INSAMANTARILE ARTIFICIALE

Biotehnologie de generaia I-a, ce permite multiplicarea descendenei unui mascul valoros, dincolo de limitele biologice ale acestuia Aplicat pe scar larg la bovine i ovine i, ntr-o msur mai mic, la celelalte specii Ofer avantaje de ordin :
Economic Zootehnic Medical

Cuprinde patru etape principale :

Recoltarea spermei Examenul materialului seminal

Ex.

Macroscopic Ex. Microscopic Ex. complementare

Diluarea si conservarea materialului seminal

Refrigerarea Congelarea

In gheata carbonica In azot lichid

Inocularea materialului seminal

A. Recoltarea spermei

1. Vaginul artificial
Imita conditiile de temperatura, presiune si lubrifiere din vaginul femelei in estru Alcatuit din : carcasa cu robinet, camasa din latex + inele de cauciuc, pahar colector + protectie Recoltarea se poate face pe o femela in calduri spontane sau induse hormonal, pe manechin sau pe un alt mascul Folosit la taur, armasar, berbec, vier, caine

2. Electroejacularea
Stimularea centrilor nervosi ai erectiei si ejacularii din maduva lombo-sacrala, cu ajutorul unui curent electric de joasa tensiune Se practica la taur (electrod endorectal bipolar) si berbec (electrod endorectal monopolar si electrod lombar monopolar) Avantaj : poate fi folosita la masculii cu impotenta de copulatie (impotentia coeundi) Dezavantaje : ejaculatul este inferior d.p.d.v. cantitativ si calitativ celui obtinut cu vaginul artificial ; uneori se poate produce ejacularea in furou

3. Metoda prezervativului (condomului)

Se practica uneori la armasar, de regula ca un expedient Pe post de prezervativ, se poate utiliza o manusa obstetricala pentru ETR

4. Metoda manuala (masturbarea)

Se practica la vier si la caine La vier elementul esential este presiunea exercitata de operator cu degetele la nivelul portiunii spiralate a penisului, analog papilelor cervicale ale scroafei La caine presiunea trebuie exercitata la nivelul bulbilor glandului, iar penisul se orienteaza posterior

B. Examinarea materialului seminal

Este precedata de si corelata intotdeauna cu examenul fizic general al reproducatorului mascul. 1.Ex. macroscopic: Volum se apreciaza imediat dupa recoltare prin citire directa in paharul de recoltare Culoare- se apreciaza subiectiv imediat dupa recoltare si variaza in functie de specie, concentratia in spermatozoizi sau prezenta substantelor straine in ejaculat (sange, puroi, urina, etc). pH apreciat cu ajutorul pH-metrelor; exista o corelatie directa intre calitatea spermei si pH-ul acesteia (cu cat proba de sperma este mai buna cu atat este mai acida) Miros

2. Ex. Microscopic:

Concentratia materialului seminal - 2 tehnici: -tehnica hemocitometrica: adaptata dupa tehnica de numarare a globulelor rosii. - metoda electronica (SQA): mult mai rapida si mai exacta. Mobilitatea spermatozoizilor - Mobilitatea generala a spermei se apreciaza cat mai repede dupa recoltare, miscarea in val se noteaza cu 5, iar lipsa de miscare cu 0; - Mobilitatea individuala se apreciaza prin examinarea unei picaturi de sperma proaspata diluata; se va aprecia traiectoria si viteza de inaintare. Mobilitatea individuala se noteaza pe o scara de la 0-5, sperma normala regasindu-se in intervalul 2,5-5.

Morfologia spermatozoizilor ofera posibilitatea de a pune in evidenta spermatozoizii imaturi, cu anomalii sau morti. Se apreciaza imediat dupa recoltare prin examen microscopic (100x cu imersie) si colorare (albastru de metilen, violet de gentiana, tus de China, opal-blau, albastru-tripan-Giemsa, eozina-negrozina, etc). Intr-un ejaculat normal procentul spermatozoizilor anormali, imaturi sau morti = max 20%.

3. Ex. complementare:

Testul hipoosmotic permite aprecieri privind integritatea membranei spermatozoidului Proba redox se bazeaza pe principiul masurarii capacitatii de reducere a celulelor spermatice prin intermediul unei substante colorate (albastru de metilen); cu cat decolorarea amestecului este mai rapida cu atat proba de sperma este mai buna.

