MICROSCOPIA ELECTRONIC

Microscopia electronic utilizeaz instrumente de examinare (microscoape

electronice) care funcioneaz pe baza unui fascicul de electroni de nalt energie
(accelerai) n scopul examinrii unor detalii de dimensiuni reduse ale obiectelor
observate.
Dimensiunile relative ale structurilor biologice i sistemele de vizualizare specifice
sunt prezentate n figura de mai jos:


Tipuri de microscoape electronice
Se descriu, la ora actual, cteva tipuri de microscoape electronice, utile n
cercetarea biomedical sau n completarea diagnosticului de laborator:
- Microscopul electronic de transmisie (TEM)
- Microscopul electronic de baleiaj (SEM)
- Microscopul electronic de reflexie (REM)
- Microscopul electronic de baleiaj i transmisie (STEM)
- Microscopul electronic cu voltaj redus (LVEM)

Microscopul electronic se deosebete de cel fotonic prin faptul c utilizeaz ca sistem
de examinare un fascicul de electroni emis ntr-un sistem vidat, n locul unui fascicul
de fotoni. Scopul acestui tip de microscop este de a produce, asemenea celui
fotonic, o imagine mrit a preparatului. Cu toate acestea, microscopul electronic are
o putere de rezoluie mai mare dect un microscop fotonic, datorit dependenei
acestei puteri de lungimea de und a radiaiei electromagnetice folosite. Electronii au
o lungime de und de 100.000 de ori mai mic dect cea a luminii vizibile (fotoni) iar
lungimea de und este invers proporional cu puterea de mrire. n plus, cu ct
electronii au o vitez mai mare (implicit, cu ct tensiunea de accelerare este mai
mare), cu att lungimea de und este mai redus i rezoluia microscopului electronic
crescut. Rezoluia microscopului electronic ajunge la circa 0,2 nm i la mriri de
circa 2 milioane de ori, n timp ce microscoapele optice obinuite (non-confocale)
sunt limitate de fenomenul de difracie la o rezoluie de 200 nm i mriri sub 2000 de
ori. Rezoluia TEM este limitat adesea de aberaiile de sfericitate dar noile sisteme
corectoare i tensiunile de alimentare mari au dus la apariia HRTEM (high resolution
TEM) care are o rezoluie sub 50 pm i o putere de mrire de circa 50 de milioane de
ori.
Lentilele utilizate n microscopia electronic sunt electrostatice sau electromagnetice,
spre deosebire de microscopia optic, unde lentilele sunt din sticl sau compozite
transparente. Lentilele de sticl nu pot influena traiectoria fasciculului de electroni.
Formarea imaginii depinde de electronii transmii prin preparat (TEM) sau emii
secundar de ctre acesta (SEM).

Informaii obinute cu ajutorul microscopiei electronice
Informaiile care se pot obine cu ajutorul microscoapelor electronice se refer la
ultrastructura unor probe biologice sau anorganice, care pot cuprinde:
microorganisme, celule, molecule mari, fragmente tisulare, metale sau cristale.
Aceste informaii pot sublinia:
- Topografia - caracteristicile de suprafa ale unui obiect, textura, raportul
direct dintre aceste caracteristici i proprietile materialului din care este
compus obiectul (duritate, reflectivitate);
- Morfologia - forma i/sau dimensiunile componentelor unui obiect, relaia
dintre aceste structuri i proprietile materialului din care este compus
obiectul (ductilitate, rezisten, reactivitate);
- Compoziie - cantitatea i calitile elementelor dintr-un obiect analizat; relaia
direct dintre compoziie i proprietile obiectului studiat;
- Noiuni cristalografice - modul de distribuie a atomilor i relaia cu proprietile
obiectului de studiat.
n biologie, scopul declarat al dezvoltrii microscoapelor electronice este de a
investiga aspecte ale universului celular, inaccesibile prin examinarea cu ajutorul
microscoapelor optice. Astzi, pornind de la principiul dezvoltat de Ernst Rushka i
Max Knoll n 1931, putem examina ultrastructura celulelor i chiar a organitelor
celulare. n aprilie 2010, la centrul de microscopie de la Universitatea California, LA,
SUA a fost publicat prima imagine a unui atom, obinut prin crio-
electronomicroscopie, iar posibilitile de explorare ale universului submolecular i
chiar subatomic par inepuizabile.

