UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZAIAI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
PROGRAM IDEI Cod CNCSIS 2100
Tema 1040/2009
STUDIUL COMPLEX AL FILOSFEREI UNOR SPECII DE PLANTE DIN
COLECTIILE GRDINII BOTANICE IAI
SINTEZA REZULTATELOR 2010
Frunzele, tulpinile, florile i fructele plantelor sunt frecvent colonizate de microorganisme epifile (bacterii, alge
albastre-verzi, alge verzi, levuri, licheni si chiar briofite), pentru care acestea reprezint habitate adecvate. Microflora epifitic
specific, existent n habitatul adiacent aparatului foliar, formeaz filosfera, prin analogie cu rizosfera, iar cea din habitatul
direct asociat cu frunza formeaz fitoplanul.
Filosfera constituie un micromediu ale crui particulariti sunt dependente att de condiiile oferite de frunz:
compoziia i cantitatea de nutrieni, inclusiv de carbohidrai, acizi organici si aminoacizi care susin creterea comunitilor
de microorganisme filosferice i care depind de specia de plant, de vrsta frunzei, de starea fiziologic a acesteia i de
prezena deteriorrilor tisulare, ct i de condiiile mediului fizic n care se dezvolt plantele i de disponibilitatea de migrare
microorganismelor. n acelai timp suprafaa frunzelor ofer condiii foarte heterogene dezvoltrii microorganismelor datorit
cantitilor variabile de ap provenit din precipitaii, rou, gutaie (mai ales pe timpul nopii), a temperaturilor variabile n
limite extrem de largi (pn la 45-550C ziua i numai 5-100C noaptea), a iluminrii cu intensiti diferite pe parcursul zilei, ct
si a prezenei radiaiilor UV puternice (FENIN i colab., 1989; YANG i colab., 2000; JACOBS i SUNDIN, 2001)(cf. VARMA
i colab., 2003); (SUNDIN i MORRIS, 2004). Prin urmare, cu toate c microorganismele triesc pe un substrat sub care
exist condiii foarte bune n ceea ce privete aportul de ap i concentraia nutrienilor, suprafaa frunzei este un mediu cu
condiii total nefavorabile, datorit faptului c, n mod obinuit, rezervele subcuticulare sunt rar accesibile microorganismelor
ce se gsesc pe suprafaa frunzei (SCHNNER i BAUER,1996)(cf. VARMA i colab., 2003).
Aceasta variaie a condiiilor oferite de filosfer determin diversitatea populaiilor de microorganisme, care sunt fie
ocazionale, fie rezidente pe suprafaa frunzei.
Actualmente exist dovezi considerabile referitoare la faptul c bacteriile formeaz agregate heterogene de mari
dimensiuni pe suprafeele vegetale. Examinrile microscopice ale frunzelor colonizate au artat c pe suprafeele vegetale
se gsesc numeroase microorganisme epifite n agregate mari de specii bacteriene mixte care cuprind i fungi (LINDOW,
2002; MORRIS i colab., 1997, 1998) ) (cf. VARMA i colab., 2003). Asemenea agregate pot constitui 30% pn la 80% din
totalul de populaii bacteriene la unele specii vegetale; avnd o proporie i structur similar cu cea a biofilmelor care se
dezvolt n habitate acvatice, ele se gsesc probabil doar pe frunze mature din climatele umede, cum sunt tropicele sau
regiunile temperate umede din nord-vestul Pacificului (ANDREWS i HARRIS, 2000) ) (cf. VARMA i colab., 2003).
Aglomerrile bacteriene de pe majoritatea altor plante au dimensiuni considerabile i pot fi mai degrab numite agregate;
formarea lor pe plante are implicaii importante pentru abilitatea acestor microorganisme de a coloniza i de a supravieui
mediului neprielnic al filosferei, capacitatea de agregare asigurndu-le o modalitate de a modifica mediul din imediata lor
apropiere n acest habitat.
Matricea dens care nconjoar celulele din cadrul agregatelor poate duce la concentrarea nutrienilor, beneficiu
evolutiv deosebit al bacteriilor epifite, dat fiind faptul c filosfera este un mediu srac n nutrieni. Rezultatele recente indic
faptul c agregatele celulare de pe frunze sunt mult mai tolerante la stresul hidric comparativ cu celulele solitare. n acest fel
celulele bacteriene din cadrul agregatelor ar putea avea capacitatea de a-i modifica microhabitatul de pe suprafaa foliar,
profitnd de starea de sntate a plantelor gazd.
Se poate deci considera faptul c suprafeele lipofile ale frunzelor formeaz microhabitate pentru multe
microorganisme, cu toate c, n ceea ce privete condiiile de via asigurate (prezena apei i disponibilitatea nutrienilor,
precum i condiiile climaterice) acestea sunt departe de a fi optime.
Ca urmare, exist nc o serie de ntrebri care merit atenia unor cercetri ulterioare.
Utiliznd metode de biologie molecular, se sper a se ajunge la o descriere mai apropiat de realitate a
diversitii n ceea ce privete componena speciilor n filosfer, experimentele fiziologice urmnd s analizeze n mod
detaliat mecanismele ce stau la baza diferitele interaciuni ce au loc ntre microorganismele epifile i cuticula plantelor.
O ntrebare important n acest sens urmrete n ce msur agregarea de specii epifite diferite ce formeaz
biofilme duce la creterea sntii lor ecologice n filosfer.
Rspunznd la aceste ntrebri n viitor se sper a se mbunti cunoaterea ecologiei microbiene a filosferei.
n contextul datelor anterior prezentate, cercetrile derulate prin prezentul proiect i propun clarificarea unor
aspecte fundamentale legate de structurarea si funcionarea filosferei la specii din familia Lamiaceae, ct i la alte specii de
plante a cror apart foliar reprezint suportul existenei unor comuniti bacteriene (specii de Dioscorea) sau care au structuri

