluții.
+
I--
I II
--- e - -- e
0-
- --0 f--
0-
0--
Figura 4.16 Conductivitatea unei soluții. Transferul total de electricitate nu este

neapărat împărțit în mod egal, deoarece diferiți ioni se deplasează cu viteze diferite.
Legea Kohlrausch spune că conductivitatea totală a unui electrolit este suma con
ductivităților anionilor și cationilor.
Conductimetrie 183
electrolit la diluție infinită, de exemplu, valoarea pentru sulfatul de potasiu

(234) este suma mobilităților ionice ale potasiului (74) și sulfatului (160).
Tabelul 4.3 Conductivitatea ionică molară
Cation Conductanță molară Anion Conductanță molară

(0 -i cm2 moi-1) (0-1 cm2mol-1)
Na+ 50 Hco- 45
Ag+ 62 HS04- 52
K+ 74 Mn04- 61
NH4+ 74 No3- 71
Zn2+ 106 c1- 76
Mg2+ 106 1- 77
Cu2 + 107 Br- 78
Fe2+ 108 co/- 119
Ca2 + 119 așa/- 160
Fe3 + 205 ow 197
H+ 350 PO 3- 240
4
4.2.1 Măsurători conductimetrice

Instrumentarul de bază pentru măsurătorile conductimetrice este o punte
Wheatstone (figura 4.17). Se utilizează un curent alternativ mai degrabă decât
un curent continuu pentru a preveni polarizarea soluției (adică anionii care se
deplasează spre anod și cationii care se deplasează spre catod) și orice
electroliză care ar putea rezulta din această polarizare.
Cu rezistențe fixe, R1 și R2 , rezistența variabilă Rv este reglată până
când prin galvanometru nu trece curent. În aceste condiții:
RI X Rv = Reen X R2
Figura 4.17
O punte Wheatstone
Astfel se obține o valoare pentru rezistența celulei, care poate fi convertită în

conductanță prin calcularea valorii reciproce.
Electrozii celulelor de conductivitate sunt de obicei confecționați din
platină acoperită cu negru de platină cu o suprafață cunoscută. Deși în multe
celule distanța dintre electrozi este reglabilă, pentru orice serie de experimente
aceasta trebuie menținută constantă și pentru multe calcule este necesară
valoarea exactă. Celulele trebuie să fie controlate termostatic, deoarece orice
modificare a temperaturii va cauza o alterare semnificativă a valorilor
conductivității.
4.2.2 Aplicații ale măsurătorilor conductimetrice

Deși conductimetria este utilă în determinarea diferitelor constante fizice,
de exemplu, constantele de disociere și de solubilitate, principala sa aplicație
analitică este monitorizarea titrărilor.
Atunci când două soluții de electrolit care nu reacționează între ele sunt
amestecate, cu condiția să nu existe o modificare apreciabilă a volumului,
conductibilitatea soluției va crește din cauza creșterii numărului de ioni. Cu
toate acestea, în cazul în care are loc o reacție între ioni, un ion fiind înlocuit
cu altul, conductibilitatea soluției se va modifica în funcție de raportul dintre
cei doi ioni.
'
(a) (b)
Volumul de alcalin Volumul de alcalin

(c) (d)
Figura 4.18 Curbe de titrare conductimetrică. Pe măsură ce un acid este titrat cu un

alcalin, compoziția ionică a amestecului se modifică și se reflectă în conductivitatea
soluției. (a) Un acid puternic și o bază puternică. (b) Un acid puternic și o bază slabă.
(c) Un acid slab și o bază slabă. (d) Un acid slab și o bază puternică.
Coulometrie 185
mobilitățile ionilor implicați. În reacția A+B-

+ c+D- =AD+ c+B-
în care CD este titrantul, efectul reacției este înlocuirea lui A+ cu c+ în
soluție. Dacă acești doi ioni au mobilități ionice diferite, conductanța soluției
se va modifica în consecință. Acest lucru este ilustrat în titrarea unui acid
puternic cu o bază puternică: ionii de hidrogen sunt înlocuiți de cationul din
bază, care va avea o mobilitate ionică mai mică și, prin urmare, o
conductibilitate mai mică (tabelul 4.3) și va avea ca rezultat o scădere treptată
a conductibilității soluției. Cu toate acestea, la punctul final al reacției,
concentrația crescândă a ionilor de hidroxil va avea ca rezultat o conductanță
în creștere (figura 4.18). O extrapolare a liniilor înainte și după punctul final
va da o interceptare la punctul final.
Titrările conductimetrice, în special atunci când sunt automatizate, sunt
utilizate în cazul în care unul dintre reactanți este foarte colorat, împiedicând
astfel monitorizarea vizuală a titrării cu ajutorul indicatorilor, sau în cazul în
care ambii reactanți sunt foarte diluați.
Celulele de conductanță cu trecere prin flux sunt detectori utili în
separările cromatografice cu schimb de ioni, în care analiții sunt ionici atunci
când intră în celula de detecție. La concentrațiile scăzute întâlnite,
conductivitatea este proporțională cu mobilitatea ionilor implicați, precum și
cu concentrația acestora, iar acest lucru, împreună cu conductivitatea de fond
a solventului, impune utilizarea de standarde. Conductivitatea crește odată cu
creșterea temperaturii și este important ca în astfel de măsurători să se
monitorizeze temperatura și să se facă corecțiile corespunzătoare la calcularea
rezultatelor.
Coulometria este o metodă electrolitică de analiză. În general, metodele

electrolitice au aplicații limitate în biochimia analitică, dar sunt utile în
analiza substanțelor care, deși nu sunt strict biochimice, sunt adesea
importante în chimia biologică și fiziologică.
Legile lui Faraday privind electroliza constituie baza analizei
coulometrice cantitative. Acestea sunt:
1. Greutatea substanței eliberate în timpul electrolizei este direct
proporțională cu cantitatea de electricitate transmisă.
2. Greutățile substanțelor eliberate de aceeași cantitate de electricitate sunt
direct proporționale cu greutățile echivalente ale acestora.
Există două tipuri de analiză coulometrică care utilizează fie curent
constant, fie tensiune constantă. În cazul celei din urmă (cunoscute sub
numele de metode coulometrice), se aplică o tensiune fixă care face ca
substanța de testat să reacționeze la un electrod, iar curentul care circulă
scade pe măsură ce scade numărul de ioni de testat rămași. Cantitatea totală
de curent care circulă în timpul reacției poate fi măsurată și corelată cu
cantitatea de substanță de testat prezentă inițial. Acest tip de măsurare are
doar aplicații biochimice limitate. În trecut, a fost utilizat pentru măsurarea
oxigenului, dar dispozitivele cunoscute sub numele de electrozi de oxigen
sunt mai frecvent utilizate în prezent. Tehnica alternativă a curentului
constant
coulometria (cunoscută sub numele de titrare coulometrică) este mai utilă în

biochimia analitică, deoarece permite generarea de reactivi specifici, adesea
foarte labili, la electrozi.
Tabelul Titrări coulometrice

4.4
Analit Titrant Generarea Electrod
generat electrolit
Calciu EDTA EDTA mercuric în amoniac Mercur

tampon catod
Clorură Ioni de argint Anod de
argint
Fier2+ Ce4+ Sulfat cerios în H2S04 Anod Anod
Oxigen Cr2+ Sulfat de crom în H2S04 Soluție Catod
(acizi) Ioni de hidroxil de sulfat de sodiu
(Bazele) Ioni de hidrogen Soluție de sulfat de sodiu Anod
4.3.1 Titrări coulometrice

Atunci când prin celulă trece un curent constant, timpul necesar pentru ca
reacția să se încheie poate fi utilizat ca măsură a cantității de substanță de
testat prezentă inițial. Reacția electrodului poate implica direct ionii de
testat (ca în cazul tehnicilor cu tensiune constantă) sau poate genera o altă
substanță care va reacționa cu substanța de testat. La un electrod pot fi
generați reactivi care nu pot fi produși în alt mod, deoarece sunt foarte
instabili. Punctul final poate fi detectat cu ajutorul unui sistem vizual, de
exemplu cu ajutorul coloranților indicatori, dar, de cele mai multe ori, cu
ajutorul unui sistem de electrozi suplimentari, de exemplu prin
potențiometrie. Titrările coulometrice oferă metode de analiză (tabelul
4.4) care sunt foarte precise și se pretează cu ușurință la automatizare și la
analiza unor probe foarte mici. Deși astfel de metode nu necesită în mod
strict standardizare, cantitatea de electricitate fiind standardul, se
obișnuiește să se utilizeze probe de control pentru a verifica sau ajusta
condițiile de analiză.
Sistemul electrolitic este format dintr-un electrod generator sau de
lucru și un electrod auxiliar (figura 4.19). Electrodul auxiliar este de
obicei ținut într-un tub de sticlă separat, cu un disc de sticlă fin și poros,
pentru a împiedica reactivul de titrare produs la electrodul de lucru să
ajungă la acesta și să reducă astfel eficiența reacției. În plus, este necesară
o pereche de electrozi indicatori pentru a detecta punctul final al reacției.
Electrozii variază în funcție de natura reacției de testare care are loc în
celulă. Pentru ca acești electrozi să funcționeze în mod eficient, trebuie să
existe ioni în toate etapele reacției și, prin urmare, se obișnuiește să se
introducă în amestecul de reacție un electrolit purtător care nu
reacționează.
Cantitatea de substanță titrată poate fi calculată cu ajutorul următoarei
ecuații:
W = ItM
Fn
Coulometrie 187
Sursă de
Conto
curent
r și
constant
crono
metru
Electrod
Electrozi auxiliar
indicatori
Electrod
de lucru
I
I
o_n_n.r:
Figura 4.19 O celulă de titrare coulometrică cu curent constant. Reactivul este

produs la electrodul de lucru și reacționează cu proba. Electrozii indicatori detectează
modificarea potențialului sau a conductivității soluției, iar valoarea modificării care are
loc este măsurată și corelată cu concentrația reactivului din probă.
unde W este greutatea substanței,

M este masa moleculară relativă,
F este constanta Faraday (96 493),
n este numărul de echivalenți,
t este timpul în secunde,
/ este curentul în amperi.
Cu toate acestea, majoritatea instrumentelor concepute pentru titrare
coulometrică sunt cel puțin semiautomate și convertesc direct timpul într-o
măsură a concentrației probei.
Determinarea clorurilor cu ajutorul unui instrument cunoscut sub
numele de clorimetru este probabil cea mai frecventă aplicație a coulometriei
în biochimie. Instrumentul este conceput pentru a genera electrolitic ioni de
argint de la un anod de argint. Acești ioni sunt eliminați din soluție sub formă
de clorură de argint nedisociată, care se depune pe anod sau precipită în
soluție. O concentrație scăzută de electrolit purtător (ioni de nitrat) permite un
curent mic
să curgă între electrozii indicatori în timpul titrării, dar crește rapid la punctul
final, când apar în soluție ioni de argint. Această creștere a curentului poate fi
utilizată pentru a declanșa un circuit de releu care oprește cronometrul și
înregistrează timpul total al reacției.
Voltammetria este termenul dat tehnicilor electrochimice care monitorizează

relația dintre tensiunea aplicată unui sistem de electrozi și curentul care
circulă ca urmare a reacției. Acoperă o gamă largă de tehnici cu electrozi
diferiți, dintre care multe sunt special concepute pentru a monitoriza o
anumită reacție chimică. Voltammetria este în general împărțită în două
subdiviziuni principale: polarografie și ampermetrie.
În timpul electrolizei, ionii sunt descărcați la electrozii corespunzători și
este necesară o alimentare continuă cu ioni pentru ca curentul să continue să
curgă. Se spune că un ion este descărcat atunci când acceptă sau donează un
electron la un electrod și, ca urmare, își pierde sarcina. Dacă există doar o
concentrație mică de ioni reactivi, aceștia vor fi descărcați rapid în jurul
electrodului și curentul va scădea la un nivel care depinde de viteza cu care
mai mulți ioni se pot dezinfecta din masa soluției către electrod. Pe măsură ce
tensiunea crește, la fel și rata de difuzie va crește până la un nivel maxim, care
este determinat nu numai de natura ionului, ci și de concentrația acestuia.
Rezultă un curent maxim, care este cunoscut sub numele de curent de difuzie.
Nivelul curentului de difuzie este utilizat în tehnicile de polarografie
cantitativă, dar tensiunea la care se produce constituie baza polarografiei
calitative. Variantele de voltametrie în care tensiunea este menținută
constantă, iar variațiile curentului sunt măsurate, sunt cunoscute sub numele
de tehnici ampermetrice și sunt utilizate frecvent pentru a monitoriza punctul
final al titrării sau prezența unui anumit analit în efluentul unei coloane
cromatografice.
4.4.1 Polarografie
În metodele polarografice, tensiunea aplicată unui sistem de electrozi este
crescută treptat, iar curentul rezultat este măsurat continuu. Informațiile sunt
de obicei prezentate într-o formă grafică cunoscută sub numele de
polarogramă, care reprezintă o reprezentare a curentului în funcție de
tensiune. În cazul în care există o concentrație foarte mare de ioni care nu
reacționează, adică ioni care nu se descarcă la tensiunea aplicată, aceștia vor fi
responsabili pentru transportul celei mai mari părți a curentului. Cantitatea de
curent transportată de acești ioni va fi aproape independentă de tensiunea
aplicată și este cunoscută sub numele de curent rezidual. Cu toate acestea, pe
măsură ce tensiunea crește și atinge potențialul de descărcare al celorlalți ioni,
curentul va crește rapid datorită descărcării lor, dar se va stabiliza la un nou
nivel maxim (curentul de difuzie), care depinde de rata ulterioară de difuzie a
acestora către electrod. Aceste modificări sunt reflectate în forma
polarogramei (figura 4.20).
Potențialul sau tensiunea la care se va descărca un anumit ion este
Voltammetrie 189
Curent de difuzie
Curent rezidual
E112
0 --- Tensiune aplicată ------------------ ve
Figura 4.20 O curbă de titrare polarografică. O polarogramă prezintă oscilații în jurul

unei curbe medii de curent-tensiune datorită modificării regulate a suprafeței picăturii
de mercur.
caracteristică a ionului, deși este ușor afectată de concentrația acestuia. Cu

toate acestea, potențialul de jumătate de undă (£112) este independent de
concentrație și
poate fi folosit pentru a identifica un anumit ion, ceea ce conferă polarografiei
un caracter calitativ.
cerere. Diferența dintre curentul rezidual și cur rentul de difuzie depinde de
concentrații și este utilizată pentru măsurători cantitative (figura 4.20). În
analiza cantitativă este necesar să se standardizeze instrumentul folosind
soluții cu concentrație cunoscută și să se pregătească un grafic de calibrare
folosind diferența dintre curentul rezidual și curentul de difuzie ca parametru
variabil.
În tehnicile polarografice clasice, se utilizează un electrod de mercur în
cădere. Acesta este un dispozitiv complex în care se folosesc picături mici de
mercur, produse în mod continuu, ca electrod activ, pentru a preveni otrăvirea
electrodului și pentru a asigura condiții constante pe tot parcursul analizei.
Pentru multe aplicații, sunt disponibili electrozi special concepuți, care sunt
mai simplu de utilizat.
O variantă specifică a tehnicii este cunoscută sub numele de voltametrie
ciclică în curent continuu (DCCV), în care variația de tensiune se face pe o
gamă limitată și pe o perioadă scurtă de timp și se inversează imediat. Ciclul
se repetă de mai multe ori și se monitorizează modelul de schimbare a
curentului. Tehnica utilizează electrozi relativ simpli și este folosită pentru a
studia reacțiile redox, existând o serie de variante sofisticate ale tehnicii.
4.4.2 Detectoare electrochimice pentru HPLC

Dispozitivele amperometrice sunt din ce în ce mai populare ca detectoare
HPLC. Se aplică o tensiune fixă și se măsoară curentul rezultat. Sistemul este
format dintr-un
celulă de debit care conține un electrod de lucru și un electrod de referință.

Există o gamă de electrozi disponibili pentru a fi utilizați în modul de oxidare,
printre care se numără carbonul sticlos, care este dur și impermeabil la
solvenți organici, platina și aurul, care tind să fie otrăviți de solvenții absorbiți,
precum și alții cu proprietăți îmbunătățite, care sunt în curs de dezvoltare
comercială.
La proiectarea unei metode este necesar să se cunoască tensiunea de
funcționare a
electrodul pentru un anumit analit. Polarograma clasică (figura 4.20) prezintă
un potențial de jumătate de undă (£112) și curentul de difuzie. Pe măsură ce
potențialul aplicat este mărit dincolo de nivelul curentului de difuzie, în cele
din urmă mobilul
va reacționa la electrod și se va produce o creștere semnificativă a curentului
care circulă. Potențialul utilizat ar trebui să se situeze între potențialul de
jumătate de undă pentru analit și potențialul de descărcare al fazei mobile. Cel
mai frecvent se alege tensiunea de la începutul curentului de difuzie. Prin
utilizarea mai multor electrozi, este posibilă măsurarea simultană a diferiților
compuși prin selectarea unei tensiuni de funcționare diferite pentru fiecare
electrod.
4.4.3 Electrod de oxigen

Conținutul de oxigen dizolvat al unei soluții poate fi determinat prin măsurarea
curentului de difuzie care rezultă la o tensiune selectată. Electrodul Clark a fost
dezvoltat în acest scop, iar ulterior au fost introduse diferite modificări. Acesta
constă, în principiu, dintr-un electrod de platină separat de probă p r i nt r - o
membrană permeabilă la oxigen, de exempl u, teflon sau polietilenă. Un electrod
de referință din argint/clorură de argint în clorură de potasiu este utilizat pentru a
completa sistemul (figura 4.21). Atunci când se aplică o tensiune care este
suficientă pentru a da
Tensiune de
alimentare a
contorului
Anod
Ag/AgCI Catod de platină
de
referință
Figura 4.21
Un electrod de oxigen. Membrană
- Biosenzori 191
se aplică un curent de difuzie pentru oxigen (adesea -0,6 până la -0,8 V în raport
cu electrodul de referință), valoarea curentului care circulă este legată de
presiunea parțială a oxigenului (P02 ) din probă. Cu toate acestea, este necesar să
se calibreze electrodul folosind soluții cu un conținut cunoscut de oxigen. Alte
gaze, precum oxigenul, pot fi reduse la tensiunea de funcționare a electrodului, de
exemplu, halogenii, hidrocarburile halogenate și dioxidul de sulf, și vor interfera
cu măsurătorile cantitative, în timp ce hidrogenul sulfurat va otrăvi electrodul.
4.4.4 Voltampermetrie de stripping anodic

Aceasta este o tehnică de analiză a urmelor de metale și reprezintă o inversare
a metodei polarografice obișnuite. Utilizând u n electrod de mercur, fie sub
formă de picătură suspendată, fie sub formă de tijă de grafit acoperită cu
mercur, se aplică un potențial negativ (catodic) în raport cu un electrod de
referință de argint/clorură de argint. Orice ioni metalici, cu potențiale de
descărcare mai mici decât cel aplicat, se vor depune pe electrod și vor forma
un amalgam cu mercurul. Este important să se controleze timpul de electroliză
și metoda de agitare a probei, deoarece cantitatea de metal depusă va fi luată
ca o măsură a concentrației sale în probă.
Etapa de analiză implică scanarea tensiunii aplicate electrodului spre un
potențial mai pozitiv (anodic). Pe măsură ce potențialul devine mai pozitiv,
atomii de metal se reoxidează, dând naștere unei unde anodice de curent.
Curentul va prezenta o valoare maximă pe măsură ce toți atomii unui anumit
element sunt îndepărtați de pe electrod sub formă de ioni. Înălțimea vârfului
care rezultă este proporțională cu cantitatea de metal, iar tensiunea la care are
loc desprinderea va fi caracteristică elementului respectiv.
Tehnica este utilă pentru cuantificarea multor metale, inclusiv a
plumbului, cuprului, mercurului, cadmiului și zincului, cu limite de detecție de
până la lOpg. Sensibilitatea sa o face o metodă foarte potrivită pentru analiza
urmelor de metale în probele biologice.
Biosenzorii sunt dispozitive analitice care încorporează o componentă

biologică și un traductor. Acestea trebuie să se afle în imediata apropiere una
de cealaltă și, de preferință, în contact intim, adică componenta biologică
imobilizată pe transductor. Astfel de dispozitive sunt disponibile în forme de
unică folosință, de exemplu, pentru măsurarea glicemiei la pacienții diabetici,
evaluarea prospețimii cărnii necoapte. Alte modele sunt adecvate pentru
utilizare continuă, de exemplu, monitorizarea on-line a proceselor de
fermentare, detectarea substanțelor toxice.
4.5.1 Componente ale biosenzorului

Componente biologice
Componentele biologice posibile se împart în două categorii principale
(tabelul 4.5), iar funcția lor este de a recunoaște și de a lega un analit specific.
Legăturile corespunzătoare ale componentei biologice sunt cele care conferă
specificitate biosenzorilor și le fac potrivite pentru analiza probelor fără
tratare prealabilă.
Tabelul 4.5 Componente biologice ale biosenzorilor
Componenta Exemple
Biocatalizatori Enzime
Celule microbiene, vegetale,
animale Organite subcelulare
Bioreceptori Anticorpi
Lectine
Receptorii membranei
celulare Acizi nucleici
Molecule sintetice
În cazul biocatalizatorilor, legarea este urmată de o reacție chimică și

de eliberarea de produse. Enzimele au fost primii catalizatori utilizați în
biosenzori și există un număr mare de aceste proteine naturale. Deși acestea
rămân cele mai frecvent utilizate, utilizarea enzimelor purificate nu este
întotdeauna satisfăcătoare și, în anumite situații, pot fi preferabile preparatele
celulare care conțin enzimele necesare în mediul lor natural. Această abordare
reduce specificitatea, dar poate fi utilizată în mod avantajos atunci când este
necesară analiza unei serii de substanțe înrudite, ca în cazul monitorizării
poluării.
În cazul dispozitivelor care încorporează bioreceptori, legarea este
necatalitică și, în esență, ireversibilă. O importanță majoră pentru dezvoltarea
acestui tip de biosenzor a avut-o disponibilitatea comercială a anticorpilor
monoclonali. Acest lucru, împreună cu disponibilitatea altor bioreceptori și cu
îmbunătățirea metodelor de monitorizare a legăturii, de exemplu, optice,
piezoelectrice, a dus la introducerea unor dispozitive capabile să detecteze
cantități infime dintr-o gamă largă de substanțe, cum ar fi medicamente,
hormoni, viruși și bacterii patogene.
Traductoare
Transductorul convertește reacția dintre analit și componenta biologică într-
un semnal electric care reprezintă o măsură a concentrației analitului. Este
disponibilă o gamă largă de traductoare, care se împart în linii mari în
electrochimice, optice, termice și piezoelectrice.
4.5.2 Blosenzori electrochimici

Biosenzorii electrochimici sunt cei mai comuni, în special atunci când
componenta biologică este o enzimă. Multe reacții enzimatice implică
consumul sau generarea de specii electroactive și pot fi monitorizate prin
tehnici ampero-metrice, potențiometrice sau conductimetrice, deși acestea din
urmă sunt cele mai puțin dezvoltate și nu vor fi discutate în continuare.
Biosenzori amperometrici
Aceste dispozitive măsoară curentul care este produs atunci când se aplică o
diferență de potențial constantă între electrozii de transducție și de referință.
Un curent este produs atunci când specia de interes este fie oxidată la anod,
fie redusă la catod. Cantitatea de curent care circulă este o funcție a
concentrației speciei respective la suprafața electrodului. Acest tip de
Biosenzori 193
este aplicabil substanțelor care sunt ușor de oxidat sau redus electrochimic la
un electrod.
Biosenzorii pentru măsurarea glucozei care se bazează pe glucoxidază
sunt exemple de dispozitive care utilizează detecția amperometrică. Reacția
globală poate fi monitorizată în mai multe moduri.
glucoză + 02 = acid gluconic + H202
Inițial, a fost utilizat un electrod de oxigen Clark pentru a măsura o reducere a

chiriei datorată consumului de oxigen. Apoi a fost introdusă detectarea
anodică a hidrogenului per oxid prin oxidare la un electrod de platină sau de
carbon, dar, din cauza potențialului ridicat al electrodului necesar, a fost
afectată de interferența altor compuși electroactivi din probă.
Încercările de a reduce interferențele și de a minimiza efectul variațiilor
tensiunii de oxigen au dus la dezvoltarea unor biosenzori cu intervale liniare
îmbunătățite care funcționează la potențiale de electrod mai mici. Aceștia
încorporează acceptori artificiali de electroni, numiți mediatori, pentru a
transfera electroni de la flavoenzima (de exemplu, glucoza-oxidază) la
electrod și, astfel, nu depind de oxigen. Ferrocenul (bis(v-
ciclopentadienil)fier) și derivații săi sunt exemple de mediatori redox pentru
flavoenzime. Reacția devine acum
glucoză + 2Fe+ = acid gluconic + 2Fe + 2H+.
(fericiniu) (ferocen)
Ferocenul este detectat la anod, care, de asemenea, regenerează ionul de

fericiniu pentru utilizare ulterioară.
Construcția biosenzorilor amperometrici pe bază de enzime implică, de
obicei, acoperirea suprafeței electrodului atât cu enzimele, cât și cu mediul
tor. Metoda adoptată și concentrațiile utilizate sunt factori importanți pentru
performanța dispozitivului. Pentru o utilizare îndelungată, imobilizarea
covalentă este cea mai satisfăcătoare metodă.
Biosenzori potențiometrici
Acestea măsoară diferența de potențial dintre electrodul de transducție și un
electrod de referință în condiții de curent zero. În mod obișnuit, se utilizează
trei tipuri de detectori poten tiometrici: electrozi selectivi de ioni (ISE),
electrozi de detectare a gazelor și tranzistori cu efect de câmp (FET).
Electrozii de detectare a gazelor sunt electrozi ISE modificați și
constau fie dintr-o membrană hidrofobă permeabilă la gaze, fie dintr-un spațiu
de aer între soluția de probă și un electrod de pH. Numai gazele care pot
pătrunde prin membrană și produc o modificare a pH-ului, de exemplu
dioxidul de carbon, amoniacul, vor fi detectate de electrod. Electrozii de
detectare a gazelor au fost utilizați în dispozitive care includ microorganisme
captive ca și componentă biologică, care metabolizează analitul de interes și
produc un gaz detectabil.
Tranzistoarele cu efect de câmp sunt traductoare potențiometrice
miniaturale, în stare solidă (figura 4.22), care pot fi ușor de produs în masă.
Acest lucru îi face ideali pentru a fi utilizați ca componente în biosenzori
ieftini și de unică folosință, fiind în curs de dezvoltare diverse tipuri. Funcția
acestor dispozitive semiconductoare se bazează pe faptul că, atunci când un
ion este absorbit la suprafața izolatorului de poartă (oxid), o sarcină
corespunzătoare se va adăuga la semiconductorul
suprafața și curentul care circulă între electrozii sursă și drenă se va modifica.

Schimbarea de tensiune rezultată este o măsură a speciilor ionice absorbite.
Variația naturii electrodului de poartă are ca rezultat diferite tipuri de
FET. De exemplu, în FET cu semiconductor de oxid metalic (MOS FET), ca
electrod de poartă se utilizează paladiu/oxid de paladiu. Acesta descompune
catalitic gaze cum ar fi hidrogenul sulfurat sau amoniacul cu producerea de
ioni de hidrogen, care trec în stratul semiconductor. Pe paladiu poate fi
acoperită o enzimă, de exemplu ureaza, care catalizează producerea
amoniacului din uree, oferind astfel un dispozitiv pentru măsurarea acestui
substrat.
În cazul FET-urilor selective de ioni (ISFET), o membrană selectivă de
ioni înlocuiește electrodul de poartă. Atunci când un gel încărcat cu enzime
este combinat cu membrana, dispozitivul poate fi utilizat pentru a măsura
substraturile care generează enzimatic specii încărcate.
Electrod de poartă
siliciu de tip p
sursă drenaj de
Izolator de
de tip tip n
poartă
n (Si02)
Figura 4.22 Diagrama schematică a unui tranzistor cu efect de câmp. Sistemul

siliciu-dioxid de siliciu prezintă caracteristici semiconductoare bune pentru utilizarea
în FET-uri. Concentrația de purtători de sarcină liberi și, prin urmare, conductivitatea
siliciului poate fi crescută prin dopaj cu impurități, cum ar fi borul. Astfel se obține
siliciu de tip p, "p" descriind prezența unui exces de sarcini mobile pozitive. De
asemenea, siliciul poate fi dopat cu alte impurități pentru a forma siliciu de tip n, cu un
exces de sarcini mobile negative.
Secțiunile 4.2-5
1. Care dintre următoarele elemente pot fi utilizate atât pentru
analiza calitativă, cât și pentru cea cantitativă?
(a) Conductimetrie.
(b) Coulometrie.
(c) Amperometrie.
(d) Polarografie.
2. Care este tehnica prin care se generează un ion reactiv la un

electrod în scopuri analitice?
(a) Conductimetrie.
(b) Coulometrie.
(c) Amperometrie.
(d) Polarografie.
3. Enzimele sunt nepotrivite pentru a fi utilizate în
sistemele de biosenzori PENTRU CĂ
biosenzorii necesită atât o componentă care să lege și să transforme
analitul într-un produs, cât și un traductor care să detecteze produsul.
4. Creșterea conductivității unei soluții este direct proporțională cu o
creștere a concentrației ionice.
PENTRU CĂ
conductivitatea unei soluții este suma conductivității ionilor prezenți.
Koryta, J. (1993) Ioni, electrozi și membrane, ediția a 2-a, Wiley-Liss Inc., SUA Koryta,
J., Dvorak, J. și Kavan, L. (1996) Principii de electrochimie, John Wiley,
MAREA BRITANIE.
Eggins, B.R. (1996) Biosensors, John Wiley, UK.
5 Radioizotopi
• Natura radioactivității
• Detectarea și măsurarea radioactivității
• Utilizări biochimice ale izotopilor
Atomii care au același număr atomic și, prin urmare, aparțin aceluiași
element, dar care au mase diferite sunt cunoscuți ca izotopi. Radioizotopii
sau, mai corect, radionuclizii emit spontan și continuu tipuri de radiații
caracteristice. Aceștia sunt deosebit de utili în biochimia analitică, natura
unică a radiației oferind baza pentru multe metode de laborator specifice și
sensibile (tabelul 5.1).
Tabelul 5.1 Date fizice ale unor izotopi utilizați frecvent
Element Simbol Timp de Emisiune beta Emisiune gamma

înjumătățir
e
Calciu 45Ca 165 d +
Carbon 14c 5760 a +
Clor 36Cl 3 X 105 a +
Cobalt 60
Co 5.26 a + +
Hidrogen 3H 12.2 a +
Iodul 1251 60dCaptura de electroni +
Iodul 1311 8.04 d + +
Fier 59Fe 45 d + +
Magneziu 2sMg 21.4 h + +
Azot 13N 600 s Positron +
Fosfor 32p 14.3 d +
Potasiu 4oK 109a Captarea electronilor +
Potasiu 42K 12.4 h + +
Sodiu 22Na 2.6 a Positron +
Sodiu 24Na 15 h + +
Sulf 35s 87.2 d +
Nucleul atomic este alcătuit din protoni și neutroni. Numărul de protoni

determină numărul atomic și, prin urmare, identitatea unui element și este egal
cu numărul de electroni orbitali, o caracteristică necesară pentru a asigura
neutralitatea electrică a atomului. Masa atomică a nucleului este constituită de
neutronii suplimentari care sunt prezenți. Prin urmare:
numărul atomic = numărul de protoni
masa atomică = suma numărului de protoni și neutroni
Aceste informații sunt prezentate în mod normal sub forma unui
superscript (masă atomică) și a unui subscript (număr atomic) la simbolul
elementului. Prin urmare,1 ic repre
reprezintă izotopul carbonului (număr atomic 6) cu masa atomică 14. În
practică, indicele este adesea omis, deoarece numărul atomic este unic pentru
elementul care este reprezentat de litera corespunzătoare (de exemplu, C
pentru carbon). Pentru simplificare în forma vorbită și adesea în forma scrisă,
izotopii sunt adesea denumiți carbon-14, fosfor-32 etc.
Stabilitatea nucleului atomic depinde de un echilibru critic între forțele
de repulsie și atracție care implică protonii și neutronii. În cazul elementelor
mai ușoare, pentru ca nucleul să fie stabil, este necesar un raport
neutroni/protoni (N : P) de aproximativ 1 : 1, dar, odată cu creșterea masei
atomice, raportul N : P pentru un nucleu stabil crește până la o valoare de
aproximativ 1,5 : 1. Un nucleu al cărui raport N : P diferă semnificativ de
aceste valori va suferi o reacție nucleară pentru a restabili raportul, iar
elementul este considerat radioactiv. Cu toate acestea, există o mărime
maximă peste care orice nucleu este instabil, iar majoritatea elementelor cu
număr atomic mai mare de 82 sunt radioactive.
5.1.1 Tipuri de radioactivitate

În cazul în care un nucleu este prea greu și numărul său atomic depășește 82,
acesta poate reveni la un aranjament mai stabil prin eliberarea atât de neutroni,
cât și de protoni. Acest lucru se realizează prin emiterea unei particule alfa,
care conține doi protoni și
doi neutroni și este un nucleu de u e
h , e2 +.
liH
Particulele alfa sunt particule relativ mari și sunt emise cu un număr
limitat de niveluri de energie. Ele poartă o sarcină pozitivă dublă și, ca
urmare, atrag electronii din atomii materialului pe care îl traversează,
provocând efecte de ionizare. Acestea au o rază de acțiune extrem de scurtă,
chiar și în aer, și, prin urmare, prezintă un pericol foarte mic ca sursă externă
de radiații, dar efectele lor în interiorul celulelor sau țesuturilor vii pot fi
grave.
Un nucleu care are un exces de neutroni va suferi o tranziție neutron-
proton, un proces care poate restabili raportul N : P, dar care necesită
pierderea unui electron pentru a transforma neutronul într-un proton încărcat
pozitiv și, ca urmare, numărul atomic crește cu unu. Particula emisă este un
electron de mare viteză cunoscut sub numele de negatron (Ir) și se spune că
atomul emite radiații beta, de exemplu
198 Radioizotopi
Dimpotrivă, nucleele care conțin un exces de protoni suferă o tranziție

de la protoni la neutroni, cu emiterea unei particule beta încărcate pozitiv,
cunoscută sub numele de pozitron (/J') și cu reducerea numărului atomic cu
unu. Un pozitron are doar o existență foarte scurtă, combinându-se imediat cu
un electron al unui atom din apropiere. Cele două particule se dezintegrează în
acest proces cu emiterea a două raze gamma, de ex.
1Ac - '!B + 13+
Un mecanism alternativ la emisia de pozitroni, pentru conversia unui
proton în neutron, implică un proces cunoscut sub numele de captare de
electroni (EC), în care nucleul captează un electron orbital dintr-un înveliș
interior pentru a restabili raportul N : P. Ulterior, un electron de pe un alt
orbital cade în golul rămas în învelișul interior, iar energia eliberată în acest
proces este emisă sub formă de raze X, numărul atomic fiind din nou redus cu
unu, de exemplu
1
11+ e- -- iTe + radiație
Emisia beta de la un atom prezintă o gamă de niveluri de energie și, deși
nivelul maxim este caracteristic izotopului, doar o mică parte din emisii poate
fi de această energie. Ca urmare, particulele beta prezintă o gamă maximă
într-un anumit material absorbant, multe emisii penetrând mult mai puțin.
Distanțele de penetrare sunt de aproximativ zece ori mai mari decât în cazul
particulelor alfa, fiind frecvente valorile de 5-10 mm în aluminiu. Deoarece
sunt ușoare, particulele beta sunt ușor de deviat de alți atomi și sunt mai puțin
eficiente ca agenți ionizanți decât particulele alfa.
Deși un nucleu poate avea un raport N : P în intervalul stabil, este
posibil ca acesta să se afle într-o stare energetică instabilă și să emită protoni
sub formă de radiații electromagnetice cu lungime de undă extrem de scurtă,
cunoscute sub numele de raze gamma. Aceștia nu au nici masă, nici sarcină
și, prin urmare, nu pot provoca efecte directe de ionizare, dar energia asociată
acestora este absorbită de un atom, ceea ce determină ejectarea unui electron,
care, la rândul său, produce efecte secundare de ionizare.
Atomii care emit radiații gamma nu suferă nicio modificare nici a
masei, nici a numărului atomic, deși foarte puține elemente emit numai
radiații gamma. Sodiul-24 (1 Na), de exemplu, emite radiații beta (emisie de
negatroni) și este transformat în magneziu-24 Cf1Mg). Cu toate acestea, el
emite, de asemenea, radiații gamma în acest proces.
Pentru a manipula radioizotopii în condiții de siguranță, este necesar,
printre altele, să se definească destul de atent puterea de penetrare a radiației
emise de orice izotop. Particulele alfa, care au doar un număr relativ limitat
de niveluri de energie, sunt absorbite prin contactul cu alți atomi. Puterea de
absorbție a unui material este menționată în termeni de grosime echivalentă a
acestuia. Grosimea necesară poate fi calculată prin împărțirea grosimii
echivalente la densitatea materialului.
Datorită gamei sale largi de energii, radiația beta prezintă o relație
aproximativ liniară între grosimea materialului necesar pentru a absorbi
radiația și logaritmul activității radiației. Procentul de particule beta care
traversează o anumită grosime a materialului absorbant are o relație
sigmoidală cu logaritmul energiei maxime a radiației.
emisie. Aceste informații permit selectarea unei anumite grosimi de material

absorbant care va opri în totalitate radiația beta de la o sursă și va permite
totuși pătrunderea unei proporții relativ constante de radiație de la o altă sursă
cu o energie maximă de emisie mai mare.
Absorbția radiațiilor gamma este mai dificil de evaluat, iar cel mai
convenabil mijloc de exprimare a puterii de absorbție a unui anumit material
este de a cita semiprețiozitatea.
5.1.2 Decadență
Emisia de radiații de către un atom are ca rezultat o schimbare în natura
atomului, care se spune că s-a dezintegrat. Viteza cu care o cantitate de izotop
se dezintegrează este proporțională cu numărul de atomi instabili prezenți, iar
un grafic de
Activitate J OO
(%) Logaritmul lui 2
activitate(%)
0-------- o - -- --
ime Timp
(a) (b)
Figura 5.1 Dezintegrarea radioactivă. Viteza de dezintegrare radioactivă este

proporțională cu numărul de atomi instabili prezenți și, deși teoretic ar trebui să
rămână întotdeauna o activitate (a), în practică, activitatea scade în cele din urmă la
zero. O reprezentare a logaritmului activității în funcție de timp (b) rezultă o linie
dreaptă din care se poate determina timpul de înjumătățire.
în funcție de timp rezultă o curbă exponențială tipică. Din acest motiv, durata
de viață reală a unui eșantion radioactiv nu poate fi măsurată și o expresie mai
medie a ratei de dezintegrare este oferită de timpul de înjumătățire t112 (figura
5.1). Timpul de înjumătățire poate fi determinat cu ajutorul ecuației care
descrie rata de dezintegrare radioactivă:
log Nr = -At
e Nu
unde Nr activitatea la momentul t,
N0 activitatea la timpul zero,
X. constanta de dezintegrare radioactivă,
t timp.
În forma sa liniară, ecuația este:
loge N1 = loge N0 -At
iar conversia în logaritmi naturali devine: logw N1 =
log10 N0-0 .4343At
200 Radioizotopi
Aceasta este ecuația unei drepte cu panta de -0,4343>...

Dacă N1 este egal cu jumătate din N0 , atunci tw va fi egal cu timpul de înjumătățire
(t½) și ecuația devine:
log10 1 = log10 2 - 0,4343>..t½
t 0.3010 0.6 9 3 1
½- 0.4343>.-. >..
O reprezentare grafică a logaritmului activității probei (log10 N1) în funcție de
timp (t) este liniară, iar timpul de înjumătățire poate fi determinat pe baza
graficului fie prin măsurarea intervalului de timp dintre două citiri ale
activității care variază cu un factor de doi, fie prin utilizarea valorii
gradientului liniei și înlocuirea în ecuație:
. 0.3010
Jumătate de viață (t½)
= .
gradient
5.1.3 Unități de radioactivitate

Unitatea curie (Ci) se bazează pe activitatea a 1 g de radiu-226 pur, care
suferă 3,7 X 1010 transformări pe secundă. Prin urmare, este definită ca fiind
cantitatea de izotop radioactiv care produce 3,7 X 1010 dezintegrări pe
secundă. Unitatea SI de activitate este becquerelul (Bq), care este egal cu o
transformare nucleară pe secundă. Prin urmare:
1 Ci= 3,7 X 1010 Bq
Activitatea specifică a unui izotop indică activitatea pe unitate de masă sau de
volum și este exprimată în becquereli pe gram (Bq g-1 ) sau milicuries pe gram
(mCi g-1 ). O probă în care toți atomii unui anumit element sunt radioactivi se
spune că este lipsită de purtători și este foarte dificil de realizat în practică.
5.1.4 Siguranță
Întotdeauna trebuie să se acorde o mare atenție la manipularea radioizotopilor.
Nu numai emițătorii puternici sunt periculoși, ci și emițătorii slabi cu perioade
lungi de înjumătățire, de exemplu tritiu, carbon-14, care pot fi încorporați în
organism și care, pe parcursul unei perioade de timp, pot constitui un pericol
grav.
Există numeroase reglementări privind manipularea și eliminarea
radioizotopilor, iar acestea trebuie să fie pe deplin înțelese și respectate atunci
când se înființează o instalație de radioizotopi. Pericolele trebuie evaluate în
totalitate, iar laboratorul trebuie să fie echipat și aprobat pentru aplicațiile
prevăzute. Toate manipulările trebuie să fie evaluate în funcție de pericolele
specifice, iar procedurile standard de operare (PSO) trebuie să fie puse în
aplicare în totalitate.
Cu toate acestea, există anumite principii generale de bună practică care
trebuie avute în vedere în mod constant atunci când se lucrează cu
radioizotopi.
1. Toate suprafețele de lucru și podelele trebuie acoperite cu un material
aprobat și trebuie să fie monitorizate în mod regulat pentru detectarea
contaminării.
2. Trebuie să se poarte îmbrăcăminte de protecție adecvată, inclusiv mănuși de
unică folosință.
3. Trebuie să fie ușor accesibile recipientele cu lichid de decontaminare în

care trebuie să fie scufundată toată sticlăria contaminată etc. după utilizare.
4. Izotopii trebuie manipulați într-un mod adecvat, folosind forceps sau
dispozitive de manipulare, dacă este necesar. Trebuie să se utilizeze o
protecție adecvată și să se poarte în permanență ecusoane de film.
5. Trebuie să se țină o evidență a cantităților și a naturii tuturor izotopilor
deținuți în laborator, iar izotopii utilizați trebuie eliminați în modul aprobat.
6. După terminarea lucrului, procedurile aprobate de spălare și decontaminare
atât a personalului de laborator, cât și a echipamentului trebuie să fie
finalizate înainte de a părăsi laboratorul.
Secțiunea 5.1
1. Care dintre următorii izotopi emit radiații gamma?
(a) 14c_
(b) 3H.
(c) 1311_
(d) 32p_
2. Care este timpul de înjumătățire al unui izotop dacă activitatea probei
scade de la 200 dezintegrare mi-n l la 150 dezintegrare mi-n I în 50
de minute?
(a) 200 de minute.
(b) 120 de minute.
(c) 100 de minute.
(d) 50 de minute.
3. Elementul reprezentat prin1 C este un izotop stabil al
carbonului PENTRU CĂ
în elementul1 C, raportul neutroni/protoni este de 1 : 1.
4. Emisia alfa este un agent ionizant foarte eficient
pentru că
particulele alfa sunt formate din electroni de mare viteză.
Radiațiile pot fi detectate în mai multe moduri, toate depinzând de efectele directe
sau indirecte de ionizare. Cele trei metode cel mai frecvent utilizate sunt ionizarea
gazelor, excitarea lichidelor sau a solidelor și inducerea de modificări chimice.
Radioactivitatea se măsoară fie ca număr de emisii individuale într-o unitate de
timp (măsurători diferențiale), fie ca efect cumulativ total al tuturor emisiilor într-
un anumit interval de timp (măsurători integrale). În general, măsurătorile
diferențiale sunt utilizate pentru lucrări analitice cantitative, iar metodele integrale
pentru dozimetrie și autoradiografie. Indiferent de instrument sau de metoda de
înregistrare, orice măsurare critică a radioactivității impune efectuarea unei
numărători de fond (blank) și corectarea valorii de test pentru acele emisii care nu
sunt datorate eșantionului. În plus, pentru a obține rezultate consecvente, trebuie
calculată media numărătorilor repetate și, dacă este cazul, trebuie efectuată o
evaluare statistică, deoarece baza fundamentală a dezintegrării radioactive este un
proces aleatoriu.
202 Radioizotopi
5.2.1 Contoare Gelger

Efectul ionizant al radiației asupra unui gaz poate fi detectat dacă se aplică o
diferență de potențial între doi electrozi poziționați în gaz. Electronii dislocați
ca urmare a ionizării vor fi atrași de anod și un curent va trece apoi între
electrozi. Acest tip de detector se bazează pe tubul Geiger-Muller, care constă
dintr-un cilindru metalic gol (catodul) în interiorul unui înveliș de sticlă și un
fir (anodul) care trece de-a lungul axei centrale a catodului (figura 5.2).
Întregul tub este umplut cu gazul de numărare, adesea un amestec de neon și
argon, la o presiune relativ scăzută. Radiație
Anod
Radiații
Catod
Figura 5.2 Tubul Geiger-Muller. Tubul este umplut cu un amestec de gaze

ionizabile, cum ar fi neon și argon, iar între electrozi se aplică o tensiune. Ionizarea
gazului de către radiația incidentă determină trecerea unui curent între electrozi.
care intră în tub provoacă ionizarea gazului detector și, ca urmare, un impuls
de curent trece între electrozi, împreună cu emisia de radiații ultraviolete.
O problemă cu un tub Geiger-Muller este faptul că, odată ce a fost
aprins, radiația ultravioletă emisă provoacă o ionizare suplimentară a gazelor
(autoexcitație). Este necesar să se stingă această autoexcitație și acest lucru se
realizează de obicei prin încorporarea unui halogen, de exemplu brom, în
amestecul de gaze în timpul fabricării. Moleculele de brom absorb această
energie suplimentară și sunt scindate în atomii lor individuali. Acești atomi se
recombină ulterior atunci când contorul nu este utilizat și astfel se regenerează
sistemul.
Fereastra de capăt a tubului trebuie să fie suficient de subțire pentru a
permite radiațiilor mai slabe să pătrundă în tub (aluminiu, 6-8 mg cm-2; mica,
2 mg cm-2), dar chiar și așa, particulele alfa și emisiile beta foarte slabe sunt fie
absorbite complet, fie parțial. Emisiile provenite de la izotopii biologic
importanți ai tritiului și carbonului 14 se încadrează în această categorie și ar
trebui să se utilizeze detectoare alternative pentru acești izotopi.
Razele gamma, fiind puternice, pătrund foarte ușor în tub, dar provoacă
o ionizare directă redusă. Cu toate acestea, ele produc o emisie de
fotoelectroni de pe pereții de sticlă sau metalici ai tubului și de pe electrozii
interni. Acești fotoelectroni produc apoi ionizarea gazului cu impulsul de
curent rezultat. Dacă tensiunea aplicată unui tub Geiger-Muller este crescută
de la zero, nu se detectează niciun răspuns la radiație, în ciuda prezenței unui
izotop radioactiv
până când se atinge o tensiune minimă sau de pornire. În acest moment se

generează un curent care crește rapid până la un platou și, în cele din urmă, la
tensiuni foarte ridicate (potențialul de rupere), tubul intră în descărcare
continuă. Contorul trebuie să funcționeze la o tensiune selectată din regiunea
de platou și va fi grav deteriorat dacă se aplică tensiuni peste potențialul de
rupere pentru o perioadă semnificativă de timp. Un detector pentru probe
lichide (figura 5.3) este o variantă comună a tubului Geiger-Muller și este
proiectat fie pentru a fi scufundat într-un lichid, fie pentru a conține un lichid.
l:t::tltltt,...,.-:¼- Sârmă cilindrică

catod de tifon
------.....,- Cutawaytoshow
anod de sârmă
Figura 5.3 A
Tub Geiger-Muller pentru
măsurarea activității
probelor lichide. 1u
Principalul dezavantaj al contoarelor Geiger-Muller este faptul că, după

ce a avut loc o ionizare și electronii au fost descărcați (un proces foarte rapid),
ionii pozitivi rezultați sunt descărcați lent și, prin urmare, împiedică alți
electroni să ajungă la anod. Perioada de timp în care detectorul este insensibil
la o nouă ionizare este cunoscută sub numele de timp mort și se situează
adesea în jurul valorii de 500 µ,s. Factorii de corecție sunt folosiți pentru a
corecta toate citirile în funcție de numărul pierdut în acest timp.
5.2.2 Contoare de scintilații

Unele substanțe, cunoscute sub numele de fluori sau scintilanți, răspund la
efectele ionizante ale particulelor alfa și beta prin emiterea de sclipiri de
lumină (sau sclipiri). Deși nu răspund în mod direct la razele gamma, acestea
răspund la efectele secundare de ionizare pe care le produc razele gamma și,
prin urmare, oferă un sistem valoros de detectare a tuturor emisiilor.
Este disponibilă o gamă de scintilanți, mulți dintre ei fiind concepuți
pentru o eficiență maximă cu izotopi specifici. Cristalele de iodură de sodiu
care conțin o cantitate mică de iodură taloasă sunt detectori foarte eficienți ai
radiațiilor gamma și
204 Radioizotopi
instrumentele bazate pe acest model sunt adesea numite contoare gamma.

Cristalul este poziționat deasupra unui fotomultiplicator care poate detecta
sclipirile de lumină și ambele sunt acoperite cu un material rezistent la
lumină, suficient de subțire pentru a permite radiațiilor gamma să treacă în
cristal. (Figura 5.4). Atunci când un eșantion este plasat pe cristal, impulsurile
de curent generate de fotomultiplicator sunt numărate electronic.
Radiațiile beta slabe și particulele alfa adesea nu pot pătrunde în
materialul de acoperire, dar utilizarea unui scintilant care, împreună cu proba,
se dizolvă într-un solvent adecvat, permite utilizarea unei tehnici similare.
Contoarele cu scintilații lichide constau, de obicei, din doi fotomultiplicatori
ecranați la lumină.
Ecranare
ușoară
Figura 5.4 Un contor gamma. Scintilațiile dintr-un cristal de fluor cauzate de

radiațiile gamma sunt detectate de un fotomultiplicator.
tuburi cu proba și un amestec de scintilant conținut într-un vas de sticlă plasat

între ele. Numai acele impulsuri care apar simultan din ambele tuburi
fotomultiplicatoare se datorează scintilațiilor, iar acestea sunt numărate
electronic, obținându-se un sistem de detecție care poate face distincția între
semnalele autentice și zgomotul aleatoriu de la detectoare. Această tehnică se
numește numărare prin coincidență. Este disponibilă o gamă de scintilanți
adecvați pentru astfel de lucrări (figura 5.5), fiecare prezentând caracteristici
particulare de emisie de lumină. Aceștia sunt dizolvați într-un solvent
adecvat, care trebuie să fie miscibil cu proba; toluenul sau xilena sunt utilizate
frecvent pentru probele organice și dioxanul pentru probele apoase.
Numărul de ionizări sau scintilații detectate de ambele tipuri de
detectoare se măsoară electronic și se prezintă fie ca număr total de
numărători (un scaler), fie ca număr de impulsuri pe minut (un contor de
numărători).
1-fenilJ-4-feniloxazoJe
(PPO)
l,4-Di-2,5 (feniloxazoil) benzen

(POPOP)
Figura 5.5 Scintilanți. Este disponibilă o gamă de scintilanți organici cu diferite

caracteristici de solubilitate și emisie. "Cocktailurile" sau amestecurile de scintilanți conțin
un scintilant primar, cum ar fi PPO, și adesea un scintilant secundar care absoarbe radiația
produsă de scintilantul primar și o reemite la o lungime de undă mai mare, de exemplu
POPOP.
Figura 5.6 Autorad.iografierea unei frunze' folosind calciwn-45. Frunza a fost ținută
timp de câteva ore într-o soluție care conține o cantitate mică de sare de fosfat de calciu-45.
Frunza a fost apoi lipită cu bandă adezivă pe partea exterioară a unui plic care conținea o
peliculă fotografică timp de o săptămână, înainte de a dezvolta pelicula în mod normal.
Aceasta este o copie a filmului și, prin urmare, efectul de ractizare se vede ca un alb pe
negru.
206 Radioizotopi
În plus, unele dispozitive de numărare (discriminatoare de înălțime a

impulsurilor) sunt concepute pentru a înregistra semnale la tensiuni specifice
și pot măsura un izotop în prezența altui izotop.
5.2.3 Autoradlografie
Radiația ionizantă are același efect ca și lumina asupra filmului fotografic, iar
gradul de înnegrire a filmului este legat de cantitatea de radiație.
Autoradiografia este deosebit de utilă pentru demonstrarea localizării
izotopilor radioactivi în țesuturi sau în cromatograme (figura 5.6).
Proba este plasată pe o peliculă fotografică protejată de lumină și lăsată
în contact suficient de mult timp pentru o expunere adecvată. Timpul de
expunere depinde de intensitatea radiației și, de obicei, poate fi determinat
doar prin încercări și erori. Cu toate acestea, este posibil să se preia un timp de
expunere aproximativ din faptul că este adesea necesară o emisie totală de 107
particule beta pe centimetru pătrat.
Autoradiografia este, de asemenea, o modalitate convenabilă de
monitorizare a cantității de radiații la care a fost expus un lucrător
(dozimetrie). Dacă se poartă în permanență o mică insignă care conține un
film fotografic, iar filmul fotografic este developat după o anumită perioadă
de timp, se poate face o estimare a radiațiilor primite, pe baza gradului de
întunecare a filmului. Pentru aceste tipuri de aplicații nu sunt necesare
instrumente sofisticate, în afară de instalații fotografice.
5.3.1 Urmăritoare
Izotopii radioactivi oferă o modalitate foarte convenabilă de monitorizare a
soartei sau a metabolismului compușilor care conțin izotopi. Atunci când este
utilizat în acest mod, izotopul este descris ca fiind un trasor, iar compușii în
care a fost introdus atomul radioactiv sunt etichetați sau marcați. Moleculele
marcate nu trebuie să reprezinte decât o proporție foarte mică din cantitatea
totală de substanță radioactivă neetichetată, deoarece acționează în același
mod ca și substanța ne radioactivă, dar pot fi detectate mult mai ușor.
Aplicațiile variate ale markerilor în biochimie variază de la studii ale
metabolismului la animale întregi sau la organe izolate până la tehnici
analitice cantitative sensibile, cum ar fi radioimunoanalizele. Fosforul-32 este
utilizat în lucrările cu acizi nucleici, în special în tehnicile de secvențiere și
hibridizare a ADN-ului. În aceste cazuri, izotopul este utilizat ca mijloc de
vizualizare a separărilor de ADN prin tehnici autoradiografice.
Deși, în general, se presupune că radioizotopii sunt metabolizați exact în
același mod ca și substanțele neradioactive, ocazional se observă unele
diferențe de reactivitate, datorate în principal diferențelor de greutate atomică
a celor doi izotopi. Efectul este cel mai evident în cazul elementelor cu cel
mai mic număr atomic, unde diferența de masă dintre izotopi este cea mai
Utilizări biochimice ale izotopilor 207
mai mare. De exemplu, diferența dintre hidrogen (masa I) și tritiu (masa 3)

este mai semnificativă decât diferența dintre iod-127 și iod- I25. Acest efect
izotopic este extrem de mic în majoritatea cazurilor și poate fi ignorat, cu
excepția cazului în care sunt implicate studii critice ale constantelor de
echilibru și ale vitezelor de reacție.
În mod ideal, moleculele ar trebui să fie marcate prin introducerea unui
izotop radioactiv în locul unui atom normal, de exemplu, carbonul 14 în locul
carbonului 12 într-un carbohidrat. Această metodă de marcare implică sinteza
moleculei fie in vivo, fie in vitro, iar utilizarea enzimelor permite adesea
introducerea izotopului într-o anumită poziție în moleculă. Poziția atomului
marcat trebuie indicată ori de câte ori este posibil, de exemplu în glucoză-l-14
C.
Alternativ, poate fi necesar să se eticheteze o moleculă prin
introducerea unui atom suplimentar și, în acest caz, trebuie să se presupună că
prezența acestuia nu modifică reactivitatea sau metabolismul moleculei.
Proteinele, de exemplu, sunt adesea marcate cu un izotop de iod. Este foarte
important ca orice etichete utilizate să fie bine fixate pe moleculă, în caz
contrar se vor obține rezultate invalide.
Alegerea unui izotop pentru studiile de trasare necesită o apreciere
nu numai a proprietăților radiochimice ale elementului, ci și a efectelor pe
care acestea le pot avea atât din punct de vedere biochimic, cât și analitic.
Izotopul ar trebui să aibă un timp de înjumătățire suficient de lung pentru
ca analiza să fie efectuată fără o scădere semnificativă a activității sale.
Ocazional, acest lucru poate reprezenta o problemă, deoarece unele
elemente au doar izotopi radioactivi cu timpi de înjumătățire foarte scurți,
de exemplu, fluorul-IS are un timp de înjumătățire de 1 l l l min. În
schimb, izotopii cu timpi de înjumătățire foarte lungi nu ar trebui să fie
utilizați pentru studii in vivo, deoarece acumularea în țesuturile
receptorului este inacceptabilă.
Elementele importante din punct de vedere biochimic, precum
hidrogenul, carbonul și calciu, sunt emițători beta slabi și sunt greu de detectat
cu ajutorul tuburilor Geiger-Muller. Contoarele cu scintilații sunt necesare
pentru aceste emisii slabe și sunt preferabile pentru emițătorii gamma, în timp
ce detectoarele Geiger-Muller sunt potrivite pentru emițătorii beta mai
puternici. Cu toate acestea, pentru radiografie, emițătorii alfa și beta slabi
oferă cea mai bună rezoluție, în timp ce emițătorii gamma sunt de obicei
nepotriviți, deoarece provoacă o încețoșare generală a filmului.
5.3.2 Analiza prin diluție izotopică

Analiza prin diluție izotopică este metoda definitivă pentru analiza cantitativă
a multor compuși, dar, de obicei, este efectuată numai în laboratoare
specializate.
În cazul în care o cantitate cunoscută de izotop cu o activitate
specifică cunoscută este amestecată cu o cantitate necunoscută de
substanță neradioactivă, reducerea activității specifice poate fi utilizată
pentru a determina gradul de diluție a izotopului și, prin urmare, cantitatea
de izotop neradioactiv prezent. Izotopul și substanța de testat trebuie să fie
bine amestecate înainte de a purifica un eșantion reprezentativ din amestec
și de a determina activitatea sa specifică.
208 Radioizotopi
Calcul
Izotop: Cantitate M
Activitate
specifică
S Amestec: Cantitate (necunoscută) Mx
+M
Activitate specifică Sx
Activitatea specifică a radioizotopului original cu o activitate totală (A) este:
S=
M
Amestecul cu izotopul neradioactiv conține aceeași activitate totală, dar
cantitatea de substanță este crescută. Prin urmare, activitatea specifică se
reduce la:
Înlocuind în această a doua ecuație o expresie pentru cantitatea de activitate

(A) în eșantion avem:
S= SX M
X M. + M
Prin urmare:
5.3.3 Analiza de radioactivare

Analiza prin radioactivare este utilizată pentru analiza urmelor de elemente
adecvate. Este o tehnică care, în general, nu se aplică la material biologic, deși
a fost utilizată pentru măsurarea plumbului în păr și unghii.
Aceasta implică iradierea simultană a eșantionului și a unei mase
standard cunoscute a aceluiași element pentru a produce un izotop radioactiv
al elementului. Se determină apoi activitățile eșantionului și ale etalonului și,
deoarece activitățile lor specifice vor fi identice, este posibil să se calculeze
masa eșantionului necunoscut.
Analiza prin activare necesită utilizarea unei surse puternice de neutroni
ca activator și este adecvată numai pentru elementele care formează un izotop
al cărui timp de înjumătățire este mai lung decât izotopii altor elemente care
pot fi produse.
Secțiunile 5.2/3
1. Ce forme de radiații poate detecta un contor Geiger?
(a) Particule alfa.
(b) Radiații beta.
(c) Radiații gamma.
2. De ce efect al radiațiilor depinde autoradiografia?
(a) Ionizare.
(b) Excitare.
(c) Schimbare chimică.
(d) Niciuna dintre acestea.
3. Izotopii utilizați în studiile de trasare trebuie să aibă un timp de

înjumătățire scurt.
PENTRU CĂ
izotopii cu un timp de înjumătățire scurt sunt mai puțin periculoși
decât cei cu un timp de înjumătățire lung.
4. Autoradiografia este adecvată numai pentru detectarea radiațiilor
gamma
PENTRU CĂ
radiațiile beta nu pot penetra stratul de gelatină al unei plăci
fotografice.
Choppin, G.R. și Rydberg, J. (1983) Nuclear chemistry - its theory and applications,
Pergamon Press, Marea Britanie.
Ehmann, W.D. și Vance, D.E. (eds.) (1991) Radiochimie și metode și analize nucleare,
Blackwell Scientific Publications, Marea Britanie.
Knoll, G.F. (1989) Radiation detection and measurement, ediția a 2-a, John Wiley, UK.
Slater, R.J. (ed.) (1990) Radioizotopi în biologie - o abordare practică, lRL Press, UK.
6 Metode automatizate de
analiză
• Analizoare discrete
• Analiza fluxului
• Robotică
Cererea crescută de analize a dus la introducerea unor aparate care vor efectua
integral sau parțial o procedură analitică. Multe dintre manipulările din cadrul
metodelor de laborator sunt comune unei varietăți de teste diferite (de
exemplu, pipetarea) și se pretează cu ușurință la mecanizare.
Introducerea într-un laborator a unor instrumente care să îndeplinească
aceste sarcini va duce la reducerea timpului de analiză și va însemna că se
poate face față unui volum de muncă sporit fără a fi nevoie de personal
suplimentar. Acest lucru ar trebui să reducă costul total per test, chiar dacă
cheltuielile asociate cu achiziționarea și funcționarea instrumentelor pot fi
ridicate.
Pe lângă considerentele legate de costuri, faptul că instrumentele
automate sunt concepute pentru a oferi o precizie analitică bună și constantă
este un factor care a influențat în mare măsură acceptarea lor pe scară largă.
Cu toate acestea, este recunoscut faptul că fiabilitatea depinde de calitatea
proiectării și fabricării lor și, în consecință, de întreținerea lor eficientă și
regulată în laborator.
Prin definiție, un sistem automatizat ar trebui să efectueze un act
necesar la un punct prestabilit în cadrul procesului și ar trebui să aibă o acțiune
de autoreglare. Aceasta implică faptul că nu este necesară intervenția
analistului în timpul procedurii și că numai acele sisteme care încorporează un
microprocesor sau un calculator pentru a controla și monitoriza performanța lor
pot fi desemnate ca fiind automate. Este posibil ca unele sisteme să nu se
conformeze strict acestei definiții, dar reprezintă un mijloc valoros de mecha
nizare a activităților de laborator.
Primele așa-numite analizoare automate au fost dezvoltate pentru a
efectua analize înlocuind pipetarea manuală prin transferul mecanic al unor
volume fixe de probă și reactivi. Acestea au fost concepute pentru a imita
manipulările unei proceduri manuale convenționale și, uneori, aveau
capacitatea de a măsura cantitatea de produs de reacție, de obicei prin
spectrofotometrie. Sitele
Metode automatizate de analiză 211
precizia pipetajului era adesea slabă, iar instrumentele erau greoaie și predispuse
la defecțiuni. Contrapărțile lor moderne oferă un grad mult mai mare de precizie
și fiabilitate și sunt disponibile o gamă largă de modele, fiecare oferind niveluri
diferite de mecanizare. Cele mai simple sunt pipetele/diluitoarele automate, care
pot fi reglate pentru a măsura și expulza volume selectate de soluție cu ajutorul
unui sistem de seringi. Acestea îl degrevează pe analist de operațiile de pipetare,
dar necesită o prezență constantă. Instrumentele care sunt mai puternic mecanizate
și care vor pipeta probe și reactivi secvențial în rafturi de tuburi joacă un rol
important în pregătirea mecanizată a probelor. Acestea au fost precursoarele a
ceea ce se numește în prezent procesoare de probe. Este posibil ca un operator să
fie nevoit să deplaseze rafturile de tuburi în diferite poziții în cadrul
instrumentului, astfel încât fiecare dintre etapele unei anumite proceduri să poată
fi finalizată. În cazul în care o metodă necesită alte manipulări pe care analizorul
mecanizat nu le poate efectua, de exemplu, cen trifugarea, atunci este necesar ca
operatorul să transfere tuburile de reacție la instrumentul de laborator
corespunzător.
Pornind de la această abordare, a fost dezvoltată o serie de analizoare
automatizate, cunoscute sub numele de analizoare discrete, prin încorporarea
unui microprocesor pentru a controla funcționarea acestora. Designul și
capacitățile diferitelor analizoare variază, dar toate necesită doar volume mici
de probă și reactivi și, adesea, reactivii "gata de utilizare" sunt furnizați de
către producător. Multe dintre cele mai noi instrumente sunt concepute pentru
a utiliza benzi de reactivi uscați de unică folosință sau dispozitive de film, mai
degrabă decât reactivi lichizi. Analizoarele moderne prezintă niveluri ridicate
de sensibilitate și specificitate datorită dezvoltării unor metode analitice
fiabile care nu suferă decât efecte de interferență minime. O importanță
deosebită în această privință o are eliminarea etapei de centrifugare, care era
necesară anterior pentru a elimina proteinele care sunt adesea prezente în
probele biologice.
În anii 1950 a fost introdusă o abordare complet nouă a automatizării,
sub forma analizei fluxului continuu. Aceasta a avut o contribuție
semnificativă la progresul analizei automatizate, iar dezvoltările ulterioare au
luat forma analizei prin injecție de flux. Instrumentele inițiale aveau un singur
canal și erau capabile să măsoare doar un singur constituent în fiecare probă.
Ulterior, au fost dezvoltate instrumente cu mai multe canale care puteau
efectua în mod simulat mai multe măsurători diferite pe fiecare probă. Acestea
au fost utile în laboratoarele în care mai multe probe necesitau aceeași gamă
de teste.
Un microprocesor sau un calculator este acum încorporat în majoritatea
analizoarelor discrete și de debit și este o cerință absolută pentru instrumentele
multicanal. Acesta permite operatorului să seteze condițiile optime de analiză
pentru fiecare test în parte și să dea instrucțiuni cu privire la limitele
acceptabile ale rezultatelor pentru probe cu concentrații cunoscute. Cu
ajutorul acestor informații, calculatorul este capabil să se autoevalueze în
permanență performanța analizorului și calitatea rezultatelor obținute. Toate
calculele necesare vor fi efectuate înainte de a se imprima concentrația
fiecărei probe, deși, uneori, imprimanta va fi instruită să producă datele sub
formă de grafice sau histograme. Rezultatele instrumentelor cu un singur
canal sunt de obicei prezentate sub forma unei liste de numere de probe cu
concentrațiile corespunzătoare. Analizoarele multicanal necesită ca toate
datele pentru fiecare eșantion să fie colectate împreună înainte de a fi tipărite
și, în cazul lor, fiecare eșantion trebuie să aibă propria identificare, de
exemplu, un cod de bare, pe care computerul îl poate recunoaște.
212 Metode automatizate de analiză
O extensie firească a automatizării analitice este reprezentată de unele

mijloace de prelucrare a datelor tuturor rezultatelor generate. Aceasta ia de
obicei forma unui calculator central care acceptă informații de la diferite
analizoare pentru a le pre-senta într-un mod util. Identificarea unui eșantion și
testele efectuate sunt introduse cu ajutorul unei tastaturi, iar computerul
compilează toate datele referitoare la fiecare eșantion. Pe lângă colectarea de
informații, calculul și evaluarea statistică a rezultatelor, o facilitate importantă
a calculatorului constă în capacitatea sa de a stoca informații pentru a le
reaminti ulterior prin intermediul unei unități de afișare vizuală.
Odată cu introducerea roboticii, domeniul de aplicare al
automatizării laboratoarelor a fost extins. Aceste instrumente robotizate
sunt complet computerizate și pot fi programate pentru a efectua fie etape
unice, fie proceduri analitice întregi. Sistemele mai complexe cuprind o
serie de module care execută secvențial diferitele etape ale unei proceduri
analitice, de la pregătirea probei până la întocmirea raportului final. Deși
introducerea unui sistem robotizat într-un laborator poate necesita o
perioadă considerabilă de evaluare a performanțelor înainte ca acesta să
poată fi utilizat în mod obișnuit cu încredere, odată ce funcționează, acesta
va continua să funcționeze fără întrerupere, eliberând astfel personalul
pentru a îndeplini alte sarcini; de asemenea, poate fi utilizat și pe timpul
nopții. Alte avantaje constau în îmbunătățirea preciziei procedurilor
complexe, care necesită multă muncă, și în reducerea expunerii
lucrătorilor de laborator la probe și reactivi periculoși.
Există o gamă largă de instrumente mecanizate și automatizate
disponibile de la o varietate de producători, iar alegerea unuia dintre
acestea ar trebui să implice mai multe considerente. Trebuie evaluată
natura volumului de muncă preconizat, atât în ceea ce privește numărul de
probe, cât și varietatea de teste care vor fi efectuate. Acest lucru va indica
nivelul de mecanizare sau de automatizare necesar. Nu trebuie neglijate
nici echipamentele de laborator existente și nici efectele automatizării
asupra politicii actuale și viitoare de personal. Costul este un aspect
important și acesta include prețul instrumentului, costurile de funcționare
a acestuia în ceea ce privește reactivii și personalul și cerințele de
întreținere. Fiabilitatea instrumentului și speranța de viață a acestuia sunt,
de asemenea, importante, iar aceste date, împreună cu informații privind
calitatea rezultatelor care pot fi obținute, trebuie căutate înainte de a lua o
decizie. Este recomandabil să solicitați un instrument în regim de probă,
astfel încât performanța acestuia să poată fi evaluată la fața locului.
Instrumentele în care fiecare test este efectuat în propriul recipient sau lamă
sunt cunoscute sub numele de analizoare discrete, spre deosebire de
analizoarele de flux în care probele se succed prin același sistem de tuburi.
Toate analizoarele discrete au un design de bază comun care include un
sistem de pipetare, un detector fotometric și un microprocesor. O evoluție a
instrumentului de testare unică este analizorul rapid paralel, care analizează
mai multe probe simultan, dar pentru un singur constituent. Cu toate acestea,
trecerea de la un procedeu analitic la altul este rapidă și simplă.
Analizoarele multitest măsoară simultan mai mult de un constituent în

fiecare probă și sunt adesea concepute pentru a satisface nevoile unui anumit
tip de laborator, de exemplu, departamentele de chimie clinică. Instrumentele
oferă diferite combinații de teste (meniu), dar acestea sunt adesea stabilite de
către producător, lăsând puține posibilități de modificare în cadrul
laboratorului.
Instrumentele anterioare efectuau același meniu de teste pentru fiecare
probă, dar introducerea analizoarelor cu acces aleatoriu a făcut posibilă
selectarea individuală de către operator a unei combinații de teste pentru
fiecare probă din gama totală disponibilă.
Alte sisteme automatizate pot fi achiziționate pentru un scop specific și
se numesc instrumente dedicate, de exemplu, analizatorul de glucoză. Altele
au aplicații destul de restrânse, un exemplu fiind analizoarele de viteză de
reacție, care sunt special concepute pentru măsurători cinetice ale activității
enzimatice. Unele dintre instrumentele dezvoltate mai recent utilizează
pachete de testare individuale de unică folosință, pre-preparate, sau
dispozitive cu benzi care conțin toți reactivii pentru fiecare test în parte, în
formă uscată.
6.1.1 Analizoare centrifugale

La sfârșitul anilor 1960 a fost dezvoltat un nou concept de analiză automată, care
a dus la introducerea analizoarelor rapide centrifugale. Proiectul de dezvoltare a
fost sponsorizat în Statele Unite ale Americii de către Institutul de Științe
Medicale Generale și Comisia pentru Energie Atomică, iar prototipul a fost
denumit sistemul GeMSAEC. În prezent, sunt disponibile mai multe instrumente,
toate bazate pe ideea originală, în care loturile de probe sunt tratate în paralel și se
utilizează forța centrifugă pentru a transfera și amesteca soluțiile, reacțiile fiind
monitorizate în permanență prin fotometrie. Aceste instrumente au o flexibilitate
considerabilă și pot fi utilizate pentru o varietate de tipuri diferite de analize prin
simpla schimbare a reactivilor din dozatoare și modificarea programului de
centrifugare. În plus, acestea utilizează doar volume mici de reactivi, ceea ce nu
numai că reduce costurile de funcționare, dar permite și analiza unor volume
foarte mici de probe.
Gi
, r-,
\
H1---1
Figura 6.1
Reprezentare schematică a , // \,
unui disc de transfer tipic / \
["----1
pentru un analizor I I I ---"
centrifugal.
Secțiunea
transversală
prezentată în
f
i
g
u
r
a
6
.
2
214Metodeautomatizate de analiză
Analiza are loc într-un disc circular numit disc de transfer sau rotor
(figura 6.1), realizat dintr-un material inert, cum ar fi Teflon sau acrilic, ale
cărui proprietăți de suprafață permit o aderență minimă a lichidului. Acesta
conține seturi de cavități dispuse radial, fiecare set fiind compus din două sau
mai multe cavități interconectate, una pentru probă și celelalte pentru reactivi
(figura 6.2). Volumele mici măsurate de eșantion și reactiv, de exemplu 5-
200JLl, sunt pipetate automat în cavitățile corespunzătoare, astfel încât fiecare
set să conțină un eșantion diferit, dar același
Exemplu Reactiv
:s =r::: iil\\& '-J b\\\\\\\\\\"Sl
Figura 6.2
O secțiune transversală a
discului de transfer este
prezentată în figura 6.1.
reactivi. Un set este de obicei pregătit ca un blanc de reactivi. Puțurile sunt

proiectate astfel încât proba și reactivii să rămână în compartimentele lor
separate până la începerea centrifugării discului. În timpul accelerării, are loc
amestecul și se inițiază reacția chimică. După o perioadă de timp adecvată, se
fac măsurători în timp ce discul încă se rotește. Aceste măsurători pot fi de
absorbanță, nefelometrice sau turbidimetrice, în funcție de designul
instrumentului. În unele instrumente, cuvele optice, câte una pentru fiecare set
de godeuri, sunt încorporate în perimetrul discului de transfer, în timp ce în
alte sisteme lichidul este expulzat în cuve individuale în interiorul centrifugei.
Analiza se finalizează în câteva minute și, dacă discul de transfer nu este de
unică folosință, acesta este spălat și uscat automat, fiind gata de reîncărcare.
Un calculator este încorporat în instrument, permițând presetarea
temperaturii de analiză și a programului de centrifugare, adică a vitezelor și a
duratei de amestecare și a etapelor de reacție. De asemenea, calculatorul este
utilizat pentru a calcula concentrațiile probelor de testare prin compararea
citirilor fotometrice ale acestora cu cele ale standardelor tratate în mod
identic. Analizoarele centrifugale se aplică nu numai la analiza punctului
final, ci, datorită capacității lor de monitorizare continuă, sunt deosebit de
utile pentru testele cinetice. Măsurătorile activității enzimatice și
imunoanalizele enzimatice se pretează în special la aceste tipuri de analizoare.
6.1.2 Analizoare de chimie uscată

Progresele în tehnologia asociată cu producția de reactivi imobilizați în
straturi subțiri au dus la dezvoltarea unei game de sisteme analitice în care
testele sunt efectuate prin adăugarea unui eșantion lichid la reactivii în formă
uscată. Această metodă de analiză nu necesită prepararea reactivilor și poate fi
realizată în mod convenabil fără instalațiile obișnuite de laborator. O aplicație
majoră este analiza unei serii de componente ale serului sanguin în scopuri de
diagnostic clinic. Testele au fost concepute pentru a fi rapide și eficiente, iar
funcționarea instrumentelor este simplă. Toate metodele analitice
parametrii sunt stocați în instrumente și sunt activați prin introducerea benzii

de reactivi cu cod de bare sau a lamei cu cod de bare. Există o gamă largă de
sisteme de analiză bazate pe reacții coloristice cu detecție prin fotometrie de
reflectanță și care implică substanțe precum enzime și anticorpi, pe lângă
reactivii mai convenționali. Boehringer Reflotron (figura 6.3) este un exemplu
de sistem de benzi de reactivi uscați, în timp ce sistemul Vitros Chemistry
System utilizează benzi de reactivi de mici dimensiuni.
Sânge aplicat aici

Peliculă Plasă de
transparentă protecție
Strat de reactiv I Strat de separare a

plasmei
Baza din plasticStrat Cod magnetic

de transport
din fibră de
sticlă
Figura 6.3 Reprezentarea schematică a benzilor de reactivi uscate, cunoscute

sub numele de suporturi de reactivi, care sunt utilizate în sistemul Boehringer
Reflotron® pentru analiza chimică a probelor de sânge. Globulele roșii sunt îndepărtate
în stratul de separare, iar plasma care trece în stratul de transport din fibră de sticlă este
analizată. Codul magnetic poartă informații despre procedura analitică.
Strat de împrăștiere
Strat de reactiv
Strat de membrană semipermeabilă
Strat indicator
carcasă Strat de suport
Figura 6.4 Secțiune transversală a unei lamele de reactiv uscat pentru

utilizarea în sistemul Vitros Chemistry System, cunoscut anterior sub numele
de analizor Kodak Ektachem. Este disponibilă o gamă de lame, care variază în ceea
ce privește natura, numărul și compoziția straturilor, pentru o varietate de analiți
din serul sanguin. Proba (aproximativ 10 µJ) este aplicată pe stratul de răspândire și
reacțiile au loc pe măsură ce aceasta pătrunde prin diferitele straturi. Detecția se
face prin fotometrie de reflectanță.
lamele multistrat (figura 6.4), dintre care unele încorporează electrozi

miniaturali selectivi de ioni pentru măsurarea ionilor, cum ar fi sodiul și
potasiul. În analizorul Du Pont aca, substanțele chimice sunt ținute în
buzunare detașabile într-un mic sac transparent în care are loc reacția de
testare (figura 6.5).
Codul binar al
parametrii de testare
Denumirea testului abrevierea
Compartiment
e de reactivi
măsurați
Figura 6.5 Pachet de testare analitică transparent (100 mm X 80 mm) pentru analizorul
Du Pont aca® care conține toți reactivii pentru determinarea glucozei. Este disponibilă o
gamă largă de pachete de analiză pentru utilizarea în analizorul discret automatizat. Odată
ce pachetul este încărcat în instrument, proba și diluanții sunt injectați automat.
Compartimentele sigilate ale reactivilor sunt apoi deschise în diferite etape ale analizei, iar
conținutul pachetului este amestecat și incubat. Punga transparentă servește apoi ca o cuvă
pentru măsurătorile de absorbție.
Secțiunea 6.1
1. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate în cazul analizoarelor
discrete?
(a) Acestea pot măsura un singur analit.
(b) Aceștia pot efectua doar o singură analiză la un moment dat.
(c) Aceștia pot utiliza benzi de testare cu reactivi uscați.
(d) Aceștia efectuează analiza în timp ce probele și reactivii
curg prin tuburi.
2. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate în cazul analizoarelor
centrifugale?
(a) Aceștia folosesc centrifugarea pentru a elimina substanțele care
interferează.
(b) Acestea utilizează forța centrifugă pentru a amesteca proba și
reactivii.
(c) Aceștia nu pot efectua teste cinetice.
(d) Acestea încorporează o ultracentrifugă preparatorie.
3. Analizoarele multiteste măsoară mai mulți analiți într-o
probă PENTRU CĂ
analizoarele cu acces aleatoriu au capacitatea de a efectua mai multe
teste.
4. Numai probele solide sunt testate pe analizoarele de
chimie uscată PENTRU CĂ
În analiza automată a fluxului, probele sunt analizate pe măsură ce sunt

pompate succesiv printr-o serie de tuburi care conțin un flux de reactivi care
curge continuu.
6.2.1 Analiza continuă a fluxului

În 1957, profesorul Skeggs a descris o metodă de analiză continuă a debitului,
care a fost dezvoltată și comercializată de Technicon Instruments Co. Ltd. sub
denumirea de "AutoAnalyser". Instrumentele cu un singur canal și cu două
canale aveau flexibilitatea de a putea efectua o varietate de teste diferite în
laboratoare, unde probele care necesitau o anumită analiză puteau fi grupate și
analizate împreună. În prezent, există o gamă limitată de instrumente
disponibile de la mai mulți producători și, deși acestea variază în ceea ce
privește designul, prezentând mai multe modificări față de modelul original,
conceptul de analiză în flux continuu este comun tuturor.
Analizoarele multiple secvențiale (SMA) au fost dezvoltate mai târziu
și aveau un design mult mai complex și includeau un computer. Acestea
puteau analiza fiecare eșantion pentru mai mulți constituenți simultan,
numărul de canale determinând această capacitate, de exemplu 6, 12 sau 20.
Aceste instrumente au fost dezvoltate în primul rând pentru laboratoarele de
chimie clinică din spitale pentru a permite o evaluare globală a compoziției
chimice a probelor de sânge. În prezent, acestea au fost înlocuite de alte tipuri
de analizoare.
Analizoarele cu flux continuu pot efectua toate etapele de bază
implicate într-o procedură fotometrică cantitativă simplă. Acestea includ
pipetarea probei și a reactivilor, amestecarea, încălzirea la temperaturi
specifice, detectarea și prezentarea rezultatelor. În plus, pot fi incluse, dacă
este necesar, digestia probei, separarea fazelor și eliminarea substanțelor care
interferează, în special a proteinelor prin dializă. Deși detecția colorimetrică
este cea mai frecvent utilizată, s-au folosit, de asemenea, tehnici fluorimetrice,
nefelometrice, fotometrice cu flacără, de indice de refracție, radiochimice și
electrochimice, ceea ce a lărgit considerabil gama de aplicații analitice.
Analiza are loc pe măsură ce probele și reactivii sunt pompați printr-un
sistem de tuburi, în loc să fie reținuți în recipiente separate. Fluxul trece prin
tubulatură către diferitele unități ale analizorului, fiecare dintre acestea
îndeplinind o funcție analitică specifică. Spre deosebire de metodele manuale
și de analizoarele discrete, nu se pipetează volume absolute, ci lichidele
implicate sunt amestecate în proporții atent controlate. Aceste proporții sunt
determinate prin utilizarea unor tuburi de livrare cu diametrul intern variabil
cu o pompă cu viteză constantă, iar factorul important este reprezentat de
diferitele viteze de curgere (ml min-1 ) în aceste tuburi.
Probele sunt aspirate succesiv în curentul de reactiv, fiecare dintre ele
fiind separată de un mic volum de apă. Bulele de aer sunt introduse în
curentul care curge și, pentru a menține un model lichid-aer regulat în curent,
se adaugă de obicei un agent de umezire, de exemplu Brij 35, la lichide.
Bulele de aer au mai multe funcții importante și sunt fundamentale pentru
218Metode automatizate de analiză
acest tip de analizor. Acestea umplu complet lumenul tubulaturii și ajută la

păstrarea integrității fiecărei părți alicotale individuale de lichid, oferind o
barieră între ele. Acestea reduc contaminarea între probele succesive,
deoarece presiunea bulei asupra peretelui interior al tubului elimină orice
picături din proba precedentă care ar putea contamina proba următoare.
Aceste caracteristici permit utilizarea unei spălări cu apă mai scurte între
probe și, prin urmare, economisesc timp. De asemenea, bulele ajută la
amestecarea probei și a reactivilor în fiecare segment de lichid. Ori de câte ori
sunt aduse împreună două fluxuri cu segmente de aer, amestecarea în
interiorul fiecărui segment de lichid se realizează prin trecerea fluxului printr-
o spirală de amestecare orizontală din sticlă, a cărei circumferință trebuie să
fie de cel puțin trei ori mai mare decât lungimea segmentelor de lichid. În
timpul trecerii prin serpentină, fiecare segment de lichid este inversat în mod
repetat, permițând straturilor mai grele să cadă prin cele mai ușoare, asigurând
astfel un amestec complet.
Cuantificarea în analiza în flux continuu se bazează pe compararea
directă a înălțimii vârfurilor pe o urmă de înregistrare a probelor și a
standardelor. Nu este necesar ca reacțiile să se încheie, deoarece toate
măsurătorile dintr-o anumită metodă se efectuează după același timp de
reacție fix, care este determinat de lungimea tubului analizorului și se bazează
pe o viteză constantă a pompei.
Instrumente cu un singur canal și cu două canale

Proiectarea tuturor instrumentelor cu un singur canal provine din sistemul
original Technicon AAI, care cuprinde mai multe unități interconectate,
numite module. Fluxurile de lichid curg prin module, fiecare dintre acestea
performează o funcție analitică diferită (figura 6.6). Analizoarele AAII
dezvoltate ulterior nu constau din module separate, ci includeau un cartuș
analitic care combină mai multe funcții într-o singură unitate.
Figura 6.6
Reprezentarea
schematică a
Recorder Detector Încălzire Dialyser Pompă de
funcția modulelor de baie dozare și
analiză a fluxului colector
continuu.
Instrumentele cu două canale sunt foarte asemănătoare cu cele cu un

singur canal și diferă doar prin faptul că analizează fiecare probă pentru doi
constituenți simultan. Fluxul de probă este împărțit în două fracții, fiecare
dintre ele trecând independent prin propriul sistem de tuburi cu reactivi și
detectori corespunzători.
Pompă de dozare și man(fold)
Amestecarea probei și a reactivilor în proporții prestabilite, mai degrabă decât
în volume specifice, este un principiu fundamental al analizei în flux continuu
și se realizează prin utilizarea unei pompe peristaltice cu bară cu role și viteză
constantă și a unor tuburi de transport din plastic flexibil cu diametre interne
diferite. Aceste tuburi de pompare sunt întinse între două blocuri terminale
din plastic, care le mențin întinse între o
platina cu arc și rolele pompei. Cantitatea de aer necesară pentru producerea

bulelor este introdusă în mod similar cu ajutorul unui tub de pompare cu un
anumit diametru intern. Există o gamă variată de tuburi de pompare
(manifold) care furnizează între 0,015 și 3,9 ml min.1 și care sunt codificate
prin culori pentru o identificare ușoară.
Sampler
Unitatea de prelevare a probelor conține o tavă (placă) care poate fi încărcată
cu până la 40 de cupe care conțin probele individuale. Probele sunt aspirate pe
rând, cu apă între ele. Durata de timp în care este aspirată proba determină
volumul de probă care este analizat.
Module de separare
O etapă de separare este uneori o parte esențială a unei metode analitice și
poate fi la fel de diversă ca distilarea, filtrarea, digestia, extracția, separarea
fazelor sau dializa. Toate acestea pot fi realizate de analizoarele cu flux
continuu, fie prin adăugarea unui racord de sticlă special conceput la colector
sau la caruciorul analitic, fie prin adăugarea unui modul separat la analizor.
Multe probe biologice conțin proteine, iar dializa este adesea utilizată pentru a
elimina aceste proteine, care altfel ar afecta analiza.
Unitatea de dializator constă într-o baie de apă controlată termostatic
(37 :± 0,1°C) care adăpostește o pereche de plăci de plastic (Lucite) cu
caneluri spiralate, care sunt fixate împreună cu o membrană de celofan
semipermeabilă întinsă între ele. Acest lucru formează, de fapt, un tub lung
și îngust care este împărțit pe lungime de membrană. Pe măsură ce fluxurile
de probă (donator) și receptor (de obicei soluție salină sau reactiv),
segmentate cu aer, curg unul lângă altul de-a lungul canalelor
semicirculare, moleculele mici de analit difuzează prin membrană în
fluxul receptor (figura 6.7). Viteza de dializă depinde de concentrația
moleculelor dializabile, dacă toți ceilalți factori care afectează dializa sunt
menținuți constanți. Acest lucru face posibilă compararea directă a
standardelor și a probelor și, deși transferul nu este niciodată com plet,
este constant, de obicei între 5 și 25 %.
/ embrane Donator (eșantion)
E
Destinatarul
Figura 6.7 Reprezentarea schematică a dializei. Moleculele mici de analit din fluxul
donator (eșantion) se dializează prin membrana semipermeabilă în fluxul receptor.
După ce iese din dializator, fluxul donator este de obicei pompat la deșeuri, în timp ce
analiza continuă cu fluxul receptor.
Diagrama de flux
O reprezentare schematică a componentelor și a configurației sistemului care este
necesar pentru a efectua o anumită metodă este cunoscută sub numele de
diagramă de flux (figura 6.8). Aceasta este o modalitate convenabilă și bine
recunoscută de înregistrare a informațiilor
cu privire la o anumită metodă, de exemplu, rata de eșantionare, temperatura

băii de încălzire, tipul de sistem de detecție și dimensiunea tuburilor de
pompare necesare pentru fiecare reactiv.
GLUCOZĂ
N13 mamelon/0,025 ID
tubulatură/10.034 sondă ------------------ Deșeuri
Constant Sampler II
, o_.o_65 \
0,090
soluție
salină
0,073 apă Către

recipientul de
spălare a
prelevatorului II
0,100 alch. ferocianură
(DI)
0,056 aer
0.073 flowcell
r-- Deșeu
I ri
l
□
..---(-C -)-t-,t
iu
Colorimeter Recorder
tubular F/C
15 mm420nm
Figura 6.8 Diagrama de flux pentru măsurarea glucozei cu ajutorul cianurii de

ferri alcaline. Tuburile de pompare sunt specificate în ceea ce privește diametrul
intern și poziția pe blocurile de capăt. Codurile de culori ale tuburilor sunt
următoarele:
Poziția 2 0.065 Albastru/Albast
ru
Poziția 4 0.090 Mov/negru
Poziția 6 0.020 Portocaliu/galb
en
Poziția 8 0.073 Verde/verde
Poziția 10 0.100 Violet/portocali
u
Poziția 12 0.056 Galben/galben
Poziția 14 0.073 Verde/verde
Posturile cu numere impare de pe blocurile de capăt sunt cele de la nivelul inferior și
sunt neocupate. H3 și DI se referă la conectorii de sticlă.
Aspecte teoretice ale analizei fluxului continuu