4. Ex. bacteriologic

presupune recoltarea separata a fractiunilor ejaculatului si realizarea de insamantari pe medii pentru germeni aerobi, anaerobi, micoplasme si fungi; in mod normal in sperma se gasesc aproximativ 10.000 celule bacteriene/ml. 5. Ex. imunologic - urmareste detectarea anticorpilor antispermatici care ar altera capacitatea fecundanta a spermatozoizilor.

C. Diluarea si conservarea materialului seminal

Diluarea materialului seminal se realizeaza in scopul fractionarii ejaculatului permitand astfel obtinerea unui numar mai mare de doze de inseminare.

mediile de dilutie trebuie sa contina: - substante energetice (glucide); - substante crioprotectoare (glicerina, lecitina din galbenusul de ou); - substante tampon - mentin constant pH-ul spermei in timpul diluarii si conservarii (citrati, fosfati, tartrati, etc); - substante care sa activeze mobilitatea spermatozoizilor in caile genitale femele (mucinaza); - substante care sa impiedice dezvoltarea florei microbiene (antibiotice, sulfamide)

Conservarea materialului seminal urmareste mentinerea mobilitatii si capacitatii fecundante a spermatozoizilor un timp cat mai indelungat, inafara cailor genitale femele.

conservarea materialului seminal se poate realiza prin -refrigerare (pastrare la 2-8C) -congelare (pastrare in azot lichid la -196 grade Celsius).
Procedee de congelare a materialului seminal: - congelarea in paiete (mari, mijlocii si mici); - congelarea in fiole; - congelarea in pilule in gheata carbonica la 79 grade Celsius abandonata la ora actuala

D. Inocularea materialului seminal

Inocularea consta in depunerea materialului seminal in caile genitale femele. Principii care trebuie respectate la inocularea materialului seminal: - inocularea sa se realizeze in momentul optim pentru fiecare specie; - depunerea materialului seminal sa se faca la locul de electie caracteristic fiecarei specii; - instrumentarul folosit la inseminare sa fie steril si incalzit la 38C; - sa se evite traumatizarea mucoasei vestibulo-vaginale, cervicale sau uterine in timpul inocularii.

Pentru sperma refrigerata: - flaconul cu material seminal se lasa la temperatura camerei 5 minute; se utilizeaza sperma care contine cel putin 60% spermatozoizi cu miscari vioaie de inaintare.

Pentru sperma congelata: - se inoculeaza dupa decongelare brusca in apa la 36 grade Celsius; se admite inocularea spermei care contine minimum 35-40% spermatozoizi cu miscari vioaie de inaintare.

Inocularea spermei la vaca: - de regula se inoculeaza 2 doze de material seminal la interval de 12 ore; -depunerea materialului seminal se realizeaza in canalul cervical sau in cavitatea uterina; - pentru depunerea spermei in caile genitale femele se poate utiliza metoda recto-vaginala/bimanuala (cel mai frecvent) sau metoda cu speculum vaginal.

Inocularea spermei la iapa: - depistarea momentului optim pentru I.A. se realizeaza prin ultrasonografie (folicul peste 35-40 mm) sau numai prin palpare transrectala cand se identifica modificarile de forma, marime si consistenta; - inseminarea artificiala ar trebui sa se realizeze cu 12 ore inaintea ovulatiei; - materialul seminal se depune in cavitatea uterina.

La oaie: inocularea materialului seminal se realizeaza imediat ce este depistata in calduri de catre berbecul incercator si se repeta dupa 12-18 ore; - cu un speculum vaginal si seringa de inoculare se inoculeaza 0,1 ml sperma la nivelul canalului cervical.

La scroafa: se folosesc catetere de cauciuc sau plastic care la extremitatea libera se termina cu o formatiune ovalara (cateterul cu oliva)sau sunt spiralate asemanator portiunii libere a penisului la vier (cateterul Melrose); - varful pipetei se angreneaza in cervix, iar materialul seminal se depune in corpul uterin.

La catea: - detectarea momentului optim pentru I.A. se realizeaza prin ex. citovaginal (celule Schollen) sau prin dozarea progesteronului plasmatic (peste 8 ng/ml); - depunerea se poate realiza intravaginal, intracervical sau intrauterin (cateterul Osiris), apoi cateaua se va mentine cu trenul posterior ridicat 15 min pentru a facilita pasajul spermatozoizilor in uter