idividualizate strict, ca sediu al comunitilor bacteriene (noduli foliari bine individualizai morfologic i anatomic-(specii de
Ardisia), prin continuarea investigaiilor de factur anatomo-histologic, fiziologic, biochimic, i microbiologic.
Dorim astfel s consolidm, prin rezultate practice, conceptele actuale despre filosfera plantelor, unanim
recunoscut astzi ca realitate biologic n regnul vegetal, dar evideniat strict doar pentru un numr redus de plante.
1. Elaborarea i parcurgerea unui model experimental optim caracterizrii filosferei la specii aparinnd genului
Ocimum i Perovskia, cultivate n condiii naturale.
1.1. Cultivarea i caracterizarea macro- i micromorfologic a microorganismelor din filosfera unor specii de
Ocimum i Perovskia n condiii diferite de cultivare oferite de Grdina Botanic din Iai
Izolarea microorganismelor de pe frunzele de Ocimum basilicum i Perovskia atriplicifolia s-a realizat pe parcursul
a dou etape corespunztoare unor fenofaze diferite (vegetativ i nflorire). Pentru izolarea microorganismelor de pe
suprafeele foliare ale unor plante aparinnd speciilor Ocimum basilicum i Perovskia atriplicifolia s-au utilizat dou metode:
amprentarea, respectiv nsmnarea la suprafaa mediului de cultur a unor diluii zecimale provenite din suspensii
microbiene n ap distilat steril. Att pentru izolare ct i pentru cultivarea ulterioar a tulpinilor bacteriene s-au folosit
aceleai condiii: agar nutritiv, temperatur de incubare: 280 C, timp: 24-48 ore. Pentru pstrare s-au pregtit culturi stoc
(glicerol 30 %) meninute la -800 C.
Caracterizarea macro- i micro-morfologic a tulpinilor microbiene izolate din filosfera speciei Ocimum
basilicum
Pentru descrierea caracterelor macro-morfologice ale tulpinilor izolate s-au urmrit o serie de caractere ale
coloniilor precum: forma, aspectul marginilor, profilul coloniei, consistena, transparena/opacitatea, suprafaa i culoarea. Pe
baza acestor caractere au fost izolate un numr total de 19 tulpini diferite. Principalele caractere macro-morfologice ale
tulpinilor bacteriene izolate sunt prezentate n Tabelul 1, Foto 1-6 (Anexa la Raportul in extenso).
Pentru descrierea caracterelor micro-morfologice, s-au efectuat frotiuri colorate dup metoda Gram (Dunca et al.,
2004). Examinarea s-a realizat cu ajutorul microscopului Olympus CH2, folosindu-se obiectivul de imersie (putere total de
mrire 1000 x). Principalele caractere analizate ale tulpinilor izolate sunt prezentate n Tabelul 2 (Anex).
Analiza micro-morfologic a tulpinilor izolate a evideniat faptul c microbiota filosferic a speciei Ocimum
basilicum este relativ puin diversificat din punct de vedere morfologic, fiind reprezentat predominant prin bacterii de tip
bacilar (73,69 %, Foto 7), dar i de tipul cocoid (15,78 %, Foto 8), respectiv cocobacilar (10,52%, Foto 9) Fig. 1.

Foto 7 Aspectul micro-morfologic al tulpinii O3FV3

(1000 x)

Foto 8 Aspectul micro-morfologic al tulpinii O4FV1

(1000 x)

Foto 9 Aspectul micro-morfologic al tulpinii O4FV3

(1000 x)

10,52%
15,78%

73,69%
tip morfologic bacilar
tip morfologic cocoid
tip morfologic cocobacilar

Fig. 1 - Principalele tipuri morfologice de bacterii izolate din filosfera plantelor de Ocimum basilicum

Caracterizarea macro- i micro-morfologic a tulpinilor microbiene izolate din filosfera speciei Perovskia
atriplicifolia
n urma analizei macro-morfologice a coloniilor bacteriene dezvoltate pe suprafaa mediului de cultur au fost
selectate 25 de tulpini diferite. Principalele caractere macro- i micro-morfologice ale acestor tulpini sunt prezentate n
Tabelul 3, Tabelul 4, respectiv Foto 10 - 15 (Anexa la Raportul in extenso). Analizele efectuate au permis evidenierea unei
populaii microbiene puin diversificat din punct de vedere morfologic n filosfera plantelor de Perovskia atriplicifolia. n
cadrul acestei polulaii predominant este tipul bacilar (22 tulpini) Foto 16, 17, ns au fost descrise i 3 tulpini reprezentate
morfologic prin tipul cocoid Foto 18 (Fig. 2).