În cazul analizei în flux continuu, probele se succed prin tubulatură și are loc
interacțiunea dintre probele adiacente, care se numește "carry-over".
Transmiterea se manifestă pe urma înregistratorului sub forma unor vârfuri
care nu sunt complet diferențiate. Acest lucru este cel mai vizibil atunci când
un eșantion cu concentrație scăzută urmează un eșantion cu concentrație
ridicată și se observă fie ca un umăr pe
vârful înalt sau obliterat (figura 6.9). Cu toate acestea, reportul poate duce, de
asemenea, la reducerea înălțimii vârfului atunci când un eșantion ridicat
urmează unui eșantion scăzut, dar acest lucru nu este evident din urmă și, prin
urmare, nu este detectat. Introducerea unor segmente de apă între probe și a
unor bule de aer în fluxurile de lichid reduce semnificativ carry-over-ul, dar
nu îl elimină.
Pentru fiecare metodă trebuie să se determine volumele adecvate de
probă și de apă, exprimate în timpi de aspirație (secunde). Acest lucru
presupune aspirarea unei soluții standard de analit timp de mai multe ori și
observarea înălțimii vârfurilor. Se poate selecta apoi un timp de spălare prin
menținerea constantă a timpului de prelevare a probei și prin variația timpului
de spălare. De obicei, se caută cea mai mare rată de eșantionare care are ca
rezultat cea mai mică cantitate de transfer.
% 100
90
80
70
60
50
40
30
20 Reportaj r
10
J J _,. .......
0
--- Timp
Figura 6.9 Efectul reportului. S-au analizat probe de concentrație mare și mică cu timpi de
spălare diferiți. Reașezarea a fost mai evidentă în cazul unui timp de spălare mai scurt.
Evaluarea reportului
O evaluare a transferului poate fi făcută prin analizarea unui eșantion cu o
concentrație ridicată a analitului (A) în trei exemplare, dând rezultatele a1 ,
a2 și a3 , urmat de un eșantion cu o concentrație scăzută (B) în trei
exemplare, dând rezultatele b1, b2 și b3 (figura 6.10). Reportul dintre a3 și b1
este dat de ecuația:
Procentul de interacțiune b1 -b 3
X 100
(k) =
a3 - b3
unde se presupune că b3 este "adevărata" valoare pentru eșantionul B,
deoarece este predată de două eșantioane de concentrație egală; efectul
de reportare ar trebui să fie neglijabil.
% 100
90
a3 a2 a1
80
70
60
50
40
30
- ,
20
b3 br2 b1
'
- l/
10
IV l/
Lw
Figura 6.10
0
Evaluarea reportului.
- Timp
6.2.2 Analiza prin injecție de flux

În această tehnică, care a fost dezvoltată în anii '70, volume de microlitri de
probă lichidă sunt injectate, la intervale regulate, într-un flux purtător care
curge continuu și care nu este segmentat cu aer. Diverse fluxuri de reactivi
sunt introduse în funcție de necesități și are loc o amestecare controlată a
reactivilor și a probei. Faptul că analiza prin injecție de flux nu implică
fluxuri cu aer segmentat face posibilă includerea unor etape de separare, cum
ar fi extracția cu solvent și difuzia de gaz.
Atunci când fluxul unit trece prin detector, se înregistrează vârfuri
tranzitorii proporționale cu concentrația de analit. Dispersia excesivă a zonei
de eșantionare în fluxul purtător este redusă prin utilizarea unor volume mici
de eșantionare, a unor tuburi cu diametru îngust și a unor timpi de ședere
scurți în sistem. Analiza rapidă și procedurile ușoare de pornire fac această
tehnică deosebit de utilă pentru probele unice care sosesc rar și necesită o
analiză imediată (tabelul 6.1).
Tabelul 6.1 Parametrii tipici pentru analiza injecției de flux
Volumul probei 40--200 µ,l

Diametrul 0,35--0,9 mm
tubului Debitul 0,5-2,5 ml min.1
Lungimile 10--200 cm
bobinelor 8-40 µJ
Volumul celulei 15--60 s
de curgere Timp 60--200 h-1
de rezidență
Eșantion de
randament
Instrumentație
Este necesar un dispozitiv de injecție de precizie pentru a minimiza dispersia
probei și pentru a menține reproductibilitatea volumului probei și a lungimii
zonei de probă. Acesta este, în general, o supapă rotativă similară celei
utilizate pentru injecție în HPLC. Sincronizarea exactă de la injectarea probei
până la detecție este critică din cauza reacțiilor care se produc rapid și care
sunt monitorizate înainte de a fi finalizate. Acest lucru necesită un debit
constant cu pulsații de mică amplitudine, obținut în mod normal cu ajutorul
unei instalații peristaltice.
Tip Funcție Schema de curgere
Adăugarea unui reactiv C w
R1
III Adăugarea a trei reactivi C w

sau amestecul a două sau trei
reactivi R1
R2
R3
Figura 6.11 Exemple de tipuri de ChemifoldTecator pentru analiza prin injecție de
flux. S, eșantion
ple portul de injecție; C, flux de transport; R1 , R2 , R3 , fluxuri de reactivi; D, detector; W,
deșeu.
pompă. Alternativ, se poate folosi o seringă sau presiunea unui gaz pentru a
propulsa fluidele. Proporțiile corecte de probă și reactivi se obțin prin
utilizarea unor tuburi cu diametre diferite. Tecator produce o serie de
analizoare complete de injecție de flux. Colectorii lor, care oferă un mijloc de
a aduce împreună conductele de fluide și de a permite ca clătirea și reacțiile
chimice să aibă loc într-un mod controlat, sunt comercializați sub denumirea
Chemifolds (figura 6.11) și este disponibilă o gamă pentru o varietate de
aplicații.
Un neajuns major al analizoarelor automate dezvoltate în anii 1960 și 1970 a

fost că, în mare măsură, pregătirea probelor a rămas neautomatizată. De
asemenea, utilizarea lor a fost în general limitată la proceduri fotometrice
cantitative pe probe lichide. Sistemele robotizate au fost dezvoltate pentru a
extinde gama de sarcini care puteau fi efectuate. Zymark Corporation și-a
bazat roboții pe faptul că toate procedurile de laborator, indiferent de
complexitate, pot fi împărțite într-o serie de pași simpli numiți Operațiuni
unitare de laborator, LUO (tabelul 6.2). Diferitele module sau stații de lucru
necesare pentru a efectua aceste sarcini pot fi legate între ele de un braț
robotizat, care este programat să transfere probe între ele în orice succesiune.
Acest lucru oferă un sistem flexibil, construit la comandă, prin care o metodă
poate fi complet automatizată, indiferent de numărul de etape și de secvența
necesară. Acesta combină robotica, controlul computerizat și instruirea și
produce un raport final (figura 6.12).
Sunt disponibile, de asemenea, stații de lucru mai puțin complexe, care
îndeplinesc funcții mai limitate, fie individual, fie în secvențe, de exemplu,
evaporarea solvenților organici, pipetarea volumelor mici, reacțiile reactivilor
periculoși și autoinjectarea în tehnici cromatografice pe coloană.
Balanță
Spectrofotometru
UV-Vis
Filtrati
D
Centrifuga
Figura 6.12 Reprezentare schematică a sistemului robotizat Zymate (Zymark

Corporation). Brațul robotizat este programat să se deplaseze între diferitele module
necesare pentru o anumită analiză.
Robotică 225
Tabelul 6.2 Operațiuni ale unității de laborator (LUO)
Clasa Definiție Exemple
Cântărire Măsurarea cantitativă a Utilizarea unei balanțe

masei probei
Omogenizare Reducerea dimensiunii Sonicare, măcinare

particulelor de probă și
crearea unei probe
uniforme
Manipulare Deplasarea eprubetelor,
Manipularea fizică a capsularea, decapsularea
materialelor de
Manipularea laborator Pipetări, transferuri,
lichidelor distribuiri
Manipularea fizică a
reactivilor lichizi Incubare, temporizare, agitare
Condiționare
Modificarea și controlul
mediului de eșantionare Absorbanță, fluorescență,
Măsurare pH
Măsurarea directă a
proprietăților fizice Filtrare, extracție,
Separare centrifugare
Separare mecanică
grosieră sau de
Control precizie
Utilizarea calculului și a
deciziilor logice în Integrarea vârfurilor, analiza
Reducerea procedurile de spectrală
datelor laborator
Conversia datelor analitice Carnete de note,

brute în informații liste, calculatoare
Documentație utilizabile
Crearea de înregistrări și
fișiere pentru recuperare
Secțiunile 6.2/3
1. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate în cazul analizei
injecției de flux?
(a) Fluxurile de lichid sunt segmentate cu bule de aer.
(b) Centrifugarea este utilizată pentru a amesteca reactivul și proba.
(c) De obicei, se utilizează volume de eșantion de microlitri.
(d) Reacțiile au loc în interiorul tuburilor.
2. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate pentru analiza
automată a fluxului?
(a) Întotdeauna se introduc bule de aer în sistem.
(b) Volumele de reactivi necesare sunt specificate pentru fiecare
metodă în parte.
(c) Probele se succed printr-un sistem de tuburi.
(d) Pentru reglarea administrării reactivilor se utilizează tuburi
flexibile cu diametre diferite.
226Metode automatizate de analiză
3. În analiza automată a fluxului nu este necesar ca reacțiile să ajungă la

finalizare.
PENTRU CĂ
în analiza automată a fluxului, cuantificarea se bazează pe compararea
vârfurilor de înregistrare a eșantioanelor și a standardelor analizate în
aceleași condiții.
4. În analiza fluxului continuu segmentat cu aer, bulele de aer ajută la
reducerea interacțiunii dintre probele adiacente (carry-over).
PENTRU CĂ
nu este posibil să se evalueze gradul de reportare pentru o anumită
metodă de analiză a fluxului continuu.
Valcarcel, M. și Luque de Castro M.D. (1988) Metode automate de analiză,

Elsevier, Țările de Jos.
Stockwell, P.B. (1996) Automatic chemical analysis, ediția a 2-a, Taylor and Francis Ltd,
Marea Britanie.
Ruzicka, J. și Hansen, E.H. (1988), Flow injection analysis, ediția a 2-a, Wiley
Interscience, SUA.
Sonntag, 0. (1993) Dry chemistry, Elsevier, Țările de Jos.
7 Metode imunologice
• Procese generale ale răspunsului imunitar

• Reacții antigen-anticorp
• Tehnici analitice - reacții de precipitare
• Tehnici analitice - imunoanaliză
Anticorpii sunt proteine produse de un animal, în cadrul unui proces cunoscut

sub numele de răspuns imunitar, ca urmare a introducerii unei substanțe
străine în țesuturile sale. O astfel de substanță este cunoscută sub numele de
antigen sau imunogen, iar anticorpii produși sunt capabili să se lege de
antigenul respectiv atunci când li se permite să reacționeze în mod
corespunzător. Unele substanțe, cunoscute sub numele de hap tens, nu sunt
capabile să inițieze un răspuns imunitar prin ele însele, dar, atunci când sunt
conjugate cu o proteină, pot acționa ca un epitop, ducând la formarea de
anticorpi.
Reacțiile antigen-anticorp au stat la baza unor metode foarte utile de
analiză calitativă și semicantitativă timp de mulți ani, în special în
microbiologie. Anticorpii au fost utilizați în identificarea bacteriilor și,
adesea, preparatele de anticorpi au primit nume care descriu o caracteristică
demonstrabilă a reacției lor cu antigenul. Astfel, lizinele erau anticorpi care
provocau ruperea membranelor celulare, opsoninele făceau ca antigenul să fie
susceptibil la fagocitoză, în timp ce aglutininele și precipitinele provocau
flocularea antigenelor celulare și, respectiv, solubile. Inițial, s-a crezut că
anticorpii care provocau aceste efecte diferite erau foarte diferiți unul de
celălalt și nu s-a apreciat la acea vreme că același anticorp poate avea efecte
diferite în funcție de condițiile de mediu și de prezența altor substanțe.
Progrese majore în utilizarea analitică a anticorpilor au avut loc odată
cu dezvoltarea câtorva tehnici fundamentale: capacitatea de a detecta
anticorpii legați de celule (testul Coombs, 1945); imunoprecipitarea în geluri
(Ouchterlony, 1953); radioimunodozarea (Yalow și Berson, 1960) și
anticorpii monoclonali (Kohler și Milstein, 1975). Acestea, împreună cu un
con-
228Metode imunologice
o înțelegere mult mai bună a răspunsului imunitar și a anticorpilor, a deschis

calea pentru dezvoltarea multor metode cantitative de analiză foarte sensibile.
Formarea de anticorpi este doar unul dintre mecanismele prin care un animal
se poate proteja de substanțe sau microorganisme potențial dăunătoare. O
protecție mecanică împotriva infecțiilor este asigurată de prezența unei
suprafețe cutanate și a unor membrane intacte, împreună cu secreția de mucus
de pe multe suprafețe membranare interne. Acizii secretați de stomac și de
piele au un efect bactericid, la fel ca și prezența în multe fluide corporale a
anumitor enzime, în special a lizozimei.
Invazia țesuturilor de către un agent infecțios inițiază un răspuns
inflamator la nivelul animalului. Aceasta este nespecifică și este mediată în
principal de substanțe eliberate de țesuturile care sunt deteriorate fie ca
urmare a traumei, fie ca urmare a efectelor toxice ale agentului infecțios.
Mediatorul principal este amina vasoactivă histamina, care determină o
creștere a fluxului sanguin local și a permeabilității capilare, ceea ce duce la
edem local. Un aspect major al răspunsului inflamator este implicarea unui
număr mare de celule fagocitare, în special a leucocitelor polimorfonucleare.
Acestea sunt atrase chimiotactic către țesuturile inflamate și sunt responsabile
în principal de eliminarea materialului particular. Acest lucru duce adesea la
distrugerea multora dintre aceste celule și la formarea de puroi.
Un grup foarte important de celule cunoscute sub numele de limfocite,
care sunt larg răspândite în toate țesuturile, apar în număr crescut în timpul
unui răspuns inflamator și sunt responsabile în primul rând de răspunsul
imunitar. Acesta este un răspuns specific la substanța sau agentul invadator
din partea animalului și implică producerea de celule și anticorpi cu
capacitatea de a recunoaște și de a lega substanța invadatoare.
7.1.1 Celule implicate în răspunsul imunitar

Limfocitele sunt un grup foarte eterogen de celule, aproape identice atunci
când sunt studiate prin metode de microscopie optică și care prezintă doar
mici diferențe prin tehnici de microscopie electronică și totuși grupul conține
celule cu multe roluri diferite. Deși un număr mare de limfocite poate fi
detectat în sângele circulant și în fluidele corporale, majoritatea limfocitelor
se găsesc în grupul de țesuturi cunoscut sub denumirea colectivă de sistem
reticulo-endotelial. Acesta include țesuturi precum ficatul, splina, măduva
osoasă, timusul și ganglionii limfatici, toate acestea fiind importante în
răspunsul imunitar. Experimentele care implică prelevarea de diferite țesuturi
de la animale experimentale au indicat că există două caracteristici diferite ale
răspunsului imunitar. Îndepărtarea timusului, o glandă mică situată în spatele
sterilor, afectează capacitatea unui animal tânăr de a respinge transplanturile
de piele, dar nu afectează în aceeași măsură capacitatea acestuia de a produce
anticorpi. Acest aspect al
răspunsul imun este cunoscut sub numele de imunitate mediată celular și se

datorează unei subpopulații de limfocite numite limfocite T (derivate din
timus). Lucrările experimentale efectuate pe păsări au demonstrat că
îndepărtarea unui nodul de țesut limfatic din intestin, cunoscut sub numele de
bursa lui Fabricius, are ca rezultat o capacitate redusă de a produce anticorpi,
dar nu modifică semnificativ răspunsul la grefele de piele. Ulterior, s-a
demonstrat că producția de anticorpi, o caracteristică cunoscută sub numele
de imunitate umorală, este asociată cu o altă subpopulație de limfocite
cunoscută sub numele de limfocite B (derivate din bursa). Măduva osoasă
acționează ca sursă de limfocite B la om.
Introducerea unui antigen în țesuturile unui animal sensibil are ca
rezultat inițial o proliferare crescută a limfocitelor în țesuturile sistemului
reticulo-endotelial, în special în ganglionii limfatici și în splină (figura 7.1).
Un animal va prezenta răspunsuri diferite dacă antigenul este complet nou
pentru el (un răspuns primar) sau dacă antigenul a fost întâlnit în trecut.
Preo,ao, 00 =- oeU
Implicarea timusului echivalent

cu Bursa implicare
I \
Celula prezentatoare de
antigen
J\ J\
Limfocite Celula Limfocite T
I \
de memorie plasma
Itică
Limfocina Citotoxice
Producția producție celule
de
anticorpi
IMUNITAT CELL-MEDIATE
E IMUNITATE
UMORALĂ
Figura 7.1 Procesele celulare ale răspunsului imunitar. Un rezumat simplificat al

secvenței de evenimente din cadrul răspunsului umoral și celular mediat la un antigen.
Nivelul
anticorpilor în
ser
Prima
injecție Al doilea Secundar
Răspuns
primar
0 0 Timp (zile)
Figura 7.2 Cinetica răspunsului imunitar. Injectarea la un animal a unei a doua

doze de antigen la câteva săptămâni după prima injecție va avea ca rezultat un răspuns
mai rapid și mai intens decât primul.
cu o ocazie anterioară (un răspuns secundar) (figura 7.2). Răspunsul secundar

:cs ,o ,:: prezintă o perioadă de decalaj redusă și o rată de sinteză a anticorpilor
: :r :ri :ri
riiit
considerabil crescută în comparație cu răspunsul primar, iar anticorpul
:::: persistă pentru o perioadă mai lungă. Cinetica răspunsului variază în funcție
I- -- de antigen și de animal, dar relația dintre răspunsul primar și cel secundar este
caracteristică.
oiij ti \......
Există trei tipuri majore de limfocite care, atunci când sunt stimulate,
1 :: l: t:l, ;-
sunt direct responsabile de efectele unei reacții imune. În timpul proliferării,
limfocitele B se transformă în plasmocite, care sunt celulele producătoare de
anticorpi, procesul menționat anterior ca imunitate umorală. Un anticorp
j:-Pfasma ¢EiUS:.ife protejează într-o varietate de moduri. Acesta poate face ca antigenul liber să
a,... fie mai susceptibil la eliminare prin procese celulare normale, cum ar fi
ltffi §- t aie)a fagocitoza, sau poate bloca efectele unei substanțe toxice. De asemenea, poate
the-:pr ss: .\,- -. funcționa împreună cu o serie de proteine plasmatice cunoscute sub
$Y ,1 . - denumirea colectivă de complement pentru a provoca leziuni litice la nivelul
lf)t!I! .. --.---.--... ., ,... membranei unei celule antigenice țintă. Există două tipuri de limfocite T
►.-- !lf O\;t,:,.,.,:iQIJ:- implicate: celulele citotoxice (celule Tc), atunci când sunt stimulate, sunt
capabile să se lege de celula antigenică și să provoace leziuni litice
imtli i:>l i f Jos-
Ft
ireversibile la nivelul membranei celulare; alte limfocite T (celule Td)
eliberează substanțe solubile cunoscute sub numele de
ca limfocine, care deteriorează celulele antigenice invadatoare și stimulează
alte
aspecte ale sistemului imunitar al gazdei. Efectele activării limfocitelor Tc și Td
sunt caracteristici ale imunității mediate de celule.
: mqK>o
,e -s. SflE!.¢tl
e ? ··· - ..'..
p. este ..
Celulele competente din punct de vedere imunologic, fie că sunt
limfocite Tor B, au receptori membranari care sunt specifici pentru un
antigen. Practic, legarea antigenului de receptorul specific de pe limfocitele
e pr i -t,y: wij t(< -...-.
corespunzătoare este cea care inițiază întregul proces, stimulând celula să
<>nlt-11 --n e -de prolifereze și să producă o clonă de celule identice, un proces cunoscut sub
l)'mpnaeytts- aer : ----
stimMtatid w -tep11cjte....-- numele de "selecție clonală". Natura răspunsului secundar se datorează în
principal acestui număr mare de celule disponibile în prezent.
Y C ieii/.< - Procesele de recunoaștere a antigenului și de stimulare imunitară sunt
extrem de complexe și implică o succesiune de etape. La intrarea în țesuturi,

antigenul este preluat de macrofage sau de alte "celule prezentatoare de
antigen" (APC) și, după modificare, este expus pe membrana externă a
celulelor. Acest antigen legat de membrană poate fi recunoscut de limfocite
prin intermediul receptorilor specifici antigenului purtați pe membranele
acestora. Un grup de celule cheie în acest proces sunt celulele T helper (celule
Th). Aceste celule recunosc antigenul prezentat de către macrofag și, atunci
când sunt stimulate de acest proces de recunoaștere, sunt capabile să
stimuleze celulele specifice B, Tc sau Td (figura 7.3).
Macrofage
Receptor de antigen
Figura 7.3 Procesul de

recunoaștere a antigenului
și de stimulare a Interleukine
limfocitelor.
În toate interacțiunile celulare din cadrul procesului imunitar, pe lângă

faptul că recunoașterea antigenului este o caracteristică majoră, există stimuli
complecși care rezultă din secreția unei serii de citokine de către diferitele
celule implicate. În procesul imunitar, deoarece interacțiunile sunt între
leucocite, aceste citokine sunt cunoscute sub numele de interleukine. Ele sunt
specifice pentru tipul de celule asupra cărora pot acționa și sunt necesare,
adesea în combinație cu recunoașterea antigenului, pentru a stimula
limfocitele țintă să acționeze în modul cerut. Această acțiune poate implica
sinteza proteinelor, replicarea sau diferențierea și este un pas esențial în
organizarea și controlul unui răspuns imunitar complet. Un limfocit individual
poate fi stimulat doar de un număr limitat de antigene (probabil doar unul, dar
cel mult două sau trei) și, pentru a furniza un număr mare de anticorpi diferiți,
este esențial să existe un număr echivalent de limfocite diferite în țesuturi.
7.1.2 Structura anticorpilor

Anticorpii fac parte dintr-un grup de proteine cunoscute sub denumirea
colectivă de imunoglobuline. Denumirea provine de la observația că, în
timpul electroforezei plasmei sanguine, proteinele asociate cu activitatea
anticorpilor migrează împreună cu fracțiunea de gamaglobulină.
Imunoglobulinele sunt molecule glicoproteice compuse din patru lanțuri

polipeptidice legate covalent prin legături disulfidice (figura 7.4). Cele patru
polipeptide constau din două lanțuri identice cu masa moleculară relativă
23000 și 50 75000 și sunt denumite, respectiv, lanț ușor și lanț greu. În
plus față de legăturile disulfurice intercatenare, fiecare polipeptidă conține un
număr de legături disulfurice intracatenare care împart lanțul polipeptidic într-
o serie de domenii. În plus, imunoglobulinele posedă o zonă cunoscută sub
numele de regiune de balama, care permite flexibilitatea lanțurilor în raport
unul cu celălalt.
108 214
11111111111 sI
Loc de legare a antigenului * sI
440
■
I 118 I
11111111111 11
t t t sI
sI
Regiuni hipervariabile
I
Nllllllll■IIIIIIIII I
Loc de legare a antigenului * sI
s
I
NIIIIIIIIIIIII
,-- Variabila --t ------------ Secțiuni constante
reg1ons
Figura 7.4 Structura de bază a moleculei IgG. Două lanțuri grele (440 de reziduuri)
și două lanțuri ușoare (214 reziduuri) sunt unite prin legături disulfurice și fiecare
prezintă o secvență de aminoacizi relativ constantă într-o secțiune (capătul C-tenninal)
și o secțiune cu secvență variabilă (capătul N-tenninal). Regiunile variabile atât ale
lanțurilor grele, cât și ale lanțurilor ușoare sunt implicate în formarea situsului de
legare a antigenului.
Compararea secvenței de aminoacizi a lanțurilor grele ale unei clase

particulare de imunoglobuline arată că aproximativ trei sferturi din fiecare
lanț de la capătul C-terminal prezintă secvențe foarte asemănătoare (sectiunea
constantă). Restul sfertului de lanț peptidic (secțiunea variabilă) prezintă o
variație considerabilă în ceea ce privește secvența de aminoacizi și
corespunde acelei părți a lanțului asociată cu situsul de legare a antigenului.
Regiuni constante și variabile similare sunt, de asemenea, demonstrabile în
lanțurile ușoare, deși, în acest caz, fiecare implică aproximativ jumătate din
peptidă. Variația este deosebit de evidentă în trei secțiuni distincte (secțiuni
hipervariabile) din lanțurile grele și se sugerează că aceste secțiuni, atunci
când sunt asociate cu trei secțiuni similare din lanțurile ușoare, sunt
responsabile de activitatea anticorpilor și de specificitatea unei
imunoglobuline.
Cinci subclase majore de irnmunoglobuline (izotipuri) (tabelul 7.1) au
au fost recunoscute, iar diferențele dintre clase constau în lanțurile grele, care,
deși au aproximativ aceeași dimensiune pentru toate clasele, variază considerabil
în ceea ce privește secvența de aminoacizi. Lanțurile grele ale imunoglobulinelor
sunt denumite -y, µ,, a, o sau E, iar atunci când două lanțuri grele identice sunt
combinate într-o imunoglobulină, molecula este desemnată ca fiind fie IgG, IgM,
IgA, IgD sau, respectiv, IgE. Izotipurile lanțului greu pot fi, de asemenea,
subdivizate în mai multe subtipuri. Există patru subtipuri de IgG (-y1 , -y2 ,
-y3, -y4), două de IgA (a1, ai) și două de IgM (µ,1, µ,2). Lanțurile ușoare nu prezintă
o astfel de variație și doar două tipuri principale sunt demonstrabile,
cunoscute sub numele de lanțurile kappa (K) și lambda (A).
Tabelul 7.1 Clase de imunoglobuline
Imunoglobulină RMM Numărul de Lanț greu Subclase de Valența Procentul

unități de bază lanțuri grele antigenică în serul normal
cu patru lanțuri
IgA 1.5 X 105 1 sau 2 a a1 a2 2-4 13
IgD 1.8 X 105 1 8 2 1
IgE 2.0 X 105 E 2 0.002
IgG 1.6 X 105 'Y 'Y1 'Y2 'Y2 'YJ 'Y4 2 80
IgM 1.0 X 106 5 µ, µ,,, J-1,i 10 6
7.1.3 Rolul anticorpilor

lgG cuprinde aproximativ 80% din totalul imunoglobulinei din plasmă și,
deoarece este relativ mică, este capabilă să traverseze membranele și să se
difuzeze în spațiile extravasculare ale corpului. Poate traversa membrana
placentară și asigură principala apărare imunitară în primele câteva săptămâni
de viață până când mecanismul imunitar propriu al sugarului devine eficient.
lgM este o moleculă mare compusă din cinci unități, fiecare dintre ele
având o structură similară cu cea a moleculei IgG. Tetramerul conține o
polipeptidă suplimentară, lanțul J (masa moleculară relativă 15 000), care
pare să fie importantă în secreția moleculei din celulă. Este un agent
aglutinant și precipitant eficient și, deși este potențial capabil să lege zece
molecule de antigen, de obicei este doar pentavalent. Nu traversează cu
ușurință membranele și se limitează în mare parte la fluxul sanguin.
lgA este asociată în principal cu secrețiile seromucoase, cum ar fi saliva,
lacrimile, fluidele nazale etc. și este secretată sub formă de dimer cu un lanț J
și o bucată secretoare (masă moleculară relativă 70 000), aceasta din urmă
aparent pentru a preveni deteriorarea moleculei de către enzimele proteolitice.
Rolul său principal pare să fie protecția membranelor mucoase, iar prezența sa
în sânge, în principal ca monomer, poate fi rezultatul absorbției dimerului
degradat.
lgE este cunoscută ca fiind o i,mmunoglobulină citofilă datorită capacității
sale de a se lega de celule, ceea ce poate explica concentrația sa scăzută în
lichidele corporale. Atunci când IgE reacționează cu un antigen, provoacă
degranularea mastocitelor la care este legată, cu eliberarea de amine vasoactive,
cum ar fi histamina. Acest proces poate fi util în inițierea răspunsului inflamator,
dar la persoanele alergice reacția este excesivă și duce la o stare de
hipersensibilitate sau hiperreactivitate.
Un anticorp se combină în mod specific cu antigenul sau haptenul

corespunzător într-un mod foarte asemănător cu legarea unei enzime de
substratul său și implică interacțiuni hidrofobe și electrostatice. Cu toate
acestea, legătura dintre un anticorp și antigen nu implică nicio reacție chimică
ulterioară, iar stabilitatea sa depinde de forma complementară a antigenului și
de situsul de legare al anticorpului. Din cauza slăbiciunii relative a forțelor
care țin împreună anticorpul și antigenul, aceste combinații sunt reversibile și
complexul se va disocia, în funcție de puterea legăturii:
Ag + Ab <=> AgAb
În cazul în care legătura este puternică, echilibrul se va situa la dreapta; în
cazul în care este slabă, la stânga. Puterea de legare a unui anticorp la un
antigen este denumită afinitate și este definită de constanta de echilibru K,
unde
K= [AgAb]
[Ag][Ab]
În cazul în care mai mulți anticorpi dintr-un antiserum se pot combina
simultan cu un antigen, suma puterii de legare este definită ca fiind aviditatea
antiserului.
Majoritatea antigenelor sunt mari și pot avea mai multe caracteristici
antigenice sau epitopi (determinanți) și, ca urmare, serul prelevat de la un
animal care a fost imunizat împotriva antigenului respectiv va conține mai
mulți anticorpi diferiți împotriva diferiților determinanți antigenici. Este
posibil ca un alt antigen să aibă în comun cu antigenul inițial anumiți
determinanți antigenici similari, astfel încât unii dintre anticorpii dintr-un antiser
se vor lega de ambii antigeni. Un astfel de antiser va prezenta reactivitate
încruciș ată între cele două antigene ș i se spune că este lipsit de specificitate.
Antiserumurile utilizate în scopuri analitice trebuie să fie specifice și este
esențial ca fiecare antiserum să fie testat temeinic înainte de a fi utilizat.
7.2.1 Producerea de anticorpi

Obținerea unui antiser specific prin imunizarea unui animal implică, de obicei,
injectarea intramusculară a antigenului pur, deși injectarea intravenoasă poate fi
adecvată pentru anumiți antigeni. Din cauza răspunsurilor primare și secundare la
antigeni, o serie de injecții care implică cantități mici de antigen este probabil să
fie mai eficientă decât o singură injecție mare. Secvența precisă și momentul pot
afecta în mod semnificativ calitatea antiserului produs. O injecție inițială este
urmată în mod normal de mai multe doze de rapel administrate la intervale de
două până la patru săptămâni. Injecțiile prea frecvente, deși pot da un răspuns mai
rapid, pot avea ca rezultat un antiser de aviditate redusă.
Specia de animal utilizată trebuie să fie cât mai diferită posibil de
animalul sursă al antigenului. Trebuie să fie relativ ușor de manipulat și să
furnizeze suficient ser pentru a face ca procesul să merite. Animalele cel mai
frecvent utilizate pentru producerea de anticorpi sunt cobaiul și iepurele, dar
pentru cantități mai mari de ser se folosesc caprele, oile și caii.
Antigenele variază considerabil în ceea ce privește capacitatea lor de a

iniția un răspuns imunitar și se obișnuiește să se încorporeze un adjuvant în
probă înainte de injectare. Un adjuvant este un amestec de substanțe care
stimulează un răspuns inflamator și împiedică eliminarea rapidă a antigenului
din țesuturi prin mecanismul normal de drenaj. Adjuvantul lui Freund constă
într-o emulsie de micobacterii moarte în ulei mineral, dar alternative mai
simple de fosfat sau hidroxid de aluminiu au un efect similar. Deși proteinele
sunt, în general, imunogene, pentru a fi eficiente, acestea trebuie să aibă o
masă moleculară relativă de cel puțin 4000 și o anumită rigiditate structurală.
Pentru a crea anticorpi împotriva unei molecule non-irnmuno-genetice (un
hapten), este necesar să o legăm de o proteină purtătoare capabilă să inițieze
un răspuns. În acest scop, se utilizează frecvent seroalbumina bovină sau
umană, precum și polipeptide sintetice, cum ar fi poli-L-lizina. Haptenul ar
trebui să fie legat covalent cu proteina purtătoare, un proces ușor de realizat
prin utilizarea unei varietăți de substanțe chimice și care implică adesea
încorporarea unei molecule de distanțare între proteina purtătoare și hapten.
Antiserurile produse în acest mod sunt cunoscute sub denumirea de
policlonale, deoarece conțin mai mulți anticorpi produși de diferite limfocite,
fiecare dintre ele răspunzând fie la diferiți determinanți antigenici ai
antigenului original, fie la alte substanțe irnmunogene din materialul injectat.
O astfel de gamă de anticorpi reduce specificitatea metodei.
Dezvoltarea tehnicilor de producere a anticorpilor monoclonali de către
Kohler și Milstein a extins enorm potențialul anticorpilor ca agenți analitici și
terapeutici. Un anticorp monoclonal este un anticorp produs de o clonă de
celule, toate derivate dintr-un singur limfocite. Orice limfocit poate produce
probabil o singură imunoglobulină și, prin urmare, anticorpul produs de o
clonă de celule identice este foarte limitat în ceea ce privește antigenele la
care se va lega, ceea ce îl face un reactiv foarte specific.
Producția de anticorpi monoclonali începe cu imunizarea unui animal
(de obicei un șoarece) în mod tradițional. Cu toate acestea, în loc să se
permită sistemului imunitar al șoarecelui să genereze anticorpi, se separă
limfocitele din splina șoarecelui și se fuzionează in vitro cu celule canceroase
de mielom care cresc în culturi celulare. Se folosește un fusogen, de obicei
polietilenglicol, iar celula fuzionată rezultată este cunoscută sub numele de
hibridom. Suspensia de celule este diluată și distribuită într-un număr mare de
subculturi pentru a se obține o distribuție monocelulară. Celula canceroasă
originală are capacitatea de a sintetiza în mod nespecific irnmunoglobulina,
dar atunci când fuzionează cu un limfocite, care a fost stimulat de antigenul
injectat, produce imunoglobulina pentru care limfocitele au informația
genetică.
Inițial, celulele hibridomului sunt cultivate într-un mediu care nu va
menține creșterea celulelor canceroase; prin urmare, acestea mor, la fel ca și
limfocitele care nu au fuzionat, lăsând doar celulele fuzionate. Pe măsură ce
celulele hibridomului cresc, lichidul supranatural este testat pentru a
determina prezența anticorpilor. Culturile care produc anticorpul dorit sunt
clonate în continuare și cultivate fie în masă, fie sub formă de tumori la
animale, iar anticorpii monoclonali sunt recoltați.
Pe lângă specificitatea lor îmbunătățită, anticorpii monoclonali oferă și
alte avantaje semnificative față de antiserumurile policlonale: există o
cantitate nedeterminată de anticorpi cu caracteristici constante, precum și o
relativă ușurință în purificare.
7.2.2 Efectele formării complexului antigen-anticorp

Combinația dintre un antigen și un anticorp duce, de obicei, la formarea unei
structuri de tip rețea (figura 7.5). Dacă această structură este suficient de
mare, ea se va sedimenta și va fi măsurabilă într-un anumit fel. Dacă
antigenul era inițial solubil, acest proces este cunoscut sub numele de
precipitare, dar dacă antigenul era celular sau particular, procesul este
cunoscut sub numele de aglutinare.
Structura generală a precipitatului
?is II [T-l
-
ee:,e
-
0
Anticorp Echivalență Antigen
exces zona exces
zona zonă
l 11 1 l 1
Suma
de precipitat
,.,. ..------
/
/ .................................................................................. .. _
/ ..... .....
/
/
/
/
/
/
/
Concentrația de antigen
Figura 7.5 Rea.cțiune antigen-anticorp. Precipitarea maximă apare atunci când

antigenul și anticorpul sunt prezenți în cantități echivalente și se datorează formării
unor structuri reticulare mari. De o parte și de alta a zonei de echivalență, cantitatea de
precipitare este redusă deoarece agregatele sunt mai mici și mai solubile.
Este extrem de dificil să se măsoare cantitatea de anticorpi prezentă în

termeni absoluți, dar activitatea sau concentrația sa poate fi de obicei legată
de un aspect demonstrabil al reacției antigen-anticorp. Un studiu al efectului
concentrației celor două componente indică faptul că proporția de anticorp
față de antigen este adesea critică pentru a produce un efect detectabil. Figura
7.5 arată efectul unor cantități variabile de antigen în prezența unei cantități
fixe de antiserum asupra gradului de precipitare. Pe măsură ce cantitatea de
antigen crește de la zero, cantitatea de precipitat crește în mod aproximativ
proporțional până la o valoare maximă. Cu toate acestea, în cazul în care
cantitatea de antigen este în continuare crescută, cantitatea de precipitat scade
adesea. Aceasta înseamnă că, în loc să se lucreze cu reactivi în exces, așa cum
se întâmplă adesea în metodele chimice de analiză, este adesea esențial să se
lucreze cu proporții optime sau echivalente de antigen și anticorp pentru a
produce un efect maxim.
În unele cazuri, în special dacă antigenul este celular, combinația dintre

antigen și anticorp va avea ca rezultat un efect biologic mai degrabă decât un
efect fizic. Celulele pot fi deteriorate, ceea ce duce fie la liză, fie la inhibarea
proceselor lor naturale, cum ar fi motilitatea. Virușii pot fi neutralizați, ceea
ce îi face neinfecțioși. Multe teste care implică astfel de mecanisme sunt
calitative și nu se pretează cu ușurință la o analiză cantitativă. Tabelul 7.2
rezumă principalele tipuri de metode analitice care implică reacții cu
anticorpi.
Tabelul 7.2 Metode imunologice de analiză. Reacții demonstrabile între

anticorpi și antigene
Natura Natura Analitică Exemplu

de reacție antigen valoare
Aglutinare Particule În principal calitativ Gruparea sângelui

sau celulară Detectarea anticorpilor
Citotoxicitate Celulară Calitativă sau Tipare celulară
semicantitativ Teste de fixare a
complementului Precipitație Solubilitate Calitativ sau Difuzie
dublă
cantitativ Difuziune radială
unică Formarea complexului Marcat Cantitativ sau
Radioimunoanaliză
molecule calitativ Imunoanaliză enzimatică
lmmunohistochimie
lmmunoblotting
Secțiunile 7.1/2
1 Care este o caracteristică a producției de anticorpi?
(a) Imunitatea mediată de celule.
(b) Imunitatea umorală.
(c) Limfocitele T.
(d) Limfocite B.
2 Care dintre următoarele descrie o imunoglobulină IgG?
(a) Este un pentamer.
(b) Are două situsuri de legare a antigenului.
(c) Are un RMM de 1,0 X 106 dalton.
(d) Este principala imunoglobulină din sânge.
3 Producerea unui răspuns de anticorpi necesită ca un antigen să fie
preluat de celulele prezentatoare de antigen (APC) pentru a fi
recunoscut de limfocite.
PENTRU CĂ
Limfocitele T sunt principalul grup de celule implicate în imunitatea
mediată celular.
4 Natura unui complex antigen-anticorp depinde mai degrabă de
raportul dintre antigen și anticorp decât de concentrațiile acestora.
PENTRU CĂ
IgM are zece situsuri de legare a antigenului, dar IgG are două.
Multe metode calitative și cantitative pentru antigene solubile se bazează pe

precipitarea acestora cu anticorpi. Este important ca condițiile pentru fiecare
test să fie optimizate cu atenție pentru a obține rezultatul dorit.
7.3.1 lmmunopreclpitare în soluție

Numărul și mărimea complexelor imune formate prin reacția antigenului cu
anticorpul depind de concentrațiile relative ale reactanților (figura 7.5).
Formarea complexelor antigen-anticorp poate fi observată prin măsurarea
absorbției aparente a luminii atunci când lumina incidentă este împrăștiată de
complexe sau prin măsurarea directă a luminii împrăștiate.
Reacția se efectuează într-un exces de anticorp și se prepară o curbă de
calibrare prin măsurarea turbidității unei serii de soluții standard de antigen.
Măsurarea turbidității unei soluții care conține un complex antigen-anticorp, în
care se măsoară cantitatea de lumină incidentă pierdută prin împrăștiere, are
avantajul simplității, dar în general prezintă un nivel scăzut de sensibilitate și
precizie. Metoda poate fi îmbunătățită considerabil prin utilizarea unui
nefelometru în locul unui simplu fotometru. Un nefelometru este similar ca design
cu un fluo rimetru, în sensul că detectorul este plasat în unghiuri drepte față de
fasciculul de lumină incidentă și, astfel, măsoară lumina împrăștiată de complex.
Gradul de împrăștiere a luminii de către o soluție tulbure crește pe măsură ce
lungimea de undă a radiației incidente scade, iar acest lucru, împreună cu cerința
de a minimiza reflexia internă a luminii incidente, a dus la utilizarea din ce în ce
mai frecventă a laserelor ca sursă de lumină.
Imunoprecipitarea este o tehnică extrem de valoroasă, deoarece permite
cuantificarea unei proteine specifice în prezența multor alte proteine similare.
Este capabilă să atingă un nivel bun de sensibilitate, limita inferioară fiind
determinată în principal de claritatea eșantioanelor blanc. Pentru a obține o
sensibilitate maximă, antiserul trebuie să prezinte o aviditate ridicată pentru
antigen și să poată fi utilizat la o concentrație scăzută (titru ridicat), aceasta din
urmă fiind importantă nu numai din punct de vedere al costurilor, ci și pentru a
minimiza turbiditatea datorată reactivilor. În plus, dezvoltarea testelor de
împrăștiere a luminii îmbunătățite cu particule, în care anticorpii sunt
imobilizați pe particule de latex, a depășit multe dintre limitările
imunoprecipitării de bază în ceea ce privește îmbunătățirea sensibilității și a
domeniului de testare. Un avantaj major al imunoprecipitării este faptul că
poate fi ușor automatizată, o caracteristică care a fost exploatată în special cu
ajutorul instrumentelor de analiză centrifugală.
7.3.2 lmmunopreclinarea în geluri

În tehnicile de imunoprecipitare, gelurile sunt utilizate pentru a stabiliza
prec1p1tatul, permițând măsurarea atât a poziției, cât și a suprafeței precipitatului.
S-a subliniat deja faptul că precipitarea maximă are loc atunci când sunt
disponibile proporții echivalente atât de antigen, cât și de anticorp. Prin urmare,
dacă se permite ca o concentrație mare de antigen să difuzeze într-un gel care
conține o concentrație uniformă de anticorpi, la un anumit punct al gradientului de
concentrație de antigen care este
formate, vor exista concentrații optime ale ambilor reactanți și se va forma un

precipitat. Dimensiunile gradientului vor depinde de concentrația inițială a
antigenului și, prin urmare, distanța dintre precipitat și punctul de plecare inițial al
antigenului va fi proporțională cu concentrația inițială a acestuia.
Acest principiu stă la baza imunodifuziunii radiale unice (SRID), o
► Imunodifuzia radială
tehnică dezvoltată pentru prima dată în 1965 de Mancini. SRID presupune
unică (SRID) este o
pipetarea unui volum măsurat de antigen în găuri practicate într-un gel de agar
metodă de
imunoprecipitare tamponat care conține anticorpul. Gelul încărcat este plasat într-o cameră
cantitativă. umedă la temperatura camerei timp de cel puțin 18 ore pentru a permite
tehnică. difuzia. În jurul fiecărei godeuri se formează inele de precipitat (procedura
7.1), precipitat care este maxim la periferie și mai puțin la periferie.
Procedura 7.1: Cuantificarea albmninei prin imunodifuzie radială unică

Reactivi
Gel de agar care conține 10% (v/v) de anticorp policlonal împotriva albuminei umane.
Soluții standard de album.in uman cu concentrații cuprinse între 10 și 100 mg 1~1 -
Metoda
În gel au fost decupate puțuri mici.
Volumele de IO µJ de soluții de albumină au fost pipetate în
godeuri. Se lasă să stea la 4 °C timp de 24 h. --
Zonele de precipitații au fost măsurate în două direcții în unghiuri drepte.
Rezultate
---
intensă spre fântână. Timpul necesar pentru ca probele care conțin o

concentrație mare de antigen să ajungă în zona de echivalență va fi mai mare
decât în cazul concentrațiilor mai mici de antigen și, prin urmare, diametrul
inelelor formate va fi mai mare. Natura radială a difuziei este de așa natură
încât diametrul inelului de precipitare va fi legat de concentrația de antigen.
În practică, se măsoară diametrul inelului ș i o reprezentare a pătratului
diametrului în funcție de concentrație dă, în general, o relație rectilinie
(procedura 7.1). Se fac două măsurători ale diametrului în unghiuri drepte
pentru a se ține seama de eventualele mici neregularități în forma inelelor.
Tehnicile SRID oferă metode utile și specifice pentru cuantificarea
proteinelor individuale. Limita de sensibilitate este de aproximativ 5 mg 1-1 și
depinde de capacitatea de a detecta și măsura inele de precipitare foarte mici.
Concentrația de
anticorpul din gel trebuie selectat cu atenție; reducerea cantității de anticorp

din gel va crește dimensiunea medie a inelului, dar va avea ca rezultat o
cantitate mai mică de precipitat și trebuie făcut un compromis între diametrul
inelului și intensitatea precipitatului. Vizualizarea precipitatului poate fi
îmbunătățită prin colorarea proteinei cu un colorant adecvat.
Unul dintre dezavantajele SRID este timpul necesar pentru ca reacția să
aibă loc. Laurell, în 1966, a încercat să depășească această dificultate folosind
electroforeza mai degrabă decât difuzia pentru a produce gradientul de
concentrație. În electroimunoanaliză, anticorpul este încorporat în gel într-un
mod similar cu SRID. Electroforeza se realizează de obicei la pH 8,6, condiții
în care anticorpii nu migrează semnificativ, dar proteinele de testat migrează.
Deoarece probele sunt împinse spre zona de echivalență prin electroforeză
mai degrabă decât prin difuzie, liniile de precipitare apar în mod caracteristic
ca vârfuri sau "rachete" pe gel (figura 7.6). O curbă de calibrare pentru
cuantificarea probelor necunoscute se construiește prin reprezentarea înălțimii
vârfului în funcție de concentrația de antigen.
Figura 7.6 Electroforeza rachetei. La pH 8,6, majoritatea proteinelor se deplasează

spre anod și are loc precipitarea în cazul în care antigenul și anticorpul (în gel) se află
în proporții egale. Dimensiunea modelului de precipitat în formă de "rachetă" rezultat
este proporțională cu concentrația inițială de antigen. Imunoglobulinele prezintă o
mobilitate electroforetică foarte mică la pH 8,6 și, prin urmare, rămân în gel în timpul
procesului.
Deși sistemele tampon sunt concepute pentru a restricționa migrarea

anticorpilor în timpul electroforezei, imunoglobulinele pot fi măsurate prin
această tehnică dacă sunt mai întâi carbamilate sau formilate. Aceste
proceduri sunt concepute pentru a mări caracterul ionic al imunoglobulinelor
fără a le modifica semnificativ proprietățile imunologice. Carbamilarea
implică o reacție cu cianat de potasiu, iar formilarea o reacție cu
formaldehidă.
Aceste tehnici se remarcă prin faptul că se bazează pe difuzarea unei
singure componente a reacției antigen-anticorp; în tehnica de
difuzie dublă, atât antigenul, cât și anticorpul sunt plasate în godeuri și se

lasă să se difuzeze. Precipitarea are loc, de asemenea, la punctul de
echivalență, dar în acest caz precipitarea se prezintă sub forma unei linii
sau a unui arc în gel. Poziția liniei este caracteristică antigenului și
permite identificarea acestuia într-un amestec com plex de proteine
similare (figura 7.7). A fost dezvoltată o varietate de tehnici calitative
similare (imunoelectroforeză, imunoelectroforeză încrucișată).
IgG Transferrină și IgG

uman IgG oatigG
\.2)-Anti-lgG Anti-umane - Anti-uman

ser IgG
Identitate Non- Identitate parțială
identitate
Figura 7.7 Dubla difuzie în geluri, cu prezentarea reacțiilor de identitate,

neidentitate și identitate parțială.
7.3.3 lmmunohistochemlstry
Specificitatea anticorpilor poate fi exploatată pentru a cerceta organizarea in
situ a celulelor și țesuturilor. Antigenele celulare pot fi identificate atât în
celule viabile, cât și în secțiuni de țesut congelate sau fixate. Anticorpii sunt
utilizați pentru a identifica antigenul corespunzător în secțiune și apoi poziția
acestui anticorp primar poate fi detectată fie direct, dacă a fost marcat inițial,
fie indirect, utilizând un alt anticorp secundar sau o moleculă secundară care
să se atașeze la anticorp (figura 7.8). Probele trebuie să fie spălate cu grijă
după adăugarea anticorpului primar sau marcat pentru a preveni orice reacție
nespecifică. Printre etichetele care au fost legate cu succes de anticorpi se
numără următoarele:
l. Coloranți fluorescenți. Imunofluorescența folosind fluoresceină sau
rodarnină a fost utilizată cu succes pentru imunohistochimie.
Fluoresceina, atunci când este iluminată cu lumină UV, emite o
fluorescență verde caracteristică, în timp ce rodarnina dă o culoare
portocalie.
2. Enzime. Enzimele sunt și ele etichete utile și au fost folosite mai multe,
peroxidaza și fosfataza alcalină fiind cele mai populare până în prezent. O
caracteristică importantă a acestei tehnici este că enzima trebuie să fie
capabilă să transforme un substrat solubil într-un produs insolubil pentru a
localiza antigenul în mod corespunzător. Sunt disponibile mai multe
substraturi adecvate, 3'3'-diaminobenzidină (DAB) și 3-amino-9-
etilcarbazol (AEC) fiind utilizate cu peroxidaza și 5-bromo-4-cloro-3-
indoilfosfat/nitro-bleu tetrazoliu (BCIP/NBT) cu fosfataza alcalină.
3. Aur coloidal. Aceasta este o etichetă utilă atât pentru metodele de colorare
directă, cât și pentru cele indirecte, deoarece nu necesită adăugarea de alți
reactivi. Sondele de aur pot fi observate cu ușurință prin microscopie
optică atunci când sunt cuplate cu un accesoriu de argint și, în plus, fiind
dense din punct de vedere electronic, oferă o sensibilitate excelentă pentru
microscopul electronic.
Cheie
A Tehnica directă
* Etichetă
;\ Anticorp
Tehnica indirectă
?□ Antigen
Streptavidină
• Biotină
Tehnica biotină/avidină
Figura 7.8 Câteva exemple de tehnici de detectare a anticorpilor. (a) marcarea

directă a anticorpului primar, (b) indirectă cu ajutorul anticorpului secundar marcat, (c)
indirectă cu ajutorul anticorpului secundar biotinilat și al streptavidinei marcate.
7.3.4 lmmunoblotting
Anticorpii pot fi, de asemenea, utilizați pentru a determina prezența sau
identitatea antigenelor solubile printr-un procedeu cunoscut în general sub
numele de imrnunoblotting. Într-o tehnică cunoscută sub numele de "dot
blotting", antigenele solubile sunt aplicate pe o membrană de nitroceluloză
sub formă de "puncte", anticorpul este apoi aplicat pe membrană, membrana
este spălată pentru a îndepărta anticorpul nelegat, iar prezența sau absența
antigenului este determinată prin mijloace similare cu cele utilizate în timpul
,...:,, t:11 $': imrnunohistochimiei.
Alternativ, ca în cazul Western blotting (figura 7.9), antigenele solubile
vezi je :1:l . t ii pot fi separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă, fie cu sau fără
tratament prealabil cu SDS. După electroforeză, antigenele sunt transferate de
pe gel pe o membrană de nitroceluloză. După ce se află pe membrană,
anticorpii pot fi utilizați pentru a detecta prezența anumitor antigene, fie
direct, fie indirect, ca în imunohistochimie. Locurile de legare nespecifice pot
fi "blocate" cu ajutorul altor proteine nespecifice, cum ar fi seroalbumina
bovină sau cazeina, înainte de spălare pentru a îndepărta anticorpul nelegat.
Molecula marcată poate fi vizualizată prin tehnicile utilizate pentru
imrnunohistochimie sau prin autoradiografie.
Electroforeză Transfer de blot Adăugarea de

anticorp primar
Blocare și Adăugarea de anticorp

spălare secundar marcat cu
enzime
Detecție cu substrat
Figura 7.9 Imunoblotting. O reprezentare a etapelor tehnicii.
Secțiunea 7.3
1 Care dintre următoarele tehnici sunt cantitative?
(a) Imunodifuzie radială unică (SRID).
(b) Imunoelectroforeza cu rachetă Laurell.
(c) Imunohistochimie.
(d) lmmunoblotting.
2 Care dintre următoarele tehnici necesită un anticorp marcat?
(a) Imunodifuzie radială unică (SRID).
(b) Imunoelectroforeza Lauren rocket.
(c) Imunohistochimie.
(d) lmmunoblotting.
3 Tehnicile de dublă imunodifuzie permit cuantificarea unei proteine
în prezența altor proteine.
PENTRU CĂ
poziția liniei de precipitare în cazul unei duble imunodifuziuni este
caracteristică antigenului.
4 În imunoelectroforeza cu racheta Lauren, înălțimea rachetei este
proporțională cu concentrația antigenului
PENTRU CĂ
în imunoelectroforeza Lauren rocket, mișcarea moleculelor mari este
întârziată de structura gelului.
Imunodozarea ca tehnică analitică a fost introdusă de Rosalind Yalow și

Solomon Berson în 1960, odată cu utilizarea anticorpilor anti-insulină pentru
a măsura concentrația hormonului în plasmă. Acest progres, pentru care
Rosalind Yalow a primit premiul Nobel, a fost probabil cel mai important
progres individual în domeniul măsurătorilor biologice din următoarele două
decenii. În prezent, se pot găsi exemple de utilizare a imunodozării în aproape
toate domeniile biochimiei analitice.
În ciuda numeroaselor evoluții noi în proiectarea imunoenzimelor,
principiile se limitează la două abordări generale: cele care se bazează pe
concurența dintre antigene marcate cu o moleculă care poate fi ușor observată
(de exemplu, un radioizotop) și antigene neomarcate pentru un număr limitat
de situsuri de legare a anticorpilor; și cele în care anticorpul este disponibil în
exces și pentru care nu există concurență pentru situsurile de legare.
Aceste principii au fost exploatate de producătorii comerciali pentru a
furniza "truse", care sunt pachete de agenți, concepute pentru a analiza probe
pentru o mare varietate de analiți. Exploatarea comercială a tehnologiei de
imunoanaliză și dezvoltarea simultană a unor instrumente automate adecvate
au avut un efect profund asupra analizei probelor biologice. Kiturile pot oferi
o gamă largă de teste, oferind o tehnologie complexă și reactivi consecvenți,
permițând chiar și laboratoarelor mici să efectueze o gamă completă de
analize.
7.4.1 Imunoanaliză cu legare competitivă

Baza acestei tehnici constă în competiția dintre antigenul testat și un antigen
marcat pentru situsurile de legare disponibile pe o cantitate fixă de anticorp. În
timp ce situsurile de legare sunt asociate în mod tradițional cu un anticorp,
orice sursă de situsuri de legare reversibile specifice poate fi utilizată pentru a
crea un test în acest format. Exemple sunt proteinele de transport specifice,
cum ar fi glob ulinul de legare a tiroxinei și anumiți receptori celulari, cum ar fi
receptorii de opiacee sau de benzodiazepină. În aceste condiții, amestecul de
echilibru poate fi reprezentat astfel:
Ag Ag [Ab]
+ [Ab]
[Ag*] Ag* [Ab]

Având în vedere că cantitățile de antigen marcat [Ag*] și de anticorp

[Ab] sunt fixate atunci când nu este prezent niciun antigen de testare
neetichetat (Ag), atunci antigenul marcat are acces liber la situsurile de legare,
iar starea de echilibru ulterioară va reprezenta cantitatea maximă de antigen
marcat care poate fi legat. În cazul în care sunt prezenți antigeni de testare
neetichetați, va exista o concurență între antigenii marcați și cei neetichetați
pentru situsurile de legare disponibile, astfel încât, la echilibru, cantitatea de
antigeni marcați legați va fi redusă cu o cantitate proporțională cu cantitatea
de antigeni neetichetați din sistem. Concentrația de antigene din probele
necunoscute poate fi determinată prin compararea proporției de antigene
marcate legate cu proporția de antigene legate atunci când se utilizează o serie
de standarde cu concentrație cunoscută de antigen.
7.4.2 Imunoanaliză necompetitivă sau imunometrică

Această abordare a imunoanalizării se caracterizează prin faptul că
anticorpul este prezent în exces și este, în general, și marcat. Deoarece
anticorpul marcat este în exces, nu este necesar să se stabilească un
echilibru, deoarece tot antigenul de testat poate fi sechestrat de excesul de
anticorp.
Ag + Ab*◄- - - - - - - - - - - - - - - -►AgAb* + Ab*
În testele imrnunometrice, spre deosebire de sistemele competitive,
cantitatea de anticorp marcat legat este direct proporțională cu cantitatea de
antigen nelansat prezentă și nu invers proporțională.
Pentru fiecare dintre aceste tipuri de imunoanaliză, pentru a observa
raportul dintre substanța legată și cea liberă în amestecul final de reacție,
trebuie utilizată o metodă care să separe aceste fracțiuni și au fost concepute
diferite metode ingenioase pentru a face acest lucru. Tehnicile care necesită
separarea fracțiilor libere de cele legate sunt denumite sisteme de testare
eterogene.
7.4.3 Componente ale sistemelor de imunoanaliză
Anticorpul
Proprietățile anticorpilor utilizați într-un imunoanalizator vor defini în mare
măsură utilitatea acestuia ca tehnică analitică. Atât anticorpii policlonali, cât
și cei monoclonali au fost utilizați în imunoanalize.
Este esențial să se determine concentrația optimă de anticorpi necesară
atunci când se utilizează un test competitiv. Prin convenție, aceasta este
diluția de antiser care va lega 50% din antigenul marcat în absența antigenului
neetichetat (figura 7.10), deși această convenție nu are o bază teoretică solidă
și mulți lucrători îi pun la îndoială validitatea. Această diluție a antiserului
este cunoscută sub numele de titlu, dar aceasta este o unitate de măsură
indirectă, deoarece într-un antiser polichinelos nu este în general posibil să se
determine masa de imunoglobulină implicată în antigen. Figura 7.10
ilustrează, de asemenea, efectul pe care scăderea masei de antigen marcat îl
are asupra evaluării titrului.
Odată ce se cunoaște titlul unui antiser, se poate evalua specificitatea
acestuia.
Procentul lOO
obligatoriu
80
60
40
20
D
'
0
5 20 80 320 1,280
Diluție de antiserum x 103
Curbă Cantitatea de antigen de referință etichetat (pg)
A 200
B 100
C 50
Figura 7.10
D 12.5
Radioimunodozare a
insulinei - titrare a Din fiecare curbă se poate determina diluția de antiserum care
antiserului. asigură legarea a 50% din cantitatea de antigen marcat.
În cazul în care un anticorp recunoaște molecule înrudite, se spune că acestea

reacționează încrucișat, iar astfel de anticorpi sunt susceptibili de a fi nepotriviți
pentru anumite teste. De exemplu, în cazul în care se fac măsurători ale unui
anumit medicament, metaboliții medicamentului care au structuri siJni lar pot
reacționa, de asemenea, cu anticorpul. Gradul de reactivitate încrucișată poate fi
evaluat prin compararea concentrației la care se obține o deplasare de 50% a
compusului înrudit cu cea necesară pentru antigen (figura 7.11).
Tabelul 7.3 Moleculele detectoare utilizate în mod obișnuit în imunoanaliză
Sistem de detectare Exemplu
Radioizotopi Iod-125, carbon-14, tritiu

Enzime Peroxidază de hrean, fosfatază
alcalină,
/3-galactosidază
Chemiluminiscență Luminol, esteri de acridiniu,
adamantil dioxetan
Bioluminescență Luciferază/luciferină
Fluorescență Fluoresceină, rodamina,
chelați de europiu
100
c
"
'" i'"
"tl
c
::,
..8,
"" 50
.,
.i::,!
0..
O ----.-------,-------,-------,r----
-- -
10 100
Cantitatea de antigen adăugat (concentrație logaritmică)
Figura 7.11 Reactivitate încrucișată. Compusul B deplasează 50% din marker la o

concentrație de 100 de ori mai mare decât compusul A și se spune că are o reactivitate
încrucișată de 1%.
Eticheta
Imunoanalizele necesită o probă pură de anticorp sau de antigen pentru a fi
marcată cu o moleculă adecvată. O astfel de moleculă ar trebui să păstreze o
eficiență ridicată a semnalului (adică să fie ușor de detectat la o concentrație
scăzută), în timp ce încorporarea sa în antigen sau anticorp nu ar trebui să
aibă niciun efect asupra imunoreactivității ulterioare a acestora.
Alegerea etichetei este importantă, iar cele mai frecvente sunt enumerate în
tabelul 7.3.
Radioizotopi
Cei mai frecvent utilizați izotopi sunt carbonul-14, tritiul (hidrogen-3) și
iodul-125. Carbonul-14 și tritiul sunt amândoi izotopi emițători de radiații
beta, în timp ce iodul-125 emite atât particule beta, cât și radiații gamma.
Carbonul-14 și tri tiul sunt exemple de mărci interne, deoarece atomul
radioactiv înlocuiește un atom existent în antigen, în timp ce iodul-125 este
descris ca o marcă externă, deoarece de obicei este necesară atașarea
covalentă a iodului la antigen. Există avantaje și dezavantaje pentru fiecare
dintre aceste etichete.
Carbonul-14 și tritiul care emit beta au avantajul că forma marcată a
moleculelor este identică cu antigenul neetichetat, dar prezintă dezavantajul
că eficiența măsurării emisiei beta, care utilizează tehnica de numărare prin
scintilație, este mai mică decât cea a emisiilor gamma asociate cu iodul-125.
În egală măsură, iodul-125 suferă de problema că atașarea covalentă a
izotopului la antigen înseamnă adesea că există o diferență structurală
semnificativă între antigenul nelansat și cel marcat. Cu toate acestea, câștigul
în măsurarea semnalului față de pierderea potențială de imunoreactivitate este
suficient pentru ca iodul-125
un izotop ales pentru sistemele de imunoanaliză. Iodul poate fi ușor substituit

pe lanțul lateral aromatic al aminoacidului tirozină prin oxidare ușoară cu
ajutorul unei varietăți de agenți; clorarnina T, enzima lactoperoxidază (EC
1.11.1.7) și agentul "iodogen" (1,3,4,6-tetraclor-3,6-difenil-glicouril), puțin
solubil, au fost utilizați cu succes pentru a obține un marker stabil și eficient.
În aplicațiile în care nu este disponibil un reziduu de tirozină adecvat, se poate
utiliza o moleculă purtătoare care conține atât o grupare fenol sau imidazol
adecvată pentru iodare, cât și o grupare amină adecvată pentru cuplarea cu o
grupare carboxilat de pe antigen.
După iodare, marcajul este de obicei purificat pentru a elimina
antigenul deteriorat și iodul care nu a reacționat, iar acest lucru poate fi
realizat în mod convenabil folosind fie cromatografia cu permeabilitate în gel,
fie HPLC.
Enzime
Marcajele enzimatice sunt de obicei asociate cu anticorpi în fază solidă în
tehnica cunoscută sub numele de testul imunoenzimatic (ELISA). Există mai
multe variante ale acestei tehnici care utilizează atât sisteme competitive, cât
și necompetitive. Cu toate acestea, cel mai bine se utilizează în combinație cu
doi anticorpi monoclonali în formatul "two-site", în care un exces de anticorp
este legat de o fază solidă, cum ar fi un tub de testare sau o placă de
microtitrare; apoi se adaugă antigenul de testat, care este în mare parte
sechestrat de anticorp (figura 7.12). După spălare
LJ
1. Atașarea anticorpului la faza solidă
. ..
2. Spălați
3. Se incubează cu proba care conține antigen
,g
4. Spălați
:1
w
5. Se incubează cu conjugatul anticorp-enzimă
6. Spălaț
i
..- 0 -.--
Se incubează cu enzima bstrat și măsurat produsul
Figura 7.12 7. su E
Testul cu două situsuri
care utilizează doi
anticorpi monoclonali
direcționați împotriva a
doi epitopi distincți.
pentru a îndepărta materialul biologic rămas, se adaugă un al doilea anticorp

monoclonal, marcat enzimatic, care recunoaște un epitop diferit pe antigen (al
doilea situs), plasând astfel antigenul între anticorpul marcat enzimatic și
anticorpul în fază solidă. Excesul de enzimă-anticorp se îndepărtează prin
spălare înainte de adăugarea unui substrat adecvat și de dezvoltarea unei
culori care se măsoară fie pe cale cinetică, fie ca reacție de sfârșit de reacție.
Printre enzimele utilizate în mod obișnuit ca etichete se numără
fosfataza alcalină (EC 3.1.3.1), peroxidaza de hrean (EC 1.11.1.7) și beta-
galactozidază (EC 3.2.1.23). Enzimele utilizate trebuie să poată fi legate
covalent de antigen sau de anticorp fără pierderea activității catalitice sau a
imuno-reactivității. Glutaraldehida poate fi utilizată ca agent de legătură, în
timp ce enzimele glicoproteice, cum ar fi peroxidaza, pot fi legate prin
intermediul grupului de carbohidrați cu ajutorul acidului periodic pentru a
forma un grup aldehidic reactiv.
Alegerea enzimei este guvernată de disponibilitatea substratului și de
tipul de detector. Au fost dezvoltate mai multe substraturi pentru a fi utilizate
cu peroxidaza de hrean: o-fenilen diarnină (OPD), 2,2-azino-di(3-etilbenzo-
tiazolină-6-sulfonat) (ABTS) și 5,5'-tetrametilbenzidină hidrochlo ride
(TMB).
De asemenea, se pot folosi enzime pentru a amplifica semnalul de la
etichetă, utilizând sisteme de ciclism. Amplificarea semnalului de la marker
are potențialul de a crește sensibilitatea sistemului de imunoanaliză.
Etichete luminescente
Există mai multe tipuri diferite de luminescență care diferă doar prin sursa de
energie utilizată pentru a excita moleculele la o stare energetică superioară;
radioluminescența apare atunci când energia este furnizată de particule de
înaltă energie; în cazul chimiluminescenței, energia este derivată dintr-o
reacție chimică; în cazul bioluminescenței, excitarea este realizată de o
moleculă biologică, cum ar fi o enzimă; iar în cazul fluo rescenței sau
fotoluminescenței, excitarea este derivată din energia luminii. Fiecare dintre
acestea a fost utilizată cu succes ca sistem de marcare pentru imunoanaliză.
În imunoanalizația prin chemiluminescență, antigenul este marcat cu o
moleculă, cum ar fi luminolul sau un ester de acridiniu, care emite lumină cu
un randament cantitativ ridicat la oxidare. Alternativ, antigenul poate fi
marcat cu o moleculă bio-luminescentă, cum ar fi luciferina, care emite
lumină atunci când este oxidată de enzima luciferază.
Au fost dezvoltate imunoanalize de succes folosind markere
fotoluminescente precum fluoresceina și rodarnina, dar există dezavantaje
semnificative în utilizarea acestor compuși. Un semnal de fond poate fi
generat de substanțele com pounds prezente în probă, care la rândul lor sunt
fluorescente atunci când sunt excitate de lumina cu aceeași lungime de undă
ca și fluoroforul utilizat ca marker. În plus, multe molecule biologice vor
acționa pentru a diminua lumina emisă prin absorbția energiei, un proces
cunoscut sub numele de stingere. Moleculele biologice pot, de asemenea, să
împrăștie energia luminii excitante astfel încât să reducă eficiența excitării.
Fiecare dintre aceste efecte a contribuit la utilitatea limitată a etichetelor
fluorescente în imunoanalize.
Problema fluorescenței de fond a fost în mare parte depășită odată cu
introducerea fluorimetriei cu rezoluție în timp. Această tehnică se bazează pe
utilizarea de fluorofori cu o fluorescență de lungă durată care poate fi
măsurată
după ce fluorescența de fond a scăzut. Timpul obișnuit de dezintegrare a
fluorescenței de fond este de aproximativ 10 ns, în timp ce timpul de
dezintegrare al fluoroforilor cu durată de viață lungă, cum ar fi chelații
metalului lantanid europiu, este de ordinul a 103-106 ns (figura 7.13). În loc
de excitarea continuă a fluoroforului, lumina de excitație este pulsată și se fac
citiri după ce emisiile de fond au scăzut. Odată ce s-a efectuat o măsurătoare,
fluoroforul este din nou pulsat, permițând acumularea semnalului de la
etichetă. S-a demonstrat că testele bazate pe acest principiu sunt la fel de
precise și de sensibile ca și testele radioizotopice.
Timp (ns)
1 - Fluorescența de fond
2 - Fluorescența chelaților de europiu
Figura 7.13 Curba de descreștere pentru chelații de europiu care arată timpul de
citire după descreșterea fluorescenței de fond.
Materiale standard
Cuantificarea antigenului se va baza în cele din urmă pe compararea
răspunsurilor antigenului testat cu cele ale unei serii de soluții standard, iar
tipul de soluție standard va depinde de natura testului. Matricea soluției
standard ar trebui să semene cât mai mult cu matricea probei (sânge, urină,
salivă etc.) și, bineînțeles, să fie lipsită de antigen. Acest lucru poate fi dificil
de realizat în practică și ar trebui să se utilizeze numai furnizori de renume.
Odată ce reactivii de testare au fost optimizați, se poate pregăti o curbă
standard. Se obișnuiește să se exprime legarea antigenului marcat ca procent
din legarea etalonului zero (B!B0 ), deși acest lucru nu este în niciun caz
1111

înseamnă singura modalitate de exprimare a rezultatului final. Răspunsurile

eșantioanelor necunoscute pot fi acum notate pe curbă, iar concentrațiile lor
pot fi citite în mod convenabil (figura 7.14).
100
ij
'C
C
C
6
50
C
Figura 7.14
Curbă standard tipică 10 50 100 µU/mJ-1
pentru testul competitiv de Log
(insulină)
insulină.
Separarea antigenului legat de antigenul liber

Întreaga bază cantitativă a imunoanalizei competitive eterogene se bazează pe
separarea fizică a fracțiunilor legate și a fracțiunilor libere pentru a putea
evalua proporțiile relative ale fiecărei fracțiuni. Deoarece componentele se
află în soluție, au fost dezvoltate o varietate de tehnici pentru a le separa
(tabelul 7.4).
Unele tehnici de separare se bazează pe îndepărtarea fizică a uneia
dintre fracțiuni: cărbunele va adsorbi puternic fracțiunea liberă, permițând
îndepărtarea rapidă a acesteia prin centrifugare; adăugarea de dextran reduce
tendința cărbunelui de a "desprinde" antigenul legat de complex; alternativ,
fracțiunea legată poate fi precipitată prin adăugarea unor concentrații adecvate
de precipitanți proteici diverși, cum ar fi alcoolul, sulfatul de amoniu și
polietilenglicolul (PEG).
Printre alte tehnici se numără cele care implică imunoprecipitarea
fracțiunii legate cu ajutorul unui al doilea anticorp, care reacționează cu
proteinele primului anticorp. Acest al doilea anticorp poate fi produs prin
imunizare:
Tabelul 7.4 Tehnici utilizate pentru separarea fracțiunilor legate și libere

în imunoanaliză
Principiul Exemplu
Adsorbția fracției libere Cărbune acoperit cu dextran

Precipitarea fracției legate Etanol, sulfat de amoniu, PEG
Imunologic Utilizarea unui al doilea anticorp
îndreptat împotriva speciei de
Faza solidă anticorpi primari Utilizarea
anticorpilor cuplați la plastic; tuburi,
bile, microplăci
Utilizarea anticorpilor cuplați la
Legare specifică particule magnetice
Utilizarea altor proprietăți de legare
specifice; proteina stafilococică A,
avidină-biotină
imunoglobulinele din specia în care au fost crescuți anticorpii primari sunt

injectate într-o altă specie. O astfel de procedură de separare se numește
deseori tehnică cu anticorpi dubli. Concentrația celui de-al doilea anticorp este
ajustată astfel încât fracțiunea legată solubilă să fie transformată într-o matrice
insolubilă care poate fi ușor separată de antigenul liber prin centrifugare. Este
posibil să se accelereze formarea matricei insolubile prin adăugarea celui de-
al doilea anticorp în combinație cu un precipitant proteic, cum ar fi
polietilenglicol sau sulfat de amoniu (tehnica celui de-al doilea anticorp
asistat).
Au fost dezvoltate multe sisteme în fază solidă în care fie anticorpul primar,
fie cel secundar este imobilizat pe suprafețe, cum ar fi materialele plastice.
Anticorpii pot fi fixați pe suprafețele din plastic atât prin simplă adsorbție la un
pH ridicat, cât și prin legare covalentă. Au fost utilizate diferite formate, cum ar fi
tuburi, bile sau plăci de microtitrare. Odată atins echilibrul, fracțiunea legată este
îndepărtată din cea liberă prin simpla decantare a conținutului tubului, lăsând
antigenul legat atașat la faza solidă. O nouă utilizare a acestei idei este atașarea
anticorpilor la particule magnetizabile care, odată ce reacția este completă,
permite separarea simplă a fracțiunilor legate de cele libere prin plasarea tuburilor
deasupra unui câmp magnetic puternic. Atunci când particulele au migrat spre
fundul tubului, fracția liberă poate fi decantată sau aspirată departe de particule.
Alte substanțe care prezintă o legătură specifică pot fi utilizate pentru a
separa fracțiunile libere de cele legate: atunci când sunt atașate la o fază
solidă, se poate utiliza capacitatea proteinei stafilococice A de a se lega de
fragmentul FC al anumitor izotipuri de lgG; se poate folosi, de asemenea,
legătura puternică a vitaminei biotină cu avidina tetravalentă. Biotina poate fi
ușor încorporată în moleculele de anticorpi, iar aceste molecule pot fi ulterior
captate de o fază solidă de avidină. Alternativ, avidina poate fi utilizată pentru
a asigura o legătură între un anticorp biotinilat și o fază solidă biotinilată.
7.4.4 Teste omogene

Testele omogene nu necesită nicio etapă de separare pentru a observa raportul
dintre antigenul marcat și neomarcat și anticorpul.
Cel mai comun dintre aceste sisteme este tehnica de imunoanaliză cu

enzimă multiplicată sau EMIT, care este deosebit de potrivită pentru
măsurarea moleculelor mici (hapteni), cum ar fi medicamentele. EMIT este o
marcă comercială a Syva Corporation din Palo Alto, California. Deși nu
implică separarea fracțiunii legate de cea liberă, este totuși un sistem de
testare competitiv. Antigenul este marcat cu o enzimă în așa fel încât enzima
își păstrează activitatea catalitică. Atunci când antigenul se leagă de anticorp,
enzima este inhibată, probabil printr-o modificare conformațională indusă sau
prin împiedicarea sterică a situsului activ al enzimei (figura 7.15).
Test + Enzime- + Anticorp Complexe antigen-anticorp antigen

marcat
antigen
cJ +?fj
♦ +
t +
j
i
The
enzima
The
enzimă
este este
activ SUBSTRATE inactiv
și și
de aici de aici
'
PRODUS
'
NU PRODUS
Figura 7.15 Imunoanaliză enzimatică multiplicată (EMIT). Cei trei reactanți,

antigenul de test (sau standard), antigenul marcat enzimatic și o cantitate limitată de
anticorp, sunt lăsați să reacționeze și să atingă o poziție de echilibru. Antigenul marcat
nelegat care rămâne este singura sursă de activitate enzimatică, enzima legată fiind
inactivată. Această enzimă liberă poate fi cuantificată prin intermediul unei metode de
analiză cinetică directă și este proporțională cu cantitatea de antigen nelansat prezentă
inițial.
Această inhibiție va fi redusă de prezența antigenului liber în proba de

test care concurează pentru situsurile de legare a anticorpilor. Cu cât este mai
mult antigen care este trimis în prealabil, cu atât mai multă activitate este
reținută și cu atât mai mult produs colorat poate fi format. Răspunsurile
necunoscutei sunt comparate cu răspunsurile unor doze standard de antigen.
În acest scop au fost utilizate enzimele lizozimă (EC 3.2.1.1.l 7), malat
dehidrogenază (EC 1.1.1.37) și glucoză-6-fosfat dehidrogenază (EC 1.1.1.49).
Enzimele dehidrogenazei sunt deosebit de utile, datorită ușurinței
suplimentare de măsurare a activității lor prin monitorizarea absorbției NADH
la 340 nm.
Au fost dezvoltate și alte teste omogene de succes, cum ar fi tehnica de
polarizare a fluorescenței, pusă la dispoziție de Abbott Laboratories din North
Chicago, SUA. Această tehnică de imunodozare competitivă se bazează pe
principiul
că, în soluție, moleculele mici se rotesc, în general, mai repede decât moleculele
mai mari. Eticheta haptenului este fluorescentă și excitată de lumina polarizată
plană. Dacă eticheta haptenului nu este legată, atunci, în timpul dintre excitare și
emisie, molecula s-a rotit suficient pentru a modifica planul luminii polarizate. În
cazul în care markerul hapten este legat, complexul mai mare nu se rotește
suficient de mult în timpul excitării și emisiei pentru a modifica planul luminii
polarizate, iar emisia poate fi măsurată. Astfel, gradul de legare a haptenului
marcat poate fi determinat fără a separa fracțiunile legate și libere. Această tehnică
este deosebit de potrivită pentru măsurarea moleculelor mici, cum ar fi
medicamentele administrate în scop terapeutic.
7.4.5 Dispozitive de imunoanaliză pe bază de membrană

Un progres deosebit de interesant în tehnologia de imunoanaliză a fost dezvoltarea
unor dispozitive noi care conțin toți reactivii necesari, de obicei sub formă uscată.
Multe dintre aceste dispozitive sunt concepute pentru testarea "la punctul de
utilizare" și sunt de natură calitativă, fiind de obicei evaluate vizual. Domeniile
acoperite includ testele de sarcină, medicamente, antigene microbiologice și
molecule de mediu, cum ar fi pes ticidele și antibioticele. Cu toate acestea, un
număr semnificativ de teste sunt de tip cantitativ și implică instrumente
specializate, unele concepute pentru a fi portabile. Aceste dispozitive de
imunodozare sunt direct comparabile cu sistemele de chimie uscată descrise
anterior.
Dispozitivele conțin, de obicei, anticorpi imobilizați pe o suprafață de
membrană deasupra unui filtru și a unui tampon absorbant (figura 7.16). Proba
este plasată în dispozitiv și trece prin membrană în tamponul absorbant. În
cazul în care analitul este trimis în prealabil în probă, acesta este sechestrat de
anticorpul de pe membrană și este apoi vizualizat prin adăugarea unui al doilea
anticorp marcat. Al doilea anticorp marcat care nu este legat de analit trece, de
asemenea, în tamponul absorbant, uneori cu ajutorul unei soluții de spălare.
Molecula marcată poate fi o enzimă, ceea ce ar necesita adăugarea unui
substrat adecvat, sau un marker, cum ar fi aurul coloidal, care are virtutea de a
fi vizibil fără ajutorul unui al doilea reactiv.
Capacul
Anticorp legat de
membrană
Hârtie de filtru
Tampon de
bumbac
Farfurie
Figura 7.16 Dispozitiv pe bază de membrană. Anticorpul este legat de membrană și

elimină orice antigen de test pe măsură ce proba este aspirată în tamponul absorbant. Se
aplică apoi un al doilea anticorp marcat și, dacă antigenul este prins în membrană, acest al
doilea antigen va fi, de asemenea, reținut în membrană și poate fi demonstrat prin
intermediul etichetei.
Acest tip de abordare este, în esență, necompetitivă și necesită, de obicei,

utilizarea a doi anticorpi monoclonali direcționați împotriva a doi epitopi distincți
de pe analit. Alte dispozitive au utilizat un sistem competitiv în două etape, în
care analitul și analitul marcat concurează pentru anticorp într-o parte a
dispozitivului. Aceasta este urmată de transferul amestecului de echilibru într-o
parte separată a dispozitivului, unde anticorpul imobilizat pe membrană elimină
materialul marcat nelegat și permite ca cel legat să treacă prin membrană în
tamponul absorbant.
Secțiunea 7.4
1 Care dintre următoarele tehnici de imunoanaliză sunt de natură
competitivă?
(a) Radioimunoanaliză (RIA).
(b) Testul imunoenzimatic de imunoabsorbție (ELISA).
(c) Imunoanaliză enzimatică multiplicată (EMIT).
(d) Imunoanaliză de polarizare în fluorescență (FPIA).
2 Separarea antigenului liber de antigenul legat se realizează în diferite
imunoanalize prin care dintre următoarele tehnici?
(a) Adsorbția antigenului liber.
(b) lmmunoprecipitarea antigenului liber.
(c) Cromatografie de aminoaciditate.
(d) Al doilea anticorp imobilizat.
3 Imunoanalizele cu legare competitivă necesită o probă pură, marcată a
antigenului.
PENTRU CĂ
Baza legării competitive în cadrul irnmunoanalizelor constă în
competiția dintre anticorp și markerul liber pentru antigenul neetichetat.
4 Prezența unui antigen cu reacție încrucișată într-o probă va duce la
valori de testare fals crescute atunci când se utilizează
imunoanalize cu legare competitivă.
PENTRU CĂ
un antigen cu reacție încrucișată va concura cu antigenul de test pentru
eticheta disponibilă.
Kirkwood, E. și Lewis, C.J. (1991) Understanding medical immunology, ediția a 2-a,

Wiley-Liss, SUA.
Coleman, R.M. (l 992) Fundamental _immunology, ediția a 2-a, William C. Brown Co.,
SUA.
Clausen, J. (1989) Tehnici imunologice pentru identificarea și estimarea
macromoleculelor, ediția a 3-a, Elsevier Science, Țările de Jos.
Goding, J.W. (1996) Monoclonal antibodies: principles and practice, ediția a 3-a,
Academic Press, UK.
Price, C.P. și Newman, D.J. (eds) (1996) Principles and practice of immunoassay,
Ediția a 2-a, Grove Dictionaries Inc., SUA.
Johnstone, A.P. și Thorpe, R. (1987) Imunochimie în practică, ediția a 3-a, Blackwell
Science, Marea Britanie.
8 Enzime
• Natura enzimelor
• Metode de dozare enzimatică
• Tehnici de monitorizare
• Tratarea probelor pentru testul enzimatic
• Metode de testare a substratului
• Analiză automatizată
• Enzime imobilizate
Enzimele ocupă un loc important în biochimia analitică și multe investigații

necesită detectarea și cuantificarea lor. Studiile privind conținutul enzimatic
al plasmei sanguine sunt deosebit de utile în biochimia clinică, atât pentru
monitorizarea proceselor metabolice normale, cât și pentru detectarea
nivelurilor anormale de producere sau eliberare a enzimelor. Testele
enzimatice oferă, de asemenea, metode convenabile de evaluare a calității
produselor alimentare și de verificare a eficienței proceselor de sterilizare și
pasteurizare.
Enzimele sunt instrumente analitice valoroase și oferă metode sensibile
și specifice de cuantificare pentru multe substanțe. Disponibilitatea din ce în
ce mai mare a preparatelor enzimatice foarte purificate, atât în soluție, cât și
în forme imobilizate, permite dezvoltarea unei game largi de metode.
Din cauza dificultăților de măsurare a cantității de enzimă în unitățile
convenționale de masă sau de concentrație molară, unitatea acceptată de
activitate enzimatică este definită în termeni de viteză de reacție. Unitatea
internațională (UI) este definită ca fiind acea cantitate de enzimă care va duce
la transformarea a 1 JLmol de substrat în produs în 1 minut, în condițiile
specificate. Unitatea SI de activitate, care devine din ce în ce mai acceptabilă,
este katal și se definește ca acea cantitate de enzimă care va duce la
transformarea a 1 mol de substrat în produs în 1 secundă. O subunitate
convenabilă este nanokatalul, care este egală cu 0,06 unități internaționale.
Activitatea specifică a unui preparat enzimatic se exprimă ca activitate
catalitică pe miligrame de proteină (unități mg-1 proteină) și este un indicator
convenabil pentru
258 Enzime
modul de comparare a purității preparatelor enzimatice. Numărul de rotație

,
exprimă activitatea catalitică în termeni de unități per mol de enzimă pură mai
degrabă decât în unități de proteină. Acest lucru permite compararea directă a
activității catalitice
ic a diferitelor enzime, adică să spunem că o enzimă este de X ori mai mare
decât o altă enzimă.
Acesta poate fi utilizat numai dacă se cunoaște masa moleculară relativă a
enzimei și conținutul de proteine al probei, iar proba este cunoscută ca fiind
un preparat pur.
Enzimele sunt clasificate în șase rubrici principale, care se referă la
reacțiile chimice implicate. Fiecare clasă este apoi subîmpărțită pentru a
clasifica celelalte caracteristici ale reacției. Principalele rubrici sunt enumerate
mai jos, dar alte detalii pot fi găsite în anexă.
I. Oxidoreductaze. Enzime care catalizează transferul de atomi de hidrogen
sau de oxigen sau de electroni.
2. Transferaze. Enzime care catalizează transferul de grupări specifice.
3. Hidrolaze. Enzime care catalizează reacții hidrolitice.
4. Lilaza. Enzime care catalizează ruperea legăturilor prin alte reacții decât
hidroliza.
5. Izomeraze. Enzime care catalizează rearanjamente intramoleculare.
6. Ligaze. Enzime care catalizează formarea de legături și necesită ATP.
Fiecare enzimă a primit un număr de patru cifre de la Comisia pentru enzime
a Uniunii Internaționale de Biochimie. Primele trei cifre se referă la reacția
catalizată de enzimă, iar ultima cifră este necesară în cazul în care mai multe
enzime cu structuri proteice diferite catalizează aceeași reacție.
Denumirea enzimei (EC W.X.Y.Z)

EC - Sistemul de numere al Comisiei
enzimatice W - indică reacția catalizată (1- 6)
X - indică substratul sau grupul general implicat
Y - indică substratul sau coenzima specifică
Z - numărul de serie al enzimei.
Toate enzimele sunt proteine, deși multe dintre ele sunt proteine conjugate și
sunt asociate cu grupuri neproteice. Activitatea lor catalitică depinde de
menținerea structurii lor native, iar ușoare variații pot duce la modificări
semnificative ale acestei activități.
O trăsătură comună a enzimelor este prezența unei fante sau a unei
depresiuni în structură, care este căptușită cu reziduuri de aminoacizi în
principal hidrofobe și în care se potrivește substratul. Anumite resturi de
aminoacizi care sunt implicate fie în orientarea substratului și, prin urmare, în
specificitatea enzimei, fie în catalizarea reacției, sunt situate în această fantă.
Acele reziduuri de aminoacizi care sunt asociate cu acest din urmă rol
formează situsul activ al enzimei și sunt adesea situate la baza acestei fante. În
cele mai multe cazuri, aceștia sunt ionici sau reactivi și includ histidină, lizină,
cisteină
și serina, precum și acizii glutamic și aspartic. În plus, legarea ionilor din

soluție, în special a cationilor, poate contribui, de asemenea, fie la localizarea
substratului, fie la catalizarea acțiunii.
8.1.1 Factori care influențează activitatea e zimelor
Temperatura
O creștere a temperaturii mărește viteza tuturor reacțiilor chimice, inclusiv a
celor catalizate de enzime, dar crește și viteza de denaturare a proteinelor
enzimatice (figura 8.1). De asemenea, denaturarea are loc mai ușor în cazul
soluțiilor pure de enzime decât în cazul celor impure.
Uneori se sugerează că enzimele prezintă o temperatură optimă de
funcționare, dar temperatura cea mai potrivită pentru o anumită reacție este un
compromis între o activitate maximă pentru o perioadă scurtă de timp și o
activitate în scădere din cauza denaturării pentru o perioadă mai lungă de
timp. Multe teste sunt efectuate la 37 °C, fie pentru că se presupune în mod
eronat că temperatura corpului uman este temperatura optimă pentru o
enzimă, fie, mai realist, pentru că, peste această temperatură, rata de
inactivare a enzimei devine mult mai semnificativă. Inițial, Uniunea
Internațională de Biochimie a recomandat ca 25 °C să fie considerată
temperatura standard, dar ulterior a ridicat-o la 30 °C, din cauza dificultăților
de a menține o temperatură mai scăzută în climatele calde. Este posibil să se
convertească activitățile enzimatice citate pentru o anumită temperatură în
activități echivalente la o altă temperatură, utilizând factori de conversie
prestabiliți, dar validitatea acestor metode este pusă sub semnul întrebării. În
prezent, nu este specificată nicio temperatură standard, dar se recomandă ca
temperatura de analiză să fie menționată în toate trimiterile la activitățile
enzimatice.
Procentul B
activitate
efectul
asupra
activității
enzimatice
\
c\
Temperatura
Figura 8.1 Efectul temperaturii asupra reacțiilor catalizate de enzime. Viteza unei
reacții chimice crește odată cu creșterea temperaturii (A), dar, din cauza denaturării
crescânde a proteinei, proporția de enzimă activă scade (B). Aceste două procese au ca
rezultat profilul caracteristic de temperatură al unei enzime (C).
260 Enzime
pH
Enzimele sunt foarte sensibile la schimbările de pH și funcționează cel mai
bine într-un interval foarte limitat, cu un pH optim definit. Efectele pH-ului se
datorează schimbărilor în starea ionică atât a reziduurilor de aminoacizi ale
enzimei, cât și a moleculelor de substrat. Aceste modificări de sarcină vor
afecta legarea substratului și viteza de reacție rezultată. Într-un interval îngust
de pH, aceste efecte vor fi reversibile, dar extremele de aciditate sau
alcalinitate provoacă adesea distorsiuni grave ale structurii proteice și duc la
denaturarea permanentă (figura 8.2). Este important de apreciat faptul că pH-
ul optim al reacției enzimatice poate fi diferit pentru diferite substraturi. Prin
urmare, o valoare indicată nu este neapărat valabilă pentru fiecare metodă de
analiză, iar acest lucru trebuie întotdeauna determinat atunci când se
proiectează analize enzimatice.
....,
Activitate I/
I
I '\
I
I
/
/
.,,,,,"'
2 4 6 8 10
pH
Figura 8.2 Efectul pH-ului asupra enzimei lactat dehidrogenază (EC

1.1.1.1.27). Enzima prezintă o activitate maximă la pH 7,4 (A). Atunci când este
depozitată în soluții tampon cu valori diferite ale pH-ului timp de 1 oră înainte de a fi
testată din nou la pH 7,4, aceasta prezintă o recuperare completă a activității la valori
de pH cuprinse între 5 și 9, dar o inactivare permanentă în afara acestor limite (B).
Concentrația substratului
Studiile experimentale privind efectul concentrației de substrat asupra
activității unei enzime arată rezultate consistente. La concentrații mici de
substrat, viteza de reacție crește odată cu creșterea concentrației. La
concentrații mai mari, rata începe să se stabilizeze și, în cele din urmă, devine
aproape constantă, indiferent de orice altă creștere a concentrației de substrat.
Alegerea concentrației de substrat este un aspect important în proiectarea
testelor enzimatice și este necesară o înțelegere a cineticii reacțiilor catalizate
de enzime pentru a dezvolta metode valide.
8.1.2 Cinetica reacțiilor catalizate de enzime

Legea acțiunii de masă afirmă că viteza unei reacții chimice este
proporțională cu produsul dintre concentrațiile reactanților. Acest lucru
înseamnă că viteza unei reacții cu un singur component va crește în raport
direct cu creșterea concentrației, dar în cazul unei reacții cu doi componenți,
aceasta va crește proporțional cu pătratul concentrației. Aceste relații
poate fi exprimată prin următoarele ecuații:

Viteză = k1 (concentrație) (un singur reactant)
Viteză = k2 (concentrație) X (concentrație) (doi reactanți)
unde k1 și k2 sunt constantele de viteză de reacție sau constantele de viteză
pentru reacții. Se spune că reacțiile prezintă o cinetică de ordinul întâi,
respectiv de ordinul doi. Ocazional, apar situații în care creșterea concentrației
unui reactant nu duce la o creștere a vitezei de reacție. Se spune că astfel de
reacții prezintă o cinetică de ordin zero.
Efectul creșterii concentrației de substrat (figura 8.3) poate fi explicat
cel mai bine prin formarea unui complex enzimă-substrat ca etapă cheie a
reacției. Descompunerea acestui singur component, complexul ES, este cea
care duce la formarea produselor, așa cum este ilustrat de ecuația [1] și, prin
urmare, se aplică cinetica de ordinul întâi.
[1]
Viteză
Cinetică de
ordin zero
aproximativ
Mixtă
cinetica de
reacție
I Aproximativ
cinetică de
ordinul întâi
Concentrația substratului
Figura 8.3 Efectul concentrației substratului asupra activității unei enzime. La

concentrații scăzute de substrat, viteza de reacție rezultată dintr-o cantitate fixă de
enzimă este proporțională cu concentrația substratului. Cu toate acestea, la concentrații
ridicate, reacția este aproape constantă și independentă de concentrația substratului.
Intervalul de concentrații de substrat dintre aceste două extreme are ca rezultat o
cinetică de reacție mixtă.
Ecuația Michaelis-Menten
Conceptul de complex enzimă-substrat este fundamental pentru aprecierea
reacțiilor enzimatice și a fost dezvoltat inițial în 1913 de Michaelis și Menten,
care au derivat o ecuație care este esențială pentru studiile enzimatice.
Ulterior lui Michaelis și Menten, mai mulți alți lucrători au abordat problema
din puncte de vedere diferite și, deși lucrările lor sunt deosebit de utile în
studiile avansate de cinetică și mecanică, au confirmat conceptele de bază ale
lui Michaelis și Menten.
Complexul ES se formează atunci când enzima și substratul se combină,
dar
262 Enzime
se poate forma, de asemenea, prin combinarea enzimei și a produsului.

