Cromatografia si electroforeza

I. Noiuni teoretice
1. Cromatografia
Cromatografia reprezint o tehnic de separare a componentelor unui amestec, ntre dou faze:
una mobil i alta staionar, ca urmare a deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare i a antrenrii
compo-nentelor amestecului n micare, cu viteze diferite, ocupnd astfel poziii diferite de-a lungul fazei
staionare. n acest mod componentele sunt separate i apoi identificate.
n funcie de natura fazelor se disting urmtoarele tipuri de cromatografie:
Faza mobila
lichid
lichid
gaz
gaz

Faza staionara
lichid
solid
solid
lichid

Denumire
lichid - lichid (LL)
lichid - solid (LS)
gaz - solid (GS)
gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se mpart n:

- metode bazate pe afinitatea diferit a componenilor (repartiie de faz, adsorbie, absorbie,

schimb ionic, afinitate);

- metode bazate pe mrimea diferit a componenilor (excluziune sferic).

Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt: cromatografia pe
coloan, cromatografia pe hdrtie, cromatografia n strat subire, gaz cromatografia.
Cromatografia pe coloan - Coloanele cromatografice sunt confecionate din sticl. Pentru o
bun rezoluie se folosesc coloane lungi dar n condiiile n care se dorete separarea unei cantitati mari de
substane se folosesc coloane cu un diametru mai mare.
n interiorul coloanei se introduce faza staionar ce trebuie, ntr-o prim etap, echilibrat cu
solventul de lucru.
Amestecul ce urmeaz a fi separat se pipeteaz n partea superioara a tubului.
Se conecteaz rezervorul cu solvent (faza mobil) la coloan i se ateapt pn ce are loc
separarea.
Datorit deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare are loc antrenarea componentelor din
amestec ntr-o micare descendent, n lungul coloanei astfel nct n timp vor ocupa poziii diferite.
Fraciile sunt colectate n tuburi i apoi analizate.

Figura 4.1. Cromatografie pe coloan.

Cromatografia pe hrtie - reprezint una din cele mai simple metode de analiz. n aceast
metod faza fix este reprezentat de o suprafata de hrtie special sau hrtie de filtru, iar faza mobil
(eluentul) de un lichid ce se deplaseaz de-a lungul fazei fixe datorit forelor de adeziune i forelor
gravitaional. Se mparte n: cromatografie pe hrtie vertical (ascendent sau descendent) i orizontal
(Pfeiffer). n figura 4.2 se poate urmri diferena dintre aceste metode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hrtie vertical ascendent i descendent

Identificarea compuilor izolai n timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul spoturilor martor,
fie calculnd timpul de reinere al fiecrui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distana fata
de linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notat cu Xj) i distana pe care a migrat eluentul
(notat cu Y):
X, J
Y
Timpul de reinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei mobile, natura substanei,
temperatur; se gsete tabelat pentru diferite substraturi, elueni i substane, de regul pentru
temperaturi de 20C.

2. Electroforeza
Reprezint metoda de separare bazat pe migrarea sub influena cmpului electric a substanelor
ncrcate cu sarcin electric.
Eletroforeza poate fi folosit att n scop analitic (separarea componenilor i dozarea lor),
preparativ (obinerea unor componeni n stare pur) dar i ca metod de studiu a proprietatilor
superficiale ale unor celule sau organite celulare.
O particul ncrcata electric, cnd este dizolvat sau suspendat ntr-un mediu lichid, sub
influena unui cmp electric uniform, atinge o vitez constant de migrare. Speciile ncrcate pozitiv se
vor ndrepta ctre catod, iar speciile ncrcate negativ ctre anod. Viteza de migrare a ambelor specii va fi
determinate de forele care acioneaz asupra lor. Aceste forte sunt:

- fora de atracie electroforetic: Fx = Q E

- fora de frecare Stokes: F2 = 6 n r| r v
- fora de frnare electroforetic: F3 = (Q-S \ r)-E
- fora F4 datorata efectului de relaxare
Imediat dup aplicarea cmpului electric, suma vectorial a acestor patru forte este egal cu zero
i viteza electroforetic devine constant (figura 4.3). Neglijnd efectul de relaxare i innd cont de
direciile celor trei forte se obine viteza electroforetic:
8-E-E
v =----------6-7T-T1

unde:

- 8 = permitivitatea absolut a mediului

- ^ = potenialul electrocinetic
- E = intensitatea cmpului electric
- r| = coeficientul de vscozitate
Mobilitatea electroforetic se defmete ca raportul dintre vitez i intensitatea cmpului electric:
v
H=
E
Datorit ncrcrii electrice nete de la suprafaa particulelor biologice, n acest regiune se
organizeaz, se structureaz, un strat dublu electric alctuit dintr-o zon compact de grosime (a) i una
difuz, n care pentru simplitate, suprafaa de demarcare a particulei fata de mediu este considerat plan
(figura 4.3).
Cnd particula este pus n micare de ctre cmpul electric aplicat, aceasta antreneaz o dat cu
ea un strat de lichid mai gros dect eel compact, notat cu (b). Planul care se afl la distana b>a de

particul se numete plan hidrodinamic de alunecare, iar potenialul n acest plan se numete potenial

electrocinetic (Q. Valoarea potenialului electro-cinetic se poate determina indirect pe baza msurrii
mobilittii electroforetice a particulei n cmp electric.