Microscopia electronic de transmisie
Este o metod de investigaie microscopic n care un fascicul de electroni
este transmis printr-un preparat ultrafin, interacionnd cu elementele componente
ale preparatului i fiind refocalizat de o serie de lentile, pentru a genera imaginea
final, mult mrit, a obiectului de examinat.
Microscopul electronic de transmisie (TEM) utilizeaz un fascicul de electroni
de nalt energie, emii de un tun electronic care conine un filament de tungsten sau
un cristal de hexaborur de lantan (LaB
6
); filamentul sau cristalul menionate
formeaz catodul. Electronii sunt accelerai de un anod, la o diferen de potenial de
100 keV. Traiectoria electronilor este controlat cu ajutorul unor lentile
electromagnetice. Electronii sunt direcionai n form de fascicul de ctre lentilele
condensor i sunt orientai ctre preparat de ctre lentilele obiectiv. Lentilele de
proiecie direcioneaz fasciculul de electroni spre sistemul de formare a imaginii.
Acest sistem poate fi reprezentat de o plac fluorescent, o plac fotografic
acoperit de emulsie sau un senzor CCD care poate transmite imaginea spre un
ecran.

Rezoluia microscopului electronic
Rezoluia maxim (rez
max
)

pe care o poate atinge un microscop fotonic este
limitat de lungimea de und a fotonilor () i de apertura numeric a sistemului optic
(NA).
NA n
rez
2 sin 2
max

Apertura numeric (NA) a unui sistem optic reprezint o mrime
adimensional care caracterizeaz limita unghiului sub care acel sistem optic poate
accepta sau emite lumin. NA = n*sin, unde este semi-unghiul conului maxim de
lumin emis sau acceptat de o lentil (sistem optic).
Lungimea de und a fotonilor este mult mai mare dect a electronilor i astfel,
invers proporional, rezoluia maxim a unui microscop electronic este mult mai mare
dect a unuia fotonic. Lungimea de und a fasciculului de electroni nu reprezint un
factor limitant al rezoluiei TEM, deoarece aceast lungime de und este funcie de
energia electronilor i implicit de tensiunea de accelerare (ex. o rezoluie de 2 pm se
obine la o tensiune de 300 kV). Cu toate acestea, aberaiile de sfericitate (care
produc curbarea mai puternic a frontului de und la marginea lentilelor fa de axul
optic), cromatice sau de astigmatism ale lentilelor electromagnetice i instabilitatea
curenilor care le strbat limiteaz rezoluia la 50 pm chiar i pentru cele mai scumpe
TEM.

Prile componente ale unui microscop electronic
Un TEM include - o surs de emisie pentru electroni (tun electronic plus surs
de alimentare), o coloan care include lentile electromagnetice i plci electrostatice,
o camer a preparatului i o camer de examinare. Toate aceste sisteme sunt situate
ntr-un vid nalt, generat de un sistem special de vidare. Lentilele i plcile sunt
necesare manipulrii i ghidrii fasciculului de electroni. n plus, un sistem ecluz i
un dispozitiv special permite inseria, amplasarea sau ndeprtarea preparatului n
axul optic al microscopului. Ataate microscopului se regsesc sistemele electronice
de formare sau amplificare a calitii imaginii (camer video lateral sau de fund,
sistem de augmentare a contrastului, sisteme de imprimare a imaginii).

Schem de funcionare a microscopului electronic de transmisie

Prile componente ale microscopului electronic de transmisie Philips CM100 din dotarea disciplinei
de Biologie Celular i foarte Molecular Iai
-tun de electroni; -Sistem de vidare (pompe); -lentile electromagnetice i aperturi; -camera
probei, cu sistem de ecluz pentru vidare; ,- panouri de control (5 - pentru aliniere, 6 - pentru
mrire i focalizare); -ecran pentru afiarea imaginii captate de camera CCD; -camera de
observaie cu ecran fluorescent