Complexul se descompune în mod normal pentru a forma enzima liberă și
produsul, dar poate reveni la enzima liberă și la substrat. Aceste patru reacții
sunt rezumate prin ecuația [2]:
k k
E+SJfilJE+P
k2 k4
Constanta de disociere a echilibrului complicat care implică complexul
enzimă-substrat este cunoscută sub numele de constanta Michaelis, Km, și
implică constantele de viteză pentru fiecare dintre cele patru reacții care
implică complexul ES:
kz + k,,
K
m
=--k1 + k4
m
Atunci când concentrația complexului este constantă, rata de formare a
complexului este echilibrată de rata de dispariție a complexului. În cazul în
care se măsoară viteza de reacție pentru orice concentrație de substrat înainte
ca produsul să fie prezent în cantități apreciabile, viteza de reacție inversă va
fi neglijabilă, iar constanta de viteză k4 poate fi ignorată. În aceste condiții:
kz + k3
K=--
m k1
Este extrem de dificil să se determine cantitățile relative de enzimă
liberă și complexată, dar este posibil să se măsoare activitatea totală a
enzimei. Proporția de enzimă liberă poate fi reprezentată ca diferența dintre
enzima totală (E) și cea complexată cu substratul (ES):
Rata de formare a ES = k1 [E - fil] [S]
Rata de eliminare a ES = k2 [ES] + k3
[ES]
unde parantezele pătrate indică "Prin concentrația reactivului.
urmare":
ki + k3 [E - ES][S]
---=
[ES]
= Km
Rearanjarea ecuației rezultă:
[E][S] [ES][S]
[ES] [ES]
[E]
Km = [S]
[ES]
[E][S]
[ES] [5]
Km + [S]
Prin definiție, rata observabilă de formare a produsului (v) este proporțională
cu concentrația complexului enzimatic substrat, ES:
v = k3 [ES]
Prin urmare, înlocuind în ecuația [5]:
k3 [E][S]
V = [6]
I(,,,,+ [SJ
Concentrația reală a enzimei este dificil de măsurat, în special în termeni de

concentrație molară, dar dacă concentrația substratului este mare în
comparație cu cea a enzimei, toată enzima va fi prezentă sub formă de
complex ES și reacția va avea loc la viteză maximă. În aceste condiții de
exces de substrat și viteză maximă (V max):
Vmax = k3 [E]
Înlocuind în ecuația [6] se obține forma comună a ecuației Michaelis:
Vmax X [SJ
V = [7]
Ecuația oferă o măsură a constantei Michaelis (Km) în funcție de viteza

măsurată a reacției (v) care rezultă dintr-o concentrație de substrat ([SJ) și de
viteza maximă (V max) care poate fi obținută folosind concentrații foarte mari
de substrat.
Valoarea vitezei maxime este legată de cantitatea de enzimă utilizată,
dar constanta Michaelis este specifică enzimei și reprezintă o măsură a
activității enzimei. Enzimele cu valori mari pentru Km prezintă o reticență la
disocierea de substrat și, prin urmare, sunt adesea mai puțin active decât
enzimele cu valori mici ale Km. Concentrația de substrat necesară pentru o
anumită analiză enzimatică este legată de Km și, atunci când se elaborează o
analiză, trebuie să se determine valoarea lui Km.
Determinarea constantei Michaelis

Se determină viteza de reacție produsă de o cantitate fixă de enzimă cu
concentrații variabile de substrat, iar un grafic al celor două variabile prezintă
o formă caracteristică (figura 8.4). Concentrația de substrat care determină
Viteza maximă
-------
Viteza 0 .6
(M min-1)
,,,,,.-
.,,,,,,,,,,,,
0.5 .,,,,,,,
/
/
/
/
0.4
Jumătate din maxim
/
/velocitate ///
0.3
- ------ ti'
I
I
I
0.2 I
/I
I
''
I
I
O.l I
I
I
l/Kmvalue
Figura 8.4 Determinarea I
constantei Michaelis 0 2 3 4 5 6 7
(Km). Concentrația substratului (mmol 1-1)
264 Enzime
o viteză care este jumătate din viteza maximă este numeric egală cu constanta
Michaelis:
Vmax Vmax Vmax X [S]
2 Km + [S]
[S] Km
În timp ce această metodă este extrem de simplă, ea este, de asemenea,

inaccesibilă din punct de vedere experimental. Din cauza naturii hiperbolice a
relației, curba se apropie asimptotic de viteza maximă, ceea ce face dificilă
deducerea unei valori pentru Vmax. Orice eroare în evaluarea acestei valori se
va reflecta în valoarea atribuită lui Km.
Lineweaver și Burk (1934) au descris o metodă pentru determinarea
a Km care utilizează forma reciprocă a ecuației Michaelis, transformând-o
într-o relație liniară (procedura 8.1):
l Km 1 1
-=-X-+- [8
V vmax [S] vmax
O reprezentare grafică a valorii reciproce a vitezei în raport cu valoarea

reciprocă a concentrației de substrat dă un grafic cu linii drepte cu intercepte
de
și
1 1
V Vmax
O metodă alternativă, cunoscută sub numele de graficul Hofstee, folosește
metoda Michaelis
ecuație sub forma
V
V = Vmax - Km [S]
în care v este reprezentată grafic în funcție de v/[S] și dă interceptări la Vmax și
Vma/Km.
Ambele metode sunt extrem de utile, deoarece navele de relații liniare
facilitează tratarea grafică, precum și manipularea statistică și ulterioară a
datelor pe calculator. Metoda Lineweaver-Burk este mai frecvent utilizată,
deși prezintă dezavantajul că valorile experimentale care sunt cele mai puțin
precise (adică cele care implică concentrații foarte mici de substanțe și care au
ca rezultat viteze foarte mici) sunt cele mai îndepărtate de origine și, prin
urmare, tind să exercite cea mai mare influență asupra graficului, cu excepția
cazului în care se utilizează o analiză de regresie liniară ponderată. Din acest
motiv, unii consideră că graficul Hofstee este o metodă mai fiabilă.
8.1.3 Mecanisme enzimatice

Etapele inițiale ale reacțiilor catalizate de enzime implică legarea reactivilor
la suprafața enzimei, iar una dintre funcțiile enzimei este de a orienta acești
reactanți unul față de celălalt. Această idee a fost sugerată de Fischer ca
ipoteza "lacătului și a cheii", în care enzima este lacătul, iar
266 Enzime
-Substratul este cheia. Deși acest lucru a explicat ideea de specificitate a unei
enzime, ideea unei structuri proteice rigide a fost greu de acceptat. Koshland
a propus o ipoteză alternativă de "potrivire indusă", conform căreia legarea
substratului determină modificarea geometriei enzimei, ceea ce are ca rezultat
orientarea corectă a grupărilor corespunzătoare atât în substrat, cât și în
enzimă.
O altă ipoteză sugerează că legarea unui substrat de o enzimă provoacă

o tensiune sau o deformare a unora dintre legăturile din molecula de substrat,
care sunt ulterior rupte. Eficacitatea acestui mecanism depinde de puterea
forței de legare și nu implică neapărat vreo mișcare a proteinei, dar sugerează
ideea unei enzime flexibile.
Multe reacții enzimatice sunt o consecință fie a atacului nucleofilic, fie
a atacului electrofilic asupra substratului, prima fiind cea mai frecventă. Dacă
o astfel de specie se apropie de o altă grupare, aceasta va avea tendința de a
îndepărta electronii de la "centrul pozitiv". În cazul în care reacția care trebuie
catalizată este
A-X - A++ x-
atunci o apropiere de un nucleofil (C-, catalizatorul) va face reacția mai
fezabilă:
,,---.,
c- A-x-c-A + x-
Atunci când se rupe o legătură, natura grupului care pleacă este importantă în
determinarea energiei de activare. Caracterul bazic al grupului este legat de
nucleofilicitatea sa și, în cazul în care caracterul bazic al grupului care pleacă
este diminuat, va fi diminuată și tendința de a reface legătura ruptă:
H+ + A-X - A-X-H+
c- ,,---.,A-X-H +- C-A + H+x

Acesta este un exemplu de cataliză acidă, iar efectul este de a îndepărta
electronii de la grupul de plecare. Adesea, atât cataliza acidă, cât și atacul
nucleofilic sunt implicate în reacțiile catalizate de enzime, în ceea ce se
numește mecanisme "push-pull".
8.1.4 Activarea enzimelor

Multe enzime au nevoie de substanțe suplimentare pentru a funcționa eficient.
Enzimele conjugate au nevoie de o grupare protetică înainte de a fi active din
punct de vedere catalitic, astfel de grupări fiind legate covalent sau ionic de
molecula proteică și rămânând nealterate la sfârșitul reacției. De exemplu,
catalaza (EC 1.11.1.6) conține o grupare hema, în timp ce ascorbat oxidază
(EC 1.10.3.3) conține un atom de cupru.
Purificarea unor enzime le inactivează, deoarece substanțele esențiale
pentru activitatea lor, dar care nu sunt clasificate ca grup protetic, sunt
eliminate. Acestea sunt frecvent ioni anorganici care nu sunt participanți
expliciți la reacție. Activarea anionică pare a fi nespecifică, iar anioni diferiți
sunt adesea eficienți. Amilaza (EC 3.2.1.1.1), de exemplu, este activată de o
varietate de anioni, în special de clorură. Activarea cationică este mai
specifică, de exemplu, magneziul este deosebit de important în reacțiile care
implică ATP și ADP ca substraturi. În cazul activării cationice, pare foarte
probabil ca cationul să se lege inițial de substrat mai degrabă decât de enzimă.
Pe lângă acești activatori, există un grup de substanțe care nu sunt
simpli activatori, ci sunt adesea co-substanțe esențiale pentru multe enzime
diferite; cele mai frecvente exemple sunt prezentate în tabelul 8.1.
268 Enzime
Tabelul 8.1 Cofactori ca sisteme de transport
Cofactor Grupa transportată Tipul de reacție
NAD+, NADf>+ Purtător Oxidare Oxidare

Flavine Redox Oxidare Oxidare
Citocromi Purtător Transfer de
AMP, ADP Redox energie
Fosfat de piridoxal Purtător Transaminare
UDP Redox Metabolismul carbohidraților
CoenzimaA Purtător Metabolismul lipidelor
Redox Fosfat
Amino
Glicozil Acil
8.1.5 Inhibarea enzimelor

O substanță care reduce viteza unei reacții catalizate de o enzimă este
cunoscută sub numele de inhibitor, iar efectele sale pot fi permanente sau
tranzitorii. Inhibarea unor reacții de către substanțe care pot fi produse fie ale
acelei reacții, fie ale unei reacții ulterioare, constituie un mecanism de control
al metabolismului celular, în timp ce inhibarea selectivă a enzimelor stă la
baza multor aspecte ale far macologiei și chimioterapiei.
Unii inhibitori se aseamănă structural cu substratul și sunt legați de
enzime, dar nu pot fi transformați în produse. Deoarece formarea complexului
dintre enzimă și inhibitor este o reacție reversibilă, inhibitorul poate fi înlocuit
de concentrații mari de substrat normal. Site-ul
V .,._J> /
#-
I:.<3'1
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
/,
Vmax nealterat
1
[SJ
Figura 8.5 Efectele cinetice ale unui inhibitor competitiv. Efectele unui inhibitor
competitiv pot fi inversate de concentrații mari de substrat, iar cantitatea crescută
necesară pentru a atinge viteza maximă determină o valoare crescută a constantei
Michaelis.
Natura enzimelor 269 .
inhibiția determină o creștere a valorii Km pentru enzimă, dar viteza maximă

a reacției rămâne neschimbată (figura 8.5). Astfel de substanțe sunt
cunoscute sub denumirea de inhibitori competitivi, iar efectele lor pot fi
reduse și chiar eliminate prin concentrații mari de substrat. Exemplul
clasic de inhibiție competitivă este acțiunea medicamentelor antibiotice
sulfonamidice datorită similitudinii lor structurale cu substratul natural
acidul p-aminobenzoic (figura 8.6).
H,N-0-COOH
acid p-aminobenzoic
H,N -0- SO,NH,

Sulfanilamidă
Sulfadiazină
Figura 8.6 Inhibiția competitivă. Medicamentele sulfonamidice concurează cu

acidul p-amino benzoic, care este un factor de creștere esențial pentru multe bacterii.
Un alt tip de inhibitor se combină cu enzima într-un loc care este adesea
diferit de locul de legare a substratului și, ca urmare, va inhiba formarea
produsului prin descompunerea complexului normal enzimă-substrat. O astfel
de inhibiție necompetitivă nu este inversată prin adăugarea de substrat în
exces și, în general, inhibitorul nu prezintă nicio asemănare structurală cu
substratul. Studiile cinetice relevă o valoare redusă pentru activitatea maximă
a enzimei, dar o valoare nealterată pentru constanta Michaelis (figura 8.7).
Există numeroase exemple de inhibitori necompetitivi, dintre care mulți sunt
considerați otrăvuri din cauza rolului crucial al enzimei inhibate. Ionii de
cianură, de exemplu, inhibă orice enzimă în care fie un ion de fier, fie un ion
de cop per face parte din situsul activ sau din grupul prostetic, de exemplu,
citocromul c oxidază (EC 1.9.3.1).
Nu toți inhibitorii se încadrează în oricare dintre aceste două clase, ci
unii prezintă efecte mult mai complexe. Un inhibitor necompetitiv este definit
ca fiind unul care determină o scădere paralelă a vitezei maxime și a valorii
Km (figura 8.8). Modul de acțiune de bază al unui astfel de inhibitor este
acela de a se lega numai de complexul enzimă-substrat și nu de enzima liberă
și astfel reduce viteza de formare a produselor. Fosfataza alcalină (EC 3.1.3.1)
extrasă din intestinul de șobolan este inhibată de L-fenilalanină în acest mod.
270 Enzime
l
V
Km nealterat
\ Vmax scade
I
[SJ
Figura 8.7 Efectele cinetice ale unui inhibitor necompetitiv. Efectul unui inhibitor
necompetitiv nu este inversat de concentrații mari de substrat, iar reacția enzimatică
prezintă o valoare redusă a vitezei maxime. Enzima rămasă este nealterată și dă
aceeași valoare pentru constanta Michaelis ca cea prezentată inițial de enzima
neinhibată.
l
V
Inhibată
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
,,,,,,/
,,
/Vm ax dec/rea/ses ,"'
Km scade
/
/
I
[SJ
Figura 8.8 Efectele cinetice ale unui inhibitor necompetitiv. Efectele unui inhibitor
necompetitiv sunt foarte complexe, iar reacția prezintă, de obicei, o scădere paralelă
atât a vitezei maxime, cât și a constantei Michaelis.
O altă clasă diferită de inhibitori se leagă covalent de aminoacizi

specifici din enzimă și aceștia sunt denumiți inhibitori ireversibili. Compușii
organofosforici, dintre care gazele neurotoxice sunt exemple, inactivează
enzimele a căror activitate se bazează pe grupa hidroxil a reziduurilor de
serină,
de exemplu, colinesteraza (EC 3.1.1.1.8).
8.1.6 Allostery
Enzimele alosterice prezintă diverse efecte de activare și inhibiție care sunt de
natură competitivă și sunt legate de modificări conformaționale în structura
enzimei. Astfel de enzime alosterice sunt adesea enzime cruciale în căile
metabolice și exercită un control asupra întregii secvențe de reacții.
Denumirea de alosterie se referă la faptul că inhibarea enzimei se face de
către substanțe care nu sunt similare ca formă cu substratul.
Conceptul de bază al enzimelor alosterice propus inițial de Monod este
o extensie a teoriei de potrivire indusă a lui Koshland. Pentru a fi activă din
punct de vedere catalitic, o enzimă alosterică trebuie să se afle într-o
conformație care să permită legarea substratului. Structura sa este în mod
normal flexibilă și poate fi stabilizată doar prin legarea altor molecule. Prin
urmare, legarea unui activator la situsul de activare blochează enzima într-o
formă în care situsul de legare a substratului este disponibil. Legarea unui
inhibitor la un situs inhibitor separat determină deformarea atât a situsului de
legare a substratului, cât și a situsului activator (figura 8.9). 6-
Fosfofructokinaza (EC 2.7.1.11), o enzimă-cheie în calea glicocolitice, este
inhibată de ATP și citrat, dar este activată de AMP, ADP, fosfat anorganic și
de substratul normal, fructoza-6-fosfat. Aceste efecte fac ca activitatea sa să
fie redusă atunci când concentrația de
0
Locul de legare
a substratului
'"MSW -ti- -
O'"'''' " "''' ""V
vAo
-
Formă inactivă Forma activă
Figura 8.9 Enzime alosterice. Legarea unui activator stabilizează enzima într-un fonn
activ, în timp ce legarea unui inhibitor denaturează situsul activ, provocând o pierdere
de activitate.
276 Enzime
compuși energetici este ridicată sau există o sursă adecvată de energie din ciclul
acidului citric. În schimb, enzima este activată de compuși a căror prezență în
cantități crescute sugerează o lipsă de compuși cu conținut energetic ridicat în
celulă.
8.1.7 lso-enzime
Enzimele care îndeplinesc aceeași funcție catalitică sunt cunoscute sub
numele de enzime omoloage și se împart în două clase. Heteroenzimele sunt
derivate din surse diferite și, deși catalizează aceeași reacție, prezintă
caracteristici fizice și cinetice diferite. Enzima hidrolitică a-amilaza (EC
3.2.1.1.1) se găsește în secreția pancreatică la om și este diferită de enzimele
cu același nume care provin din bacterii sau malț. !so-enzimele, denumite
uneori izozime, sunt forme moleculare diferite ale aceleiași enzime și se
găsesc în același animal sau organism, deși prezintă adesea un model de
distribuție între țesuturi.
Multe izoenzime sunt hibrizi ai unui număr limitat de subunități. Unele
enzime prezintă forme multiple datorită creșterii nivelului de polimerizare a
unei singure subunități; acestea nu ar trebui să fie numite cu adevărat
izoenzime, deoarece nu prezintă nicio diferență genetică între diferitele
forme. Colinesteraza, de exemplu, prezintă cinci forme constând dintr-o
singură subunitate existentă sub formă de monomeri, dimeri, trimeri,
tetrameri și pentameri.
□
-■-
□ AB3
Ai
Figura 8.10 Structura cuaternară a proteinelor. Enzima lactat dehidroge nază (EC
l.l.l.l.27) are o masă moleculară relativă de aproximativ 140 000 și se prezintă sub
forma unui tetramer produs prin asocierea a două proteine globulare diferite (A și B), o
caracteristică care are ca rezultat cinci forme hibride diferite ale enzimei active.
Peptidele A și B sunt inactive din punct de vedere enzimatic și sunt adesea indicate
prin M (mușchi) și H (inimă). Tetramerul A4 predomină în mușchiul scheletic, în timp
ce forma B4 predomină în mușchiul cardiac, dar toate țesuturile prezintă majoritatea
tipurilor în cantități diferite.
Metode de dozare 273
enzimatică
Lactat dehidrogenazei (EC 1.1.1.1.27) prezintă un pat tern clasic de
izoenzimă. La om, aceasta este compusă din două subunități proteice diferite,
cunoscute sub numele de A și B, dispuse în tetrameri (figura 8.10), ceea ce dă
cinci forme hibride diferite ale celor două unități de bază. Subunitățile A și B
sunt inactive din punct de vedere enzimatic, dar toți tetramerii sunt activi și,
datorită compoziției lor diferite, pot fi separați unul de celălalt prin
electroforeză sau cromatografie cu schimb de ioni. Aceștia prezintă, de
asemenea, proprietăți catalitice diferite, de exemplu, specificitatea
substratului și cinetica de inhibiție, iar aceste proprietăți oferă adesea baza
pentru testele izoenzimatice relativ specifice. Enzimele cu variante de
izoenzime prezintă adesea o distribuție caracteristică a izoenzimelor în
diferite țesuturi, iar forma B4 a lactat dehidrogenazei se găsește în principal în
mușchiul cardiac, iar forma A4 în principal în mușchiul scheletic.
În timp ce izoenzimele prezintă variații regulate în structura lor
moleculară, cea mai semnificativă este diferența în ceea ce privește activitatea
lor catalitică. Ele prezintă adesea efecte diferite de inhibiție și activare,
permițând unei izoenzime să funcționeze în condiții care ar reduce activitatea
alteia și este probabil ca astfel de variații să contribuie la controlul aceleiași
reacții în condiții celulare sau tisulare diferite.
Secțiunea 8.1
1. Ceea ce urmează va determina întotdeauna o reducere a
activității unei enzime. Selectați adevărat sau fals pentru fiecare
dintre afirmații:
(a) O reducere a temperaturii.
(b) O reducere a concentrației de substrat.
(c) O creștere a concentrației produsului.
(d) O creștere a pH-ului.
2. Prin ce este sugerată activitatea catalitică ridicată a unei enzime?
(a) O activitate specifică scăzută.
(b) O constantă Michaelis scăzută (Km).
(c) O cifră de afaceri scăzută.
(d) O viteză maximă scăzută (Vma,J
3. La concentrații mici de substrat, orice creștere ușoară a
concentrației va duce la o creștere a activității enzimatice,
deoarece
la concentrații scăzute de substrat, nu toată enzima disponibilă este
încorporată în complexul enzimă-substrat.
4. Efectul unui inhibitor competitiv poate fi inversat prin creșterea
concentrației de substrat.
PENTRU CĂ
un inhibitor competitiv nu prezintă, în mod normal, nicio asemănare
structurală cu substratul.
Testele enzimatice în care se măsoară fie substratul, fie produsul enzimelor de

testat sunt cunoscute ca teste directe. Pentru multe enzime, testele directe sunt
274 Enzime
fie nu este convenabil, fie nu este fezabil, și se utilizează teste cuplate.

Amestecul de reacție pentru un test cuplat include substraturile pentru
enzima inițială sau de testare, precum și enzimele suplimentare și reactivii
necesari pentru a transforma produsul primei reacții într-un produs detectabil
al reacției finale. De exemplu, enzima aspartat aminotransferaza (EC 2.6. l. l.
l ) duce la formarea de oxaloacetat, care poate fi transformat în acid malic de
către enzima malat dehidrogenază (EC 1.1.1.1.37) cu transformarea simultană
a NADH în NAD+, reacție care poate fi urmărită spectrofotometric la 340
nm:
aspartat aminotransferaza
aspartat oxoglutarat ------ glutamat oxaloacetat
+ +
malat dehidrogenază
oxaloacetat + NADH --------+ malat + NAD+
În acest exemplu, malat dehidrogenază este cunoscută ca enzima indicatoare.
Au fost descrise multe teste în care produsul inițial formează substratul
unei reacții intermediare care implică enzime auxiliare. De exemplu, testul
creatin-kinazei (EC 2.7.3.2) implică hexokinaza (EC 2.7.1.1.1) ca enzimă
auxiliară ș i glucoza-6-fosfat dehidrogenază (EC 1.1.1.1.49) ca enzimă
indicatoare:
creatin-kinază
fosfat de creatină + ADP ----- creatină + ATP
hexokinaza
ATP + glucoză ------+ ADP + glucoză-6-fosfat
glucoză-6-fosfat dehidrogenază
glucoză-6-fosfat + NADP+. 6-fosfogluconat + NADPH
8.2.1 Teste optimizate

Înainte de orice activitate experimentală pentru elaborarea unui test, trebuie
obținute informații despre enzime din literatura de specialitate, cum ar fi pH-
ul optim, activatorii, inhibitorii și valorile Km. Este important ca toate aceste
informații să fie confirmate experimental cu ajutorul metodei selectate.
pH-ul optim al unei enzime variază adesea de la un substrat la altul și
trebuie să fie determinat pentru fiecare substrat în parte. Sistemul tampon
utilizat va afecta adesea activitatea globală a unei enzime și poate modifica
pH-ul său optim. În general, tampoanele amino, cum ar fi glicilglicina și
tricina etc. (tabelul 8.2), determină o activitate enzimatică mai mare decât
tampoanele anorganice simple, cum ar fi fosfatul și carbonatul. Tampoanele
sunt mai eficiente într-un interval de pH restrâns (aproximativ două unități)
care se concentrează pe valoarea lor pKa. Acei tampoane cu valori pKa
similare cu pH-ul optim cunoscut al enzimei ar trebui să fie testate pentru a
determina efectul lor asupra activității enzimei într-un interval limitat de pH.
Este dificil să se determine pH-ul optim al fiecărei enzime atunci când
enzimatică
proiectarea unui test cuplat din cauza prezenței altor enzime și este necesar să
se utilizeze o tehnică de testare directă pentru fiecare dintre ele. Efectul
tampoanelor, al activatorilor și al inhibitorilor trebuie, de asemenea, să fie
verificat prin aceeași metodă directă. Selectarea pH-ului general al testului
poate să nu fie ușoară din cauza diferențelor de optimi între diferitele enzime. În
general, este recomandabil să se selecteze pH-ul optim al enzimei de testat
pentru a obține sensibilitatea maximă, iar pierderea proporțională de activitate
pentru fiecare enzimă suplimentară poate fi determinată din profilurile de pH
ale acestora (figura 8.2) și compensată prin
adăugarea unei cantități mai mari de enzimă în amestecul de analiză.
Tabelul 8.2 Tampoane

tampon
Denumire comună Compus de bază pK.
ACES Acid aminosulfonic 6.8
ADA Acid aminoacetic 6.6
BES Acid aminosulfonic 7.1
BICINĂ Hidroxiglicină 8.3
CAPS Acid aminosulfonic 10.4
EPPS Acid piperazinesulfonic 8.0
GG Glicilglicină 8.2
HEPES Acid piperazinesulfonic 7.5
MES Acidul morfolinosulfonic 6.1
MOPS Acidul morfolinosulfonic 7.2
TAPS Acid aminosulfonic 8.4
TES Acid aminosulfonic 7.5
TRICINE Hidroxiglicină 8.1
Tris Hidroxiaminometan 8.1
Este esențial să se identifice necesitatea oricăror activatori și să se

determine concentrațiile optime ale acestora. În multe teste cuplate, nu este
neobișnuit să se constate că un activator pentru o enzimă poate inhiba o altă
enzimă. Concentrația optimă selectată a tuturor activatorilor trebuie verificată
în raport cu toate celelalte enzime pentru a se stabili dacă există efecte de
inhibiție. Problemele pot fi adesea rezolvate printr-un control atent al
concentrațiilor și prin creșterea cantităților de enzime suplimentare inhibate.
Pentru a obține o viteză maximă, trebuie utilizată o concentrație de
substrat care este de cel puțin zece ori mai mare decât valoarea Km a enzimei.
Deși viteza maximă se atinge doar teoretic la o concentrație infinită de
substrat, este posibil, cu ajutorul ecuației Michaelis-Menten, să se calculeze
procentul de viteză maximă dat de orice concentrație de substrat. Pentru o
concentrație de substrat de zece ori mai mare decât valoarea Km, viteza (v)
obținută va fi:
Vmax X 10
=
V 1 + 10
10
V = 91% viteză maximă
11
Deși este de dorit să se utilizeze o concentrație cât mai mare posibil,
unele enzime sunt supuse inhibiției substratului și dau o reacție caracteristică de
276 Enzime
Graficul Lineweaver-Burk (figura 8.11). În astfel de cazuri, concentrația de

substrat aleasă trebuie să dea cea mai mare viteză de reacție posibilă. Este
important ca, atunci când se descrie un test enzimatic, să se raporteze viteza
maximă procentuală pe care o va da metoda.
Singurul factor limitator de viteză într-o analiză cuplată ar trebui să fie
concentrația produselor inițiale și de legătură, iar toți ceilalți reactivi ar trebui
să fie în exces. Rolul enzimelor auxiliare și indicatoare este în esență cel al
unui sistem de analiză a substratului și, în condiții optime de analiză, viteza
reacției indicatoare trebuie să fie egală cu viteza de formare a produsului
inițial. Reacția indicatoare trebuie să fie capabilă să se adapteze la diferitele
viteze de reacție ale testului, iar viteza sa poate fi definită prin ecuația
Michaelis-Menten în mod obișnuit:
Vmax X [P]
viteza de încercare = viteza indicatorului
Km + [P]
=
unde [P] este concentrația produsului de testat.
Concentrația produsului este în mod normal foarte scăzută și aproape
constantă, datorită stabilirii unei stări de echilibru între formarea sa și
utilizarea în reacția de indi cator. Prin urmare:
Vrrnx [P]
viteză = --
Km
Reciprocă 60
a vitezei
(AA34onm min-1)
40
20
Vmax teoretic
Valoarea Km
neinhibată
-I 0 3 5 7
Reciprocul concentrației de substrat (mmol 1-1 )
Figura 8.11 Inhibarea substratului. Enzima L-aminoacid oxidază (EC l. 4. 3. 2)

suferă o inhibiție a substratului la concentrații de L-leucină mai mari de 3,0 mmol
1-1 - Un grafic Lineweaver-Burk arată curba caracteristică a liniei drepte obișnuite.
Tabelul 8.3 Exemple de metode cinetice spectrofotometrice de dozare a enzimelor
Enzima Numărul CE Direct sau Substrat Produs detectat Substrat de Enzime

cuplat utilizat legătură de
legătură
Lactat dehidrogenază 1.1.1.27 D Piruvat NADH
o-Aminoacid oxidază 1.4.3.3 C o-Alanină NADH Amoniac Glutamat dehidrogenază
y-Glutamil transpeptidază 2.3.2.2 D -y-Glutamil-p- p-Nitroanilină

nitroanilidă
Aspartat aminotransferaza 2.6.1.1 C L-Aspartat NADH Oxaloacetat Malat dehidrogenază
Fosfatază alcalină 3.1.3.1 D p-Nitrofenil p-Nitrofenol

fosfat
5'-Nucleotidaza 3.1.3.5 C 5'-AMP NADH Adenozină Adenozină deaminază

Amoniac Glutamat dehidrogenază
Argininosuccinat liază 4.3.2.1 D Argininosuccinat Fumarat
Aldolază 4.1.2.3 C Fructoză-1,6- NADH Gliceraldehidă-3- Glicerofosfat

difosfat fosfat dehidrogenază
Fosfat de glucoză 5.3.1.9 C Fructoză-6- NADP+ Glucoză-6- Glucoză-6-fosfat

izomerază fosfat fosfat dehidrogenază
Sintetază de glutamină 6.3.1.2 C L-Glutamat NADH ADP Piruvat kinaza

Piruvat Lactat dehidrogenază
278 Enzime
Pentru ca reacția indicatoare să fie paralelă cu reacția de testare, raportul

VmaiKm pentru enzima indicatoare trebuie să fie semnificativ mai mare decât
același raport pentru enzima de testare. Valoarea pentru Vmax este singura
variabilă din ecuație și este determinată de cantitatea de enzimă prezentă, de
obicei exprimată în unități per volum de analiză. De obicei, se recomandă o
creștere de 100 de ori pentru fiecare etapă, ceea ce va permite concentrații de
aproximativ 1/100 din valoarea Km pentru a obține o viteză comparabilă cu
viteza de reacție de testare. În cazul în care efectele pH-ului sau ale inhibiției
reduc activitatea enzimei într-o proporție cunoscută, poate fi necesar să se
mărească și mai mult cantitatea de enzimă adăugată la analiză. Tabelul 8.3
enumeră câteva exemple de teste cuplate și directe pentru o serie de enzime.
8.2.2 Măsurarea activității enzimatice

Pentru a urmări evoluția unei reacții catalizate de o enzimă, este necesar să se
măsoare fie epuizarea substratului, fie acumularea produsului. Pentru aceasta,
este necesar ca fie substratul, fie produsul să prezinte o caracteristică
măsurabilă care să fie proporțională cu concentrația sa. Acest lucru nu este
întotdeauna valabil și au fost dezvoltate o serie de tehnici pentru a monitoriza
reacțiile enzimatice. Pentru a ilustra unele dintre metode și pentru a oferi o
apreciere a detaliilor tehnice și a calculelor, sunt prezentate trei exemple
(procedurile 8.4-8.6) care utilizează enzima o-aminoacid oxidază (tabelul
8.4).
Tabelul 8.4. o-Aminoacid oxidază (EC 1.4.3.3.3)
Sursa Rinichi de mamifere

Masa moleculară relativă 125 000
Reacția catalizată Aminoacid + 02 +H2 O
Constanta Michaelis (o- 4,4 X 10-3 mol 1-1
alanină) pH optim (o-alanină) 8.3
Cofactor FAD
Viteza la care substratul este transformat în produs prin acțiunea unei

enzime depinde de concentrațiile atât ale enzimei, cât și ale substratului. Viteza
inițială a unei astfel de reacții este maximă și această viteză inițială de reacție
este cea care reflectă activitatea enzimei (figura 8.12). Factorul principal al
acestei scăderi este epuizarea substratului, dar cantitatea tot mai mare de produs
care com pet e pentru enzimă reduce, de asemenea, viteza reacției de avansare. În
plus, se poate produce inactivarea enzimei, în special dacă este vorba de un timp
de reacție apreciabil.
O curbă de reacție tipică a u n u i test direct cu o viteză inițială maximă este
adesea modificată într-o reacție cuplată, în care poate exista o perioadă inițială de
întârziere (figura 8.13) în timpul căreia produsele de legătură se acumulează până
la o concentrație constantă, iar viteza maximă este determinată de panta secțiunii
abrupte a curbei.
Măsurarea vitezei de reacție se face cel mai frecvent într-unul din cele
trei moduri. Viteza de reacție în termeni de epuizare a substratului sau de
enzimatică
Concentrația de Reacție inițiată prin adăugarea de enzimă
substrat
------ Secțiunea
{ aproximativ
liniară (20%)
-----
....................
0 Timp
Figura 8.12 Curba de progresie caracteri.stic a unei reacții catalizate de o enzimă.

Viteza de reacție scade de la o viteză inițială maximă, V0, care poate fi reprezentată de
tangenta la curbă la timpul zero. Viteza scade cel mai puțin în timpul primelor 15-20%
din variația totală a reacției.
acumularea produsului poate fi monitorizată prin înregistrarea variației de

concentrație și reprezentarea grafică a valorilor ca în figura 8.12. O astfel de
tehnică este cunoscută sub numele de analiză cinetică sau continuă. Cea
mai valabilă măsură a vitezei de reacție este viteza inițială, V0 , iar aceasta
poate fi determinată fie prin trasarea unei tangente la curbă la momentul zero,
fie prin utilizarea unui echipament electronic pentru a măsura variația din
primele câteva secunde. Prin urmare:
concentrația de enzimă a viteza (V0 )
Nu este întotdeauna posibil să se măsoare vitezele inițiale în acest mod

din cauza dificultăților de detectare a substratului sau a produsului, caz în care
se poate utiliza o metodă alternativă în care se măsoară cantitatea de substrat
utilizată pe o perioadă relativ lungă, dar determinată. Deși această metodă
poate fi predispusă la erori din cauza vitezei de reacție în scădere, ea poate fi o
metodă analitică valabilă, deoarece prima secțiune a curbei de progresie a
reacției este relativ liniară. Această secțiune liniară (figura 8.12) cuprinde, de
obicei, primele 10-20 % din variația totală posibilă și, cu condiția să se fi
demonstrat că timpul de analiză se situează în aceste limite, activitatea
enzimatică poate fi corelată cu cantitatea de substrat sau de produs
transformat. Astfel de metode sunt cunoscute sub denumirea de teste cu timp
fix. Prin urmare:
1
concentrația enzimei a
cantitatea de substrat
utilizată
o cantitate de produs format
O tehnică care depinde de aceeași ipoteză de bază ca și cea a timpului fix

--
280 Enzime
dar care raportează activitatea enzimatică la timpul necesar pentru formarea

unei cantități fixe de produs se numește analiză cu schimbare fixă. Este
deosebit de util pentru reacțiile care determină o modificare a pH-ului și care
pot fi monitorizate potențiometric. Prin urmare:
1
concentrația enzimei un
timp
Absorbanța I I I
(340 nm) '- Viteza de reacție în
- --- -::,. gol B
-
"'
-.., ....
'\ Laviteza de reacție

tal
V
Epuizarea
substratului
1
-..._ r
T
+
Exemplu Substrat
--0 ------------------ Timp

Figura 8.13 Urma de reacție tipică a unui test enzimatic cuplat. Reacția indicatoare
în multe teste cuplate va prezenta adesea o modificare demonstrabilă după adăugarea
probei, dar înainte de adăugarea substratului pentru enzima de testare. Această reacție
albă se poate datora prezenței unor substraturi endogene în probă, iar viteza sa (B)
trebuie măsurată pentru a putea calcula activitatea enzimei de testare (T - B) din viteza
totală de reacție (T) care rezultă din adăugarea substratului.
8.2.3 Cuantificarea activităților enzimatice

În mod normal, nu este posibil să se utilizeze preparate standard de enzime și,
deși sunt disponibile în comerț mostre de enzime pretestate, acestea sunt
utilizate de obicei în programele de asigurare a calității și nu ca standarde și,
în consecință, toate valorile de testare trebuie calculate pe baza vitezelor de
reacție măsurate sau a concentrațiilor de produs. Deoarece astfel de calcule
presupun că există o relație directă între viteza de reacție și concentrația
enzimei, este esențial, atunci când se stabilește o analiză, să se determine
intervalul efectiv de activitate pentru care această relație este liniară. Acest
lucru se realizează cel mai convenabil prin testarea unor diluții pregătite cu
grijă ale unei probe care conține o activitate enzimatică ridicată și prin
reprezentarea grafică a vitezelor de reacție rezultate în funcție de procentul de
diluție al probei (figura 8.14).
Activitatea enzimatică, exprimată în katals, reprezintă numărul de moli
de substrat absorbit de enzimă în 1 secundă. Se întâmpină adesea dificultăți
considerabile
enzimatică
în calcularea activității pornind de la primele principii și este important să se
aprecieze etapele necesare în acest calcul. Aproape invariabil, toate aceste
etape pot fi condensate într-un singur factor de conversie care poate fi aplicat
la viteza de reacție măsurată sau la citirea instrumentului pentru a calcula
activitatea enzimatică dintr-o probă. Procedurile de la 8.4 la 8.6 oferă detalii
privind calculele.
Viteza de reacție o.15

(M340run min-1)
Limita de liniar
0.10 -relație""
0.05
0 L.- . .... L,.. .. .
0 20 40 60 80 100
Concentrația enzimei (%)
Figura 8.14 Intervalul analitic efectiv al unui test enzimatic. Analiza o-aminoacid
oxidazei (EC 1.4.3.3.3), folosind metoda detaliată în procedura 8.5, arată un interval
analitic valabil până la o viteză maximă de reacție de 0,10 modificări ale absorbției pe
minut.
282 Enzime
Secțiunea 8.2
1. Ce cantitate de produs va fi formată în două minute de 10 mg dintr-
un preparat enzimatic cu o activitate specifică de 2,0 milickatal mg-
1
?
(a) 0,04 mol.
(b) 0,48 mol.
(c) 2,4 mol.
(d) 40 mol.
2. Dacă 1,0 ml de preparat enzimatic într-un volum total de analiză de
5,0 ml duce la formarea unei concentrații de 0,3 mmol 1-1 de produs
în IO minute, care este activitatea preparatului enzimatic în katal ml-
17
(a) 2,5 X 10-7katalm1-1.
(b) 1,5 X 10-5 katal m1-1.
(c) 1.2 X 10-3katalm1-1-1-
(d) 3,0 X 10-3 katal ml-1.
3. Viteza inițială a unei reacții este cea care reflectă cel mai bine
activitatea unei enzime.
PENTRU CĂ
viteza inițială a unei reacții catalizate de o enzimă este influențată de
temperatura ambiantă.
4. În testele cuplate, este esențial ca concentrația enzimei indicatoare să
fie menținută la un nivel scăzut.
PENTRU CĂ
cantitatea de produs formată de reacția de testare într-o analiză
cuplată este inițial foarte mică.
8.3.1 Metode gazometrice

Unele reacții catalizate de enzime au ca rezultat producerea sau absorbția unui
gaz, iar unele dintre primele metode de analiză au folosit acest fenomen ca
bază pentru monitorizarea reacției. În mod clasic, Krebs, în elucidarea
metabolismului glucozei, a folosit astfel de metode. Acestea măsoară fie
modificările de presiune care
.
Tehnici de 283
monitorizare
rezultă un volum fix (manometrie Warburg) sau modificările de volum
necesare pentru a menține o presiune constantă (respirometrie Gilson).
Aceasta din urmă este potențial mai utilă, deoarece concentrația molară a
gazului poate fi mai ușor de calculat din volum decât din modificările de
presiune, dar ambele tipuri de metode sunt extrem de plictisitoare și dificil de
realizat și, prin urmare, sunt rareori utilizate în prezent. Acestea au fost în
mare parte înlocuite de dispozitivele electrochimice de măsurare a gazelor.
Absorbția oxigenului de către enzimele oxidative și generarea de
dioxid de bonbon de către enzimele de decarboxilare sunt cele mai
frecvente reacții gazoase utilizate (tabelul 8.5). Unele reacții implică
ambele gaze și este posibil să se măsoare absorbția de oxigen în prezența
dioxidului de carbon prin includerea unui compartiment în vasul de reacție
care să conțină o soluție de hidroxid de sodiu pentru a absorbi dioxidul de
carbon. În cazul în care se generează amoniac, acesta este în general
reținut în soluție apoasă, cu condiția ca pH-ul să nu fie prea ridicat. Acesta
poate fi eliberat ulterior prin adăugarea unei soluții concentrate de
hidroxid de sodiu.
Tabelul 8.5 Exemple de metode gazometrice de dozare enzimatică
Enzima Numărul CE Substrat Produs Gaze schimbate
D-aminoacid oxidază 1.4.3.3 o-Aminoacizi/oxigen Amoniac Absorbția oxigenului

Malat dehidrogenază 1.1.1.38 Piruvat/dioxid de carbon Malat Absorbția dioxidului de
carbon
Catalaza 1.11.1.6 Peroxid de hidrogen Oxigen Eliberarea oxigenului
Colinesterază 3.1.1.8 Acetilcolină Acid acetic Eliberarea de dioxid de
carbon
din tamponul de
bicarbonat
Histidină decarboxilază 4.1.1.22 L-histidină Dioxid de carbon Eliberarea de dioxid de
carbon
Piruvat carboxilază 6.4.1.l Oxaloacetat/ ADP Dioxid de carbon Eliberarea de dioxid de
carbon
Volumul real al gazelor schimbate în timpul acestor reacții este foarte

mic și, prin urmare, dispozitivele de măsurare trebuie să fie foarte sensibile.
Deoarece ușoarele variații de temperatură afectează în mod semnificativ fie
volumul, fie presiunea unui gaz, este necesar un control strict al temperaturii.
Recipientele de reacție sunt de obicei baloane Warburg de formă
caracteristică, cu un număr variabil de brațe laterale. Majoritatea reactivilor
sunt conținuți în vasul principal, în timp ce cei care vor iniția reacția sunt
ținuți în brațele laterale. Cuva centrală este folosită pentru a ține un mic filtru
de hârtie înmuiat într-o soluție de hidroxid de sodiu pentru a absorbi orice
dioxid de carbon generat în timpul reacției. Reacția se declanșează prin
înclinarea balonului pentru a amesteca conținutul brațelor laterale și al vasului
principal.
În cazul tuturor metodelor gazometrice, este esențial ca toate
conexiunile și punctele de oprire să fie etanșe la gaz și, de obicei, aceste
conexiuni sticlă-capcană sunt lubrifiate cu unsoare de lanolină. Cu toate
acestea, este nevoie de o tehnică foarte atentă pentru a se asigura că sistemul
este etanș și este de dorit să se testeze dacă există scurgeri după ce sistemul a
fost configurat și înainte de inițierea reacției.
284 Enzime
Manometrie Warburg
Construcția de bază a unui manometru Warburg este ilustrată în figura 8.15 și
constă dintr-un manometru cu tub în U conectat printr-un braț lateral la
reactorul de reacție.
Tehnici de 285
monitorizare
balon, care este imersat într-o baie cu temperatură constantă. Membrul
manometrului este calibrat de la un punct mediu zero pe o distanță de 300
mm, iar compoziția fluidului este astfel încât presiunea exercitată de 10
000 mm să fie egală cu 1 atm.
Citirile obținute reflectă viteza reacției și, în multe cazuri, sunt
suficiente, deși este posibil să nu ofere informații cantitative privind cantitatea
de gaz eliberată. Pentru a lucra cantitativ, este necesar să se determine
constanta de balon (k), care ține cont de volumul total de gaz din sistem, de
solubilitatea gazului în apă și de temperatura absolută a reacției. Acest factor
poate fi apoi utilizat pentru a converti citirile presurizate în volum de gaz.
Oprire cu trei căi
Balon
Warburg
Braț lateral
Puțul central
Mem Mem
brul brul
exter inter
ior n
Figura 8.15 Manometrul Warburg. Înainte de a se efectua orice citire, lichidul

manometric din membrul interior este reglat în poziția zero cu ajutorul șurubului de
presiune de la baza manometrului. Modificările înălțimii (h) vor reflecta apoi
modificările de presiune din balon care rezultă din orice schimb de gaze în timpul
reacției.
286 Enzime
Respirometrie Gilson
Respirometrul Gilson (figura 8.16) utilizează un sistem de presiune constantă,
iar variațiile de volum ale gazului sunt compensate prin modificarea
volumului balonului cu ajutorul unei seringi calibrate. Presiunea generată de
balonul de testare și de conținutul acestuia este echilibrată în raport cu un
volum de gaz de referință cu ajutorul unui mic manometru indicator. Pe
măsură ce are loc schimbul de gaze, lichidul din manometru este menținut la
același nivel prin modificarea pistonului seringii (volumetru), care este
calibrat în microlitri. Citirea volumetrului oferă o măsură directă a volumului
de gaz schimbat, dar este totuși necesar să se corecteze valoarea pentru
temperatura și presiunea standard dacă sunt necesare rezultate critice:
La p
Volumul de gaz X -X -X -
T P0
unde T este temperatura absolută a reacției, T0 este
temperatura zero absolut (-273°C), P este
presiunea atmosferică de încercare,
P0 este presiunea atmosferică standard (760 mm mercur).
Volumul de gaz poate fi convertit în moli de gaz folosind faptul că 1 mol de
gaz la temperatura și presiunea standard ocupă 22,4 litri.
Metoda descrisă pentru dozarea o-arninoacidului oxidază în procedura
8.4 ilustrează utilizarea respirometrului Gilson în cadrul unui test gazometric.
Volurneter
Manometr
u indicator
Balon de testare Referință

balon
Figura 8.16 Respirometru diferențial Gilson. 'Volumul oricărui gaz schimbat poate fi
măsurat prin modificarea volumului balonului de testare cu ajutorul unui sistem de seringi
calibrate (volum ter) până când se restabilește echilibrul inițial al presiunii între balonul
de testare și cel de referință.
Tehnici de 287
monitorizare
8.3.2 Metode spectrofotometrice

Utilizarea spectrofotometriei pentru monitorizarea reacțiilor catalizate de enzime
(tabelul 8.6) este o metodă foarte convenabilă și populară datorită simplității
tehnicii și a preciziei posibile. Tehnica se pretează cu ușurință nu numai la
controlul temperaturii prin utilizarea de suporturi de celule încălzite cu apă
sau cu încălzire electrică, ci și la măsurarea vitezelor inițiale prin tehnici de
monitorizare și înregistrare continuă sau prin sisteme automate de analiză.
Deși numai un număr mic de substraturi sau produse prezintă maxime
de absorbție în regiunea vizibilă a spectrului, un număr considerabil de
substraturi și produse prezintă
286 Enzime
maxime în ultraviolet. Cu toate acestea, pentru a putea măsura viteza de

epuizare a substratului sau de formare a produsului, este necesar ca aceste
două componente ale reacției să prezinte caracteristici de absorbție diferite
pentru a permite măsurarea uneia dintre ele fără interferențe din partea
celeilalte.
Substanțele naturale care sunt utilizate cel mai frecvent sunt coenzimele
nucleotide NAD+ și NADP+, care sunt reduse în mod reversibil de multe
enzime:
NAD(P)+ + + H2 ,... NAD(P)H + H+
(oxidat) (redus)
Cele două forme ale acestor coenzime (oxidată și redusă) au caracteristici
spectrale diferite (figura 8.17), care permit ca forma redusă să fie detectată la
340 nm în prezența formei oxidate.
Absorbanța
NADH
Maxim de absorbție 340 nm
Figura 8.17 Spectrele

de absorbție ale
NAD+ și NADH. 200 300 400 500
Lungimi de undă (nm)
Substraturile naturale pentru multe enzime nu prezintă proprietăți

spectrale semnificative și se pot utiliza substraturi artificiale alternative
(analogi). Multe enzime hidrolitice pot fi detectate cel mai ușor prin utilizarea
de analogi ai substratului; glicozidele, de exemplu, pot fi măsurate folosind
derivați p-nitrofenilici ai carbohidraților corespunzători. Hidroliza duce la
producerea de p-nitrofenol, care poate fi măsurat la 404 nm.
Tabelul 8.6 Exemple de metode spectrofotometrice cu timp fix pentru dozarea
Tehnicienzimelor
de 287
monitorizare
Enzima Numărul CE Substrat Produs Măsurare
Glucoză oxidază 1.1.3.4 Glucoză Peroxid de hidrogen Oxidarea unui cromogen

Aspartat aminotransferaza 2.6.1.1 L-Aspartat Oxaloacetat Formarea unei hidrazone
Colinesterază 3.1.1.8 Acetilcolină Acetat Transformarea în hidroxamat
Aldolază 4.1.2.3 Fructoză-1,6-difosfat Fosfat de dihidroxiacetonă Formarea unei hidrazone
Izomeraza fosfat de glucoză 5.3.1.9 Glucoză-6-fosfat Fructoză-6-fosfat Reacția cu resorcinol
L-Glutamat sintetază 6.3.l.2 L-Glutamat/ ATP Fosfat Determinarea fosfatului
Tabelul 8.7 Exemple de metode fluorimetrice a testului enzimatic
Enzima CE nwnber Substrat Produs Lungimea de Lungimea de

undă de undă de
excitație emisie
(nm) (nm)
Monoaminooxidază 1.4.3.4 Kynurenine 4-hidroxichinolină 315 380

UDP-glucuroniltransferaza 2.4.1.17 4-metilwnbelliferonă 4-metilglucuronidă 340 440
Colinesterază 3.1.1.8 lndoxiacetat Indoxil 395 470
Lipază 3.1.1.3 Dibutiriilfluoresceină Fluoresceină 490 520
Notă: Toate testele enzimatice legate de NAD+- și NADp+- pot fi, de asemenea, monitorizate fluorimetric.
Compușii fluorescenți din fiecare test sunt indicați cu caractere aldine.
Tabelul 8.8 Exemple de metode electrochimice de dozare a enzimelor
Enzima CE nwnber Substraturi Produse Dispozitiv
o-Aminoacid oxidază 1.4.3.3 o-Aminoacizi/oxigen Amoniac Electrod selectiv pentru

Urat oxidază 1.7.3.3 Acid uric/oxigen Alantoină Acid amoniac Electrod pentru
Colinesterază 3.1.1.8 Acetilcolină acetic Acizi oxigen Electrod pentru
Lipază 3.1.1.3 Triacilgliceroli grași oxigen
Anhidraza carbonică 4.2.1.1 Dioxid de Bicarbonat Electrod de
carbon Glutamat decarboxilază 4.1.1.15 L-Glutamat 4-Aminobutirat/CO2 pH Electrod
arginază 3.5.3.1 L-Arginină L-Omithină/uree de pH
Electrod de
pH Electrod
de pH Electrod pentru uree
Electrod de dioxid de carbon Electrod selectiv pentru uree selectiv
Tehnici de 289
monitorizare
Au fost elaborate numeroase metode în care un produs al reacției este
modificat chimic pentru a produce o substanță cu o anumită proprietate spec
trală. Fosfatul anorganic eliberat prin hidroliza esterilor de fosfat poate fi
măsurat prin metode chimice simple (Fiske și Subbarow) după ce reacția
enzimatică a fost oprită. Aceste tehnici sunt adesea convenabile, dar nu se
pretează la măsurarea vitezei inițiale.
Testele enzimatice cuplate reprezintă o bună alternativă la modificarea
chimică și permit utilizarea unei tehnici cinetice. Într-un test cuplat, rata de
formare a produsului se măsoară prin utilizarea produsului reacției ca substrat
pentru o a doua reacție enzimatică, care poate fi monitorizată mai ușor.
Testele cuplate oferă o mare flexibilitate în metodologia enzimatică, păstrând
în același timp toate avantajele tehnicilor de monitorizare continuă și sunt
ilustrate de procedura 8.5.
290 Enzime

Utilizarea substraturilor sau a produselor fluorescente permite o măsurare
cinetică sensibilă a reacțiilor enzimatice și, deși există relativ puține
substraturi fluorescente naturale, se pot utiliza uneori analogi (tabelul 8.7).
Unii produse pot fi transformate în compuși fluorescenți și pot fi utilizate în
teste cu timp fix.
Metodele fluorimetrice sunt utile pentru monitorizarea reacțiilor care
implică coenzimele nucleotide. Fluorescența naturală a formelor reduse în
regiunea de 460 nm poate fi utilizată în testele cinetice. Cu toate acestea,
această fluorescență este distrusă la valori ale pH-ului sub 2,0, în timp ce
formele oxidate ale coenzimelor prezente sunt stabile. Dacă pH-ul soluției
este ridicat la peste 10,5 și încălzit, formele oxidate se transformă la rândul lor
în derivați fluorescenți. Această ultimă procedură se pretează la teste cu timp
fix, cum este ilustrat în procedura 8.6.
Metodele fluorimetrice, deși sunt sensibile în mod inerent, prezintă
dezavantaje semnificative care se referă la dificultățile tehnice ale
măsurătorilor de fluorescență. Mulți compuși fluorescenți sunt instabili, în
special la lumina ultravioletă, deși uneori este posibil să se mărească
stabilitatea prin includerea unor reactivi suplimentari, de exemplu imidazol.
Prezența altor substanțe fluorescente fie în probă, fie în reactivi, va da o
fluorescență de fond care va reduce sensibilitatea măsurătorilor. Aceasta este
o problemă, în special atunci când se analizează extracte de țesut etc., în care
aminoacizii aromatici din proteine vor contribui la fluorescență.
O problemă majoră în măsurătorile fluorimetrice este cauzată de faptul
că multe substanțe, adesea prezente în cantități mici ca impurități în reactivi și
solvenți, pot stinge radiația emisă de substanța fluorescentă. Din acest motiv,
este necesar să se utilizeze numai reactivi de cea mai mare puritate și să se
asigure că toate echipamentele sunt scrupulos de curate.
Tehnici de 291
monitorizare
8.3.4 Metode de luminescență

Bioluminescența oferă baza pentru metode sensibile de testare enzimatică atât
pentru testele de substrat, cât și pentru testele enzimatice cuplate. Luciferaza
licuriciului (EC 1.13.12.5) catalizează producerea de lumină (540-600 nm)
prin oxidarea luciferinei (o-LH2 ) (figura 8.18).
o-LH2 + ATP + 02 AMP + PP + o-L + o-L + CO2 + lumină

292 Enzime
Enzima este activată de ionii de magneziu, are un pH optim de

aproximativ 7,5 și oferă o metodă foarte sensibilă de testare a ATP, dar are
aplicații mult mai largi atunci când este utilizată în teste cuplate cu enzime de
conversie a ATP.
Luciferaza din surse bacteriene catalizează oxidarea aldehidelor
alifatice cu lanț lung și necesită coenzima FMN. Lungimea de undă a radiației
emise în această reacție este de aproximativ 490 nm:
FMNH2 + RCHO + 02 FMN + RCOOH + H20 + lumină

Reacția poate fi cuplată la oxidarea fie a NADH, fie a NADPH, prin prezența
unei flavină-dehidrogenaze, care este de obicei prezentă în complex cu
luciferaza:
NAD(P)H + FMNNAD (P)+ + + FMNH2
O gamă largă de teste cuplate care implică ATP, NAD(P)H și FMN
poate fi dezvoltată cu ajutorul acestor două enzime și oferă niveluri sporite de
sensibilitate față de alte teste cuplate (procedura 8.7).
HO
(X S
NXSXCO2OH
\N H
N,_/SyH2
D-Luciferină
Figura 8.18
HO s/'\N O
Luciferina, un substrat
pentru bioluminescență. Oxiluciferină
8.3.5 Metode electrochimice

Măsurarea pH-ului cu ajutorul electrodului de sticlă oferă o metodă foarte
convenabilă pentru monitorizarea reacțiilor în care se produce fie un acid, fie
o bază, în special anumite enzime hidrolitice (tabelul 8.8). Modificarea pH-
ului care rezultă din reacție are un efect asupra activității enzimei și, prin
urmare, asupra vitezei de reacție, iar pentru a menține reacția la pH-ul optim
și a măsura totuși cantitatea de acid sau de bază formată se poate utiliza un
sistem de pH-stat. Într-un astfel de instrument, ușoare modificări față de un
pH inițial preselectat activează o supapă solenoidă pentru a permite
adăugarea unui acid sau a unui alcalin pentru a menține pH-ul la valoarea
selectată. Reacția este monitorizată nu ca o modificare a pH-ului, ci ca volum
de titrant necesar pentru a menține pH-ul. O astfel de metodă evită, de
asemenea, dificultățile legate de măsurarea directă a modificării pH-ului în
prezența tampoanelor din amestecul de reacție.
Utilizarea electrozilor selectivi de ioni permite o utilizare mai largă a
metodelor electrochimice pentru monitorizarea formării anumitor produse, de
exemplu amoniac, în timp ce electrozii simpli de platină pot fi utilizați pentru
monitorizarea redox.
Tehnici de 293
monitorizare
reacții catalizate de oxidoreductaze sau de enzimele hidrolitice care utilizează
analogi ai substratului care provoacă modificări redox. Schimbul de oxigen
poate fi monitorizat cu un electrod de oxigen, ca alternativă la manometrie, și
sunt disponibile și alți electrozi, de exemplu de dioxid de carbon.
8.3.6 Metode microcalorimetrice

Aproape toate reacțiile catalizate de enzime sunt exotermice, iar modificarea
entalpiei (fl.HJ) implică eliberarea de energie sub formă de căldură. Creșterea
de temperatură rezultată, deși foarte mică, oferă o metodă nespecifică de
monitorizare a reacției. Majoritatea calorimetrelor utilizate în acest scop
măsoară creșterea temperaturii într-un recipient izolat (calorimetre adiabatice)
și, deși variația de temperatură poate fi de doar 1 X 10-3 °C, aceasta poate fi
detectată și măsurată cu ajutorul unor termistori.
Cantitatea de căldură degajată în timpul unei reacții este proporțională
cu cantitatea de substanță implicată, dar această relație este complicată de
reacțiile secundare în studiile enzimatice. Deși utilizarea constantelor
entropice înseamnă că, teoretic, calorimetria nu necesită standardizare, în
multe cazuri aceasta va fi necesară. Schimbarea inițială de energie poate fi
adesea îmbunătățită, ceea ce duce la o creștere a sensibilității metodei. Ionii
de hidrogen eliberați în timpul unei reacții, de exemplu, vor protoniza un
tampon cu o evoluție mai mare a căldurii.
294 Enzime
Glucoză+ ATP= glucoză-6-fosfat +ADP+ H+ AH= -27 kJ mo1-1 Tris +

H+ = Tris H+ dB= -47 kJ mo1-1
Total dB= -74 kJ mo1-1
În mod similar, utilizarea unor reacții cuplate poate asigura o eliberare
suplimentară de energie, de exemplu, determinarea cuplată a glucozei cu
ajutorul glucoxidazei (EC 1.1.3.4) și a catalazei (EC 1.11.1.6).
Glucoză + 02 = acid gluconic
I + H202 AH= -83 kJ mo1-1
H0 =H0+ AH= -125 kJ mo1-1
22 2
-0 2
2
Total AH= -208 kJ mo1-1
Deoarece schimbările de energie sunt atât de mici, microcalorimetria se
pretează mai degrabă la testele de substrat în prezența unui exces de enzimă
decât la testele enzimatice și este deosebit de utilă atunci când se utilizează
enzime imobilizate.
Secțiunea 8.3
1. Prin ce pot fi monitorizate reacțiile catalizate de enzime care implică
coenzima nucleotidă NAD?
(a) Fluorimetrie.
(b) Absorbția la 450 nm.
(c) Luminometrie.
(d) Schimbul gazos.
2. Ce implică reacțiile de bioluminescență?
(a) Un proces oxidativ.
(b) Enzima, amilaza licurici.
(c) Emiterea de radiații ultraviolete.
(d) Inhibarea de către proteine.
3. Spectrofotometria la 340 nm se pretează la testele enzimatice
cinetice PENTRU CĂ
NADH este o componentă a multor reacții enzimatice oxidative.
4. Reacțiile enzimatice care implică coenzimele nucleotide pot fi
adesea urmărite fluorimetric.
PENTRU CĂ
aproape toate reacțiile catalizate de enzime sunt exotermice.
Studiile privind conținutul enzimatic al celulelor implică în mod frecvent

utilizarea de eșantioane grosiere de origine animală sau vegetală. În astfel de
cazuri, poate fi necesară o disecție preliminară a țesutului pentru a izola
componentele relevante ale țesutului și pentru a îndepărta materialul structural
nedorit, cum ar fi colagenul, celuloza etc., înainte de a trece la o întrerupere
mai critică a celulelor. Uneori, este posibil să se utilizeze tehnica culturii de
țesuturi pentru a furniza prepa rații de celule pure pentru studii ulterioare.
Tratarea probelor pentru testul 295
enzimatic
8.4.1 Cultura de țesuturi
Cultura de țesuturi, mai frecvent utilizată sub denumirea de cultură celulară,
permite cultivarea în număr mare a celulelor animale și vegetale prin tehnici
comparabile cu cele utilizate în microbiologie, dar, din cauza naturii fragile a
celulelor, necesită condiții speciale de cultură. Mediile de cultură utilizate
trebuie să furnizeze toți factorii esențiali pentru creștere, cum ar fi o gamă
largă de aminoacizi, nucleotide, co-factori enzimatici, precum și factori
nedeterminați care pot fi furnizați numai în produse speciale, de exemplu ser
fetal bovin. Condițiile de mediu trebuie să fie controlate cu atenție, în special
pH-ul, iar acesta este frecvent menținut prin cultivarea într-un sistem tampon
de bicarbonat și într-o atmosferă saturată de dioxid de carbon.
Acumularea de produse reziduale inhibă creșterea și este necesar să se
schimbe mediul de cultură la intervale regulate, de obicei la câteva zile. Ca în
cazul tuturor tehnicilor de cultură celulară, asepsia este esențială, dar foarte
dificil de menținut. Prin urmare, antibioticele pot fi încorporate în mediile de
cultură pentru a ajuta la menținerea sterilității.
8.4.2 Depozitarea probelor pentru testul enzimatic

Toate probele trebuie depozitate în mod corespunzător pentru a minimiza
pierderea de activitate din cauza denaturării proteinelor, a lipsei de
stabilizatori sau a prezenței inhibitorilor. Condițiile optime de depozitare
variază în funcție de enzimele diferite și de natura probei, sânge, țesut etc.
Astfel de informații se vor căuta în manualele de specialitate.
În general, se recomandă adesea depozitarea la temperaturi scăzute,
cu molecule protectoare trimise în prealabil, de exemplu, depozitarea la -
20°C în ser albuș de bovine sau glicerol. O soluție de 50% (v/v) de glicerol
este deosebit de utilă, deoarece este încă fluidă la -20°C și, fiind neproteică,
poate fi ulterior îndepărtată foarte ușor. Pentru enzimele care sunt
predispuse la efecte oxidative, prezența unor substanțe reducătoare ușoare,
cum ar fi aminoacidul cisteină sau substanțe similare, poate fi benefică.
8.4.3 Tratarea eșantioanelor de țesuturi și celule

Foarte puține enzime sunt secretate de celule și este adesea necesar să se
întrerupă celulele pentru a demonstra activitatea enzimatică. Atunci când este
necesar conținutul total de enzime din celule, este necesar să le întrerupeți
complet și să eliminați toate particulele prin centrifugare, lăsând proteina
enzimatică dispersată în lichidul supranatural (figura 8.19). Multe enzime sunt
legate de membrană și sunt eliberate din membranele fragmentate numai dacă
în mediu se încorporează un detergent adecvat. Printre detergenții utilizați se
numără Triton XlOO și sărurile biliare, de exemplu, dezoxicolatul de sodiu.
Enzimele care nu prezintă o activitate maximă fără efectele de eliberare ale
detergenților sunt numite "latente". Cu toate acestea, multe studii celulare
necesită o întrerupere atentă a celulei și separarea ulterioară a diferitelor
organite celulare, cum ar fi mitoconiile, nucleele etc., printr-un proces
cunoscut sub numele de fracționare celulară.
Omogenizarea grosieră a țesuturilor poate fi realizată cu unul dintre cele
mai mari
296 Enzime
Mișcarea
omogenizatorului
I
Celula
de
lichi
d
suspensie
Congelat
suspensie
celulară
(a) (b)
Figura 8.19 Omogenizatoare de celule. Membranele celulare sunt perturbate de

efectele de forfecare datorate faptului că sunt forțate prin deschideri înguste. În cazul
omogenizatorului Potter (a), spațiul dintre piston și pereții tuburilor este esențial pentru
determinarea amplorii efectului perturbator, iar în cazul sistemelor de presare a
celulelor, (b) perturbarea este cauzată de forțarea rapidă a unei suspensii de celule
congelate printr-o gaură mică.
instrumente cu lamă cu viteză mare, cunoscute de obicei sub numele de

mixere, și, deși sunt utilizate în general pentru a produce dispersii celulare din
țesuturi tăiate, acestea cauzează, de asemenea, daune considerabile celulelor
atunci când sunt utilizate la viteze mari. Prin urmare, acestea sunt utilizate în
principal pentru omogenizarea preliminară a probelor de țesut înainte de
întreruperea celulară completă a acestora cu ajutorul unei tehnici alternative.
Pentru eșantioane mai mici de țesut, există diverse instrumente cu lame
cilindrice rotative care, deși provoacă o dezintegrare generală a țesuturilor, pot
fi controlate pentru a produce o deteriorare celulară mai specifică. Pe lângă
efectele tăietoare ale lamei rotative, astfel de instrumente generează adesea
efecte ultrasonice datorită designului în formă de castele al lamelor.
Multe celule, în special bacteriile, drojdiile etc., necesită măsuri foarte
drastice pentru a le dezintegra, iar în acest scop sunt disponibile diverse
dezintegratoare de celule. Vibrațiile ultrasonice determină formarea de bule
minuscule, fenomen cunoscut sub numele de cavitație, care este cauzat de
variațiile extreme de presiune generate de undele sonore, deși generarea de
căldură poate cauza probleme dacă probele nu sunt răcite frecvent în timpul
Tratarea probelor pentru testul 295
enzimatic
tratamentului. Un alt aspect

Metode de testare a 297
substratului
pericolul constă în potențialul de deteriorare a auzului și este necesar să se
folosească o protecție fonică în jurul instrumentului.
Efectele de forfecare sunt adesea utilizate pentru a distruge celulele și
probabil cel mai frecvent utilizat este omogenizatorul Potter, care constă într-
un tub de sticlă cu un pistil de PTFE cu fixare strânsă, care poate fi utilizat fie
manual, fie acționat de un motor cu viteză variabilă. Distanța dintre pistil și
pereții tubului este esențială pentru a obține gradul de fragmentare necesar.
Un spațiu de aproximativ 0,25 mm este utilizat frecvent pentru prepararea
suspensiilor mitocondriale (figura 8.19). Tehnicile alternative de forfecare
disruptivă includ forțarea unei probe congelate printr-un orificiu foarte mic
sub presiune ridicată sau scuturarea cu bile mici de sticlă.
Au fost descrise multe metode de fracționare a organitelor celulare și
probabil că nu este posibilă o metodă care să fie la fel de eficientă pentru
conservarea fiecărei componente individuale. Pentru fiecare tip de celulă ș i
organite trebuie selectată ș i evaluată metoda cea mai adecvată.
Enzimele subcelulare
Este adesea necesar să se evalueze eficiența procedurilor de fracționare a
celulelor. Microscopia electronică a fracțiilor preparate este foarte
informativă, dar nu oferă nicio indicație cantitativă privind puritatea fracției.
Este adesea mai ușor să se măsoare concentrațiile relative ale enzimelor
marker în fiecare fracție (tabelul 8.9).
Se presupune că aceste enzime marker sunt asociate doar cu una dintre
organitele celulare și, prin urmare, concentrațiile relative ale acestora în
fiecare fracție vor oferi o indicație a gradului de contaminare încrucișată în
cadrul preparatelor. Există o dezbatere considerabilă cu privire la validitatea
acestei ipoteze, iar informații mai precise pot fi obținute din textele de
specialitate.
Tabelul 8.9 Markerii de organite
Structura Enzima Numărul CE
Citoplasmă Lactat dehidrogenază l. l. l. l.27

Membrană Adenilat ciclaza 4.6.1.1
Reticulul endoplasmatic Glucoză-6-fosfatază 3.1.3.9
Lisosomi Fosfatază acidă 3.1.3.2
Peroxizomii Catalaza 1.11.l.6
Mitocondrii
Membrana interioară Citocrom c oxidază 1.9.3.l
Membrana exterioară Amină oxidază 1.4.3.4
Matricea Glutamat dehidrogenază 1.4.1.3
Nucleu NMN adeniltransferază 2.7.7.l
Enzimele sunt instrumente analitice extrem de utile, în primul rând datorită

specificității lor. În prezent, un număr foarte mare de enzime sunt disponibile
în comerț în diferite forme de puritate și, deși costul lor este adesea ridicat, de
obicei sunt necesare doar cantități mici. Procedura 8.8 descrie o metodă cu
timp fix pentru cuantificarea o-alaninei folosind o-arninoacid oxidază.
298 Enzime
Metode de testare a 299
substratului
8.5.1 Metode cu punct final
În cea mai frecvent utilizată metodă de cuantificare a substratului, se măsoară
valoarea totală a modificării care rezultă din prezența substratului și se
utilizează pentru a calcula cantitatea inițială de substrat prezentă. Trebuie să
existe o activitate enzimatică adecvată pentru a se asigura că transformarea
substratului în produs are loc într-o perioadă de timp rezonabilă, dar spre
sfârșitul unei reacții, concentrația substratului va fi foarte scăzută, iar timpul
necesar pentru a ajunge la poziția de echilibru va fi relativ lung. Raportul V
ma/Km este util pentru a evalua cantitatea de enzimă necesară, iar valorile
numerice de aproximativ
1.0 sunt recomandate. Cu condiția ca concentrația substratului să fie mai mică
decât valoarea Km, aceste condiții vor duce la un timp de reacție de puțin
peste 3 minute pentru o conversie de aproximativ 99% a substratului.
Reacțiile nu se finalizează neapărat până la capăt și, indiferent de
cantitatea de enzimă utilizată, poziția de echilibru a reacției nu se va schimba.
Pentru măsurătorile cantitative, este important ca reacția să se apropie cât mai
mult posibil de finalizare, iar acest lucru poate fi realizat printr-o varietate de
metode. Poziția de echilibru poate fi modificată prin schimbarea pH-ului față
de cel optim pentru enzimă. De exemplu, poziția de echilibru pentru reacția în
care piruvatul este transformat în lactat de către lactat dehidrogenază (EC
1.1.1.1.27) este foarte mult în favoarea piruvatului la pH-ul normal de 7,6,
dar la pH-ul de 9,0 echilibrul se modifică în favoarea lactatului.
În reacțiile cu doi și trei substraturi, utilizarea unor concentrații ridicate
ale celui de-al doilea și al treilea substrat va deplasa echilibrul reacției de
testare spre formarea produsului, iar utilizarea unei a doua reacții care are ca
rezultat regenerarea unuia dintre substraturile inițiale din produsul său va forța
în mod similar conversia substratului de testare. Analiza glu tamatului, de
exemplu, poate fi realizată cu ajutorul enzimei glutamat dehidrogenază (EC
1.4.1.3), în care oxoglutaratul este produsul, iar reacția poate fi forțată aproape
până la finalizare prin încorporarea piruvatului și a lactatului dehidroge nază
(EC 1.1.1.27) pentru a regenera NAD+ utilizat în reacția de testare (figura
8.20). Ulterior, se poate determina cantitatea de oxoglutarat formată și se
poate calcula cantitatea inițială de glutamat. Sistemele ADP/ATP se pretează,
de asemenea, foarte bine la această abordare, folosind enzima piruvat kinaza
(EC 2.7.1.40) și fosfoenolpiruvatul pentru a regenera ATP.
De asemenea, testele de determinare a punctului final pot utiliza sisteme
enzimatice cuplate, în care produsul reacției de testare furnizează substratul
pentru reacțiile auxiliare și indicatoare ulterioare. Alegerea pH-ului este mai
puțin critică decât în cazul măsurării activității enzimatice: în mod frecvent se
folosește un pH de compromis și
)
Glutamat
dehidrogenază
---------------------NADH + oxoglutarat
Figura 8.20 Lactat dehidrogenază

Reciclarea NAD+ într-un - ------------------------ NADH + piruvat
test de L-glutamat.
300 Enzime
creșterea cantității de enzimă utilizată pentru a compensa orice pierdere de

activitate. Alternativ, reacția poate fi finalizată în două etape, modificând pH-
ul prin utilizarea atentă a sistemelor tampon pentru a doua etapă a reacției.
Pentru cuantificarea zaharozei se utilizează /3-0-fructofuranozidază
(invertază) (EC 3.2.1.26) la pH 4,6 și, după o perioadă de timp adecvată, pH-
ul se schimbă la 7,5 pentru a se finaliza a doua etapă a reacției:
/3-0-fructofuranozidază
zaharoz glucoză + fructoză pH 4,6 acid
glucoxidază
ă gluconic + H202 pH 7,0
glucoză
peroxidază
culoare pH 8,0
Ciclul enzimatic
Concentrațiile foarte mici de substraturi pot fi analizate prin reciclarea
substratului de testat pentru o perioadă de timp apreciabilă, dar definită, și prin
măsurarea cantității de produs format. Coenzima NADPH, de exemplu, poate
fi analizată cu ajutorul celor două enzime glutamat dehidrogenază (EC
1.4.1.3) și glucoză-6-fosfat dehidrogenază (EC 1.1.1.1.49):
NADPH + oxoglutarat + NH3 = NADP+ + L-glutamat
NADP+ + glucoză-6-fosfat = NADPH + 6-fosfogluconat

Amestecul de reacție conține oxoglutarat, amoniac, glucoză-6-fosfat și cele
două enzime. Reacția este inițiată prin adăugarea substratului de testare
(NADPH) și se lasă să continue pentru un timp definit. Reacția este oprită și
enzimele sunt inactivate, de obicei prin căldură. Cantitatea de 6-fosfogluconat
care s-a acumulat se determină cu ajutorul unei metode adecvate, iar aceasta
se raportează la cantitatea de NADPH prezentă inițial. În acest caz, produsul
poate fi determinat folosind glucoza-6-fosfat dehidrogenază și monitorizând
oxidarea excesului de NADPH. Aceste metode necesită o calibrare cu cantități
cunoscute de substrat de testare.
8.5.2 Metode cinetice

Metodele cinetice directe comparabile cu cele utilizate pentru testele
enzimatice sunt în general fezabile numai cu instrumente automate, din cauza
dificultății de măsurare a vitezei de reacție care scade rapid pe măsură ce
concentrația scăzută de substrat se epuizează în continuare.
Cu toate acestea, testele cinetice care utilizează sisteme cuplate în care
concentrația substratului este menținută constantă printr-un proces de reciclare
se pot preta la o utilizare mai generală. Într-o astfel de situație, viteza reacției
indicatoare va rămâne, de asemenea, constantă și poate fi corelată cu
concentrația inițială a substratului. Cantități mici de coenzimă NAO+ pot fi
măsurate prin cuplarea reducerii sale la NADH cu reducerea simultană a
citocromului c, proces care poate fi monitorizat la 550 de curse (figura 8.21).
Reactivul de analiză conține etanol și citocrom c, împreună cu enzimele alcool
dehidrogenază (EC 1.1.1.1.1) și citocrom c reductază (EC 1.6.99.3). La
inițierea reacției cu
Analiză automatizată 301
care conține NAD+, se dezvoltă rapid o stare de echilibru în care rata de

reducere a citocromului c reflectă concentrația de NAD+.
Analizele cinetice directe sunt singurele metode valabile pentru
măsurarea activatorilor și inhibitorilor și se pot realiza diagrame de calibrare
a procentajului de activare sau inhibiție prin cantități cunoscute de substanță.
Printre exemplele de teste de inhibiție se numără cuantificarea pesticidelor
organofosforice prin inhibarea colinesterazei (EC 3.1.1.1.7), în timp ce
manganul poate fi măsurat în cantități de până la 1 X 10-12 mo! prin efectul său
activator asupra izoci trate dehidrogenazei (EC 1.1.1.1.41).
alcool dehidrogenază
NAD+ + etanol acetaldehidă + NADH
( )
+NADH
Figura 8.21 O analiză cinetică a NAD+. Rata de creștere a absorbanței la 550 nm pe

măsură ce citocromul c este redus este o măsură a concentrației de NAD+ în stare de
echilibru.
Există multe instrumente concepute fie pentru testele enzimatice, fie pentru
testele de substrat care utilizează enzime. Informațiile privind capacitățile
analitice ale acestor instrumente vor fi furnizate de către producători. Acestea
vor include adesea protocoale pentru teste specifice care utilizează kituri de
reactivi pregătiți în prealabil și disponibili în comerț. Aceștia pot fi sub formă
lichidă sau uscată și, pentru testele de substrat, pot include enzime
imobilizate. Posibilitatea de a dezvolta metode automate suplimentare pe un
anumit instrument depinde de designul acestuia, iar unele instrumente sunt
dedicate exclusiv unor analize specifice.
Multe instrumente automate măsoară activitatea enzimatică folosind
metode colorimetrice cu timp fix. Cu toate acestea, unele dintre ele pot fi
clasificate ca fiind analizoare de viteză de reacție, de exemplu analizoarele
centrifugale, iar aceste instrumente determină viteza de reacție fie din panta
inițială a curbei de reacție, fie din măsurători repetate la intervale fixe. În
ambele metode, se consideră că panta liniei reprezintă activitatea enzimei.
Principala funcție tehnică a unui analizor de viteză de reacție este
adăugarea și amestecarea automată a reactivilor și a probei în condiții de
temperatură atent controlate și monitorizarea reacției imediat după inițiere.
Datele generate sunt prezentate în diferite forme, dar toate implică un anumit
grad de informatizare. Cele mai versatile tipuri de instrumente sunt cele care
utilizează sisteme de detecție spectrofotometrică și cele care utilizează teste
legate de NADH. Unele instrumente sunt dedicate unor metodologii specifice
care adesea
302 Enzime
implică electrozi selectivi de ioni sau reactivi preparați în comerț și, prin
urmare, pot fi restricționate pentru utilizare generală.
Prezența unei perioade de decalaj în multe teste cuplate și dificultățile în
determinarea porțiunii liniare a unei curbe reprezintă principalele probleme în
calcularea activității enzimatice cu ajutorul analizoarelor de viteză de reacție.
În cazul celor mai simple instrumente, panta curbei în primele câteva secunde
ale reacției este extrapolată într-o linie dreaptă sau, dacă se știe că reacția
prezintă o perioadă de întârziere, se poate măsura viteza de reacție după o
perioadă de timp definită. Instrumentele mai sofisticate utilizează
microcalculatoare pentru a determina porțiunea liniară a curbei și pentru a
calcula activitatea enzimatică direct din pantă. Derivata a doua a curbei de
progresie a reacției (rata de variație a pantei) poate fi monitorizată de
calculator și, atunci când se menține o valoare zero pentru o perioadă de timp
(10-15 secunde), aceasta indică o secțiune liniară a graficului. Din valoarea
pantei se poate calcula activitatea enzimatică.
O abordare alternativă implică măsurarea timpului necesar pentru mici
modificări fixe ale absorbanței și calcularea ratei pentru fiecare măsurătoare
în parte. Calculatorul stochează și compară toate valorile, selectând în final
panta secțiunii liniare a curbei și calculând din nou activitatea enzimatică.
Este posibil să se lege enzimele de o matrice insolubilă printr-o varietate de

metode și să se păstreze în continuare activitatea lor catalitică. Caracterul
reutilizabil al enzimelor imobilizate poate reduce semnificativ costurile și
oferă o sursă convenabilă de enzime pentru efectuarea de teste de substrat.
Astfel de preparate prezintă adesea o stabilitate mai mare și efecte de inhibiție
reduse decât enzimele solubile, deși, ocazional, valorile optime ale pH-ului
pot fi ușor alterate.
Legătura covalentă cu o varietate de polimeri folosind reziduuri de
aminoacizi neesențiali este o metodă convenabilă de imobilizare. Inactivarea
enzimei în timpul procesului poate fi redusă în mod semnificativ prin prezența
unui inhibitor competitiv al enzimei. Tehnicile de imobilizare fizică (figura
8.22) sunt mai puțin drastice decât legarea covalentă, dar pot apărea unele
modificări ale proprietăților enzimei, de exemplu, pH-ul optim și efectele de
activare. Enzimele pot fi adsorbite pe o varietate de materiale polare, cum ar fi
cărbunele, gelul de silice, alumina și rășinile schimbătoare de ioni și, deși
aceasta este o tehnică simplă, o problemă majoră constă în ușurința cu care
enzimele pot fi desorbite ca urmare a variațiilor de pH și de concentrație a
tamponului, etc. Formarea unui polimer reticulat, adesea poliacrilamidă, în
prezența enzimei are ca rezultat captarea moleculelor de enzimă în matricea
polimerului, dar permite totuși accesul moleculelor mici de substrat la enzime.
Alternativ, enzimele pot fi încapsulate prin producerea unei emulsii a unei
soluții apoase de enzimă într-un solvent organic. Picăturile sunt stabilizate
prin adăugarea unui polimer adecvat care, după ce formează o membrană în
jurul picăturilor, se lasă să se întărească, iar capsulele pot fi apoi spălate
pentru a fi curățate de ceilalți reactivi. Membrane semipermeabile adecvate
pot fi produse cu o varietate de reactivi, inclusiv colodiu și polistiren.
Enzime imobilizate 303
Capcana
Figura 8.22
Metode generale de
imobilizare a Încapsulare Adsorbție
enzimelor.
Enzimele imobilizate pot fi utilizate în metodele de cromatografie de

afinitate, dar utilizarea lor ca catalizatori poate fi fie în producerea sau
eliminarea de substanțe chimice în procesele chimice, fie ca instrumente
analitice. Multe teste de substrat pot fi efectuate folosind enzime imobilizate
pe o varietate de suprafețe, de exemplu, bile de sticlă, tuburi de plastic sau de
nailon. Alternativ, ele pot fi încorporate în gel sau în straturi microparticulare
pe benzi sau lame uscate.
Enzimele imobilizate utilizate împreună cu electrozi selectivi de ioni
oferă metode de analiză foarte convenabile. Enzima imobilizată poate fi ținută
într-un gel sau într-o membrană în jurul electrodului, iar substanța care trebuie
măsurată difuzează în gelul enzimatic. Transformarea acesteia în produs
modifică echilibrul ionic pe membrana selectivă de ioni (figura 8.23). Este
important ca stratul de enzimă să fie subțire, pentru a minimiza orice
probleme cauzate de vitezele lente de difuzie prin strat.
Principalul avantaj al electrozilor enzimatici constă în simplitatea
metodei de analiză, deși prezența ionilor interferenți poate reprezenta o
problemă, în special atunci când se utilizează electrozi sensibili la cationi.
Metodele de construcție a electrozilor enzimatici sunt discutate în secțiunea
privind biosenzorii.
Determinările de substrat (tabelul 8.10) cu ajutorul electrozilor
enzimatici trebuie efectuate în condiții controlate de temperatură și pH, iar
dacă se utilizează soluții standard pentru calibrarea electrodului, acestea
trebuie analizate în același timp. Timpul de răspuns al unor electrozi
enzimatici poate fi de câteva minute și, deși pentru mulți dintre ei timpul este
mai scurt, acest factor trebuie luat în considerare în proiectarea unei metode
de analiză.
304 Enzime
Membrană selectivă
de ioni
Semi- t?:- Enzima imobilizată

