BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SUBSTANE PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC 1. Scopul lucrrii Metoda spectrofotometric face parte din clasa metodelor fizice de determinare a concentraiei unei soluii n laborator. Similar celorlalte metode fizice, este simpl, rapid i ieftin. Folosind un spectrofotometru Spekol, vei determina concentraia unei soluii. 2. Principiul lucrrii Spectrofotometria reprezint o clas larg de metode de investigare. Ea face parte dintr-o clas i mai mare i anume clasa metodelor spectrometrice. Orice metod spectrometric nregistreaz i msoar spectre electromagnetice. Un spectru reprezint totalitatea valorilor unei mrimi ce caracterizeaz un sistem. n cazul unui spectru electromagnetic acesta reprezint totalitatea lungimilor de und (frecvenelor) pe care un sistem le poate emite sau absorbi. Atunci cnd un sistem absoarbe radiaii electromagnetice el trece pe un nivel energetic superior iar cnd emite pe unul inferior. Condiia (de rezonan) ce trebuie ndeplinit este: h = Es- Ei (4.1)

unde Es = energia nivelului superior, Ei = energia nivelului inferior, = frecvena radiaiei. Din condiia de rezonan rezult c sistemele pot absorbi aceleai radiaii pe care le pot i emite. Vom obine deci, practic, aceleai informaii fie c analizm ce emite sistemul fie c nregistrm ce absoarbe. Dac lungimile de und emise sau absorbite au valori ntr-un domeniu cvasicontinu obinem spectre de benzi, iar dac variaz discontinuu sunt spectre de linii. Spectrele de linii sunt n general specifice substanelor n stare atomic n timp ce spectrele de benzi sunt, n general, specifice substanelor n stare molecular. Fiind vorba de un numr foarte mare de metode se impune clasificarea lor. i n acest caz se pot face mai multe clasificri avnd n vedere mai multe criterii. Un prim criteriu poate fi al domeniului spectral investigat. n toate domeniile spectrale electromagnetice exist metode de investigare, multe dintre ele cu aplicaii n clinic. Domeniile spectrale electromagnetice sunt, n ordinea descresctoare a energiei deci cresctoare a lungimii de und, urmtoarele: gama ( ), raze X, ultraviolete (UV),

DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SUBSTANE PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC

vizibil, infrarou (IR), microunde i radiounde. n cazul metodelor spectrometrice din domeniile UV, vizibil i IR metodele se numesc, n general, spectrofotometrice. Datele obinute prin metode spectrometrice sunt n general extrem de precise. De asemenea, n funcie de domeniul spectral investigat, informaiile obinute pot fi foarte diverse. Astfel n domeniul putem obine date privind nivelele energetice nucleare, tipul de nucleu atomic i structura lui precum i procesele la care ia parte. n domeniul X datele se refer la nivelele energetice interne ale atomilor. Domeniile UV i vizibil dau informaii despre nivelele energetice periferice ale atomilor (care particip la formarea legturilor chimice). Investigarea domeniului IR duce la cunoaterea micrilor intermoleculare sau moleculare precum i a interaciilor dintre molecule. De exemplu, prin absorbia n domeniul IR apropiat pot apare modificri n micrile vibratorii moleculare n timp ce absorbia n domeniul IR ndeprtat duce la modificri n micrile rotatorii moleculare. n domeniul microundelor datele obinute provin de la spinul (momentul magnetic intrinsec) electronic plasat n cmp magnetic, iar n domeniul radioundelor informaiile se refer la spinul nuclear de asemenea plasat n cmp magnetic. Orice interacie a sistemului care absoarbe sau emite radiaii electromagnetice duce la modificri ale nivelelor sale energetice i implicit la modificarea spectrului electromagnetic. Analiznd, deci, acest spectru vom afla informaii nu numai despre sistem ci i despre mediul n care acesta se gsete. Ca metode cu implicaii clinice vom meniona:
Domeniul spectral Numele metodei Informaii (aciuni) directe Informaii (aciuni) indirecte Semnificaii clinice

