Testarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice.

Metoda difuzimetrică. Tehnici cantitative

1. Categorii de sensibilitate la antibiotice ale tulpinilor bacteriene:

 S – Sensibil la doze standard (expunere normala) – exista o probabilitate mare de

succes terapeutic la administrarea de antibiotic in doze standard

 I – Sensibil la expunere crescuta – exista o probabilitate mare de succes terapeutic

cand expunerea la antibiotic este crescuta, fie prin ajustarea regimului de
administrare a antibioticului, fie prin concentrarea antibioticului la locul infectiei.

 R – Rezistent - exista o probabilitate mare de esec terapeutic chiar si in cazul

expunerii crescute la antibiotic.

Expunerea defineste influenta pe care modul de administrare, doza, intervalul dintre doze,
distributia si eliminarea antibioticului din organism o au asupra agentului etiologic la locul
infectiei.

2. Metoda difuzimetrică

Principiu: pe suprafaţa mediului Mueller-Hinton însămânţat uniform cu tulpina de testat

depunem microcomprimate cu diferite antibiotice; antibioticul difuzează circular în mediu,
realizând concentraţii descrescătoare; cultura este inhibată în zona în care antibioticul
realizează concentraţii ≥ concentratia minimă inhibitorie (CMI)

CMI = concentratia minimă de antibiotic care inhibă cresterea vizibila a unei tulpini
bacteriene.

Indicaţii: testarea uzuală a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor cu creştere rapidă.

Necesar şi procedură:

- realizarea unei suspensii a tulpinii de testat (folosind cultura pură) cu densitatea de 10 8

UFC/ml, apreciată cu standardul de 0,5 McFarland;

- impregnarea cu această suspensie a unui tampon de vată steril cu ajutorul căruia se

însămânţează uniform suprafaţa mediului Mueller-Hinton;

- depunerea microcomprimatelor cu antibiotice;

1
 - incubare la 35º ± 1° C, timp de 18 ± 2 ore;

- în cursul incubării, antibioticul difuzează circular în mediu, realizând concentraţii

descrescătoare în raport cu distanţa faţă de microcomprimat; cultura este inhibată în zona în
care antibioticul realizează concentraţii ≥ CMI.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC –

American Type Culture Collection) cu sensibilitate cunoscuta la antibioticele testate, cu
ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru.

 Citire şi interpretare: diametrul zonei de inhibiţie a creşterii (mm), se compară cu cele

două diametre critice superior (D) si inferior (d) pentru definirea tulpinii ca “S”, “I”
sau “R”.

 Daca “D” si “d” au aceeasi valoare, categoria “I” nu se aplica in acel caz.

≥D ≤d

S I R
Rezistent
Sensibil la Sensibil la
expunere expunere
normala crescuta

Avantaje: posibilitatea testării simultane a sensibilităţii faţă de mai multe antibiotice

Dezavantaje: concordanţa redusa a rezultatelor obţinute in vitro cu rezultatele terapiei in
vivo.
Notă: de subliniat timpul necesar pentru obtinerea unui rezultat final (primocultură, cultură
pură etc)
3. Metode cantitative

Principiu: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânţat într-un gradient discontinuu
de concentraţii de antibiotic; după incubare este urmărită CMI.

Indicaţii:

- precizarea categoriei de sensibilitate a unei tulpini clasificate in categoria “I”

prin antibiograma difuzimetrică;
- determinarea sensibilităţii bacteriilor fastidioase;
- testarea rezistenţei S. aureus faţă de vancomicină.

2
 a. Metoda diluţiilor în mediu lichid
Necesar şi procedură:

- realizarea de diluţii duble succesive de antibiotic în bulion Mueller-Hinton;

- se adaugă câte 0,1ml din suspensia de 5x105UFC/ml a tulpinii de testat;
- se utilizează un martor cultivare şi a unui martor sterilitate mediu;
- incubarea mediilor la 35º ± 1° C, timp de 18 ± 2 ore.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC), cu

ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru

Citire şi interpretare:
 CMI corespunde celei mai mici concentraţii de antibiotic (µg/mL), care determină
inhibarea vizibilă a creşterii, comparativ cu martorii pentru cultivarea tulpinii şi
sterilitatea mediului;
 raportăm această valoare la cele două concentraţii critice, maximă (C) şi minimă (c)
pentru definirea tulpinii ca S, I sau R.
Rezultatul este formulat după ce am verificat dacă, CMI a tulpinii de referinţă se
încadrează între valorile recunoscute de standard.

≤c ≥C

S I R
Sensibil la Sensibil la Rezistent
expunere expunere
normala crescuta

Avantaje: determinarea cu exactitate a CMI.

Dezavantaje: realizarea testării faţă de un singur antibiotic folosind o cantitate mare de

materiale şi medii.

b. Testul E
 îmbină acuratețea testării cantitative și simplitatea testării difuzimetrice
cu mare economie de timp;

3
 pe o suprafață a unei langhete de 5mm / 50 mm din plastic inert este
fixat un gradient exponențial de antibiotic, cu 15 diluții, iar pe cealaltă suprafață
este marcată scala de lectură în µg/ml corespunzătoare CMI;
 langhetele cu antibiotic sunt depuse radiar pe suprafața unei plăci cu
mediu agar Mueller Hinton, preînsămânțată cu tulpina testată în condiții
standardizate. După incubarea corespunzătoare, CMI este indicată de intersecția
dintre zona elipitică de inhibiție a culturii și scala de gradiente a langhetei;
 testul este fiabil, reproductibil și permite determinarea concomitentă, a
CMI pentru mai multe antibiotice.