Foto 16 Aspectul micro-morfologic al tulpinii FV 2

(1000 x)

Foto 17 Aspectul micro-morfologic al tulpinii F2-2d

(1000 x)

Foto 18 Aspectul micro-morfologic al tulpinii FV3

(1000 x)
12%

88%
tip morfologic bacilar
tip morfologic cocoid

Fig. 2 - Principalele tipuri morfologice de bacterii izolate din filosfera plantelor de Perovskia atriplicifolia

Prezena unor populaii microbiene puin diversificate n filosfera speciilor Ocimum basilicum i Perovskia
atriplicifolia poate fi explicat prin particularitile eco-fiziologice ale celor dou plante. Capacitatea acestora de a produce
metabolii secundari (uleiuri volatile) cu proprieti antimicrobiene (Basher et al., 1997; Burt, 2004) limiteaz gradul de
colonizare cu microorganisme a suprafeelor foliare. Investigaii similare efectuate de Karamanoli i colab. pe plante de
origine mediteranean (lavand, rozmarin, salvie i oregano) au evideniat diferene n ceea ce privete colonizarea
suprafeelor foliare n funcie de cantitatea de compui fenolici produi de fiecare specie n parte (Karamanoli et al., 2000).
Cel mai mare grad de colonizare a fost observat la lavand, acesta fiind corelat cu concentraia cea mai mic de uleiuri
volatile produs i prin urmare cu cea mai slab activitate antibacterian dintre toate speciile investigate.
2. Caracterizarea filosferei n corelaie cu particularitile morfo-anatomice i fiziologice ale aparatului foliar i cu
productia de uleiuri volatile la specii de Ocimum si Perovskia, n condiii naturale de cultivare i/sau condiii de
ser, n ciclul ontogenetic al plantelor
2.1. Caracterizarea fiziologic a microorganismelor din filosfera unor specii de Ocimum i Perovskia n momente
ontogenetice diferite
n vederea caracterizrii fiziologice s-a optat pentru utilizarea testelor Api 50CH (Biomerieux). Avantajul acestor
teste const, pe de o parte, n posibilitatea evalurii potenialului metabolic al microorganismelor de a utiliza diferite surse de
carbon (carbohidrai i derivai ai acestora: heterozide, polialcooli, acizi uronici etc.), iar pe de alt parte n oportunitatea
identificrii taxonomice a tulpinilor bacteriene filosferice.
Api 50 CH este un sistem standardizat care asociaz 50 teste biochimice pentru studiul metabolismului
carbohidrailor la microorganisme. Sistemul este utilizat mpreun cu mediul Api 50 CHB pentru identificarea genului Bacillus
i a genurilor nrudite. Este compus din 50 microtuburi cu substraturi utilizate pentru evidenierea proceselor de fermentaie
ale glucidelor i derivailor. Pentru hidratarea substraturilor din microtuburi s-a utilizat mediul Api 50 CHB inoculat cu o
suspensie din cultura de 24 ore a bacteriei de testat. Dup introducerea mediului inoculat n microtuburi, galeriile au fost
incubate 24 ore la 280 C. n timpul incubrii, desfurarea proceselor de fermentaie este evideniat printr-o modificare a
culorii din rou (control negativ, poziia 0) n galben (reacie pozitiv, pozi iile 1-49) ca urmare a producerii de acid detectat
de un indicator de pH prezent n microtuburi.
Pentru realizarea acestor teste au fost selectate (pe baza caracterelor micro-morfologice) 7 tulpini izolate din
filosfera speciei Perovskia atriplicifolia i 4 tulpini din filosfera speciei Ocimum basilicum (Foto 16-26) recoltate n dou etape
corespunztoare unor fenofaze diferite (vegetativ i nflorire). Au fost alese doar tulpinile reprezentate morfologic prin bacili.
Rezultatele analizelor efectuate demonstreaz c microorganismele care populeaz suprafeele foliare ale celor
dou plante investigate utilizeaz cu precdere monoglucidele, toate tulpinile testate metaboliznd D-glucoza, D-fructoza,
dar i esculina un glicozid, derivat al glucozei cu cumarina - Fig. 3 (Tabelul 6 Anexa la Raportul in extenso). De
asemenea, 81 % din tulpinile testate utilizeaz D-maltoza, D-trehaloza, D-riboza i N-acetiglucozamina.
Nici una din tulpinile testate nu au fost capabile s metabolizeze eritrolul, D-arabinoza, D i L-xiloza, dulcitolul,
inozitolul, sorbitolul, .a.
Preferinele metabolice ale bacteriilor filosferice testate sunt asemntoare majoritii microorganismelor, ele
utiliznd cu preferin monoglucidele simple (Morris et al., 1996).
Gluconat de potasiu
1

D-tagatoz
3

D-turanoz

1
1

Gentibioz
Glicogen

Amidon

D-rafinoz

1
1

Inulin
9

D-trehaloz

D-zaharoz

1
1

D-melibioz
D-lactoz

10

D-maltoz

D-celobioz

Salicin

11

Esculin

8
2

Arbutin
9

Amigdalin

N-acetiglucozamin

Metil D-glucopiranozid

D-manitol

L-ramnoz

11
11

D-manoz
D-fructoz

5
4

D-glucoz
9

D-galactoz

D-xiloz

5
0

D-riboz
6

10

12

L-arabinoz
Glicerol

Fig. 3 Utilizarea surselor de C de ctre tulpinile bacteriene izolate din filosfera speciilor
Perovskia atriplicifolia i Ocimum basilicum (Api 50CH)

Utilizarea testelor API 50CH i a programului Apiweb au permis identificarea taxonomic a celor 11 tulpini
bacteriene testate (Tabelul 6). Rezultatele obinute demonstreaz c microbiota ce se dezvolt pe suprafaa foliar la cele
dou specii de plante este puin diversificat, fiind reprezentat prin Bacillus cereus i Bacillus pummilus la Perovskia
atriplicifolia, respectiv prin Bacillus mycoides i Bacillus pummilus la Ocimum basilicum. Datele confirm concluziile descrierii
morfologice a tulpinilor testate, cauza diversitii sczute fiind probabil legat de capacitatea celor dou plante de a produce
uleiuri volatile. Datorit efectului antimicrobian indus de aceste uleiuri, pe suprafaa frunzelor nu se poate dezvolta o
comunitate de microorganisme foarte bine reprezentat din punct de vedere calitativ.