Toate prile componente ale TEM n care circul electronii (de la filament la
sistemul de observaie din camera de formare a imaginii) sunt dispuse n interiorul
sistemului care genereaz un vid nalt.
Tunul electronic (sursa de electroni) este format din:
- filament (catod)
- circuit de polarizare
- cilindru Wenhelt (se citete "venelt")
- anod de extracie
Sursa de electroni, reprezentat de filamentul de tungsten sau de cristalul de
hexaborur de lantan (sau de ceriu) (catodul), nclzite de un circuit special.
Sursa de tensiune, de voltaj nalt, de obicei de 100-300 kV, alimenteaz
anodul i catodul. n plus, exist un circuit electric suplimentar pentru nclzirea
filamentului. Creterea curentului care trece prin filament duce la o saturaie a curbei
de emisie a electronilor. Pentru prelungirea duratei de exploatare a filamentului,
trebuie s existe un echilibru ntre nclzirea filamentului i tensiunea de accelerare.
Sistemul de extracie/filtrare a electronilor - cilindrul Wenhelt. Acesta este
format dintr-un circuit de polarizare cuplat la o diferen de potenial de numai cteva
sute de voli fa de filament (catod). Este util pentru focalizarea i controlul
fasciculului de electroni. A fost inventat n 1902, de ctre fizicianul german Arthur
Rudolph Berthold Wenhelt. Are rolul de a nu permite dispersia electronilor emii de
filament.
Sistemul de accelerare a electronilor - anodul. Este format dintr-o plac de
metal, perforat, ncrcat pozitiv.



Funcionarea sursei de electroni. Filamentul (sau cristalul) genereaz
electroni prin fenomenul de emisie termoionic (efect Edison) sau prin emisie
electronic asistat de cmp, n mediu vidat. Prin emisie termoionic, electronii sunt
emii de filamentul nclzit printr-un circuit electric separat. Curentul care traverseaz
filamentul controleaz temperatura acestuia (optim 2500K) i implicit numrul de
electroni emii. n general, avem nevoie de un numr mare de electroni emii de o
regiune ngust a filamentului; putem obine acest efect prin "saturarea" filamentului,
implicit creterea curentului n filament pn la un prag limit (unde numrul de
electroni emii rmne constant) Electronii sunt emii cu o anumita vitez, ctigat
prin ciocniri cu atomii care au o agitaie violent datorat temperaturii generate de
alimentarea filamentului (catod). O parte mic din aceti electroni ating anodul chiar
in lipsa unui cmp electric aplicat. Electronii sunt apoi extrai i selectai cu ajutorul
cilindrului Wenhelt, accelerai i focalizai cu ajutorul anodului. Circuitul de polarizare
controleaz dimensiunea regiunii de filament care emite electroni. Dac polarizarea
este prea mare, nu exist emisie de electroni. Variaia curentului de polarizare
influeneaz iluminarea probei. Orificiul specific al anodului emite un fascicul
divergent de electroni. Electronii de energie nalt permit examinarea unor probe cu
grosimi mai mari, dar determin i afectarea probei.
Lentilele electromagnetice au rolul de a focaliza razele paralele la o anumit
distan focal. TEM utilizeaz lentile electromagnetice pe baz de solenoizi (bobine)
care formeaz lentile convexe. Cmpul electromagnetic generat de aceste lentile
trebuie s fie simetric radial, n caz contrar aprnd aberaii de sfericitate, cromatice
sau astigmatism. Lentilele sunt alctuite din fier, fier-cobalt i aliaje nichel-cobalt cum
ar fi permalloy-ul.
Lentilele TEM sunt dispuse pe 3 nivele - condensor, obiectiv, proiector:
- lentilele condensor au rolul de a forma fasciculul primar de electroni;
- lentilele obiectiv au rolul de a focaliza fasciculul de electroni dup trecerea prin
preparat;
- lentilele proiector au rolul de a proiecta fasciculul care provine de la lentilele
obiectiv pe ecranul fluorescent sau pe senzorul CCD.
Lentilele posed i un sistem de rcire bine calibrat care disip cldura
format n timpul utilizrii.
n plus fa de lentile, coloana TEM mai include plci metalice inelare
(aperturi) care au rolul de a exclude electronii care sunt mai ndeprtai de o anumit
distan fa de axul optic. Aceste plci sunt practic formate din discuri mici, metalice,
cu orificiu central, care sunt suficient de groase pentru a mpiedica trecerea
electronilor prin disc n timp ce trecerea electronilor axiali este permis. Aperturile au
rolul de a reduce intensitatea fasciculului de electroni precum i filtrarea electronilor
mprtiai sub unghiuri mari prin procese determinate de aberaii cromatice sau de
sfericitate.
Ajustarea lentilelor electromagnetice astfel nct planul imaginii este nlocuit cu
planul focal posterior determin obinerea unui spectru de difracie pe sistemul de
formare a imaginii. Probele cristaline formeaz o imagine cu un spectru multipunct n
timp ce probele policristaline sau amorfe genereaz un spectru de difracie inelar.