Figura 8.23 ;6.(;,<:,<:,<:,/V'vVvvv,
Un electrod membrană
enzimatic. permeabilă
Tabelul 8.10 Teste de substrat care utilizează electrozi enzimatici
Substrat Enzima Substrat sau produs măsurat Sistem de

electrozi
Aminoacizi o- și L-aminoacizi oxidaze Peroxid de Cation de
hidrogen Amoniac platină
Etanol Alcool oxidază Peroxid de Cation de
hidrogen Oxigen platină
Glucoză Glucoză oxidază Peroxid de Oxigen
hidrogen Oxigen de
L-Glutamat Glutamat dehidrogenază Amoniac Ioni de platină
Acid lactic Lactat dehidrogenază ferocianură Oxigen
Uree Urează Amoniac de
platină
Cation de
platină
Secțiunile 8.4/5/6/7 Cation de
1. Care dintre următoarele substanțe pot fi utile pentru stabilizarea
platină
soluțiilor de enzime?
(a) Proteine.
(b) Sărurile biliare.
(c) Acizi nucleici.
(d) Aminoacizi.
2. Cum sunt cunoscute enzimele asociate cu organitele subcelulare?
(a) Enzime secretate.
(b) Enzimele solubile.
(c) Enzime de marcare.
(d) Enzime indicatoare.
Lecturi 305
suplimentare
3. Metodele cu punct final pentru cuantificarea substraturilor nu

sunt adecvate atunci când testul implică sisteme de reacție
cuplate, deoarece
sunt disponibile instrumente automate care pot efectua teste cinetice ale
substraturilor.
4. Legătura covalentă a proteinelor cu polimeri insolubili este
nepotrivită ca metodă de imobilizare a enzimelor
PENTRU CĂ
orice modificare chimică a unei enizme o inactivează întotdeauna.
Bergmeyer, H.U. (ed.) (1993) Methods of enzymatic analysis, ediția a 3-a, VCH
Publishers, SUA.
Palmer, T. (1995) Understanding enzymes, ediția a 4-a, Horwood (Ellis) Ltd, UK.
Eisenthal, R. și Danson, M.J. (eds) (1992) Enzyme assays - a practical approach,
IRL Press, Regatul Unit.
Rothe, G.M. (1994) Electrophoresis of enzymes, Springer-Verlag, UK.
Davis, J.M. (1995) Basic cell culture: a practical approach, Oxford University Press,
UK.
--
9 Carbohidrați
• Structura și funcția generală

• Metode chimice de analiză a carbohidraților
• Metode enzimatice de analiză a carbohidraților
• Separarea și identificarea amestecurilor de carbohidrați
Carbohidrații sunt aldehide sau cetone de alcooli polihidroxilici superiori sau

componente care produc acești derivați prin hidroliză. Aceștia apar în mod
natural în plante (unde sunt produși fotosintetic), animale și microorganisme
și îndeplinesc diverse roluri structurale și metabolice. Monozaharidele sunt
cei mai simpli carbohidrați și apar adesea în mod natural ca unul dintre
derivații lor chimici, de obicei ca și componente ale dizaharidelor sau
polizaharidelor.
Se întâmpină dificultăți în analiza calitativă și cantitativă a
amestecurilor de carbohidrați din cauza similitudinii structurale și chimice a
multora dintre acești compuși, în special în ceea ce privește stereoisomerii
unui anumit carbohidrat. În consecință, multe metode chimice de analiză nu
sunt capabile să facă diferența între diferiți carbohidrați. Specificitatea
analitică poate fi îmbunătățită prin separarea preliminară a componentelor
amestecului cu ajutorul unei tehnici cromatografice înainte de cuantificare, iar
tehnici precum cromatografia gaz-lichid și cromatografia lichidă sunt
deosebit de utile. Cu toate acestea, disponibilitatea preparatelor purificate ale
multor enzime implicate în mod special în metabolismul carbohidraților a dus
la dezvoltarea multor metode de analiză relativ simple, care au specificitatea
necesară și o sensibilitate ridicată și utilizează reactivi mai puțin toxici.
Pregătirea probei înainte de analiză va depinde atât de natura probei, cât
și de metoda analitică aleasă și poate implica întreruperea celulelor, proceduri
de omogenizare și de extracție, precum și îndepărtarea proteinelor sau a altor
substanțe care interferează. Poate fi necesar să se prevină descompunerea și
degradarea conținutului de carbohidrați în timpul acestor tratamente sau în
timpul depozitării, prin adăugarea de agenți antibacterieni, cum ar fi timolul
sau mertiolatul, sau de substanțe, cum ar fi ionii de fluor, care vor inhiba
transformarea enzimatică a carbohidraților.
Monozaharidele sunt compuse din carbon, hidrogen și oxigen și au formula

generală CnHznOn. De obicei, ele sunt clasificate în funcție de numărul de
atomi de carbon pe care îi conțin și de natura grupei carbonil reactive, adică o
aldehidă sau o cetonă (tabelul 9.1). Numărul de atomi de carbon dintr-o
monosacaridă poate varia de la trei la nouă, deși cele mai frecvente sunt cele
compuse din șase sau mai puțin, dintre care hexosele sunt deosebit de
importante. Monozaharidele sunt adesea reprezentate ca structură liniară, dar,
datorită naturii reactive a grupului carbonil, cele compuse din cinci sau mai
mulți atomi de carbon există de obicei în forme ciclice și sunt prezente ca
atare în moleculele mai complexe de carbohidrați.
Tabelul 9.1 Exemple de monosacaride care apar în mod obișnuit
Formula Nume trivial

Clasa Numărul de
generală atomi de carbon Aldose Cetose
Trioses 3 C3H603 Glicerină Dihidroxiacetonă

(gliceraldehidă)
Tetroses 4 C4 H804 Erythrose Eritruloză
Pentose 5 CsH100s Riboză Ribuiose
Hexoses 6 C6H1206 Glucoză Fructoză
9.1.1 Stereolsomerie
Deși aproape toți compușii de origine biologică conțin unii atomi de carbon
asimetrici, fenomenul de stereoisomerie este deosebit de important în cazul
carbohidraților. Cea mai simplă aldoză, gliceraldehida, are doar un singur
atom de carbon asimetric sau centru chiral (carbonul 2) și, prin urmare, sunt
posibile doar două aranjamente posibile ale OH și H din unitatea CH2 OH.
Dacă gruparea OH este prezentată ca fiind proiectată spre stânga pe
penultimul atom de carbon în reprezentarea în lanț drept a moleculei, atunci,
prin convenție, molecula se numește izomerul L, în timp ce dacă gruparea OH
este prezentată ca fiind proiectată spre dreapta, aceasta este cunoscută sub
numele de izomerul D. Acești doi stereoizomeri ai acelorași carbohidrați sunt
enantiomeri sau imagini în oglindă unul față de celălalt.
Toți carbohidrații pot exista în oricare dintre aceste două forme, iar
prefixarea D sau L se referă doar la configurația din jurul atomului de carbon
asimetric cu numărul cel mai mare. Enantiomerii au același nume (de
exemplu, D-glucoză și L-glucoză) și sunt compuși asemănători din punct de
vedere chimic, dar au proprietăți optice diferite. Majoritatea monosacaridelor
care apar în mod natural, fie că sunt aldoze sau cetoze, au configurația D.
Cei doi izomeri ai gliceraldehidei (figura 9.1) sunt compușii părinți ai
așa-numitei serii D și L a aldoselor. O serie similară de car bohidrați poate fi
derivată pentru cetoze, dar deoarece compusul părinte
308 Carbohidrați
Număr
ul
atomilo
r de
carbon
CHO CHO
I I
HO*CH 2 H*COH
I I
CH2OH 3 CH2OH
L-Gliceraldehidă D-Gliceraldehidă
Figura 9.1 Enantiomeri ai gliceraldehidei. Enantiomerii sunt imagini în oglindă unul

față de celălalt și sunt asemănători din punct de vedere chimic, dar vor face ca un
fascicul de lumină polarizată plană să se rotească în direcții opuse. Gliceraldehida are
un singur centru asimetric (*), iar denumirea de D sau L este determinată de orientarea
grupărilor O și OH în jurul acestui atom de carbon. În cazul carbohidraților cu mai
mult de un atom de carbon asimetric, prefixul O sau L se referă numai la configurația în
jurul atomului de carbon asimetric cu numărul cel mai mare, deși în astfel de
enantiomeri configurația în jurul tuturor centrelor asimetrice va fi, de asemenea,
inversată.
CH2OH
I
C=O
I
CH2OH
Dihidroxiacetonă
CH2OH
I
C=O
/ --1--
--2--
CH2OH -
I
C=O
I I
HO*CH --3-- H*COH
I I
CH2OH --4-- CH2OH
L-eritrouloză-eritroză
Figura 9.2 Dihidroxiacetona și enantiomerii eritrozei. Trioza, dihidroxiacetona, este

compusul părinte al cetozelor, deoarece are cel mai mic număr de atomi de carbon, dar
nu conține un centru asimetric. Prin urmare, seriile o și L ale cetozelor se construiesc din
cei doi enantiomeri ai tetrazei, eritruloza, care are un atom de carbon asimetric (*).
dihidroxiacetona nu conține un atom de carbon asimetric, seria este construită

din cetoetaroza, eritruloza (figura 9.2), care se formează atunci când se
adaugă o grupare CHOH la dihidroxiacetonă.
De fiecare dată când numărul de atomi de carbon este mărit cu unul
(prin adăugarea unei grupe CHOH), se produce un nou carbohidrat care are o
formă chimică distinctă și un nume complet diferit. Deoarece acest grup
poate fi adăugat fie ca HO-C-H, fie ca H-C-OH, se creează un centru

asimetric (chi ral) suplimentar în moleculă, ceea ce îi permite să existe în
două forme izomere. Acești doi noi izomeri care diferă doar printr-un singur
centru asimetric se numesc epimeri, iar fiecare epimer are un nume propriu
(figura 9.3).
Fiecare serie este construită prin adăugarea de unități CHOR
suplimentare între carbonul I și carbonul 2 pentru a produce un număr tot mai
mare de izomeri, numărul real fiind 2n, unde n este numărul de centri chirali
suplimentari. Astfel, există opt stereoizomeri ai o-aldohexozelor (figura 9.3),
opt stereoizomeri ai
CHO
I
HCOH
I
CH2OH
/ D-Gliceraldehidă
CHO CHO
I I
HCOH HOCH
I I
HCOH HCOH
I I
CH2OH CH2OH
/ D-eritroză \ /D-Threose
CHO CHO CHO CHO

I I I I
HCOH HOCH HCOH HOCH
I I I I
HCOH HCOH HOCH HOCH
I I I I
HCOH HCOH HCOH HCOH
I I I I
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
D-Riboză-D-Arabinoză-Xiloză D-Lixoză
CHO
I\ CHO CHO
/\ CHO CHO
/\ CHO CHO
/\ CHO
I II I I I I I I
HCOH HOCH HCOH HOCHHCOH HOCHHCOH HOCHHCOH
HOCH I I I I I I I I
HCOHHCOH HOCHHOCH HCOH HCOH HOCHHOCH
I II I II I II I
HCOH HCOH HCOH HOCH HOCH HOCH HOCH HOCH I I
HCOH
HCOH HCOH
IIIIIIIIIIII
! I HCOH HCOH HCOH HCOH HCOH HCOH
I I I I I
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH lH20H CH2OH CH2OH CH2OH
CH2OH CH2OH CH2OH
o-Altoză D-Altroză D-Glucoză D-Manoză D-Guloză D-Glucoză D-Ldoză D-Galactoză o-Taloză
Figura 9.3 Stereoisomerii D-aldoselor. o-Riboza și o-arabinoza diferă doar prin

configurația lor în jurul unui singur atom de carbon (carbonul 2) și sunt exemple de
epimeri. Diastereoizomerii sunt stereoisomeri care nu sunt enantiomeri unul altuia, ci
sunt forme distincte din punct de vedere chimic, cele opt o-hexoze fiind exemple. Cu
toate acestea, unii sunt, de asemenea, epimeri unul altuia, de exemplu o-aluloza și o-
altoza. Numărul de aldoze din seria L este egal cu cel din seria D și fiecare compus este
un enantiomer al unuia din cealaltă serie.
310 Carbohidrați
CH2OH
I
C=O
I
CH2OH
Dihidrilactetonă
1H2OH
c=o
I
HCOH
I
CH2OH
D-eritroză
fH2OH CH2OH
C=O IC=O
I I
HCOH HOCH
I I
HCOH HCOH
I I
CH2OH
CH2OH
D-Ribuloză D-Xiluloză
CH2OH
/ CH2OH
/
I I CH2OH
I
CH2OH
I
C=O C=O C=O C=O
I
HCOH HOCH
I I I
HCOH HOCH
I I I I
HCOH HCOH HOCH HOCH
I I I I
HCOH HCOH HCOH HCOH
I I I
CH2OH CH2OH CH2OH bH20H
D-PsicozăD-FructozăD-SorozăD-Tagatoză
Figura 9.4 Stereozomerii o-cetozelor. În seria L de cetoze va exista un număr egal de

izomeri.
L-aldohexozele și patru stereoizomeri atât ai D-cetohexozelor (figura 9.4),

cât și ai L-cetohexozelor.
Prezența unui atom de carbon asimetric conferă moleculei proprietatea
de activitate optică, permițându-i să provoace rotația unui fascicul de lumină
polarizată plană în sensul acelor de ceasornic sau în sens invers. Astfel, toți
carbohidrații naturali care conțin atomi de carbon asimetrici sunt activi din
punct de vedere optic și pot fi desemnați (+) pentru rotația în sensul acelor de
ceasornic (dextro) sau (- ) pentru rotația în sens antiorar (laevo). Desemnarea
D sau L pentru gliceraldehidă, cea mai simplă monosacaridă, care are un
singur centru asimetric, se referă la
capacitatea acestor doi izomeri optici de a roti dextro ( +), respectiv laevo (-)
lumina. Cu toate acestea, nu rezultă că un membru al seriei D de
monosacaride va fi automat dextrozorotativ, deși formele D și L ale
aceluiași compus vor prezenta întotdeauna direcții opuse de rotație.
Atunci când cantități egale de izomeri dextro- și laevorotori sunt trimise
în prealabil, așa cum se întâmplă în cazul unui compus preparat sintetic,
amestecul rezultat nu are activitate optică, este desemnat DL și se numește
amestec racemic.
9.1.2 Structura
O grupare aldehidă și o grupare alcool pot reacționa împreună pentru a forma
un hemiacetal, iar atunci când acest lucru se întâmplă în cadrul unei
aldohexose, se formează o structură inelară cu cinci sau șase membri. Atât
pentosele, cât și cetohexosele formează structuri ciclice similare și, ca atare,
hexosele și pentosele există în mod predominant în natură, în echilibru fiind
prezente doar urme ale formelor aldehidă sau cetonă. Hemiacetal ciclic al
unei aldohexoze se formează prin reacția aldehidei de la carbonul 1 cu
gruparea hidroxil de la carbonul 4 sau 5, producând o punte de oxigen (figura
9.5). În mod similar, forma ciclică a cetohexozei este produsă prin reacția
grupei cetonă de la carbonul 2 cu hidroxilul de la carbonul 5.
1
CHO
H I HC
HJOH H2COH HJOH
I .
"f:J
I
-
HOCH O HO3
-HO\
CH I o
H4 COH HC
I I
HC H5 COH HCOH
I 6
I I
CH2OH CH2OH CH2OH
Figura 9.5 Structuri ciclice, bemiacetalice ale o-glucozei. Reacția dintre un alcool și
gruparea aldehidă din cadrul unei aldohexose are ca rezultat formarea unui hemi acetal.
Singurele structuri inelare stabile sunt cele cu cinci sau șase membri. Cetohexozele și
pen-tosele există, de asemenea, ca structuri inelare datorită unor reacții interne
similare.
Acest lucru introduce un nou centru asimetric la carbonul 1 și mărește

numărul posibil de izomeri de două ori. Configurația acestei noi grupări
hidroxil (gruparea hidroxil glicozidică de la carbonul 1) în raport cu puntea
oxi-genetică dă naștere la doi izomeri suplimentari ai carbohidratului original
(figura 9.6), care sunt desemnați fie ca formă a (gruparea OH reprezentată
pe aceeași parte a atomului de carbon ca și puntea de oxigen) sau forma /3
(gruparea OH reprezentată pe partea opusă a atomului de carbon față de
oxigenul
pod). Astfel de monosaharide, care diferă doar prin această configurație în
jurul atomului de carbon de care este atașat grupul carbonil (carbonul
anomeric), se numesc anomeri.
Aceste două orientări posibile ale grupării hidroxil conferă diferențe în
312 Carbohidrați
ceea ce privește proprietățile optice atunci când substanța este prezentă în
stare cristalină anhidră.
alfa beta
H-C-OH H-C-OH
I
HO-C-H 0 HO-C-H
I 0
H-t=:J
H-C
I
H-t=:J
H-C
I
H-C-OH H-C-OH
I I
H H
o-Glucoză
alfa beta
H H
I I
H-C-OH H-C-OH
HO-C-H HO-C-H
-Jo
H-,-OH
H-C
I o
I
-i
H-, ::
H-C
I
I I
H-C-OH H-C-OH
I I
H H
D-Fructoză
Figura 9.6 Formele anomerice ale o-glucozei și o-fructozei. Anomerii alfa și beta
sunt denumiți cu referire la configurația grupului hidroxil glicozidic asociat cu puntea
de oxigen.
iar a-o-glucoza are o rotație specifică de + 113°, în timp ce cea a /3-0-glu

cose este de + 19,7°. Cu toate acestea, ambele forme în soluție apoasă dau
naștere unui amestec equi libriu care are o rotație specifică de +52,5°,
aproximativ 36% fiind în forma a și 64% în forma /3, cu doar o urmă
prezentă sub formă de aldehidă liberă. Deoarece este nevoie de mai multe ore
pentru ca acest echilibru să se stabilească la temperatura camerei, orice
soluție standard de glucoză pentru a fi utilizată cu un test enzimatic specific
(de exemplu, glucoza de către glucoxidază care este specifică pentru
/3-0-glucoză) trebuie să se lase să atingă echilibrul înainte de utilizare, astfel
încât proporțiile fiecărui izomer să fie aceleași în soluția standard și în soluția
de test. Enzimele care accelerează atingerea acestui echilibru se numesc
mutarotaze și pot fi încorporate în reactivii de analiză pentru a accelera
formarea echilibrului.
Formele ciclice adoptate de hexoze și pentose pot fi reprezentate ca
structuri inelare simetrice numite formule de proiecție Haworth, care
oferă o mai bună reprezentare a aranjamentului spațial al grupărilor
funcționale una față de cealaltă. Nomenclatura se bazează pe cei mai
simpli compuși organici care prezintă un inel similar cu cinci sau șase
membri
314 Carbohidrați
Pyran Furan
Figura 9.7 Eteri ciclici cu șase și cinci membri. Structurile inelare stabile pe care le
adoptă hexoza și pentosa sunt cu cinci sau șase membri și conțin un atom de oxigen.
Ei sunt denumiți ca derivați ai furanului sau piranului, care sunt cei mai simpli
compuși organici cu structuri inelare similare, de exemplu glucofuranoza sau
glucopiranoza pentru structurile inelare cu cinci, respectiv șase membri ale glucozei.
a-o-Glucopiranoză /3-0-Glucofuranoză
,B-o-Glucopiranoză
a-D-Frucofuranoză B-o-Fructofuranoză
Figura 9.8 Formulele de proiecție Haworth. Inelul este considerat a fi planar, cu

grupurile substituente care se proiectează deasupra sau sub plan. Liniile îngroșate
repre zintă porțiunea inelului care este orientată în afara hârtiei spre cititor. Formele
anomerice alfa și beta sunt reprezentate cu grupul hidroxil de la carbonul 1 sub sau,
respectiv, deasupra planului inelului.
structură, și anume furanul și piranul (figura 9.7). Structurile ciclice cu cinci

membri ale zaharurilor se numesc furanoze, iar inelele cu șase membri se
numesc piranoze. Astfel, denumirea dată formațiunii cu cinci cicluri cu cinci
membri
adoptată de D-glucoză este D-glucofuranoza, iar structura inelară cu șase
membri este D-glucopiranoza (figura 9.8). Doar urme de glucoză apar în
forma furanoză în soluție, forma piranoză fiind mai stabilă. Cu toate acestea,
galactoza, precum și alte aldohexoze, există în cantități apreciabile sub formă
de furanoză în soluție și ca element constitutiv al polizaharidelor. Cetozele
pot prezenta, de asemenea, o configurație inelară, iar cetohexoza, fructoza,
există ca un amestec de forme furanoză și piranoză, cea din urmă formă
predominând în amestecul de echilibru. Cu toate acestea, configurația
fructozei, atunci când apare ca element constitutiv al unei dizaharide sau
polizaharide, este de obicei forma furanoză.
În structurile de inele simetrice reprezentate prin formulele
Haworth, inelul este considerat ca fiind plan, iar configurația fiecăruia
dintre grupurile subconstituente este reprezentată ca fiind fie deasupra, fie
sub plan. Grupurile care au fost prezentate în dreapta coloanei vertebrale
de carbon în reprezentarea liniară sunt desenate sub planul inelului, iar
cele care erau inițial în stânga sunt desenate deasupra planului. O excepție
este hidrogenul atașat la carbonul 5, a cărui grupare hidroxil este
implicată în formarea punții de oxigen, care este desenată sub planul
inelului, în ciuda faptului că în reprezentarea liniară a formei D este
reprezentată în stânga. Orientarea grupei hidroxil de la carbonul 1
determină a
sau /3, și este indicat sub plan pentru forma a și deasupra
planul pentru forma /3 (figura 9.8).
Formulele de proiecție plană Haworth seamănă foarte puțin cu forma
piranozelor cu șase membri, care adoptă de fapt o conformație neplană a
inelului comparabilă cu cea a ciclohexanului. Forma de scaun este cea mai
H
HO
0
H
a-D-Glucopiranoză
HO
0
H
/3-D-Glucopiranoză
Figura 9.9 Conformația D-glucozei. Piranozele adoptă o con-formare neplană a

inelului și este favorizată forma de scaun cu cel mai mare număr de grupe hidroxil
ecuatoriale, mai degrabă decât axiale. Trebuie remarcat faptul că a-D-glucopiranoza,
spre deosebire de
/3-0-glucopiranoză, are o grupare hidroxil axială.
316 Carbohidrați
reprezentare exactă a moleculei (figura 9.9), iar configurația substituenților

inelului poate fi descrisă ca fiind fie ecuatorială (în planul inelului), fie axială
(perpendiculară pe inel). Deși sunt posibile două conformații pentru fiecare
zahăr simplu, în general forma cu cei mai puțini constituenți axiali este cea
mai stabilă. Trebuie remarcat faptul că, odată cu con versionarea /3-n-
glucopiranozei în a-n-glucopiranoză, o grupare hidroxil axială devine
evidentă, iar numărul de subtituenți ecuatoriali și axiali ai inelului din
stereoizomerii aldohexozelor va varia. Conformația adoptată are importanță
în chimia carbohidraților, deoarece configurația axială sau ecuatorială
influențează reactivitatea moleculei.
9.1.3 Derivați ai carbohidraților care apar în mod natural

Monozaharidele sunt adesea întâlnite din punct de vedere biochimic ca
componente ale unor molecule complexe, în care sunt legate de alte
reziduuri care pot fi sau nu monosacaride. Astfel de carbohidrați naturali
variază ca mărime și complexitate, de la dizaharide, care, după cum
sugerează și numele, sunt compuse din două unități de monosaharide,
până la polizaharidele mari și complexe. Homopolizaharidele sunt
polimeri ai unei singure monosacaride, în timp ce heteropolizaharidele
sunt compuse din mai multe tipuri de monosacaride și pot implica, de
asemenea, reziduuri necarbohidratate. Glicoproteinele sunt în principal
proteine, dar conțin între 5 și 10 % carbohidrați în greutate. Moleculele
înrudite care sunt predominant polizaharide sunt denumite în mod normal
proteoglicani. Se găsește o gamă întreagă de structuri diferite care variază
în funcție de dimensiune, proporția de carbohidrați și natura reziduului de
carbohidrat. Ele sunt predominante în tisuurile mamiferelor, în special în
secrețiile mucoase, iar multe proteine importante, inclusiv unele enzime,
proteine serice, hormoni hipofizari și substanțe ale grupelor sanguine, sunt
glicoproteine.
Printre glicolipidele importante, care sunt combinații de carbohidrați și
lipide, se numără cerebrosidele și gangliozidele. Acestea sunt constituenți ai
creierului și ai țesutului nervos și sunt considerate de obicei împreună cu
lipidele, deoarece sunt insolubile în apă. În pereții celulelor bacteriene se
găsesc polimeri hidrosolubili cu masă moleculară relativă mare care conțin
lipide și carbohidrați, cunoscuți sub numele de lipopolizaharide.
În multe cazuri, monosaharidele care se găsesc în aceste structuri
complexe sunt prezente sub forma unuia dintre derivații lor chimici, care
poate fi un produs de oxidare sau de reducere, un ester de fosfat sau de sulfat
sau un derivat amino etc. Cu toate acestea, aceste forme modificate ale
monosacaridelor pot avea ele însele roluri biochimice importante și nu se
găsesc întotdeauna încorporate în polizaharide.
Glicozamine
Monozaharidele care conțin o grupare amino, care înlocuiește de obicei grupa
hidroxil de pe carbonul 2, se numesc glicozamine sau zaharuri amino. Ele
apar com monar sub formă de derivați N-acetil (figura 9.10) și apar frecvent
sub această formă într-o varietate de heteropolizaharide. Printre acestea se
numără mucopolizaharidele (mai corect numite glicozaminoglicani, cele
CHOH
HO
H
OH
I
O=C
\
CH3
a-o-N-acetilglucozamină (GlcNAc)
HO
OH
Figura 9.10 Derivați N-

acetilici ai
monozaharidelor. a-o-N-acetilgalactosamina (GalNAc)
termen acceptat pentru polizaharidele care conțin aminozaharuri) și cutii

peptidogene. Glicozaminoglicanii se găsesc în țesuturile conjunctive animale
și în fluidele corporale și sunt structuri complexe care conțin, de asemenea,
acizi uronici. Peptidoglicanii sunt componente ale pereților celulari bacterieni,
iar structurile variază de la o specie la alta. Ele sunt compuse din derivați N-
acetil legați de lanțuri scurte de aminoacizi. Mai multe antibiotice conțin
glicozamine, inclusiv eritromicina, care este un derivat N-metil și
carbomicina, în care se găsește derivatul 3-amino rar întâlnit al ribozei.
Esteri
Esterii fosfați și, într-o măsură mai mică, esterii sulfatici ai cabalinei de
monosacca sunt derivați naturali foarte importanți. Metabolismul hidraților de
carbon implică formarea și interconversia unei succesiuni de monosacaride și
a esterilor fosfați ai acestora, dintre care glucoza-I-fosfat și fructoza-6-fosfat
sunt exemple importante. Esterii de sulfat ai monozaharidelor sau ai
derivaților acestora (de obicei esterificați la carbonul 6) se găsesc în mai
multe polizaharide, în special în sulfatul de condroitină, care este un
constituent al țesuturilor conjunctive.
Produse de oxidare
Există trei clase posibile de acizi de zahăr care pot fi produși prin oxidarea
monosacaridelor (figura 9.11). Acizii aldonici sunt produși din aldoze atunci
când gruparea aldehidă de la carbonul 1 este oxidată la un acid carboxilic.
Dacă, totuși, gruparea aldehidă rămâne intactă și se oxidează doar o grupare
alcool primară (de obicei la carbonul 6 în cazul hexoselor), atunci se formează
un acid uronic. Atât acizii aldonici, cât și acizii uronici apar în natură ca
intermediari în
CHO COOH COOH

I I I
CHOH CHOH CHOH
I I I
CHOH CHOH CHOH
1 I I
CHOH CHOH CHOH
I I I
CHOH CHOH CHOH
I I I
COOH CH2 0H COOH
Acid glucuronic Acid gluconic Acid glucuric
COOH
Acid glucuronic
Figura 9.11 Produse de oxidare a glucozei. Acidul gluconic este un acid aldonic format
atunci când gruparea aldehidă este oxidată. Acidul glucuronic, un acid uronic, este
rezultatul oxidării grupării alcool primar. Atunci când atât grupa aldehidă, cât și grupa
alcool primară sunt oxidate, se formează acidul gluconic, care este un acid aldaric.
metabolismul carbohidraților, iar acizii uronici sunt constituenți importanți ai

glicozarninoglicanilor. Acidul glucuronic, format din glucoză, joacă un rol
deosebit de util în detoxifierea multor compuși înainte de excreția lor de către
rinichi. Este capabil să contribuie la eliminarea lor prin formarea de esteri cu
un alcool sau cu o grupare fenolică, iar multe medicamente și acizi sunt
excretați în urină conjugați cu acidul glucuronic în acest mod.
Acizii aldariici se formează atunci când se folosesc condiții de oxidare
mai puternice, cum ar fi acidul azotic, când se oxidează atât gruparea aldehidă,
cât și cea de alcool primar.
Glicozilamine
Membrii acestei grupe de compuși, care include nucleozidele extrem de
importante, se formează atunci când atomul de carbon al unei monosaharide, sau
adesea derivatul său deoxi (figura 9.12), este legat direct de azotul unei baze
azotate, inclusiv de grupa amino a unui aminoacid dintr-un lanț peptidic (figura
9.13), cu pierderea grupei hidroxil. Astfel de legături N-glicozidice nu trebuie să
fie contopite cu legătura dintr-o glicozidă, care se face prin intermediul unui atom
de oxigen.
Acele nucleozide care se găsesc în acizii nucleici ADN și ARN implică
unirea ribozei sau a dezoxiribozei cu o bază purinică sau pirimidinică. O astfel
de nucleozidă este adenozina, în care un azot al adeninei este legat de carbonul
1 al pentozei, riboza. În această formă, este o componentă a ARN-ului, dar ca
derivat fosforat al adenozinei (de exemplu, ATP), care este un compus cu un
nivel ridicat de energie, îndeplinește un rol important în metabolism.
Dinucleotidele NAD și NADP sunt doi cofactori necesari pentru multe
transformări enzimatice, iar acestea conțin, de asemenea, N-glicozide ale
fosfatului de riboză. Alte nucleozide importante se găsesc
318 Carbohidrați
2OH
H
O
C
o
Q
.
H H
H H
OH H
2-Deoxiriboză
Figura 9.12 Derivați deoxi. Aceștia conțin cu un atom de oxigen mai puțin decât
monozaharida din care sunt derivați. 2-Deoxiriboza este cea mai importantă deoxi pen
tose și este un constituent major al acidului dezoxiribonucleic (ADN). Deoxihexoza
este larg răspândită printre plante, animale și microorganisme, în special ca și
componente ale polizaharidelor complexe. Exemple sunt ramnoza (6-deoximannoză),
un com ponent al pereților celulari bacterieni, și fucose (6-deoxigalactoză), care se
găsește adesea în glicoproteine și este un constituent important al substanțelor din
grupul sanguin uman.
OH OH
Adenozină
Figura 9.13 O glicozilamină. Adenozina este o nucleozidă și este un exemplu de
glicozilamină în care atomul de azot al purinei, adenina, este legat direct de carbonul 1
al /3-0-ribofuranzei.
în unele antibiotice, de exemplu puromicina, care este un antibiotic de origine

fungică a cărui structură include N-acetil riboză legată de o bază purinică.
Glicozide
Glicozidele reprezintă un grup important de derivați ai carbohidraților și sunt
compuse dintr-un carbohidrat legat prin intermediul grupei hidroxil de pe
atomul de carbon anomeric (grupa hidroxil glicozidică) de o altă grupă, care
poate fi sau nu un alt carbohidrat (figura 9.14). Dacă acest grup nu este un
carbohidrat, este cunoscut sub numele de grup agliconic și poate fi un grup
metil, steroid, glicerol sau un grup mai complex. O astfel de legătură este
cunoscută sub numele de legătură glicozidică și implică o reacție de
condensare între grupul hidroxil de la carbonul anomeric al formei ciclice a
carbohidratului și un grup alcool al celeilalte molecule. În acest mod sunt
legate unitățile de monosaharide în dizaharide și polizaharide și, de asemenea,
carbohidrații pot fi legați de pro teine prin intermediul grupului hidroxil al
unui aminoacid, de exemplu, serina. Glicozidele pot varia considerabil în
compoziția lor și pot fi găsite ca și constituenți ai
H
C-C=O
\iC-OI I
O-CH20H OH
OH H
HO O
H OH
Digitoxenină
Figura 9.14 Un glicozid steroidic. Digitoxenina este un medicament de stimulare

cardiacă. Este o glucozidă steroidică în care un compus cu structură steroidică este
legat de a-o-glu copranoză prin condensarea grupului hidroxil anomeric de pe
carbohidrat și a grupului alcool de la poziția 5 de pe nucleul steroidic.
țesuturile vegetale și animale, unde îndeplinesc o varietate de roluri. Diferite

extracte care conțin glicozide specifice sunt utilizate ca medicamente,
coloranți și arome.
Legătura glicozidică poate fi clasificată ca o legătură alfa sau beta, în
funcție de orientarea grupului hidroxil glicozidic, dar o descriere completă a
legăturii ar trebui să indice, de asemenea, atomul de carbon prin care se
formează puntea de oxigen și tipul de inel al monosacaridelor,
adică piranoză sau furanoză. Astfel, specificația completă a maltozei (o
dizaharidă compusă din două unități de glucoză cu o legătură alfa) este a-o-
glu-copiranozil-(1-4)-o-glucopiranoză (figura 9.15). Pentru comparație, este
prezentată și structura cel lobozei, care este de asemenea compusă din unități
de glucopiranoză, dar implică o legătură beta.
Natura legăturii glicozidice dintre două monosacaride sau formele
modificate în care acestea apar în mod natural reprezintă o caracteristică
importantă a structurii di-, oligo- și polizaharidelor, în special în ceea ce privește
capacitatea lor de a acționa ca substraturi pentru enzime. Acțiunea hidrolazelor
care rup legăturile glicosidice depinde de natura legăturii, precum și de cele două
substanțe pe care le leagă. Un exemplu de astfel de stereospecificitate este
demonstrat de capacitatea enzimei umane de a
amilaza pancreatică salivară pentru a diviza legăturile glicozidice a între unitățile
de glucoză din amidon, dar nu și legăturile /3 din celuloză. Cu toate acestea,
hidrozele glicozidice, deși depind, în general, de compoziția glicozidului,
poate acționa asupra mai multor glicozide similare. Astfel, glicanohidroliza
testiculară de hialuronat (EC 3.2.1.35) scindează legăturile J3(1-4) dintre
reziduurile de N-acetil-D-glucozamină și acidul D glucuronic, care alcătuiesc
glicozaminoglicanul acid hialuronic, dar degradează și condroitinsulfatele, care
sunt compuse din acid o-glucuronic legat de N-acetil-o-galactosarnină sulfatată.
Disacaridele și polizaharidele reprezintă o proporție mare din
alimentație și sunt prezente în alimentele naturale și prelucrate; amidonul,
polizaharida
320 Carbohidrați
CH2OH
H OH
HO
OH
Maltoză a (I 4) glicozidică
H OH H OH
HO OH
Celobioză /3( I 4 ) legătură glicozidică
Figura 9.15 Structura dizaharidelor. Maltoza și cellobioza sunt amândouă

dizaharide care conțin numai unități de glucoză, diferența dintre structurile lor
constând în modul în care sunt unite unitățile de glucoză. Legătura glicozidică din
maltoză este a(I-4), în timp ce cea din cellobioză este /3(1-4).
forma de depozitare a glucozei (figura 9.16), care se găsește în cartofi și în

cereale, reprezintă o proporție majoră din total. Digestia acestor carbohidrați
alimentari se bazează pe capacitatea anumitor enzime, prezente în salivă și în
secrețiile intestinale, de a hidroliza legătura glicozidică dintre unitățile
monosacaridice. Astfel, polizaharidul, este degradat enzimatic cu eventuala
CH OH CH2OH
H -
OH OH OH OH
Celuloză
Amiloză
Amilopectină
Figura 9.16 Structurile homopolizaharidelor de glucopiranoză. Celuloza este o

structură lin ear a unităților de glucopiranoză legate ,B(l-4). Amidonul este format din
amiloză, care are o structură liniară a(l-4), și amilopectină, care are puncte de
ramificare a(l-6) pe lanțurile liniare a(l-4). Glicogenul are o structură similară cu
cea a amilopectinei, dar cu un grad mai mare de ramificare a(l-6).
322 Carbohidrați
CH20H
,1----0
Forma alfa
CH20H
0
Figura 9.17 Anomerii alfa și beta ai maltozei. Atunci când numai gruparea hidroxil
de pe carbonul anomeric al unuia dintre reziduurile de monosacaride este implicată în
legătura glicozidică, gruparea hidroxil anomerică de pe celălalt reziduu este încă liberă.
Acest lucru permite două orientări posibile, care sunt descrise ca forme alfa sau beta
ale reziduului de neronosaccharide.
eliberare a monosacaridelor, care sunt apoi absorbite din tractul gastroin testinal
și ulterior metabolizate pentru a produce energie. Astfel de enzime hidrolitice
sunt specifice pentru legăturile a și sunt ineficiente față de legăturile {3. Ca o
consecință a acestui fapt, acele polizaharide care sunt polimeri de glucoză cu
legături f:l au o valoare alimentară limitată la om, polizaharida structurală
celuloza fiind un exemplu. Cu toate acestea, este o componentă nutritivă
substanțială și eficientă a dietei rumegătoarelor, care au o populație bacteriană
ridicată în rumen, capabilă să metabolizeze celuloza cu eliberare de glucoză.
Polizaharidele servesc, de asemenea, drept rezervoare de energie, iar catabolismul
glicogenului, care este un polimer de glucoză cu legături de tip "l", similar
amilopectinei și care se găsește în țesutul muscular și hepatic al animalelor,
îndeplinește această funcție.
OH HO
HO
Figura 9.18 Structura zaharozei. Zaharoza este o dizaharidă care are o singură formă
structurală posibilă, neexistând nicio grupare hidroxil anomerică liberă.
Atunci când legătura glicozidică implică carbonul anomeric al uneia

dintre monosacaride, grupul aldehidic liber de pe cealaltă monosacaridă poate
avea două orientări posibile. Astfel, sunt posibile formele ex și {3 ale unui
astfel de compus (figura 9.17). Dacă cele două monosacaride sunt legate printr-
o punte oxi genică între carbonul anomeric al fiecăreia, așa cum este cazul
zaharozei (figura 9.18), se elimină posibilitatea ca o grupare aldehidă sau
cetonă liberă să rămână și este posibilă o singură formă structurală care nu are
proprietăți reducătoare.
Secțiunea 9.1
1. Identificați fiecare dintre următorii carbohidrați ca fiind fie
monosacaride (M), dizaharide (D) sau polizaharide (P).
(a) Maltoză.
(b) Celuloză.
(c) Sucroză.
(d) Fructoză.
2. Care dintre următoarele au proprietăți reducătoare?
(a) Fructoză.
(b) Sucroză.
(c) Lactoză.
(d) Glucoză-I-fosfat.
3. Amidonul are o valoare nutritivă
pentru oameni PENTRU CĂ
amidonul este compus din unități de glucoză legate printr-o legătură
/3(1-4).
4. a-o-glucoza și {3-o-glucoza sunt forme anomerice una a
celeilalte PENTRU CĂ
anomerii sunt imagini în oglindă unul față de celălalt.
324 Carbohidrați
Multe dintre primele metode disponibile pentru măsurarea carbohidraților se

bazau pe reactivitatea chimică a acestora și implicau adăugarea unui reactiv
particular cu formarea ulterioară a unui produs colorat. Deși ieftinitatea și
simplitatea tehnică a acestor proceduri au contribuit la popularitatea lor
anterioară, ele sunt nespecifice în mod inerent și implică adesea utilizarea
unor substanțe care sunt acum recunoscute ca fiind periculoase. Este esențial
să se efectueze o evaluare a pericolului înainte de a utiliza astfel de tehnici.
Lipsa de specificitate este atribuită în mare parte faptului că multe
monosacaride au o compoziție chimică și proprietăți similare, deși
semnificația lor biologică variază foarte mult. Numeroasele forme izomere în
care există hexozidele, toate având o compoziție chimică identică, unele
dintre ele prezentând chiar o interconversie la o structură complet comună în
soluție alcalină (figura 9.19), demonstrează dificultățile întâmpinate în
încercarea de a măsura un membru individual al acestui grup într-un eșantion
care conține altele. Metodele chimice nu sunt capabile nici măcar să
diferențieze în mod eficient între clasele de monosaharide, deoarece sunt
utilizate reacțiile grupului carbonil. Această funcție este comună tuturor
monosacaridelor și, prin urmare, acestea pot da produse de reacție similare
sau uneori identice. Cu toate acestea, cu condiția să se aprecieze limitele
acestora, utilizarea metodelor chimice este justificată într-o varietate de
situații.
Fructoză
H
I
H-C-OH
I
C=O
I
R
H-C=OH H-C=O
I I
H-C-OH HO-C-H
II I
Figura 9.19 Interconversia R R
glucozei, mannozei și Glucoză Comună Mannoză
fructozei în soluție slab formă de
alcalină. enediol
9.2.1 Reacții ale grupei carbonil

Reacțiile grupării carbonil formează baza multor metode calitative de
detectare a carbohidraților, iar câteva dintre acestea au fost utilizate în mod
cantitativ. Acestea sunt metode generale care adesea măsoară doar cantitatea
totală predată în probă. Cu toate acestea, în unele cazuri, reactivii sau
condițiile de reacție au fost modificate pentru a îmbunătăți specificitatea.
---
Metode de reducere
Carbohidrații care au o grupare aldehidă sau cetonă potențial liberă există în
soluție în echilibru cu forma de enediol. La un pH ușor alcalin, această
conversie este favorizată, iar enediolul rezultat este un agent reducător activ
(figura 9.19). Metodele de reducere pot fi utilizate pentru dizaharide, cu
condiția ca gruparea aldehidă sau cetonă a cel puțin uneia dintre
monosacaride să nu fi fost eliminată în legătura glicozidică. Zaharoza este un
exemplu de dizaharidă în care atomii de carbon anomeri ai ambelor
monosacaride sunt implicați în legătura glicozidică și se pierde puterea de
reducere. Cu toate acestea, această distincție între dizaharidele reducătoare și
cele nereducătoare poate fi uneori utilizată în mod avantajos în testele
calitative.
Una dintre cele mai comune metode implică reducerea ionilor cuprici
(Cu2 +) în ioni cuprici (Cu+), care în soluție alcalină formează hidroxid cupric
galben, care la rândul său este transformat prin căldura reacției în oxid cupric
roșu insolubil (Cu2 0). În testele calitative bazate pe această reacție,
producerea unui precipitat galben sau roșu-portocaliu indică prezența unui
carbohidrat reducător. Este necesar să se mențină sărurile cuprice în soluție și,
în acest scop, reactivul lui Benedict include citrat de sodiu, în timp ce
reactivul lui Fehling utilizează tartrat de sodiu și potasiu. În condiții de reacție
atent controlate, cantitatea de oxid cuprat format poate fi utilizată ca o
indicație cantitativă a cantității de carbohidrat reducător prezent, deși diferiți
carbohidrați vor duce la formarea unor cantități diferite de oxid cuprat.
Metodele de măsurare a cantității de oxid de cupru format sunt
numeroase, dar cea mai frecvent utilizată constă în reducerea acidului
fosfomolibdic sau a acidului arsenomolibdic de către oxidul de cupru pentru a
obține oxizi de molibden inferiori. Intensitatea complexului colorat produs
este legată de concentrația substanțelor reducătoare din proba inițială.
Culoarea produsă de acidul arsenomolibdic este mai stabilă, iar metoda este
mai sensibilă decât în cazul acidului fosfomolibdic.
Metoda neocuproinei pentru măsurarea oxidului cupros este mai
sensibilă decât reactivul acidului fosfomolibdic și utilizează clorhidrat de 2,9-
dimetil-1,10-fenantrolină (neocuproină), care produce o culoare stabilă și este
specifică pentru ionii de cupro.
Cu toate că au fost folosiți o varietate de oxidanți, alții decât sărurile de
cupru, ferricianura este singurul de remarcat. Ionii de ferocianură (soluție
galbenă) sunt reduși la ioni de ferocianură (soluție incoloră) prin reducerea
hidraților de carbon atunci când sunt încălziți într-o soluție alcalină.
Concentrația de hidrați de carbon poate fi pusă în legătură cu scăderea
absorbției la 420 nm.
Fe(CN6)3- - - Fe(CN6)4-
Precizia acestui tip de metodă în care cuantificarea implică colorimetria
inversă (adică absorbția scade odată cu creșterea concentrației de analit) este
discutabilă, în special la concentrații mici ale analitului, din cauza dificultății
de a măsura ușoarele diferențe de absorbție față de valoarea ridicată a marjei.
În plus față de lipsa de specificitate a acestor metode de reducere deja
menționate, substanțele reducătoare care nu sunt carbohidrați prezente în
eșantion vor
326 Carbohidrați
reacționează, de asemenea, în mod similar, rezultând o eroare pozitivă. De-a

lungul anilor, lucrătorii au modificat compoziția reactivilor, prepararea
probelor și chiar forma eprubetelor în încercarea de a reduce interferențele.
Nume precum Fehling, Benedict, Nelson, Somogy, Folin și Wu sunt încă
asociate cu aceste metode de reducere. Astfel de considerații nu au prea multă
importanță în zilele noastre, când metodele de reducere sunt mai puțin
utilizate și se preferă metodele enzimatice sau cromatografice mai specifice și
mai precise.
Reacții cu amine aromatice

Diferite amine aromatice se condensează cu aldoze și cetoze în acid acetic
glacial pentru a forma produse colorate ale căror maxime de absorbție sunt
adesea caracteristice unui carbohidrat sau grup individual. Utilizarea unor
amine aromatice diferite sau măsurători de absorbție la lungimi de undă
alternative oferă un grad de specificitate pentru zaharuri individuale. Natura
cancerigenă a unor amine aromatice a împiedicat utilizarea lor ca reactivi de
laborator.
Printre aminele aromatice care au fost utilizate se numără o-toluidina,
acidul p-aminosali ciclic, acidul p-aminobenzoic, difenilamina și p-
aminofenolul. Capacitatea lor de a reacționa preferențial cu un anumit
carbohidrat sau cu o anumită clasă de carbohidrați este adesea utilă, de
exemplu p-aminofenolul, care prezintă o anumită specificitate pentru cetoză
în comparație cu aldoză și este util pentru măsurarea fructozei. Acești reactivi
s-au dovedit deosebit de utili pentru vizualizarea și identificarea
carbohidraților după separarea amestecurilor prin cromatografie pe hârtie sau
în strat subțire, atunci când variațiile de culoare și prezența sau absența unei
reacții ajută la interpretarea cromatogramei.
Reacții cu acizi puternici și cu un fenol

Atunci când sunt încălzite cu un acid puternic, pentosele și hexosele se
deshidratează pentru a forma derivați de furfural și, respectiv,
hidroximetilfurfural (figura 9.20), ale căror grupări aldehidice se vor
condensa cu un compus fenolic pentru a forma un produs colorat. Această
reacție stă la baza unora dintre cele mai vechi teste calitative pentru
detectarea carbohidraților, de exemplu testul Molisch, care utilizează acid
sulfuric concentrat și a-naftol.
Prin alegerea atentă atât a condițiilor de reacție, cât și a combinației
fenolice utilizate, se poate obține o culoare caracteristică unui anumit
carbohidrat sau grup înrudit, ceea ce conferă metodei un anumit grad de
specificitate. Astfel, testul lui Seliwanoff utilizează acid clorhidric și fie
rezorcinol, fie acid 3-indolilacetic pentru a măsura fructoza cu o interferență
minimă din partea glucozei. Culoarea produsă de pentose cu orcinol
(reactivul lui Bial) sau p-bromoanilină este suficient de diferită de cea
produsă de hexose pentru a permite cuantificarea acestora în prezența
hexoselor. Cu toate acestea, niciuna dintre metodele bazate pe formarea
furfuralului sau a derivaților săi nu poate fi considerată ca fiind complet
specifică.
Într-un eșantion biologic pot fi prezente substanțe care nu sunt
carbohidrați, care se descompun la încălzire în condiții acide și care vor
reacționa în mod similar cu un carbohidrat. Acidul glucuronic este un
exemplu și este adesea prezent în abundență în urină și poate da o reacție fals
pozitivă pentru carbohidrați.
328 Carbohidrați
HC=O HC=O
I I
HCOH
I
HCOH H1C 17
I I o
HCOH HIIC
I _J
H2COH HC
Furfural
HC=O
I
HCOH
I
HCOH
I
HCOH
I
HCOH
Figura 9.20 I
H2COH
Formarea furfuralului și a
5-hidroximetilfurfuralului. 5-hidroximetilfurfural
9.2.2 Studii structurale ale polizaharidelor

Deși reacția cu iod poate fi folosită ca test calitativ pentru prezența unor
homopolizaharide (amidon - albastru; glicogen și dextrine
- roșu; celuloză și inulină - fără culoare), cuantificarea polizaharidelor se
realizează, de obicei, prin hidroliza legăturilor glicozidice cu eliberarea
componentelor individuale. Acest lucru se poate realiza prin încălzire la 60 °C
cu acid clorhidric concentrat timp de 30 de minute, urmată de cuantificarea
monosacaridelor cu ajutorul unei metode adecvate. Cu toate acestea, această
procedură de hidroliză acidă poate duce la distrugerea unor carbohidrați, iar
condiții mai blânde, folosind acid acetic sau concentrații mai mici de acid
clorhidric (0,1-2,0 mo11-1 ) sunt adesea preferabile. Metanoliza în condiții
blânde va produce glicozidele metilici, care sunt deosebit de potrivite pentru
analiza prin cromatografie gaz-lichid. Hidroliza enzimatică a legăturilor
specifice este, de asemenea, de mare valoare în investigarea structurii și
compoziției hetero- și homopolizaharidelor și, în astfel de studii, poate fi
important să se măsoare orice fracțiuni necarbohidratate sau derivați
monosacaridici care au fost eliberați prin hidroliză chimică sau enzimatică.
Astfel, reziduurile de acid uronic pot fi determinate în analiza anumitor
glicozaminoglicani, la fel ca și componenta lipidică a unui glicolipid și acidul
sialic al unei glicoproteine.
Cercetările structurale privind gradul de ramificare, precum și poziția și
natura legăturilor glicozidice și a reziduurilor necarbohidratate din coardele
polysaccha pot include oxidarea periodatului și alte proceduri, cum ar fi metilarea
exhaustivă. Difracția razelor X și tehnicile spectroscopice, cum ar fi rezonanța
magnetică nucleară și dispersia optică rotativă, oferă, de asemenea, informații
valoroase, în special în ceea ce privește structurile tridimensionale ale acestor
polimeri.
Oxidarea periodatului
Oxidarea periodatului implică oxidarea și scindarea simultană a legăturilor
carbon la carbon care au grupări hidroxilice libere adiacente sau o grupare
aldehidă sau cetonă adiacentă unei grupări hidroxilice. Acțiunea acidului
periodicat este reprezentată de următoarea ecuație:
R
I
HI-OH + 104 - 2R---CHO + H20 + l03
H---C--OH
I
R
Reacția cu aldoze și cetoze este diferită, iar procedura poate fi utilizată
pentru a face distincția între ele. Monozaharidele și glicozidele libere nu
reacționează în mod identic cu acidul periodic, iar acest lucru dezvăluie
informații despre structura, secvența și legătura dintre monosaharide sau
dintre derivații acestora într-o polizaharidă.
Oxidarea poate fi efectuată la pH 5,0 prin adăugarea unei soluții apoase
de metaperiodat de sodiu. Reacția se lasă să se desfășoare la întuneric la 4 °C
și după 24 de ore, excesul de periodat este distrus prin adăugarea de
etilenglicol. Obiectivele oxidării periodatului sunt de a elucida numărul de
grupe hidroxil vecine prin estimarea numărului de moli de periodat consumat
și de a determina structura fracțiunii rămase după reacție. Cantitatea de
periodat utilizată în reacție poate fi determinată în mai multe moduri, inclusiv
prin metode titrimetrice și spectrofotometrice. Dacă produsele de oxidare a
periodatului sunt reduse cu borohidrat de sodiu
dride, se produc polialcooli care pot fi ușor hidrolizați în condiții ușor acide, iar
produsele de reacție pot fi determinate. Identificarea acestor produse oferă
informații considerabile despre legăturile dintre componentele polizaharidice și,
de asemenea, despre succesiunea lor în structura generală.
Procedurile de laborator și interpretarea rezultatelor studiilor de oxidare
a perioadelor sunt exerciții complicate, iar această scurtă prezentare este
destinată doar ca o introducere generală în acest subiect, iar detalii
suplimentare, dacă este necesar, trebuie căutate într-un text mai specific.
Există un număr mare de enzime care sunt capabile să modifice carbohidrații sau
derivații carbohidraților și care pot fi utilizate în diferite metode analitice.
Enzimele hidrolitice, care rup legăturile glicozidice, sunt utile în studiul structurii
dizaharidelor sau polizaharidelor și în metodele de cuantificare (tabelul 9.2).
Astfel de enzime vor hidroliza legăturile glicozidice dintre reziduurile de
monosacaride și vor elibera componentele individuale pentru analize ulterioare.
Enzima este aleasă ținând cont de natura legăturii glicozidice implicate, care
poate să nu fie unică pentru o anumită dizaharidă sau polizaharidă. Astfel, u-
glucozidaza va hidroliza atât legătura a(l-4) a maltozei, cât și legătura a(l-2) a
zaharozei, rezultând în ambele cazuri eliberarea de glucoză.
Metode enzimatice de analiză a 329
carbohidraților
Tabelul 9.2 Exemple de glicozide
Enzima de hidroliză Legătura Denumirea Produse de hidroliză

glicozidică trivială a
substratului
/3-Galactosidază /3(1--+4) Lactoză o-Galactoză. o-Glucoză
(CE 3.2.1.23)
a-Glucosidază a(l--+4) Maltoză o-Glucoză. o-Glucoză
(CE 3.2.1.20)
/3-Fructofuranosidază /3(1--+2) Zaharoză o-Glucoză. o-Fructoză
(CE 3.2.1.26)
a-Galactosidază a(l--+6) Melibiose o-Galactoză. o-Glucoză
(CE 3.2.1.22)
Amiloglucozidază a(l--+4) Glicogen D-Glucoză
(CE 3.2.1.3.3) a(l--+6)
Celulază /3(1--+4) Celuloză o-Glucoză
(CE 3.2.1.4)
Metodele enzimatice de cuantificare a monosacaridelor sunt utilizate

atunci când este necesar un grad mai mare de specificitate decât cel care poate
fi obținut prin majoritatea metodelor chimice. Acestea permit adesea
cuantificarea unui stereoisomer în prezența altora și pot face adesea diferența
între
a și f3 forme anomerice.
Specificitatea absolută a unei enzime pentru un singur substrat este rară
și pot exista mai multe monosacaride prezente într-o probă care pot fi
acționate în grade diferite de aceeași enzimă. Hexokinaza (EC 2.7.1.1.1), deși
este utilizată într-o metodă de măsurare a glucozei, nu este specifică pentru
acest substrat și va cataliza fosforilarea altor hexoside. Specificitatea unei
anumite enzime poate varia, de asemenea, în funcție de sursa din care a fost
preparată (de exemplu, origine microbiană, fungică, animală sau vegetală), iar
metoda de preparare comercială poate afecta puritatea și, prin urmare, poate
influența rezultatele obținute atunci când se utilizează enzima. Deși în prezent
este posibil să se urmărească puritatea multor enzime într-o formă foarte
purificată, nu trebuie să se excludă posibilitatea prezenței unor cantități mici
de enzimă nedorită, al cărei substrat este prezent și în proba analizată.
9.3.1 Dozarea glucozei cu ajutorul glucoxidazei

Enzima flavoproteică, glucoxidază (EC 1.1.3.4), care poate fi obținută de la
Aspergillus niger, catalizează oxidarea {3-o-glucozei de către oxigenul
atmosferic pentru a produce o-gluconolactonă, care este transformată în acid
glu conic cu producerea de peroxid de hidrogen:
{3-o-glucoză + 02 + H20 ._ acid o-gluconic + H2O2
Oxidarea a-o-glucozei are loc la mai puțin de 1% din rata de oxidare a
anomerului f3. Deoarece aceste două forme există în soluție în echilibru în
proporție de 36% (a) și 64% (/3), trebuie să se permită ca mutarotarea formei
a în forma f3 să atingă echilibrul în probă și în standardele pentru a se
obține un echilibru consistent.
330 Carbohidrați
rezultate. Includerea de aldose-1-epimerază (glucomutaroza) (EC 5.1.3.3.3) în

reactivul de glucooxidază va permite restabilirea rapidă a echilibrului a-/3,
permițând efectiv ca reacția să se finalizeze.
Rata de oxidare a altor monosaharide (de exemplu, galactoza, mannoza,
xiloza, arabinoza și fructoza) de către glucoxidază s-a dovedit a fi neglijabilă
sau nulă, dar unii derivați ai glucozei reacționează ușor, de exemplu, glucoza
2-deoxi-o prezintă o rată de reacție mai mică de 5% din cea cu /3-0-glucoza.
Cuantificarea glucozei cu ajutorul glucoxidazei se realizează prin
măsurarea fie a peroxidului de hidrogen format, fie a oxigenului consumat în
timpul reacției, ambele fiind proporționale cu conținutul de /3-0-glucoză din
probă.
Măsurarea peroxidului de hidrogen format

Metode spectrofotometrice
Metodele care au fost inițial dezvoltate pentru utilizarea de rutină erau
proceduri colorimetrice în care peroxidul de hidrogen format era măsurat prin
monitorizarea modificării culorii unui acceptor de oxigen cromogen în
prezența enzimei peroxidază (EC 1.11.1.7). Astfel de cromogeni sunt incolori
în forma lor redusă, dar prezintă culori caracteristice atunci când sunt oxidați,
iar o-tolidina și o-dianisidina au fost printre substanțele utilizate inițial. Cu
toate acestea, din cauza caracterului lor potențial cancerigen, au fost înlocuite
cu alte substanțe chimice mai puțin toxice, care prezintă proprietăți
cromogene similare și care oferă avantajele metodologice ale unui timp de
reacție mai rapid și ale obținerii unui produs colorat mai stabil.
În timp ce glucoza-oxidază este foarte specifică pentru /3-0-glucoză,
determinarea colorimetrică a peroxidului de hidrogen este mult mai puțin
specifică și pot fi introduse erori semnificative în această a doua etapă a
reacției de analiză. Dificultățile vor apărea dacă preparatul de glucoxidază
este contaminat cu catalază, care distruge peroxidul de hidrogen prin
transformarea acestuia în oxigen și apă. În plus, unele substanțe, cum ar fi
acidul ascorbic, glutationul ș i hemoglobina, interferează cu reacția,
concurând cu cromogenul ca donatori de hidrogen. Cu toate acestea, se spune
că unii dintre cei mai recent introduși cromogeni reduc la minimum aceste
efecte, iar reacția care implică cuplarea oxidativă catalizată de peroxidază a 4-
amino-fenazonei și a fenolului pentru a produce un complex colorat este
utilizată pe scară largă. Un alt cromogen utilizat în mod obișnuit este acidul
2,2'-azino-di (3-etil-benztiazolon-sulfonic), care oferă o metodă de analiză
simplă și sensibilă.
carbohidraților
Există numeroase kituri și dispozitive de testare cu reactivi uscați,

produse în comerț, care sunt disponibile pentru determinarea glucozei cu
ajutorul glucoxidazei. Acestea conțin toți reactivii necesari, deși compoziția
lor poate varia de la un producător la altul, în special în ceea ce privește
acceptorul cromogenic de oxigen utilizat.
Metode electrochimice
Măsurarea electrochimică a peroxidului de hidrogen produs constituie baza
instrumentelor denumite adesea analizoare de glucoză. Mai multe sunt
disponibile în comerț și, deși designul variază de la un producător la altul, o
caracteristică comună a celor care măsoară amperometric peroxidul de
hidrogen produs este utilizarea glucoxidazei sub formă imobilizată. Aceasta
este adesea încorporată într-un electrod enzimatic care este înconjurat de o
cameră mică de reactivi tamponați în care se introduce proba. Mai recent, au
fost dezvoltate și alte dispozitive biosenzoriale similare, care au demonstrat o
specificitate și un interval liniar îmbunătățite.
Alternativ, enzima imobilizată poate fi împachetată într-un pat care să
permită analiza continuă a probelor, de exemplu a unui flux de proces. Proba
este trecută prin patul de enzimă imobilizată, iar peroxidul de hidrogen
produs este monitorizat amperometric. Canalele duble permit analiza
simultană a glucozei și a lactozei sau a glucozei și a zaharozei (figura 9.21),
dizaharidele fiind hidrolizate enzimatic, iar conținutul de glucoză fiind
măsurat. Astfel, în analiza zaharozei, o zaharază imobilizată rupe legătura
glicozidică pentru a produce glucoză și fructoză, iar o mutarotasă imobilizată
asigură conversia a-o-glucozei în /3-0-glucoză pentru măsurarea acesteia prin
metoda glu cose oxidazei. Măsurarea lactozei se realizează în mod similar
folosind J3-galactosidază ca enzimă hidrolitică.
Măsurarea oxigenului consumat
Alternativ, oxidarea inițială a glucozei poate fi monitorizată, iar acest lucru se
poate realiza cel mai ușor prin măsurarea cantității de oxigen consumate în
timpul reacției. A fost utilizată o metodă electrochimică care utilizează un
electrod polarografic de oxigen Clark, iar primul electrod de oxigen descris
pentru măsurarea glucozei în 1962 conținea glucoza oxidază solubilă ținută
între membrane de cuprofan. Modificări recente au dus la încorporarea în
electrod a unei varietăți de forme de glucooxidază imobilizată.
332 Carbohidrați
Glucoxidază Detector
imobilizat de
ă peroxid
de
hidrogen
Exemplu
Sucrasă
imobilizată
+ Detector
mutarotasă de
+ peroxid
glucoză- de
oxidază hidrogen
Glucoxidază Detector
imobilizat de
ă peroxid
de
hidrogen
Exemplu
Imobilizat
/3-galactosidază Detector
+ de
glucoză peroxid
- de
oxidază hidrogen
Figura 9.21 Diagramă schematică a analizei automate simultane continue și

continue a amestecurilor de glucoză și zaharoză sau de glucoză și lactoză.
Catalaza este un contaminant comun al preparatelor de glucooxidază și

va duce la o măsurare eronată a consumului de oxigen din cauza regenerării
oxigenului din peroxidul de hidrogen produs în timpul reacției. Această eroare
poate fi evitată prin distrugerea peroxidului de hidrogen pe măsură ce este
produs, prin adăugarea de etanol, ceea ce duce la formarea de acetaldehidă:
H2O2 + etanol - acetaldehidă + H2 O
Se utilizează, de asemenea, iodură și molibdat de amoniu, care reduc rapid
peroxidul de hidrogen la apă:
HO + 21- + 2H+ amoniu
22 molibdat
Mai multe tipuri de analizoare de glucoză sunt disponibile în comerț și,
deși achiziționarea unui astfel de instrument implică un efort financiar inițial
considerabil, acesta va avea avantajele vitezei de analiză (câteva secunde),
volumelor reduse de reactivi și dimensiunilor foarte mici ale eșantioanelor (de
exemplu, 10 µJ). Analizoarele de glucoză sunt, de obicei, simplu de utilizat,
nefiind nevoie de personal cu o înaltă calificare pentru efectuarea analizei și,
din aceste motive, ele devin din ce în ce mai populare.
carbohidraților
9.3.2 Dozarea glucozei cu ajutorul glucozei
dehidrogenazei
Glucoza poate fi măsurată cu ajutorul glucozei dehidrogenazei bacteriene (EC
1.1.1.1.47), care catalizează dehidrogenarea /3-0-glucozei în D-
gluconolactonă, hidrogenul fiind transferat la NAO+ sau NADJ>+. Metoda
constă în măsurarea creșterii absorbanței la 340 nm, cauzată de producerea de
NADH, folosind fie o tehnică de analiză cinetică, fie o tehnică de analiză cu
timp fix. Coeficientul de absorbție molară pentru NADH este utilizat în
calculul final. Trebuie inclusă o mutarotasă (EC 5.1.3.3.3) în analiză pentru a
accelera conversia formei a în forma f3.
O versiune colorimetrică a metodei utilizează o sare de tetrazoliu.
Oxidarea NADH este cuplată la reducerea bromurii de 3-(4,5-dimetil-2-
tiazolil)- 2,5-difeniltetrazoliu de către o diaforază (EC 1.6.4.3) și se dezvoltă
un formazan albastru închis. Absorbția se citește la o lungime de undă
cuprinsă între 540 și 600 nm. Această metodă este mai sensibilă decât metoda
cu ultraviolete, dar este mai predispusă la interferențe, în special din partea
agenților reducători prezenți în probă, ceea ce va duce la o eroare pozitivă.
334 Carbohidrați
9.3.3 Dozarea glucozei cu ajutorul hexokinazei

O altă enzimă utilizată pentru măsurarea glucozei este hexokinaza (EC
2.7.1.1) care catalizează fosforilarea glucozei pentru a produce glucoza-6-
fosfat cu adenozin trifosfat ca donator de fosfat și ioni de magneziu ca
activator. Rata de formare a glucozei-6-fosfat poate fi legată de reducerea
NADP de către enzima glucoză-6-fosfat dehidrogenază (EC 1.1.1.1.49).
Această reacție indicatoare poate fi monitorizată spectrofotometric la 340 nm
sau fluorimetric:
hexokinaza
glucoză + --------------ATP> glucoză-6-fosfat + ADP
glucoză-6-fosfat dehidrogenază
glucoză-6-fosfat ------------------------------------ + 6-fosfogluconat
+ NADP+. + NADPH + H+
Cu toate acestea, enzima hexokinaza nu este specifică pentru glucoză și
este capabilă să transforme alte hexoze în derivații lor corespunzători de 6-
fosfat. În plus, specificitatea enzimei poate varia ușor în funcție de sursa sa.
Hexokinaza de drojdie va cataliza fosforilarea unui număr de alte hexosze,
precum și a glucozei, inclusiv D-mannoza, D-fructoza, 2-deoxi-D-glucoza și
D-glucozamina. Acest lucru oferă un sistem de dozare pentru mannoză sau
fructoză (figura 9.22) dacă reacția inițială este legată de o a doua reacție
adecvată.
În determinarea glucozei, deși există o lipsă de specificitate a
hexokinazei, testul general este foarte specific pentru glucoză, deoarece
enzima de legătură este specifică pentru glucoza-6-fosfat și nu va reacționa
nici cu fructoza-6-fosfat, nici cu manoza-6-fosfat fără încorporarea
fosfoglucozei izomerazei (EC 5.3.1.9) pentru a o transforma în glucoza-6-
fosfat. Prin urmare, pentru testul specific de glucoză este necesar ca
preparatul de hexokinază să nu fie contaminat cu fosfoglucoza izomerază.
9.3.4 Metode diverse de măsurare a hexozelor

Alte două hexozide care apar frecvent și care se găsesc de obicei ca și
componente ale polizaharidelor sau combinate cu alte molecule în structuri
complexe sunt galactoza și fructoza și, în mod similar cu alte monosacaride,
sunt disponibile metode enzimatice pentru măsurarea lor. O metodă
enzimatică pentru măsurarea fructozei cu ajutorul hexokinazei a fost descrisă
anterior, împreună cu metoda pentru mannoză și glucoză (figura 9.22).
Galactoza-oxidază (EC 1.1.3.9) catalizează oxidarea /3-D-galactozei într-
un mod similar cu oxidarea /3-D-glucozei de către glucoza-oxidază și stă la
baza unei metode cantitative identice. Specificitatea este mai mică decât cea a
glucozei-oxidază și, deși glucoza nu este un substrat, pot fi oxidate și alte
monosacaride și glicozide, inclusiv L-altoza, D-taloza, D-galactozamina,
melibioza și raf finoza, în funcție de sursa enzimei. Un test care utilizează
galactoză dehidrogenază (EC 1.1.1.1.48), care catalizează conversia de
Separarea și identificarea amestecurilor de 335
carbohidrați
Manuloză-
Mannoză
6-fosfat
Fructoză-6-
Fructoză
fosfat
Glucoză-6-fosfat
Glucoză
NADP+
NADPH)
6-fosfogluconat
Figura 9.22 Sisteme de dozare a mannozei, fructozei și glucozei utilizând

hexochinaza. Mannoza, fructoza și glucoza pot fi analizate independent, utilizând
hexokinaza și enzimele suplimentare corespunzătoare. Toate reacțiile pot fi
monitorizate prin creșterea absorbanței la 340 nm pe măsură ce NADP' este redus în
NADPH.
o-galactoza în o-galactonolactonă în prezența coenzimei NAD+, este mai

specifică și sunt disponibile preparate enzimatice pentru care singurele alte
substraturi sunt a-L-arabinoza și /3-0-fucoza. Generarea de NADH este
monitorizată în mod convenabil la 340 de grade și permite cuantificarea
galactozei:
galactoză
dehidrogenază
o-galactoză + NAD+ o-galactonolactonă + NADH + H+
Din punct de vedere istoric, tehnici precum formarea osazonilor și

d e m o n s t r a r e a fermentației au contribuit semnificativ la separarea și
identificarea carbohidraților. Observarea structurii cristaline caracteristice și a
punctului de topire al derivatului osazonei, preparat prin reacția monosacaridului
cu fenilhidrazina, a fost utilizată pentru identificare. Totuși, această metodă nu
este complet specifică, deoarece reacția implică atât atomii de carbon 1, cât și 2,
rezultatul fiind că cele trei hexosze, glucoza, fructoza și mannoza (figura 9.19),
vor da osazone identice datorită formei lor comune de enediol.
336 Carbohidrați
Testele de fermentare se bazează pe capacitatea drojdiei de a oxida

zahărul pentru a produce etanol și dioxid de carbon, deși numai izomerii D
sunt fermentescibili și numai un număr relativ mic dintre aceștia. Cu toate
acestea, tehnicile cromatografice moderne sunt mult mai acceptabile, iar
tehnicile pe hârtie și în strat subțire sunt utile pentru separarea de rutină și
semicantificarea amestecurilor de carbohidrați, deși tehnicile GLC sau HPLC
pot fi necesare pentru probele mai complexe sau pentru analiza cantitativă.
9.4.1 Cromatografie pe hârtie și în strat subțire

Au fost utilizate atât tehnici cromatografice ascendente, cât și descendente pe
hârtie și, atunci când se utilizează suporturi în strat subțire, se poate folosi fie
silicagel, fie celuloză. Deoarece numărul de carbohidrați prezenți în probă este
adesea mic, alegerea atentă a solventului va face, în general, inutilă efectuarea
separărilor bidimensionale care sunt adesea necesare atunci când sunt prezente
un număr mare de substanțe, cum ar fi aminoacizii. Soluțiile de referință ale
fiecărui carbohidrat pot fi alcătuite în concentrații de aproximativ 2 g 1-1
dizolvate într-un solvent de izopropanol (10% v/v în apă), iar eșantioane de
aproximativ 10 µJ ar trebui să dea pete perceptibile după separare.
Sisteme de solvenți
Mai multe sisteme de solvenți monofazici sunt utile pentru separarea
amestecurilor de hidrați de carbon, iar în toate cele enumerate în tabelul 9.3
cele mai mici molecule de solut au cea mai rapidă mobilitate. Astfel,
pentosele au valori Rp mai mari decât hexosele, urmate de dizaharide și
oligozaharide.
Distanța parcursă de diferitele oligozaharide reflectă numărul de unități
de monosaharide din care sunt compuse, moleculele mici de est fiind cele care
se deplasează cel mai departe. Cu toate acestea, în general, distanțele parcurse
de toate clasele de carbohidrați sunt mici și, deși modificarea compoziției
solventului poate avea ca rezultat o mobilitate generală mai mare, diferențele
relative dintre componente sunt încă mici și poate fi necesar ca solventul să
fie îndepărtat de la capătul suportului pentru a obține o separare satisfăcătoare.
În aceste
În aceste circumstanțe, distanța parcursă de glucoză este utilizată ca referință
și i se atribuie valoarea Rp = 100 în orice sistem de solvenți. Migrarea unui
alt bohidrat de automobil este raportată ca valoare Rg a acestuia:
R= distanța parcursă de substanță X
100
g distanța parcursă de glucoză
Localizarea reactivilor
Pentru vizualizarea componentelor separate se pot utiliza o varietate de
reactivi și poate fi util să se efectueze cromatograme în două exemplare și să
se utilizeze un colorant diferit pe fiecare dintre ele pentru a ajuta la
identificarea punctelor necunoscute. Cei mai frecvent utilizați reactivi
folosesc reacțiile chimice ale carbohidraților deja descrise în secțiunea privind
metodele cantitative și trebuie luate măsuri de siguranță adecvate atunci când
se utilizează diferiți reactivi de localizare. Compoziția reală a reactivilor poate
fi modificată fie în ceea ce privește concentrația componentelor, fie prin
înlocuirea unui produs chimic cu un altul foarte asemănător, deși principiul de
carbohidrați
Tabelul 9.3 Câțiva solvenți monofazici pentru cromatografia în strat subțire a carbohidraților
Compoziția Proporții* Comentarii

solventului
Acetat de etil
Piridină Apă
60}
30
Utilizate în mod obișnuit. Oferă o bună
separare a pentozelor și hexozelor. Rezolvă
20 glucoza și galactoza (C).
n-Butanol
Piridină Apă
60}
40
Se pot folosi multe variații ale compoziției
pentru a crește sau a reduce mobilitățile
Acid formic 30 globale (C)
Metil-etilcetonă
Butanol terțiar Apă
130 Oferă o bună separare a monosacaridelor și
dizaharidelor (C)
Acetat de
etil Etanol 5}
Piridină 1450
Acid acetic
Apă
710 Util pentru separarea pentoselor și hexoselor
(SG)
n-Butanol
Acetonă 0}
Acid acetic 10
Apă 10
10 Poate fi util dacă se efectuează și separări de
aminoacizi. Valorile RF tind să fie scăzute,
35 }
iar glucoza și galactoza nu sunt rezolvate.
Utilizați al doilea după solvenți care conțin
10 piridină pentru a o elimina (C)
20
n-Butanol Separă monosacaridele și dizaharidele. Este util în

Acid acetic special pentru acizii de zahăr. Dezvoltare triplă utilă
Apă pentru oligozaharide (SG)
n-Butanol Separă monosacaridele și dizaharidele. Este

Acid acetic util în special pentru glicozidele metilici și
Eter dietilic alcooli de zahăr. Oferă o bună separare cu
Apă mono-, di-, tri- și oligozaharide. Utilizate
ca al doilea solvent după n-butanol/acid
acetic/apă (SG)
* Proporțiile de constituenți pot fi variate.