Nr. crt.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Tabelul 6 ncadrarea taxonomic a tulpinilor izolate din filosfera speciilor

Perovskia atriplicifolia i Ocimum basilicum (Api 50CH)
Tulpina
Genul
Specia
F1-2v
Bacillus
cereus
FB1
Bacillus
cereus
FM1
Bacillus
lentus
FV2
Bacillus
pummilus
FB6
Bacillus
pummilus
FM3
Geobacillus
thermoglucosidasius
F2-6
Bacillus
mycoides
O3FV3
Bacillus
pummilus
O3FV1
Bacillus
mycoides
O4FV2
Bacillus
mycoides
O3FD2
Bacillus
mycoides

% identificare
89,1
97,8
65,2
99,8
64,6
58,8
71,9
99,9
73,3
88,5
71,9

2.2. Caracterizarea morfologic a limbului foliar la specii de Ocimum i Perovskia (microscopie optic) n corelaie cu
intensitatea unor procese fiziologice fundamentale (fotosintez, respiraie, activitate catalazic si peroxidazic, coninut de
pigmeni asimilatori) i cu producia de uleiuri volatile
Materialul vegetal investigat morfo-anatomic (microscopie optic) este reprezentat de frunze de Ocimum basilicum
L. i de Perovskia atriplicifolia Benth. Cultivate n zona de cercetare. Protocolul de pregtire a materialului vegetal n
vederea secionrii impune fixarea materialului proaspt n alcool etilic 70% i parcurgerea ulterioar a urmtoarelor etape:
Secionarea materialul vegetal; javelizarea seciunilor; colorarea seciunilor cu verde iod i rou ruteniu; montarea seciunilor
n glicero-gelatin.
Preparatele obinute au fost analizate i fotografiate la microscopul fotonic Novex (Holland)
Investigaiile realizate asupra aparatului foliar al speciilor Ocimum basilicum L. i Perovskia atriplicifolia Benth.
confirm o serie de date din literatura de specialitate referitoare la particularitile structurale ale lamiaceelor n general, dar
aduc i informaii noi referitoare la:
prezena perilor secretori n ambele epiderme ale limbului foliar la ambele specii;
cei mai numeroi sunt perii secretori cu baz unicelular, pedicel unicelular i parte secretoare bicelular (prezeni
mai cu seam pe tulpin), precum i cei cu partea secretoare tetra- (rar octo-) celular (prezeni mai cu seam pe
frunze); mai puin numeroi sunt perii cu pedicel bicelular i parte secretoare unicelular (prezeni mai cu seam
pe tulpin) n cazul speciei Ocimum basilicum L.;
la Perovskia atriplicifolia Benth. s-au observat numeroi peri secretori cu parte secretoare bicelular i un numr
mai mic de peri cu partea secretoare pluricelular.
Pentru analiza parametrilor funcionali - proces de fotosintez (A) i respiraie (R) - a fost folosit aparatul portabil de
determinare in vivo LCi, rezultatele raportndu-se la gradul de iluminare de care a beneficiat aparatul fotosintetic al
plantelor (Q leaf) Tabelul 7.
Tabelul 7 - Ritmului mediul al proceselor fotosintetic i repirator la Perovkia atrilicifolia
pe parcursul perioadei de vegetaie a anului 2010

Q leaf
A
R

1034.88
48.8216
0.5612

229.32
4.3216
1.4444

92.28
1.412
4.9

Analiznd, ritmul fotosintetic (A) i respirator (R) la Perovskia atriplicifolia, n funcie de gradul de insolaie de
care a beneficiat aparatul su foliar (Q leaf), observm o reducere a procesului fotosintetic, odat cu parcurgerea ciclului
ontogenetic, maximum fotosintetic nregistrndu-l frunzele n etapa vegetativ, de tineree structural, cnd structurile
fotosintetice aveau un potenial funcional maxim, n timp ce procesul respirator debuteaz cu valori minime, se intensific
vizibil n etapa de nflorire (motivat, probabil, de necesarul energetic sporit al plantelor pentru constituirea aparatului
reproductor), pentru a se finaliza la cote maxime, cerute, pe ct se pare, de formarea organelor de nmulire, care necesit
pentru constituire un efort energetic sporit al ntregului organism vegetal.

Coninutul de pigmeni asimilatori foliari (Fig. 4), dozat prin metoda spectrofotometric pe extracte acetonice
(Artenie i Tnase, 1982), se pliaz, prin valorile nregistrate pe ritmul fotosintetic discutat, anterior.
mg/g s.pr.