Spectru de difracie cristalin pentru o
granul de oel austenitic

Formarea imaginii pentru TEM depinde de modul de operare. n modul de operare
obinuit (cmp luminos), formarea contrastului este clasic, prin obstruarea sau
absorbia electronilor n prob. Zonele mai groase ale preparatului sau zonele cu
atomi mai grei vor aprea ntunecate, n timp ce zonele fr preparat apar luminoase,
de unde i denumirea de "cmp luminos". Imaginea final reprezint o proiecie
bidimensional a probei de-a lungul axului optic.

Microscopia electronic de baleiaj
Microscopia electronic de baleiaj se distinge de TEM prin faptul c
analizeaz fasciculul de electroni emii de preparat, n urma impactului cu electronii
primari emii de surs.
Electronii de nalt energie emii de surs baleiaz suprafaa probei dup un
model prestabilit (de la stnga la dreapta i de sus n jos).
Electronii primari interacioneaz cu nucleii i electronii atomilor din prob.
Aceste interaciuni genereaz mai multe tipuri de semnale: electroni secundari (cei
care sunt analizai i care formeaz imaginea, electroni de retrodifuzie, electroni
Auger, radiaii X, luminiscen de catod.
Structura SEM:
1. Sursa de electroni (tunul electronic) care accelereaz electronii n coloana
microscopului.
2. Lentile electromagnetice (condensor i obiectiv) care pot controla diametrul
fasciculului de electroni i l pot focaliza pe preparat.
3. Aperturi (filme metalice cu orificii punctiforme) care filtreaz electronii
deflectai sau cu un unghi incident prea mare.
4. Sistem de control al poziiei probei (deplasri n plan orizontal, balans,
rotaie)
5. O suprafa de interaciune ntre fascicul i prob care genereaz
semnalele menionate mai sus. Aceste semnale produc imagini sau
spectre.
6. Toate elementele menionate sunt meninute n vid de diferite niveluri (vidul
din coloana superioar este mai nalt dect n camera probei).
Rezoluia SEM la ora actual este de 0,4 nm pentru microscoapele industriale (voltaj
nalt - 30kV) i de 0,9 nm pentru microscoapele biologice (Magellan de la FEI) (voltaj
redus - 1 kV)
Modul de funcionare al SEM
- tunul electronic genereaz un flux monocromatic de electroni
- fluxul de electroni este condensat de ctre prima lentil condensor; lentila este
util pentru formarea fasciculului de electroni ct i pentru limitarea curentului
din fascicul
- fasciculul de electroni este condiionat de apertura condensorului, eliminndu-
se astfel electronii care au un unghi incident prea mare
- a doua lentil condensor formeaz un fascicul de electroni subire, coerent i
controlabil
- o a doua apertur condensor filtreaz electronii cu unghi de inciden crescut
un set de bobine produc baleierea fasciculului de electroni dup un model
prestabilit (de la stnga la dreapta i de sus n jos); viteza de baleiere este
reglabil, fasciculul insistnd cteva microsecunde asupra fiecrui punct al
probei
- lentilele finale - obiectiv - focalizeaz fasciculul de electroni n zona dorit de
la suprafaa probei
- cnd fasciculul de electroni atinge proba, sunt produse semnalele menionate
mai sus (electroni secundari, de retrodifuzie, radiaii X etc)
- sistemele de detecie interpreteaz semnalele emergente i formeaz
imaginea sau dau alte date analitice
- procesul de formare a imaginii dureaz 30-60 sec.

Schem de funcionare a SEM


Granule de polen, imagine SEM