Mediile de suport recomandate: (C), celuloză; (SG), silicagel.
reacția cu un carbohidrat rămâne nealterată. Astfel de variații în compoziția

reactivului pot fi avantajoase pentru a promova producerea de culori caracteristice
pentru diferiți carbohidrați (tabelul 9.4), fie în cadrul unei clase (de exemplu,
hexoses cu reactiv de anilină difenilarnină fosfat), fie prin diferențierea pe o bază
mai largă (de exemplu, pentoses de hexoses sau aldoses de cetoes). În anumite
situații, se poate recomanda utilizarea unui reactiv care încorporează o enzimă
specifică și va fi necesar să se țină seama d e orice lipsă aparentă de specificitate
enzimatică și să se cunoască toate substraturile asupra cărora va acționa enzima.
338 Carbohidrați
Tabelul 9.4 Reacții de culoare ale mono- și dizaharidelor comune
Carbohidrați Localizarea reactivilor
Naftoresorcinol Acid 4-aminobenzoic Anilină difenilamină

fosfat
Riboză Roșu/maro Albastru/verde

Xiloză Violet Verde/albastru
Arabinoză Roșu/maro Albastru/v
Xiluloză Verde/maro niu erde
Glucoză Roșu/maro Albastru/v
Galactoză niu Maro erde
Fructoză Roșu Maro Maro Gri/albastr
Roz* u
Gri/albastr
u
Portocaliu/maro
Zaharoz Roșu Maro* Maro
ă Maro Albast
Lactoză ru
* Indică faptul că reactivul prezintă o sensibilitate scăzută pentru acel carbohidrat.
Tabelul 9.5 oferă exemple de reactivi de localizare utili, a căror

compoziție poate fi modificată pentru tehnicile de imersie sau de pulverizare,
culorile apărând de obicei după încălzire la 100°C timp de 5-10 minute.
Reacția reactivilor de localizare acizi poate fi afectată dacă nu se elimină
complet piridina prezentă în solventul cromatic. Acest lucru este deosebit de
important atunci când se utilizează straturi subțiri de hârtie și celuloză, deși în
cazul siliciului nu este atât de important. Piridina este absorbită de celuloză și
nu poate fi îndepărtată complet prin uscare în cuptor, deși problema poate fi
rezolvată prin scufundarea cromatogramei uscate în n-butanol și reuscarea
înainte de aplicarea reactivului de localizare sau prin utilizarea unui al doilea
sistem de solvenți care include un alcool, de obicei n-butanol.
9.4.2 Cromatografie gaz-lichid

Cromatografia gaz-lichid poate fi metoda de alegere atunci când este necesar
să se identifice sau să se cuantifice unul sau mai mulți carbohidrați, în special
atunci când aceștia sunt prezenți în cantități mici. Deși această tehnică este
adesea utilizată deoarece este posibilă rezolvarea carbohidraților cu structuri
foarte asemănătoare, faptul că un
și /3 anomeri și formele piranoză și furanoză ale aceluiași carbohidrat, toate
oferă vârfuri separate este uneori un dezavantaj.
Cromatografia în fază gazoasă trebuie efectuată folosind derivați
volatili ai carbohidraților și, deși au fost studiați mai mulți (de exemplu, Eteri
O-metil, Eteri O-acetil, Eteri O-metil trimetilsililici, O-metil oximi și Eteri O-
trimetilsilici), folosind o varietate de faze staționare, derivații O-trimetilsilici
(TMS) sunt probabil cei mai frecvent utilizați, deși circumstanțele pot impune
utilizarea unei alternative. Astfel de derivați TMS sunt ușor de preparat și au
fost aplicați cu succes la o mare varietate de compuși. Trebuie remarcat faptul
că, în general, carbohidrații necesită doar condiții slabe de sililare, în caz
carbohidrați
contrar va avea loc o izomerizare de tip ran dom cu producerea de vârfuri
false care fac foarte dificilă interpretarea urmei cromatografice. Utilizarea
unui amestec de HMDS (hexametildisilazan), TMCS (trimetilclorosilan) și
piridină
340 Carbohidrați
Tabelul 9.5 Exemple de reactivi de localizare adecvați pentru TLC a carbohidraților
Reactiv Compoziție și utilizare Principiul reacției Observații
Acid sulfuric Acid concentrat Deshidratarea Reactiv de localizare generală pentru toate clasele de
concentrat Spray carbohidraților carbohidrați. Unele diferențe ușoare de culoare
pentru diferite clase (galben/maro/negru). Nu este
adecvat pentru utilizarea pe plăci de celuloză.
Orcinol-sulfuric 200 mg de orcinol în I 00 ml Formarea de furfural și acid Detectează mono-, di-, tri- și oligozaharide.
I0% acid sulfuric derivați cu căldură și Variații de culoare verde/violet/maro
Spray acid care se condensează
cu
un fenol
Reacționează cu cetozele. Culorile (roșu/maroniu)
Naftoresorcinol 200 mg naftoresorcinol Formarea de furfural și se estompează la temperatura camerei, dar nu și
în 3,2 ml de 90%. derivați cu căldură și la -20°C. Piridina reziduală din solvent va
acid ortofosforic în acid care se condensează interfera
cu
I 00 ml metanol un fenol
Scufundare
Foarte util pentru mulți carbohidrați diferiți.
Acid 4-aminobenzoic 1,4 g acid 4-aminobenzoic Reacție cu aromatice Foarte sensibil pentru pentose. Culorile
+ 3,2 ml 90%. amină în acid (roșu/maroniu) pot fi conservate prin acoperirea
ortofosforic fierbinte acid ortofosforic în cu vinil din aerosol.
I 00 ml metanol
Scufundare
Nu este la fel de sensibil ca unii reactivi, dar
Anilindifenilamină I ml anilină + I g Reacția cu fosfatul variațiile de culoare sunt utile în interpretare
aromatic Difenilamină în 100 ml amină în acetonă acidă (gri/albastru/verde/maroniu).
fierbinte. Se adaugă IO ml 85%.
acid ortofosforic
Scufundare
340 Carbohidrați
(2: 1:10), deși carbohidrații combinați cu sau care conțin amino, fosfați, grupe
carboxilice sau acizi nucleici vor necesita un agent de sililare mai puternic, iar
BSA (N,O-bis(trimetilsilililil) acetamidă) sau BSTFA (N,O-bis(trimetilsililil)
trifluoroacetamidă) împreună cu TMCS (trimetilclorosilan) și piridină sunt
utilizate pe scară largă.
Alegerea unei faze staționare va depinde de natura carbohidraților care
urmează să fie separați și, în timp ce o coloană OV-17 (fenilmetil gumă
polisiloxi) poate da separări izomerice satisfăcătoare, o fază nepolară, cum ar
fi OV-1 (metilpolisiloxi gumă), poate fi mai utilă pentru o gamă mai largă de
carbohidrați (figura 9.23).
n
I II
I II
Manitol
Omul
. GlcNAc.
AcNeu.
Gal.
Fuc.
Glc.
Figura 9.23 Separarea concentrațiilor echimolare de metilglicozide prin

cromatografie gaz-lichid. Analiza a fost efectuată pe o fază staționară OV-1 folosind un
gradient de temperatură de la 120 la 220°C.
L-fucoza și o-galactoza au dat fiecare trei vârfuri separate corespunzătoare nosidei
fura și alfa și beta-metilpiranozidelor. o-mannoza, o-glucoza și N-acetilglucozamina
(GlcNAc) au dat fiecare două vârfuri datorate alfa și beta-piranozidelor. o-manitolul,
care a fost utilizat ca standard intern, și acidul N-acetilneurarninic (AcNeu) au dat
vârfuri unice. În aceste condiții cromatografice, nu s-a obținut o rezoluție completă a
tuturor componentelor, iar unele dintre ele au avut timpi de retenție identici, de ex.
/3-0-metilgalactopiranozidă și a-o-metilglucopiranozidă.
9.4.3 Cromatografie lichidă de înaltă performanță

Separarea și cuantificarea amestecurilor de carbohidrați se poate realiza prin
HPLC, o metodă care nu necesită formarea unui derivat volatil, ca în cazul
GLC. Au fost utilizate atât tehnici de separare, cât și tehnici de schimb de
ioni, cu detectoare cu ultraviolete sau cu indice de refracție. Cromatografia de
partiție se realizează de obicei în modul de fază inversă, utilizând ca fază
mobilă o fază staționară legată chimic și acetonitril (80:20) în 0,1 mol 1-1
acid acetic. Au fost utilizate atât rășini schimbătoare de anioni, cât și rășini
schimbătoare de cationi. Carbohidrați
Lecturi 341
suplimentare
formează complecși anionici în tampoane alcaline de borat, iar pentru
separarea lor se pot utiliza rășini schimbătoare de anioni de amoniu cuaternar
în forma hidroxilată. Problemele cauzate de reacțiile de rearanjare în soluție
alcalină au fost reduse la minimum prin utilizarea tampoanelor de acid
boric/glicerol la pH 6,7. Este posibilă separarea monosacaridelor la acest pH
prin eluție cu un astfel de tampon la care s-a adăugat clorură de sodiu. Acest
lucru este omis în cazul di- și trisacaridelor și se folosește un tampon mai slab
de acid boric/glicerol care prelungește timpul de eluție și permite o bună
rezoluție. Rășinile schimbătoare cationice sulfonate cu contra-ioni metalici
sunt, de asemenea, utile pentru analiza carbohidraților. În mod normal, se
utilizează apă sau eluenți ușor acizi în condiții de temperatură controlată, de
exemplu 85 °C. Rășinile sunt disponibile într-o varietate de forme. Forma de
calciu sau de plumb este în general recomandată pentru monosaharide și
dizaharide, în timp ce pentru oligozaharide este preferată forma de argint sau
de sodiu.
Secțiunile 9.2/3/4
1 Care dintre următoarele enzime acționează asupra unui carbohidrat?
(a) Cataliză.
(b) Celulază.
(c) Amilază.
(d) Peroxidază.
2 În testul glucoxidazei de glucoză, care dintre următoarele elemente
sunt utilizate pentru a măsura peroxidul de hidrogen produs?
(a) O diaforază și o sare de tetrazoliu.
(b) O peroxidază și un acceptor de hidrogen.
(c) O peroxidază și un acceptor de oxigen.
(d) O mutarotază și o amină aromatică.
3 Glucoza-6-fosfat dehidrogenază este utilizată ca enzimă indicatoare
în testul hexokinazei de glucoză.
PENTRU CĂ
hexokinaza este specifică pentru fosforilarea glucozei.
4 Detectoarele cu indice de refracție nu sunt adecvate pentru
utilizarea în HPLC a carbohidraților.
PENTRU CĂ
carbohidrații sunt ușor de detectat prin fluorescența lor naturală.
Chaplin, M.F. și Kennedy, J.F. (eds) (1994) Carbohydrate analysis, ediția a 2-a, IRL
Press, UK.
Birch, G.G. (ed.) (1985) Analysis of food carbohydrate, Elsevier Applied Science
Publishers, UK.
Bochkov, A.F., Zaikov, G.E. și Afanasiev, V.A. (1991) Carbohidrați, VSP, Țările de
Jos.
10 Aminoacizi
• Structură generală și proprietăți

• Reacții generale
• Analiza N-terminală
• Reacții ale aminoacizilor specifici
• Separarea amestecurilor de aminoacizi
• Analizator de aminoacizi
Aminoacizii sunt molecule organice cu masă moleculară relativă mică

(aproximativ 100-200) care conțin cel puțin o grupare carboxil (COOH) și
una amino (NH2 ) și sunt constituenți esențiali ai țesuturilor vegetale și
animale. Variațiile care apar între diferiții aminoacizi constau în natura
grupărilor R (lanțuri laterale) ale acestora (figura 10.1), o caracteristică care
are o importanță fundamentală și care conferă individualitate fiecărui
aminoacid. Din cunoașterea naturii chimice a grupei R, se pot face predicții
cu privire la proprietățile unui anumit aminoacid și, invers, cunoașterea
proprietăților unui aminoacid în curs de investigare va ajuta la identificarea
grupei R și, prin urmare, a aminoacidului.
r---1
IH o 7
a-Amino '\,. I a-Carboxil
grup I /N-C-C-C'\,. Igroup
IHI 0-HI
L-------------------------- J
Figura 10.1 Structura generală a unui a-aminoacid. Partea moleculei reprezentată în
interiorul casetei este comună tuturor a-aminoacizilor, în timp ce R reprezintă lanțul
lateral, care este diferit pentru fiecare aminoacid.
Există mai multe metode disponibile pentru cuantificarea aminoacizilor,

care oferă doar informații despre conținutul total de aminoacizi din probă.
indiferent dacă sunt prezenți unul sau mai mulți aminoacizi și nu poate face
diferența între componentele individuale. În cazul în care este necesar să se
detecteze un anumit aminoacid în prezența altora, în teorie se alege o metodă
care utilizează o caracteristică chimică sau fizică specifică aminoacidului în
cauză. În practică, acest lucru este, de obicei, dificil de realizat și multe dintre
aceste metode prezintă grade diferite de specificitate. Astfel, unele dintre
metodele cele mai utilizate și cele mai răspândite implică separarea diverșilor
aminoacizi din probă printr-o tehnică cromatografică sau electroforetică
urmată de determinarea calitativă sau cantitativă a fiecărui component prin
una dintre metodele colorimetrice sau fluorimetrice generale. Cu toate acestea,
în cazul în care scopul analizei este de a detecta și identifica diferitele
componente de aminoacizi fără o separare prealabilă, se poate utiliza un
reactiv mai specific, în cazul în care reacția depinde de prezența unui anumit
tip de aminoacid. Astfel de reactivi sunt, de asemenea, adesea utilizați ca
agenți de vizualizare în cazul tehnicilor de cromatografie pe hârtie și în strat
subțire sau de electroforeză.
10 ..1
► Proteinele sunt Există aproximativ 20 de aminoacizi care se găsesc în proteine, toți fiind
aminoacizi, cu excepția celor doi a-iminoacizi pralină și hidroxiprolină (figura
compus din a-amino
I 0.2), care, în scopul acestei discuții, vor fi asimilați aminoacizilor datorită
acizi și a-iminoacizi.
asemănării lor. A-aminoacizii sunt numiți astfel deoarece gruparea amino este
atașată la carbonul a- al lanțului care este, prin convenție, atomul de carbon
adiacent grupului carboxil. Atomii de carbon următori sunt desemnați {3, 'Y, 8
și E (figura 10.3). Prin urmare, în
CH2 --CH2 HO -CH -CH -CH2
I I I I
CH2 CH- COOH CH2 ,CH - COOH
'-.._/ '-.._/
NH NH
Figura 10.2
a- Iminoacizi. Proline Hidroxiprolină
E 8 y p a
c-c-c-c-c-c-c-cooH
a-Alanină ,B-Alanina
CH2 - CH2 - COOH

I
NH2
acid a-aminobutiric acid y-aminobutiric
Figura 10.3 CH3- CH2 - CH -COOH CH2 - CH2- CH2- COOH

Structura formelor I I
alternative de NH2 NH2
aminoacizi.
344 Aminoacizi
a-aminoacizii, atât grupa amino, cât și grupa carboxil sunt atașate la același
atom de carbon. Mulți aminoacizi naturali care nu se găsesc în proteine, dar
care sunt importanți fie în metabolism, fie ca și constituenți ai plantelor și
antibioticelor, au structuri care diferă de cea a-aminoacizilor. În aceste
compuși, gruparea amino este atașată la un alt atom de carbon decât atomul de
carbon a-car bon și se numesc în consecință /3, 'Y, 8 sau E aminoacizi (tabelul
10.1).
Tabelul 10.1 Câțiva aminoacizi naturali care nu se găsesc în proteine

Aminoacid Semnificație Formula
metabolică sau sursă
tisulară
acid a-aminobutiric Țesuturi vegetale CH3 --CH2--CH--CH--COOH

și animale I
NH2
CH2--CH2--CH--CH--COOH
acid a,y-
diaminobutiric
Antibiotice
I I
NH2 NH2
CHr'--CH2--COOH
,B--Alanina Coenzima A I
NH2
CH2--CH2--CH2--CH2--COOH
acid y-aminobutiric Țesut cerebral I
NH2
COOH--CH-{CH2h--CH--COOH
acid a,s- Peretele celular I I
bacterian NH2 NH2
diaminopimelic
10.1.1 Clasificare
Atunci când se analizează principiile și aplicațiile metodelor de determinare a
aminoacizilor, este util să se poată aprecia caracteristicile acestor compuși.
Deși nu este întotdeauna esențial să se cunoască formula structurală exactă a
aminoacizilor individuali, este util să se poată reține proprietăți particulare sau
prezența grupărilor funcționale.
Tabelul 10.2 Clasificarea aminoacizilor pe baza

structurii chimice
Natura chimică a grupei R Exemple
Alifatice Gly, Ala, Val,

Aromatice Val, Leu Phe,
Hidroxilice Tyr, Trp
Carboxilice Ser, Thr
Sulfurate care Asp, Glu
conțin sulf Imino Cys, Met
Aminoamidă Pro, Hyp
Lys, Arg
Asn, Gin
Este convenabil să se grupeze aminoacizii cu grupe R similare care

prezintă caracteristici chimice sau fizice comune. Clasificarea se poate baza
pe natura chimică a grupei R, iar un astfel de sistem (tabelul 10.2) facilitează
memorarea proprietăților generale ale fiecărui aminoacid. Cu toate acestea,
un sistem de clasificare bazat pe polaritatea grupei R poate fi, de asemenea,
util, iar acesta, împreună cu formula structurală și formele prescurtate ale
aminoacizilor a, este prezentat în tabelul 10.3.
Tabelul 10.3 Aminoacizi
Denumire comună Abrevierea Structură pl Observații
Grupuri R polare
neîncărcate NH2
I
H-C-H 6.0 Atom de hidrogen pe lanțul
Glicină Gly I lateral - nu este optic activ
COOH
NH2
I
H-C-CH2OH 5.7 Grup hidroxil în lanțul lateral
Serină Ser I
COOH
NH2 H
I I
Treonină Thr H-C--C-C- 6.5 Grup hidroxil în lanțul lateral
CH 3 - are doi atomi de carbon
I I asimetrici
COOH OH
,....-CHOH
"
HNj CH2
Hidroxiprolină Hyp H-c. .. I 5.8 Grupa hidroxil este adăugată
I CH2 la prolină după sinteza în
COOH proteine și se găsește
numai în colagen și
gelatină - are doi atomi de
carbon asimetrici
Cisteină Cys 5.0 Conține sulf - formează legături

disulfură
NH2
Tirozină Tyr H-I-CH - j 1 \ 5.7 Lanțul lateral aromatic fenolic
OH
cooH
Asparagină Asn 5.4 Amida acidului aspartic

346 Aminoacizi
Tabelul 10.3 Aminoacizi (continuare)
Denumire comună Abrevierea Structura pl Comentarii
H2
Glutamină H-C-CH2-CH2-CH2-CONH2 5.7 Amidă a acidului
I glutamic
COOH
Grupuri R nepolare
H2
Alanină Ala H-CI -CH 6,0 Lanț lateral alifatice
3
COOH
NH2 CH
I / 3
Valine Val H-C-CH-CH 6.0 Lanț lateral alifatice
I \ ramificat
COOH CH3
NH2 CH3
I /
Leucină Leu H-C-CH-CH:r- 6.0 Lanț lateral alifatic
CH ramificat
I \
COOH CH3
H2 /CH3
Isoleucină Ile 6.0 Lanț lateral alifatic
H-C CH ramificat - are doi
I \ atomi de carbon
COOH 2
asimetrici
CH3
/CH2
HN "--
1 CH2
Proline Pro H-C I 6.1 Iminoacid -
I ... CH2 distorsionează oc-
helixul regulat
COOH structură
NH2
Fenilalanină Phe H-CI

I -CH
COOH
0
2
6,0 Lanț lateral aromatic
H2
Triptofan Tip H-CI -CH 5.9 Lanț lateral aromatic
2
heterociclic
COOH
NH
H2
Metionină Met H-C-CH2-CH2-CH2 - 5.8 Lanț lateral alifatice
S-CH3 conține sulf
I
COOH
Tabelul 10.3 Aminoacizi (continuare)
Denumire comună Abrevierea Structură p/ Observații
Polar cu o grupare carboxil

suplimentară 7H2
H-C-CH2-COOH 2.9 Dicarboxilic
Acid aspartic Asp I
COOH
r2 -CH -CH -CH -

Acid glutamic Glu H-CI COOH
3.2 Dicarboxilic
2 2
COOH
Polar cu o grupă suplimentară ionizabilă conținând N
7H2
Lizină Lys H-f-CH2-CH2-CH2- CH2-CH2- 9.7 Diamino
NH2 COOH
NH2
I
Hidroxilizină Hyl H-f-CH2-CH2-CH2-CHOH-CH2- 9.2 Grupa hidroxi este
CH2- NH2 adăugată după sinteza
COOH în proteine - se
găsește numai în
colagen și gelatină
Arginină Arg I 0.8 Grupa Guanidino -

important în ciclul
ureei
7H2 7.6. Grupa imidazol

Histidină His
H-C-CH2 -C=CH heterociclică în lanțul
I I I lateral
COOH HN ,NH
"-c/
H
10.1.2 Izomerie
Carbonul a- al tuturor aminoacizilor, cu excepția glicinei, are patru grupe de
substituenți diferiți și, prin urmare, este un atom de carbon asimetric. Un astfel de
atom poate exista în două aranjamente spațiale diferite, care sunt imagini în
oglindă unul față de celălalt. Aceste forme structurale ale moleculelor sunt
cunoscute sub numele de stereoisomeri și se folosește notarea comună a formelor
D și L, o nomenclatură care se referă la configurația lor spa tială absolută în
comparație cu cea a gliceraldehidei (figura 10.4).
348 Aminoacizi
CHO CHO
I I
HO-C-H H-C-OH
I I
CH2OH CH2OH
L-Gliceraldehidă o-Gliceraldehidă
COOH COOH
I I
H2N-C-H H-c-H2N
I I
CH3 CH3
L-Alanină o-Alanină
Figura I 0.4 Relația stereochimică dintre aminoacizi și glicer aldehida. Denumirea

de o sau L pentru un aminoacid se referă la configurația sa absolută în raport cu
structura o-, respectiv L-gliceraldehidei. Formele o și L ale unui anumit compus se
numesc enantiomeri.
Toți aminoacizii, cu excepția glicinei, există în aceste două forme

izomere diferite, dar numai izomerii L ai aminoacizilor a se găsesc în
proteine, deși mulți aminoacizi D se găsesc în mod natural, de exemplu în
anumiți pereți celulari bacterieni și în antibioticele polipeptidice. Este dificil
de diferențiat între izomerii D și L prin metode chimice și, atunci când este
necesar să se rezolve un amestec racemic, o enzimă specifică izomerilor oferă
o modalitate convenabilă de a degrada izomerul nedorit, lăsând intact celălalt
izomer. În mod similar, într-o anumită probă, un izomer poate fi determinat în
prezența celuilalt izomer folosind o enzimă cu specificitate pentru izomerul în
curs de investigare. Celălalt izomer prezent nu va acționa ca substrat pentru
enzimă și nu se va demonstra nicio activitate enzimatică. Enzima L-
aminoacid oxidază (EC 1.4.3.2), de exemplu, este o enzimă care prezintă
activitate numai cu aminoacizii L și nu reacționează cu aminoacizii D.
Cu toate că notația D și L este încă folosită în mod obișnuit în domeniul
aminoacizilor și al
terminologia carbohidraților, nomenclatura modernă folosește un sistem care
permite specificarea configurației unui atom asimetric. Acest sistem se
numește convenția R-S sau regula secvenței și presupune atribuirea unei
priorități (a>b>c>d) celor patru atomi substituenți diferiți atașați atomului
asimetric pe baza numărului atomic al fiecăruia. Secvența grupărilor
substituente în raport cu axa dintre atomul de carbon asimetric și gruparea
substituentă cu cea mai mică prioritate (d) este utilizată pentru a desemna
atomul ca fiind R (rectus, dreapta) sau S (sinister, stânga) (figura 10.5) (figura
10.5).
10.1.3 Proprietăți ionice
Aminoacizii conțin atât grupe acide (COOH), cât și grupe bazice (NH2). Prin
urmare, aceștia pot acționa atât ca acizi slabi, cât și ca baze slabe și, prin
urmare, sunt numiți
-CHO
IC----H d H-c-OH
CHO
I
I
HO '\ CH2cOH CH2OH
a
R-Gliceraldehidă o-Gliceraldehidă
a- b- c este în sensul acelor de ceasornic
COOH
I
HN-C-H
2 I
CH3
C a
S-Alanină L-Alanină
a- b- c este în sens invers
acelor de ceasornic
Figura 10.5 Denumirea sistematică a unui aminoacid folosind convenția R-S.

Compusul este denumit prin desemnarea configurației atomului de carbon asimetric ca
fiind R sau S. Pentru aminoacizii care conțin mai mult de un centru asimetric, de
exemplu treonina și izoleucina, se specifică configurația în jurul fiecărui atom
asimetric.
ampoliți. Comportamentul lor este numit amfirotic deoarece pot accepta sau
dona un proton, reacție care poate fi reprezentată prin următoarea ecuație:
Chiar și această reprezentare nu este complet adevărată, deoarece

implică faptul că un aminoacid există într-o formă neîncărcată (R.NH2
.COOH), în timp ce molecula în această stare poartă o sarcină negativă și una
pozitivă și, ca urmare, nu prezintă nicio sarcină netă. Aceasta este cunoscută
sub denumirea de formă dipolară sau "zwitterion" a aminoacidului (figura
10.6).
R
I
NH/-c-coo-
1
H
Figura 10.6 Forma dipolară sau zwitterionică a unui aminoacid. Aminoacizii
există sub formă încărcată în soluție apoasă, grupa carboxil fiind disociată și grupa
amino asociată. Unii aminoacizi au, de asemenea, o grupare suplimentară ionizabilă
prezentă în lanțul lor lateral (grupa R). Ionizarea fiecărui grup este dependentă de pH
și pentru fiecare aminoacid există un pH la care sarcinile sunt egale și opuse, iar
molecula nu poartă nicio sarcină netă. Acesta se numește pH izo-ionic (pl).
350 Aminoacizi
În soluție, disocierea fiecărei grupe ionizabile din moleculă poate fi

reprezentată după cum urmează:
COOH """" coo- + H+
NH/"""" NH2 + H+
Formele disociate și nedisociate ale fiecărei grupe există în echilibru una cu
cealaltă, iar poziția echilibrului (sau tendința fiecăreia dintre grupe de a se
disocia) poate fi exprimată în termenii constantei de echilibru (de disociere)
K, numită adesea Ka deoarece se referă la disocierea grupărilor care
eliberează protoni, adică acizii. Valorile reale ale lui Ka sunt adesea foarte
mici și sunt exprimate în mod convențional ca logaritm negativ al valorii, un
termen cunoscut sub numele de valoarea pKa:
pKa = - log Ka
Această funcție are ca rezultat o valoare numerică mai puțin complicată
de utilizat și este comparabilă cu metoda de exprimare a concentrației ionilor
de hidrogen dintr-o soluție, respectiv valoarea pH-ului:
pH = - log [W]
Concentrația de ioni de hidrogen eliberați prin disocierea unui acid este
legată de constanta de disociere a acelui acid, iar această relație poate fi
exprimată prin ecuația Henderson-Hasselbalch:
H K l
[sare] p =p
a + og [acid]
unde parantezele pătrate indică concentrația molară a substanței menționate.
O examinare a acestei ecuații relevă faptul că, atunci când concentrațiile
de sare și de acid nedisociat sunt egale, pH-ul soluției este numeric egal cu
pKa pentru acidul respectiv. Cu cât valoarea pKa pentru un acid este mai
mică, cu atât mai mare este capacitatea acidului de a se disocia, producând
ioni de hidrogen, o caracteristică cunoscută sub numele de puterea acidului.
Aminoacizii cu două grupe ionizabile, o grupă a-carboxil și o grupă a-amino,
vor fi caracterizați printr-o valoare pKa pentru fiecare grupă, iar valoarea
reală va da o indicație a puterii grupei acide sau bazice în cauză.
Ionizarea unui aminoacid este cel mai ușor de demonstrat printr-o curbă
de titrare, care poate fi preparată prin titrarea unei soluții de aminoacid în
forma complet protonată cu o soluție de hidroxid de sodiu (figura 10.7) și prin
reprezentarea grafică a cantității de alcalin adăugat în funcție de pH-ul rezultat
al soluției. Curba de titrare pentru un aminoacid simplu va prezenta două
regiuni în care adăugarea de alcalin are ca rezultat doar o mică modificare a
valorii pH-ului amestecului. Acțiunea de tamponare a unui aminoacid este cea
mai semnificativă în aceste intervale de pH.
Primul punct final într-o astfel de titrare se datorează grupului carboxil,
iar valoarea pKa pentru acesta se numește pK.1 , în timp ce a doua valoare pK
este pentru grupul amino și se numește pKai- În practică, fiecare acid și sarea
sa vor acționa ca un tampon într-un interval de pH de aproximativ o unitate de
fiecare parte a valorii sale pKa. Pentru aminoacidul alanină, unde pKat este
2,4 și pK32 este 9,6, acțiunea tampon cea mai eficientă are loc în intervalele de
pH 2,4 ::±:: 1,0 și 9,6 ::±:: 1,0.
În plus față de grupele a-amino și a-carboxil, acei aminoacizi cu o grupă

ionizabilă suplimentară vor avea, de asemenea, o valoare pKa. Acidul
glutamic este un exemplu de aminoacid cu o grupare acidă suplimentară
(COOH) pe carbonul -y, iar lizina este un exemplu de aminoacid cu o grupare
amino suplimentară pe carbonul
€ - atom de carbon. Ca urmare, fiecare dintre ele are trei grupe ionizabile și trei
pK.
pH
10
Amestec
de
formu
lare
9
2&3
7
Sarcina
negativă
6 --------------
1 netă
Formular
2
pjl predomină
5 Sarcina
pozitivă
netă
4
3 Ameste
c de
forme 1
2 și 2
Cationic Zwitterionic ...=!!:._ Anionic

...=!!!:. formular +H+ formează
_ formă +H+ CH3 CH3
I I
CH3
I
©NH3-C- COOH ©NH3-c- cooe NH,-c-cooe
I I I
H H H
Figura 10.7 Curba de titrare a alaninei. O soluție de alanină (0,1 mo! 1-1 ) în
formă complet protonată la pH 2,0 este titrată cu 0,1 mo! 1-1 hidroxid de sodiu. Se
înregistrează volumele de hidroxid de sodiu adăugate și se trasează în funcție de
valorile pH-ului rezultat pentru a obține o curbă de titrare care este tipică pentru un
aminoacid cu numai două grupe ionizabile (o grupă carboxil și una amino). Cele
două zone umbrite arată intervalul de pH în care adăugarea de alcalin are ca
rezultat doar o schimbare foarte mică a pH-ului și în care aminoacidul prezintă
cea mai semnificativă acțiune tampon. La un pH echivalent cu pK.1 , există
cantități egale de forme 1 și 2, în timp ce la un pH echivalent cu pK.2 , formele 2 și
3 sunt în concentrații egale. Valoarea pl pentru alanină este de 6,0 și reprezintă
media dintre pKa1 (2,4) și pKa2 (9,6). La un pH mai mic decât valoarea sa pl, un
aminoacid va purta o sarcină pozitivă netă, dar va purta o sarcină negativă netă la
352 Aminoacizi
valori ale pH-ului mai mari decât valoarea sa pl.
Tabelul 10.4
Aminoacid Formulă Valori pK8
Acid glutamic
(grupare COOH
IOOH 4.1
suplimentară) CH2
I
CH2
I -
H-C-NHi 9.5
I -
COOH 2.1
Ni\ 10.8
Lizină I
(extra NH2 grup) CH2
I
CH2
I
CH2
I
CH2
H-C-NHi
I -
I 9.2
COOR
2.2
Asteriscurile (*) indică locul în care poate avea loc câștig sau pierdere de protoni.
Tabelul 10.5 Valorile pKa pentru unii aminoacizi
Aminoacid Grupa extraionizabilă a-Carboxil a-Amino Grup

suplimentar
pKal PKa2 pKa3
Arginină Guanidinium 1.8 8.9 12.5

Cisteină Sulfidrilă 1.7 10.8 8.3
Tirozină Fenolic 2.0 9.1 10.l
Histidină Imidazol 1.8 9.2 6.0
pot fi demonstrate (tabelul 10.4), valoarea pKa3 fiind pentru grupa extra. Alte
grupe funcționale prezente într-un aminoacid pot fi, de asemenea, ionizabile
și vor avea valori pKa caracteristice (tabelul 10.5). Astfel de aminoacizi dau
naștere la curbe de titrare complexe.
Sarcina totală purtată de un aminoacid depinde de pH-ul soluției și de
valorile pKa ale grupărilor ionizabile prezente. Dacă pH-ul este mai mare
decât valoarea pKa pentru o grupare, se va pierde un proton și molecula va
purta o sarcină negativă (figura 10.7), dar dacă pH-ul este mai mic decât
valoarea pKa, va predomina o sarcină pozitivă. Faptul că, la diferite valori ale
pH-ului, diferiți aminoacizi vor fi prezenți în diferite forme ionice și vor purta
sarcini nete diferite este utilizat în multe metode analitice, de exemplu, în
electroforeză și în cromatografia cu schimb de ioni.
Punctul izo-ionic al unei molecule este pH-ul la care numărul de
sarcini negative datorate pierderii de protoni este egal cu numărul de sarcini
pozitive datorate pierderii de protoni.
354 Aminoacizi
câștig de protoni și predomină forma zwitterionică. Punctul izoelectric (pl)

este pH-ul soluției la care moleculele nu prezintă migrație în câmp electric și
poate fi determinat experimental prin electroforeză: pentru aminoacizi, acesta
este egal cu punctul izo-ionic. Punctul izo-ionic al unui aminoacid cu o
grupare carboxilică și una amino este media celor două valori pK. (figura
10.7). Cu toate acestea, atunci când sunt prezente trei grupe ionizabile, efectul
unei grupe acide suplimentare va fi acela de a reduce caracterul ionic al
celeilalte grupe acide și, prin urmare, valoarea pl nu va fi media celor trei
valori pK. separate, ci se va apropia mai mult de media celor mai apropiate
valori pK.
10.1.4 Peptide
Atunci când doi aminoacizi sunt legați între ei prin condensarea grupării a-
amino de la un aminoacid și a grupării a-carboxil de la altul pentru a forma o
legătură peptidică, compusul rezultat se numește dipeptidă (figura 10.8).
Caracterul ionic al aminoacizilor constituenți va fi modificat ca urmare a
pierderii fie a unei grupări amino, fie a unei grupări carboxil, iar proprietățile
dipeptidei vor depinde nu numai de grupările terminale amino și carboxil, ci
și de orice grupări R ionizabile. În cazul peptidelor care conțin un număr din
ce în ce mai mare de aminoacizi, semnificația celor două grupări terminale
(COOH și NH2 ) devine mai puțin importantă, iar natura ionică a grupărilor R
devine mai importantă. Moleculele care conțin mai mulți aminoacizi legați în
acest mod sunt cunoscute sub denumirea de polipeptide și, în general, sunt
-vR
clasificate ca proteine doar atunci când sunt compuse din mai mult de 50 de
aminoacizi și masa lor moleculară relativă depășește 5000.
grup
I COOH1
I I I
: CH2 I
I I I
I--i-C-H2 + H
,- Io I
N-C-COOH
H2N-C-C-C
I I r+-,
H HI CH31
L I
f
- Rgroup
COOH
I "--H20
CH2
I
CH H
I I
H,N- C C-COOH
- I I
H CH3
'-_ Legătură peptidică
Figura 10.8 Structura unei dipeptide. Legătura peptidică unește acidul glutamic și
alanina prin condensarea grupei a-carboxil a acidului glutamic și a grupei a-amino a
alaninei. Dipeptida rezultată se numește glutamilalanină, care poate fi prescurtată
NHz-Glu-Ala-COOH sau Glu-Ala.
354 Aminoacizi
Legăturile peptidice din proteine sunt între grupările a-amino și a-

carboxil, dar în mod natural apar peptide în care legătura peptidică implică o
grupare carboxil sau amino care este atașată la un alt atom de carbon decât
carbonul a-. Aminoacidul glutamic conține două grupe carboxil atașate la
atomii de carbon a- și y și oricare dintre ele poate fi implicată în legăturile
peptidice. O dipeptidă formată între grupa y-carboxil a acidului glutamic și
grupa amino a alaninei se numește y-glutamilalanină (figura 10.9). Legăturile
se pot forma, de asemenea, între gruparea 1:-amino a lizinei și alți aminoacizi.
Se găsesc și peptide ale căror constituenți sunt alți aminoacizi decât a-
aminoacizii; carnosina, de exemplu, este o dipeptidă care se găsește în mușchi
și este formată din {3-alanină și histidină.
Singura dovadă reziduală a aminoacizilor care alcătuiesc polipeptidele
este grupul R al acestora, iar componentele individuale sunt numite acum
reziduuri de aminoacizi. Este convențional ca, atunci când se reprezintă
peptide, să se arate reziduul de aminoacid terminal cu gruparea amino liberă
în stânga oricărei diagrame și să se desemneze Reziduul 1 (reziduul N-
terminal) și cel cu gruparea carboxil liberă (reziduul C-terminal) în dreapta
oricărei diagrame (figura 10.10).
Mulți dintre hormonii și antibioticele naturale sunt polipeptide, iar
investigarea atât a constituenților aminoacizilor, cât și a secvenței acestora în
lanțul polipeptidic reprezintă domenii importante de cercetare. Aceste
cercetări pot dezvălui informații privind partea biologic activă a moleculei,
fapt care poate fi apoi utilizat în producția comercială a unei peptide sintetice.
H
I
C-COOH
I
"'CH3
Figura 10.9 Structura y-glutamilalaninei. Dipeptida este formată din acid glutamic
legat printr-o legătură peptidică care implică gruparea carboxil atașată la atomul de
carbon y și gruparea a-amino a alaninei.
Reziduul N-
teninal
5
Ser - Tyr - Ser -Met - Glu - Lui - Phe - Arg - Trp - Gly -
15 20
25 30
Lys -Val-Tyr-Pro - Asn-Gly-Ala- Glu-Asp-Glu-
35 39
Ser--Ala-Glu--Ala--Ala-- Phe-Pro - Leu- Glu- Phe
Reziduu C-
terminal
Figura JO.JO Secvența de aminoacizi a adrenocorticotrofinei umane. Reziduurile

de aminoacizi din acest hormon polipeptidic sunt legate prin legături peptidice și fiecare
reziduu primește un număr începând cu reziduul N-terminal (numărul 1) până la reziduul
C-terminal (numărul 39).
care conține doar acea mică parte din polipeptidul original, dar care prezintă o
activitate fiziologică comparabilă cu cea a moleculei întregi. Acest lucru este
valabil pentru mai mulți hormoni, un bun exemplu fiind hormonul hipofizar
anterior, hormonul adrenocorticotrofic (ACTH), care este compus în mod
natural din 39 de resturi de aminoacizi (figura 10.10), dar o peptidă sintetică
care conține doar resturile I-23 ale hormonului original prezintă o activitate
fiziologică comparabilă.
Secțiunea 10.1
1. Ce conțin toți a-aminoacizii?
(a) Cel puțin două grupe amino (NH2 ).
(b) Cel puțin două grupe carboxil (COOR).
(c) Cel puțin o grupare amino (NH2 ).
(d) O grupare amino (NH2 ) și o grupare carboxil (COOR).
2. Care dintre următorii aminoacizi sunt aromatici (A) și care sunt
bazici (B)?
(a) Glicină.
(b) Lizină.
(c) Tirozină.
(d) Cisteină.
3. Legătura care leagă aminoacizii între ei în proteine este cunoscută
sub numele de legătură peptidică.
PENTRU CĂ
o reacție de condensare între o grupare amino și o grupare carboxil
produce o amidă.
356 Aminoacizi
4. La un pH mai mare decât valoarea sa pl, un aminoacid va purta o sarcină

negativă.
PENTRU CĂ
în condiții adecvate de pH, un aminoacid poate accepta sau dona un
proton.
Există mai mulți compuși care reacționează cu aminoacizii pentru a da

produse colorate sau fluorescente și, prin urmare, pot fi utilizați în metode
calitative sau cantitative. Metodele fluorimetrice sunt din ce în ce mai
populare și oferă unele avantaje importante față de spectrofotometria de
absorbție pentru analiza aminoacizilor.
10.2.1 Ninhidrină
Ninhidrina (trichetohidrinden hidrat) reacționează cu un aminoacid atunci
când este încălzită în condiții acide (pH 3-4) pentru a produce amoniac, dioxid
de carbon și un complex albastru-violet. Această reacție stă la baza multor
metode utilizate pe scară largă (figura 10.11). Din fiecare mol de aminoacid se
eliberează un mol de dioxid de carbon, excepție făcând aminoacizii
dicarboxilici, care produc doi moli de dioxid de carbon, și aminoacizii a-
iminoacizi, prolina și hidroxiprolina, care nu produc dioxid de carbon. Deși
aceasta a stat la baza unei tehnici gazometrice, metodele colorimetrice sunt
acum cele mai frecvente.
Coeficientul de absorbție molară al produsului colorat poate fi utilizat
pentru cuantificarea aminoacizilor individuali, dar această valoare variază de
la un aminoacid la altul și trebuie determinată în condițiile de analiză. Cu
toate acestea, trebuie utilizată o valoare acceptată pentru cuantificarea
aminoacizilor totali dintr-un amestec, atunci când citirile absorbției se fac în
mod normal la 570 nm.
Aminele, altele decât a-aminoacizii, vor da, de asemenea, o reacție colorată
cu ninhidrina, dar fără a produce dioxid de carbon. Astfel, {3-, y-, o- și E
aminoacizii și peptidele reacționează mai lent decât a-aminoacizii, pentru a da
complexul albastru, în timp ce iminoacizii duc la formarea unui produs de
culoare galbenă care poate fi măsurat la 440 nm. Eliminarea unor substanțe
precum pro teina, amoniacul și ureea din probele biologice poate fi necesară
în cadrul lucrărilor de cuantificare, deoarece și acestea reacționează în mod
similar.
Reacția de colorare cu ninhidrină s-a dovedit foarte utilă în lucrările
calitative și este utilizată pe scară largă pentru vizualizarea benzilor de
aminoacizi după separarea elecroforetică sau cromatografică a amestecurilor.
Reactivul utilizat în astfel de circumstanțe se prepară de obicei în etanol și,
dacă se adaugă 2,4,6-collidină, variațiile de culoare produse de diferiți
aminoacizi vor ajuta la identificarea acestora (tabelul 10.6).
Reacții generale 357
Ninhidrină Ninhidrină redusă
IcI
2.
OC (
II
\:
0 0
II II
3. (JCct=N-c(c
(
II I
0 OH
Complex de culoare albastră
Figura JO. IReacția cu ninhidrină. Reacția generală a aminoacizilor cu ninhidrina

este:
1. decarboxilarea oxidativă a aminoacidului și producerea de ninhidrină redusă,
amoniac și dioxid de carbon;
2. ninhidrina redusă reacționează cu mai multă ninhidrină și cu amoniacul eliberat;
3. se formează un complex de culoare albastră.
Tabelul 10.6 Reactiv de ninhidrină modificat
AminoacidCuloarea produsă
Histidină Maro
Fenilalanină Maro/gri
Glicină Acid Albastru
glutamic Albastru
Lizină strălucitor
Tirozină Gri/albastru
Prolină Gri
Hidroxiprolină Portocaliu
Acid aspartic Portocaliu
Portocaliu
Portocaliu/galben
Compoziția
reactivului 2.5 g
Ninhidrină 73 ml
2,4,6-Colidină 1750 ml
Etanol 73 ml
Acid acetic glacial
358 Aminoacizi
10.2.2 o-ftalaldehidă
Aminoacizii primari vor reacționa cu o-ftalaldehida în prezența puternicului
reducător 2-mercaptoetanol (pH 9-11) pentru a obține un produs fluorescent
(maxim de emisie, 455 nm; maxim de excitație, 340 nm). Peptidele sunt mai
puțin reactive decât a-aminoacizii, iar aminele secundare nu reacționează
deloc. Prin urmare, prolina și hidroxiprolina trebuie tratate mai întâi cu un
agent de oxidare adecvat, cum ar fi cloramina T (N-cloro-p-toluen-
sulfonamida de sodiu) sau hipocloritul de sodiu, pentru a le transforma în
compuși care să reacționeze. În mod similar, cistina și cisteina trebuie, de
asemenea, să fie mai întâi oxidate în acid cisteic.
Reactivul apos este stabil la temperatura camerei, iar reacția se
desfășoară rapid, fără a necesita căldură. Metoda este de aproximativ zece ori
mai sensibilă decât metoda cu ninhidrină și este deosebit de utilă în cazul în
care cuantificarea multor aminoacizi se realizează cu ajutorul analizoarelor de
aminoacizi sau HPLC. Cu toate acestea, randamentul fluorescent al
aminoacizilor individuali variază, iar valorile fluorescenței trebuie să fie
determinate pentru munca cantitativă în același mod ca și valorile de culoare
pentru ninhidrină.
10.2.3 Fluorescamină
Toate aminele primare reacționează cu fluorescamina în condiții alcaline (pH
9-11) pentru a forma un produs fluorescent (figura 10.12) (maxim de
excitație, 390 nm; maxim de emisie, 475 nm). Fluorescența este instabilă în
soluție apoasă, iar reactivul trebuie preparat în acetonă. Aminele secundare,
prolina și hidroxiprolina, nu reacționează decât dacă sunt mai întâi
transformate în amine primare, ceea ce se poate face cu ajutorul N-
clorosuccinimidei. Deși reactivul prezintă interes datorită vitezei sale rapide
de reacție cu aminoacizii la temperatura camerei, acesta nu oferă o
sensibilitate mai mare decât reacția cu ninhidrină.
Amină Fluorescamină Produs fluorescent

primară (non-
fluorescentă)
Figura 10.12 Reacția fluorescaminei cu o grupare amino primară. Reacția unui

aminoacid care conține o grupare amino primară cu o soluție de fluorescamină în
acetonă la pH 9,0 duce la transformarea fluorescaminei nefluorescente într-un produs
fluorescent.
Analiza N-terminală 359
10.3.1 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzen
l-Fluoro-2,4-dinitrobenzenul (FDNB) reacționează în soluție alcalină (pH 9,5)
cu grupa amino liberă a unui aminoacid sau a unei peptide pentru a forma un
derivat dinitrofenil (DNP) galben (figura 10.13). Această reacție nu poate fi
utilizată pentru cuantificarea exactă a amestecurilor de aminoacizi, deoarece
coeficienții de absorbție molară ai derivaților DNP ai diferiților aminoacizi
variază, dar este foarte utilă în metodele calitative de analiză. Derivații galbeni
de DNP ai aminoacizilor liberi dintr-o probă pot fi văzuți clar după separarea
prin cromatografie pe hârtie sau în strat subțire și, în scopul identificării, se
compară valorile RF cu cele ale aminoacizilor cunoscuți tratați într-un man
ner identic. FDNB este o substanță periculoasă și ar trebui să fie utilizată
numai în circumstanțe excepționale și în condiții stricte de siguranță.
FDNB Derivat de culoare galbenă

Figura 10.13 Reacția FDNB cu compuși care conțin o grupare amino liberă.
Reacția la pH 9,5 între FDNB și aminoacizi sau peptide duce la formarea unor derivați
dinitrofenilici de culoare galbenă.
Grupa amino a reziduului de aminoacid N-terminal al unei peptide va

reacționa cu reactivul FDNB pentru a forma derivatul galben caracteristic
DNP, care poate fi eliberat din peptidă fie prin hidroliza acidă, fie prin
hidroliza enzimatică a legăturii peptidice și identificat ulterior. Acest lucru
prezintă un interes istoric, deoarece Dr. F. Sanger a folosit pentru prima dată
această reacție în activitatea sa de determinare a structurii primare a
hormonului polipeptidic insulină, iar reactivul este adesea denumit reactivul
lui Sanger.
10.3.2 Clorură de dansil

Clorura de dansil (clorura de dimetilarninonaftalină-5-sulfonil) va reacționa
cu grupările amino libere în soluție alcalină (pH 9,5-10,5) pentru a forma
derivați puternic fluorescenți (figura 10.14). Această metodă poate fi, de
asemenea, utilizată în combinație cu procedurile cromatografice pentru
identificarea aminoacizilor într-un mod similar cu reactivul FDNB, dar
prezintă o sensibilitate de aproximativ 100 de ori mai mare. Acest lucru o
face aplicabilă la mai puțin de 1 nmol de material și mai ușor de utilizat cu
cantități foarte mici de aminoacizi eliberați după hidroliza peptidelor.
Aminoacizii dansilici sunt, de asemenea, foarte rezistenți la hidroliză și pot fi
localizați cu ușurință după separarea cromatografică prin vizualizare sub o
lampă cu ultraviolete; a se vedea procedura 10.1.
360 Aminoacizi
S02
I
NH
I
H-c-R
I
/c'
o 0
H
Produs fluorescent
Figura 10.14 Reacția clorurii de dansil cu compușii care conțin o grupare amino
liberă. La un pH alcalin, reacția are ca rezultat formarea de derivați fluorescenți ai
aminoacizilor liberi și ai reziduului de aminoacid N-ternarinal al peptidelor.
10.3.3 Secvențierea peptidelor

Elucidarea secvenței de aminoacizi dintr-un lanț polipeptidic este un proces
complex, dar a fost simplificat considerabil odată cu introducerea unor
instrumente complet automatizate. În mod normal, acestea sunt capabile să
secvențieze cu certitudine peptide care conțin până la aproximativ 20 de
reziduuri de aminoacizi. Moleculele mai mari trebuie mai întâi să fie divizate
în fragmente ușor de gestionat prin digestie chimică sau enzimatică, urmată
de o nouă scindare în diferite poziții cu ajutorul unor enzime specifice
reziduurilor, pentru a produce fragmentele suprapuse necesare pentru analiza
completă a unei proteine sau a unei polipeptide lungi.
Analiza N-terminală 361
Secvențiatoarele de peptide efectuează automat toate reacțiile

procedurii de degradare Edman în condiții controlate, iar o schemă tipică este
descrisă mai jos. Derivații N-terminali eliberați sunt apoi analizați prin
HPLC în fază inversă.
Proba care urmează să fie secvențiată este mai întâi aplicată pe un
suport solid într-o cameră închisă. Sunt disponibile o varietate de suporturi,
dar discurile din fibră de sticlă oferă avantajul unei eficiențe de reacție
ridicate datorită suprafeței lor mari. Pretratarea prealabilă a discului cu
polibren conferă o ușoară încărcătură suprafeței, care atrage proteinele, dar
nu produce problemele care au apărut atunci când peptidele erau legate
covalent de un suport de sticlă.
Ciclul programat (figura 10.15) începe cu eliminarea oxigenului din
cameră prin purjare cu argon. Se adaugă trimetilamină pentru a obține
condițiile alcaline necesare pentru cuplarea fenilizotiocianatului cu N-
terminal al peptidei. Se utilizează apoi acid trifluoroacetic (100%) pentru a
scinda derivatul N-terminal, lăsând N-terminalul N-terminal al peptidului.
Peptidă Peptidă
NH NH
I I
N + C=O C=O
Trimetilamină
II I (CH3)JN I
C R-CH R-CH
II I I
s NH2 NH
Fenilizotiocianat
I
C=S
I
©
NH
Feniltiocarbamil
peptidă
r ,I 1-g; ::; :.
SH H
II I I
©-<:=r-R II
0 H
I
Trifluoroacetic
acid (25%)
@-
NH-C
"
I
N-C-R
-s-C=O
Derivat de anilinotiazolozonă
Derivat de
Figura 10.15 feniltiohidantoină +
HzN-
Procedura de Peptidă
secvențiere a peptidelor Peptidul scurtat se întoarce la
în fază solidă bazată pe începutul ciclului următor
tehnica de degradare
Edman.
362 Aminoacizi
peptida rămasă este pregătită pentru următorul ciclu. Derivatul de

anilinotiazolozonă (ATZ) eliberat este eluat de pe disc cu clorură de butil într-
o cameră separată unde este convertit în derivatul mai stabil feniltiohidantoină
(PTH) prin adăugarea de acid trifluoroacetic (25%). După uscarea cu argon și
reconstituirea în aproximativ 100 µl de solvent, proba este gata pentru analiza
prin HPLC în fază inversă.
Este adesea dificil să se cuantifice un anumit aminoacid în prezența altora din

cauza similitudinilor chimice. Interferența din partea altor substanțe decât
aminoacizii reprezintă, de asemenea, o problemă în multe metode considerate
specifice. Spectroscopia ultravioletă are o valoare redusă în detectarea
aminoacizilor aromatici, deoarece aceștia au maxime de absorbție similare și
diferă considerabil în ceea ce privește coeficienții de absorbție molară.
10.4.1 Metode colorimetrice

Există mai mulți reactivi coloranți care au o valoare cantitativă redusă fără
eliminarea prealabilă a substanțelor care interferează, deși în unele cazuri
poate fi posibilă creșterea specificității reactivului pentru determinarea unui
anumit aminoacid prin modificarea compoziției sale sau a condițiilor de
reacție. Reactivul Pauly (reactiv de acid sulfanilic diazotizat), de exemplu,
reacționează cu histidina și tirozina pentru a da un produs de culoare roșie, dar
și alți compuși fe nolici dau această reacție. Reactivul lui Erhlich (p-
aminobenzalde hyde în HCl) dă un produs roșu-violet cu triptofanul și alți
indoli și un produs de culoare galbenă cu aminele aromatice și ureidele, dintre
care ureea este cea mai răspândită în fluidele biologice. Cu toate acestea, ele
sunt utile din punct de vedere calitativ, în special ca reactivi de localizare
după separarea aminoacizilor prin electroforeză sau cromatografie, iar
utilizarea lor în secvențe de dip-uri multiple ajută la identificare.

Metodele fluorimetrice oferă adesea o specificitate și o sensibilitate
îmbunătățite față de procedurile colorimetrice, iar testele cantitative pentru
aminoacizii aromatici tirozină și fenilalanină ilustrează acest aspect.
Tirozină
l-Nitroso-2-naftolul reacționează cu tirozina în prezența nitritului de sodiu
pentru a forma un compus roșu instabil care se transformă, prin încălzire cu
acid azotic, într-un produs galben fluorescent stabil. După îndepărtarea
excesului de nitroso-naftol acționat cu ume, fluorescența se măsoară la 570
nm cu excitație la 460 nm. Acest reactiv este foarte periculos și trebuie tratat
în consecință.
Fenilalanină
Fenilalanina reacționează cu ninhidrina în prezența unei dipeptide (de obicei
glicil-L-leucină sau L-leucil-L-alanină) pentru a forma un produs fluorescent.
Fluorescența este intensificată și stabilizată prin adăugarea unui reactiv
alcalin de cupru pentru a ajusta pH-ul la 5,8, iar fluorescența rezultată se
măsoară la 515 nm după excitare la 365 nm; a se vedea procedura 10.2.
10.4.3 Metode microbiologice

Testele microbiologice au fost utilizate pe scară largă pentru cuantificarea
aminoacizilor deoarece, până de curând, acestea au fost cele mai fiabile,
sensibile și specifice teste disponibile. Acestea sunt aplicabile oricărui tip de
material biologic, deși prezența activatorilor sau inhibitorilor cauzează uneori
probleme. Aceste metode se pretează la analiza unor loturi mari de probe și
sunt ieftine, dar necesită mult timp și nu sunt adecvate pentru toți
aminoacizii. În prezent, ele au fost înlocuite în mare măsură de cromatografia
cu schimb de ioni pentru cuantificarea aminoacizilor specifici și vor fi
discutate doar pe scurt.
Anumite microorganisme au nevoie de aminoacizi pentru creștere și fără
364 Aminoacizi
ei nu se pot reproduce. Au fost produse multe tulpini de astfel de

microorganisme care prezintă dependență față de un anumit aminoacid. Prin
urmare, încercările de a cultiva un astfel de microorganism în prezența unei
cantități mici de aminoacid respectiv vor avea ca rezultat un grad limitat de
creștere. Acest lucru poate fi evaluat prin turbidimetrie sau prin măsurarea
creșterii producției de acid lactic fie prin microtitrare, fie prin modificarea pH-
ului.
O modificare a testului microbiologic care utilizează difuzia în geluri a
fost introdusă cu succes în laboratoarele de biochimie clinică pentru
depistarea în masă a probelor de sânge pentru nivelurile ridicate de
fenilalanină găsite în fenilcetonurie (PKU), care este o tulburare ereditară a
metabolismului aminoacizilor. Acesta este adesea numit "testul Guthrie",
după numele inițiatorilor săi, Guthrie și Susi, și este cel mai utilizat test
microbiologic pentru măsurarea unui aminoacid. Este un test de inhibiție
bacteriană și se bazează pe capacitatea fenilalaninei de a contracara efectele
unui antagonist metabolic competitiv ,B-2-tenilalanină (figura 10.16) asupra
creșterii unei tulpini speciale de Bacillus subtilis care necesită fenilalanină ca
factor de creștere.
HC-CH
HC
II C-CH2-
II CH-COOH
\/ I
S NH2
2-Thienilalanină Fenilalanină
Figura 10.16 Testul Guthrie. Similitudinea de structură dintre fenilalanină și

antagonistul său metabolic, /3-2-thienilalanina, oferă baza pentru un test microbiologic
pentru fenilalanină.
Testul se efectuează pe un strat de agar în care se încorporează un

amestec de suspensie de spori de Bacillus subtilis, cantitatea minimă de
nutrienți de creștere și o cantitate fixă de antagonist metabolic, B-2-
thienilalanină. Pe suprafața agarului se așează discuri de hârtie de filtru
îmbibate cu sânge, cu un diametru identic (aproximativ 4 mm), împreună cu o
serie de standarde de fenilalanină, de asemenea sub formă de discuri de sânge,
iar plăcile de agar sunt incubate peste noapte la 37 °C. Creșterea bacteriană
are loc numai atunci când concentrația de fenilalanină din discurile de sânge
este suficientă pentru a depăși efectele antagonistului metabolic, rezultând
zone de creștere în jurul fiecărui disc. A doua zi, se măsoară diametrul de
creștere bacteriană în jurul fiecărui disc și se raportează la concentrația de
fenilalanină.
10.4.4 Metode enzimatice

Există mai multe enzime care, în teorie, pot fi utilizate pentru cuantificare, dar
care, deoarece reacționează cu mai mulți aminoacizi, nu pot fi utilizate pentru
a măsura un aminoacid individual într-un amestec.
Specificitatea unei enzime pentru un anumit izomer poate fi utilizată
pentru măsurarea aminoacizilor D în prezența izomerilor L sau invers,
iar aminoacizii oxidați sunt utili în acest sens. Acestea catalizează deaminarea
oxidativă a aminoacizilor:
aminoacid oxidază
aminoacid+02 ------ acid oxo H+2 O2 + NH3
D-aminoacidul oxidază (EC 1.4.3.3.3) extras din rinichi de oaie prezintă

o selectivitate scăzută și la pH 8-9 va oxida mulți aminoacizi D, în timp ce L-
aminoacidul oxidază (EC 1.4.3.2) din veninul de șarpe (Crotalus adaman
teus) la pH 8-9 catalizează oxidarea multor aminoacizi L. Cu toate acestea,
deoarece aceste enzime prezintă o reactivitate diferită față de diferiți
aminoacizi, rezultatele pentru un eșantion care conține mai mulți aminoacizi
D și L pot fi dificil de interpretat. Prin urmare, utilizarea acestor enzime este
recomandată numai pentru măsurarea unui singur izomer al unui aminoacid
izolat. Ele pot fi, de asemenea, utilizate pentru a elimina un izomer nedorit
dintr-un eșantion care conține ambii izomeri pentru a permite măsurarea
ulterioară a celuilalt izomer.
O abordare pentru măsurarea aminoacizilor cu ajutorul unei aminoacizi
oxidaze este măsurarea cantității de amoniac format în timpul reacției, fie
folosind un electrod selectiv de ioni, fie prin legarea acestuia la oxidarea
NADH de către enzima glutamat dehidrogenază (EC l.4.1.3). Această reacție
este descrisă în procedura 8.8. Într-o metodă alternativă, cantitatea de peroxid
de hidrogen formată se măsoară fie cu ajutorul unui electrod selectiv de ioni,
fie prin oxidarea unui cromogen adecvat cu ajutorul unei peroxidaze. Aceste
proceduri sunt comune altor teste care utilizează oxidaze (de exemplu,
glucoxidază).
L-aminoacidul oxidază a fost utilizat pentru a măsura L-fenilalanina și
implică adăugarea unui tampon de arsenat-borat de sodiu, care favorizează
conversia produsului de oxidare, acidul fenilpiruvic, în forma sa enol, care
apoi formează un complex de borat cu un maxim de absorbție la 308 nm.
Tirozina și triptofanul reacționează în mod similar, dar complexele lor enol-
borat au maxime de absorbție diferite la 330 și, respectiv, 350 nm. Astfel, prin
citirea absorbției la aceste lungimi de undă, se îmbunătățește specificitatea
testului. Analiza L-alaninei poate fi, de asemenea, aproape complet specifică
prin transformarea L-piruvatului format în reacția de oxidare în L-lactat prin
adăugarea de lactat dehidrogenază (EC 1.1.1.1.27) și monitorizarea oxidării
NADH la 340 nm.
Un grup de enzime care pot fi utilizate pentru măsurarea L-
aminoacizilor sunt L-aminoacizii decarboxilazați (EC 4.1.1) de origine
bacteriană, dintre care mulți sunt specifici pentru substrat. Acestea catalizează
reacții de tipul:
Unele enzime cu specificitate îmbunătățită a unui singur aminoacid sunt

disponibile pe piață. Un exemplu este fenilalanina dehidrogenaza (EC
1.4.1.1.1), derivată din surse bacteriene, care acționează asupra fenilalaninei
cu transformarea simultană a NAD în NADH. Cuantificarea fenilalaninei se
bazează pe determinarea cantității de NADH produsă, folosind procedee
standard. În metodele directe, se măsoară absorbanța la 340 nm, în timp ce în
metodele colorimetrice, reacția este cuplată la un acceptor de electroni.
366 Aminoacizi
cum ar fi metilsulfatul de l-metoxi-5-metil-fenaziu (1-MPMS) sau se

transformă nativ într-o sare de tetrazoliu.
Există variații în ceea ce privește specificitatea substratului enzimelor
provenite din diferite surse și reactivitatea încrucișată trebuie verificată
întotdeauna atunci când se elaborează un test enzimatic. Acest lucru include o
investigație a interferențelor cauzate de o varietate de substanțe care pot fi
prezente în probă, în plus față de studiile privind specificitatea aminoacizilor.
Secțiunile 10.2/3/4
1. Reacția la ninhidrină:
(a) este specific pentru a-aminoacizi;
(b) produce peroxid de hidrogen cu aminoacizi;
(c) produce produse de culoare galbenă cu iminoacizi;
(d) poate fi monitorizat la 570 nm?
2. Care dintre următorii reactivi (atunci când sunt utilizați în
condiții adecvate) reacționează cu un rest de aminoacid N-
terminal?
(a) Ninhidrină.
(b) Clorură de dansil.
(c) l-Fluoro-2,4-dinitrobenzen.
(d) Fenilizotiocinat.
3. Clorura de dansil reacționează cu gruparea carboxil a unui
aminoacid PENTRU CĂ
derivații dansilici ai aminoacizilor sunt fluorescenți.
4. Spectroscopia ultravioletă poate fi utilizată pentru a identifica
aminoacizii individuali.
PENTRU CĂ
aminoacizii aromatici prezintă maxime de absorbție semnificativ
diferite unul de celălalt.
Identificarea și cuantificarea aminoacizilor individuali dintr-un amestec este

adesea necesară în studiile metabolice și în investigațiile privind structura
proteinelor. Utilizarea cromatografiei în strat subțire sau a electroforezei
poate fi adecvată pentru a indica cantitățile relative și numărul de aminoacizi
diferiți dintr-un eșantion, dar utilizarea cromatografiei gaz-lichid sau a unui
analizor de aminoacizi este esențială pentru analiza cantitativă.
10.5.1 Cromatografie pe hârtie și în strat subțire

Cromatografia pe hârtie a fost utilizată cu succes timp de mulți ani și este în
continuare un instrument util, în ciuda faptului că tehnicile în strat subțire, în
special cu plăci din plastic sau cu suport de folie, pregătite în comerț și
disponibile imediat, oferă avantaje în ceea ce privește viteza, rezoluția și o
manipulare mai ușoară. Se pot aplica volume mai mari de probă pe hârtie,
permițând eluția ulterioară a unui anumit amino
Separarea amestecurilor de 367
aminoacizi
pentru purificare și analiză ulterioară, iar acest lucru poate fi deosebit de
important pentru identificarea unui constituent necunoscut al probei.
Înainte de cromatografie, poate fi necesar să se elimine substanțele care
interferează, cum ar fi proteinele, carbohidrații și sărurile, iar acest lucru se
poate face cu ajutorul unei rășini schimbătoare de ioni. O coloană mică care
conține o rășină schimbătoare de cationi, de exemplu Zeo-Karb 225, se
prepară sub formă acidă prin tratarea acesteia cu acid clorhidric (2 mol 1-1 ).
După ce coloana de rășină a fost spălată cu apă, se aplică proba acidificată, iar
substanțele care interferează se spală cu apă și se aruncă. Aminoacizii sunt
reținuți pe rășină și pot fi ulterior eluți prin adăugarea unui volum mic de
soluție de amoniac.
(2 mol-l I) în coloană și se spală cu apă distilată. Alka
se colectează și se reduce volumul eluentului de linie cu ajutorul unui
evaporator rotativ. Alte tehnici, cum ar fi extracția cu solvent, dializa sau
precipitarea proteinelor, pot fi, de asemenea, utilizate pentru a separa
aminoacizii de celelalte componente ale probei.
Tabelul 10.7. Solvenți pentru cromatografia pe hârtie și în strat subțire
Solvent Proporții Comentarii
n-Butanol
Acid acetic glacial
Apă
12
3
5
} Utilizat pe scară foarte largă pentru curse
unidirecționale sau ca prim solvent în
cromatografia bidirecțională
n-Butanol 7
Acetonă
Acid acetic glacial
Apă
7
2
4
} Utilizat pe scară foarte largă pentru curse
unidirecționale sau ca prim solvent în
cromatografia bidirecțională
Fenol 160 g }
Apă 40 ml
Oferă o gamă largă de valori RF pentru o serie de
aminoacizi. Trebuie să fie întotdeauna utilizat al
doilea în orice rulări cu două căi. Îndepărtarea
fenolului necesită mult timp. Trebuie să se ia
măsuri de precauție în utilizarea sa din cauza
naturii toxice și corozive a fenolului.
Fenol 160g } Utile pentru separarea aminoacizilor bazici și

Apă 40ml trebuie utilizate întotdeauna în al doilea rând în
Amoniac I ml orice operație cu două căi.
rulează. Adăugarea de amoniac provoacă
decolorarea solventului și, prin urmare, trebuie
pregătit frecvent. Alte observații ca cele de mai sus
n-Butanol pentru fenol
Acetonă JOO}
Dietilamină 2 Acesta poate înlocui adesea fenolul ca solvent în
Apă 5 unele rulări cu două sensuri pe hârtie. În cazul
lucrărilor în strat subțire, ar trebui să fie utilizat
ca prim solvent. Dietilamina trebuie îndepărtată
Jsopropanol de pe hârtie înainte de a se folosi agenți de
Acid formic localizare.
Apă
Aceasta oferă o separare foarte bună dacă este
368 Aminoacizi
ut a ilea rând pentru cromatografia în strat subțire.
ili l
za
tă d
în o
aminoacizi
Identificarea unui aminoacid se realizează prin compararea valorilor Rp
cu cele ale soluțiilor de referință și se recomandă utilizarea a cel puțin trei
sisteme de soluții diferite înainte de a se stabili identitatea acestuia cu un
anumit grad de certitudine.
Natura aminoacizilor este un factor important în alegerea unui solvent și
diferiți solvenți vor permite o mai bună rezoluție a componentelor acide,
bazice sau neutre (tabelul 10.7). În general, creșterea proporției de apă în
solvent va crește toate valorile Rp, iar introducerea unor cantități mici de
amoniac va crește Rp-ul aminoacizilor bazici. Unii solvenți conțin substanțe
chimice nocive, de exemplu fenol, iar acest lucru poate restricționa utilizarea
lor rutieră. Compoziția chimică poate limita, de asemenea, gama de reactivi de
localizare care pot fi aplicați în mod satisfăcător. De exemplu, reactivul acid
sulfanilic nu poate fi utilizat cu solvenți fenolici.
Puterea de rezolvare a cromatografiei pe hârtie sau în strat subțire poate
fi sporită prin utilizarea tehnicilor bidimensionale, care implică utilizarea a
două sisteme de solvenți diferiți. Un volum mai mare (X3) de probă decât cel
utilizat în mod normal pentru separarea cromatografică unidimensională se
aplică pe un colț al mediului suport și se realizează separarea în prima
dimensiune. Apoi, cromatograma se usucă bine la aer, se rotește cu un unghi
de 90° și se analizează în cel de-al doilea solvent. După o nouă uscare, se
scufundă în reactivul de localizare cho sen. În cromatografia bidimensională,
compoziția celor doi solvenți va determina ordinea în care aceștia sunt utilizați
(tabelul 10.7).
Separările bidimensionale permit rezoluția unui număr mare de
aminoacizi prezenți într-o probă, iar cei care au o mobilitate similară într-o
dimensiune vor fi, de obicei, separați unul de celălalt în cea de-a doua
dimensiune. Acest lucru este deosebit de util pentru detectarea componentelor
care sunt prezente doar în concentrații mici și care ar putea fi ascunse într-o
dimensiune de alți aminoacizi care sunt prezenți în concentrații mai mari.
Localizarea reactivilor
Reactivii utilizați pentru vizualizarea aminoacizilor pe cromatograma uscată
pot fi aplicați fie prin pulverizare, fie prin imersie. Cei utilizați în mod
obișnuit produc benzi intens colorate cu aproximativ 20 nmol din fiecare
aminoacid pentru cromatografia pe hârtie și 5 nmol pentru separările în strat
subțire, deși pot fi detectate cantități er mici.
Ninhidrina este cel mai frecvent utilizat reactiv. În cazul în care
compoziția este mod
ificată din 2,0 g1-1 în acetonă prin adăugarea de acid acetic și 2,4,6-colidină,
culorile produse variază în funcție de diferiți aminoacizi, ceea ce ajută foarte mult
la interpretare și identificare (tabelul 10.6). Toți a-aminoacizii a vor reacționa la
rece în câteva ore, iar dacă se aplică căldură timp de 10 min la aproximativ 100
°C, toți compușii care conțin o grupare amino primară sau secundară atașată la un
atom de carbon alifatic vor reacționa cu formarea de diverse culori. Astfel, dacă
un compus produce o culoare la încălzire, dar nu și la rece, este aproape sigur că
nu este un a-aminoacid. Culorile de ninhidrină se estompează lent, în special în
prezența unor vapori de acid puternic, dar sunt mai stabile dacă cromatograma
este păstrată la întuneric, la 4 °C. Păstrarea petelor se poate realiza și prin tratarea
cu o soluție de sare de cupru sau de nichel, dar culorile se schimbă în roz intens.
Alternativ, se poate încorpora acetat de cadmiu (1,0 g 1-1 ) în reactivul de
ninhidrină.
370Tabelul
Aminoacizi
10.8 Reactivi pentru detectarea colorimetrică a aminoacizilor
Denumir Compoziție și Aminoacizi Culoare Comentarii

e condiții de reacție* detectată** produsă
comună
---
lsatină2,0 g 1-1 în acetonă. Se încălzește la Pro Albastru Nespecifică, în principal pentru prolină,
I05°C timp de 2-3 min. închis dar reacționează la anumiți aminoacizi
Hyp cu conținut de sulf și la unii acizi
Albastru/ver aromatici. A se utiliza mai întâi în
de procedurile de imersie multiplă.
AspLight
albastru
GluLight
maro
Ala Gri/albastru
Phe Albastru
Tyr Albastru/gri
/3-AlaAlbastru deschis
GlnLight
roșu
Ehrlich p-Dimetilaminobenzaldehidă (100 g 1-1 ) în Trp Roz/roșu Reacționează unele indoli, amine
con. HCI. Se amestecă l volum cu 4 volume Citrulină Galben aromatice și ureide. Se utilizează
de acetonă. Nu este nevoie de căldură. după ninhidrină în secvențe de
Reacționează în 20 minute imersie multiplă.
Pauly Acid sulfanilic (9 g 1-1 ) în con. HCI. Se Lui Roșu Reacționează unii imidazoli și compuși
amestecă I v o l u m cu l O volume de apăi; I Tyr Portocaliu fenolici și sărurile de amoniu. Culori
volum de nitrit de sodiu (50 g 1-1) și I volum deschis variază - roșu, maro, galben. Se utilizează
de carbonat de sodiu (100 g 1-1). după ninhidrină, izatină sau Ehrlich în
secvențe de imersie multiple.
Diacetil 10 g 1-1 a-naftol în 80 g 1-1 NaOH plus un Arg Guanidine mono- și di-substituite,
volum egal de diacetil (1 ml la litru de apă). Violet/roș de exemplu, creatina, creatinina,
Se amestecă înainte de utilizare. Se încălzește u reacționează de asemenea
la 100 °C timp de
2-3 min
prusside următo nțe: hidroxid de sodiu, nitroprusiat de sodiu,
Cianură I 00 g 1-1 din
nitro arele ferricianură de potasiu. Se amestecă I volum din
fiecare din
substa fiecare soluție cu 3 volume de apă și se lasă să stea în
repaus ționează. Culorile se estompează
Cys Cistină Homocys Purpuriu U
timp de în aproximativ 30 de minute.
Homocistină Purpuriu n
cu 30 de
Purpuriu i
minute
Purpuriu i
înainte
de Purpuriu
utilizare. a
Nu este m
nevoie i
de n
căldură o
a
c
i
z
i
c
u
c
o
n
ț
i
n
u
t
d
e
s
u
l
f
r
e
a
c
372 Aminoacizi
* Detaliile oferite sunt pentru locația cromatografică sau electroforetică și se vor dilua pentru utilizarea cu probe lichide.
** Aminoacizii detectați în mod obișnuit sunt evidențiați cu caractere aldine.
370 Aminoacizi
Au fost descriși și alți reactivi care sunt mai specifici pentru anumiți
aminoacizi (tabelul 10.8), iar utilizarea lor ajută în mod semnificativ la
procesul de identificare. Diferiți reactivi de localizare pot fi aplicați fie pe
cromatograme separate, fie ca parte a unei secvențe de mai multe picturi, când
trebuie utilizați în ordinea recomandată pentru a preveni interferența unui
reactiv cu altul. Mulți reactivi sunt periculoși și trebuie manipulați în
conformitate cu procedurile de siguranță aprobate.
Formarea DNP sau a derivaților de dansil aminoacizi urmată de
cromatografie sau electroforeză este o tehnică utilă în anumite circumstanțe.
Pregătirea derivaților de DNP poate fi indicată atunci când eșantionul de
analizat conține o varietate de alte substanțe, a căror eliminare ar fi
complicată, ceea ce ar putea duce la erori analitice considerabile. Cu toate
acestea, formarea și extracția derivaților necesită mult timp și poate introduce
ea însăși inexactități în analiză și ar trebui să fie utilizată numai atunci când
oferă un avantaj față de separarea aminoacizilor netratați.
Utilizarea derivaților dansilici nu este recomandată pentru analiza de
rutină a aminoacizilor liberi, dar este foarte potrivită pentru identificarea unui
aminoacid necunoscut care a fost extras selectiv din proba originală și care
este prezent în cantități mici. Ambele tipuri de derivați pot fi separate cu
ușurință prin cromatografie sau electrofiză și nu este nevoie de niciun reactiv
de localizare, deoarece derivații DNP sunt de culoare galbenă, iar derivații
dansilici sunt fluorescenți.
Faptul că diferiți aminoacizi au sarcini nete diferite la un anumit pH permite
separarea amestecurilor prin electroforeză de joasă sau înaltă tensiune.
Mediile de suport cel mai frecvent utilizate sunt hârtia sau straturile subțiri
(celuloză sau silicagel), iar pentru vizualizarea petelor se pot folosi reactivii
de localizare deja descriși pentru cromatografie. Separările la tensiuni înalte
pot fi realizate mai rapid decât la tensiuni joase, iar unul dintre principalele
avantaje ale primei variante este că sărurile și alte substanțe care pot fi
prezente în probă afectează mai puțin calitatea electroforetogramei. Acest
lucru permite separarea aminoacizilor în extracte relativ brute și în fluide
netratate, în timp ce, înainte de electroforeza de joasă tensiune, este necesar
să se elimine substanțele care interferează, cum ar fi proteinele, carbohidrații
și sărurile, folosind aceleași metode ca și cele descrise pentru cromatografie.
Cu toate că separările electroforetice pot fi realizate folosind tampoane
pe o gamă largă de valori de pH, în practică valorile pH-ului alese sunt fie pH
2,0, fie pH 5,3. La pH 2,0, toți aminoacizii poartă o sarcină pozitivă, iar
aminoacizii bazici, care au cea mai mare sarcină pozitivă, vor migra cel mai
mult spre catod, în timp ce la pH 5,3 migrarea se va produce spre ambii
electrozi, în funcție de sarcina purtată. Separările la pH 5,3 sunt deosebit de
utile pentru a determina natura acidă sau bazică a unui aminoacid sau a unei
dipeptide necunoscute. O tehnică bidimensională care implică o separare
inițială prin electroforeză de înaltă tensiune la pH 2,0 urmată de
cromatografie este un mijloc util de separare a aminoacizilor similari și a
peptidelor scurte și nu necesită desalinizare.
ing sau purificarea excesivă a probei (figura 10.17).
aminoacizi
OHlS
Electroforeză pH2.0
OGLY
OALA
OVAL QlLE
-osER LEU
QTHR
GLNO O0QPRO OPHE
0CYS2
QHYP
Butanol-acid acetic-apă (12:3:5)
Figura 10.17 Electroforeza și cromatografia bidimensională de înaltă tensiune a

aminoacizilor. Electroforeză pe hârtie la înaltă tensiune (4000 V) într-un tampon acid
acetic-acid formic la pH 2,0 în prima dimensiune, urmată de cromatografie descendentă
în a doua dimensiune într-un solvent n-butanol-acid acetic-apă (12 : 3 : 5). Petele au
fost vizualizate cu un reactiv de ninhidrină și colidină.
10.5.3 Cromatografie în fază gazoasă

Sunt necesari derivați ai aminoacizilor (tabelul 9.10) deoarece aminoacizii nu
sunt ei înșiși suficient de volatili pentru cromatografia gaz-lichid și pot apărea
dificultăți în alegerea și metoda de derivatizare. În trecut, nicio coloană nu era
în mod normal capabilă să rezolve derivații unui grup atât de divers de
compuși, dar introducerea coloanelor capilare de silice topită a dus la o
rezoluție considerabil îmbunătățită.
Avantajul derivaților de trimetilsililil (TMS) constă în simplitatea
procedurii de derivatizare, care se realizează prin adăugarea de N,0-
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamidă (BSTFA) în acetonitril și încălzirea timp de
aproximativ 2 ore la 150 °C în condiții de anhidritate într-un tub sigilat. Cu
toate acestea, pot apărea probleme datorate formării de derivați multipli ai
fiecărui aminoacid. O altă tehnică implică formarea de esteri de n-butil ai
aminoacizilor și trimetilsililarea ulterioară a acestora printr-o procedură
similară. Apoi, esterii butilici se formează prin încălzirea aminoacizilor timp
de 15 minute în n-butanol și HCl, iar aceștia sunt apoi transformați în derivați
de esteri N-TMS-n-butilici. Se utilizează în mod obișnuit esteri alchilici de N-
acetil aminoacizi. Acetilarea esterilor butilici, metilici sau propilici ai
aminoacizilor,
372 Aminoacizi
Tabelul 10.9 Derivați ai aminoacizilor adecvați pentru cromatografia gaz-lichid
Derivat Formula
R
I
N -TMS -TMS ester TMS - NH - C- COOTMS
I
H
N -TMS - ester n-butil TMS-NH-C-COOC H

i
I 49
R
I
CF -CO-NH-C-C-COOC H
TFA - ester n-butilic
3 I 49
H
R
I
-
1
HFB - ester n- C3 H7 - CO - NH - COOC3H7
propilic
H
pentru a da derivați trifluorocetinici (TFA) sau heptafluorobutirilici (HFB) pot fi

performați prin reacția acestora cu anhidride TFA sau HFB în diclorură de
metilen la 150 °C timp de 5 minute. Cu acești derivați se pot utiliza detectoare cu
captare de electroni, care oferă o sensibilitate mai mare decât detectoarele cu
ionizare de flacără.
Până la introducerea coloanelor capilare, nu a fost posibilă separarea
tuturor aminoacizilor din proteine pe o singură coloană. Alegerea fazei staționare
va depinde de tipurile de derivați care au fost preparați și, în unele situații, poate
fi totuși preferabilă utilizarea simultană a două coloane diferite.
O altă dificultate în separarea prin cromatografie în fază gazoasă a
aminoacizilor este alegerea detectorului și poate fi necesar să se împartă fluxul
de gaz și să se utilizeze doi detectori diferiți. Detectorul de ionizare cu flacără,
care este utilizat în mod obișnuit, este nespecific și va detecta orice
componente ale probei care nu sunt aminoacizi, cu excepția cazului în care s-a
efectuat o purificare înainte de derivare. În plus, răspunsul molar relativ al
detectorului de ionizare cu flacără variază pentru fiecare aminoacid, ceea ce
necesită producerea de curbe standard separate. Ca o con secvență, deși
cromatografia în fază gazoasă oferă avantaje teoretice, aplicarea sa practică
este rezervată în principal pentru circumstanțe speciale, când un detector de
azot poate fi util pentru a crește specificitatea.
10.5.4 Cromatografie lichidă de înaltă performanță

Utilizarea coloanelor în fază inversă cu derivatizarea aminoacizilor înainte de
coloană oferă o alternativă acceptabilă la instrumentele dedicate ale unui analizor
de aminoacizi sau la separarea prin HPLC urmată de derivatizarea după coloană.
Analizator de 373
aminoacizi
Se utilizează faze mobile tamponate, iar proporțiile de solvenți polari (de
exemplu, metanol, tetrahidrofuran) depind de tipul de derivat utilizat. Pentru
rezolvarea amestecurilor complexe este necesară o eluție în gradient, iar timpul de
analiză este mai mic de 1 oră. În funcție de natura derivaților de aminoacizi, se
folosesc detectoare ultraviolete, de fluorescență sau electrochimice.
Derivatizarea aminoacizilor primari cu o-ftalaldehidă (OPA) este
simplă, iar reproductibilitatea slabă datorată instabilității produsului de reacție
poate fi îmbunătățită prin automatizare și prin utilizarea unor tioli alternativi,
de exemplu, etanhiol în locul 2-mercaptoetanolului utilizat inițial. O metodă
fluorimetrică alternativă care utilizează 9-fluoroenilmetilcloroformatul de
fluor (FMOC-CL) necesită eliminarea excesului de reactiv nereacționat
înainte de cromato grafie pe coloană. Această procedură este mai dificil de
automatizat complet, iar rezultatele sunt mai puțin reproductibile. Cu toate
acestea, sensibilitatea este comparabilă cu cea a metodei OPA, cu o detecție la
un nivel scăzut de picomole sau femtomole, și are avantajul suplimentar că
pot fi determinați atât aminoacizii primari, cât și cei secundari.
Au fost utilizate, de asemenea, clorura de dansil (clorura de 5-
dimetilaminonaftilen-1-sulfonil) și clorura de dabsil (4-dimetil-
aminoazobenzen-4'-sulfonil). Sensibilitatea celei din urmă metode este slabă
și ambele au probleme de interferență cu excesul de reactivi.
Reacția cu fenilizotiocianat (PITC) în condiții alcaline produce produși
stabili de adaos de feniltiocarbamil (PTC) care pot fi detectați fie în ultraviolet
sub 250 nm, fie electrochimic. Cu toate acestea, această metodă implică o
procedură complexă de derivatizare și oferă o sensibilitate mai slabă decât
alternativele disponibile pentru aminoacizi individuali. Cu toate acestea, ea
este utilă în combinație cu analiza automată a peptidelor, atunci când reziduuri
individuale derivatizate pot fi scindate și analizate după conversia în condiții
acide în feniltiohidantoine.
10.5.5 Cromatografie cu schimb de ioni

Rășinile schimbătoare de ioni pot fi utilizate pentru a izola aminoacizii de alte
substanțe înainte de analiză, dar cromatografia schimbătoare de ioni este
utilizată și pentru a separa amestecuri de aminoacizi. Prin utilizarea unei rășini
schimbătoare de cationi și prin variația pH-ului tamponului de eluare, este
posibilă separarea unei game largi de aminoacizi. Analizatorul de aminoacizi,
care cuantifică, de asemenea, fiecare aminoacid, se bazează pe această
tehnică. Rășinile schimbătoare de anioni tind să fie utilizate doar în
circumstanțe speciale pentru separarea aminoacizilor puternic acizi.
Deși separarea cromatografică a aminoacizilor pe coloane de amidon a fost

introdusă în 1941, mai mult de 10 ani mai târziu, Spackman, Stein și Moore
au dezvoltat primul analizor de aminoacizi bazat pe separarea prin
cromatografie cu schimb de ioni și pe cuantificarea fiecărui component din
efluentul coloanei prin reacția cu ninhidrină. Instrumentele disponibile în
prezent se bazează pe proiectul lor original, permițând pomparea unor soluții
tampon cu pH sau forță ionică variabilă printr-o coloană de rășină controlată
termostatic.
374 Aminoacizi
(figura 10.18), deși sunt introduse în mod constant numeroase modificări care
duc la îmbunătățirea performanțelor. Cele mai semnificative modificări au
fost apariția rășinilor de înaltă calitate, automatizarea sofisticată și creșterea
sensibilității sistemelor de detecție. Acestea au contribuit la reducerea
timpului de analiză de la câteva zile la câteva ore și au extins intervalul
analitic până sub nivelul nanomolelor (10-9 mol).
Injectarea
probei
Presiune
gabarit Tampon 1 Tampon 2 Tampon 3
Pompă
Coloană de rășină
cu cămașă de apă
Reactiv de
ninhidrină
Figura 10.18 Diagrama Pomp

schematică a unui ă
analizor de aminoacizi Manome Baie de Flux prin intermediul Celule Imprimare
care utilizează reactivul tru încălzir de înregistrare
de ninhidrină pentru e 100°c (570 nm și 440 nm)
cuantificare.
10.6.1 Principii de separare

Separarea are loc într-o coloană de rășină de polistiren reticulat sulfonat, care
este un puternic schimbător de cationi. Matricea rășinii este de natură puternic
anionică (SO3 -) și, la pH-ul scăzut utilizat inițial, aminoacizii vor fi încărcați
pozitiv și vor fi atrași de grupările sulfonate încărcate negativ.
Pe măsură ce pH-ul tamponului care trece prin coloană este ridicat,
aminoacizii vor fi eluabili în mod diferențiat, deoarece sarcina lor pozitivă
netă scade și sunt mai puțin atrași de situsurile de sulfonat de pe matricea de
rășină. Aceștia vor ieși din coloană într-o secvență legată de valorile lor
individuale. La pH 3,25, pH-ul la care începe de obicei analiza, aminoacizii
cu o grupare acidă suplimentară în lanțul lor lateral vor avea o afinitate foarte
mică pentru rășină și vor fi primii care vor ieși din coloană, în timp ce, la
aceeași valoare a pH-ului, acei aminoacizi al căror lanț lateral conține o
grupare ionizabilă suplimentară capabilă să poarte o sarcină pozitivă, de
exemplu lizina și histidina, vor fi puternic fixați pe rășină și vor fi eluate din
coloană numai atunci când pH-ul este ridicat substanțial și sarcina lor pozitivă
netă este redusă.
Analizator de 375
aminoacizi
Cu toate acestea, nu numai pH-ul tamponului de eluție determină
poziția relativă de eluție a aminoacizilor, ci și concentrația de cationi din
tampon. Soluțiile tampon de citrat de sodiu sunt utilizate în mod obișnuit, iar
ionii de sodiu pozitivi concurează cu aminoacizii încărcați pozitiv pentru
situsurile de acid sulfonic de pe rășină:
rășină-SO3 - - -.- +AA + Na+ ,,,,. rășină-SO3 ... +Na + AA+
Deși aminoacizii au o afinitate considerabilă pentru rășină, ionii de
sodiu sunt prezenți în mod constant într-o concentrație mult mai mare și, ca
urmare, echilibrul ecuației de mai sus este deplasat spre dreapta, iar
aminoacizii sunt alungați din rășină. Astfel, molaritatea tamponului de eluție
influențează eluția și, atunci când concentrația ionică a tamponului este
crescută, aminoacizii sunt eluțiți mai rapid de pe coloană.
Interacțiunile non-ionice dintre aminoacizi și rășină influențează, de
asemenea, secvența de eluție, permițând ca aminoacizii cu valori identice ale
pl să fie eluate separat. Polaritatea aminoacidului este importantă în această
privință, iar cei cu o grupă R nepolară, hidrofobă, interacționează cu matricea
de rășină puternic hidrofobă. Gradul de reticulare afectează, de asemenea,
separarea, deoarece influențează "viteza de difuzie a speciilor încărcate către
situsurile de schimb". Astfel, o predicție precisă a poziției aminoacizilor pe o
cromatogramă este dificilă și poate varia considerabil față de cea determinată
în practică.
Rezolvarea cantitativă a amestecurilor de aminoacizi se realizează prin
variația compoziției tamponului care curge prin coloană, fie prin creșterea
pH-ului și menținerea unei molarități constante (concentrația de cationi), fie
prin menținerea constantă a pH-ului, dar cu variația molarității, fie prin
utilizarea unei combinații de ambele. Alți factori, cum ar fi temperatura
coloanei, debitul tamponului și tipul de cationi tampon, joacă un rol
important, dar mai puțin semnificativ, în calitatea separării.
10.6.2 Aspecte practice
Coloana
În cazul analizoarelor prototip, era adesea nevoie de două coloane pentru a
obține o separare completă a tuturor aminoacizilor. Se folosea o coloană de
50-100 cm pentru separarea aminoacizilor acizi și neutri și o coloană de 5-10
cm pentru aminoacizii bazici, fiecare cu un diametru de 1 sau 2 cm, dar
instrumentele de astăzi folosesc coloane unice cu diametre mai înguste.
Deoarece lățimea vârfului este proporțională cu rădăcina pătrată a lungimii
coloanei, aceste coloane din sticlă sau oțel inoxidabil oferă vârfuri înguste și o
mai bună separare a aminoacizilor strâns înrudiți.
Tampoane
Compoziția și pH-ul tamponului trebuie să fie precise cu o precizie de 0,001
mo11-1 și
0,01 unități de pH. Majoritatea metodelor se bazează pe aplicarea secvențială
a unei serii de soluții tampon cu pH și molaritate crescânde, cu pH-ul inițial în
jurul valorii de 3,2. Se folosesc soluții tampon de citrat de sodiu sau, de
preferință, de citrat de litiu, care conțin un detergent (BRIJ 35), un antioxidant
(tiodiglicol) și un conservant.
376 Aminoacizi
(acid caprilic) și poate fi utilizat pentru a realiza o eluție în trepte sau în

gradient. În cazul în care se efectuează o eluție în trepte, fiecare tampon este
pompat prin coloană pentru perioade de timp diferite, care sunt alese în funcție
de tipurile de aminoacizi care trebuie separați și de dimensiunile coloanei.
Tampoanele utilizate frecvent sunt pH 3,25, pH 4,25, pH 5,25 și pH 10,0 cu
molaritate constantă sau variabilă, dacă se dorește o separare a aminoacizilor
acizi, neutri și bazici. Cu toate acestea, în cazul în care se studiază grupuri de
aminoacizi cu caracteristici ionice similare, de exemplu cei cu o grupare R
acidă, este adesea necesar să se utilizeze doar unul sau doi dintre tampoane.
Atunci când se utilizează tehnica de eluție în gradient, tampoanele sunt
amestecate într-un mod prestabilit pentru a obține schimbări graduale ale pH-
ului și ale puterii ionice. În unele modele se utilizează un sistem de eluție în
gradient cu doi tampoane, în care un tampon acid, pH 2,2, și un tampon
alcalin, pH 11,5, sunt amestecate în proporții variabile pentru a obține valori
de pH din ce în ce mai mari. Eluția în gradient oferă o separare îmbunătățită
cu un timp de analiză redus și elimină fluctuațiile dramatice ale liniei de bază
datorate schimbărilor bruște ale tamponului. O practică mai puțin obișnuită
este utilizarea unui sistem "Iso-pH", care utilizează o eluție în trepte sau în
gradient, folosind tampoane cu o concentrație crescândă de cationi, care poate
fi cuprinsă între 0,2 și 1,6 moli 1-1 și o valoare aproape constantă a pH-ului
între 3,25 și 3,65.
Temperatura
Temperatura coloanei de rășină trebuie menținută cu atenție pentru a evita
modificări atât ale pH-ului tamponilor, cât și ale ionizării aminoacizilor. Deși
creșterea temperaturii determină de obicei o eluție mai rapidă, efectul poate fi
variabil pentru diferiți aminoacizi, iar pozițiile relative de eluție pot fi
modificate, ceea ce face dificilă interpretarea rezultatelor. Temperatura
frecvent aleasă este de 60°C, deși uneori sunt necesare temperaturi mai
scăzute pentru a rezolva doi aminoacizi similari. Programarea temperaturii,
care presupune o modificare a temperaturii într-un anumit moment al
procedurii de separare, este utilizată pe scară largă.
Debitul coloanei
Separările reușite și reproductibile necesită un debit tampon constant, iar acest
lucru se obține fie cu o pompă cu presiune constantă, fie cu o pompă cu debit
constant. Aceste pompe sunt concepute pentru a furniza un debit constant de
fluid indiferent de rezistența la curgere, iar evoluțiile recente în proiectarea
pompelor au permis producerea unui debit precis și fără impulsuri; acest lucru
a contribuit la creșterea preciziei și sensibilității analitice care pot fi obținute
în prezent cu analizoarele de aminoacizi. Alegerea debitului depinde de tipul
de rășină, de dimensiunile coloanei și de designul general al instrumentului,
iar acest lucru variază de la un model la altul.
Pregătirea probei
Volumul de probă care poate fi aplicat pe coloana de rășină variază în funcție
de diferitele instrumente disponibile în comerț. Odată cu perfecționarea
progresivă a instrumentelor, tendința a fost de a reduce volumul de probă la
50 µ1 sau mai puțin. Pregătirea corectă a probei este foarte importantă pentru
a obține rezultate reproductibile ș i pentru o funcționare fără probleme. Acest
lucru variază în funcție de natura probei și de constituenții acesteia, dar
Analizator de 377
lichidul aminoacizi
378 Aminoacizi
aplicată pe coloană trebuie să fie curată și lipsită de proteine și alte molecule

mari. Nerespectarea acestei cerințe va duce la o colmatare lentă a coloanei de
rășină și poate necesita îndepărtarea, curățarea și reambalarea rășinii sau
achiziționarea unei noi coloane. În general, probele lichide au nevoie doar de
filtrare sau centrifugare pentru a elimina artefactele, dar orice proteină
prezentă trebuie eliminată prin precipitare cu acid picric sau acid
salicilsulfonic sau prin dializă sau ultrafiltrare. Probele solide, cum ar fi
produsele alimentare și tisuele animale sau vegetale, pot necesita
omogenizare, extracție și deproteinizare. Orice peptide sau proteine care fac
obiectul unei investigații pentru determinarea compoziției lor în aminoacizi
trebuie mai întâi să fie hidrolizate pentru a elibera aminoacizii liberi.
Proba preparată poate fi aplicată în tamponul cu pH 2,2 direct pe partea
superioară a coloanei și se poate începe secvența de analiză, iar după eluția
tuturor aminoacizilor și regenerarea coloanei de rășină, se poate aplica
următoarea probă. Cu toate acestea, multe modele mai noi încorporează un
dispozitiv de încărcare automată care permite stocarea mai multor probe gata
de analiză, fie în cupe de probă, fie în mici serpentine de teflon. După
finalizarea unei analize, următoarea probă stocată este aplicată automat pe
rășină și ciclul de tamponare este repornit.
Detecție
Este necesară o a doua pompă pentru a furniza un debit constant de reactiv
pentru a satisface efluentul coloanei. După ce reacția a avut loc, fluxul este
monitorizat în permanență cu ajutorul unei celule de curgere, fie într-un
colorimetru, fie într-un fluorimetru. Reactivul de ninhidrină este cel mai
utilizat și, după ce soluția a trecut printr-o serpentină în baia de încălzire la
100°C, absorbția este monitorizată la 570 și 440 nm pentru a detecta
aminoacizii și, respectiv, iminoacizii. Reactivul de ninhidrină trebuie preparat
cu precizie, folosind substanțe chimice de înaltă calitate. Ninhidrina se
dizolvă în etilenglicol fără peroxid, eter monometilic (soluție de metilcel) și se
tamponează cu acetat la pH 5,5. În timpul preparării reactivului, gazul de azot
este barbotat pentru a exclude aerul și se adaugă o cantitate mică de agent
reducător, clorură staniu sau clorură titanică, pentru a asigura producerea unei
cantități limitate, dar precise de ninhidrină redusă. Unele analizoare introduc
argon sau azot în efluentul coloanei pentru a produce un flux de gaz
segmentat, iar în aceste instrumente se utilizează ca agent de reducere fie
cianură de sodiu, fie hidrazină. Reactivul preparat trebuie să aibă o culoare pai
palidă și trebuie depozitat într-o sticlă întunecată, sub presiune de azot,
deoarece este sensibil la lumină și la oxigen.
Reacția de ninhidrină necesită căldură și, prin urmare, fluxul de eluat
de coloană plus reactivul de ninhidrină trebuie să treacă printr-o spirală de
tuburi cu diametru îngust (diametru aproximativ I mm) ținută într-o baie de
încălzire la 100°C. Este important să se asigure că fluxul nu este restricționat,
deoarece încălzirea excesivă poate provoca precipitarea ninhidrinei în aceste
tuburi cu microtuburi, ceea ce duce la oprirea completă a analizorului.
Reacția cu o-ftalaldehidă se compară favorabil cu reacția cu ninhidrină
din mai multe puncte de vedere. Reactivul este stabil și se prezintă sub formă
apoasă, ceea ce elimină utilizarea de substanțe chimice potențial toxice și
depozitarea sub azot. Deoarece reacția se desfășoară rapid la temperatura
camerei, nu este nevoie de o baie de încălzire la 100°C, cu toate problemele
sale inerente, iar sensibilitatea crescută permite detectarea la nivel de
Analizator de 379
aminoacizi
picomole.
:. "' 10
-c+"t .:
-
-t+-i-
i..J ; -1 : ! I
--
-,-
,
-=-=r:-._
Et
4=,=f --..--
:i-=""'f ti
=
-1::::
II
■ uu
■ I=
- '™¥71-
-
. --1.
T--
Figura 10.19 Urma analizorului de aminoacizi. Separarea unui amestec standard fiziologic complex de aminoacizi în 3,5 ore, utilizând tampoane de
citrat de litiu și detecție cu ninhidrină: IO nmol din fiecare aminoacid, inclusiv standardul intern, nor-leucina, au fost aplicate pe coloană (0,3 X 35 cm)
într-un volum total de 50 ml.
(Fotografii prin amabilitatea lui Rank Hilger, Margate, Marea Britanie.)
Analizator de 379
aminoacizi
10.6.3 Quantltatlon
Culoarea sau fluorescența produsă per mol de aminoacid variază ușor pentru
diferiți aminoacizi și trebuie să fie determinată pentru fiecare dintre ei pentru
a fi cuantificată. Acest lucru se face prin încărcarea unui amestec de
aminoacizi care conține aceeași concentrație de fiecare aminoacid, inclusiv
standardul intern ales, și prin calcularea suprafețelor vârfurilor de pe urma
înregistratorului pentru fiecare factor de răspuns în mod obișnuit (figura
10.19). Aceste valori se notează și se utilizează în calculele ulterioare ale
concentrațiilor probelor.
Întotdeauna trebuie utilizat un standard intern pentru fiecare analiză
efectuată. Acesta este un aminoacid despre care se știe că este absent din
proba analizată. De exemplu, în analiza plasmei sanguine, se poate folosi
oricare dintre aminoacizii non-fiziologici, nor-leucina sau acidul a-amino-/3-
guanidinobutiric. Aceștia ar trebui adăugați într-o cantitate cunoscută la
eșantion înainte de orice pretratare a eșantionului (de exemplu, îndepărtarea
proteinelor).
În cazul în care se cunoaște cantitatea de standard intern care a fost
adăugată la probă, concentrația aminoacidului necunoscut poate fi
determinată folosind relația dintre suprafețele de vârf. Aceste calcule trebuie
să ia în considerare diferiți factori de răspuns.
În acest fel, se ține seama de pierderile datorate pregătirii probei,
precum și de variația intensității culorii sau a fluorescenței produse de diferite
preparate de reactiv și de modificările condițiilor de analiză.
Secțiunile 10.5/6
1. Formarea derivaților aminoacizilor este în mod normal necesară
înainte de separarea lor prin care dintre următoarele tehnici?
(a) HPLC în fază inversă.
(b) Cromatografie gaz-lichid.
(c) Electroforeza de înaltă tensiune.
(d) Cromatografie de schimb de ioni.
2. Eluția de pe coloana schimbătoare de ioni dintr-un analizor de
aminoacizi este afectată de care dintre următoarele aspecte?
(a) Concentrația fluidului de eluare.
(b) pH-ul fluidului de eluare.
(c) Derivatul de aminoacid utilizat.
(d) Temperatura coloanei.
3. La pH 2, toți aminoacizii migrează electroforetic spre catod.
PENTRU CĂ
aminoacizii nu poartă nicio sarcină netă la pH-ul lor izoelectric.
4. În analizorul de aminoacizi se utilizează o rășină schimbătoare
de cationi puternici pentru că
aminoacizii sunt eluți de pe o rășină schimbătoare de cationi puternici
cu un tampon cu un pH mai mic de 4.
380Aminoacizi
Allen, G. (1989) Secvențierea proteinelor și peptidelor. În Burdon, R.M. și van