Figura 4.3. Forele ce acioneaz asupra unei particule ncrcate cu sarcin electric suspendatfi ntr-un mediu lichid. Distribuia
ionilor n stratul dublu electric de la suprafaa unei particule scufundate ntr-un electrolit.

Metoda microscopic de electroforez - acest metod este singura tehnic disponibil pentru
determinarea vitezei electroforetice a particulelor mari, cum ar fi celulele sanguine, microorganisme,
particule coloidale, etc. Se bazeaz pe observarea direct, la microscop a migrrii particulelor suspendate
ntr-o soluie tampon adecvat ca urmare a aplicrii unui cmp electric creat de un curent continuu.
Pentru aceast tehnic este necesar o celul electroforetic (figura 4.4), prevzut cu doi
electrozi, un sistem de umplere i golire, ce se poate introduce n cmpul unui microscop. Celula poate fi
plan sau cilindric (capilar).
A

Figura 4.4. Electroforeza microscopic: cuva electroforetic folosit i imaginea

observat la microscop prevzut cu micrometru ocular.

Electroforeza la joas tensiune - Este o metod ce permite separarea proteinelor plasmatice.

Dispozitivul experimental folosit este prezentat n figura 4.5.
Ca suport al electrolitului (al soluiei tampon) se folosete att hrtie special pentru electroforez
(de tip Whatman) ct i membrane de celuloz. Dintre avantajele utilizrii membranelor de celuloz

amintim, n primul rnd: rezoluia mult mai bun i un timp de migrare mai mic.

Figura 4.5. Electroforeza la joas tensiune - dispozitiv experimental.

Dup separarea proteinelor urmeaz un procedeu de fixare i colorare. n primul rnd, mediul
suport este fixat prin introducere n etanol, metanol sau acid, ori prin nclzire fcnd astfel proteinele
insolubile.
Benzile sunt colorate cu ajutorul unor colorani specifici proteinelor (albastru de brom fenol), se
spal n mai multe bi cu acid acetic 2% i sunt trecute prin vapori de amoniac pentru regenerarea
colorantului (figura 4.6).

Figura 4.6. Electroforeza - mediul suport dup procedeele de fixare i colorare.

Dup aceste procedee benzile sunt scanate cu ajutorul unor densitometre prin reflexie, transmisie sau
combinate, ce permit trasarea spectrelor caracteristice probelor oferind totodat cantitatea n g/lOOml.
Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloz a serului uman este prezentat n figura 4.7.

Figura 4.7. Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloz a serului uman.

Este cunoscut faptul c scderea albuminelor survine de regul n toate disproteinemiile, find ns
mai accentuat n cazul unui deficit n aportul de proteine, n deficitul de sintez (ciroz hepatic), sau n
pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri).

Creterea ah a2 - globulinelor se nsoete de regul de o cretere a fibrinogenului i a

glicoproteinelor i de o accelerare a VSH-ului. O cretere marcat a a2 - globulinelor se ntlnete n
sindromul nefrotic.
Modificrile (3 - globulinelor au o important mai redus, dar creterea y - globulinelor indic
prezena unor inflamaii cronice, sau sugereaz o proliferare reactiv sau tumoral a imunocitelor
productoare de imunoglobuline. Scderea y - globulinelor survine n sindromul nefrotic, malnutriie.
Toate aceste modificri au ca rezultat forme diferite ale spectrlor electroforegramelor analizate
(figura 4.8).

Figura 4.8. Tipuri de disproteinemie: (A) Inflamaie acut, (B) Inflamaie cronic, (C) Sindrom nefrotic, (D) Enteropatie
exudativ, (E) Ciroz hepatic, (F) Mielom multiplu, (G) Hipogamaglobulinemie.

Focalizarea izoelectrica (electrofocusing) - reprezint o metod de separare a particulelor cu

puncte izoelectrice diferite ntr-un gradient de pH sub aciunea unui cmp electric omogen.
Punctul izoelectric al unei particule (sau molecule) corespunde valorii pH-ului la care sarcina
electrica net este nul.
Dispozitivele de electrofocusing folosesc o coloana n care se realizeaz un gradient natural de
pH prin utilizarea unor amfolii transportori cu urmtoarele proprietati: bun capacitate de tamponare i
bun conductivitate la punctul izoelectric, mas molecular mic, solubilitate bun la punctul izoelectric,
absorbie mic a luminii peste 260nm, nu reacioneaz chimic cu componenii amestecului ce urmeaz a fi
descompus.
Cei mai utilizai sunt acizii poliaminopolicarboxilici avnd masa molecular ntre 300-1000D i
puncte izoelectrice situate n domeniul de pH=3-10.