Gama-terapie (cobaltoterapie)

Absorbia radiaiilor n esuturi nregistrarea emisiei de radiaii Absorbia radiaiilor X n esuturi Absorbia razelor X n esuturi

Distrugerea celulelor (preponderant cele canceroase) Determinarea distribuiei radioizotopilor introdui n organism Imagini ale organelor interne dense (esut osos) Imagini a oricrei seciuni prin corp

Terapia cancerului Diagnostic funcional al organului Diagnosticarea fracturilor, fisurilor etc. Imagini cu detalii de ordinul milimetrului (mai ales pe

Scintigrafia

Radiografie

Tomografie computerizat cu raze X

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

esuturi dense) UV,vizibil, IR Spectrofotometrie Absorbia Determinarea Diagnosticarea acestor radiaii concentraiilor diferitelor diferitelor de ctre molecule maladii (ex. molecule diabetul) Absorbia Determinarea raportului radiaiilor roii Coxihemoglobin/Chemoglobin total i infraroii de ctre snge Monitorizarea gradului de oxigenare a sngelui Se sper c se vor putea urmri procesele metabolice

Vizibil, IR

Oximetrie

Microunde

Rezonan Absorbia Urmrirea proceselor n electronic de spin microundelor care apar radicali liberi (RES) de ctre radicalii liberi aflai n cmp magnetic Tomografie de rezonan magnetic nuclear (RMN) de vizualizare Absorbia Imagini a oricrei radioundelor de seciuni prin corp ctre nucleele de hidrogen plasate n cmp magnetic

Radiounde

Imagini cu detalii de ordinul milimetrului mai ales pe esuturi bogate n ap (moi)

Tabelul 4.1 O clasificare a metodelor cu implicaii clinice

Un alt criteriu de clasificare a metodelor spectrometrice poate fi cel al modului de obinere a spectrelor. Sistemele analizate pot fi puse s emit sau s absoarb radiaii electromagnetice. Vorbim astfel de spectrometrie de emisie respectiv absorbie.

Se poate face i o clasificare avnd n vedere rezoluia spaial sau temporal a metodei. Prin rezoluie nelegem valoarea minim a unui parametru pentru care metoda utilizat mai poate furniza date. Astfel exist metode spectrofotometrice care pot nregistra spectre din regiuni cu suprafaa de ordinul micronului ptrat (microspectrofotometrie sau citospectrofotometrie obinut prin cuplarea unui spectrofotometru cu un microscop). n domeniul rezoluiei temporale se pot nregistra spectre n intervale de ordinul fs (f =10-12). Comparnd aceast rezoluie cu timpul de via a unui electron pe o stare excitat (~10-8s) constatm c astfel de metode ne permit s urmrim chiar i cum se excit sau dezexcit un atom. Acest lucru este posibil atunci cnd i detectorul de radiaii este foarte sensibil. n prezent exist detectoare care pot nregistra chiar i un singur foton.

DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SUBSTANE PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC

Desigur cnd vrem s caracterizm n ntregime metoda vom utiliza toate criteriile. De exemplu, metoda pe care o vom utiliza se numete spectrofotometrie de absorbie n domeniul vizibil pe macroprobe. Informaiile obinute cu aceast metod pleac de la legea absorbiei luminii scris sub forma: I = I010-cd (legea BEER-LAMBERT) I0 = intensitatea luminii incidente pe prob, I = intensitatea luminii emergente din prob, = coeficient specific de absorbie zecimal (depinde de natura substanei i de lungimea de und a luminii incidente), c = concentraia substanei absorbante, d = grosimea probei. Se definete coeficientul de transmisie al substanei sau factor spectral de transmisie astfel: (4.2)