Stadiu veg
Inflorire

4.5

Fructificare

3.5

2.5

1.5

0.5

0
Cl a

Cl b

Pigm carot

Fig. 4 - Variaia coninutului de pigmeni asimilatori foliari la Perovskia atriplicifolia

pe parcursul perioadei de vegetaie a anului 2010

Enzimele repiratorii peroxidaza i catalaza, dozate prin metode spectrofotometrice specifice (Artenie i Tnase,
1982), reprezint, la rndul lor, indici biochimici importani pentru aprecierea ritmului metabolic celular n cazul aparatului
foliar supus unor condiii stresante de ambient (factori abiotici de mediu variabili, dar i factori biotici specifici, ca de exemplu
instalarea i constituirea comunitilor microbiene n filosfera specific). Activitile enzimatice investigate au demonstrat
(prin nregistrrile concomitente cu cele efectuate pentru procesul respirator) variaii + / - semnificative indicnd, considerm
noi, ritmuri metabolice diferite, corelate n special cu vrsta organului investigat (frunza), care rspunde unitar la aciunea
cumulat a unor factori de stres abiotic i / sau biotic.
Analiza calitativ a uleiurilor volatile produse de frunze, realizat prin metoda cromatografiei GC-MS pe probe
extrase prin hisrodistilarea materialului vegetal cu un aparat de tip Clevenger, a evideniat compuii caracteristici, dintre care
amintim, n funcie de procentajul de identificare eucalyptole (24.62%), o-cymene (17.87%) i borneol (15.37%), urmai de terpinene (6.39%), bornyl acetate (4.83%) i camphene (4.66%). n uleiul obinut din planta ntreag au fost identificai n
total 32 compui; 27 dintre acetia au fost identificai i n uleiul din tulpini, iar 27 dintre constituenii evideniai n planta
analizat integral au fost identificai i n frunze, n timp ce 24 dintre acetia au fost detectai n uleiul volatil obinut din flori
(Fig. 5).

Fig. 5 Compozii uleiului volatil produs de frunze de Perovskia atriplicifolia n faza de antez

Pentru specia Ocimum basilicum L. ritmul fotosintetic urmeaz o curb cu valori maxime n faza de antez, de
construcie a aparatului reproductor, faz n care i coninutul de pigemni asimilatori totali i pe forme componente,
alturi de coninutul de uleiuri volatile, ca produi secundari de maxim importan pentru ecologia speciei, ating valori
maxime.
Intensitatea mai redus a procesului de fotosintez din faza vegetativ se poate explica prin suprafaa foliar
total mai mic atins de aparatul vegetativ, acest moment constituind etapa de consolidare morfologic, structural i
funcional a aparatului fotoasimilator; spre finele cilului ontogenetic plantele investigate i reduc mult ca intensitate procesul
fotosintetic, mbtrnirea funcional a structurilor fotoasimilatoare fiind clar exprimat i de scderea coninutului de
pigmeni asimilatori foliari totali i pe forme componente.
Procesul respirator are la rndul su un ritm de realizare specific, cu valori sporite pornind de la faza vegetativ
spre faza de antez, faz intens consumatoare de resurse energetice, direcionate cu preponderen pentru construirea
aparatului reproductor i pentru asigurarea proceselor metabolice suport de sinteza a numeroi compui de maxim
importan pentru viaa indivizilor vegetali luai ca ntreg, printre care uleiurile volatile ocup un loc primordial; uletrior
respiraia foliar se reduce valoric semnificativ spre finele cilului de vegetaie, iar ezimele cilului respirator (peroxidaza i
catalaza) activeaz, la rndul lor oarecum proporional cu intensitatea acestui proces catabolic.

3. Evidenierea particularitilor filosferei la specii de plante (Dioscorea i Ardisia) care manifest grade diferite ale
interrelaiilor dintre microorganisme i suportul foliar
3.1. Izolarea si cultivarea microorganismelor din filosfera speciilor de Dioscorea si Ardisia
n vederea izolrii microorganismelor din filosfera speciilor Dioscorea batata, D. japonica i Ardisia crenata au fost
utilizate dou metode:
1. Amprentarea pe agar nutritiv (Tsavkelova et al., 2007): frunze din diferite regiuni ale plantei (baz i vrf) au fost
aezate n condiii sterile pe suprafaa mediului de cultur, att pe faa ventral ct i pe cea dorsal; plcile Petri au fost
ulterior incubate 48 ore la 280 C (Foto 27-28).

Foto 27 Dioscorea batata - frunze bazale: amprent pe agar nutritiv

Foto 28 Dioscorea japonica - frunze bazale: amprent pe agar nutritiv

2. nsmnarea la suprafaa mediului de cultur (agar nutritiv) a unor diluii zecimale provenite din suspensii
microbiene n ap distilat steril: frunze de Dioscorea batata, D. japonica i Ardisia crenata au fost introduse n baloane cu
ap distilat steril, agitate apoi la 190 rpm i 280 C, timp de 30 min; din aceste suspensii au fost obinute diluii zecimale
seriate care au fost nsmnate prin etalare (Dunca et al., 2004). Ulterior, plcile Petri au fost incubate 72 ore la 280 C (Foto
29-31).
Dup cele trei zile de incubare s-au izolat de pe suprafaa plcilor cu coloniile dezvoltate (pe baza caracterelor
macro-morfologice) mai multe tulpini bacteriene. Repicarea s-a fcut cu ajutorul ansei sterile, n eprubete cu mediu de
cultur nclinat, avnd aceeai compoziie cu cea a mediului iniial folosit pentru izolare. Eprubetele nsmnate prin tehnica
descrierii de striuri la suprafa au fost incubate la 280 C, timp de trei zile.