Knippenberg, P.H. (eds) Lilboratory techniques in biochemistry and molecular biol
ogy, Vol. 9, ediția a 2-a revizuită, Elsevier, SUA.
Fini, C., Floridi, A. și Pinelli, V.N. (1989) Lilboratory methodology in biochemistry:
amino acid analysis and sequencing, CRC Press, UK.
Bailey, P.D. (1992) An introduction to peptide chemistry, John Wiley, UK.
11 Proteine
• Structura proteinelor
• Metode generale de cuantificare
• Separarea proteinelor
Cuvântul "proteină" descrie doar un singur tip de polimer care implică în

principal aminoacizi și totuși include multe mii de molecule diferite. Este
posibil să se măsoare conținutul total de proteine dintr-un eșantion, în ciuda
faptului că tehnici de preparare relativ simple pot fi capabile să demonstreze
prezența diferitelor proteine. Cu toate acestea, în cazul în care interesul
constă doar într-una dintre aceste proteine, atunci o măsurătoare a
conținutului total de proteine ar fi complet nepotrivită. Metodele de
cuantificare a proteinelor sunt fie adecvate pentru toate proteinele, fie
concepute pentru a măsura proteine individuale. Aceste metode specifice pot
depinde fie de o etapă pregătitoare a analizei, fie de utilizarea unei
caracteristici specifice a proteinei în cauză.
Cuantificarea unei proteine care are o funcție biologică specifică, un
hormon, de exemplu, poate să nu ofere o indicație reală a activității sale
biologice din cauza inactivării unei părți din proteină. În cazul proteinelor
care au funcții biologice definite, se poate alege între cuantificarea chimică și
testele biologice. Din acest motiv, activitatea catalitică a unei enzime este mai
frecvent măsurată decât concentrația proteică a acesteia.
Secvența de aminoacizi dintr-un lanț polipeptidic este cunoscută sub numele

de structură primară. Această caracteristică este determinată genetic și este
responsabilă nu numai de forma finală a proteinei, ci și de caracteristicile sale
fizice și, în cele din urmă, de funcția sa biologică. Proteinele sunt alcătuite din
aproximativ 22 de aminoacizi, care sunt legați prin legătura peptidică (figura
11.l), o legătură amidică ce implică grupa amino a unui aminoacid și grupa
carboxil a altui aminoacid. Formarea unei legături peptidice are ca rezultat
pierderea unei legături amino și a unei legături
382 Proteine
gruparea carboxil a fiecărui aminoacid, restul moleculelor (reziduurile) fiind

componentele principale ale structurii proteinei. Cu toate acestea, aminoacizii
de la fiecare capăt al unui lanț polipeptidic păstrează fie o grupare amino
(reziduul N-terminal), fie o grupare carboxil (reziduul C-terminal). Prin
convenție, reziduul N-terminal este întotdeauna desemnat ca fiind reziduul
numărul unu într-o secvențiere numerică a aminoacizilor din proteină. Forma
tridimensională a unui lanț polipeptidic sau a unei porțiuni de lanț este
cunoscută sub numele de structură secundară. În forma sa cea mai simplă,
lanțul polipeptidic complet întins ar prezenta o structură asemănătoare cu cea
indicată în figura l l .2(a). Cu toate acestea, acesta adoptă adesea o structură
elicoidală similară celei din figura l l.2(b), care este stabilizată de hidrogenul
din interiorul lanțului.
7
-C-C-C-N-C-
Figura 11.1 ) II
Legătura o
peptidică.
I
IIle I
/ II
_,,/ I
N-c/
\ c......_ I ,/
---
\
\ --c _,,,"'
(a) (b)
Figura 11.2 Structura secundară a proteinelor. Cea mai simplă dispunere spațială a
aminoacizilor într-un lanț polipeptidic este sub forma unui lanț complet întins (a), care
are o structură vertebrală regu lară datorită unghiurilor de legătură implicate și din care
atomii suplimentari, H și 0, și reziduurile de aminoacizi, R, se proiectează sub diferite
unghiuri. Forma elicoidală (b) este stabilizată prin legături de hidrogen între grupul -
NH al unei legături peptidice și grupul --CO al unei alte legături peptidice. Reziduurile
de aminoacizi se proiectează mai degrabă din elice decât în interiorul acesteia.
Structura 383
proteinelor
legături formate între hidrogenul amidic al unei legături peptidice și oxigenul
unei grupări carbonil ale altei grupări. O legătură de hidrogen este o legătură
necovalentă între sarcina pozitivă ușoară indusă într-un atom de hidrogen
atunci când acesta este legat covalent de un atom electronegativ (de exemplu,
azot) și sarcina negativă ușoară a unui alt atom electronegativ (de exemplu,
oxigen).
Multe proteine prezintă nu numai aceste două caracteristici structurale,
ci și forme intermediare. Prezența iminoacizilor prolină și hidroxiprolină
induce curburi în lanț datorită variantei legăturii peptidice rezultate (figura
11.3). Glicina, care nu are efectiv nicio catenă laterală (H), permite o
flexibilitate mai mare la nivelul legăturii peptidice decât alte reziduuri de
aminoacizi. Legătura între lanțuri poate avea loc, de asemenea, între lanțuri
extinse paralele pentru a produce structuri de foițe plisate în care legăturile de
hidrogen se formează între atomii de hidrogen și de oxigen din lanțuri
diferite. În funcție de dispunerea lanțurilor, acestea sunt cunoscute ca foi
plisate paralele sau foi plisate antiparalele (figura 11.4).
Figura 11.3 Efectul iminoacizilor asupra structurii proteinelor. Prezența

iminoacizilor prolină și hidroxiprolină introduce o constrângere în unghiurile legăturii
peptidice, ceea ce are ca rezultat o curbură în structura anterior regulată a lanțului.
Structura terțiară a unei proteine reprezintă forma sa generală și

nivelul de organizare la care rolul proteinei devine semnificativ. Acele
proteine care au o structură generală sferică sau globulară datorită pliajului
intern al lanțului sunt cunoscute sub denumirea de proteine globulare (figura l
l l .5). Ele sunt semisolubile în apă, formând soluții coloidale, iar în formă
solidă prezintă adesea o structură cristalină. Ele sunt de obicei proteinele
funcționale ale celulei, enzimele și imunoglobulinele fiind exemple. Pro
teinele fibroase sunt proteinele structurale și sunt lanțuri polipeptidice liniare
care sunt asociate între ele pentru a forma șiruri sau foițe. În general, acele
proteine fibroase care au o structură elicoidală tind să fie proteine elastice,
de exemplu, cheratina, în timp ce proteinele cu o structură de foiță plisată
tind să fie neelastice, de exemplu, mătasea. Cu toate acestea, proteinele
elicoidale devin neelastice dacă există un grad ridicat de legătură între elicele
individuale, colagenul fiind un bun exemplu (figura 11.6).
384 Proteine
Lanțuri antiparalele Lanțuri paralele
Figura 11.4 Foi plisate de proteine fibroase. Foițele plisate paralele sunt compuse din
lanțuri polipeptidice care au toate aminoacidul N-terminal la aceeași extremitate, în
timp ce foițele plisate antiparalele implică lanțuri polipeptidice care sunt inversate
alternativ în sens. Ambele forme de foițe prezintă un grad ridicat de legătură de
hidrogen între lanțuri.
Figura 11.5 Proteine globulare. Plierea unui lanț polipeptidic într-o formă globulară
este stabilizată de interacțiuni hidrofobe și de unele legături covalente, în special de
legătura disulfură dintre reziduurile de cisteină. Lanțul polipeptidic prezintă unele
secțiuni de natură regulată și elicoidală și alte secțiuni, în special la nivelul curburilor
și pliurilor, în care conformația lanțului este distorsionată.
Structura 385
proteinelor
Figura 11.6 Colagen. Colagenii sunt constituenți majori ai cartilajului și ai altor

țesuturi conjunctive și conțin cantități mari de iminoacizi prolină și hidroxiprolină.
Structura de bază implică trei lanțuri polipeptidice cu un grad considerabil de legătură
de hidrogen între lanțuri.
Natura reziduurilor de aminoacizi este de o importanță capitală în

dezvoltarea și menținerea structurii proteinelor. Lanțurile polipeptidice
compuse din aminoacizi alifatici simpli tind să formeze mai ușor elicoizi
decât cele care implică mulți aminoacizi diferiți. Secțiunile unui lanț
polipeptidic care sunt în principal nepolare și hidrofobe tind să fie îngropate
în interiorul moleculei, departe de interfața cu apa, în timp ce reziduurile de
aminoacizi polari se află de obicei în exteriorul unei proteine globulare.
Lanțul polipeptidic pliat este stabilizat și mai mult prin prezența legăturilor
disulfidice, care sunt produse prin oxidarea a două resturi de cisteină. Astfel
de legături covalente sunt extrem de importante în menținerea structurii
proteice, atât la nivel intern, în cazul proteinelor globulare, cât și la nivel
extern, în legătura dintre lanțurile adiacente din proteinele fibroase.
Reziduurile din acei aminoacizi care sunt clasificate ca fiind fie acide,
fie bazice sunt capabile să accepte sau să doneze un proton și vor purta, la
orice pH dat, o sarcină de semn și intensitate caracteristică. Prezența tuturor
acestor grupări ionizabile face ca proteinele să prezinte nu numai
caracteristici acide și bazice, ci și caracteristicile unui electrolit. Astfel de
substanțe sunt cunoscute sub denumirea de ampoliți. La valori scăzute ale
pH-ului, ionizarea grupărilor bazice va fi dominantă, iar proteina va purta o
sarcină pozitivă netă, în timp ce la valori ridicate ale pH-ului, ionizarea
grupărilor anionice va fi cea mai evidentă. La un pH specific moleculei,
natura anionică va echilibra exact natura cationică, iar proteina nu va purta
nicio sarcină netă. Acesta este cunoscut sub numele de pH-ul izo-ionic al
proteinei.
La pH-ul izo-ionic, efectul de respingere a sarcinilor similare, care este
principala forță de stabilizare a suspensiilor coloidale, lipsește, iar proteina va
prezenta o solubilitate minimă și poate precipita. Precipitarea va depinde în
principal de gradul de hidratare, un fenomen în care moleculele de apă sunt
legate de exteriorul polar al proteinei și acționează ca factor de stabilizare în
suspensiile coloidale. Sarcina efectivă purtată de un coloid este cunoscută sub
numele de potențial zeta și este afectată nu numai de natura ionică a
reziduurilor de aminoacizi, ci și de factori externi. În prezența sărurilor are loc
adsorbția ionilor, ceea ce duce la o reducere a sarcinii purtate de coloid. La un
moment dat, concentrația de săruri va fi de așa natură încât potențialul zeta se
va reduce la zero, iar proteina va avea din nou tendința de a precipita, un
proces cunoscut sub numele de "sărare". Acest efect este amplificat de
concurența pentru moleculele de apă de către aceste concentrații ridicate de
săruri.
386 Proteine
Multe proteine globulare au un alt nivel de organizare, cunoscut sub

numele de structură cuaternară, care descrie asocierea unităților proteice
pentru a obține o proteină agregată cu o proprietate funcțională definită.
Funcțiile catalitice complexe ale izoenzimelor depind de structura lor
cuaternară. Legăturile implicate sunt de obicei necovalente și în principal
hidrofobe între regiunile nepolare de pe suprafețele moleculelor în cauză.
Hemoglobina, de exemplu, este compusă din patru lanțuri polipeptidice, în
mod normal în două perechi identice, formând tetramerul de hemoglobină,
care este mai eficient în transportul oxigenului decât monomerul. În plus față
de cele patru lanțuri proteice, hemoglobina încorporează și o porfirină de fier
care facilitează legarea oxigenului. Proteinele precum hemoglobina care
implică componente neproteice sunt cunoscute sub numele de proteine
conjugate.
Secțiunea 11.1
1. Care este principala forță stabilizatoare în structura secundară a
proteinelor?
(a) Legătură peptidică.
(b) Legătura de hidrogen.
(c) Legătura disulfură.
(d) Legătură hidrofobă.
2. Ce va arăta o proteină în soluție la pH-ul său izo-ionic?
(a) Solubilitate minimă în apă.
(b) Nu se percepe nicio taxă netă.
(c) Activitate enzimatică maximă.
(d) Stabilitate maximă.
3. Termenul de structură globulară a unei proteine este asociat cu
nivelul terțiar al structurii proteice
PENTRU CĂ
o proteină globulară este solubilă în apă.
4. Legătura hidrofobă este importantă la nivelul secundar al structurii
proteice
PENTRU CĂ
legătura hidrofobă este produsă de afinitatea dintre regiunile nepolare
ale lanțului polipeptidic.
Natura probei și prezența oricăror substanțe care interferează sunt

considerente importante în selectarea unei metode adecvate. Probele fluide
sunt cele mai ușor de manipulat, dar unele metode sunt adecvate pentru
analiza materialelor solide. Prezența substanțelor care interferează poate
necesita o purificare inițială a componentelor proteice. Acest lucru se poate
realiza prin precipitarea proteinelor solubile și, după spălare, prin cuantificare
cu ajutorul unei metode adecvate. Utilizarea căldurii sau a acizilor puternici
are ca rezultat o reacție ireversibilă.
denaturare și, de obicei, va fi necesară o metodă cum ar fi Kjeldahl. Cu toate

acestea, precipitatul produs de săruri, alcool etc. poate fi redisolvat în alcalin
și se poate utiliza ulterior o metodă precum reacția Biuret. Alternativ,
substanțele care cauzează interferența, care sunt adesea molecule mici, cum ar
fi aminoacizii și sărurile, pot fi eliminate prin dializă cu un volum mare de
soluție tampon adecvată. Proba poate fi conținută într-o pungă sigilată
realizată din tuburi Visking adecvate sau se poate folosi una dintre unitățile
comerciale cu fibre goale, în care o lungime lungă de tuburi de dializă cu
diametru îngust oferă o suprafață foarte mare pentru o dializă rapidă.
Absorbanța Absorbție
Tirozină Protein
ă
200 300 200 300

Lungime de undă Lungime de undă
(nm) (nm)
Absorbanța Absorbanța
Triptofan Fenilalanină
Figura 11.7
Spectrele de absorbție ale 200 300 200 300
Lungime de undă Lungime de undă
aminoacizilor și ale (nm) (nm)
proteinelor.
11.2.1 Metode spectroscopice

Prezența reziduurilor de aminoacizi aromatici face ca proteinele să prezinte
un maxim de absorbție la 280 nm, iar compararea valorii absorbției unei
soluții de testare cu cea a unei soluții standard oferă o metodă sensibilă de
cuantificare. Aceasta nu poate fi considerată o metodă absolută de
cuantificare.
388 Proteine
deoarece variațiile în conținutul de aminoacizi fac ca valorile coeficienților de

absorbție să varieze de la o proteină la alta. Figura 11.7 prezintă spectrele de
absorbție ale mai multor aminoacizi și ale unei proteine și, deși maximele de
absorbție ale aminoacizilor variază, efectul cumulativ este cel care face ca
toate proteinele să prezinte un maxim de absorbție la 280 nm. La această
lungime de undă, triptofanul are cel mai mare coeficient de absorbție molară
și contribuie cel mai mult la valoarea absorbției înregistrată. Absorbția în
regiunea de 220 nm, datorată legăturii pep tide, a fost utilizată pentru
cuantificarea proteinelor, dar multe alte compuși absorb, de asemenea, la
această lungime de undă și, prin urmare, aceste metode suferă un grad
considerabil de interferență.
11.2.2 Metode chimice
Metoda Kjeldahl
Metoda Kjeldahl măsoară conținutul de azot al unui compus și poate fi
utilizată pentru a determina conținutul de proteine al unui eșantion, cu
condiția ca proporția de azot din proteine să fie cunoscută. Determinarea
proteinelor este îngreunată de prezența azotului din surse neproteice. Cel mai
simplu mod de a elimina această sursă de eroare este de a precipita proteinele
folosind o metodă adecvată și de a determina conținutul de azot din precipitat.
Conținutul de azot al proteinelor este de obicei acceptat ca fiind de 16%
din greutatea totală, dar acest lucru poate să nu fie întotdeauna corect,
deoarece valorile pentru fiecare proteină în parte diferă. Acest lucru este
valabil în special dacă proteina are fie o proporție mare de aminoacizi bazici
(atomi de azot suplimentari), fie este o proteină conjugată cu o componentă
neproteică apreciabilă (tabelul 1 I. 1).
Tabelul 11.1 Conținutul de azot al diferitelor proteine
Sursă de proteine Proporția de azot Factor de

% greutate totală conversie
Carne 16.0 6.25

Plasmă sanguină 15.3 6.54
Lapte 15.6 6.38
Făină 17.5 5.70
Ouă 14.9 6.68
Toți compușii care conțin azot sunt oxidați în amoniac prin încălzirea
probei cu acid sulfuric concentrat împreună cu un catalizator, de obicei ioni
de cupru, deși au fost utilizați ioni de mercur și seleniu metalic. De obicei, se
include sulfatul de potasiu sau de sodiu pentru a crește punctul de fierbere al
amestecului, deși trebuie evitată încălzirea excesivă pentru a preveni
descompunerea sulfatului de amoniu. Această etapă de digestie este
importantă și durează de obicei câteva ore, timp în care proba devine inițial
maro sau neagră și se degajă vapori de dioxid de sulf. În cele din urmă,
soluția se limpezește, iar încălzirea trebuie continuată timp de încă
aproximativ 2 ore.
Amestecul răcit se transferă într-un balon de distilare cu abur, iar după
390 Proteine
,............ ,.. Wa ter
Scurg
ere
Balon
colector
Figura 11.8
Markham încă.
alcalinizând amestecul cu hidroxid de sodiu în exces, amoniacul se distilează

într-un balon receptor (figura 11.8). Amoniacul este captat într-o soluție de
acid boric, iar ionii de amoniu sunt titrați direct cu o soluție standard de acid
clorhidric. Cu toate că acidul boric este cel mai convenabil, este posibil să se
rețină amoniacul într-un volum cunoscut de acid clorhidric standard și să se
trateze acidul rezidual cu o soluție de hidroxid de sodiu. Avantajul acestei din
urmă metode este că detectarea punctului final al titrării (un acid puternic și o
bază puternică) este mai ușoară decât în cazul titrării cu borat de amoniu și
acid clorhidric.
Calculul se bazează pe faptul că 1 atom de azot va duce la formarea a 1 mol
de amoniac, care va necesita ulterior 1 mol de acid. Prin urmare:
1,0 mol HCI = 14 g azot
Dacă pentru a neutraliza amoniacul format dintr-o anumită cantitate de
probă sunt necesari A ml de soluție acidă cu conținut de B mo11-1 , cantitatea
de azot pre trimisă în probă este:
14
lO00 X A X B grame
și cantitatea de proteine din care a fost obținut acest azot:
--1X4
AXBX--1g00rams
1000 16
Deși metoda Kjeldahl este anevoioasă și greoaie, ea poate fi extrem de
precisă dacă se cunoaște proporția de azot din proba de proteine și dacă se
poate asigura recuperarea completă a azotului. Acest lucru poate fi verificat
prin experimente de recuperare, în special pentru etapa de digestie a
procesului.
Metoda Biuret
Denumirea dată acestei metode este, într-un fel, nefericită și înșelătoare.
Metoda a fost dezvoltată în urma observației că biuretul reacționează cu o
soluție alcalină de sulfat de cupru pentru a da un complex de culoare purpurie.
Proteinele și unele amine reacționează în mod similar cu biuretul. În absența
unui titlu mai potrivit, dar la fel de simplu, s-a păstrat denumirea de biuret,
deși relevanța sa chimică pentru cuantificarea proteinelor este vagă. Cu toate
acestea, a fost utilizat în elucidarea naturii complexului de cupru format
(figura 11.9). Ionii de cupru formează un complex de coordinare cu cele patru
grupări nucleofile-NH, care, în reacția cu proteinele, sunt furnizate de
legăturile peptidice care leagă aminoacizii. Complexul prezintă maxime de
absorbție la 330 și 545 nm (figura 11.10). Absorbția se măsoară de obicei la
545 nm și, deși sensibilitatea la 330 nm este mai mare, măsurătorile sunt mai
predispuse la interferențe.
Compușii care conțin două din oricare dintre următoarele grupe legate
printr-un atom de carbon sau de azot dau o reacție similară:
-CONH2
-CH2NH2
-C(NH)NH2
-CSNH2
Anumiți polialcooli, în special glicerolul și etilenglicolul, formează, de asemenea, și
un complex similar, deși maximele de absorbție diferă ușor de cele ale
,
NH2
' NH2
I
/
' ' ' ''--------\ c

/
/
/
/,:C--- /
1/ N NH '..:::
0
HI \
0
H2N--C
C---NH2
0 0
Figura 11.9 Reacția Biuret. Complexul de coordinare format în soluție alcalină între
ionii de cupru și atomii de azot nucleofil din patru molecule de biuret.
392 Proteine
Absorbanța
300 400 500 600 700

Figura 11.10 Spectrul de absorbție al complexului proteină-cupru din reacția

biuret.
a complexului proteină-cop r. Reactivul biuret constă într-o soluție alcalină

de sulfat de cupru la care se adaugă fie tartrat de sodiu și potasiu, fie citrat de
sodiu pentru a preveni precipitarea ionilor de cupru sub formă de hidroxid.
Metoda este extrem de robustă și fiabilă și respectă relația Beer-
Lambert până la o concentrație finală de proteine de aproximativ 2 g 1-1 (o
concentrație a probei de aproximativ 20 g 1-1), cu o limită inferioară de
aproximativ 100 µg de proteine (concentrație a probei de 1,0 g 1-1). Culoarea
atinge intensitatea maximă în aproximativ 15 minute și este stabilă timp de
cel puțin câteva ore. Metoda este simplă și fiabilă și se pretează ușor la
automatizare, dar lipsa de senzitivitate este cel mai mare dezavantaj al său.
Toate proteinele reacționează în mod similar, iar rezultatele arată foarte
puține diferențe pentru diferite proteine.
Metoda Lowry
Un reactiv pentru detectarea grupărilor fenolice, cunoscut sub numele de
reactivul Folin și Ciocalteu, a fost utilizat în cuantificarea proteinelor de către
Lowry (1951). În forma sa cea mai simplă, reactivul detectează reziduurile de
tirozină datorită naturii lor fenolice, dar sensibilitatea metodei a fost
îmbunătățită considerabil prin încorporarea ionilor de cupru. Un complex
cupru-proteină produs cu ajutorul unei versiuni diluate a reactivului biuret
determină reducerea acizilor fosfotungstic și fosfomolibdic, principalii
constituenți ai reactivului Folin și Ciocalteu, la albastru de tungsten și albastru
de molibden. Compoziția exactă a produselor de reacție albastre nu este
cunoscută, dar acestea prezintă vârfuri largi de absorbție în partea roșie a
spectrului vizibil (600-800 nm). Aproximativ 75% din reducerea care are loc
se datorează complexului cupru-proteină, iar reziduurile de tirozină (și, într-o
măsură mai mică, de triptofan) sunt responsabile pentru restul. Reactivul lui
Folin și Ciocalteu are o compoziție complexă și, în mod normal, este pur
chestat gata de utilizare. Se prepară prin încălzirea la reflux a tungstatului de
sodiu și a molibdatului de sodiu cu acid ortofosforic. Reactivul este în mod
normal de culoare galben pal și are un termen de valabilitate limitat.
Metoda este mai sensibilă decât metoda biuretului și are un interval de
analiză de la 10 µ,g la 1,0 mg de proteină. Utilizând metoda descrisă mai jos,
aceasta este echivalentă cu concentrații ale probei cuprinse între 20 mg 1-1 și
2,0 g 1-1 . Relația dintre absorbanță și concentrația de proteine se abate de la o
linie dreaptă și este necesară o curbă de calibrare. Metoda este, de asemenea,
supusă interferenței ionilor simpli, cum ar fi potasiul și magneziul, precum și a
diverșilor compuși organici, cum ar fi tamponul Tris și EDTA (acidul
etilendiamină tetraacetic). Compușii fenolici prezenți în probă vor reacționa,
de asemenea, iar acest lucru poate avea o importanță deosebită în analiza
extractelor de plante.
394 Proteine
Metoda acidului bicinchoninic

Aceasta este o modificare a metodei Lowry care implică o etapă de legare a
colorantului. Complexul cupru-proteină care stă la baza metodelor Biuret și
Lowry poate fi chelat cu acid bicinchoninic pentru a produce un complex
foarte stabil cu un maxim de absorbție puternic la 562 nm.
Se spune că aceasta suferă de mai puține efecte de interferență decât
metoda Lowry și este capabilă să detecteze niveluri de proteine de până la IO
µ,g. Prezența lipidelor interferează cu testul și este necesară modificarea
tehnicii în cazul în care sunt prezenți detergenți. Reactivul este stabil doar
pentru o perioadă scurtă de timp, dar dacă sulfatul de cupru este adăugat doar
înainte de utilizare, reactivii stoc se păstrează pe termen nelimitat.
U.2.3 Metode de legare a coloranților

Observațiile conform cărora prezența proteinelor afectează modificarea
culorii unor indicatori utilizați în titrări acido-bazice au condus la dezvoltarea
unor metode de cuantificare a proteinelor bazate pe aceste caracteristici de
absorbție modificate ale acestor coloranți. Deoarece prezența proteinelor
modifică culoarea produsă de acești indicatori atunci când se măsoară pH-ul,
controlul pH-ului este vital pentru cuantificarea proteinelor prin metode de
fixare a coloranților.
Portocaliul de metil tamponat la pH 3,5 se leagă de albumină cu o
afinitate mai mare decât de alte proteine, iar complexul rezultat prezintă o
absorbție redusă la 550 nm. Metoda nu este adecvată ca metodă generală de
determinare a proteinelor din cauza variației considerabile a legăturii colorantului
cu diferite proteine. Albastrul strălucitor de Coomassie a fost utilizat pe scară
largă într-o metodă generală de cuantificare a proteinelor, iar atunci când este
complexat cu proteinele prezintă o deplasare în
Absorbanța
400 500 600 700

Figura 11.11 Spectrul de absorbție al proteinei-Coomassie albastru strălucitor G

250 de complexe: A, numai albastru strălucitor Coomassie; B, complexul proteină-
colorant.
maximul său de absorbție de la 464 nm la 595 nm. Creșterea absorbanței la

595 nm poate fi utilizată ca o măsură a concentrației de proteine (figura
11.11). Absorbția maximă se dezvoltă foarte rapid (2-5 min) și este stabilă
timp de cel puțin o oră.
Metoda este adecvată pentru toate proteinele, deși cantitatea de colorant
legat variază de la o proteină la alta într-un mod care pare să fie legat de
proporția de reziduuri de aminoacizi bazici din proteină. De exemplu,
seroalbumina bovină dă valori de absorbanță cu 60% mai mari decât aceeași
concentrație de albumină de ou. Prin urmare, este important ca soluțiile de
proteine standard utilizate să aibă aceeași compoziție ca și proteina de testat.
Controlul pH-ului este important ș i, deș i reactivul este puternic tamponat,
orice probă foarte alcalină poate modifica pH-ul ș i, prin urmare, poate afecta
rezultatul. Unii detergenți, atunci când sunt prezenți, prezintă o interferență
semnificativă, ceea ce duce la creșterea valorilor de absorbție.
Metoda este capabilă să detecteze doar 5 µ,g de proteină și este
necesară o curbă de calibrare din cauza variațiilor dintre diferite proteine și a
neliniarității relației absorbție-concentrație.
396 Proteine
Verdele de bromcresol este utilizat frecvent pentru cuantificarea

albuminei, de care se leagă selectiv la pH 4,2, ceea ce determină o creștere a
absorbției la 630 nm. Colorantul are inițial o culoare galbenă, dar com plexul
proteină-colorant rezultat este de un albastru intens (figura 11.12). Metoda
este relativ specifică pentru albumină, verdele de bromcresol fiind capabil să
deplaseze majoritatea substanțelor care pot fi inițial legate de molecula
proteică.
Metoda este sensibilă, prezentând o limită inferioară de detecție de
aproximativ 50 µ.,g de proteină și o relație liniară între absorbanță și
concentrația de proteină până la aproximativ 0,2 g.
Absorbanța
/\
, I
\
\
,
I
IA
I \\
\
\
Figura 11.12 \
\
Spectrul de absorbție al
\
complexului albumină -
verde de bromcresol:
A, numai verde de 300 500 600 700
bromcresol; Lungime de undă (nm)
B, complex albumină-
colorant.
Utilizarea verde de bromcresol pentru măsurarea albuminei a fost
criticată din mai multe motive. Există o tendință de precipitare a complexelor
proteină-colorant la pH 4,2, care este foarte aproape de pH-ul izo-ionic al
albuminei. Se susține că metoda nu este absolut specifică pentru albumină și,
în special în cazul probelor de ser, prezintă o distorsiune pozitivă a
rezultatelor. Există, de asemenea, o anumită variabilitate în intensitatea culorii
produse de albumine din diferite surse, fapt care face ca alegerea materialului
standard să fie importantă.
S-a sugerat că purpuriul de bromcresol prezintă o mai bună
specificitate pentru albumină și o variație mai mică a intensității culorii în
comparație cu verdele de bromcresol. Complexul colorant-albumină prezintă
un maxim de absorbție la 603 nm, iar utilizarea unui reactiv tamponat la pH
5,2 reduce considerabil tendința de precipitare a complexului.
11.2.4 Metode imunologice

Anticorpii oferă un instrument analitic foarte convenabil și specific pentru
determinarea proteinelor, un rol considerabil sporit de disponibilitatea unei
game largi de anticorpi monoclonali. Mulți anticorpi sunt capabili să precipite
proteina țintă, iar turbiditatea rezultată poate fi măsurată fie prin metode tur
bidometrice, fie prin metode nefelometrice. Diferitele tipuri de imunoanalize
alternative oferă o sensibilitate sporită față de metodele turbidometrice.
Multe dintre metodele descrise anterior nu fac diferența între diferite proteine,
dar este adesea necesar să se determine cantitatea unei anumite proteine în
prezența altora. Deși proteinele sunt compuse din aminoacizi, problemele
implicate în separarea proteinelor individuale sunt considerabil mai mari
decât în cazul separării aminoacizilor, iar masa moleculară relativă mare
înseamnă că unele dintre tehnicile de separare mai simple, cum ar fi
cromatografia în strat subțire sunt inadecvate. Faptul că structura terțiară și

cuaternară a unei proteine poate fi serios și adesea permanent alterată chiar și
de condiții destul de ușoare reprezintă o problemă suplimentară.
11.3.1 Precipitații
Concentrații ridicate ale unei varietăți de săruri, inclusiv sulfați, sulfiți și fosfați,
pot fi utilizate pentru a precipita proteinele, dar fiecare fracțiune produsă constă
în continuare într-un amestec de proteine și necesită, de obicei, o purificare
suplimentară. Denaturarea excesivă a proteinelor este evitată prin utilizarea unor
temperaturi scăzute.
Tehnicile de fracționare a sării pregătesc fracțiuni de proteine prin
creșterea succesivă a concentrațiilor de sare. Se adaugă suficientă sare la
probă pentru a obține cea mai mică concentrație selectată, iar precipitatul
rezultat este eliminat, de obicei prin centrifugare sau filtrare. Se adaugă apoi
mai multă sare la probă pentru a crește concentrația până la următorul nivel
selectat, iar precipitatul este din nou îndepărtat. Procesul se poate repeta la
concentrații de sare din ce în ce mai mari și se poate obține o serie de
precipitați care pot fi redisolvați într-un tampon adecvat. Sarea poate fi
ulterior eliminată din preparatul de proteine prin tehnici precum dializa sau
cromatografia de permeabilitate pe gel.
De asemenea, se pot utiliza diferiți alcooli, iar fracțiunile clasice Cohn
ale proteinelor serice sunt separate cu ajutorul unor concentrații specifice de
etanol în condiții de temperatură și pH atent controlate.
Electroforeza, în toate formele sale, are o aplicație majoră în separarea
proteinelor, deoarece sarcina și dimensiunea moleculară sunt importante atât
pentru separarea electroforetică, cât și pentru structura proteinelor. Tehnicile
convenționale care utilizează un mediu de susținere plat, de exemplu, benzi
de acetat de celuloză sau plăci de gel deschis, sunt completate și adesea
înlocuite de tehnicile capilare, care oferă caracteristici analitice suplimentare.
În ambele tehnici, factorii cheie în separarea proteinelor sunt alegerea pH-ului
de operare și a condițiilor electroforetice care trebuie utilizate.
Electroforeza capilară este o tehnică instrumentală și este foarte
dependentă de disponibilitatea echipamentelor și a reactivilor comercializați.
Deciziile tehnice sunt luate în mare parte de către producător și nu de către
analist. Cu toate acestea, este esențial ca analistul să poată identifica
caracteristicile moleculare ale problemei analitice și apoi să selecteze o
tehnică adecvată.
Aspecte tehnice
Atunci când se selectează un suport, trebuie luați în considerare diverși factori.
Hârtia de filtru are dezavantaje semnificative, cel mai grav fiind adsorbția
proteinelor. Mediile de celuloză modificată, cum ar fi acetatul de celuloză,
prezintă efecte de adsorbție semnificativ mai reduse care, împreună cu o
structură foarte uniformă a porilor, au ca rezultat o rezoluție mult îmbunătățită,
deși calitatea mem branelor de acetat de celuloză variază în mod semnificativ de
la un producător la altul.
Diferitele alte tipuri de medii de suport, cum ar fi gelurile de amidon și
398 Proteine
de poli-acrilamidă, prezintă o rezoluție îmbunătățită datorită unui efect de

filtrare moleculară.
tehnicile de focalizare electrică oferă probabil cea mai bună rezoluție și multe
dintre benzile rezultate se datorează unor proteine specifice. Acestea sunt
utilizate în principal ca tehnică calitativă sau semicantitativă, în primul rând
din cauza numărului mare de benzi care se dezvoltă și sunt deosebit de
valoroase atunci când trebuie comparate probe succesive din aceeași sursă
pentru a determina prezența sau absența unei anumite proteine sau pentru
investigarea proprietăților fizice, de exemplu p/.
Este important de reținut că utilizarea acestor medii diferite pentru
același eșantion va avea ca rezultat modele de separare care nu pot fi ușor de
comparat între ele. Separarea proteinelor serice pe acetat de celuloză va avea
ca rezultat 5-7 benzi, în timp ce utilizarea gelului de poliacrilarnid va da 17
benzi.
pH-ul tamponului utilizat afectează sarcina purtată de proteină și, deși
în teorie se poate utiliza orice pH, în practică, valori ale pH-ului mai mari
decât pH-ul izoelectric al proteinei (ceea ce face ca proteina să fie încărcată
negativ) oferă separări mai bune decât alte valori ale pH-ului. La selectarea
condițiilor pentru separarea unui anumit amestec de proteine, un pH tampon
care oferă cea mai mare diferență în sarcina purtată de fiecare proteină în
parte determină cea mai mare diferență de viteze și, prin urmare, de distanțe
finale de deplasare. În practică, se folosesc cel mai frecvent tampoane cu pH
8,6.
În plus față de pH-ul său, concentrația unui tampon afectează, de
asemenea, mobilitatea proteinelor. La concentrații mari, potențialul zeta al
proteinei este redus, ceea ce duce la o distanță mai scurtă de migrare. Cu toate
acestea, deoarece concentrațiile mai mari de tampon oferă o rezoluție mai
bună, trebuie găsită o concentrație de compromis și trebuie să se găsească
tampoane cu o forță ionică (µ) care variază între 0,025 și
0,075 sunt utilizate frecvent.
Diferitele tipuri de electroforeză capilară se realizează fie în soluție
liberă, fie în gel. Alegerea metodei depinde de natura probei și de obiectivul
analitic, dar electroforeza în gel capilar, inclusiv electroforeza izoelectrică și
electroforeza SDS, este deosebit de utilă pentru aplicațiile cu proteine.
O problemă majoră a utilizării capilarelor de silice topită este efectul de
adsorbție cu proteinele, care duce la lărgirea benzilor în timpul procesului de
separare. Există o serie de tehnici disponibile pentru a minimiza acest efect,
de la utilizarea unor pH-uri extreme pentru a reduce sarcina capilarului, la
utilizarea de capilare acoperite cu diverse grupări hidrofile pentru a masca
grupările Si-OH ionizate din silice și adăugarea unei serii de substanțe în
tampon care sunt concepute pentru a concura eficient cu proteinele pentru
situsurile ionice.
Aspecte cantitative
În cazul electroforezei convenționale, care utilizează un mediu de susținere
solid, proba este aplicată sub formă de dungă. Zonele sau benzile de proteine
care se dezvoltă în timpul electroforezei pot fi precipitate în porii mediului de
susținere cu acid tricloroacetic și colorate cu ajutorul unui colorant adecvat
(Ponceau S, nigrosin etc.). Cantitatea de colorant legat este adesea corelată
direct cu cantitatea de proteine, dar această relație cantitativă este criticabilă
din motivele prezentate la capitolul metode de legare a coloranților. Cu toate
acestea, ea oferă o metodă semi-cantitativă convenabilă, diferitele fracțiuni
400 Proteine
fiind de obicei exprimate ca procent din total, mai degrabă decât în cantități
absolute. Dacă se determină conținutul total de proteine din proba originală
folosind una dintre metodele generale descrise anterior, este posibil să se
calculeze cantitatea de proteine din fiecare fracțiune.
Cantitatea de colorant legată de fiecare fracțiune poate fi determinată

pur și simplu prin tăierea benzilor colorate și eluția colorantului într-un volum
fix de solvent adecvat. Se măsoară absorbanța fiecărei soluții și se consideră
că suma valorilor absorbției este proporțională cu cantitatea totală de proteine.
Prin urmare, cantitatea de proteine din fiecare fracție poate fi calculată ca
procent din total.
O metodă alternativă și mai satisfăcătoare de cuantificare este scanarea
benzii electroforetice colorate cu ajutorul unui densitometru, care este un
fotometru modificat în care electroforegrama înlocuiește cuva de sticlă
obișnuită. Banda se deplasează încet pe traseul luminii, iar semnalul de la
detectorul fotoelectric este trasat de un înregistrator cu stilou, a cărui viteză de
înregistrare este sincronizată cu mișcarea benzii. Rezultatul este un traseu care
reprezintă valoarea absorbanței în funcție de distanța parcursă de-a lungul
electroforetogramei, iar aria de sub traseu este proporțională cu conținutul
total de proteine. Din aria de sub fiecare vârf, se poate calcula proporția de
proteine asociată cu acel vârf (figura 11.13).
Trebuie să se utilizeze o traiectorie foarte îngustă a luminii, pentru a se
asigura că nu este posibilă o apropiere
benzile adiacente sunt rezolvate. În cazul în care instrumentul măsoară
lumina transmisă, este necesar ca membrana de susținere să fie translucidă.
Acest lucru se poate face fie prin impregnarea benzii cu un ulei cu un indice
de refracție ridicat, fie, pentru
y a1 Albumină
1111111!1111!1111 lliijl 111!111111111111111 11111111

Procent din suprafața totală sub fiecare vârf
56
Figura 11.13 Electroforeza proteinelor din serul uman. Electroforetograma, după

colorarea cu un colorant adecvat, poate fi scanată cu ajutorul unui densitometru, care
oferă o urmă a modelului de absorbție al benzii.
402 Proteine
unele tipuri de materiale din acetat de celuloză, folosind un reactiv etanol-acid

acetic-etilenglicol, care provoacă colapsul structurii poroase a mem branului,
făcându-l transparent. Unele densitometre sunt concepute pentru a măsura
lumina reflectată mai degrabă decât cea transmisă și permit astfel utilizarea
benzilor opace. Acest lucru simplifică tehnica, dar introduce un factor
suplimentar în relația dintre absorbție și cantitatea de proteine prezente în
eșantion. Această relație este încă valabilă pentru măsurătorile de reflectanță,
cu condiția ca cantitatea de proteine în cauză să fie foarte mică și, prin urmare,
astfel de instrumente sunt de obicei concepute pentru tehnici microanalitice.
În cazul electroforezei capilare a proteinelor, este esențial ca tamponul

și mediul să aibă o bună transparență în ultraviolete pentru a permite o
detecție eficientă după separare. Gelul de poliacrilamidă prezintă o problemă
în acest sens, interferând cu detectarea proteinelor la 214 nm. Ca o consecință
a impactului comercial asupra electroforezei capilare, producătorii oferă o
gamă de medii gata de utilizare.
Electroforeză SDS
Proteinele pot fi disociate în lanțurile lor polipeptidice constitutive cu ajutorul
detergentului dodecil sulfat de sodiu (SOS) după reducerea legăturilor
disulfidice. SOS se leagă de lanțul polipeptidic producând un com plex în
formă de tijă, a cărui lungime depinde de masa moleculară relativă a
proteinei. Numărul mare al acestor molecule de detergent puternic anionice
legate de proteină (aproximativ egal cu jumătate din numărul de reziduuri de
aminoacizi) maschează efectiv sarcina nativă a proteinei și, la un pH neutru,
are ca rezultat un raport sarcină/masă relativ constant pentru toate proteinele.
Ca urmare, mobilitatea electroforetică a tuturor complexelor proteice-SOS
este aproximativ egală, dar efectul de cernere moleculară al gelului de
poliacrilamidă determină o mobilitate relativă care este invers legată de
dimensiunea complexului. În anumite condiții, această relație inversă poate fi
demonstrată printr-un grafic liniar al mobilității relative a proteinei în raport
cu logaritmul masei moleculare relative a acesteia (figura 11.14). Este necesar
să se utilizeze o serie de proteine cunoscute pentru a obține o curbă de
calibrare, iar în acest scop sunt disponibile în comerț kituri.
Înainte de electroforeză, proba este diluată în tampon care conține SOS (10-
--25 g 1-1) și ,8-mercaptoetanol (10---50 ml 1-1), care reduce orice
legături disulfidice care stabilizează proteina. Se încălzește apoi la 100 °C

timp de 2-5 minute pentru a denatura proteina și a expune lungimea totală a
lanțului polipeptidic la detergent. După răcire, se efectuează electroforeza pe
gel de poli-acrilamidă, iar benzile se vizualizează ulterior cu ajutorul unui
colorant adecvat.
(a)
Iog10 5.0
RMM
7
4.5
Figura 11.14 4.0 -------.----------,-----

Determinarea masei 0 0.5 1.0
moleculare relative Mobilitate relativă
(RMM) a unei proteine
prin electroforeză SDS. (b)
402 Proteine
Număr Proteină RMM log10RM

M
Citocrom c (mușchi) II 700 4.068
2 Mioglobina (scheletul ecvestru) 17 200 4.236
mușchi)
3 y-Globulină (lanțul L) 23 500 4.371
4 Anhidraza carbonică (bovine) 29 000 4.462
5 Ovalbumina 43 000 4.634
6 Albumină (umană) 68 000 4.832
7 Transferrină (umană) 77 000 4.886
Fotografia (a) arată aceste proteine separate pe un gel de poliacrilamidă 5% după

tratarea cu 0,1% SDS. O diagramă (b) alog 1 oRMM în raport cu mobilitatea relativă a
fiecărei proteine arată o relație liniară și oferă baza pentru determinarea masei
moleculare relative a unei proteine necunoscute.
11.3.3 Metode imunologice

Separarea unui amestec de proteine prin tehnici electroforetice, cum ar fi gelul
de poliacrilamidă, poliacrilamida SDS sau focalizarea izoelectrică, are ca
rezultat, de obicei, un model complex de benzi sau zone de proteine.
Interpretarea rezultatelor implică adesea o comparație a modelelor
amestecurilor de test și de referință, iar identificarea unei proteine individuale,
chiar și prin imunoelectroforeză (figura 11.15), este foarte dificilă. Cu toate
acestea, proteinele specifice pot fi adesea identificate folosind o tehnică de
imunoblotting cunoscută sub numele de Western blotting. Condiția prealabilă
este disponibilitatea unui anticorp, fie policlonal, fie monoclonal, împotriva
proteinei testate.
După separarea inițială printr-o tehnică electroforetică convențională pe
un gel, proteinele sunt transferate (sau blocate) prin electroforeză de pe gel pe
o membrană, de obicei din nitroceluloză. Gelul și membrana, care a fost
înmuiată în prealabil într-un tampon electroforetic adecvat, sunt așezate între
doi electrozi. Se aplică o tensiune, de exemplu 100 V, iar proteinele migrează
de la
lgG lgA lgM
Figura II.IS lmmunoelectroforeza proteinelor serice umane. Proteinele sunt separate

electroforetic din godeuri tăiate într-un gel adecvat. După electroforeză, în gel se taie o
cuvă paralelă cu direcția de migrare și se umple cu un anti ser. Componentele sunt lăsate să
se difuzeze timp de 24-48 de ore pentru ca liniile de precipitare să se dezvolte. Serul uman
conține multe proteine, printre care pot fi identificate imunoglobulinele.
gelul la membrana adiacentă. După aproximativ 1 oră, membrana se

îndepărtează și se spală cu grijă cu tampon și cu o soluție diluată de albumină
bovină pentru a bloca orice adsorbție nespecifică ulterioară a anticorpilor pe
membrană.
Următoarea etapă constă în tratarea membranei cu o diluție adecvată a
anticorpului specific și lăsarea reacției să aibă loc timp de cel puțin 1 oră.
Excesul de anticorpi este apoi spălat de pe membrană, iar anticorpul legat care
rămâne este detectat cu ajutorul unui al doilea anticorp împotriva primului, de
exemplu imunoglobulină de iepure. Acest al doilea anticorp a fost marcat în
prealabil, de exemplu, cu enzima peroxidază de hrean, dar se pot folosi și alte
markere, cum ar fi aurul conjugat sau un izotop, cum ar fi125 1. Benzile pot fi
apoi vizualizate folosind o metodă adecvată. Modelul de zone rezultat este
apoi comparat cu electroforetograma înainte de imunoblotting, iar proteinele
specifice sunt identificate pentru orice investigație sau separare ulterioară.
Tehnica se poate realiza, de asemenea, într-o singură etapă, dacă
anticorpul inițial este marcat, dar acest lucru este mai puțin convenabil și
adesea mai costisitor decât un singur preparat de anticorpi marcați care poate
fi utilizat pentru a detecta toți anticorpii de la o singură specie de donator.
11.3.4 purificare de imunoafinitate

Proteinele sunt adesea imunogeni puternici, iar disponibilitatea anticorpilor
specifici, în special a anticorpilor monoclonali, face ca tehnica cromatografiei
afini să fie foarte utilă în separarea și purificarea proteinelor individuale.
Tehnica a fost utilizată pentru a purifica o gamă largă de proteine, cum ar fi
hormonii, receptorii membranari și proteinele complementului. Cu toate
acestea, nu se limitează la proteine și este potențial aplicabilă oricărei
substanțe imunogene. Disponibilitatea anticorpilor adecvați este esențială, iar
aceștia pot fi obținuți prin tehnici policlonale pe animale întregi sau prin
cultivarea de celule monoclonale. Primii anticorpi pot necesita o purificare
prealabilă înainte de a fi imobilizați.
Cea mai frecvent utilizată tehnică de imobilizare implică utilizarea
mediilor de sefarose activate cu bromură de cianogen. Gelul de sefarose este
activat prin tratarea cu o soluție de bromură de cianogen timp de câteva
minute. Apoi se spală cu apă distilată rece ca gheața înainte de a fi amestecat
cu o diluție de anticorp pentru a efectua legarea. După ce se lasă să
reacționeze peste noapte, gelul se spală cu tampon Tris-HCl pentru a
neutraliza orice grup activ rămas.
Coloana este umplută cu gelul preparat și este echilibrată cu un tampon
adecvat, de obicei cu un pH în jur de 8, înainte ca proba să fie trecută încet
prin ea. În această etapă, substanța de testat este legată de anticorpul
imobilizat și reținută în coloană. În mod normal, pot fi acceptate volume mari
de probă, de obicei de aproximativ cinci ori mai mari decât volumul coloanei.
Coloana este din nou spălată cu tampon și, în final, antigenul legat este
eluat. Nu există o regulă generală care să permită selectarea unei soluții de eluare
adecvate, dar se folosesc frecvent tampoane cu pH-uri relativ extreme, adesea
pH 2,5. Alternativ, se pot folosi concentrații ridicate de diverși solvenți, de
exemplu uree, săruri de guanidiniu și SDS. Antigenul este deplasat rapid din
mediul coloanei și colectat într-un volum cât mai mic posibil. După utilizare,
mediul poate fi spălat ș i regenerat pentru a fi utilizat ulterior.
404 Proteine
11.3.5 Metode cromatografice

Diverse tehnici cromatografice pot fi aplicate la studiul amestecurilor de
proteine. Tehnicile pe coloană au avantajul că fracțiunile rezultate pot fi
cuantificate prin metoda generală descrisă anterior. Cromatografia de
permeabilitate pe gel este frecvent utilizată pentru a separa amestecuri de
proteine, dar este necesar să se cunoască în prealabil dimensiunea proteinelor
prezente pentru a selecta gelul cel mai potrivit. Cromatografia de schimb de
ioni cu schimbători de ioni din celuloză substituită, dietilaminoetilceluloză
(DEAE) și carboximetilceluloză (CM), este frecvent utilizată, dar, la fel ca în
cazul cromatografiei de permeabilizare pe gel, aplicațiile principale sunt în
aspectele pregătitoare ale analizei proteinelor. Tehnicile cromatografice de
afinitate, inclusiv cele care utilizează anticorpi ca liganzi, permit separarea
foarte specifică a proteinelor.
HPLC în fază inversă poate fi utilizată pentru separarea peptidelor și a
proteinelor. Peptidele mai mici (mai puțin de 50 de resturi de aminoacizi) pot
fi separate în mod satisfăcător pe faze legate de octadecilsilan (C-18), în timp
ce pentru recuperarea adecvată a moleculelor mai mari se recomandă
tetritilsilanul (C-4) sau octilsilanul (C-8). Pentru proteinele cu mase
moleculare relative mai mari de 50 000 este de obicei necesară o garnitură
poroasă de coloană cu proprietăți de permeabilitate a gelului și de fază
inversă.
Cromatografia de interacțiune hidrofobă (HIC) este o variantă a
cromatografiei în fază inversă, care este deosebit de utilă pentru separarea
proteinelor. În locul fazelor staționare puternic hidrofobe utilizate în mod
normal, cum ar fi octadecilsilanul (C-18), se folosesc faze mai mici și mai
puțin hidrofobe, cum ar fi grupurile metil, butil și fenil. Fazele mobile sunt
apoase, iar interacțiunile hidrofobe dintre proteine și faza staționară sunt
sporite în cazul unor concentrații mari de sare, în jurul valorii de 1-2 mol 1-1 -
Separările tipice implică echilibrarea coloanei și aplicarea probei într-un
tampon cu o concentrație mare de sare și apoi eluarea secvențială a
proteinelor cu un gradient descrescător de concentrație de sare. Ca în cazul
majorității tehnicilor de separare care implică proteine, pH-ul și temperatura
tamponului de eluare sunt importante.
Secțiunile 11.2/3
l. Proteinele prezintă un maxim de absorbție la aproximativ care lungime
de undă?
(a) 220 nm;
(b) 260 nm;
(c) 280 nm;
(d) 340 nm.
2. Toate proteinele conțin aproximativ ce procent de azot (p/p)?
(a) 12%.
(b) 16%.
(c) 22%.
(d) 27%.
Lecturi 405
suplimentare
3. Cromatografia în strat subțire este o tehnică adecvată pentru

separarea proteinelor.
PENTRU CĂ
proteinele sunt compuși polari și sunt adsorbite de silicagel.
4. Electroforeza este o tehnică adecvată pentru identificarea unei
proteine specifice.
PENTRU CĂ
fiecare proteină are un pH izoelectric.
Bollag, D.M. și Edelstein, S.J. (1991) Protein methods, John Wiley, UK.
Harris, E.L. andAngal, S. (eds) (1990) Protein purification -a practical approach, IRL
Press, UK.
Hames, B.D. (ed.) (1990) Gel electrophoresis of proteins - a practical approach, ediția a
2-a, IRL Press, UK.
Kenny, A. și Powell,-S. (eds) (1992) Practical protein chromatography, Humana Press,
SUA.
Dunn, M.J. (1993) Gel electrophoresis: proteins, Bios Scientific, UK.
12 Lipide
• Acizi grași
• Lipide simple
• Lipide complexe
• Structuri lipidice-proteice
• Pregătirea și manipularea probelor
• Metode cantitative
• Separarea amestecurilor de lipide
Cuvântul "lipide" este utilizat în mod vag pentru a descrie materialul biologic
care poate fi extras din țesuturile vii cu ajutorul solvenților organici. Această
definiție cuprinde substanțe eterogene din punct de vedere chimic, cum ar fi
acizii grași și diferiții lor derivați, steroizii, prostaglandinele, precum și
vitaminele "liposolubile" A, D, E și K. Cu toate acestea, o definiție mai
restrânsă a lipidelor, care este în general mai acceptabilă, este aceea de esteri
naturali ai acizilor grași cu lanț lung care sunt solubili în solvenți organici,
cum ar fi cloroformul, eterul dietilic sau hidrocarbonatul, dar care sunt
insolubili în apă. Conform acestei definiții, formele libere ale vitaminelor
liposolubile sunt excluse, la fel ca și sterolii neesterificați, inclusiv cho
lesterolul, acizii biliari și hormonii steroizi. Cu toate acestea, deoarece în
multe cazuri acestea apar adesea în mod natural sub formă de esteri ai acizilor
grași și deoarece există similitudini în abordarea analizei lor, cele de
importanță biologică vor fi luate în considerare pe scurt.
Lipidele au fost clasificate într-o varietate de moduri de către diferiți
lucrători, dar, în general, două categorii, simple și complexe, sunt evidente. În
acest text, substanțele care conțin doar un acid gras cu lanț lung și un alcool
(care poate fi fie glicerol, un alcool cu lanț lung, un sterol sau una dintre
vitaminele liposolubile) sunt considerate sub denumirea generală de lipide
simple. Lipidele complexe sunt esteri acilici fie ai glicerolului, fie ai
aminoalcoolului cu lanț lung, sfin gosină, care conțin, de asemenea, un grup
hidrofil, cum ar fi un ester fosfat al unui alcool organic, un carbohidrat sau un
grup sulfat.
Acizi grași 407
Lipidele există rareori într-un organism în stare liberă, ci sunt de

obicei asociate cu proteine sau combinate cu polizaharide. Ele sunt
constituenți alimentari importanți care furnizează energie, vitamine și
acizi grași esențiali și adesea dau gust și palatabilitate alimentelor.
Lipidele acționează ca lubrifianți și izolatori, iar depozitele de grăsime din
țesutul adipos al organismului reprezintă o sursă bogată de energie.
Combinațiile de lipide și proteine au o importanță celulară deosebită, în
special în structurile membranare și, de asemenea, ca mijloc de transport
al lipidelor în sânge. Hormonii steroizi sunt derivați din colesterol și
cantități foarte mici din aceștia exercită efecte fiziologice puternice.
Unitățile structurale majore ale formelor naturale ale lipidelor simple și

complexe sunt acizii monocarboxilici alifatici cu lanț lung. Aceștia au o mare
importanță datorită contribuției lor la caracteristicile fizice și chimice ale
compușilor din care fac parte. În cadrul cercetării structurii unei lipide, poate
fi necesar să se determine nu numai identitatea și cantitatea de acizi grași
prezenți, ci și poziția lor în moleculă.
Cei mai comuni acizi grași de origine vegetală și animală sunt cei liniari
lanțuri cu un număr par de atomi de carbon (de la 4 la 24, dar mai ales 16 și
18) cu o grupare carboxil terminală. Acestea pot fi complet saturate sau pot
conține un
Tabelul 12.1 Exemple de acizi grași saturați cu catenă dreaptă - CnH2 n+ 1.COOH
Numărul de Denumire sistematică Denumire trivială Apariție majoră

atomi de
carbon
n-Dodecanoic Laurie Distribuit pe scară largă.
12 Componentă majoră a unor
uleiuri din semințe
14 n-Tetradecanoic Mystiric Uleiuri din semințe și nuci
16 n-Hexadecanoic Palmitic Cel mai frecvent acid gras saturat din
animale și plante
18 n-Octadecanoic Stearic Foarte frecvente, în special în
lipide complexe
20 n-Eicosanoic Arahidic Ulei de arahide
22 n-Docosanoic Behenic Triacilgliceroli din semințe
24 n-Tetracosanoic Lignoceric Componentă minoră a grăsimilor din
semințe
26 Se găsește în cerebroside
n-Hexacosanoic Cerotic Răspândit ca și componente ale
28 ceară de plante și insecte
n-Octacosanoic Montanic Ceară de plante
Acizii grași impari apar în mod natural, cu un număr de atomi de carbon între 3 și 19. Cei cu
număr de carbon între 15 și 19 sunt prezenți în cantități mari în anumite specii de pești și
bacterii. Acizii grași cu număr par, de la 4 la 10, se găsesc în principal în grăsimile din lapte
și unt.
408 Lipide
sau mai multe (până la șase) legături duble. Se pot găsi, de asemenea, lanțuri
ramificate și structuri mai complexe, în special în cazul acizilor grași derivați
din plante sau microorganisme.
12.1.1. Nomenclatură
Acizii grași au fost denumiți timp de mulți ani sub numele lor banal, iar
acestea sunt încă utilizate frecvent. Nomenclatura sistematică se bazează pe
denumirea acidului gras după hidrocarbura saturată cu același număr de atomi
de carbon, finalul -e fiind schimbat în cazul acizilor saturați în -anoic (tabelul
12.1) și în cazul acizilor nesaturați în -enoic (tabelul 12.2), atomii de carbon
fiind numerotați de la carbonul carboxil. Printr-un sistem mai vechi, carbonul
2 este denumit carbonul a-, carbonul 3 este denumit carbonul ,B, ceilalți atomi
de carbon fiind numerotați în mod corespunzător, carbonul metil final fiind
denumit carbonul w (figura 12.1). Convenția pentru definirea poziției oricărei
legături duble poate folosi simbolul Li cu un număr superscript. Sunt utilizate
pe scară largă și alte versiuni prescurtate, ceea ce poate da naștere la confuzii,
deoarece același compus poate fi scris în diverse moduri (tabelul 12.3).
Tabelul 12.2 Câțiva acizi grași mononesaturați care apar în mod natural
Numărul de Denumire sistematicăDenumire trivialăObservație majoră

atomi de
carbon
cis-5-Dodecenoic Denticetic Bacterii
12 cis-9-Dodecenoic Lauroleic
cis-5-tetradecenoic Fizeteric Bacterii
14 cis-9-Tetradecenoic Myristoleic Bacterii și plante
cis-5-hexadecenoic Plante
16 cis-7-Hexadecenoic Plante, alge, bacterii
cis-9-Hexadecenoic Palmitoleic Foarte răspândit
cis-11-Hexadecenoic Palmitvaccenic Uleiuri
din semințe trans-3-Hexadecenoic Plante
cis-6-0ctadecenoic Petroselenic Plante, uleiuri din semințe
18 cis-9-0ctadecenoic OleicMult răspândit
cis-11-0ctadecenoic cis-vaccenic Bacteria
trans-9-0ctadecenoic Elaidic Grăsimi de animale
rumegătoare trans-11-0ctadecenoic transvaccenic Grăsimi de animale
pentru rumegătoare cis-9-eicosenoic Gadoleic Uleiuri de semințe și
20 de pește
cis-11-Eicosenoic Uleiuri de semințe și de
22 pește
cis-13-Docosenoic Erucic Uleiuri de semințe și de
24 pește
trans-13-Docosenoic Brassidic Uleiuri de semințe și de
pește
cis-15-Tetracosenoic Nervonic Cerebroside cerebrale
Izomerii trans sunt mult mai rari decât izomerii cis. Mulți izomeri poziționali diferiți ai acizilor monoenoici pot fi
prezenți într-un singur lipid natural, iar aceasta nu este o listă completă. Acizii palmitoleic și oleic sunt, din punct de
vedere cantitativ, cei mai comuni acizi grași nesaturați în majoritatea organismelor. Acizii monoenoici cu catenă
impară sunt componente minore ale lipidelor animale, dar sunt mai importanți în unele lipide de pește și bacteriene.
Acizi grași 409
Figura 12.1 Sistemul de numerotare a carbonului din acizii grași. Atomii

de carbon sunt numărați în ordine succesivă, atomul de carbon carboxil fiind
numărul I. În acest sistem, carbonul metil terminal al acidului oleic (octadecenoic)
are numărul 18. Un sistem mai vechi numește acest carbon metilic drept carbon w,
iar atomul de carbon adiacent drept numărul
2. Numerotarea continuă apoi spre carbonul carboxil și se dau valori pentru n
pentru a indica numărul de atomi de carbon de la carbonul w până la eventualele
legături duble. A se vedea tabelul 12.3.
Tabelul 12.3 Nomenclatura acizilor grași
Denumire trivialăAcid oleic Acid linoleic
Numărul de atomi de 18 18
carbon Structura CH/CH2})CH=CH(CH2hCOOH CHiCHz)4 CH=CH.CH2.
CH=CH(CH2 hCOOH
Denumiri sistematice acid cis-9-0ctadecenoic acid cis,cis,-9,12-
Acid (d- )9- 0ctadecadienoic acid (d-)9,12-
0ctadecenoic Acid d9- 0ctadecadienoic acid (d-)9,12-
0ctadecenoic Acid d9- 0ctadecadienoic
0ctadecenoic acid d9-12-0ctadecadienoic
Simboluri *w-9-0ctadecenoic acid acid w-6,9-0ctadecadienoic
Acid *(n-9)-0ctadecenoic Acid (n-6, n-9)-0ctadecadienoic
18: I 18:2
18:1; 9 18:2; 9,12
C 18:1 Cl8:2
d9C 18:1 d9,12Cl8:2
M-18:1 d9,12Cl8:2
M-18:1 d9,12-18:2
18:149 18:249,12
*w-9-18:1 w-6,9-18:2
*18:lw9 18:2w6,9
*9-18:1 6,9-18:2
*18:l(n-9) 18:2(n-6)
* Bazat pe o terminologie mai veche în care numerotarea se face pornind de la carbonul w (gruparea metil terminală)
și n indică numărul de atomi de carbon de la ultima legătură dublă până la carbonul w. O nomenclatură mai
acceptabilă desemnează carbonul carboxi I ca fiind carbonul 1.
410 Lipide
12.2.1 Ceară
Ceara este un ester de acizi grași cu alcooli primari cu lanț lung (figura 12.2).
Acidul gras este, de obicei, cu lanț drept, care poate fi saturat sau mono-
nesaturat, deși, ocazional, se găsesc acizi cu lanț ramificat sau hidroxi. Aceștia
sunt compuși extrem de nepolari și sunt relativ inerți din punct de vedere
chimic, dar pot fi hidrolizați cu ajutorul unui alcalin puternic, cum ar fi
hidroxidul de potasiu, un proces numit saponificare.
Ceara se găsește în secrețiile animalelor și ale insectelor și în pereții
celulari ai unor bacterii. Grăsimea depozitată de animalele marine are o
componentă ridicată de ceară, care formează o rezervă de energie. Ceara este
extrasă și utilizată în comerț la prepararea cremelor, a produselor cosmetice, a
produselor de lustruit, a lubrifianților și a straturilor de protecție pentru
suprafețe.
Figura 12.2 Structura cerii. Structura generală a unei ceruri este prezentată în care n și
mare sunt de obicei între 8 și 18. Este prezentată structura hexadecanoatului de
hexadecanoat de hexadecil (palmitat de cetil), o ceară care se găsește în uleiul de
cașalot. Acesta este un ester al acidului hexadecanoic (palmitic) și al hexadecanolului
(alcool cetilic).
12.2.2 Acilgliceroli
Acilglicerolii sunt esteri ai acizilor grași ai alcoolului trihidric, glicerolul, și
sunt adesea numiți gliceride. Un prefix (mono-, di-, tri-) indică numărul de
acizi grași esterificați la glicerol care, în cazul triacilglicerolilor, sunt aproape
întotdeauna diferiți. Triacilglicerolii sunt probabil cea mai importantă clasă
unică de lipide și sunt componente majore ale grăsimilor și uleiurilor atât la
animale, cât și la plante, în timp ce monoacilglicerolii și diacilglicerolii apar
doar în cantități infime în aceste țesuturi.
Dacă pozițiile 1 și 3 ale moleculei de glicerol conțin acizi grași diferiți,
se creează un centru de simetrie și triacilglicerolul va exista în diferite forme
enantiomorfe. În încercarea de a descrie poziția acizilor grași pe molecula de
glicerol au fost utilizate mai multe sisteme de nomenclatură, dar în prezent se
preferă sistemul de numerotare stereospecific (sn). În acest sistem, care oferă
o descriere neechivocă a derivaților glicerolului, gruparea hidroxil secundară
de pe carbonul 2 al glicerolului este prezentată la stânga în proeictul Fischer,
iar atomul de carbon prezentat deasupra acestuia este numit atunci carbon 1 și
atomul de carbon
Lipide simple 411
unul de mai jos, carbon 3 (figura 12.3). În nomenclatura mai veche,

simbolurile a și a' erau folosite pentru a indica poziția grupărilor hidroxil
primare, iar {3 era folosit pentru a specifica gruparea hidroxilară secundară.
În unii acilgliceroli naturali, unul sau doi dintre acizii grași sunt
esterificați cu un eter alchilic al glicerolului (figura 12.4). Grupa alchil a
acestor l-alchil-2,3-diacil-sn-gliceroli conține, de obicei, 16 sau 18 atomi de
carbon. Se găsesc în principal în uleiul de ficat al animalelor marine și numai
în cantități foarte mici în țesuturile animale și vegetale. Uneori apar împreună
cu un grup înrudit de compuși în care carbonul 1 al glicerolului este legat
printr-o legătură de eter vinilic de o grupare alchil (figura 12.4). Aceste
substanțe, plasmalogenii neu trali, sunt l-alchenil-2,3-diacil-sn-gliceroli.
Acizii grași cu un număr par de atomi de carbon cel mai frecvent
implicați în acilgliceroli sunt: palrnitic, stearic, oleic și linoleic, în timp ce
acizii grași cu număr impar și cu lanț ramificat apar doar rareori.
Acilglicerolii de origine animală conțin în principal acizi grași saturați, deși
multe uleiuri de pește sunt
0
II
H2C-o-c-R1 I. H2COH
IT I I
R2 -C-O--C-C-- 2. HO--C--H
H
Figura 12.3
I W I
H2C -O-C-R3 3. H2COH
sn Nomenclatura
triacilglicerolilor. R1, R2 și
R3 sunt lanțuri acil. 1,2,3-Triacil-sn-glicerol Glicerol
H2C-O- C16H33
I
HO-C-H
I
H2COH
1-Hexadecyl-sn-glicerol (alcool
chimilic)
O H2C-O -C16H33
II I
R2 -C-0-C-H O
I
HzC-o-c-R3
II
l-alchil-2,3-diacil-sn-glicerol
O H2C-0-CH=CH-R1
II I
R2-c-o-C-H
Figura 12.4 I
Eteri glicerilici și esterii
lor. R1 , R2 și R3 sunt I-alchenil-2,3-diacil-sn-glicerol
lanțuri acil. (un plasmalogen neutru)
412 Lipide
foarte bogate în acizi polinesaturați. Acilglicerolii vegetali conțin proporții

ușor crescute de acizi grași nesaturați, mulți dintre aceștia prezentând grade
mai mari de nesaturare. Grăsimile din lapte și unele uleiuri din semințe și nuci
au o proporție mai mare de acizi grași cu lanț scurt (C-4-C-10).
12.2.3 Esteri de sterol

Sterolii sunt compuși care au o structură steroidică (figura 12.5) și care conțin
o grupare hidroxil, care este capabilă să formeze un ester. Ei sunt foarte
răspândiți în natură și există în mod obișnuit sub formă de amestecuri de
sterol liber și esteri cu acizi grași. Colesterolul (figura 12.5) este de departe cel
mai răspândit sterol la animale, o concentrație ridicată fiind întâlnită în creier,
în țesutul nervos și în membrane. Plante
Nucleu de ciclopentanoperhidrofenantren
0
11
R-C-0
Ester de colesterol
Figura 12.5 Ester de colesterol. Colesterolul este un derivat al sistemului de inele

condensate de ciclopentanoper hidrofenantren și, prin urmare, este un membru al
grupului de compuși numiți steroizi. El apare adesea esterificat în poziția 3 cu un acid
gras cu lanț lung, care poate fi saturat sau nesaturat și care conține în mod obișnuit 16
sau 18 atomi de car bon. Steroizii care formează esteri în acest mod se numesc mai
corect steroli.
conțin steroizii înrudiți, /3-sitosterol, ergosterol și stigmasterol (figura 12.6),

dar bacteriile nu pot sintetiza steroli. Multe substanțe importante din punct de
vedere biologic au structuri similare, iar hormonii sexuali steroidieni și
hormonii adrenocorticali, acizii biliari și glicozidele cardiace intră în această
categorie. Diferitele atașări la nucleul steroidului au ca rezultat compuși cu o
gamă largă de acțiuni biologice.
Vitaminele D (figura 12.7) sunt un grup de compuși care derivă dintr-un
nucleu steroidic. Ele sunt implicate în metabolismul calciului și al fosfaților.
Lipide simple 413
Vitaminele active sunt produse prin transformarea provitarninelor de către

lumina ultravioletă. Ergosterolul, un sterol de drojdie, este transformat în
forma sa activă, ergocalciferol (vitamina D2 ), iar 7-dehidrocolesterolul, care
se găsește în multe alimente naturale și este sintetizat și la om, este
transformat în colecalciferol (vitamina D3 ). Uleiurile din ficat de pește sunt
practic singura sursă de vitamina D3 din natură. Forma cea mai activă a
vitaminei D3 este 1,25-dihidroxicolecalciferolul și aceasta este produsă prin
hidroxilarea colecalciferolului la poziția 25 în ficat și apoi la poziția 1 în
rinichi.
26
26 28
25
27
HO
Colesterolul Stigmasterol
HO HO
Figura 12.6 Steroli. ,(>-Sitosterol Ergosterol
HO
D2 Ergocalciferol D3 7-Cholecalciferol
OH
Figura 12.7
Forme active ale
vitaminelor D. 1,25-Dihidroxicolecalciferol
414 Lipide
12.2.4 Vitaminele A, E și K
Carotenii a-, {3- și y, care se găsesc în majoritatea plantelor, sunt provitamine
ale vitaminei A și sunt transformați în alcool vitaminic A (all-trans-retinol),
care se numește de obicei vitamina A1 (figura 12.8), prin scindare oxidativă în
punctul median. Retinolul și esterii săi de acizi grași sunt formele principale
în care este stocată vitamina A la animale și la oameni, iar produsul său de
oxidare, 11-cis-retinal (vitamina A1 aldehidă), este necesar pentru procesul
vizual.
CH20H
All-trans-retinol
Figura 12.8 Vitamina A1 - All-trans-retinol (alcool de vitamina A) este denumit de

obicei vitamina A1 -
Figura 12.9 a-Tocoferol. Aceasta este forma de vitamina E care este cea mai activă din
punct de vedere biologic, tocoferolii /3, -y și o fiind mai puțin puternici.
2-metil-1,4-naftochinonă
0
2-metil-3-fitil-1,4-naftochinonă
Figura 12.10 Forme active ale vitaminei K. Deși 2-metil-1,4-naftochinona are

activitate de vitamina K, cei mai importanți compuși au un lanț izoprenic în poziția 3.
Lipide 415
complexe
Se știe că mai mulți tocoferoli diferiți au activitate de vitamina E, dar a-
tocoferolul, un trimetiltocol (figura 12.9), este cel mai activ din punct de
vedere biologic. Alte forme mai puțin puternice sunt /3-, -y- și 8-tocoferolii,
care conțin mai puține grupe metil. Toți au proprietăți antioxidante, iar o
deficiență are ca rezultat o lipsă de protecție a acizilor grași nesaturați din
fosfo lipidele membranare împotriva oxidării de către oxigenul molecular.
Compușii care prezintă activitate vitaminică K sunt naftochinone
substituite. Compusul părinte, 2-metil-1,4-naftochinona, prezintă o anumită
activitate biologică, la fel ca și alți compuși similari, dar sintetici. Se crede că
producerea formelor complete active în mod natural depinde de adăugarea
unui lanț izoprenic în poziția 3 a inelului aromatic. Diferențele în această
catenă laterală produc diferitele vitamine K (figura 12.10). Un rol fiziologic
extrem de important al vitaminei K este în sinteza factorilor de coagulare a
sângelui, II (protrombina), VII, IX și X.
Lipidele complexe sunt considerate aici ca fiind esteri acilici ai glicerolului

sau ai sfingosinei care conțin, de asemenea, o grupare hidrofilă. Ele sunt
uneori numite lipide conjugate, compuse sau polare. Această din urmă
denumire provine din faptul că toate conțin cel puțin o grupare hidrofilă, ceea
ce conferă moleculei o regiune polară (cap). Cu toate acestea, restul
moleculei este nepolară datorită prezenței lanțurilor hidrocarbonate.
Din cauza suprapunerii terminologiei, este dificil să se împartă aceste
lipide în grupe distincte, dar este convenabil să le clasificăm în funcție de
IJ:"::,.""-'.'.'. -- 1
. y?{ I
.._el Polar cap
r:¥ :
0
:;"" 1
l
1
I
I
I Coadă
nepolară I
I
Un}R1j
------ '
Figura 12.11 Structura fosfogliceridelor. Membrii acestui grup sunt derivați ai
compusului părinte, 1,2-diacil-sn-glicerol-3-fosfat (acid fosfatidic), în care X este un
atom de hidrogen. Acesta este înlocuit fie cu un aminoalcool, fie cu un reziduu
polihidroxilat. În fosfogliceridele derivate din țesuturile animale, R1 este de obicei un
lanț acil saturat cu 16 până la 20 de atomi de carbon, iar R2 este de obicei nesaturat. În
fosfogliceridele din frunze predomină lanțurile acil polinesaturate care conțin 16 sau
18 atomi de carbon, iar cele de origine bacteriană sunt adesea mai complexe.
416 Lipide
gruparea hidrofilă (ester fosfat, carbohidrat sau grup sulfat) și prezența

glicerolului sau a sfingosinei. Într-un astfel de sistem, orice lipid care conține
o grupare fosfat, indiferent de celelalte componente polare, se numește
fosfolipid. În mod similar, un sulfolipid este orice lipid cu o grupare sulfat, în
timp ce un glicolipid conține un carbohidrat, dar nu are grupare fosfat.
12.3.1 Fosfolipide
Fosfolipidele în care gruparea fosfat și acizii grași sunt esterificați în glicerol
se numesc fosfogliceride (glicerofosfolipide sau fosfatide), în timp ce în
fosfingolipide (sfingofosfolipide) alcoolul este sfingosina, un alcool cu lanț
lung.
Fosfogliceride
Acestea reprezintă cea mai frecventă clasă de lipide complexe (figura 12.11)
și conțin un reziduu de acid fosforic (grupa fosfat) și doi acizi grași esterificați
în glicerol. De gruparea fosfat este atașat un aminoalcool, denumit uneori
bază azotată, care poate fi fie serină, colină sau etanolamină sau, uneori,
derivații monometilici sau dimetilici ai etanolaminei (tabelul 12.4). Alternativ,
în locul acestora se atașează un compus polihidroxilat care este fie glicerol, fie
mio-inositol sau unul dintre derivații acestora
Tabelul 12.4 Fosfogliceride cu conținut de azot
Nume Baza azotată* Apariție majoră Observații

+
Fosfatidil -CH2CH2CH2N.( CH3h Foarte abundent în Denumite în mod
obișnuit coline țesuturile animale. lecitine
Se găsește, de
asemenea, în
plante și
microorganisme.
Important în
alveolele
pulmonare
+
Fosfatidil -CH2CH2CH2NH3 Cantități mari în Vechiul nume trivial
este
etanolamine animale, plante cefalină. Metil și
și dimetil
microorganisme etanolamină
apar și derivați
+
Fosfatidil NH3 Larg distribuit De obicei izolat ca
serine I dar în mici săruri cu K+, Ca2 +,
Na+ sau Mg2-
(sau treonină) -CH2 CH.COOH cantități. Este un
important
componentă a
creier și celule roșii
lipide
*Reprezentat prin X în figura 12.11.