I I0

(4.3)

iar dependena = f ( ) se numete curba de transmisie a corpului absorbant studiat. Se definete extincia zecimal ca logaritmul zecimal al inversului coeficientului de transmisie:
1 E = lg ,

(4.4)

numit i densitate optic. Se observ c E = K d sau K =

E d

Este evident c mrimea absorbiei depinde de numrul centrilor absorbani, respectiv de concentraia acestora, fapt explicitat de Beer care a stabilit relaia:
K = C

(4.5)

unde: C concentraia substanei, msurat n mol/l - coeficient de extincie, msurat n 1/mol*cm. De asemenea, putem observa c

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

E = C d , care este expresia cea mai utilizat a extinciei.

Coeficientul de extincie, , depinde numai de lungimea de und a radiaiei i caracterizeaz substana absorbant. Aa cum atomii pot fi identificai, n emisie, dup spectrele proprii de emisie, tot astfel o anumit specie de atomi poate fi identificat prin studierea curbelor de absorbie = f ( ) . Cu ajutorul acestei metode se pot obine informaii calitative (identificarea compuilor din prob) i cantitative (determinarea concentraiilor acestora). Pentru a identifica natura compuilor dintr-o prob trebuie s trasm un grafic de tipul E = f(). Dei extincia nu depinde explicit de , ea depinde implicit prin intermediul lui . Cnd trasm o astfel de curb trebuie s ne asigurm c n timpul nregistrrii ceilali parametri de care depinde E (natura probei, concentraia i grosimea ei) nu se modific. Pentru probele stabile acest lucru este uor de obinut. Dac ns n prob au loc diverse procese devine esenial timpul de nregistrare care trebuie s fie mult mai mic dect timpul n care au loc schimbri semnificative n prob. Dac respectm aceste condiii forma curbei obinute depinde doar de natura probei. Ea se numete curb de absorbie. Nu exist dou substane care s aib exact aceeai curb de absorbie. Aceasta face ca identificarea substanelor s fie cert. Pentru aceasta este suficient s comparm curba obinut de noi cu cele aflate n cataloagele de spectre. Desigur se pote face acest lucru i automat cu ajutorul calculatorului. Deoarece metoda este foarte sensibil avem nevoie de cantiti foarte mici de substan pentru a face identificarea. Pentru a determina concentraia substanelor din prob trebuie s trasm un al doilea grafic E = f(c). Acest al doilea grafic trebuie trasat n condiiile n care avem mai multe probe de aceeai natur cu concentraii cunoscute (etaloane) i una sau mai multe probe de concentraii necunoscute. nregistrarea o facem n cuve etalonate (de aceeai grosime) i la aceeai (de preferat cea corespunztoare maximului de absorbie). n aceste condiii, graficul va fi o dreapt ce trece prin origine iar concentraia o aflm prin interpolare sau extrapolare pe grafic. Este de preferat s utilizm mai multe etaloane pentru a micora erorile. Dac vrem s determinm concentraiile mai multor substane dintr-o prob trebuie s trasm cte un astfel de grafic pentru fiecare substan la o la care doar ea absoarbe. Din nou precizia metodei poate fi foarte mare. Este de remarcat, totui, c i ali parametri, cum ar fi temperatura sau pH-ul, pot influena nregistrrile. De aceea, atunci cnd este cazul, trebuie meninui constani i aceti parametri.

DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SUBSTANE PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC

3. Mod de lucru Vom folosi un spectrofotometru n domeniul vizibil, soluii de acridin-orange, etalon (cu concentraii cunoscute), soluii cu concentraii ce urmeaz a fi determinate i eprubete calibrate. Schema bloc a unui spectrofotometru este reprezentat n Fig. 4.1:

Fig. 4.1 Schema bloc a unui spectrofotometru

S = sursa de radiaii care trebuie s emit toate din domeniul investigat (n cazul nostru este un bec cu incandescen ce emite lumin alb). M = monocromator, alege din ce emite sursa o singur (poate fi cu prism, cu reea de difracie sau filtre). B = solventul (blanc) folosete la etalonarea de T=100% P = proba pentru care msurm E (sau T) D = detectorul transform lumina n curent electric n cazul nostru este o fotocelul dar la aparatele mai performante poate fi un fotomultiplicator sau fotodiod. A = amplificator I = nregistrator, microampermetru gradat n uniti liniare de transmisie i uniti logaritmice de extincie. Citirile se vor face n regiunea 420-540 nm cu citiri din 10 n 10 nm. Pentru o citire se introduce n cuva aparatului eprubeta cu apa distilat (solventul). Se alege din butonul 1 Comutatorul 2 n poziia 0 obtureaz fanta dinspre prob a aparatului astfel nct la fotocelul nu ajunge lumin. n aceste condiii aparatul ar trebui s indice T = 0. Dac nu indic aducem acul indicator la 0 din butonul 3. Cu comutatorul 2 n poziia I se deschide drumul luminii prin eprubeta cu solvent spre fotocelul. Vom considera c solventul nu absoarbe lumina (sau nu ne intereseaz ce absoarbe) astfel nct ce iese din solvent va fi considerat I0 aparatul de msur trebuind s indice T = 100%. n cazul n care acest lucru nu se ntmpl vom aduce acul indicator n dreptul indicaiei 100 din butonul 4. Dup ce am efectuat reglrile de 0 i 100

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

introducem, pe rnd, eprubetele cu soluiile de acridin-orange (AO) i citim extinciile. Dup modificarea lungimii de und toate reglrile trebuie refcute.

Fig. 4.2 Vedere frontal a spectrofotometrului SPEKOL

Cu datele msurate vom trasa curbele de absorbie [E = f()] pentru fiecare soluie n parte dar pe acelai grafic. Fiind soluii de aceeai natur ar trebui ca forma curbelor s nu difere dar nlimea lor s fie cu att mai mare cu ct concentraia soluiei este mai mare. Pentru AO vom putea observa prezena a dou maxime relative la 465 i 494 nm. Aceasta indic prezena n soluii a dou specii moleculare. Cel de-al doilea, prezent practic singur la concentraii mici, se datorete monomerului de AO n timp ce al doilea (a crei amplitudine relativ crete cu creterea concentraiei soluiei) se datorete dimerului de AO. Proporia celor dou specii moleculare poate fi modificat i prin modificarea temperaturii. La temperaturi mai mari va predomina monomerul iar la temperaturi mai mici dimerul. Modificarea pH-ului unei soluii de AO duce la apariia unui echilibru ntre alte dou specii moleculare monomerul nedisociat de AO predominant la valori mici ale pH-ului (max = 494nm) i cationul de AO predominant la ph mare ( max = 434nm). Curbele de absorbie ale soluiei de AO trasate la valori ale ph-ului diferite se intersecteaz n acelai punct n dreptul valorii = 450nm. Acest punct se numete punct izosbestic i el indic existena a dou specii ce se schimb una n alta n funcie de valoarea parametrului care variaz (n cazul nostru pH-ul). Pentru determinarea concentraiei necunoscute se traseaz graficul E = f(c) cu valorile extinciei corespunztoare unuia din maximele relative (de exemplu cel de la 494 nm sau la valori apropiate). Pe grafic se pune apoi valoarea Ex a extinciei soluiei de concentraie

DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SUBSTANE PRIN METODA SPECTROFOTOMETRIC

necunoscut msurat la aceeai lungime de und. Prin interpolare sau extrapolare pe grafic se va afla apoi concentraia. Chiar dac vom trasa graficul folosind aceleai date valoarea concentraiei obinute poate fi uor diferit deoarece trasarea lui este relativ arbitrar. Pentru trasarea obiectiv a graficului se poate folosi metoda celor mai mici ptrate.