Foto 29 Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Dioscorea

batata dezvoltate pe agar nutritiv

Foto 30 Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Dioscorea

japonica dezvoltate pe agar nutritiv

Foto 31 Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Ardisia crenata

dezvoltate pe agar nutritiv

Pentru verificarea puritii tulpinilor izolate, dar i pentru descrierea caracterelor micro-morfologice, s-au efectuat
frotiuri colorate dup metoda Gram (Dunca et al., 2004) care au fost supuse examenului microscopic (1000 x).
Dup ntocmirea coleciei, tulpinile pure s-au pstrat la temperatura de + 40 C. Au fost obinute culturi stoc (glicerol
30 %) pentru pstrare la -800 C. Colecia de microorganisme astfel ntocmit a servit studiilor ulterioare.
3.2. Aprecierea macro i micromorfologic a suprafeei foliare la specii de Ardisia i Dioscorea, n corelaie cu poziionarea
comunitilor de microorganisme pe aparatul foliar
Aspecte anatomice si micromorfologice la Ardisia crenata Sims
Nodulii bacterieni de pe frunzele unor specii din familia Myrsinaceae (inclusiv din genul Ardisia) au fost pentru
prima dat descrii de Hohnel (1881). Acetia apar pe marginea frunzei i fac parte dintr-o simbioza obligatorie pentru
desfurarea ciclului de via la aceste specii; bacteriile sunt prezente n muguri i infecteaz toate primordiile foliare precum

i florile i seminele. Studiile au artat c tratamentele ce distrug bacteriile se soldeaz cu moartea plantei (Nakahashi et al.,
2005). Seciunile transversale prin frunze tinere ne arat noduli bacterieni complet formai. Infectarea frunzelor are loc n
stadiile timpurii ale ontogenezei printr-o stomat asemntoare unei hidatode, care se inchide ulterior. Aceasta este de
dimensiuni mai mari dect o stomat obiniut de pe frunz. Dup infectare, stomata se nchide prin fuzionarea celulelor din
camera substomatic (Miller, 1990). Partea central a nodozitii este alcatuit din celule tubulare, alungite spre zona de
ptrundere a bacteriilor. Aceasta apare aproape incolor pe seciuni proaspete, n zonele laterale observndu-se puine
cloroplaste, mult mai mici dect cele din mezofilul adiacent. Gardner et al. (1984) descriu din punct de vedere ultrastructural
cloroplastele din aceast regiune ca fiind aproape complet degenerate, cu membrana intern uneori dezorganizat, cu grane
dezorganizate i fr plastoglobuli. Lersten si Horner (1976) precizeaz faptul c bacteriile ncep s se divid dup ce au
intrat n celule. Prezena lor inhib dezvoltatea cloroplastelor. Bacteriile sunt prezente att intracelular, ct i n spaiile
extracelulare. n acest stadiu nodozitatea este alcatuit doar din masa central de celule i conexiunea vascular cu esutul
conductor al frunzei (vizibil la partea intern a nodozitii).
La frunza matur nodozitile sunt de dimensiuni mult mai mari, prezint o structur mai organizat, zona central
compact fiind inconjurat de o zon vascular continu. Aceasta este alcatuit att din vase conductoare lemnoase, ct i
liberiene (n partea intern a nodozitii) i numai din esut liberian n rest. La periferia zonei vasculare se poate observa un
strat de celule strns unite ntre ele, dispuse ordonat (structura lor amintind de un endodermoid, cu rol, probabil n izolarea
nodozitii). Unele dintre aceste celule, situate n apropierea fasciculului conductor libero-lemnos, prezint perei celulari
ngroai i lignificai. Aceast strat protector este ntrerupt doar n dreptul fostei camere substomatice prin care s-a realizat
infectarea. estutul conductor liberian predominant n aceast structur vascular asigur translocarea substanelor
nutritive de la planta gazd spre celulele nodozitii (Miller, 1990). Bacteriile vii se gsesc att n celule, ct i n afara lor, n
strns legtur cu peretele celulelor din stratul protector; aceasta ar sugera faptul c bacteriile ar prelua o parte din
materialul parietal al gazdei pentu a-l folosi la sinteza peretelui propriu (Gardner, 1984). n nodozitatea matur, unele celule
au pereii distrusi, fapt observat i de ctre Gardner (1984). n vecintatea nodozitii se observ numeroi ursini de oxalat
de calciu; acetia au fost evideniai att n lumin direct, ct i n lumin polarizat i prin microscopia electronic cu
baleiaj. Dei prezeni n toat structura frunzei, numrul relativ crescut n vecintatea nodozitii sugereaz rolul protector al
acestora, ct i realizarea unui depozit de calciu ionic, necesar metabolismului nodozitii (calciul fiind implicat n biogeneza
peretelui celular).

A.

C.

E.

B.

D.

F.

Foto 32 Morfologia frunzei de Ardisia crenata (A faa adaxial, B faa abaxial) se observ nodozitile situate pe margine, C seciune
transversal printr-o frunz tnr (x20) se observ o nodozitate n curs de formare, D seciune transversal printr-o frunz tnr (x20) se
observ nodozitatea cu celule tubulare, alungite spre locul de ptrundere al bacteriilor, E, F detalii cu nodozitatea din frunza tnr (x40) se
observ stomata modificat prin care s-a realizat infecia, deschis nc; de asemenea, putem observa fasciculul conductor ce va asigura
vascularizatia nodozitii (orig).