Lipide 417
complexe
Tabelul 12.5 Variații structurale ale polihidroxi-fosfogliceridelor
Structura de bază a acidului fosfatidic prezentată în figura 12.11 este modificată

prin înlocuirea diferiților compuși polihidrici în locul lui X
Glicerol
Glicerol x 2
Glicerol-aminoacid
GIycerol-3-fosfat
Mio-inositol
Mio-inositol-4-fosfat Mio-
inositol-4,5-difosfat
(tabelul 12.5). Fosfogliceridele sunt derivați ai acidului glicerofosforic (l,2-

diacil-sn-3-fosfat), care se mai numește și acid fosfatidic.
Diferitele fosfogliceride sunt adesea denumite prin plasarea
constituentului atașat la gruparea fosfat după "fosfatidil", de exemplu,
fosfatidilcolină (3-sn-fosfatidilcolină sau 1,2-diacil-sn-glicerină-3-
fosforilcolină). Există multe fosfogliceride din cauza posibilelor variații ale
lanțurilor de acizi grași, iar atunci când se cunoaște structura chimică
completă, aceasta trebuie utilizată (de exemplu, l-palmitoil-2-oleoil-
fosfatidilcolină). Ar trebui evitată nomenclatura care implică utilizarea
sistemului DL.
Fosfogliceridele sunt buni agenți emulgatori datorită grupului fosfat
polar și a prezenței unui grup atașat la acesta, care poate fi, de asemenea,
încărcat, ceea ce face ca un capăt al moleculei să fie foarte hidrofil, în timp ce
restul moleculei este compus din grupuri hidrofobe mari. Acestea sunt
componente semnificative ale membranelor celulare și ale lipoproteinelor
plasmatice și au, de asemenea, roluri fiziologice foarte importante, inclusiv
prevenirea colapsului alveolelor pulmonare, care este posibilă datorită
proprietăților surfactante ale fosfatidilcolinei, în principal.
Se găsesc și fosfolipide care au structuri similare (tabelul 12.6). Printre
acestea se numără lizofosfolipidele, care au doar una dintre cele două poziții
posibile ale glicerolului esterificat, aproape invariabil la carbonul I, și
plasmalogenii, în care există un eter de vinil cu lanț lung la carbonul I în locul
unui ester de acid gras. Acești compuși conțin, de asemenea, un aminoalcool,
care poate fi fie serină, fie etanolamină, fie colină. Alte fosfolipide mai rare
sunt formele monoacil monoeter, dieter și fosfono.
Fosfingolipide
Sfingolipidele conțin sfingosina, un alcool cu lanț lung, sau unul dintre
derivații săi. Sfiningolipidele care conțin o grupare fosfat, adică fosfosfin
golipidele, sunt denumite în mod normal sfingomieline. Acestea sunt esteri ai
unei ceramide și ai fosforilcolinei (figura 12.12) și sunt denumite ceramide-1-
fosforilcoline. Ceramida este, de obicei, o amidă a unui acid gras și a
aminoalcoolului cu lanț lung, sfingosina (4-sfingenina), deși uneori se găsesc
derivați ai sfingosinei, de exemplu dihidrosfingosina (sfinganina). Acidul gras
poate fi saturat sau monoenoic și este adesea un acid hidroxi.
Sfingomielinele au fost izolate pentru prima dată din creier și țesut
nervos, unde sunt abundente, dar se găsesc și în multe alte țesuturi animale.
418 Lipide
Tabelul 12.6 Variații în structura fosfogliceridelor
Structural Trivial nameStructure Natura

formular comună
aX
Monoacil Lizofosfolipide CH2-0-CO-R1 Serină Etanolamină

I
CH-OH
Colină
I 11
CH2-0-P-O-X
I
Oe
Monoacil, Plasmalogeni CHz-0-CH=CH-R1 Serină Etanolamină
1- I
alchenil CH-0-CO-R2
Colină
I 11
CH2-0-P-O-X
I
Oe Etanolamină Serină
CH2 0-R1
Monoacil, I
CH-O-CO-R2
monoeter
I 11
CH2-0-P-O-X Glicerol
I
Oe Glicerol-3-
CH2 0-R1 fosfat
Dieter H-O-R2
I 11
CH2-0-P-O-X
I Etanolamină
Oe
CH2-0-CO-R1
Fosfonolipide
I
Legătura C H-0-CO-R2
carbon-
fosfor
I 11 $
CH2-0-P-CH2-CH2-CH2-NH 3
I
Oe
R1 și R2 reprezintă lanțuri acil saturate sau nesaturate.
12.3.2 Glicolipide
Glicolipidele pot fi, de asemenea, clasificate în funcție de conținutul de
glicerol sau sfingosină. Cu toate acestea, ultimul grup (glicozfolipidele) are
structuri variate și complexe care necesită o subdivizare în grupuri mai mici.
Lipide 419
complexe
CH3(CH2h2 H
\ /
C=C
/ \
H CH-CH-CH-CH2OH
I I
OH NH2
Sfingosină
CH3(CH2)12 H
\ /
C=C
/ \
H CH-CH-CH-CH2OH
I I
OH NH
r,
t{
t
('
Aceramidă
CH3(CH2)12 H
\c=c/ .
/ \
H CH-CH-CH-CH2O
I I
OH NH
I
C=O
I
R'
O sfingomielină
Figura 12.12 Sfingomieline. Sphingomielinele sunt esteri ai unei ceramide și ai fosfo

rilcolinei. Cu toate acestea, compuși similari sunt ceramidele-1-fosforil etanolamine și
formele fosfono ale sfingolipidelor. Ceramidele (N-acetil-sfingosine) sunt amide ale
unei baze di- sau trihidroxilate cu lanț lung, care conține între 12 și 22 de atomi de
carbon, dintre care sphingo sine (4-sfingenina) este cea mai frecventă, și un acid gras
cu lanț lung, al cărui lanț acil este indicat prin R1 . Acesta poate conține până la 26 de
atomi de carbon.
Glicozil diacetilgliceroli
Aceștia sunt componente majore ale plantelor și microorganismelor, deși cantități
mici pot fi detectate în unele țesuturi animale. Ele conțin glicerol cu doi acizi
grași esterificați în pozițiile 1 și 2 și unul sau mai multe reziduuri de carbohidrați
legați printr-o legătură glicozidică în poziția 3 (figura 12.13). Se numesc 1,2-di-
acetil,3-glicozil-sn-gliceroli. Cei care se găsesc în plante conțin adesea un acid
gras foarte nesaturat și una sau două molecule de galactoză. Glicozil
diacilglicerolii bacterieni conțin adesea un acid gras cu lanț ramificat și până la
patru carbohidrați, care pot include glucoză, mannoză, galactoză, ramnoză și acid
glucuronic.
Glicozipide
Glicozfingolipidele în care o unitate de ceramidă (N-acetil sfingosină) este
legată prin poziția I pe baza lanțului lung fie de glucoză, fie de galactoză se
numesc ceramide monoglicozilice (cerebroside) (figura 12.14). Compușii care
conțin mai mult de un reziduu de carbohidrat trebuie să fie denumiți în mod
corespunzător ca di-, tri- sau tetra-oligoglicozilceramide și nu numiți
420 Lipide
o--cH2
IHI "fl
C-o-c -R2
OH
H2C-o-c-R1
Figura 12.13 Structura glicozildiacilglicerolului. Carbohidratul, care poate fi fie un

reziduu de monosacaridă, fie un reziduu de dizaharidă, este atașat printr-o legătură
glicozidică la poziția sn-3 a glicerolului.
Ceramidă Carbohidrați
Figura 12.14 Ceramide monoglicozilice (cerebroside). R' este un lanț acil. Este
reprezentat reziduul car bohidrat de galactoză, deși acesta poate fi înlocuit cu un alt
hexaze. Se găsesc, de asemenea, ceramide glicozilice care conțin între doi și șase
reziduuri de carbohidrați, dar numai derivații mono sunt denumiți cerebroside.
Monosialogangliozidă (Chu) sau (GaNT1)
/3 /3 /3
Cer-glc (4 - 1 ) gal (4-1) galNAc (3 - I ) gal
0)
NANA
Disialogangliozidă (Gmal sau (GcNT2a)
/3 /3 /3
Cer-glc (4 -1) gal (4-1) galNAc (3 - 1 ) gal
(0NANA
(0 NANA
Figura 12.15 Gangliozidele. Prefixul mono-, di, tri- sau tetra- indică numărul de reziduuri
de acid sialic (acid N-acetil neuraminic, NANA) prezente în moleculă. Numeroasele
gangliozide diferite au structuri complexe și, pentru comoditate, se folosesc notații
prescurtate. Cele mai comune două au fost introduse de Svennerholm, care a numit
compusul "părinte" GM1 , și Wiegnandt, care l-a numit GGNT1- Acest din urmă sistem
oferă suficiente informații pentru ca structurile să poată fi elaborate din forma prescurtată,
odată ce simbolurile au fost învățate. GalNAc reprezintă N-acetil galactosarnina în
structura de mai sus.
Structuri lipidice- 421
proteice
cerebroside. Glicozilceramidele au fost descoperite pentru prima dată în
creier (de unde și denumirea de cerebroside) și acestea conțin în principal
galactoză, în timp ce glu cosidele de ceramide sunt mai frecvente în alte
țesuturi animale și în plante. Cerebrosidele sulfați (sulfatide) se găsesc mai
ales în creier și în acestea o grupare sulfat este atașată la poziția 3 a
galactozei.
Glicozfolipidele care conțin una sau mai multe molecule de acid N-
acetilneuraminic (acid sialic), fiecare legată de unul sau mai multe reziduuri
de carbohidrați dintr-o oligoglicozilceramidă, se numesc gangliozide (figura
12.15). Acestea conțin glucoză, galactoză și N-acetilgalactosamină în
proporții variabile în diferite țesuturi. Ele se găsesc pe suprafața exterioară a
mem branelor celulare, în special a celulelor ganglionare din creier și din
sistemul nervos.
Lipidele sunt rareori prezente în celule sub formă "liberă", cu excepția

rezervelor de stocare, dar se găsesc de obicei în combinație cu proteine sau cu
componentele glucidice ale macromoleculelor. Cele două structuri lipidice-
proteice majore sunt membranele celulare și lipoproteinele plasmatice.
12.4.1 Membrane celulare

Toate membranele biologice conțin cel puțin 25% lipide în asociere cu pro
teine într-o structură complexă și organizată. Mai multe proteine diferite pot fi
prevazute într-o anumită membrană și, în timp ce unele au roluri structurale,
altele au proprietăți enzimatice. Distribuția lipidelor în întreaga membrană
poate fi variabilă, dar se pot face generalizări cu privire la proporțiile și tipul
de lipide prezente. Lipoproteina din teaca de mielină a țesutului nervos
conține aproximativ 80% lipide, în timp ce conținutul de proteine este
semnificativ mai mare în celulele care sunt implicate în metabolismul activ.
Membranele celulelor animale conțin colesterol, fosfogliceride, sfingolipide și
glicolipide. Celulele bacteriene nu conțin colesterol și nici celulele animale,
nici cele bacteriene nu conțin sulfolipide, care se găsesc în concentrații mari
în cloroplaste vegetale împreună cu glicolipidele. În membranele celulelor
animale predomină fosfolipidele, dar proporțiile diferitelor lipide variază
considerabil de la o membrană la alta.
Structura generală este cea a unui strat bistratificat în care secțiunile
hidrofobe ale unei varietăți de lipide sunt orientate spre centrul stratului
bistratificat, iar zonele hidrofile spre mediul apos din interiorul și exteriorul
celulei. În modelul mozaicului fluid acceptat, lipidele au o mișcare laterală în
cadrul structurii.
12.4.2 Lipoproteine plasmatice

Lipoproteinele care circulă în plasma sanguină sunt complexe formate din
diferite proporții de lipide și proteine (tabelul 12.7). Prezența fosfolipidelor și
a proteinelor este cea care face ca aceste agregate să fie hidrosolubile și sub
această formă lipidele, altfel insolubile, sunt transportate în mediu apos între
Tabelul 12.7 Fracțiile lipoproteice plasmatice
Fracțiune Compoziție procentuală în

greutate uscatăLipide de transport rol
0::r (")
>-l
::i. g,::r
"'
C 'l
(1)
"'-
(>
0
(1) 0
.., "' '"g'.
o_f.>.,
(JQ
'<C 'l (1) 0 0

.".t,i
0
. .,
(1)
"'I- t:::
"S. (>
g, M
5-
S&
Q.
"' ) "' "'
Chylomicron 99 80-95 2-6 3-9 ~l Transportul grăsimilor absorbite în intestin către ficat
și țesuturile adipoase (triacilglicerol exogen)
Lipoproteine cu densitate foarte mică 90 40-80 10--40 15-20 5-10 Transportul grăsimilor sintetizate în
ficat (VLDL) (triacetină endogenă!glicerol)
Lipoproteine cu densitate scăzută 78 10 45-50 ~20 20-25 Transportul colesterolului, mai ales
sub formă de ester acil, (LDL) sintetizat în ficat
Lipoproteine cu densitate mare 50 1-5 ~20 ~30 45-55 Transportul colesterolului din
țesuturile periferice către (HDL) ficat pentru catabolism
proteice
țesuturi. Acestea sunt micelare și constau din centre hidrofobe de acilgliceroli
și esteri de colesterol înconjurate de învelișuri hidrofile de proteine și
fosfolipide. Lipoproteinele sunt de obicei grupate în clase pe baza densității
lor (tabelul 12.8). Fiecare clasă include lipoproteine ale căror caracteristici
fizice și chimice și compoziție lipidică sunt similare și ale căror densități,
care sunt legate de raportul lipide : proteine, se încadrează într-un interval
specificat. Variațiile de densitate permit separarea diferitelor clase, chiar dacă
nu complet, prin ultracentrifugare. Metode alternative includ precipitarea cu
diferite săruri și, mai frecvent, electroforeza. Mobilitățile electroforetice sunt
comparabile cu cele ale unor proteine plasmatice (a-, {3- și pre/3-globu line) și
acest lucru a fost folosit în scopul clasificării. Investigarea pacienților cu
suspiciuni de anomalii lipoproteice poate include analiza conținutului de
lipide al unei anumite clase de lipoproteine, de exemplu, nivelul colesterolului
HDL.
Tabelul 12.8 Lipoproteine plasmatice
Fracțiune Intervalul de Rata de flotație Diametrul aproximativ

densitate (gl- Svedberg (Sr)* (nm)**
1)
Chilomicroni <0.95 >400 100-1000
VLDL 0.95-1.006 20---400 3 80

(pre-/3)
LDL 1.006-1.063 20 15-25

( /3)
HDL l.063-1.210 7.5-10.0
(o:)
*A*lb*umin:N > l.281 Cel mai mic

EFA
* Rata de flotare Svedberg (analogă unui coeficient de sedimentare negativ) este viteza cu
care fiecare lipoproteină plutește printr-o soluție de clorură de sodiu cu o greutate specifică
de l,063.
** Diametrele variază foarte mult în fiecare grup și dacă valorile extreme ale fiecărui
grup
au fost date, acestea ar demonstra suprapunerea dintre grupuri.
*** Complexele de albumină și de acizi grași neesterificați (99: l) constituie doar
aproximativ 5% din toate lipoproteinele plasmatice.
Secțiunile 12.1/2/3/4
1. Care este denumirea sistematică a unui acid gras mono-
nesaturat care conține 18 atomi de carbon și o legătură dublă la
carbonul 6?
(a) Acid 5-octadecenoic.
(b) Acid 6-octadecenoic.
(c) Acid 5-octadecanoic.
(d) Acid 6-octadecadienoic.
2. Care dintre următoarele sunt lipide complexe?
(a) Triacilgliceroli.
(b) Fosfogliceride.
(c) Glicerofosingolipide.
(d) Ceară.
424 Lipide
3. Lipidele sunt transportate în plasma sanguină legate de

proteine, în complexe numite lipoproteine.
PENTRU CĂ
lipoproteinele sunt clasificate în funcție de densitatea lor.
4. Triacilglicerolii sunt principala componentă a
grăsimilor animale PENTRU CĂ
triacilglicerinele sunt cunoscute sub denumirea de grăsimi saturate.
Cuantificarea lipidelor poate necesita o etapă inițială de extracție. Aceasta

nu ar trebui să degradeze lipidele și nici să extragă componentele non-
lipidice, cum ar fi carbohidrații, aminoacizii etc. Cerințele individuale vor
dicta cât de riguroasă trebuie să fie orice procedură de extracție și
purificare, dar trebuie luate întotdeauna câteva precauții fun damentale
pentru a minimiza posibilitatea de erori.
În mod ideal, probele din organisme vii ar trebui extrase fără întârziere
pentru a preveni deteriorarea autooxidantă sau enzimatică a constituenților
lipidici. În cazul în care acest lucru nu este fezabil, proba trebuie congelată
imediat și depozitată la -20°C într-un recipient de sticlă sub azot. Adesea,
lipidele vor fi extrase într-un solvent organic, iar în această etapă și în etapele
ulterioare ale procedurii analitice este foarte importantă expunerea minimă a
lipidelor la aer, lumină și căldură pentru a preveni oxidarea sau distrugerea
lipidelor.
Regulile generale care ar trebui, prin urmare, să fie respectate includ
utilizarea unei pături de azot ori de câte ori este posibil și evaporarea
solvenților la temperaturile cele mai scăzute posibil, care nu trebuie să
depășească 50°C. Adăugarea unui antioxidant, cum ar fi butilhidroxitoluenul
butilat (2,6-di-t-butil-4-metilfenol) la solvenții de extracție (0,1 g 1-1) poate fi
necesară pentru a preveni deteriorarea lipidelor nesaturate, dar este esențială
pentru stocarea extractelor lipidice la aproximativ 0,1% din greutatea lipidelor.
Inactivarea enzimelor lipolitice poate fi obținută, de obicei, prin adăugarea
unui alcool, cum ar fi metanol sau, în unele cazuri, izopropanol. Acesta din
urmă este recomandat pentru unele enzime mai stabile care se găsesc uneori
în țesuturile vegetale. Alternativ, planta poate fi scufundată pentru scurt timp
în apă clocotită.
Contaminarea este o problemă majoră în analiza lipidelor și trebuie
evitată utilizarea recipientelor și a dopurilor din plastic, a bidoanelor sau a
tuburilor din cauciuc, precum și a grăsimii de pe robinetele de închidere etc.
Toți solvenții utilizați trebuie să fie de cea mai pură calitate și să nu conțină
peroxid, iar toată sticlăria trebuie să fie curată cu scrupulozitate.
12.5.1 Proceduri de extracție

Lipidele din probe lichide sau suspensii celulare pot fi extrase direct în
solvenți organici, dar probele solide vor necesita un tratament prealabil, cum
ar fi homogenizarea sau ultrasonizarea. Solvenții sunt aleși în funcție de
natura lipidelor prezente și, într-o anumită măsură, de tipul de eșantion, de
exemplu, țesut animal sau vegetal. Etanol-eter dietilic (3 : 1) cu extracție
proteice
ulterioară
într-o hidrocarbură de petrol este utilă pentru lipidele nepolare, dar variațiile
amestecului Folch metanol-cloroform-apă sunt utilizate pe scară mai largă.
Metanolul întrerupe complexele lipidice-proteice din membrană și inactivează
lipazele, iar cloroformul dizolvă lipidele. Se adaugă adesea o soluție de sare
(KCl, NaCl sau CaCl2 ), iar substanțele nelipidice sunt absorbite în această fază
apoasă prin agitare energică. Acestea pot fi îndepărtate în stratul apos superior în
urma centrifugării pentru a separa fazele. Extracția ș i spălarea repetate vor
îmbunătăți izolarea lipidelor necontaminate în stratul inferior de cloroformă, care
pot fi apoi analizate prin metoda aleasă.
12.6.1 Lipide totale

Conținutul total de lipide al unei probe poate fi evaluat gravimetric dacă
lipidele sunt mai întâi extrase și apoi uscate complet până când se
înregistrează o greutate constantă. Pentru rezultate precise, întreaga
procedură trebuie să fie concepută astfel încât să se reducă la minimum
pierderea de lipide în fiecare etapă. Aceasta include utilizarea unor tehnici de
extracție și purificare foarte eficiente în condiții analitice adecvate.
Alte metode, deși sunt mai puțin solicitante din punct de vedere tehnic,
oferă, de asemenea, rezultate îndoielnice, deoarece pot măsura doar anumite
componente lipidice. Astfel, culoarea roz produsă de lipidele nesaturate cu un
reactiv care conține acid sulfuric, acid fosforic și vanilină poate fi utilizată ca
procedeu de screening pentru a evalua conținutul total de lipide fără extracție
preliminară, dar rezultatul nu va reflecta decât conținutul de lipide nesaturate al
probei. Proba se încălzește cu acid sulfuric concentrat și, după răcire, se adaugă
un reactiv fosfovanilină, care conține 1,2 g de vanilină în 1 litru de acid fosforic
80%. Absorbția se citește la 530 nm după 30 de minute și se compară cu
concentrații cunoscute de lipide tratate în același mod. Nu este posibilă o
cuantificare exactă, deși un factor, derivat în funcție de lipidele specifice utilizate
pentru prepararea curbei standard, poate fi util în anumite circumstanțe.
12.6.2 Colesterolul
În multe țesuturi, colesterolul și alți steroli există sub forma unui amestec de
alcool liber și esterul său de acid gras cu lanț lung (esterificat în poziția 3 a
nucleului steroidului). Determinarea conținutului de colesterol al unei probe
poate implica măsurarea oricăreia dintre aceste două fracțiuni în mod
individual sau a colesterolului total. Este posibil să se precipite colesterolul
liber prin adăugarea unui volum egal de digitonină (l g 1-1 în etanol 95%), un
glucozid natural, pentru a forma un complex care este insolubil în majoritatea
solvenților, inclusiv în apă. Metodele chimice de cuantificare a colesterolului
măsoară colesterolul total, adică colesterolul liber și esterificat, astfel încât
trebuie să se preîntâmpine un precipitat de digitonină dacă se dorește
măsurarea colesterolului liber. Metodele enzimatice nu măsoară esterii, iar o
etapă de hidroliză, fie chimică, fie enzimatică (folosind esterul de colesterol
hidrolază, EC 3.l.l.13), este necesar pentru măsurarea colesterolului total.
426 Lipide
Metoda colorimetrică
Reacția colorată a colesterolului și a esterilor de colesterol cu anhidridă acetică
și acid sulfuric concentrat stă la baza metodei atribuite lui Liebermann și
Burchard. Această reacție nu este în întregime specifică pentru colesterol sau
pentru esterii acestuia, deoarece reacționează și alți steroli. În forma sa
originală, reactivul constă din anhidridă acetică, acid sulfuric concentrat și
acid acetic glacial, iar intensitatea culorii verzi este influențată de proporțiile
reactivilor și de cantitatea de apă prezentă. Este posibil să se obțină o creștere
a sensibilității dacă reactivul conține ioni ferici. S-au folosit diferite modificări
ale compoziției reactivilor, iar unele metode sunt fluorimetrice.
Metoda enzimatică
Metodele enzimatice prezintă o acuratețe și o fiabilitate îmbunătățite în
comparație cu procedurile colorimetrice. Testul care utilizează colesterol-
oxidază este analog cu măsurarea glucozei cu ajutorul glucozei-oxidază, dar
nu este complet specific pentru colesterol, iar toți sterolii cu o grupare 3-{3-
hidroxil și o dublă legătură în poziția 4-5 sau 5-6 vor reacționa. Metoda se
bazează pe oxidarea colesterolului în colest-4-ene-3-ona cu producerea
simultană de peroxid de hidrogen. Colesterolul total poate fi determinat dacă
se efectuează o hidroliză preliminară a esterilor. Concentrația produselor de
reacție va fi proporțională cu cantitatea de colesterol prezentă inițial și se
poate măsura oricare dintre acestea. Colest-4-ene-3-one are un maxim de
absorbție la 240 nm, iar concentrația sa poate fi calculată din coeficientul de
absorbție molară, astfel
evitându-se astfel necesitatea unor standarde de colesterol. Abordarea

alternativă constă în măsurarea peroxidului de hidrogen produs și, deși acest
lucru poate fi realizat în diferite moduri, procedura obișnuită utilizează o
peroxidază și un acceptor de oxigen cromogenic:
colesterol
oxidază
colesterol + 0 2 -----4 colest-4-ene-3-one + H202
pH7-8
peroxidază
H202 + 4-aminoantipiren + fenol ---chinonăirnină +
H20
12.6.3 Acilgliceroli
Mono-, di- și triacilglicerolii pot fi măsurați prin determinarea cantității
de glicerol eliberat prin hidroliză. Lipidele se extrag mai întâi în
cloroform-metanol (2:1) și se efectuează saponificarea în condiții care să
nu afecteze legăturile esterilor fosfați, altfel s-ar măsura și glicerolul
provenit din fosfogliceride. Încălzirea la 70°C timp de 30 de minute cu
hidroxid de potasiu alcoolic (0,5 mol I-1 ) s-a dovedit a fi satisfăcătoare.
Cu toate acestea, fosfolipidele pot fi îndepărtate înainte de saponificare,
fie prin extracție, fie prin adsorbție pe acid silicic activat.
Pentru a compensa orice glicerol liber prezent în probă, testul se
efectuează atât înainte, cât și după etapa de hidroliză aleasă, diferența dintre
rezultate indicând glicerolul derivat din acilgliceroli.
428 Lipide
Metoda colorimetrică
Glicerolul poate fi oxidat în formaldehidă de către acidul periodic, iar
formaldehida poate fi măsurată spectrofotometric la 570 nm după reacția cu
acidul cromotropic sau fluorimetric după adăugarea de diacetilacetonă și
amoniac. Reactivul acidului cromotropic constă în acid 8-dihidroxinaftalen-
3,6-disulfonic dizolvat în acid sulfuric 50%.
Metoda enzimatică
Au fost dezvoltate teste enzimatice pentru măsurarea glicerolului și sunt
disponibile kituri comerciale, unele dintre acestea incluzând o lipază
microbiană pentru a efectua hidroliza enzimatică a acilglicerolilor. Într-o
metodă de analiză cuplată, glicerolul kinaza (EC 2.7.1.30) este utilizată pentru
a transforma glicerolul în glicerol-3-fosfat, care este cuplat la oxidarea NADH
cu ajutorul piruvat kinazei (EC 2.7.1.40) și lactat dehidrogenazei (EC
1.1.1.27). Scăderea absorbanței la 340 nm este legată de concentrația de
glicerol și, prin urmare, de cantitatea de acilglicerol prezentă inițial:
glicerol kinaza
glicerol + ATP ----- glicerol-3-fosfat + ADP
piruvat kinaza
ADP + fosfoenolpiruvat ---- piruvat + ATP
lactat dehidrogenază
piruvat + NADH ------- lactat + NAD+
O metodă alternativă utilizează glicerol dehidrogenază (EC 1.1.1.1.6) pentru a

produce NADH. Acesta este măsurat fie prin absorbția sa la 340 nm, fie prin
utilizarea unei diaforeze (EC 1.6.4.3), care catalizează reducerea unui
colorant, p-iodonitro tetrazolium violet (INT), pentru a produce un complex
colorat cu un maxim de absorbție la 540 nm:
+ glicerol dehidrogenază
glicerol + NAD ------- NADH+ dihidroxiacetonă
NADH+ INT diaforază NAD++ INT(H)

lipide
12. 7. 1 Extracția cu solvent

Lipidele pot fi extrase din probe biologice folosind o varietate de solvenți
organici. Un solvent cloroform-metanol este potrivit pentru toate lipidele, dar
este posibil să se extragă selectiv diferite clase de lipide pe baza solubilității
lor în diferiți solvenți organici. Acest lucru se poate realiza prin adăugarea
unui solvent care va efectua fie precipitarea, fie extracția lipidelor de interes.
Un exemplu în acest sens este precipitarea concentrațiilor mari de fosfolipide
cu acetonă rece și uscată, iar în cazul celui de-al doilea, extracția acizilor grași
în eter sau heptan la un pH acid. Cu toate acestea, ca toate procedurile de
extracție cu solvent, acestea nu sunt în întregime specifice.
Împărțirea diferitelor lipide între doi solvenți imiscibili (distribuție în
contracurent) este utilă pentru fracționarea brută a claselor de lipide cu
polarități foarte diferite. Extracțiile repetate într-o pereche de solvenți
aleasă cu grijă sporesc eficacitatea separării, dar în practică se găsesc încă
amestecuri de lipide în fiecare fracțiune. Un sistem eter de petrol-eter-
etanol-apă poate fi utilizat pentru a elimina contaminanții polari (în faza
alcoolică) atunci când interesul constă în analiza ulterioară a gliceridelor
neutre, care pot fi recuperate din faza eterică. Carbon
430 Lipide
tetraclorură-metanol-apă este utilă în analiza lipidelor vegetale pentru a

separa carotenii și clorofilele nepolare de fosfo lipidele și glicolipidele
mai polare. Conținutul de lipide din fiecare fază poate fi monitorizat cu
ușurință cu ajutorul cromatografiei în strat subțire, iar procesul de
extracție poate fi repetat până când se obține separarea dorită.
Tabelul 12.9 Clase de lipide în

ordinea creșterii polarității
Cel mai puțin polar
Hidrocarburi saturate
Hidrocarburi nesaturate
Esteri de ceară
Esteri sterilici
Aldehide cu lanț lung
Triacilgliceroli
Alcooli cu lanț lung
Acizi grași liberi
Chinone
Steroli Diacilgliceroli
Diacilgliceroli
Monoacilgliceroli
Cerebroside
Glicozil diacetilgliceroli
Sulfolipide
Glicerofosfatide acide
Fosfatidil etanolamină
Lecitină
Sphingomielină
Lizolecitină
Cele mai multe polare
12. 7.2 Tehnici de coloană

Cromatografia de adsorbție pe o coloană de acid silicic (silicagel) poate fi
utilizată pentru a separa amestecuri de lipide la scară pregătitoare. Alte
adsorbanți alternativi sunt Florisil (silicat de magneziu), Florisil spălat cu
acid sau alumina, care prezintă avantaje în anumite cazuri, de exemplu
Florisil este util pentru izolarea glicolipidelor. Gradul de separare obținut
în general va depinde de mulți factori, inclusiv de complexitatea
amestecului de lipide, de dimensiunile coloanei, de tipul de adsorbant
utilizat și de alegerea solvenților de eluare. Tehnicile în strat subțire pot fi
utilizate pentru a purifica în continuare fracțiunile colectate și sunt utile
pentru a monitoriza compoziția efluentului coloanei.
Lipidele sunt legate de particulele fine ale adsorbantului de către
particule polare, ionice
și forțele van der Waals, cele mai polare fiind ținute cel mai strâns, iar
separarea are loc în funcție de polaritățile relative ale lipidelor individuale
(tabelul 12.9). De obicei, lipidele se eluează de pe coloană cu solvenți de
lipide
polaritate crescândă, atunci când lipidele cele mai puțin polare vor apărea în
primele fracturi. Solvenții și ordinea în care sunt utilizați vor fi dictate de
componentele probei. Separarea inițială a unui amestec divers în cele trei
grupe mari de lipide neutre, glicolipide ș i fosfatide poate fi efectuată
utilizând o secvență de solvenți cloroform-acetonă-metanol. Fracțiunile
colectate pot fi apoi separate în componentele lor individuale prin tehnici pe
coloană sau în strat subțire pregătitoare.
Coloanele de acid silicic pot fi utilizate pentru separarea amestecurilor
de lipide neutriale prin eluție cu hexan care conține proporții crescânde de
eter etilic ( 100%). Lipidele sunt eluate în următoarea ordine:
Hidrocarburi Esteri
de colesterol
Triacilgliceroli
Acizi grași liberi
Colesterol
Diacilgliceroli
Monoacilgliceroli.
Probele bogate în glicolipide și sulfolipide (de exemplu, extractele de
plante) pot fi separate prin eluarea glicolipidelor cu cloroform-acetonă (1:1),
urmată de sulfolipide cu acetonă. Fracționarea extractelor care conțin
concentrații ridicate de mai multe fosfolipide (de exemplu, țesuturi animale)
se poate realiza folosind cloroform la care s-au adăugat proporții din ce în ce
mai mari de metanol (95:5 până la 50:50), rezultând următoarea secvență
tipică:
Acid fosfatidic Fosfatidil
etanolamină Fosfatidil serină
Fosfatidil colină Fosfatidil
inositol Sfingomielină.
Cromatografia pe bază de celuloză schimbătoare de ioni cu DEAE
(dietilaminoetil) sau TEAE (trietilaminoetil) este o tehnică utilă pentru
separarea lipidelor complexe pe scară largă, prima având cea mai largă
gamă de aplicații. Aceasta poate fi utilizată uneori după cromatografia cu
acid silicic a lipidelor totale pentru a separa lipidele care sunt eluate
împreună,
de exemplu, fosfatide și glicolipide sau glicolipide și sulfolipide.
Separarea are loc în principal pe baza schimbului de ioni al acestor lipide
cu grupe ionice, deși grupele polare neionice, de exemplu hidroxilul,
exercită de asemenea o influență datorită adsorbției de către celuloză.
Celuloza DEAE se utilizează sub formă de acetat, iar lipidele încărcate,
neionice (de exemplu, fosfatidil etanolamina sau colina, sfingomielina,
cerebroside) sunt eluate cu cloroform care conține proporții variabile de
metanol. Lipidele slab acide (de exemplu, fosfatidil serina) pot fi eluate
cu acid acetic glacial, iar lipidele puternic acide sau foarte polare (de
exemplu, fosfatidil glicerol, fosfatidil inositol, sulfatide și sulfolipide) pot
fi eluate cu cloroform-metanol care conține acetat de amoniu și amoniac
diluat.
432 Lipide
12. 7.3 Cromatografie în strat subțire

Plăcile de silicagel în strat subțire pot fi utilizate pentru a separa lipidele la
scară pregătitoare sau analitică. Acestea sunt uneori utilizate pentru a
fracționa lipidele în clase înainte de a fi îndepărtate de pe placă și de a fi
analizate ulterior prin GLC. În acest caz, zona corespunzătoare de silicagel
este îndepărtată și lipidele sunt extrase în cloroform sau eter dietilic cu 1-2%
metanol pentru lipidele simple sau în cloroform-metanol-apă (5 : 5 : 1) pentru
lipidele polare.
Polaritatea lipidelor determină gradul de adsorbție pe siliciu, cele mai
polare fiind cele mai puternic reținute. Mobilitatea lipidelor în timpul
cromatografiei va fi afectată de polaritatea solventului, iar solvenții din ce în
ce mai polari vor rupe legăturile de adsorbție cu mai multă eficiență, ceea ce
va duce la valori mai mari ale RF. În cazul în care proba conține compuși cu
polarități foarte diferite, un anumit solvent poate fi capabil doar să separe
lipidele în clase generale, de exemplu, acizi grași, acilgliceroli, colesterol,
fosfolipide. Poate fi posibilă separarea componentelor unor astfel de grupe
printr-o selecție atentă a solvenților.
Dezvoltarea dublă în aceeași direcție, folosind același solvent sau doi
solvenți diferiți, ajută uneori la separarea lipidelor nepolare. Cu toate acestea,
tehnicile bidimensionale sunt adesea necesare pentru a rezolva amestecuri de
lipide polare complexe (de exemplu, fosfolipide, glicolipide, sfingolipide).
Aceasta implică efectuarea cromatografiei într-un solvent și, după ce se usucă
placa și se rotește la 90°, se trece în alt solvent.
Gelul de silice G conține un liant, sulfat de calciu, care îl ajută să adere
la placă, dar gelul de silice H nu conține și este preferabil pentru anumite
separări de lipide, în special pentru amestecuri polare. Unele plăci preparate în
comerț conțin un liant organic alternativ care nu interferează în același mod ca
și sulfatul de calciu, dar care poate prezenta unele dificultăți cu metodele de
localizare, în special cu carbonizarea. Gradul de hidratare a adsorbantului și
dimensiunea particulelor vor influența separarea și, deoarece acestea nu pot fi
garantate, standardele autentice ar trebui să fie întotdeauna rulate în același
timp cu probele.
Nitratul de argint poate fi încorporat în suspensia de adsorbant (25 g 1-1
), ceea ce dă o concentrație finală de aproximativ 5% în placa uscată. Ionii de
argint se leagă în mod reversibil de legăturile duble din compușii nesaturați,
ceea ce duce la un retard selectiv, iar lipidele sunt separate în funcție de
numărul și configurația (cis sau trans) a legăturilor duble. Această tehnică este
extrem de utilă pentru analiza acizilor grași, a mono-, di- și în special a
triacilglicerolilor, când se pot rezolva chiar și izomerii poziționali. Ioni de
borat pot fi, de asemenea, încorporați în gelul de silice, iar aceste plăci sunt
utilizate pentru a separa compușii cu grupe hidroxil libere adiacente.
Lipide nepolare
Se folosesc în mod obișnuit diverse combinații de hexan sau eter de petrol
(40-60°C, bp) și eter dietilic, de obicei cu o cantitate mică de acid acetic (de
exemplu, 90: IO: 1) sau eter diizopropilic și acid acetic (98,5: 1,5).
Mobilitatea cea mai mare este demonstrată de esterii de colesterol, urmați de
triacilgliceroli, acizi grași liberi, colestorol, diacilgliceroli și monoacilgliceroli,
lipidele polare complexe rămânând nemișcate. Dezvoltarea dublă în doi
solvenți, de exemplu diizopropil
lipide
eter-acetic (94: 4), urmat de acid hexan-eter dietilic-acetic (90: 10).
: 1) sau dietil eter-benzen-etanol-acid acetic glacial (40 : 50 : 2 : 0,2),
completat cu dietil eter-hexan (6 : 94) poate îmbunătăți calitatea separării.
Acizi grași
Doar o proporție foarte mică de acizi grași sunt prezenți în formă liberă,
neesterilizată, iar marea majoritate sunt componente ale altor lipide. Cu toate
acestea, este important să se poată măsura și identifica acizii grași liberi
prezenți în oricare dintre forme și, pentru aceasta, ei trebuie mai întâi extrași
într-un solvent organic și apoi, de obicei, transformați în esterul lor metilic.
Cea mai simplă metodă de metilare, care se aplică atât acizilor grași
esterificați, cât și celor neesterificați, constă în încălzirea probei de lipide timp
de 2 ore sub un curent de azot la 80-90°C cu acid sulfuric 4% în metanol.
După răcire și adăugarea de apă, esterii metilici rezultați se extrag de mai
multe ori în hexan, iar extractele combinate se usucă pe carbonat de sodiu și
sulfat de sodiu anhidru. Fracția de solvent se reduce apoi în volum cu un
curent de azot.
Metilarea acizilor grași din acilgliceroli se poate obține prin dizolvarea
probei în diclorometan și încălzirea la 50 °C cu metox ide de sodiu în metanol
într-un flacon cu dop timp de 15 minute. Acest proces are ca efect atât eliberarea
acizilor grași din acilglicerol, cât și metilarea acestora. Este cunoscut sub numele
de transesterificare. După acidificarea cu acid acetic glacial și diluarea cu apă,
esterii metilici ai acizilor grași se extrag în eter dietilic. Extractul se spală cu o
soluție de bicarbonat de sodiu (20 g 1-1 ), se usucă și se reduce volumul cu azot.
Acizii grași liberi nu sunt metilați prin această procedură.
O procedură alternativă presupune eliberarea acizilor grași prin
hidroliză de alchimie (saponificare) prin refluxarea probei extrase cu hidroxid
de potasiu diluat în alcool timp de 1 h. După răcire, adăugare de apă și
acidificare, acizii grași sunt extrași în eter dietilic. Esterii metilici pot fi apoi
preparați prin tratare cu diazometan, care poate fi, de asemenea, utilizat direct
pe acizii grași liberi. Saponificarea este mai puțin satisfăcătoare, deoarece este
o procedură de lungă durată și duce adesea la pierderea componentelor
lipidice.
Cromatografia în strat subțire de argentație este o procedură extrem de
utilă pentru separarea esterilor metilici ai acizilor grași. Acizii grași saturați au
cele mai mari valori RF, care scad odată cu creșterea gradului de nesaturare,
iar pentru un anumit acid, izomerul trans se deplasează de obicei înaintea
izomerului cis corespunzător. Solvenții cel mai frecvent utilizați conțin hexan
și eter dietilic (9 : 1), deși se folosește un amestec de 4 : 6 pentru a separa
compușii cu mai mult de două legături duble. Pentru a separa izomerii
poziționali ai aceluiași acid, condițiile trebuie să fie controlate cu atenție și
este adesea necesară dezvoltarea multiplă în toluen la temperaturi scăzute.
Acilgliceroli
O gamă largă de mono-, di- și triacilgliceroli pot fi separați pe plăci de silice
cu nitrat de argint folosind un solvent cloroform-acid acetic (99 : 0,5) (figura
12.16). Pentru amestecurile de monoacilgliceroli și diacilgliceroli, plăcile
impregnate cu borat oferă o rezoluție mai bună, iar un solvent cloroform-
acetonă (96 : 4) poate fi utilizat pentru a separa monoacilglicerolii de
diacilgliceroli, izomerii 1,2 de izomerii 1,3 și izomerul 1 de izomerul 3 în
434 Lipide
s s s
s 0 s
0 s s
Triacilgliceroli
s L s
L s s
0 0 0
0 0 -
} Diacilgliceroli
0 - 0
s
} Monoacilgliceroli
0
SOLVENT
cloroform: acid acetic
(99:0,5)
Figura 12.16 TLC cu nitrat de argint a acilglicerolilor. S, 0 și L desemnează acizii

grași din fiecare compus.
S, stearil, 18 : 0
0, oleoil, 18: 149
L, linoleil, 18: 249-12
O rezoluție și o mobilitate îmbunătățite ale amestecurilor de monocilgliceroli și
diacilgliceroli pot fi obținute folosind un solvent cloroform-acetonă și plăci impregnate
cu borat.
monoacilgliceroli. Se pot obține rezultate confuze din cauza migrației acililor

care are loc în timpul extracției, chiar dacă se are grijă să se evite utilizarea
căldurii și a solvenților alcoolici. Producerea derivaților de acetat previne
migrarea acizilor și permite totuși separarea în mod obișnuit.
Triacilglicerolii pot fi separați într-un mod similar pe plăci impregnate
cu nitrat de argint, dar pot fi necesari solvenți diferiți pentru a rezolva
amestecuri care conțin compuși cu un număr foarte diferit de legături duble.
Solvenți cum ar fi hexan-eterul dietilic (80:20) sau cloroformul-metanol
(99:1) se pot aplica atunci când sunt prezente până la patru legături duble, în
timp ce solvenți mai polari, de exemplu eterul dietilic sau cloroformul-
metanol (96:4) sunt necesari pentru grade mai mari de nesaturare și chiar
cloroformul-metanol-apă (65:25).
: 4) pentru cei puternic nesaturați, adică cu 6 până la 12 duble legături (figura
12.17).
Lipide complexe
Este dificil să se separe gama largă de lipide complexe într-un singur sistem
de solvenți, dar sarcina este simplificată dacă proba a fost deja parțial
purificată (de exemplu, printr-o tehnică pe coloană) și dacă este prezentă doar
o singură clasă de lipide. Chiar și așa, este adesea necesar să se efectueze o
cromatografie bidimensională, iar gelul de silice fără liant este adesea
preferat.
Amestecurile de fosfogliceride pot fi separate cu ajutorul unui amestec
cloroform-metanol-apă, ale cărui proporții pot fi variate în funcție de
constituenții probei (de exemplu, 65 : 25 : 4). Uneori se include acetona în
solvent și se pot folosi plăci impregnate cu nitrat de argint. Acidul acetic (1-4%)
lipide
este, de asemenea, un aditiv util pentru a efectua separarea fosfogliceridelor
neutre.
436 Lipide
Triacilgliceroli cu
până la patru mai mult de patru

legături legături duble
duble
sss
SSM
SMM
t MDD&SMT
MMT MMT
S SD cso
MMM
. V)
DOD
SMD "ii '
SDT&MDT
MMD ..us
l
SOD DDT
cloroform: cloroform: metanol

SOLVENT
metanol (99: I) (96:4)
Figura 12.17 TLC cu nitrat de argint a triacilglicerolilor.

S, acid gras saturat M,
acid gras monoenoic D,
acid gras dienoic
T, acid gras trienoic
Triacilglicerolii cu un număr total similar de legături duble pot fi separați cu ajutorul unui
solvent de cloroform-metanol. Proporțiile de solvent sunt ajustate pentru a obține rezoluția
compușilor cu un total de până la patru duble legături sau mai mult de patru.
Tabelul 12.10 Procedee de colorație distructivă
Reactiv Metoda Observații
30-50% acid sulfuric în Pulverizați placa și încălziți-o la Detectează toate lipidele prin
apă (v/v) 180°C pentru carbonizarea materiei organice,
5 min. pe o plită fierbinte sau producând zone carbonizate de
30 min. în cuptor culoare neagră. La temperaturi mai
scăzute (-80°C), sterolii dau o
Acid cromic culoare roșu-violet.
6g1-1 dicromat de potasiu Pulverizați placa și încălziți-o la
în acid sulfuric 55%. 180°C pentru Toate lipidele dau pete negre carbonizate
5 min. pe o plită fierbinte sau
Acid ortofosforic 50% în 30 min. în cuptor
apă
După pulverizare, se încălzește pe Toate lipidele dau pete negre carbonizate
o placă fierbinte la 300°C timp
de 5 minute.
din fosfogliceride acide (fosfatidil serină și fosfatidil inositol). Alte modificări

care pot îmbunătăți calitatea separării includ adăugarea de carbonat de sodiu sau
de sulfat de amoniu la prepararea silicagelului sau îndepărtarea preliminară a
lipidelor simple din partea superioară a plăcii prin trecerea acesteia în
solventul acetonă-hexan (l : 3). În cazul în care extractul este bogat în
fosfogliceride acide, este preferabil să se utilizeze un solvent care să conțină
amoniac.
lipide
Tabelul 12.11 Exemple de pete nedistructive
Reactiv Metoda Observații
Vapori de iod Se introduce placa uscată În câteva minute apar pete de

într-un vas sigilat care culoare galben-maronie închisă,
conține câteva cristale de acolo unde lipidele au absorbit
iod. iodul.
Lipidele nesaturate sunt mai
intens colorate. Glicolipidele nu se
colorează semnificativ
Rodamină 6G
(0,lgl-1în Pulverizarea sau imersia Un colorant versatil pentru toate
apă) plăcii și vizualizarea sub clasele de lipide. Pete roz-violet-
lumină UV roșu. Cel mai util cu solvenți
alcalini. Colorantul poate fi
2',7'- încorporat în placă
diclorofluo
resceină Pulverizarea sau imersia Nu detectează fosfolipidele sau
(1-2 g 1-1) plăcii și vizualizarea sub glicolipidele. Alte lipide dau pete
în etanol lumină UV galbene pe fond violet. Util pentru
95%) solvenți acizi. Colorantul poate fi
încorporat în placă
Apă Petele opace apar pe un fundal

translucid. Nu este foarte
Pulverizați placa pentru a o sensibilă și se aplică numai la
satura lucrările pregătitoare.
În cazul în care sunt prezente atât fosfogliceridele, cât și

glicolipidele, se folosesc de obicei tehnici bidimensionale, dar este
posibilă rezolvarea mem brilor din ambele clase folosind un amestec de
diizobutilcetonă-acid acetic-apă (40 : 25 : 5). Un solvent compus din
acetonă, acid acetic și apă (100 : 2 : 1) va separa mono- și di-
galactoziligliceridele, care sunt deosebit de abundente în extractele de
plante, de fosfogliceride, care rămân la origine.
Au fost descrise multe combinații de solvenți pentru obținerea de soluții
bidimensionale.
și, în general, dacă se alege un solvent alcalin sau neutru pentru prima
dimensiune, cel de-al doilea solvent trebuie să fie acid. De asemenea, se poate
folosi ca unul dintre solvenți să conțină acetonă, ceea ce va spori mișcarea
glicolipidelor în raport cu fosfogliceridele. Acidul acetic nu ar trebui să fie
utilizat în primul solvent, deoarece este dificil de îndepărtat complet și
afectează calitatea separării în a doua dimensiune. Dificultăți se întâlnesc, de
asemenea, în eliminarea butanolului, care interferează cu procesul de
carbonizare folosit adesea pentru localizarea petelor.
Detecție și cuantificare
Lipidele pot fi vizualizate pe plăci în strat subțire cu ajutorul unei colorații
generale, dar acest lucru nu indică de obicei natura lipidelor prezente. Multe
dintre acestea sunt distructive (tabelul 12.10), iar lipidul nu poate fi analizat
mai departe după eluzierea de pe placă, dar alte coloranți sunt nedistructivi
(tabelul 12.11). Există
"'
438 Lipide
Separarea amestecurilor de lipide
437
Tabelul 12.12 Reactivi specifici de localizare
Reactiv Lipide detectate Comentarii
Orcinol-acid sulfuric Glicolipide Se încălzește placa la I 20°C.

2 g de orcinol într-un litru de acid sulfuric Pete albastru-violet pe fond alb. Aproximativ
75%. 10 minute
Glicolipide Se încălzește placa la I 20°C.

a-naftol Pete albastru-violet. Alte lipide polare dau
5 g 1-1 a-Nafol în metanol: apă (1:1). Se pete galbene, iar colesterolul dă un
pulverizează placa, se usucă la aer și se pata gri-roșie
aplică un nou strat de vopsea cu acid
sulfuric 95%. Glicolipide Fosfatidilglicerolul dă o pată purpurie
Fosfatide aproape imediat, iar fosfatidiliositolul o
Periodate-Schiff cu o grupare pată galbenă după aproximativ 40 de
Se pulverizează cu 10g1-1 periodat de hidroxil minute. Glicolipidele dau pete albastre,
sodiu. Se lasă timp de 10 minute pentru vicinală intensitatea crescând până la 24 de ore.
oxidare. Se îndepărtează excesul cu
dioxid de sulf. Când placa este incoloră,
se pulverizează cu 10 g de 1-1
p-rosanilină HCI în apă decolorată în
prealabil prin saturație cu dioxid de sulf Pete roșii-portocalii în câteva minute cu
Colină încălzire ușoară
Pata DragendortT care conține
A. Iodură de potasiu 400 g 1-1 în apă.
B. Subnitrat de bismut 17 g 1-1 în
acid acetic 20%.
Amestecați A și apă Band (1:4:15) imediat
înainte de utilizare. Petele purpurii apar cu fosfatidil
Care conțin etanolamină și fosfatidil serină, de
Ninhidrină grupe amino exemplu, după încălzirea la 100°C.
2 g 1-1 în acetonă libere
Petele albastre apar imediat
Albastru de molibden Care conțin fosfor

Molibdat de sodiu 100 g 1-1 în 4 luni! 1-1
HCI. Hidrazină HCI 10 g 1-1 în apă. Se
amestecă 100 ml din fiecare și se
încălzește în apă clocotită timp de 5 Compușii care conțin reziduuri de acid sialic
min. Se răcește și se diluează până la 1 Gangliozide reacționează pentru a da pete albastru-
litru violet. Alte glicolipide dau pete galbene
Resorcinol
A. 20 g 1-1 resorcinol în apă
B. HCI concentrat
C. 0.1 mo! 1-1 sulfat de cupru Se încălzește la 100°C. Colesterolul apare sub
D. Apă Colesterolul și formă de
Amestec A,B,C,D (10:80:0,5:10) esterii săi o pată roșie-violetă în câteva minute, urmată
de esteri. Continuarea încălzirii
Reactiv acid de clorură ferică acidă provoacă carbonizarea tuturor lipidelor
0,5 g de clorură ferică, 5 ml de acid
acetic glacial și 5 ml de acid sulfuric
concentrat în 1 litru de apă.
438 Lipide
sunt reactivi specifici care vor reacționa cu una dintre grupele chimice din
lipide (tabelul 12.12), de exemplu, ninhidrina pentru lipidele care conțin o
grupare amino liberă.
În unele cazuri, cuantificarea sau cel puțin compararea proporțiilor
lipidelor separate poate fi posibilă prin scanarea directă a plăcii prin
densitometrie de reflectanță, de exemplu, după carbonizare. Alternativ, pata
poate fi răzuită de pe placă, iar culoarea sau fluorescența soluției eluate poate
fi măsurată. Compușii eluați pot fi supuși unei analize ulterioare, de exemplu
prin GLC, pentru a permite cuantificarea sau identificarea. Pentru a obține
rezultate fiabile și semnificative, standardele cunoscute trebuie să fie
întotdeauna analizate în condiții identice, din cauza variației de culoare în
cazul diferitelor lipide. Chiar și așa, rezultatele obținute prin metode diferite
vor varia adesea.
12. 7 .4Cromatografie gaz-lichid

Cromatografia gaz-lichid este o tehnică foarte utilă în analiza lipidelor, în
special pentru separarea compușilor foarte asemănători în cadrul unor clase.
Din cauza variațiilor mari de structură și de proprietăți între clase, nu este de
obicei posibil să se rezolve membri ai diferitelor clase pe aceeași coloană.
GLC este utilă atât pentru analiza cantitativă, cât și pentru analiza calitativă și,
de asemenea, pentru investigarea structurii lipidelor.
Cu toate acestea, analiza structurală completă a unui lipid va necesita
adesea o analiză suplimentară a efluentului coloanei colectate pentru un
singur vârf GLC. Spectroscopia în infraroșu și RMN și spectrometria de masă
sunt toate tehnici utile care vor oferi informații în scopul identificării, inclusiv
poziția și configurația eventualelor legături duble.
Acilgliceroli
Acilglicerolii pot fi separați sub formă de molecule intacte prin GLC, după ce
au fost preparați cu derivați de acetat sau de trimetilsililil (TMS) pentru a
reduce polaritatea și a preveni migrarea acililor. Acetilarea poate fi efectuată
la temperatura camerei prin adăugarea unei soluții de anhidridă acetică în
piridină (5 : I). După ce se lasă reacția să aibă loc peste noapte, excesul de
reactiv se elimină cu un curent de azot și se încălzește ușor. Derivații de TMS
pot fi preparați prin tratare cu un exces de N,O-bis(trimetilsilililil) acetarnidă
(10% v/v în hexan) sau cu un amestec de hexametildisilazan și
trimetilclorosilan în hexan. Sililarea este completă în câteva minute la
temperatura camerei.
Derivații de eter TMS ai monoacilglicerolilor sunt suficient de volatili
pentru a fi analizați pe o coloană de poliester (de exemplu, EGA, PEGA), care
permite separarea pe baza lungimii lanțului și a gradului de saturație a
componentei de acid gras. Cu toate acestea, pentru diacetilgliceroli și
triacilgliceroli este necesară o fază staționară de silicon nepolară (de exemplu,
SE-30, OV-1), care este stabilă termic până la 350 °C. Compușii sunt separați
numai în funcție de numărul total de atomi de carbon din acizii grași prezenți,
cunoscut sub numele de numărul de carbon, iar cei care diferă cu doi în
numărul de carbon pot fi separați. Temperatura necesară pentru separarea
diacetilglicerolilor este de aproximativ 270-310°C, cu o programare a
temperaturii între 2 și 4°C pe minut (figura 12.18). Poate fi necesară o
lipide
temperatură mai ridicată pentru triacilgliceroli, în timp ce monoacilglicerolii,
care pot fi, de asemenea, analizați pe aceste coloane, necesită temperaturi
mult mai scăzute.
440 Lipide
Analiza calitativă poate implica identificarea unei molecule de acilglicerol

intacte sau poate fi un studiu al compoziției și structurii acesteia. GLC este
deosebit de utilă în special pentru investigarea acizilor grași prezenți într-un
triacilglicerol și a poziției lor în moleculă. Hidroliza chimică poate fi utilizată
pentru a elibera toți acizii grași, în timp ce enzima lipaza pancreatică (EC
3.1.1.1.3) va hidroliza, în teorie, numai acizii grași esterificați în pozițiile I și 3,
lăsând 2-monoacilglicerolul. În practică, în cele din urmă are loc hidroliza la
poziția 2, iar procedeul trebuie controlat cu atenție, altfel se vor obține rezultate
înșelătoare. În mod similar, sunt disponibile și fosfolipaze specifice, care desfac
o legătură particulară dintr-un fosfolipid, permițând analiza unui component
individual.
Esteri de ceară
Esterii de ceară au mase moleculare relative similare cu cele ale
diacetilglicerolilor și sunt eluate în condiții comparabile de cromatografie în
fază gazoasă. Alternativ, fracțiunile alcool și acid gras pot fi eliberate prin
saponificare, iar esterii metilici ai acestora pot fi supuși cromatografiei în fază
gazoasă.
Esteri de colesterol
Acestea pot fi analizate cu ajutorul coloanelor aplicabile pentru triacilgliceroli.
Cu ajutorul programării temperaturii, poate fi posibilă separarea compușilor
care diferă
Hexanoat
de
colesterol
Clase de
diacilglicerol
Figura 12.18 GLC a diacetilglicerolilor. Reprezentarea schematică a separării

derivaților trimetilsililici ai diacetilglicerolilor pe o fază staționară SE-30 cu
lipide
programare a temperaturii. Hexanoatul de colesterol este standardul intern.
442 Lipide
cu un singur atom de carbon, în timp ce analiza izotermă va rezolva în mod

normal compușii cu același număr de atomi de carbon, dar care conțin acizi
grași cu grade diferite de nesaturare. Aceste coloane se pot aplica, de
asemenea, la analiza glicosiligliceridelor.
Acizi grași
De obicei, acizii grași se transformă în derivați de metil ester înainte de a fi
separați prin GLC, deși este posibil să se analizeze acizii grași cu catene
scurte (de la doi la opt atomi de carbon) ca acizi grași liberi. Se pot utiliza
faze staționare polare sau nepolare, iar coloanele capilare (tubulare deschise)
sau SCOT separă izomerii poziționali și geometrici. Izomerii cis au timpi de
retenție mai scurți decât izomerii trans corespunzători pe o fază nepolară și
invers pe o fază polară.
Coloanele nepolare au fie hidrocarburi parafinice saturate
(unsoare Apiezon) sau unsoare de silicon ca fază lichidă. Unele unsori
siliconice adecvate includ SE-30, OV-101, JXR 9 (toate metil-siliconi) și OV-
1 (dimetil-siliconi). Separarea are loc în mare parte pe baza masei mol eculare
relative (lungimea lanțului), iar aceste unsori sunt utile pentru separarea
amestecurilor de acizi grași saturați, de obicei pe cale izotermă. Cu toate
acestea, ele pot face diferența între componentele saturate și nesaturate cu
aceeași lungime de lanț, acizii nesaturați având timpi de retenție mai scurți
decât acizii saturați corespunzători, așa cum se întâmplă și în cazul
structurilor cu lanțuri ramificate în comparație cu cele cu lanțuri drepte.
Tabelul 12.13 Faze staționare polare pentru GLC a acizilor grași (esteri
metilici)
Polaritate Faza staționară
Foarte polar EGS Succinat de etilenglicol

DEGSSuccinat de etilenglicol
EGSS-XCopolimer de EGS cu silicon metilic
Polaritate medie EGA Adipatul de etilenglicol
BDSButanediol succinat
EGSS-YCopolimer de EGS cu o proporție mai mare de
silicon metilic decât EGSS-X
Polaritate NPGS Succinat de neopentilglicol
scăzută EGSP-ZCopolimer de EGS și fenil silicon
Fazele lichide ale coloanelor polare sunt, de obicei, polimeri

termorezistenți de etilenglicol și acizi dibazici, succinic sau adipic (tabelul
12.13). Acizii grași sunt separați atât pe baza lungimii catenei, cât și a
gradului de nesaturare, iar unele coloane sunt capabile să rezolve acizii grași
cu aceeași lungime a catenei, dar cu număr diferit de legături duble ( ).
acizii grași saturați prezintă cei mai scurți timpi de retenție, urmați de cei
monoenoici, dienoici etc. (figura 12.19).
În unele cazuri, este posibil să se identifice un compus necunoscut
cu un anumit grad de certitudine, demonstrând că acesta are un timp de
retenție identic cu cel al unui acid gras cunoscut. Cele două substanțe
trebuie să treacă prin
lipide
Răspunsul
detectorului
Figura 12.19 GLC a esterilor metilici ai acizilor grași. Reprezentare schematică a

separării izotermei mal pe o fază staționară PEGA.
cocromatografie pe cel puțin două coloane care au faze staționare de

polaritate diferită, de exemplu EGSS-X și EGSS-Y. În cazul în care acest
lucru nu este fezabil, lungimea catenei substanței de testat poate fi
determinată folosind timpul de retenție relativ al acesteia în comparație cu
timpii de retenție relativi ai acizilor grași cunoscuți. Timpul de retenție relativ
al unei substanțe este timpul său de retenție comparat cu cel al unui etalon
ales de lungime de catenă cunoscută, de exemplu, palmitat de metil (16 : 0).
. . . fX timpul de retenție al esterului
Re1metilic X timpul de retenție=ativă o
timpul de retenție al meti1 palmitat
Pentru a determina lungimea catenei acizilor saturați, se determină
timpii de retenție relativă a mai multor acizi grași cu lungimea catenei
cunoscută. O reprezentare a aritmului logaritmului timpului de retenție
relativ în funcție de lungimea catenei rezultă un grafic cu linie dreaptă care
poate fi utilizat pentru a afla lungimea catenei substanței de testat.
Identificarea compușilor nesaturați este mai complicată, dar o abordare
utilă constă în determinarea timpilor de retenție relativă a mai multor acizi
grași cu lanț lung diferiți, cu un număr cunoscut de legături duble, atât pe o
coloană polară, cât și pe una nepolară. O reprezentare grafică a timpilor de
retenție relativă a fiecărui compus de referință pe faza polară în raport cu cei
demonstrați pe faza nepolară are ca rezultat o serie de linii drepte paralele,
fiecare linie corespunzând unei serii omoloage de saturați, monoeni, dieni,
trieni etc. Acest grafic poate fi apoi utilizat pentru a oferi informații despre
structura, lungimea catenei și numărul de duble legături prezente în acidul
necunoscut.
Conversia unui acid nesaturat în compus saturat permite determinarea
mai ușoară a lungimii lanțului prin GLC. Acest lucru se poate realiza prin
444 Lipide
hidrogenare și, în cazul în care inițial au fost prezente legături duble,

substanța rezultată își va modifica timpul de retenție în funcție de cel al
acidului saturat.
Acizii nesaturați pot fi divizați chimic la nivelul dublei lor legături.
Oxidarea cu permanganat-periodat a fost utilizată pentru a produce acizii
carboxilici corespunzători, în timp ce o tehnică alternativă de ozonoliză duce
la formarea de aldehide și esteri aldehidici. Toți acești produși de reacție pot fi
identificați prin GLC, iar informațiile pot fi utilizate pentru a determina
poziția dublei legături în acidul gras original.
Secțiunile 12.5/6/7
1. Saponificare
(a) este un proces de reacție a unei lipide esterificate cu un alcalin;
(b) eliberează carbohidrați dintr-un glicozipid;
(c) nu va afecta fosfogliceridele;
(d) este o reacție de transaminare?
2. Problemele analitice asociate cu extracția lipidelor din țesuturi cu
solvenți organici sunt:
(a) evaporare;
(b) oxidare;
(c) inactivarea;
(d) contaminare?
3. Metodele enzimatice de cuantificare a triacilglicerolilor
utilizează o enzimă pentru a măsura glicerolul
PENTRU CĂ
glicerolul este eliberat dintr-un triacilglicerol de către enzima lipază.
4. Lipidele cele mai polare vor elua ultimele dintr-o coloană de acid
silicic dacă se aplică solvenți de polaritate crescătoare.
PENTRU CĂ
lipidele nepolare sunt eluate de pe o coloană de acid silicic cu solvenți
organici polari.
Gurr, M.I. și Harwood, J.L. (1991) Lipid biochemistry, an introduction, ediția a 4-a,
Chapman & Hall, UK.
Christie, W.W. (1989) Cromatografie în fază gazoasă și lipide: un ghid practic, Oily
Press Ltd, Regatul Unit.
Christie, W.W. (1987) HPLC and lipids, Pergamon Press, Marea Britanie.
Kates, M. (1986) Techniques of lipidology, ediția a 2-a, Elsevier Science, Țările de Jos.
13 Acizi nucleici
• Compoziția și structura acidului nucleic

• Izolarea și purificarea acizilor nucleici
• Metode de analiză a acizilor nucleici
• Vectori
• Secvențierea ADN
Toate celulele din organismele vii conțin molecule mari de acid nucleic:
acid ribonucleic (ARN) și acid dezoxiribonucleic (ADN). Aceste două
molecule sunt polimeri de nucleotide. ADN-ul se găsește în cromozomi,
iar genele sunt secvențe unice de nucleotide ADN. Genele conțin
informațiile moștenite care, împreună cu ARN-ul, dirijează sinteza tuturor
proteinelor celulei.
Realizarea faptului că ADN-ul și, prin urmare, informația moștenită,
poate fi transferată de la un organism la altul, a condus la apariția
importantului domeniu al tehnologiei ADN recombinant. Capacitatea de a
deschide molecula de ADN și de a introduce o altă genă este
fundamentală pentru aceste manipulări și necesită utilizarea a două clase
speciale de enzime. Endonu cleazele de restricție taie molecula de ADN
între nucleotide specifice, în timp ce ligazele reunesc bucățile de ADN
tăiate. Plasmidele, ADN necromosomal care se găsește în
microorganisme, sunt acceptorii obișnuiți pentru aceste bucăți de ADN
transferate, iar noua moleculă care se formează este cunoscută sub numele
de moleculă de ADN recombinant. În plus, un alt grup de enzime, ADN-
polimerazele, care sintetizează un nou șir de ADN folosind un șablon de
ADN existent, sunt de o importanță vitală în analiza structurii și expresiei
genelor.
Tehnologia ADN recombinant este o industrie în plină dezvoltare și
este exploatată comercial pentru a produce o serie de produse, inclusiv
vaccinuri, medicamente și enzime.
444 Acizi nucleici
Nucleotidele din ARN și ADN sunt formate din trei componente: un

carbohidrat, o grupare fosfat și o bază organică azotată. Există două tipuri de
molecule de carbohidrați în acizii nucleici, ambele sunt D-pentose, adică
conțin cinci atomi de carbon. Carbohidratul din ARN este riboza, în timp ce
ADN-ul conține deoxiriboză, care are un atom de hidrogen în loc de o grupare
hidroxil atașată la carbonul din poziția 2 (figura 13.1).
S
H2 O I OH
HOCI/4C HH Cl
I" I 1;' I
H c- H
Figura 13.1 13 21
OH OH
Structurile de riboză și
2-dezoxiriboză. Riboză 2-Deoxiriboză
Există cinci baze comune care se găsesc în acizii nucleici. Adenina (A),
gua nouă (G) și citozina (C) se găsesc atât în ADN, cât și în ARN. Uracilul
(U) se găsește numai în ARN și timina (T) numai în ADN. Structurile acestor
baze sunt prezentate în figura 13.2. Adenina și guanina sunt baze purinice, în
timp ce uracilul, timina și citosina sunt baze pirimidinice.
Hidroliza alcalină descompune nucleotida în reziduurile sale fosfat și
bază de zahăr. Baza de zahăr este cunoscută sub numele de nucleozidă.
Nucleosidele sunt denumite în funcție de tipul de bază prezentă. Dacă este
prezentă o bază purinică, denumirea se va termina în -osină, de exemplu
adenozină, în timp ce dacă este prezentă o pirimidină, denumirea se va
termina în -idină, de exemplu uridină.
Pirimidine
NH2 0
I II
,,.,C N
Nv '-c-- HN/ C '-c...-N\".
I II CH I II
CH
HC.::::,...,....c /
"N .............. .._N _,......,c, _,,,c-......._ I
H HN N N
2 H
Adenină (A) Guanină (G)
Purine
0
II
_,,,,c....._ .,....cH3
HN C
I II
Figura 13.2
.d" c, NU, NU, NU, NU.
017 N
Structurile pirimidinei H
și purinei
bazele acizilor Citosină (C) Timină (T) Uracil (U)
nucleici.
Nucleotidele sunt denumite în funcție de nucleozidă și de poziția pe

molecula de zahăr la care este atașat fosfatul. Pentru a face diferența între
sistemul de inele de zahăr și sistemul de inele de bază, pozițiile zahărului sunt
desemnate cu un superscript ". Fosfatul poate fi atașat la reziduul de zahăr fie
în poziția 3', fie în poziția 5' (figura 13.3). Prin urmare, o nucleotidă care
conține baza adenină, cu fosfat atașat în poziția 5' a ribozei, se numește
adenozină-5'-fosfat. Denumirile nucleotidelor care se găsesc în ADN și ARN
sunt prezentate în tabelul 13.1.
0
II
_,...C-...._ /CH3
o
HN C
OH I II
I C CH
0 .o
. ' N/
O=P-0-CH2
bH
OH 01;:1
Timidină-5' -fosfatAdenosină-3' -fosfat
Figura 13.3 Structura și denumirea nucleotidelor. 5' indică faptul că grupul fosfat este
atașat la poziția 5 a inelului de zahăr.
Tabelul 13.1 Denumirea nucleotidelor din ADN și ARN
Baza Ribonucleotidă Deoxiribonucleotide
Adenină Adenozin-5'-fosfat (AMP) Deoxiadenozină-5'-fosfat

(dAMP)
Guanină Guanosină-5'-fosfat (GMP) Deoxiguanosină-5'-fosfat
(dGMP)
Citosină Ctidina-5'-fosfat (CMP) Deoxi-citidină-5'-fosfat
(dCMP)
Timină Deoxitimidină-5'-fosfat
(dTMP)
Uracil Uridină-5'-fosfat (UMP)
Nucleotidele individuale sunt unite între ele pentru a forma

oligonucleotide sau acizi nucleici. Legătura se face de la zahărul unei
nucleotide la zahărul următoarei nucleotide prin intermediul grupului fosfat.
Această legătură se numește legătură fosfodiester. Fosfatul dintre zaharuri
este legat de poziția 5' a unei molecule de zahăr și de poziția 3' a celei de-a
doua molecule. Această secvență repetată de zahăr-fosfat formează coloana
vertebrală a acidului nucleic. Cele cinci baze diferite, atașate la zaharuri în
poziția 1', se îndepărtează
446 Acizi nucleici
de la coloana vertebrală de zahăr-fosfat (figura 13.4). Prin convenție, capătul

acidului nucleic care conține gruparea hidroxil sau fosfat 5' liberă se scrie la
stânga și se numește cap, în timp ce capătul cu fosfatul 3' liber este coada și se
scrie la dreapta.
Secvența de baze diferite din oligonucleotidă este cea care are
importanță funcțională și, prin urmare, lanțul de acid nucleic este de obicei
exprimat pur și simplu ca secvență de baze, de ex.
AGCTAAGGTCCATG...
Figura 13.4 Structura oligonucleotidelor. Nucleotidele sunt unite prin intermediul

punților fosfo diesterice dintre reziduurile de zahăr. Bazele ies în afară de coloana
vertebrală de zahăr-fosfat.
13.1.1 Structura ADN-ului

Watson și Crick au arătat că structura normală a ADN-ului constă într-o dublă
spirală formată din două șiruri de oligonucleotide simple. Cele două șiruri de
zaharuri-fosfați ale helixului se desfășoară în direcții opuse (antiparalele), iar
bazele indică
spre interior și se împerechează foarte precis cu bazele de pe filamentul opus.

Împerecherea bazelor are loc între o bază purinică și o bază pirimidinică;
guanina se împerechează întotdeauna cu citozina, iar adenina cu timina
(figura 13.5).
Această structură elicoidală este menținută împreună prin legături de
hidrogen între perechile de baze. Legătura de hidrogen se formează între o
pereche de electroni de pe grupul ceto sau azotul inelar al unei baze și un
atom de hidrogen de pe un gen nitro inelar sau de pe grupul amino al altei
baze (figura 13.6). Trei astfel de legături se formează între o pereche de baze
citosină/guanină și două legături între o pereche ade nouă/timină. Legăturile
individuale de hidrogen sunt foarte slabe, dar prezența unui număr mare de
legături în dubla elice produce o configurație extrem de stabilă. Structura are
ca rezultat faptul că perechile de baze sunt stivuite paralel una față de
cealaltă, permițând astfel interacțiuni hidrofobe între perechile de baze
stivuite, ceea ce contribuie, de asemenea, la stabilizarea structurii.
În majoritatea moleculelor de ADN, cele două capete ale dublei elice
ADN sunt unite pentru a forma un cerc închis. Atunci când se întâmplă acest
lucru, ADN-ul formează o super-înfășurare, înfășurându-se pe sine. ADN-ul
superînfășurat depinde de integritatea cercului închis. Orice ruptură a cercului
va cauza derularea superbobinei.
Cele două șiruri antiparalele de ADN sunt complementare unul față de
celălalt. Astfel, acolo unde există un reziduu de adenină într-un catenar, există
un reziduu de timină în cel de
3'
os de garfosfat
ck
3' 5'
Figura 13.5 Structura elicoidală a ADN-ului. Bazele de pe șirurile opuse se
împerechează. Împerecherea se face întotdeauna între timină și adenină și citozină și
guanină.
448 Acizi nucleici
reciproc, în timp ce guanina și citosina se completează reciproc. Atunci când

două șiruri complementare de acizi nucleici (ADN sau ARN) sunt amestecate
în eprubetă, legătura de hidrogen dintre perechile de baze ale șirurilor opuse
va aduce laolaltă șirurile și va produce o structură stabilă bicatenară. Acest
prces este cunoscut sub numele de hibridizare și este utilizat pe scară largă în
analiza ADN-ului. Puterea hibridizării va depinde de numărul de perechi de
baze completate corect, adică de omologia dintre cele două șiruri.
Pe lângă ADN cromozomial, multe bacterii conțin în citoplasmă
structuri circulare închise de ADN bicatenar, numite plasmide. Aceste
plasmide sunt capabile să se reproducă independent de cromozom și, de
obicei, poartă una sau mai multe gene care sunt responsabile pentru o
caracteristică utilă pe care o joacă bacteria gazdă, de exemplu, rezistența la
antibiotice. Numărul de molecule de plasmidă din fiecare bacterie este
cunoscut sub numele de număr de copii și variază în funcție de diferitele
specii de bacterii și tipuri de plasmidă.
3'-.-----------.. ---------------- 5'

\J ,cH, \N
A ...,A
H
Timină , ..,A Citosină
0 N O O N N-H
I I I I
r
HI H H H HH Legătură de hidrogen
I I I -
H-N'()O
H
-
Adenină N
/JI/ N f Guanină
--.!(_
/ H / H
5' T- 3'
Figura 13.6
Legătura de
hidrogen
între perechile de baze. Coloană vertebrală de zahăr-fosfat
13.1.2 Structura ARN-ului

Există trei tipuri de ARN: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr) și
ARN de transfer (ARNt). Dintre acestea, numai ARNm este utilizat în
tehnologia ADN recombinant. ARNm este o oligonucleotidă monocatenară
care este copiată (transcrisă) de pe una dintre catenele spiralei ADN și, prin
urmare, are o secvență de baze complementară secvenței ADN originale.
Acesta diferă de ADN și de alte specii de ARN datorită unei secvențe de baze
adenină atașate la capătul său 3' (coada poli-A). ARNm monocatenar nu
formează o structură secundară precisă precum cea a ADN-ului. Cu toate
acestea, probabil că are loc o anumită împerechere de baze între nucleotidele
de pe același catenă pentru a produce zone elicoidale scurte, care sunt separate
de regiuni neelicoidale extinse.
Dintre diferitele molecule de acid nucleic din interiorul celulei, cele trei care
sunt cel mai des izolate sunt ADN cromozomial, ARNm din țesuturi sau
celule și ADN plasmidic din bacterii. În toate cazurile, principiile de izolare
sunt similare și pot fi împărțite în trei etape.
1. Celulele sau țesuturile sunt rupte pentru a elibera conținutul lor.
2. Extractul celular este tratat pentru a elimina toate componentele, cu excepția
ADN-ului sau ARN-ului.
3. Soluția de ADN sau ARN rezultată se concentrează.
13.2.1 Izolarea ADN-ului celular total

Eșantionul de țesut sau de celule este mai întâi omogenizat într-un tampon
care conține un detergent precum Triton X-100 și sulfat de sodiu de dedesecil
(SDS), care dezagregă celula și disociază complexele ADN-proteine.
Proteinele și ARN-ul sunt apoi îndepărtate prin incubări secvențiale cu o
enzimă proteolitică (de obicei, proteinaza K) și ribonucleasa. În cele din
urmă, ADN-ul se extrage în etanol. Etanolul precipită numai acizii nucleici cu
lanț lung și lasă în stratul apos nucleotidele simple rezultate din digestia
ARN-ului.
450 Acizi nucleici
Centrifugare în gradient de densitate cu clorură de cesiu

O metodă alternativă de izolare a ADN-ului este centrifugarea în gradient
de densitate cu clorură de cesiu (CsCl), care separă proteinele, ARN-ul și
ADN-ul în funcție de densitatea lor de flotabilitate. Un gradient de
densitate este produs prin centrifugarea unei soluții de CsCl la viteză
mare. Macromoleculele prezente în soluția de CsCl în timpul centrifugării
vor forma benzi în puncte distincte ale gradientului, în funcție de
densitatea lor flotantă. ADN-ul are o densitate flotantă de 1,7 g m1-1 și,
prin urmare, va migra în acest punct al gradientului. Proteinele au o
densitate flotantă mult mai mică și vor pluti în partea superioară a tubului,
în timp ce ARN-ul se va aglutina în partea inferioară (figura 13.7).
Centrifugarea în gradient de densitate în prezența bromurii de etidiu
(EtBr) este mai des utilizată pentru separarea ADN plasmidic de ADN
cromozomial. Legătura EtBr cu ADN-ul provoacă desfacerea parțială a
dublei helixuri. Această desfacere are ca rezultat o scădere a densității de
flotabilitate de aproximativ 0,125 g m1-1 pentru ADN-ul liniar. Cu toate
acestea, ADN-ul supraînfășurat se leagă doar de o cantitate mică de EtBr
și scăderea densității de flotabilitate este de numai aproximativ 0,085 g
m1-1 . În timpul extracției ADN-ului din bacterii, ADN-ul cromozomal
este rupt în fragmente SI):lall. Acest proces face ca ADN-ul să se relaxeze
într-o stare liniară. ADN-ul plasmidic, mult mai mic, nu este rupt și
rămâne într-o formă supraînfășurată. Prin urmare, moleculele de plasmidă
supraînfășurate se vor grupa într-un gradient EtBr-CsCl într-o poziție
diferită față de ADN cromozomal liniar (figura 13.7). Poziția benzilor de
ADN poate fi observată cu ajutorul luminii ultraviolete, care face ca EtBr-
ul legat să devină fluorescent.
(a) (b)
1.6 1.6
Creșterea
CsCI
concentrație 1.65 1.65 ADN liniar
11m111a.- (cromozomială)
1.7 1.7 ADN supraînfășurat
(plasmidă)
1.75 1.75
1.8 1.8
Densita Densitate
te gm1- gmJ-1
J
Figura 13.7 Centrifugarea cu gradient de densitate cu clorură de cesiu pentru (a)

separarea ADN-ului de ARN și proteine și (b) separarea ADN-ului liniar și a ADN-ului
supraînfășurat.
13.2.2 Izolarea ARN-ului

Izolarea ARN-ului este mai puțin simplă decât cea a ADN-ului. Proba este
ușor contaminată de ribonucleaza care provoacă descompunerea ARN-ului.
Activitatea ribonucleazei endogene este împiedicată prin adăugarea de
inhibitori în primeleIzolarea
etape. și purificarea acizilor nucleici 451
452 Acizi nucleici
în timp ce activitatea exogenă este redusă la minimum prin utilizarea de

substanțe chimice pure și de sticlărie sterilă. O a doua problemă este
asocierea strânsă a ARN-ului cu proteinele, ca în cazul polisomilor. Sunt
necesare tratamente dure pentru a elibera ARN-ul din aceste complexe. Au
fost descrise multe metode de izolare a ARN-ului, inclusiv cele prezentate
mai jos.
Metoda proteinazei K
În această metodă, celulele sunt lizate prin incubare într-o soluție hipotonă,
care lasă nucleele intacte. Resturile celulare și nucleele sunt peletizate prin
centrifugare, lăsând ARN-ul citoplasmatic liber de ADN în supranatant.
ARN-ul se eliberează din polisomi prin incubare cu proteinază K, iar proteina
se extrage în fenol/cloroform. ARN-ul este apoi precipitat din faza apoasă cu
ajutorul etanolului.
Metoda tiocianatului de guanidină

Celulele sunt lizate într-un tampon care conține reactivi puternic chaotropi,
cum ar fi tiocianatul de guanidină și 2-mercaptoetanolul, care denaturează
complet orice ribonuclează preîntâmpinată. Supernatantul se pune apoi pe o
pernă de CsCl (5,7 mol 1-1 ) și se centrifughează la 100 000 g timp de 18 ore.
ARN-ul trece prin CsCl și se peletizează, în timp ce ADN-ul și proteinele
rămân în soluția apoasă. Pelerina de ARN se dizolvă în tampon și se
concentrează prin precipitare în etanol rece.
ARNm este apoi izolat din acest extract celular total prin cromatografie
de afinitate folosind oligo-dT-celuloză sau poli(U)-sefaroză.
Izolarea ADN-ului și ARN-ului din țesuturi a fost simplificată în ultimii
ani prin utilizarea de kituri care permit ca extracția să aibă loc într-o singură
etapă și, prin urmare, să accelereze procesul. Acești reactivi favorizează
formarea complexelor de ARN cu guanidina și moleculele de apă și suprimă
interacțiunile hidrofile ale ADN-ului și ale proteinelor. De fapt, ADN-ul și
proteinele sunt eliminate efectiv din faza apoasă, în timp ce ARN-ul rămâne
în această fază. După centrifugare pentru a separa cele două faze, ARN-ul
este precipitat din faza apoasă cu etanol sau izopropanol. După îndepărtarea
fazei apoase, ADN-ul și proteinele din faza organică pot fi recuperate prin
precipitare secvențială cu etanol și izopropanol. Toate tipurile de ARN sunt
izolate prin această metodă. Dacă este necesar, ARNm poate fi izolat prin
cromatografie de afinitate folosind oligo-dT-celuloză sau poli(U)-sefaroză.
13.2.3 Metode electroforetice

Metoda standard utilizată pentru separarea, identificarea și purificarea
fragmentelor de ADN (și ARN) este electroforeza prin gel de agaroză.
Tehnica este simplă, se realizează rapid și este capabilă să rezolve amestecuri
de fragmente de ADN la un nivel ridicat.
La un pH neutru sau alcalin, grupările fosfat ale ADN-ului dau naștere
la o sarcină negativă uniformă pe unitatea de lungime a moleculei de ADN,
care se deplasează astfel spre anod în câmp electric. Moleculele de
dimensiuni diferite pot fi separate prin efectuarea electroforezei printr-o
matrice de susținere. Mărimea moleculelor de ADN depinde de lungimea
lanțului, astfel încât dimensiunile moleculelor de ADN
sunt exprimate în număr de perechi de baze. Matricea oferă mai puțină
rezistență la moleculele mici, care se deplasează astfel mai repede. Viteza de
deplasare a unei molecule de o anumită lungime în matrice depinde de
dimensiunea porilor gelului, care este determinată de concentrația de agaroză.
În mod obișnuit, se utilizează concentrații între 0,5 și 2%, care acoperă o gamă
de dimensiuni de ADN cuprinsă între 200 și 50 000 de perechi de baze.
Separarea se poate face în aparate verticale sau orizontale, în tije sau
plăci. Datorită ușurinței de utilizare, cel mai frecvent se folosesc sistemele de
electroforeză pe plăci orizontale, în care întregul gel este scufundat în tampon
(figura 13.8).
e--4@-:p =-=-=====-=----- y:=0

J k;t--==-=c==-=--====-==-=-==-==-==-=-=- =-====-=c¾-""""'.U - Buffer
/
- f,
ADN plasat în
un puț tăiat în
gel
Gel
Electroforeză
r I I I &l-
0
Figura 13.8
ADN separat
Separarea ADN-ului prin în benzi de
electroforeza pe gel de fragmente de
agaroză. diferite
dimensiuni Cel mai mic
ADN-ul din gel poate fi localizat direct prin includerea în gel a unei
concentrații scăzute de bromură de etidiu, care se leagă de ADN, ceea ce face
ca acesta să devină fluorescent. Trebuie să se ia întotdeauna măsuri de
siguranță adecvate atunci când se utilizează bromura de etidiu, din cauza
naturii sale periculoase. Doar 1 ng de ADN poate fi detectat prin examinarea
directă a gelului în lumină ultravioletă. Deoarece lumina ultravioletă poate
provoca leziuni oculare, trebuie purtați ochelari de protecție atunci când se
examinează gelurile. Pentru a evita expunerea prelungită la lumina
ultravioletă, care poate provoca deteriorarea ADN-ului, precum și a persoanei,
se obișnuiește să se fotografieze gelurile pentru analiza ulterioară. Un
transiluminator luminează gelul cu lumină ultravioletă cu lungimea de undă de
300 nm de jos în sus, iar emisia fluorescentă la 590 nm este fotografiată cu o
cameră Polaroid. Se poate utiliza un filtru roșu pentru a spori contrastul dintre
banda fluorescentă și fundal (figura 13.9).
Pentru determinarea dimensiunii ADN-ului, markerii adecvați sunt
incluși într-unul dintre benzi. Se poate obține un grafic de calibrare în linie
dreaptă prin reprezentarea grafică a distanței migrate în funcție de log 10
perechile de baze ale markerilor.
454 Acizi
Alternative la nucleici
electroforeza în gel de
agaroză
Electroforeza pe gel de
agaroză poate fi utilizată
numai pentru moleculele
de ADN care au o
dimensiune mai mare de
200 de perechi de baze.
Pentru moleculele mai
mici decât această
dimensiune, gelul de
poliacrilamidă
este necesară o electroforeză. Acest tip de electroforeză funcționează pe

același principiu ca și electroforeza în agaroză și separă moleculele în funcție
de mărimea lor. Se utilizează geluri care conțin 12% poliacrilarnid pentru a
rezolva fragmente între 20 și 100 de perechi de baze și 3,5% poliacrilid
pentru fragmente între 80 și 200 de perechi de baze.
Electroforeza pe gel capilar este din ce în ce mai des utilizată pentru
separarea fragmentelor de ADN. De obicei, se folosesc capilare umplute cu
gel de poliacrilarnide, deoarece gelurile de agaroză nu pot rezista la căldura
generată de tensiunile înalte utilizate. Această tehnică este utilizată în special
pentru a separa oligo nucleotide și produse de secvențe de ADN, dar ADN
bicatenar, cum ar fi produsele de digestie cu endonucleaza de restricție și
PCR, pot fi separate cu geluri fizice. Acestea sunt soluții de polimeri cu
vâscozitate relativ scăzută, de exemplu, alchilceluloză.
Aparat foto
Polaroid
Gel
filtru u.v.
Figura 13.9
Transiluminator și Transiluminator
aparat foto pentru
fotografierea ADN-ului
în gel.
Extracția ADN-ului din geluri

Într-o serie de cazuri, de exemplu pentru clonarea și secvențierea ADN,
ADN-ul trebuie recuperat din gel cu un randament cât mai mare posibil și fără
deteriorarea moleculelor. Au fost încercate mai multe metode, niciuna nu este
pe deplin satisfăcătoare, dar electroeluția este cel mai des utilizată. Cele două
probleme majore ale acestei metode sunt, în primul rând, faptul că agaroza
este adesea contaminată de polizaharide sulfatate, care sunt extrase din gel
împreună cu ADN-ul și care sunt inhibitori puternici ai multor enzime și, în al
doilea rând, că randamentul ADN-ului, în special pentru moleculele mari, este
relativ scăzut.
Banda de ADN este tăiată de pe gel și plasată într-o pungă de dializă
care conține un mic volum de tampon. Punga este plasată într-un rezervor
electroforetic și, atunci când curentul este pornit, ADN-ul iese din gel.
Polaritatea curentului este inversată timp de câteva momente pentru a
determina ca ADN-ul aflat pe membrana de dializă să se întoarcă în tamponul
din interiorul pungii. ADN-ul din tampon este apoi precipitat cu etanol.
456 Acizi nucleici
13.2.4 Metode cromatografice
Cromatografie lichidă de înaltă performanță

O alternativă la izolarea acizilor nucleici prin electroforeză urmată de eluție
electroforetică este HPLC. Utilizarea HPLC prezintă mai multe avantaje. Este
simplu și ușor de utilizat și are un grad ridicat de rezoluție, este mai rapid
decât electroforeza și se evită contaminarea fragmentelor de ADN cu
impurități din gelul de agaroză.
Cele două tipuri de HPLC utilizate cel mai frecvent sunt cele cu fază
inversă și cele cu schimb de ioni. HPLC în fază inversă se bazează pe
diferențele de hidrofobicitate dintre acizii nucleici de diferite lungimi și
compoziții de baze. Aplicația sa principală este separarea bucăților mici de
ADN (mai puțin de 50 de perechi de baze), cum ar fi produsele de sinteză a
oligonucleotidelor. Se utilizează în mod obișnuit o eluție în gradient cu
cantități crescânde de acetonitril, nucleotidele mai mici și mai polare
eluzionând primele. Rezoluția este excelentă, iar separarea oligonucleotidelor
care diferă în lungime cu o singură pereche de baze este ușor de realizat. În
plus, diferența de hidrofobicitate a diferitelor baze înseamnă că
oligonucleotidele de aceeași lungime, dar cu compoziție diferită a bazelor, pot
fi, de asemenea, clasificate ca fiind de aceeași lungime.
să fie separate. Ordinea polarității și, prin urmare, a eluției este Glo> C > A >
T
(Figura 13.10).
(a) (b)
15
18
17 2
16 I
Absorbanța Absorbție
15 minute 15 minute
Figura 13.10 Separarea oligonucleotidelor prin HPLC în fază inversă. (a)

Rezolvarea unui amestec de oligonucleotide cu lungimi de 15, 16, 17 și 18 nucleotide.
(b) Rezolvarea a două oligonucleotide, fiecare de 18 nucleotide, dar care diferă în ceea
ce privește compoziția bazelor. Vârful 1 este TCACAGTCTGATCTCACC. Vârful 2
este TCACAGTCTGATGATCTC-GAT.
În cromatografia cu schimb de ioni, acizii nucleici sunt separați pe baza

diferenței de sarcină. Fiecare acid nucleic are o sarcină netă diferită, în funcție
de numărul de grupe fosfat din moleculă (lungimea bazei) și de sarcinile
respective ale bazelor (compoziția bazei). Acest din urmă efect este relativ
minor și, prin urmare, separarea depinde aproape exclusiv de dimensiune.
Separare
458 Acizi nucleici
se realizează prin creșterea lentă a tăriei ionice a fazei mobile folosind

NaCl, KCl sau KH2 PO4 . Oligonucleotidele mai mari și mai încărcate se
eluează mai târziu decât cele mai scurte.
HPLC cu schimb de ioni poate fi utilă și pentru separarea
moleculelor mari de acid nucleic. O astfel de aplicație este ca alternativă
la centrifugarea cu gradient de densitate CsCl în prepararea plasmidelor.
Moleculele de plasmide constau, de obicei, din l 000 până la l O 000 de
perechi de baze. Plasmidul este mai întâi izolat din celula bacteriană prin
liză alcalină, iar plasmidul pur este obținut din acest extract brut printr-o
separare cromatografică într-o singură etapă.
Cromatografie de afinitate pentru izolarea ARNm

Majoritatea moleculelor de ARNm eucariote au până la 250 de baze
adenină la capătul 3. Aceste "cozi poli(A)" pot fi utilizate pentru
purificarea prin cromatografie de afinitate a ARNm dintr-un extract de
ARN celular total. În condiții de salinitate ridicată, poli (A) se va hibridiza
cu oligo-dT-celuloză sau cu sefaroza poli(U). Aceste materiale sunt
polimeri de 10 până la 20 de nucleotide de deoxitimidină sau nucleotide
de uri dină legate covalent de un suport de carbohidrați. Acestea se leagă
ARNm care conține cozi poli (A) cu o lungime de până la 20 de reziduuri.
ARNr și ARNt nu posedă secvențe poli (A) și nu se leagă. După spălare,
ARNm poate fi eluat cu un tampon cu conținut scăzut de sare.
Secțiunile 13.1/2
1. Care dintre următoarele elemente sunt prezente în moleculele de ADN?
(a) Cozi de poli (A).
(b) Deoxiadenozină-5'-fosfat.
(c) Ctidina-5'-fosfat.
(d) Legături fosfodiesterice.
2. Care dintre următoarele tehnici utilizate în separarea moleculelor de
ARN și ADN se bazează pe faptul că ARN și ADN sunt molecule
încărcate negativ?
(a) Electroforeză.
(b) HPLC în fază inversă.
(c) HPLC cu schimb de ioni.
(d) Cromatografie de afinitate.
3. ARN și ADN sunt izolate din țesuturi prin sedimentare în
gradient de densitate cu clorură de cesiu.
PENTRU CĂ
legarea ADN-ului de bromura de etidiu determină derularea structurii
elicoidale a acestuia.
4. Două molecule de ADN cu lungimi de 2000 și 3000 de perechi de
baze pot fi separate prin electroforeză pe gel de agaroză.
PENTRU CĂ
în electroforeza pe gel de agaroză, moleculele mari se deplasează mai
repede prin gel decât moleculele mici.
Metoda utilizată pentru a determina concentrația de ADN va depinde de natura

probei. În tehnologia ADN recombinant se utilizează probe relativ pure de
ADN sau ARN, astfel încât sunt adecvate metode spectrofotometrice simple.
Cu toate acestea, atunci când sunt prezente cantități mari de substanțe care
interferează, cum ar fi în cazul unui omogenat de țesut sau de celule, va fi
necesară o metodă chimică.
13.3.1 Metode spectrofotometrice

Prezența sistemelor de legături duble conjugate în bazele purinice și
pirimidinice înseamnă că ADN și ARN absorb lumina în regiunea ultravioletă
la 260 nm. Pentru determinări aproximative se poate presupune că o soluție de
50 µ,g m1-1 de ADN bicatenar (dsADN) are o absorbție de 1 la 260 nm. O
cuantificare mai exactă poate fi obținută prin compararea raportului dintre
absorbanța probei la 260 și 280 nm. Termenul de densitate optică (OD) este
adesea utilizat în locul celui de absorbție. Preparatele de ADN pur ar trebui să
aibă o DO 260/OD 280 de 1,8. Un raport mai mic decât acesta poate indica o
contaminare cu proteine, în timp ce un raport mai mare poate indica prezența
ARN-ului.
Bazele care nu sunt legate prin legături de hidrogen absorb mai puternic
decât cele care sunt împerecheate. Prin urmare, tratamentele care perturbă
legătura de hidrogen dintre perechile de baze, cum ar fi căldura sau alcalii, vor
crește absorbția ADN-ului. Atunci când o soluție de ADN bicatenar (dsADN)
este încălzită lent, inițial se înregistrează puține modificări ale absorbției până
când se atinge "temperatura de topire" (Tm). Aici legăturile de hidrogen sunt
rupte, producând o creștere rapidă a
ADN monocatenar
Absorbanța
(260nm)
Cu catenă dublă
ADN
50 60 70 80 90 100
Temperatura °C
Figura 13.11 Temperatura de topire pentru ADN. La această temperatură, absorbția

crește deoarece cele două șiruri de ADN se despart.
458 Acizi nucleici
absorbția la o valoare mai mare, care nu se modifică semnificativ la încălzirea

ulterioară (figura 13.11).
ADN-ul este adesea prezent în cantități prea mici pentru a fi detectat
prin spectroscopie directă. În acest caz, se poate utiliza colorantul fluorescent
EtBr pentru a amplifica absorbția. EtBr se leagă de molecula de ADN prin
intercalarea între perechile de baze adiacente. Acesta absoarbe lumina
ultravioletă la 300 nm și emite lumină la 590 nm în regiunea roșie/portocalie a
spectrului vizibil. Metoda poate fi utilizată pentru a determina cantitatea de
ADN dintr-o eprubetă, comparând fluorescența mediată de EtBr a probei cu
cea a unor etaloane cu cantități cunoscute de ADN.
13.3.2 Metode chimice
Metoda Burton
Acesta este un test spectrofotometric bazat pe reacția difenilarninei cu
fracțiunea dezoxiriboză a ADN-ului pentru a produce un complex care
absoarbe la 600 nm. Reacția este specifică pentru dezoxiriboză, iar ARN-ul nu
interferează. Se poate utiliza pe extracte relativ brute, în cazul în care nu este
posibilă determinarea directă prin spectrofotometrie a concentrației de ADN.
Testul de fluorescență DABA

Acidul diarninobenzoic (DABA) reacționează cu aldehidele de forma RCH
CHO pentru a produce un compus puternic fluorescent. Îndepărtarea
catalizată de un acid a bazei purinice din acidul nucleic expune carbonații l' și
2' ai deoxiribozei.
Metode de analiză a acizilor 457
nucleici
și produce o astfel de grupare aldehidă. Deoxiriboza este aldehida
predominantă prezentă în celulele mamiferelor și, în esență, singura prezentă
în precipitatele acide din extractele apoase. Prin urmare, nu este necesară
nicio purificare, iar ARN-ul nu interferează. Metoda poate fi utilizată pe probe
foarte mici (de exemplu, 100 µl).
13.3.3 Metode enzimatice

Majoritatea manipulărilor ADN necesită utilizarea de enzime purificate. În
interiorul celulelor, aceste enzime sunt utilizate pentru replicarea și
transcrierea ADN, pentru descompunerea ADN-ului străin, pentru repararea
ADN-ului mutant și pentru recombinare între diferite molecule de ADN.
Majoritatea enzimelor purificate sunt disponibile în comerț. De obicei, acestea
sunt furnizate în tampon Tris care conține 50% glicerol și sunt depozitate la -
20°C. Glicerolul este inclus în tampon pentru a preveni înghețarea, dar trebuie
îndepărtat înainte de utilizare, deoarece modifică activitatea unor enzime.
Pentru fiecare enzimă, este furnizată o soluție tampon optimizată.
Majoritatea tampoanelor au la bază Tris-HCl și au un interval de pH de 7,4-
8,0. Toate conțin ioni de magneziu ca activatori pentru enzime. Puterea ionică
a tampoanelor este importantă și diferite enzime necesită diferite puteri ionice
pentru o activitate optimă. În general, se folosesc trei concentrații de tampon:
scăzută, medie și ridicată, care conțin 10, 50 și 100 mo! 1-1 clorură de sodiu,
respectiv clorură de potasiu.
Endonucleaze de restricție
Endonucleazele de restricție sunt enzime izolate din bacterii. In vivo, aceste
enzime sunt implicate în recunoașterea și tăierea ADN-ului străin, protejând
astfel bacteriile împotriva infecției cu fagi și viruși. Acestea recunosc
secvențe specifice de baze în ADN bicatenar și rup legăturile fosfodiesterice
dintre două nucleotide din cadrul secvenței. Aceste secvențe de recunoaștere
pot avea o lungime de patru, cinci sau șase nucleotide. Peste 350 de enzime
diferite au
nucleici
au fost izolate până în prezent și fiecare recunoaște o secvență de baze
diferită. În tabelul 13.2 sunt prezentate unele dintre cele mai frecvent utilizate
enzime cu secvențele lor de recunoaștere.
Unele enzime, de exemplu Eco RI, taie ADN-ul într-o poziție diferită în
cele două șiruri, producând o proeminență monocatenară sau un "capăt
lipicios". Alte enzime, cum ar fi Pvull, produc fragmente cu terminații tăiate
fără capete lipicioase. Formarea capetelor lipicioase este utilă deoarece, prin
potrivirea perechilor de baze ale capetelor lipicioase, orice fragment de ADN
produs prin acțiunea aceleiași enzime de restricție poate fi unit într-un mod
specific.
Tabelul 13.2 Secvențe de recunoaștere a unei selecții de endonucleaze de

restricție. ADN-ul bicatenar este tăiat în pozițiile săgetate.
Enzima Organism Secvența de recunoaștere
Eco RI Escherichia coli G'..\ATTC

CTIAPf
BamHI Bacillus dGATCC

amyloliquefaciens CCTAGe
CGAT1CG
Pvu I Proteus vulgaris
GC1TAGC
Pvu II Proteus vulgaris cAdcTG

GTSGAC
A1AGCTI
Hin dIII Haemophilus
influenzae Rd TICG¥
Alu I Arthrobacter luteus AdCT

TC1GA
GG1cc
Hae III Haemophilus
aegyptius cceG
Hin fl Haemophilus G TC CT
influenzae CTNAe
ADN ligaze
Ligazele se găsesc în toate celulele, dar cele două care sunt utilizate în analiza
ADN sunt fie ADN ligazele din Escherichia coli, care necesită nucleotida
NAD ca și cofactor, fie ADN ligazele T4 din fagul T4, care necesită adenozin
trifosfat (ATP) ca și cofactor. Ambele enzime catalizează sinteza unei legături
fosfodiesterice între gruparea hidroxil 3' a unui nucleotid și gruparea fosforil
5' a nucleotidului următor într-o moleculă de ADN-DS. Ligazele sunt utilizate
cel mai adesea pentru a produce o legătură covalentă între nucleotidele din
mol eculele de ADN unite prin potrivirea perechilor de baze ale capetelor
lipicioase (figura 13.12).
460 Acizi nucleici
A-A-T-T-T-C-R
R-G G-R
R-C-T-T-T-A-A-A
!
Amestec
Împerecherea bazelor aduce
moleculele împreună
R-G A-A-T-T-T-C- R'
l
1111111
R-C-T-T-A-A-A 0-R'
T4 lig ,
R-G-A-A-A-T-T-T-C-R
R - C- C- T- T- T- A- A- 0- R '
Figura 13.12 Unirea a două molecule de ADN de către enzima T4 ligază. Enzima
produce legături covalente între nucleotidele dintr-un lanț de ADN. Moleculele de
ADN sunt reunite prin împerecherea bazelor la capetele lor lipicioase.
ADN polimeraze
ADN polimerazele sintetizează un nou șir de ADN complementar unui șir de
ADN sau ARN existent (figura 13.13). În amestecul de incubare se adaugă
oligonucleotide scurte complementare capetelor catenei originale de ADN sau
ARN, cunoscute sub numele de primeri.
1. ADN polimeraza 1. Pentru majoritatea aplicațiilor se utilizează ADN
polimeraza 1 din E. coli. Enzima se atașează la o regiune monocatenară
scurtă dintr-o moleculă de ADNdb și apoi sintetizează un nou șir de ADN,
degradând șirul existent pe măsură ce avansează. Atunci când se utilizează
in vitro, această incubare se realizează la 12-15 °C pentru a preveni mai
mult de o rundă de replicare. Se utilizează pentru marcarea in vitro a ADN-
ului prin metoda nick translation (descrisă mai jos).
2. Fragmentul Kienow. Molecula ADN polimerazei I conține activitățile de
polimerază și nuclează în părți diferite ale moleculei enzimatice. Aceste
două părți pot fi separate prin tratare cu subtilizina enzimatică. Partea care
păstrează funcția de polimerază este cunoscută sub numele de fragment
Klenow. Această enzimă sintetizează o nouă catenă de ADN
complementară numai cu o singură catenă de ADN (șablonul). Este
utilizată pentru a crea capete contondente în ADNDs și în metoda dideoxi
de secvențiere a ADN-ului.
3. Transcriptază inversă. Această enzimă este implicată în replicarea
retrovirusurilor in vivo. Aceasta sintetizează un șir de ADN complementar
(ADNc) folosind ARN în loc de ADN ca șablon. Este utilizată pe scară
largă pentru a crea un șir de ADNc din ARNm extras din celule sau
țesuturi pentru clonare sau pentru analiza PCR.
4. Taq polimeraza este o ADN polimerază termostabilă care a fost izolată
inițial din bacteria Thermus aquaticus, care trăiește în izvoarele calde.
nucleici
Această enzimă are o activitate maximă la 70-80°C și rămâne activă la
temperaturi de până la 90°C. Este utilizată pe scară largă în analiza ADN-
ului prin PCR.
Enzime de modificare a ADN-ului

Multe alte enzime pot fi utilizate pentru a elimina sau adăuga grupuri la
capetele moleculei de ADN. Cele trei enzime principale sunt: fosfataza alcalină,
care elimină o grupare fosfat de la extremitatea 5'; polinucleotid kinaza, care
adaugă o grupare fosfat la o extremitate 5' liberă; și deoxinucleotidil
transferaza terminală, care adaugă una sau mai multe deoxinucleotide la
extremitatea 3'.
(a) ADN polimeraza 1

/ Șablon
5'
3'
A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T3'
T-A-C-C-G
-a-ni-ck-
G-T-A5'
,Primer
--- A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T
,t- a-c- g-t - t- a-c,G-T-A Șir
nou sintetizat
Înlocuirea nucleotidelor existente
(b) Fragmentul Klenow
5' A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T3'
--- A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T
3' T-A-C-C-G G-T-A5' T-A-C-C-G-t -t -a-c-G-T-T-A
Doar porecla
este completată
ARN
-
(c) Transcriptaza inversă / șablon
Figura 13.13
A-U-G-C-A-A-U-G-C-A-U A-U-G-C-C-A-A-U-G-C-C-A-
Acțiunile ADN
G-T-A t-a-c-g-t-t-t-a-c-G-T-A
polimerazelor ADN
utilizate în tehnologia
ADN recombinant.
I
Noul fir de ADN
13.3.4 Detectarea unor secvențe specifice de ADN

Dacă o moleculă de ADN monocatenar este plasată cu o secvență de ADN
complementară, cele două molecule se vor hibridiza. Această hibridizare stă
la baza mai multor tehnici foarte puternice de detectare și cuantificare a unor
secvențe specifice de acid nucleic. Hibridizarea poate fi realizată fie.în
soluție, fie, mai frecvent, cu ADN-ul imobilizat pe filtre de nitroceluloză.
Secvența complementară de ADN este cunoscută sub denumirea de sondă
ADNc. În prezent, sunt disponibile sonde pentru un număr mare de secvențe
importante de acizi nucleici.
Producerea de sonde de ADN marcate

Înainte de a utiliza sonda pentru hibridizare, aceasta trebuie să fie marcată
pentru a permite detectarea ulterioară. O metodă de marcare este prin
încorporarea de nucleotide marcate cu32 P, proces care poate fi realizat în
două moduri.
Traducerea Nick utilizează enzima ADN polimeraza 1. Majoritatea
fragmentelor de ADN conțin câteva zone crestate. ADN polimeraza 1 se poate
462 Acizi nucleici
atașa aici și
nucleici
catalizează o reacție de înlocuire a catenei. Atunci când reacția este efectuată
în prezența deoxinucleotide marcate radioactiv, șirul de ADN înlocuit devine
marcat. De obicei, este inclusă doar o singură deoxinucleotidă marcată.
Umplerea capetelor este o metodă mai blândă, dar poate fi utilizată
numai pe moleculele de ADN care au capetele lipicioase. Aceasta utilizează
fragmentul Kienow, care umple capetele lipicioase prin sintetizarea șirului
complementar. Din nou, dacă reacția este efectuată în prezența
deoxinucleotide marcate, rezultă un șir de ADN marcat radioactiv.
Se utilizează, de asemenea, sisteme de etichetare ne-radioactive.
Acestea încorporează nucleotide biotinilate sau conjugate cu fluoresceină în
sonda ADNc în locul nucleotidei P32 . Sonda marcată radioactiv poate fi
detectată direct prin autoradiografie, în timp ce sondele biotinilate sau
conjugate cu fluoresceină sunt detectate cu ajutorul anticorpilor conjugați cu
fosfatază alcalină sau peroxidază, direcționați împotriva biotinei sau
fluoresceinei. Legarea anticorpului de nucleotidă poate fi apoi vizualizată prin
incubarea cu substratul enzimatic și cu un reactiv colorat. Deși sistemele de
marcare non-radioactivă sunt avantajoase din punct de vedere al siguranței și
al eliminării, procedura de vizualizare necesită mai multe etape de incubare,
ceea ce poate consuma mult timp.
Greutate
Șervețele de hârtie ) . I
Filtru
hârtie --- Gel de
nitroceluloză
' ,fj --------?I ---- Tampon
Figura 13.14 Transferul ADN-ului de pe un gel pe o foaie de nitroceluloză.
Tamponul se infiltrează prin gel până la nitroceluloză și ia ADN-ul cu el.
Blotting Southern
Metoda cea mai des utilizată pentru detectarea secvențelor specifice de ADN
este Southern blotting. ADN-ul este fragmentat prin digestie cu o
endonuclează de restricție, iar fragmentele sunt separate prin electroforeză pe
gel de agaroză. Benzile de ADN sunt apoi transferate pe o membrană de
nitroceluloză, astfel încât moleculele individuale de ADN să fie reținute în
timpul procesului de hibridizare. Appa ratusul utilizat pentru acest transfer
este prezentat în figura 13.14. Nitroceluloza este așezată pe gel și se lasă
tamponul să se absoarbă prin ea, transportând ADN-ul de pe gel pe
membrană, unde ADN-ul este legat. Rezultatul este că membrana de
nitroceluloză poartă o replică a benzilor de ADN din gelul de agaroză. ADN-
ul de pe membrană este apoi incubat cu o sondă de ADN marcată, care se va
hibridiza cu orice bandă care conține secvențe complementare acesteia. După
spălare, această hibridizare poate fi vizualizată.prin autoradiografie sau prin
utilizarea unui sistem de detecție cu anticorpi (figura 13.15).
Specificitatea hibridizării dintre sondă și ADN depinde de temperatura
și puterea ionică a tamponului. La temperaturi ridicate și la o concentrație
scăzută de sare (stringență ridicată), hibridizarea este foarte specifică. La
stringențe mai mici (temperaturi scăzute și concentrație mare de sare),
hibridizarea este mai puțin specifică, iar sonda ADNc se va lega la multe
secvențe. În Southern
464 Acizi nucleici
blotting, incubarea cu sonda se realizează la stringențe scăzute, ceea ce

permite hibridizarea unui număr mare de fragmente. Membrana este apoi
spălată la o stringență ridicată, astfel încât sonda să rămână legată numai la
secvențe foarte omoloage.
O altă tehnică similară cu Southern blotting este Northern blotting. Aici, în
loc de fragmente de ADN, fragmentele de ARNm sunt probate cu o sondă de
ADNc marcată, după separarea prin electroforeză și transferul pe membrane de
nitroceluloză. Northern blotting este utilizat pentru a detecta și cuantifica ARNm
din extractele de țesut.
2 3 4 5 2 3 4 5
Gel de agaroză Placă autoradiografică
Figura 13.15 Detectarea unei secvențe specifice de ADN prin hibridizare cu o

sondă de ADNc marcată cu 32P. ADN-ul este transferat pe nitroceluloză și incubat cu
sonda. După spălare, legarea specifică este vizualizată prin autoradiografie. Secvența
de ADN detectată de sondă este prezentă în benzile 2, 3 și 5, dar nu în benzile 1 și 4.
Reacția în lanț a polimerazei

Cu toate că, prin utilizarea sondelor ADNc care conțin multe molecule de 32 P
(activitate specifică ridicată), pot fi detectate doar 20 pg de ADN sau ARNm
prin Southern sau Northern blotting, multe secvențe de ADN sau ARN din
țesuturi se află sub acest nivel de detecție. Reacția în lanț a polimerazei
permite replicarea masivă a unei secvențe țintă de ADN și permite detectarea
secvențelor de ADN sau ARN care sunt prezente doar în una sau două copii
pe celulă. Secvența țintă de ADN este extrasă din celulă și denaturată în șirul
său unic prin încălzire la 90°C. Se sintetizează și se aneantizează doi amorse
oligonucleotide complementare la capetele opuse ale șirurilor simple ale
ADN-ului țintă. Amorsele pentru PCR constau dintr-o secvență de 20-30
nucleotide specifică pentru ADN-ul țintă și au ca rezultat amplificarea numai
a secvenței respective de ADN. Șirul unic amorsat este apoi extins cu ajutorul
ADN polimerazei 1. Secvența bicatenară nou sintetizată este apoi denaturată
prin încălzire la 90°C și se adaugă noi amorsă oligonucleotide. Acest proces
se repetă apoi prin 25-30 de cicluri și are ca rezultat o creștere mare a ADN-
ului (figura 13.16).
Reacția depinde de utilizarea polimerazei Taq, care este stabilă la
temperaturi ridicate și poate supraviețui încălzirii repetate la 90°C fără a-și
pierde activitatea. Procesul de amplificare se realizează într-un termociclator,
care permite controlul automat al vitezei de încălzire și răcire, al timpilor de
incubare la fiecare temperatură și al numărului de cicluri. Aceste informații
pot fi programate în termociclator la începutul procesului de reacție, care se
realizează în prezența nucleotidelor marcate. Produsul PCR este detectat prin
electroforeză pe gel de agaroză și autoradiografie.
O extensie a metodei PCR nucleici
este RT-PCR. În acest caz, ARNm este
extras din celule sau țesuturi, convertit în ADNc cu ajutorul enzimei
transcriptază inversă și apoi se efectuează PCR. Această metodă este utilizată
pentru a detecta expresia unor secvențe specifice de ARNm în celule sau
țesuturi.
i
3' 5'
5' I II 3'
90°C Denatura
re
37°i
Atașați grundul
3' 5'
.i\iiii Ciclul I
ii ii ii
5'
*
75°C Extindere primer
3'
3' I I I j j j j j j j j 11 II 11 11 11 111 11
5' Ii 3'
5'
11 11 I j j
. 3'
5' Ii j
' I11 11 11 1 j
i jjt 11 11 j 11 j 11 I j 11
90°C Denaturare
5'
3'
37°i Primer de
C
fixare iWi 5'
3'
"""
5' 3'
3'
5'
-iWii
5'
iii I 3'
75°C prelungire rrimer Ciclul 2
5' 3'
:
3' 5'
I t I j 1 11 11 It I 11 11 11 I j j j j 1111
jj5'
3'
j j j j j j j j j I j j j j I 1 j 11 I 11 I 11 it I I I
5'
:11 :I : 3'
3,,, - 1 I 1 ...1 ...1......I. 1 I....I....I .... 5'

5 1 I...I-...I...1.....1.....I. 1 1 1 1 1 3,
I I I I I I j-j
r :::,,,,,,,,,,,,,,,,, 11,,, :
+ I Repetați ciclurile
t de 25-30 de ori
466 Acizi nucleici
!
Figura 13.16 Reacția în lanț a polimerazei pentru amplificarea secvențelor de
ADN. ADN-ul este încălzit pentru a separa cele două catene. Un primer este atașat la
capătul 5' al fiecărei catene și extins cu ajutorul ADN polimerazei 1. Cele două noi
șiruri sunt separate ca și înainte și ciclul se repetă de până la 30 de ori.
Vectori 465
Secțiunea 13.3
1. Care dintre următoarele enzime sunt utilizate în RT-PCR?
(a) Endonucleaze de restricție.
(b) Taq polimeraza.
(c) Transcriptază inversă.
(d) T4 ADN ligază.
2. Care dintre următoarele situații apar în analiza ADN-ului prin
Southern blotting?
(a) Separarea moleculelor de ADN prin electroforeză.
(b) Amplificarea secvențelor de ADN.
(c) Hibridizarea între șiruri complementare de ADN.
(d) Incubarea cu amorse specifice.
3. O soluție de 15 µ,g m1-1 de ADN bicatenar purificat va avea o
absorbanță de aproximativ 0,3 la 260 nm.
PENTRU CĂ
o creștere a temperaturii întrerupe legătura de hidrogen dintre
perechile de baze.
4. Enzima ADN polimeraza 1 este utilizată la producerea de sonde
ADNc marcate.
PENTRU CĂ
enzima ADN polimeraza l adaugă nucleotide la capătul moleculei de
ADNc.
Bucăți de ADN, de exemplu gene sau sonde ADNc, sunt multiplicate prin
intermediul unei metode bazate pe replicarea in vivo în celule bacteriene.
Secvența de ADN este încorporată într-un vehicul sau vector care o
transportă într-o celulă gazdă, de obicei E. coli. Pe măsură ce cultura de
bacterii crește, vectorul se replică și el, producând astfel mai multe secvențe
de ADN necesare. Două dintre tipurile de molecule de ADN care apar în
mod natural și care pot fi utilizate ca vectori sunt plasmidele și cromozomii
virali.
13.4.1 Plasmide
Plasmidele sunt molecule circulare de ADN dublu catenar care se găsesc în
citoplasma celulelor bacteriene. Pentru a fi un vector util, plasmidul trebuie
să fie mic. Cu cât plasmidul este mai mic, cu atât este mai ușor de preluat în
bacterii. Majoritatea plasmidelor vectoriale au o lungime de aproximativ 3-4
kilobaze (kb). Acest lucru permite încorporarea unor secvențe de ADN de
până la 10-12 kb fără a afecta absorbția plasmidelor. De asemenea, este util
dacă vectorul are un număr mare de copii. Cu cât numărul de copii este mai
mare, cu atât mai multe molecule de ADN vor fi produse.
Absorbția plasmidei în celula bacteriană se numește transfonnatare și în
laborator poate fi indusă în două moduri. Într-o metodă, bacteriile și ADN-ul
sunt plasate în CaC12 (50 mmol 1-1) rece ca gheața. Acest lucru induce ADN-ul
să se lipească de exteriorul bacteriei. Temperatura este apoi crescută la 42°C și
ADN-ul intră în celulă. A doua metodă este prin electroporare,
466 Acizi nucleici
care presupune aplicarea unui scurt impuls de înaltă tensiune la o suspensie de

celule și ADN. Aceasta are ca rezultat o permeabilitate tranzitorie a
membranei și absorbția subsecventă a ADN-ului în bacterii.
13.4.2 Cromozomi virali

Cromozomii bacteriofagilor, care sunt viruși care infectează în mod specific
bacteriile, pot fi, de asemenea, utilizați ca vectori. Aceștia sunt molecule
liniare de ADN bicatenar care conțin genele necesare pentru replicarea virală
în celula gazdă. În timpul infecției, moleculele de ADN sunt inserate în gazda
bacteriană. Cel mai utilizat bacteriofag este lambda (X.), care infectează E.
coli. În cadrul E. coli, lambda are două moduri alternative de replicare: ciclul
litice și ciclul lizogenic. În ciclul litic, ADN-ul este încorporat în cromozomul
E. coli. Are loc replicarea, rezultând în producerea unui număr mare de
particule fagice mature, care sunt eliberate din celulă prin liza celulară. În
modul lizogenic, ADN-ul lambda este încorporat în ADN-ul cromozomal în
așa fel încât are loc replicarea ADN-ului lambda, dar acesta nu este
împachetat în particule mature și nu are loc liza celulară. În schimb, genomul
lambda este moștenit de fiecare celulă bacteriană fiică la diviziunea celulară.
Lambda este menținută în această stare de profagie prin acțiunea unei proteine
represoare, cl. Dacă proteina represoare este inactivată, ADN-ul lambda este
extirpat din cromozomul gazdă și se activează un ciclu litic.
Într-o formă mutantă de lambda, proteina represoare este inactivă la
temperaturi mai mari de 37 °C, dar activă la temperaturi mai scăzute. Atunci
când acest lambda este utilizat ca vector, E. coli infectat este crescut mai întâi
la 32 °C pentru a permite replicarea ADN-ului în ciclul lizogenic.
Temperatura este apoi crescută la 37°C pentru a inactiva reprimatorul.
Aceasta are ca rezultat excizia genomului lambda și eliberarea particulelor
lambda prin liză.
Un alt cromozom viral care poate fi utilizat ca vector este cel al fagului
filamentos Ml3. Cromozomul MI3 este o moleculă de ADN monocatenar
care, atunci când este inserat în gazda bacteriană, se replică în afara
cromozomului bacterian în citoplasmă. Virusul este apoi reasamblat și eliberat
din celula bacteriană fără liză celulară.
13.4.3 Selectlon de bacterii transformate

Procedura de inserție a ADN-ului într-un vector și introducerea ulterioară a
acestuia în gazda bacteriană este extrem de ineficientă și va avea ca rezultat
faptul că majoritatea bacteriilor din cultură fie nu conțin niciun vector necesar,
fie conțin un vector în care nu este inserat ADN. Cu toate acestea, au fost
produși vectori care, prin plasarea bacteriilor în medii specifice, permit numai
creșterea celor care conțin vectorul și ADN-ul inserat.
Un astfel de vector plasmidic este pBR322 (figura 13.17). Acesta
conține două gene care codifică rezistența la antibioticele ampicilină și
tetraciclină. Bacteriile care preiau vectorul (bacterii transformate) vor fi
rezistente la antibiotic și vor crește în prezența acestuia, în timp ce bacteriile
netransformate nu vor rezista. Prin urmare, bacteriile sunt cultivate pe medii
care conțin fie ampicilină, fie tetraciclină. Coloniile rezultate trebuie să
conțină bacterii care au preluat vectorul.
În cadrul genelor care codifică ampicilina și tetraciclina sunt unice.
Vectori 467
Pst 1
(a) pBR322
Hin dIII
PstI
Sa/I
BamHI
SmaI
Eco RI
(b) pUC8
Figura 13.17 Hărți ale plasmidelor (a) pBR322 și (b) pUCS care arată situsurile de
endonuclează de restricție din genele utilizate pentru selectarea recombinanților.
situsuri de recunoaștere pentru multe enzime de restricție diferite.

Fragmentele de ADN sunt inserate în aceste situsuri cu ajutorul enzimei
corespunzătoare. Inserarea fragmentului de ADN duce la întreruperea genei și
la pierderea rezistenței la antibiotic. Prin urmare, orice bacterie care a preluat
vectorul cu fragmentul de ADN inserat (recombinanți) nu se va dezvolta în
prezența antibioticului respectiv. Acest proces se numește inactivare
inserțională.
Pentru a selecta o bacterie care conține un fragment de ADN inserat în
gena de tetraciclină din pBR322, de exemplu după utilizarea enzimei de restricție
Bam HI, bacteriile sunt cultivate pe un mediu care conține ampicilină. Coloniile
care cresc conțin plasmidul, dar numai câteva conțin moleculele recombinante
pBR322. Coloniile se repetă apoi pe medii care conțin tetracy clină. Coloniile
care cresc sunt rezistente la tetraciclină și, prin urmare, au o genă de tetraciclină
intactă. Cele care conțin molecula recombinantă nu vor crește, dar pot fi luate de
pe placa originală și crescute în masă (figura 13.18).
468 Acizi nucleici
O altă formă de inactivare prin inserție utilizată pe scară largă este gena
lacZ', care a fost utilizată pentru prima dată în vectorul pUC8 (figura 13.17). Gena
lacZ codifică pentru enzima J3-galactosidază, care descompune lactoza și este
prezentă în cromozomul E. coli. Unele tulpini de E. coli au o genă lacZ modificată
(lacZ') care are un segment mare lipsă. Acești mutanți pot sintetiza întreaga
enzimă numai atunci când segmentul lacZ lipsă este furnizat de o plasmidă
precum pUC8. Acest segment lacZ poate fi inactivat prin inserția unui fragment de
ADN cu ajutorul unei enzime de restricție corespunzătoare. pUC8 conține, de
asemenea, o genă de rezistență la ampicilină și, prin urmare, selecția implică mai
întâi cultivarea bacteriilor pe ampicilină pentru a selecta transformanții, urmată de
transferul pe medii care conțin X-gal. X-gal este un substrat sintetic pentru enzima
J3-galactosidază și dă un produs albastru. Bacteriile care conțin o moleculă pUC8
recombinantă nu furnizează o bucată suplimentară de enzimă, astfel încât X-galul
nu este descompus, iar coloniile sunt albe. Bacteriile care conțin molecula pUC8
intactă vor furniza fragmentul de J3-galactosidază, astfel încât X-gal este
descompus și se formează colonii albastre. Coloniile albe sunt cele necesare și pot
fi prelevate direct de pe această placă.
(a)
Hârtie de filtru
Incubare
Medii cu
tetraciclină
Coloniile cu gena tet
Colonii intactă - nerecombinante
care
conțin
(b)
vectorul
Colonii care
conțin
vectorul
recombinant
Colonii pe Ampicilină Colonii pe tetraciclină
Figura 13.18 Reproducerea în plăci pentru selecția bacteriilor care conțin un

vector recombinant. (a) Metoda utilizată pentru a transfera colonii de bacterii între
plăci.
(b) Compararea distribuției coloniilor între plăci permite identificarea coloniilor care
conțin vectorul recombinant. Cercurile punctate reprezintă coloniile care nu se
dezvoltă pe tetraciclină.
Secvența bazelor nucleotidice din molecula de ADN este cea care este
fundamentală pentru funcția acidului nucleic. Prin urmare, tehnicile care
determină această secvență sunt extrem de importante în tehnologia ADN
recombinant. Două
Secvențierea 469
ADN
au fost dezvoltate metode similare. Ambele depind de producerea unui
amestec de oligonucleotide marcate fie radioactiv, fie cu fluoresceină, cu un
capăt comun și care diferă în lungime cu o singură nucleotidă la celălalt capăt.
Acest amestec de oligonucleotide este separat prin electroforeză de înaltă
rezoluție pe gel de poliacrilamidă, iar poziția benzilor este determinată.
Secvențele de ADN cunoscute asociate cu gene specifice sunt stocate în
biblioteci de calculatoare care sunt accesibile în mod liber. Acest lucru
permite compararea genelor recent secvențiate cu cele care codifică proteine
cunoscute.
13.5.1 Metoda Maxam și GIibert
În această metodă, fragmentul de ADN monocatenar care urmează să fie

secvențiat este marcat la capăt prin tratare cu fosfatază alcalină pentru a elimina
fosfatul 5', urmată de reacția cu ATP marcat cu32 P în prezența unei
polinucleotide kinaze, care atașează32 P la terminalul 5'. Fragmentul de ADN
marcat este apoi împărțit în patru părți, fiecare dintre acestea fiind tratată cu un
reactiv care modifică o bază specifică, după cum urmează.
Aliquota 1 este tratată cu sulfat de dimetil, care metilează reziduurile de
guanină.
Aliquota 2 este tratată cu acid formic, care modifică reziduurile de
adenină și gua nouă.
Alicota 3 este tratată cu hidrazină, care modifică reziduurile de timină și
cito-sinus.
Aliquota 4 se tratează cu hidrazină în prezența NaCl (5 mol 1-1 ), ceea ce
face ca reacția să fie specifică pentru citosină.
După aceste reacții, cele patru alicote sunt incubate cu piperidină, care
desface coloana vertebrală de zahăr-fosfat a ADN-ului de lângă reziduul care
a fost modificat. Reacția de modificare se realizează în condiții care permit
doar unui număr limitat de baze din fiecare moleculă de ADN să reacționeze.
În condiții perfecte, acesta va fi de o bază per moleculă de ADN. Aceasta
înseamnă că clivarea cu piperidină va duce la producerea unui amestec de
oligo nucleotide, fiecare având aceeași extremitate 5', dar care se prelungește
până la nucleotida de lângă cea care a fost modificată (figura 13.19). Orice
bază din molecula originală de ADN are aceeași probabilitate de a reacționa
ca oricare alta cu reactivul care îi este specific. Prin urmare, aceste reacții
distribuie în mod egal radioactivitatea între produsele de scindare.
Oligonucleotidele din fiecare alicotă sunt plasate în patru godeuri
diferite, dar adiacente, ale unui gel de poliacrilamidă conținând SDS și
separate prin electroforeză. Fragmentele separate sunt detectate prin
autoradiografie. Rezoluția acestor geluri este de așa natură încât se pot
distinge oligonucleotidele care diferă doar cu o singură nucleotidă. Cele mai
mici fragmente călătoresc cel mai departe. Prin urmare, banda care a călătorit
cel mai mult conține doar o singură nucleotidă, în timp ce următoarea bandă
de pe gel conține două nucleotide etc. Culoarul în care se găsește banda
indică următoarea bază din secvență. Secvența ADN se obține, prin urmare,
prin citirea gelului de jos în sus (figura 13.19).
5' 32P-C- G-A-G-C-G-G-T-A-- 3' Extremitatea șirului marcat
/ i- nced
Despărțire la GCdespărțire la A și ---------------------- :C leve-ve-at C :-a-nd-: Cleave at

C
reziduuri Reziduuri G Reziduuri T reziduuri
32P-C-Gi-A-G-G-C-G-G-
i
32 p - C - G - A - G - C - G - G - T - A 32 32P-Ci-Gi-G-A-G-C-G-G-
P-C-G-A-G-G-C-G-G-
32p - C - G - G - A - G - C - G - G - T-A
T-A T 32P - C - G - A - G - C - G T-A
32 32P - C - G - A - G
P-C-G-G-A-G-C-C 32
P-C-G-G-A-G-G
32P - C - G - G - A - G - C
32P-C- G-A
32P-C-G
32P-C-G-A
32p_c
32p_c
Filon
neclintit
Gel de
A3'
secvențiere
TG
CG
G
A
GS'
Figura 13.19 Metoda Maxam și Gilbert de secvențiere a ADN-ului. Șirul de ADN marcat este împărțit în patru părți alicotate. Fiecare dintre
acestea este tratată pentru a scinda șirul de lângă o bază diferită, rezultând un amestec de nucleotide de diferite lungimi. Aceste nucleotide sunt
separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă, iar secvența de ADN este citită de pe gel.
Secvențierea 471
ADN
13.5.2 Metoda dideoxi
Această metodă a fost dezvoltată de Sanger și colegii săi și este denumită și
metoda de terminare a lanțului. Procedura necesită un șablon de ADN
monocatenar și un amorsă scurtă complementară la capătul 3' al regiunii de
ADN care urmează să fie secvențiată. Se produce o copie complementară a
șirului de ADN
!;
'O
I
II') 0
uI
1 ----------------tM
0
I
<:
E-< I
I
<:
uI 'O £-)
I +"'
0
uI
II
E-<
uI
I
0 "'
0
'O
'O
u1
0I 0 :g
I I
<: <:
I I
E-< 0 0 -o
0 I I I
:g u u u
+ \11 V1 \ii
Figura 13.20 Metoda de secvențiere a ADN prin metoda dideoxi (terminarea

lanțului). O copie complementară a catenei de ADN este sintetizată în prezența ana
logilor dideoxi ai fiecărei baze. Terminarea lanțului are loc atunci când analogul este
inserat în locul bazei adevărate. Șirurile de ADN nou sintetizate sunt separate prin
electroforeză pe gel de poliacrilamidă, iar secvența este dedusă din modelul benzilor.
472 Acizi nucleici
de către fragmentul Kienow al ADN polimerazei 1. Sinteza se realizează în

prezența a patru trifosfați dezoxiribonucleotide, dintre care unul este marcat
cu32 P. În prezența trifosfaților dideoxiribonucleotide concurente (ddNTP), are
loc o terminare specifică a sintezei ADN, în care derivatul dideoxi este
încorporat în locul dezoxiribonucleotidă. Se efectuează patru incubări, fiecare
în prezența unui derivat dideoxi diferit. Fiecare incubare generează o
populație eterogenă de oligonucleotide marcate care se termină cu aceeași
nucleotidă (figura 13.20).
La fiecare incubare se adaugă uree pentru a separa cele două șiruri de
ADN, iar șirurile simple sunt separate electroforetic în benzi adiacente ale
unui gel de poliacrilarnitură SDS. Ureea este, de asemenea, prezentă în gel
pentru a se asigura că șirurile de ADN rămân separate. Gelul este apoi
autoradiografiat. Secvența de ADN poate fi dedusă din ordinea crescătoare a
benzilor din cele patru benzi adiacente.
ADN-ul șablon monocatenar necesar pentru această metodă de
secvențiere este de obicei furnizat prin utilizarea bacteriofagului Ml3 ca
vector. Cea mai răspândită metodă de secvențiere a ADN-ului care utilizează
acest sistem este "abordarea shotgun". Se produce o serie aleatorie de
fragmente din ADN-ul care urmează să fie secvențiat. Acest lucru se poate
face prin sonicare sau prin digestie cu enzime de restricție. Fiecare fragment
este încorporat în vectorul MI3 și se obține secvența acestuia. Compararea
secvențelor fiecărui fragment va evidenția secțiuni care se suprapun și va
permite deducerea secvenței bucății originale de ADN.
În locul celor marcați cu32 P se pot utiliza trifosfați de
dezoxiribonucleotide marcați cu fluoresceină. După ce secvențele de ADN
sunt separate prin electroforeză, benzile de ADN rezultate devin fluorescente
și sunt analizate cu ajutorul unui aparat de formare a imaginii fluoro-
orografice, care produce o imagine a benzilor fluorescente similară cu
autoradiografia obținută atunci când se utilizează nucleotide marcate cu 32P.
Kiturile care conțin toți reactivii necesari pentru secvențierea ADN,
inclusiv enzima ADN polimerază, MI3, vectorul, amorse, tampoane și
nucleotide marcate și neomarcate sunt disponibile de la mai mulți producători.
Toate componentele acestor kituri au fost optimizate pentru a fi utilizate
împreună.
Secțiuni 13.4/5
1. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate în ceea ce privește
metoda dideoxi pentru secvențierea ADN-ului?
(a) Se sintetizează noi lanțuri de ADN care se termină la baze
selective.
(b) Terminarea catenei se realizează prin incubare cu
trifosfat de dideoxiribonucleotidă.
(c) Șirul de ADN este rupt lângă bazele selectate prin incubare cu
piperidină.
(d) Șirurile de ADN produse sunt separate prin electroforeză pe gel.
2. Care dintre următoarele afirmații sunt adevărate?
(a) Inserția unei bucăți de ADN într-o anumită genă
determină activarea acelei gene.
(b) Bacteriile transformate cu plasmidul pBR322 cu ADN inserat
în gena de rezistență la ampicilină vor crește într-un mediu care
conține tetraciclină.
Lecturi 473
suplimentare
(c) Bacteriile transformate cu plasmidul pUC8 cu ADN inserat în
gena LacZ' nu se vor dezvolta într-un mediu care conține
ampicilină.
(d) Moleculele de plasmidă sunt scindate în anumite locuri cu
ajutorul endonucleazelor de restricție.
3. Bacteriile care conțin plasmidul pUC8 cu o genă inserată în gena
LacZ' cultivate pe un mediu care conține X-gal sunt de culoare
albastră PENTRU CĂ
gena "LacZ" codifică o componentă a enzimei galactosidază care
transformă X-galul într-un produs de culoare albastră.
4. Bacteriofagul lambda (A) conține genele care codifică rezistența la
ampicilină și tetraciclină.
PENTRU CĂ
bacteriofagul lambda (A) conține gene care îi permit să se supună atât
modului de replicare litice, cât și celui lizogenic.
Brown, T.A. (1995) Gene cloning, ediția a 3-a, Chapman & Hall, UK.
Old, R.W. și Primrose, S.B. (1994) Principles of gene manipulation, ediția a 4-a, Blackwell
Law, Marea Britanie.
Emery, A.E. și Malcolm, S. (1995) An introduction to recombinant DNA in medicine,
Ediția a 2-a, Wiley-Liss Inc., SUA.
Walker, J. (ed.) (1989) Nucleic acid techniques in methods in molecular biology,
Humana Press Inc., SUA.
Brown, T.A. (1991) Essential molecular biology - a practical approach, IRL Press,
MAREA BRITANIE.
Apendice: Numerotare și
clasificarea enzimelor
1.4.7 Cu o proteină de fier-sulfură ca acceptor

1.4.99 Cu alte acceptoare
1.1 Acțiunea privind grupul de donatori
CH-OH 1.5 Acționează asupra grupului CH-NH al
donatorilor
1.1.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor
1.1.2 Cu un citocrom ca acceptor 1.5.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor
1.1.3 Cu oxigen ca acceptor 1.5.3 Cu oxigen ca acceptor
1.1.99 Cu alți acceptori 1.5.99 Cu alți acceptori
1.2 Acționând asupra grupării aldehidă sau oxo a Acționează asupra NADH sau NADPH
1.6
donatori 1.6.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor
1.2.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor 1.6.2 Cu un citocrom ca acceptor
1.2.2 Cu un citocrom ca acceptor 1.6.4 Cu un compus disulfidic ca acceptor
1.2.3 Cu oxigen ca acceptor 1.6.5 Cu o chinonă sau un compus înrudit ca
acceptor
1.2.4 Cu un compus disulfidic ca acceptor
1.6.6 Cu o grupare azotată ca acceptor
1.6.99 Cu alți acceptori
1.3 Acțiunea asupra grupului de donatori
CH-CH 1.7 Acționează asupra altor substanțe
azotate com-
1.3.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor pounds ca donatori
1.3.2 Cu un citocrom ca acceptor
1.3.3 Cu oxigen ca acceptor
1.7.7 Cu o proteină fier-sulfură ca acceptor
1.3.99 Cu alți acceptori
1.7.99 Cu alți acceptanți
1.4 Acționează asupra grupei CH-NH2 a donatorilor
1.8 Acționează asupra unei grupe de
donatori cu sulf
Lecturi 475
suplimentare
Numerotarea și clasificarea enzimelor 475
1.8.4 Cu un compus disulfidic ca acceptor 1.14.14.14 Cu flavină sau flavoproteină redusă ca un

prim receptor
1.8.5 Cu o chinonă sau un compus înrudit ca donator, și încorporarea unui atom de
acceptor oxigen
1.8.7 Cu o proteină de fier-sulfură ca acceptor 1.14.15 Cu o proteină de fier-sulfură redusă ca
acceptor
1.8.99 Cu alți acceptori un donor și încorporarea unui atom de
oxigen
1.9 Acțiunea asupra unui grup de donatori de hematii 1.14.16. Cu pteridină redusă ca unul
dintre donatori, și
l.9.3 Cu oxigen ca acceptor încorporarea unui atom de oxigen
1.9.6 Cu o grupare azotată ca acceptor 1.14.17 Cu ascorbat ca donator și încorpor-
rația unui atom de oxigen
1.14.18. cu un alt compus ca donator și
1.10 Acționează asupra difenolilor și a subfenolilor înrudiți încorporarea unui atom de oxigen
poziții de donatori 1.14.99 Diverse (necesită caracterizare suplimentară)
1.10.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor izare)
1.10.2 Cu un citocrom ca acceptor 1.15 Acționând asupra radicalilor

superoxidici ca acceptor
l.10.3 Cu oxigen ca acceptor tor
1.11 Acționând asupra peroxidului de hidrogen ca accep- 1.16
Oxidarea_ ionilor metalici tor 1.16.3 Cu oxigenul ca acceptor
1.12 Acționează asupra hidrogenului ca donator
1.17 2 grupuri
Acționează asupra -CH
l.12.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor
1.18 Acționează pe ferredoxina redusă ca
1.13 Acționând asupra donatorilor unici cu donator
încorpora-
tionarea oxigenului molecular (oxigenoze) 1.18.1 Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor
1.18.2 Cu dinitrogen ca acceptor
1.13.11. Prin încorporarea a doi atomi de oxi-
gen 1.18.3 Cu H+ ca acceptor
1.13.12. Cu încorporarea unui atom de oxigen 1.19 Acționează asupra flavodoxinei reduse
ca donator
(monooxigenaze interne sau monooxigenaze interne
oxidaze cu funcție mixtă) 1.19.2 Cu dinitrogen ca acceptor
1.13.99 Diverse (necesită caractere suplimentare) 1.97 Alte oxidoreductaze

izare)
1.14 Acțiunea asupra donatorilor
împerecheați cu încorporare de oxigen
molecular
2.1 Transferul grupărilor cu un singur
carbon
1.14.11 Cu 2-oxoglutarat ca donator, și
încorporarea a câte un atom de oxigen 2.1.l Metiltransferaze
în ambii donatori 2.1.2 Hidroximetil-, formil- ș i alte substanțe
înrudite
476 Anexa
1.14.12 Cu NADH sau NADPH ca unul dintre donatori, transferazele
și încorporarea a doi atomi de oxigen 2.1.3 Carboxil- și carbamoiltransferazele
într-un singur donator 2.1.4 Amidinotransferaze
1.14.13 Cu NADH sau NADPH ca unul dintre donatori,
2.2 Transferul aldehidei sau al
cetonilor
și încorporarea unui atom de oxigen
reziduuri
2.3 Aciltransferaze 3.1.1 Hidrolaze ale esterilor carboxilici
2.3.1 Aciltransferaze Arninoaciltransferaze 3.1.2 Hidrolaze tiolesterice Hidrolaze
2.3.2 3.1.3 monoester fosforice
3.1.4 Hidrolaze de diester fosforic
2.4 Glicoziltransferaze 3.1.5 Hidrolaze de monoester trifosforic
2.4.1 Hexosiltransferaze 3.1.6 Hidrolaze de ester sulfuric
2.4.2 Pentosiltransferaze 3.1.7 Hidrolaze monoester difosforice
2.4.99 Transferul altor grupe glicozilice 3.1.11 Exodeoxiribonucleaze producătoare de 5'-
fosfomonoesteri
2.5 Transferul de grupe alchil sau aril, altele
3.1.13 Exoribonucleaze producătoare de 5'-fosfo-
decât grupele metil monoesteri
3.1.14 Exoribonucleaze producătoare de alte
2.6 Transferul grupărilor azotate
substanțe decât 5'-
fosfomonoesteri
2.6.1 Aminotransferaze 3.1.15 Exonucleaze active fie cu ribo-, fie cu ribo-
sau
2.6.3 Oximinotransferaze acizi dezoxiribonucleici și producerea de
5'-fosfomonoesteri
2.7 Transferul de substanțe care conțin 3.1.16 Exonucleaze active fie cu ribo- sau cu
fosfor
grupuri
acizi dezoxiribonucleici și producerea de
2.7.1 Fosfotransferaze cu un alcool altul decât grupul 5'-fosfomonoester ca
acceptor 3.1.21 Endodeoxiribonucleaze producătoare
de 5'-
2.7.2 Fosfotransferaze cu un carboxil fosfomonoesteri
grup ca acceptor 3.1.22 Endodeoxiribonucleaze producătoare de alte
2.7.3 Fosfotransferaze cu un azot decât 5' -fosfomonoesteri
grup ca acceptor 3.1.23 Endodeoxiribonucleaze specifice locului:
2.7.4 Fosfotransferaze cu un fosfat clivarea este specifică secvenței
grup ca acceptor 3.1.24 Endodeoxiribonucleaze specifice locului:
2.7.5 Fosfotransferaze cu regenerare de clivajul nu este donatori specifici de
secvență (aparent catalizând intramolecul- 3.1.25 Endodeoxiribonucleaze specifice de
situs, transferuri ulare) specifice pentru baze modificate
2.7.6 Difosfotransferaze 3.1.26 Endoribonucleaze producătoare de 5'-fosfo-
2.7.7 Nucleotidie ltransferaze monoesteri
2.7.8 Transferazele pentru alte fosfete substituite 3.1.27 Endoribonucleaze care produc alte
grupe decât cele de fată 5'-fosfomonoesteri
2.7.9 Fosfotransferaze cu acceptori împerecheați 3.1.30 Endonucleaze active fie cu ribo-, fie cu ribo-
sau
acizi dezoxiribonucleici și producerea de 5'-
2.8 Transferul grupărilor care conțin sulf fosfomonoesteri
2.8.1 Sulfurtransferaze 3.1.31 Endonucleaze active fie cu ribo-, fie cu ribo-
sau
2.8.2 Sulfotransferaze acizi dezoxiribonucleici și producerea de
2.8.3 CoA-transferaze altele decât 5' -fosfomonoesteri
3.2 Acționează asupra compușilor glicozilici

3.2.l Hidroliza compușilor O-glicozilici
478 Anexa
3.2.2 Hidroliza compușilor N-glicozilici
3.1 Acționează asupra legăturilor esterice
3.2.3 Hidroliza compușilor S-glicozilici
3.3 Acționează asupra legăturilor eterice

3.3.1 Tioeter hidrolaze
3.3.2 4.1 Carbon-<:arbon liaze
Eter hidrolaze
4.1.1 Lilaza carboxilică
3.4 Acționează asupra legăturilor peptidice (peptide
4.1.2 Aldehidă liaze
hidrolaze)
4.1.3 Lilaza oxoacidelor
3.4.11 Hidrolaze a-aminoacetilpeptidice 4.1.99 Alte lipaze carbon-carbonice
3.4.13 Hidrolaze dipeptidice
3.4.14 Dipeptidilpeptide hidrolaze dipeptidice
4.2 Lilaza carbon-oxigen
3.4.15 Peptidildipeptide hidrolaze 4.2.1 Hidrolizații

3.4.16 Carboxipeptidaze de serină 4.2.2 Acționează asupra polizaharidelor
3.4.17 Metalo-carboxipeptidaze 4.2.99 Alte lipaze carbon-oxigen
3.4.21 Serin proteinaze
3.4.22 4.3 Lizaza carbon-azot
Proteinaze tiolice
3.4.23 4.3.l Lilaza amoniacală
Carboxil (acid) proteinaze
3.4.24 4.3.2 Amidină liaze
Metaloproteinaze
3.4.99 Proteinaze cu mecanismul catalitic necunoscut 4.4 Lilaza carbon-sulfură
nism
4.5 Lilaza halogenurilor de carbon
3.5 Acționează asupra legăturilor carbon-azot, 4.6 Lilaza fosfor-
oxigen, altele decât legăturile peptidice
4.99 Alte liaze
3.5.1 În cazul amidelor liniare
3.5.2 În cazul amidelor ciclice
3.5.3 În cazul amidinelor liniare
3.5.4 În cazul amidinelor ciclice
3.5.5 5.1 Racemaze și epimeraze
În cazul nitrililor
3.5.99 În alți compuș i 5.1.1 Acțiunea asupra aminoacizilor ș i
derivaților
5.1.2 Acțiunea asupra hidroxiacizilor și a
derivaților
Acționează asupra anhidridele acide
3.6 5.1.3 Acțiunea asupra carbohidraților și a
derivaților
3.6.1 În anhidridele cu conținut de fosfor 5.1.99 Acțiunea asupra altor compuș i
3.6.2 În anhidridele care conțin sulfonil
5.2 Izomeraze cis-trans
Acționează asupra legăturilor carbon-<:arbon
3.7 5.3 Oxidoreductaze lntramoleculare
În substanțele cetonice
3.7.1 5.3.1 Aldoze și cetoze de conversie inversă
3.8 Acționează asupra legăturilor halogenurate 5.3.2 Interconversia grupărilor ceto- ș i
enol
3.8.1 În compușii C-halidici 5.3.3 Transpunerea legăturilor C=C
3.8.2 În compușii de P-halide 5.3.4 Transpunerea legăturilor S-S
5.3.99 Alte oxidoreductaze intramoleculare
3.9 Acționează asupra legăturilor fosfor-
azot 5.4 Transferaze intramoleculare
5.4.1 Transferul grupărilor acil
3.10 Acționează asupra legăturilor sulf-azot
3.11 Acționează asupra legăturilor carbon-fosfor
5.4.2 Transferul grupărilor fosforil
480 Anexa
5.4. 3Transferul grupărilor amino

5.4. 99Transferul altor grupuri
5.5 Lilaza intramoleculară

5. 99Alte izomeraze
6.1 Formarea de legături carbon-oxigen

6.1. lLigaze care formează aminoacil-
ARNt și compuși înrudiți
6.2 Formarea legăturilor carbon-sulfură
6.2.1 Acid-țiol ligazele
6.3 Formarea de legături carbon-azot
6.3.1 Ligaze acid-amoniacale (sau amine)
(amide sintetaze)
6.3.2 Ligaze acid-aminoacid (sintaze
peptidice)
6.3.3 Ciclo-ligaze
6.3.4 Alte ligaze carbon-azot
6.3.5 Ligaze carbon-azot cu glutarnină ca
arnino-N-donator
6.4 Formarea legăturilor carbon-carbon
6.5 Formarea legăturilor de ester fosforic.
Întrebări de autotestare: Instrucțiuni
& răspunsuri
Întrebări de autotestare
Instrucțiuni
Fiecare set de întrebări de autotestare este format din patru întrebări. Primele două sunt întrebări cu
alegere multiplă care oferă patru răspunsuri alternative la întrebare, iar dumneavoastră trebuie să
selectați răspunsurile corecte. Orice număr dintre ele sau nici unul dintre ele nu poate fi corect.
Ultimele două întrebări constau fiecare din două afirmații unite de cuvântul BECAUSE. Luați în
considerare fiecare afirmație în parte și decideți dacă este adevărată sau falsă. Dacă ambele întrebări
sunt adevărate, decideți dacă întreaga propoziție este adevărată, adică dacă cea de-a doua afirmație
oferă o explicație corectă pentru prima afirmație.
Întrebări de autotest
Răspunsuri
Pentru fiecare întrebare cu alegere multiplă sunt indicate răspunsurile corecte.
Pentru fiecare întrebare de analiză a relațiilor, cele două afirmații sunt identificate ca fiind
ADEVĂRATE sau FALSE. Atunci când ambele sunt adevărate, relația dintre cele două afirmații
este identificată ca fiind RELATIVĂ sau NERELATIVĂ.
480Răspunsuri la întrebările de autotestare
Răspunsuri la întrebările de autotestare.

Pentru o explicație, consultați instrucțiunile de la pagina xiii.
Secțiunea Ql Q2 Q3 În Q4 În
legătură legătur
cu ă cu
1.1 a C Fals Adevă Adevăra Adevă Da
rat t rat
1.2 b a Adevărat Adevă Da Adevăra Adevă Da
rat t rat
1.3 b C C
2.1 a b Adevărat Adevă Da Fals Adevă
rat rat
2.2 d a Adevărat Adevă Da Adevăra Adevă Nu
rat t rat
2.3 a b C Adevărat Adevă Nu Fals Adevă
rat rat
2.4/5/6 C d C Adevărat Fals Adevăra Fals
t
3.1 a bd ab Adevărat Fals Adevăra Adevă Da
t rat
3.2 C ad Adevărat Adevă Da Fals Adevă
rat rat
3.3 a cd C d Adevărat Fals Fals Adevă
rat
3.4/5 b d aC Fals Adevă Adevăra Adevă Nu
rat t rat
4.1 C a Adevărat Fals Adevăra Adevă Da
t rat
4.2/3/4/5 d b Fals Adevă Adevăra Adevă Da
rat t rat
5.1 C b Adevărat Adevă Da Adevăra Fals
rat t
5.2/3 b C a Fals Fals Fals Fals
6.1 C b Adevărat Adevă Nu Fals Adevă
rat rat
6.2 C d C d Adevărat Adevă Da Adevăra Fals
rat t
7.1/2 b d bd Adevărat Adevă Nu Adevăra Adevă Da
rat t rat
7.3 a b C d Fals Adevă Adevăra Fals
rat t
7.4 abed ad Adevărat Fals Adevăr Fals
at
8.1 aC b Adevărat Adevă Da Adevăr Fals
rat at
8.2 C a Adevărat Adevă Nu Fals Adevăra
rat t
8.3 a a Adevărat Adevă Da Adevăr Adevăra Nu
rat at t
8.4/5/6/7 abd C Fals Adevă Fals Fals
rat
9.1 DPDM aC Adevărat Fals Adevăr Fals
at
9.2/3/4 bC C Adevărat Fals Fals Fals
10.1 C b-B c-A Adevărat Adevă Da Adevăr Adevăra Da
rat at t
10.2/3/4 C d bC Fals Adevă Fals Fals
rat
10.5/6 b ab d Adevărat Adevă Da Adevăr Fals
rat at
11.1 b ab Adevărat Adevă Nu Fals Adevăra
rat t
11.2/3 aC b Fals Adevă Fals Adevăr
rat at
12.1/2/3/4 b C Adevărat Adevă Nu Adevăr Fals
rat at
12.5/6/7 a bd Adevărat Adevă Da Adevăr Adevăra Da
rat at t
13.1/2 bd aC Adevărat Adevă Nu Adevăr Fals
rat at
13.3 bC aC Adevărat Adevă Nu Adevăr Fals
rat at
13.4/5 abd bd Fals Adevă Fals Fals
rat
488 Index
Index
absorbție, 50 alchenil-diacil-glicerol, 411 voltampermetrie anodică de

absorptiometru, 60 alchil-diacil-glicerol, 411 stripping, 191 anomer, 312
absorbție maximă, 38 absorbția alosterie, 271 antronă, 326
radiației, 38 ABTS, 250, 330 alfa-carbohidrat, 311 anticorp,227,402
acreditare, 24 alfa helix, 382 antigen, 234
precizie, 13 a-naftol, 326, 437 analizor reacție antigen-anticorp, 234
acetil-D-galactosamină, 319 de aminoacizi, 373 determinant antigenic, 234
acetilarea, 427,438 aminoacid oxidază, 278, 283, 286, antiserum, 234
aminoacizi acizi, 352, 385 348,364 cromatografie de argentație, 432
acrilamidă, 137 reziduu de aminoacid, 353, 382 amină aromatică, 326 reactiv de
activator, 267, 301 secvență de aminoacizi, 360 acid arsenomolibdic, 325 ascorbat
situsul activ, 258 aminoacizi oxidază, 267
acilglicerol, 410,427,433, 438 metode cromatografice, 371 aspartat aminotransferaza, 274
adjuvant, 235 clasificare, 344 kituri de testare, 5
ADP, 38 metode colorimetrice, 351, 362 asimetrie, 307,347,409
hormonul adrenocorticotrofic, 355 derivați pentru GLC, 371 spectroscopie de absorbție atomică,
cromatografie de adsorbție, 99 electroforeză, 370 39, 80
cromatografie de afinitate, 308, 403, metode enzimatice, 364 fluorescență atomică, 76
455 metode fluorimetrice, 359, 362 număr atomic, 196
AFID, 121 metode microbiologice, 363 atomizare, 77, 81
gel de agar, 136 proprietăți, 343 ATP, 48,291
agaroză, 136,451 structură 343 Derivat ATZ, 362
aglutinare, 236 aminoantipiren, 427 autoanalizator, 217
aglutinină, 227 amino zahăr, 315 testul automat al substratului, 317
grupa agliconă, 318 aminofenazonă,330 autoradiografie, 206, 462, 469
segmentare aeriană, 217 amperometrie, 188 enzimă auxiliară, 274
alanină, 298, 351 detectoare amperometrice, 189 aviditate, 234
acid aldaric, 316 amphiprotic, 348 grup axial, 314
aldehidă, 325 amfoline, 140
acid aldonic, 316 ampolit, 140, 348, 385
aldoză, 307 ampicilină, 467 Limfocitul B, 229
aldose-1-epimerază, 329 amplitudine, 37 Bacillus subtilis, 363 test de
detector de ionizare cu flacără amilază, 267, 322 inhibiție bacteriană, 364
alcalină, 121 reactiv de cupru amilopectină, 321 bacteriofag, 466
alcalin, 325 fosfatază alcalină, angstrom, 37 lărgirea benzii, 106
250,269,461 viteza unghiulară, 154 lățimea benzii, 62
celulă cu strat de imunitate mediată de celule, 229 membrană de acetat de celuloză,
barieră, 68 unitate de cellobioză, 320 135,397 analizor centrifugal rapid,
bază, 29 celuloză, 321, 327 213, 301
aminoacid de bază, 385 forța centrifugă, 154
becquerel, 200 centrifugare, 153, 423, 449
Beer-Lambert, 49 forță centripetă, 154
vibrații de încovoiere, 44 ceramidă, 419
carbohidrat beta, 311 cerebrosidă, 315,420
emisie beta, 197, 248 deplasare chimică, 88
/3-galactosidază, 250 centrul chiral, 307
Reactivul lui Bial, 326 fază staționară chirală, 114 cloramină
prejudecăți, 9, 13 T, 249
acid bicinchoninic, 393 contor de clorură, 186
biotest, 4 colesterol, 412, 425
bioluminescență, 48, 250, 291 colesterol oxidază, 426 cromatografie
biosenzor, 191, 303, 331 de aminoacizi, 366 de
Biuret, 390 carbohidrați, 335
bolometru, 69 de lipide, 429
lungimea legăturii, 44 de proteine, 404
placă de borat în strat subțire, acceptor cromogenic de oxigen, 330
433 Brij, 217, 375 electrod Clark, 190, 303
verde de bromcresol, 395 intervalul clasei, 6
bromcresol purpuriu, 396 selecție clonală, 230
tampoane, 275, 375 cocromatografie, 101
bursa lui Fabricius, cromatografie de legătură coordonată,
229 metoda Burton, 432
457 coeficient de variație, 10 cofactor,
267
coerență, 29
aminoacid C-terminal, 354, 382 colidină, 356, 368
clorură de cesiu, 160, 450 colorimetru, 60
grafic de calibrare, 30, 54 valoarea culorii, 379
electrod de calomel, 172 eficiența coloanei, 107
calorimetru, 293 material de împachetare a coloanelor,
coloană capilară, 119,440 106, 114 coloane pentru
electroforeză capilară, 144 cromatografie, 106 imunoanaliză cu
carbamilare, 241 legare competitivă,
carbohidrați 245
metode cromatografice, 335 inhibitor competitiv, 269
derivați pentru GLC, 338 complement, 230
metode enzimatice, 328 lipide complexe, 415,434
structură, 307 sulfat de condroitină, 316
analiză structurală, 327 conductimetrie, 181
electrod de dioxid de carbon, legătură conjugată, 41
293 gruparea carbonil, 307, enzimă conjugată, 267
324 proteină conjugată, 383 analiză în
caroten, 414 flux continuu, 217 albastru
report, 220 strălucitor coomassie, 394 testul
catalază, 267, 331 Coomb, 227
tehnici de întrerupere a celulelor, coeficient de corelație, 16
295 fracționare celulară, 157, 295 coulometrie, 185
membrană celulară, 421 contra-ion, 117
488 Index
testul enzimatic cuplat, 274 reticulare, 130 digitonină, 425

reactivitate încrucișată, 248
Curie, 200
Parcela Cusum, 21
cianură, 269
ciclodextrine, 114
voltampermetrie ciclică, 189
citocrom c, 301
bromură de cianogen, 403
Metoda DABA, 457

clorură de dabsil, 373
clorură de dansil, 359
derivați de dansil, 370
curent întunecat, 68
DCCV, 189
enzime de decarboxilare, 283
decilaldehidă, 293 grade
de libertate, 8 electron
delocalizat, 41
Cupa lui Delve, 83
densitometrie, 399
centrifugare cu gradient de densitate,
159, 450
deoxiriboză,318,444
derivați
pentru GLC, 124, 338, 371, 438
pentru HPLC, 117, 373
unitate derivată, 29
desalinizare, 152
lampă cu deuteriu, 61
cărbune acoperit cu dextran,
353 dextro-rotație, 322
diacetil fosfat, 417 unitate
de dializă, 219
dializă, 147, 219, 387
acid diaminobenzoic, 457
diaforază, 333
diasteroizomer, 309
dibutil-4-metil-fenol, 424 dicloro-
2-hidroxibenzen sulfat de dicloro-
2-hidroxibenzen
acid onic, 330
diclorofluoresceină, 436
metoda dideoxi, 471
spectroscopie diferențială, 56
centrifugare diferențială, 156
rețea de difracție, 65
curent de difuzie, 188
reflexie difuză, 64
digitoxenină, 3 l 9
Index 483
dihidroxicolecalciferol, 413 celulă electrolitică, 169 ESR, 85

diluții, 30 radiații electromagnetice, 37 bromură de etidiu, 450, 457
acid dimetilbenzen-sulfonic, 425 captarea electronilor, 198 excitare, 39, 45
sulfat de dimetil, 469 detector de captură de electroni, spectru de excitație, 45, 73
derivat dinitrofenil, 359 122 spectrometru de rezonanță de volumul de excludere, 151
matrice de diode, I 04 spin de electroni. standard extern, 110
difenilamină, 326, 457 troscopie, 85
formă dipolară, 348 orbital electronic, 40
dipol, 44 tranziție electronică, 42 Test F, 11
voltampermetrie ciclică în curent compus electrofilic, 122 FAB, 126
continuu, 189 electroforeză Faraday, 185
dizaharidă, 318 tampoane, 132 bombardament ionic rapid,
analizor discret, 212 capilară, 144 126 acid gras, 407, 433, 440
dispersia unui spectru, 65 mass-media, 135 FDNB, 359, 368
separarea deplasării, 96 de aminoacizi, 370 Fehling, 325
electroforeza de deplasare, 142 de acizi nucleici, 451 testul de fermentare, 335
constanta de disociere, 350 de proteine, 397 ferocianură, 325
legătură disulfură, 383 electroporare, 465 ferocen, 193
ADN electrospray, 127 proteină fibroasă, 383
ligaze, 459 atomizare electrotermică, 83 FID, 121
polimeraza, 460, 464 ELISA, 249 tranzistor cu efect de câmp,
sonde, 461 emisie de radiații, 45 spectru de 193 filtru, 62
secvențiere, 468 emisie, 45 Fischer, 264
structură, 444 EMIT, 254 Formula de proiecție Fisher, 410
Derivat DNP, 359, 370 enantiomer, 307, 348 test enzimatic cu schimbare fixă,
dozimetrie, 202 umplere finală, 462 280 test enzimatic cu timp fix, 279
legătură dublă, 41 testul substratului de punct final, fotometru cu flacără, 77
cromatografie cu dublă dezvoltare, 299 enediol, 325 detector de ionizare cu flacără,
432 nivelurile energetice ale unei 121 constantă de balon, 284
Dragendorff, 437 molecule, 43 constanta de entropie, FLEC, 115, 118
electrod de mercur în cădere, 189 293 florisil, 431
analizor de chimie uscată, 2 I 4 cicluri enzimatice, 300 analiza fluxului, 217
dsDNA, 456, 460 de enzime celulă de curgere, 104
analizor cu două canale, 218 activare, 267 diagrama de flux, 220
legarea coloranților, 393 analiză, 273 analiza injecției de flux, 223
calcule, 280, 286, 289, 291 modelul mozaicului de flux,
clasificare, 258, 474 sistem de 421 fluorescamină, 358
ECD, 122 numerotare a comisioanelor, fluorescență, 45, 73, 358, 456
EDL, 81 258 imunoas- polarizare fluorescență, 45,
procedura de degradare Edman, 361 efectul pH-ului, 260 73, 358, 456 imunoa-
volumul efluentului, 151 efectul temperaturii, 259 să zicem, 254
Reactivul lui Ehrlich, 362, 369 electrod, 192, 304, 331 fluorimetru, 74
detectoare electrochimice, I 05, 189 imunodozare, 249 testul enzimatic fluorimetric, 290
potențial electrochimic, 133 inhibiție, 268 fluorodinitrobenzen, 359, 368
cromatografie electrocapilară, cinetică, 260 fluoroenilmetilcloroformiat de
146 etichetă, 249 fluoroenil, 390
lămpi cu descărcare fără electrozi, mecanisme, 264 fluoroimunoanaliză, 250
81 potențial de electrod, 170 unități, 257 FMOC-CL, 390
electroeluzie, 453 epimer, 309 FMN, 293
electroendosmoză, 134 epitop, 234 extracție Folch, 425 Polin
electroliză, 185 grup ecuatorial, 313 și Ciocalteu, 392 Polin și
ergocalciferol, 413 Wu, 326 formazan, 333
ergosterol, 413 formilare, 241
eroare, 6
484 Index
frecvență, 6 glicogen, 322,327 hialuronat glicanhidrolază, 322

Adjuvantul Freund, 235 glicolipide, 315,318,418,437 acid hialuronic 322
forța de frecare, 154 glicoproteină, 315 hibridizare, 448,461
separarea frontală, 94 glicozamină, 315 hibridom, 235
fluorescența feței frontale, glicozaminoglican, 315 hidrazină, 469
74 fructofuranosidază, 329 glicozidază, 3139, 329 legătura de hidrogen, 382, 448, 456
fructoză, 312 glicozidă, 318 electrod de hidrogen, 171
combustibili pentru spectroscopia de hidroxil glicozidic, 318 lampă cu hidrogen, 61
flacără, 78 furanoză, 313 glicozipide, 419 peroxid de hidrogen, 193, 330, 427
furfural, 327 glicozilamină, 317 hidrolază, 258, 319, 476
glicozilceramină, 419 hidroliză, 425, 433, 440
glicozidildiacilglicerol, 419 legătură hidrofobă, 383
galactoză, 326, 335 glicil-leucină, 368 cromatografie de interacțiune
galactoză dehidrogenază, 335 bune practici de laborator, 27 eluție hidrofobă, 383 cromatografie de
galactoză oxidază, 334 în gradient, 94, 124; 377,454 interacțiune hidrofobă.
celulă galvanică, 169 starea fundamentală, 42 grafie, 404
contor gamma, 204 tiocianat de guanidină, 451
radiații gamma, 198, 248 Guthrie, 363
gangliozidă, 315,420 ICP, 79
cromatografie lichidă în fază lgA, 233
gazoasă, 118 de aminoacizi, hemoglobină, 59, 89,386 IgD, 233
371 semicelula, 170 IgE, 233
de carbohidrați, 338 timpul de înjumătățire, 199 IgG, 233
de lipide, 438 semi-reacție, 170, IgM, 233
metode gazometrice, 282 potențialul de semiundă, 188 iminoacid, 343, 356, 368, 383
pentru aminoacizi, 356 hapten, 227, 235 enzimă imobilizată, 161, 194, 302,
electrod de detectare a gazelor, 191 formula de proiecție Haworth, 313 331
Tub Geiger-Muller, 202 pericole, 23 răspuns imunitar, 228, 234
tehnici de difuzie pe gel, 239 sănătate și siguranță, 24 imunizare, 234 cromatografie de
filtrare pe gel, 149 lanț greu, 232 imunoafinitate,
cromatografie de permeabilizare pe înălțimea echivalentă cu o placă 166
gel, 149 de proteine, 153, 404 teoretică, 108 imunoblotting, 243
Respirometru Gilson, 285 nucleul de heliu, 197 imunoelectroforeză, 241, 402
celulă de sticlă, 70 hemiacetal, 311 imunoglobulină, 231
electrod de sticlă, 174 Henderson-Hasselbalch, 350 imunohistochimie, 242
filtru de sticlă, 62 heteroenzimă, 272 testul imunometric, 246
GLC, 118 HETP, 108 imunoprecipitare, 238
proteină globulară, 383 hexokinaza, 274, 334 enzimă indicatoare, 274
glucomutorotază, 329 hexoză,274, 326,334 ipoteză de potrivire indusă,
analizor de glucoză, 332 HIC,404 266
glucoză dehidrogenază, 333 cromatogie lichidă de înaltă plasmă cuplată inductiv, 79 răspuns
electrod de glucoză, 332 performanță, 102,340,372,454 inflamator, 228
glucoză-oxidază, 48, 193, 294, 300, histogramă, 7 radiație infraroșie, 39, 43, 61
329 Hofstee, 264 spectroscopie în infraroșu, 43
glucoză-6-fosfat dehidrogenază, lampă cu catod gol, 81 rețea inhibitor, 268, 301
274,300,334 holografică, 66 viteza inițială, 278
acid glucuronic, 316 imunoanaliză omogenă, 253 inactivarea inserțională, 466
glutamat dehidrogenază, 289, 365 omogenizare, 295 insolubilizarea proteinei, 164 INT,
gliceraldehidă, 308, 348 enzimă omologă, 272 428
gliceride, 410 homopolizaharide, 315, 327 interferențe, 4, 9, 19
glicerol, 410, 426, 456 HPLC, 102 filtru de interferență, 62
glicerol kinaza, 428 imunitate umorală, 229 interleukină, 231
glicerofosfolipide, 416 standard intern, 79, 110, 379
unitate enzimatică
internațională, 259
Index 485
colorimetrie inversă, 325
486 Index
iodare, 248 lactat dehidrogenază, 271, 299,364 lizină, 227

izotopi de iod, 196, 248 lactoperoxidază, 248 lizofosfolipide, 417
iodogen, 249 laevo-rotatorie, 310
violet de iodonitrotetrazoliu, 428 lanțul lambda, 232
cromatografie cu schimb de ioni, clorură de lantan, 84 Ml3, 466
129 de aminoacizi, 373 laser, 73 macrofage, 231
de carbohidrați, 341 latență, 295 spectroscopie de rezonanță magnetică,
de lipide, 431 Laurell, 241 85 Mancini, 239
de acizi nucleici, 456 lectină, 166 colector, 218
de proteine, 404 LED, 72 mannoză, 334
cromatografie cu perechi de ioni, leucil-alanină, 363 enzimă marker, 297
117 Graficul Levey-Jennings, 21 spectrometrie de masă, 125
electrod selectiv de ioni, 175, 216, Liebermann și Burchard, 428 Iigase, efectul de matrice, 79
292,303 258, 459, 478 metoda Maxam și Gilbert, 469 viteza
sursă de ioni, diodă emițătoare de lumină, maximă, 156
126 72 metode de liniarizare, 33 McReynold constant, 123
forță ionică, 131, 398 analiză de regresie liniară, 18 medie, 6
centrifugare de izo-densitate, 159, Lineweaver și Burk, 264, 276 mediator, 193
450 acid linoleic, 409 MEKC, 145
focalizare izoelectrică, 139 bistrat lipidic, 421 imunoanaliză pe bază de membrană,
pH izoelectric, 140, 358 lipide 255 lampă cu vapori de mercur, 61
izoenzima, 272 metode cromatografice, 432 antagonist metabolic, 363
pH izo-ionic, 358, 385 clasificare, 408 derivați metehanoliză, 327
separare izocratică, 103 pentru GLC, 438 extracție, metoxi-5-metil-1-fenaziu
izomerază, 258,477 429 metilsulfat de metil, 366
izomerie, 307, 347 polaritate, 430 glicozidă de metil, 327
izotacofereză, 142 separare, 429 portocaliu de metil, 393
analiza izotermă, 124 lipoproteine, 421 roșu de metil, 42
diluție izotopică, 207 electrod cu membrană lichidă, 178 metilare, 433
etichetare izotopică, 206, 248 cromatografie lichidă lichidă, 101 Constanta Michaelis, 261
localizarea reactivilor Michaelis-Menten, 261
pentru aminoacizi, 368 material de ambalare cu
J lanț, 233 pentru carbohidrați, microparticule, 107
336 coloane microbore, 119
pentru lipide, 436 testul enzimatic microcalorimetric,
K., 358 pentru acizi nucleici, 293
lanțul kappa, 232 453 pentru proteine, fracțiune microsomală, 157
katal, 258, 280 400 fracțiune mitocondrială, 157
katharometru, 120 ipoteza "lacătului și a cheii", fază mobilă, 1I6
cheratină, 383 269 logit, 33 clasa modală, 6
cetoză, 307 injector de buclă, 103 modulație, 81
testul cinetic al enzimei, 278 Lowry, 393 coeficient de absorbție molară, 54,
testul cinetic al substratului, 300 luciferaza, 250, 293 289,298,387
kjeldahl, 388 luciferină, 291 conductivitate ionică molară, 183
Klenow fragment, 460, 470 luminescență, 48, 291 test spectroscopie de absorbție moleculară,
Km,261 enzimatic luminescent, 291 49
Koshland, 266 imunoanaliză luminescentă, 250 spectroscopie de emisie moleculară,
Kovat, 123 etichete luminescente, 250 73 cromatografie de excludere
luminol, 48 moleculară
LUO, 224 phy, 149
raport de laborator, 33 liază, 258, 477 determinarea greutății moleculare,
sistem de gestionare a informațiilor ganglion limfatic, 228 153, 163,400
de laborator, 26 limfocite, 228 Molisch, 326
operațiuni de laborator, 224 Iimfokină, 230
gena Lac Z, 467
Index 487
albastru de molibden, 325,437 ODS, 115, 404 fenilcetonurie, 364
radiație monocromatică, 50 acid oleic, 409 feniltiocarbanoil, 390
monocromator, 61 oligonucleotide, 455, 463 derivați de feniltiohidantoină, 361
anticorp monoclonal, 235, 246 o-ftalaldehidă, 358, 377 ester fosfatic, 316
monoglicozil ceramidă, 315,420 activitate optică, 310 derivat fosfatidic, 417
monosaccharide, 307 materiale optice, 70 acid fosfatidic, 4 I 7
Curba Morse, 46 sistem optic, 70 derivat fosfatidilat, 417
electroforeza cu graniță mobilă, test enzimatic optimizat, 274 fosfofructokinaza, 271
133 orcinol, 326, 437 fosfoglucoza izomeraza, 334
MPMS, 366 enzime marcatoare de organite, fosfogliceride, 416
mucopolizaharide, 315 297 organofosforice, 269 fosfolipide, 416,431 reactiv acid
analizor multicanal, 217 osazonă, 335 fosfomolibdic, 325 fosfonolipide, 417
mutarotasă, 312, 330, 333 OSHA, 24 fosforescență, 48
enzimă oxidativă, 283 fosforil colină, 417
electrod de oxigen, 190, 293, 331 reactiv fosfo-vanilină, 425
Aminoacidul N-terminal, ozonoliză, 442 detector fotoconductiv, 67
382 Analiza N-terminală, detector fotoelectric, 67
359 tub fotoemisiv, 68
NAD(P)H, 287, 333 32P, 196, 462 fotometru, 60
nanometru, 37 p-a acid minobenzoic, 326 fotomultiplicator, 68
negatron, 197 p-a acid minosalicilic, 326 celulă fotovoltaică, 67
Nelson și Somogyi, 326 p-b romoanilină, 326 metode fiziologice de analiză, 4
neocuproină, 325 p orbitală, 40 test pl, 139,351
nefelometrie, 238 t împerecheat, 14 legătura pi, 41
Ecuația Nernst, 170 cromatografie pe hârtie, 101, 336, pK., 274, 351
Nernst glower, 61 366 Planck, 37
raportul dintre neutroni și volum specific parțial, 163 celulă plasmatică, 230
protoni, 197 translație de cromatografie de partiție, IOI spectroscopie de emisie cu plasmă, 79
poante, 461 reactivul lui Pauly, 369 plasmalogen, 418
ninhidrină, 356, 368, 377, 437 PCR, 463 plasmidă, 465
membrană de nitroceluloză, 462 material de ambalare pelicular, 106 foaie plisată, 385
conținutul de azot al proteinelor, pentoză, 307, 326 PLOT, 112
388 nitrosonaftalină, 362 peptidă, 353, 360 P02 , 191
inhibiția necompetitivă, 269 legătură peptidică, 353, 382 polaritate, 93, 191, 117
dezvoltare normală, 96 secvențierea peptidelor, 360 lumină polarizată, 310
distribuție normală, 8 peptidoglican, 316 polarografie, 188
Northern blotting, 463 diluții procentuale, 31 coada poli(A), 455
fracțiune nucleară, 157 oxidarea periodatului, 327 gel de poliacrilamidă, 137, 397
spectroscopie prin rezonanță pompă peristaltică, 218 oxidare antiserum policlonal, 235 reacție în
magnetică nucleară, 85 permanganat-periodat, lanț a polimerazei, 463 leucocite
clonarea acizilor 442 polimorfonucleare, 228
nucleici, 465 peroxidază, 250, 427 polinucleotide kinaza, 461
izolare, 449 gradient de pH, 139 polizaharide, 318, 327
metode de analiză, 456 măsurarea pH-ului, 174 polivinilpirolidonă, 330
purificare, 449 pH stat, 292 ponceau S, 400
secvențiere, 468 fagocit, 228 pozitron, 198
structură, 444 fenobarbitonă, 59, 110 biosenzor potențiometric, 193 test
nucleofil, 267 fenol-cloroform, 467 enzimatic potențiometric, 292
nucleozidă, 317, 444 fenilalanină, 364 potențiometrie, 169, 193 precipitare
nucleotidă, 444 fenilalanină dehidrogenază, 384, cu anticorpi, 238 precipitină, 227
390
fenilizotiocianat, 361
octadecilsilan, 115, 404
octilsilan, 115, 404
488 Index
precizie, 9 determinarea masei moleculare sefarose, 403

răspuns imunitar primar, 230 relative, 153, 163, 400 analizor secvențial multiplu, 217
structură primară, 382 timp de retenție relativ, 109, 441 graficul Shewart, 150
amorsă, 463 abatere standard relativă, 10 Unități SI, 29
prismă, 65 reproductibilitate, 9 SIMS, 126
formular de risc de procedură, 25 indice de rezoluție, I 07 sigma bond, 41
pompă de dozare, 218 frecvența de rezonanță, 88 cifre semnificative, 13
grup protetic, 267 linia de rezonanță, 39, 45 celulă de silice, 70
proteine resorcinol, 326, 437 silicagel, 100, 336, 432
electroforeză, 397 metode factor de răspuns, 111, 379 mătase, 383
de analiză, 386 precipitare, endonuclează de restricție, 458 placă cu strat subțire de nitrat de
397 timp de retenție, I 07, 123 argint, 432 reactivi de sililare, 124,
structură, 381 sistemul reticulo-endotelial, 228 338, 371,
proteinaza K, 449 retină, 414 438
proteoglicani, 315 retinol, 414 lipide simple, 410
PTC, 390 cromatografie în fază inversă, 117, analizor cu un singur canal, 218
PTH, 361 404,454 tranziția singlet, 47
piranoză, 311 transcriptază inversă, 460 SMA, 217
Re, 101,336 numerotare sn-stereospecifică, 409
Rg,336 deoxicolat de sodiu, 295
spectrometru de masă cuadripolar, rodamina, 436 dodecilsulfat de sodiu, 400,404,
114 raport calitativ, 1 RIA, 248 449
asigurarea calității, 19 ribonuclează, 449 hipoclorit de sodiu, 358
evaluarea controlului calității, 19 riboză, 307 anticorp în fază solidă, 249, 253, 403
analiza quanta!, 4 ARN, 317,448 electrod în stare solidă, 178
cuantificare prin cromatografie pe robotică, 224 fracțiune solubilă, 157
coloană, 110 electroforeza rachetelor, 241 puterea solventului, 116
raport cantitativ, I tranziție rotațională, 43 sisteme de solvenți pentru
celulă de cuarț, 70 RT-PCR, 464 cromatografie, 337,367,430
structura cuaternară, 386 POS, 26
stingerea fluorescenței, 75 Blotting sudic, 462
s orbitală, 40 sp orbital, 40
fracționarea sării, 397 activitate specifică
Convenția R-S, 348 unitate de eșantionare, 219 a enzimelor, 257
amestec racemic, 311 Sanger, 359 de radioizotopi, 200
radioactivitate, 196 saponificare, 410, 427, 433 conductanță specifică,
degradare, 199 semnal de saturație, 79 183
detecție, 210 scintilant, 203 rotație specifică, 312
etichetare, 206, 461 contor de scintilații, 203, 248 specificitate, 19
siguranță, 200 SCOT, 119 spectrometru, 60
unități, 200 electroforeză SDS, 400 răspuns spectrofotometru, 60 testul enzimatic
analiza radioactivării, 208 imunitar secundar, 230 spectrofotometric,
radioimunoanaliză, 248 spectrometrie de masă cu ioni 286
eroare aleatorie, 6 secundari, spectru, 38,
RCF, 155 126 reflexie speculară, 64
proteine receptoare, 166 structura secundară, 382 sfingolipide, 417
complot reciproc, 33 bucată de secretor, 233 sfingomielină, 417
ADN recombinant, 461 spectrometrie de masă sectorială, sfingosină, 417
reacție redox, 170, 193 127 coeficient de sedimentare, 156, squalane, 123
înălțimea redusă a plăcii, 109 163, izotop stabil, 197
rețea de reflexie, 66 423 abaterea standard, 7 eroarea
fotometrie de reflectanță, 215 Seliwanoff, 326 standard a unei medii, 8
sensibilitate, 19 procedură standard de operare, 26
Sephadex, 150 soluție standard, 54
Index 489
amidon, 136, 318, 327 curbe de titrare, 351 uzură, 112
fază staționară, 115, 122, 438 Derivați TMS, 124, 338, 371, 438
stereoisomerie, 307, 347 tocoferol, 414
steroid, 412 toluidină, 326 drojdie, 335
capete lipicioase, 459 tampon de reglare a tăriei ionice
lumina rătăcită, 52 totale, 180
vibrații de întindere, 44 trasor, 206 potențial zeta, 133, 385
strictețe, 462 transferază, 258, 475 electroforeză zonală, 133
enzime subcelulare, 297 transesterificare, 433 separare zonală, 96
organite subcelulare, 150 transformare, 467 zwitterion, 349
testul substratului, 297 transilurnator, 453
inhibarea substratului, 276 transmitanța, 50
subtilizină, 460 triacilglicerol, 410,431, 433, 438
zaharoză, 323 tranziție triplet, 47
acid de zahăr, 316 Triton XIOO, 295,449
ester de sulfat, 316 adevăr, 13
sulfolipide, 416,431 triptofan, 387
sulfonamidă, 269 lampă cu tungsten, 61
ADN supraînfășurat, 450 metode turbidometrice, 238
coloană tubulară deschisă acoperită cifra de afaceri, 258
cu suport, 119,440 separare bidimensională, 367,
Unitatea Svedberg, 163, 423 370,432
eroare sistematică, 8 tirozină, 362, 387
T4 ligază, 459 ultracentrifugare, 153

T4 fag, 459 ultrafiltrare, 147
Limfocitul T, 229 dezintegrator cu ultrasunete, 296
test t, 13 radiații ultraviolete, 39, 67
reziduuri, 102, 135 inhibiția necompetitivă, 269
taq polimeraza, 477 unități, 29
spectrometrie de masă în tandem, acid uronic, 316
128 analiză cu gradient de
temperatură, 1214,
438 Van Slyke, 356
șablon, 460 vectori, 465
structura terțiară, 383 tranziție vibrațională, 44
fosfat de tetrabutilamoniu, 117 cromozomi virali, 466
tetraciclină, 467 radiația vizibilă, 37, 39, 67
tetrametilendiamină, 137 tuburi de vizitare, 387
sare de tetrazoliu, 333 placă vitaminele A, D, E, K, 414
teoretică, l 07 vmax- 261
detector de conductivitate termică, volumul gol, 151
120 termocuplu, 69 celulă voltaică,
termociclator, 463 I69
thienylalanină, 364 voltampermetrie,
cromatografie în strat subțire, 99, 188
336,
366,432
timus, 229 coloane acoperite cu pereți, 112
spectrometrie de masă cu timp de Manometrie Warburg, 282
zbor, 112 lungime de undă, 37
TISAB, 180 numărul de undă, 44
cultura de țesuturi, 4, 306 ceară, 410, 439
490 Index

Analytical Biochemistry 3rd Ed - D. Holme, H. Peck (1998) WW-pages-Toata

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Analytical Biochemistry 3rd Ed - D. Holme, H. Peck (1998) WW-pages-Toata

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biochimie analitică

David J. Holme și Hazel Peck

și companii asociate din întreaga lume

Vizitați-ne pe World Wide Web la:

© Addison Wesley Longman Limited 1998

Drepturile lui David J. Holme și Hazel Peck de a fi identificați

Toate drepturile sunt rezervate; nicio parte a acestei

Prima publicare 1983

ISBN 0 582 29438-X

Biblioteca Britanică Date de catalogare în publicație

O fișă de catalog pentru această carte este disponibilă la British Library

Biblioteca Congresului Catalogare în date de publicare

Tipărit de 55 în 10/12 Times

Prefață la a treia ediție Vlll

1 Principii generale de biochimie analitică 1

4 Metode electroanalitice 168

6 Metode automatizate de analiză 210

7 Metode imunologice 227

Structuri lipidice-proteice 421

13 Acizi nucleici 443

Apendice: Numerotarea și clasificarea enzimelor 474

respectiv metode. De asemenea, le suntem recunoscători numeroșilor colegi

J.W. Suttie, Introducere în biochimie. Holt, Rinehart and Winston, New

• Selectarea unei metode valide de analiză

Biochimia analitică implică utilizarea metodelor de laborator pentru a

Pentru a putea alege o metodă analitică adecvată, este esențial să se cunoască

Tabelul 1.1 Baza fizică a metodelor analitice

măsurarea obținută și cantitatea de substanță din eșantion.

Tabelul 1.2 Metoda generalizată de analiză

Purificarea substanței de testat

1.1.1 Metode instrumentale

a dus la dezvoltarea a numeroși reactivi complecși concepuți pentru a

1.1.2 Metode fiziologice

Utilizarea de celule din țesuturi specifice cultivate în culturi, mai

Tabelul 1.3 Bioteste care utilizează linii celulare

Prolactină Celule de limfom de Creștere

Măsurarea activității catalitice a unei enzime este, de asemenea, un

1.1.3 Kituri de testare

2. Care dintre următoarele se poate spune că este un rezultat cantitativ?

1.2.1 Variabilitatea datelor analitice

Intervalul clasei Frecvență

Calculul abaterii standard necesită un număr mare de replici.

Limite definite în jurul mediei în Procentul de măsurători totale care se

partea de măsurători care se încadrează în intervale definite. Două limite

Prin urmare, există un avantaj considerabil în efectuarea unui număr

1.2.2 Evaluarea metodelor analitice

Coeficientul de variație sau abaterea standard relativă exprimă abaterea

abaterea standard, implicațiile valorilor coeficientului de variație pentru două

Tabelul 1.5 Un exemplu de abatere standard și

Medie (x) Experimental

Utilizarea coeficientului de variație (JI) arată că precizia

Este posibil să se demonstreze un grad ridicat de precizie într-un set de

O comparație a impreciziei a două metode poate ajuta la alegerea uneia

numărul de cifre semnificative care trebuie menționate în orice rezultat

nsă, atât imprecizia (eroare aleatorie), cât și orice distorsiune (eroare

Formula pentru testul "t" descrisă în procedura 1.3 compară media

linia dreaptă poate fi evaluată cu ajutorul coeficientului de corelație (r). O

Este posibil ca două metode care diferă semnificativ în ceea ce privește

o eroare sistematică care ar fi fost într-un fel proporțională cu concentrația

1.2.3 Asigurarea calității în biochimia analitică

în mod corespunzător. Atitudinea personalului implicat este de o importanță

cea mai evidentă implicație este că rezultatul ar putea fi greșit. Deducții

Limitele mai restrânse sunt cunoscute, de obicei, ca limite de