Iniierea nodulilor bacterieni se realizeaz timpuriu n ontogenez, prin infectarea frunzelor cu bacterii ce se afl pe
suprafaa lor (n filosfer) (Lersten, 1976). Frunzele ajunse la maturitate nu mai pot incorpora bacterii pentru a realiza acest
tip de simbioz (stomatele modificate prin care se realizeaz infecia se inchid ntre timp). Nodulii bacterieni de la speciile de

Ardisia au fost considerai ca fiind hidatode modificate (Miehe, 1911). Rolul lor este nc controversat. Iniial se credea c ar
avea rol n fixarea azotului, ntr-un mod similar cu cele din genul Rhizobium, de la leguminoase; ulterior, ali cercettori au
presupus faptul c nodulii bacterieni ar fi o surs de substane de cretere pentru plante (Becking, 1977), substane pe care
ele nu ar fi capabile s le produc. Investigaiile ultrastructurale relev ns similariti morfologice ntre bacteriile din
nodozitile foliare de la Ardisia i cele din nodozitile fixatoare de azot de la legumnioase (din genul Rhizobioum). Cercetri
recente (Nakahashi et al. 2005) par s infirme simbioza obligatorile ntre bacterii i frunzele de la Ardisia.
Investigaiile electronomicroscopice, utiliznd microscopul electronic cu baleiaj au evideniat morfologia bacteriilor
att n nodozitile tinere, ct i n cele mature. n nodozitatile tinere numrul bacteriilor observate este foarte mare; ele
manifest un vizibil pleiomorfism, majoritatea avnd forma de bastona, de 1,5-2,5 m, altele fiind in forma de V sau Y.
Unele dintre ele (puine la numr) sunt n faza de diviziune. n nodozitile mature bacteriile observate sunt mai puine ca
numr, dar au dimensiuni mai mari. O parte dintre ele au degenerat n cursul dezvoltrii nodozitii, resturile lor fiind prezente
n spaiile intra i inter celulare. Degenerarea bacteriilor n nodozitatea adult a fost observat i de Gardner (1984), care
precizeaz faptul c materialul organic rezultat poate fi refoslosit de crte bacteriile rmase.

Foto 33 Seciune transversal prin

marginea frunzei de la Ardisia crenata (x20)
(necolorat) A se observ nodozitatea
matur aproape incolor, celulele avnd un
numr redus de cloroplaste mici, B seciune transversal prin nodozitatea
matur (coloraie cu rou rutheniu i verde
iod) (x20) se observ fasciculul
conductor mixt, libero-lemnos din partea
intern a nodozitii i stratul protector ce
nconjoar nodozitatea, C detaliu din
nodozitatea matur (x40) se observ mici
fascicule liberiene de jur mprejurul
nodozitii, sub startul protector, D
seciune transversal prin nodozitatea
matur (x20) se observ conexiunea
vascular cu sistemul conductor al frunzei,
E detaliu din zona conexiunii vasculare
(x40) se observa vase de lemn si de liber
sectionate longitudinal, E sectiune
transversala prin marghinea frunzei intr-o
zona fara nodozitati (x20) (orig.).

A.

C.

B.

D.

E.

Foto 34 Seciune transversal prin nodozitatea de la frunza matur observat n lumin polarizat A (x20) sunt vizibile numaroase cristale de
oxalat de calciu n vecintatea nodozitii, B detaliu din nodozitatea matur (observaie n lumin polarizat) (x40), C, D seciuni transversale
prin frunza matur (x40) se observ peri secretori peltai, cu baza unicelular, piciorul unicelular i glanda pluricelular, E stomat situat
uor peste nivelul celulelor epidermice (x40) (orig).

Foto 35 Aspecte electronomicroscopice ale nodozitilor bacteriene de

pe frunzele de Ardisia: A seciune
transversal prin frunza tnr (bara = 200
m), B - seciune transversal prin frunza
matur (bara = 500 m), C bacterii cu
localizare intracelular din nodozitatea frunzei
tinere (bara = 10 m), D bacterii alungite sau
n form de Y sau V cu localizare intracelular
din nodozitatea frunzei tinere (bara = 5 m), E
bacterii viabile i degenerate n nodozitatea
frunzei mature (bara = 5 m), F bacterie n
form de Y din nodozitatea frunzei mature
(bara = 2 m) (orig.).

Micromorfologia epidermei
Au fost investigate din punct de vedere
micromorfologic att epiderma superioar, ct i cea
inferioar. Stomatele, prezente n ambele epiderme
sunt de tip anizocitic (mai numeroase n epiderma
inferioar). Cuticula prezint o granulaie fin de
cear epicuticular i este striat la baza perilor
secretori. Pe epiderma inferioara se observ
numeroi peri secretori scuri, peltai, cu glanda bi-,
tetra- sau multi celular. Conform unelor ipoteze
(Miller 1990), aceti peri ar juca un rol important n
realizarea infeciei bacteriene din mugur la
primordiile foliare tinere. Pe suprafaa ambelor epiderme au fost observate bacterii izolate, de tip bacil, de 2-3 m,
unele aflate n proces de diviziune.

Foto 36 Aspectul general al nodozitii de pe frunza matur (bara = 500 m) A, B zona de intrare a bacteriilor este obturat la frunza matur
(bara = 50 m), C ursin de oxalat de calciu n vecintatea nodozitii (bara = 20 m) (orig)

Foto 37 Micromorfologia epidermei inferioare de la frunza matur: A apect general se observ numeroase stomate de tip anizocitic i un pr
secretor peltat (bara = 100 m), B pr secretor cu glanda bicelular (bara = 20 m), C pr secretor cu glanda tertacelulara(bara = 20 m), D
pr secretor cu glanda pluricelular (bara = 20 m), E - pr secretor cu glanda pluricelular (bara = 20 m), F - pr secretor cu glanda
pluricelular vzut lateral (bara = 20 m) (orig).

Aspecte micromorfologice la specii de Dioscorea

Au fost investigate din punct de vedere micromorfologic dou specii ale genului Dioscorea: D. batata L. i D.
japonica Thunb.ntre cele dou specii analizate apar diferene micromorfologice evidente. La Dioscorea jaopnica cuticula,
ndeosebi pe epiderma inferioar, este striat i prezint cear epicuticular dens, sub form de plci. Perii secretori sunt
numeroi la Dioscorea batata, n timp ce la D. japonica ntlnim ndeosebi peri tectori. n mezofilul frunzelor s-au observat
celule mari, cu cristale de oxalat de calciu (rafide). Pe suprafeele foliare au fost observate bacterii i fungi aparinnd
filosferei, bacteriile fiind izolate, mai rar n asociere cu hifele fungale.

Foto 38 Aspecte
micromorfologice ale frunzei de
Dioscorea batata. A epiderma
inferioar n dreptul nervurii
mediane (imagine de ansamblu);
se observ peri secretori
localizai pe nervur (bara = 200
m), B epiderma inferioar ntre
nervuri se observ hife
miceliene (bara = 50 m), C
detaliu (bara = 10 m), D, E
bacterii localizate pe epiderma
inferioar (bara = 5 m), F
bacterie i o hif micelian de pe
epiderma inferioar (bara = 10
m) (orig.)

4. Studiul comparativ al factorilor ce intervin n constituirea i funcionarea comunitilor filosferice la specii de

Dioscorea si Ardisia
4.1. nregistrarea factorilor de mediu cu efect major asupra dezvoltrii plantelor test n Grdina Botanic (temperatur,
umiditate, insolaie)
nregistrarea factorilor de mediu n funcie de care s-au dezvoltat plantele test s-a realizat utiliznd un aparat portabil LCi
de determinare a intensitii fotosintezei, repiraiei, transpiraiei, cu nregistrare automat a gradului de insolaie la nivelul
funzelor; umiditatea aerului i temperaturii de lucru au fost msurate pe parcursul realizrii determinrilor folosind un
Termohigrometru Testo 625 cu sensor de umiditate i temperatur (Tabelul 8).
Tabelul 8 - Variaia factorilor de mediu n spaiul de analiz (perioada de vegetaie - anul 2010)
Specia investigat

Recoltarea

Ocimum basilicum

Vegetativ
nflorire
Fructificare
Vegetativ
nflorire
Fructificare
Determ. I
Determ. II
Determ. I
Determ. II

Perovskia atriplicifolia
Dioscorea (D. batata i D. japonica)
Ardisia crenata

Insolaie
(Q leaf)
110.2
200
120.3
1034.88
229.32
92.28
89.6
67.6
50.4
55

Temperatur
(0C)
34.3
26.3
29
35.4
24.5
22.7
27.3
28.7
26
24.5

Umiditate (%)
58.5
70
47.7
55.6
72
53.2
72.9
57.2
55
50

4.2. Cercetri preliminare privind dinamica numeric a populaiilor de microorganisme din asociaiile filosferice la Ardisia i
Dioscorea cultivate n Grdina Botanic Iai
Izolarea i aprecierea cantitativ a microbiotei de pe frunzele de Dioscorea batata i D. japonica au fost corelate cu
dou fenofaze corespunztoare creterii vegetative i nfloririi, iar pentru Ardisia crenata determinrile s-au realizat la faza de
nflorire. Pentru estimarea numrului de UFC (uniti formatoare de colonii) s-au prelevat steril fragmente de frunze cu
greutatea de 1 g utilizate pentru ob inerea de suspensii n ap distilat steril (agitare la 190 rpm, 280 C). Suspensiile
obinute au fost nsmnate pe agar nutritiv.
Numrul de UFC/g frunz a variat la speciile analizate n funcie de fenofaza urmarit (Tabelul 9). Cel mai mare
grad de colonizare al suprafeelor foliare a fost nregistrat pe parcursul creterii vegetative, numrul de UFC/g frunz
scznd ulterior spre nflorire. O posibil explicaie este legat de faptul c planta elibereaz la nivel foliar pe parcursul
creterii vegetative cantiti mai abundente de exudate, ceea ce determin o proliferare a microbiotei epifite (Lindow et al.,
2003). De asemenea, la momentul nfloririi, cantitile de uleiuri volatile produse de structurile foliare specializate sunt mai
ridicate, ceea ce determin un efect antimicrobian mai pronunat i, prin urmare, o mai slab reprezentare cantitativ a
microbiotei filosferice (Jurkevitch et al., 2000; Thompson et al., 1995).
Tabelul 9 - Dinamica numeric a populaiilor de microorganisme din filosfera plantelor de
Dioscorea batata, D. japonica i Ardisia crenata
Izolare

Dioscorea batata
UFC/g frunz
32 x 105
57 x 105
19 x 104

Vegetativ 1
Vegetativ 2
nflorire

Dioscorea japonica
UFC/g frunz
14 x 104
31 x 104
84 x 102

Ardisia crenata
UFC/g frunz
61 x 102

4.3. Cuantificarea reaciilor de rspuns fiziologic (fotosintez, respiraie) ale aparatului foliar suport pentru comunitile de
microorganisme simbionte la specii de Ardisia i Dioscorea
Pentru speciile genului Dioscorea nregistrarea parametrilor s-a realizat n momente diferite, la interval de 30 zile,
datorit faptului c cele dou specii au port lianoid, cu o cretere prelungit a lstarilor. Au fost efectuate determinri la un
numr de 5 frunze pentru ficare individ analizat (cte 5 indivizi la fiecare determinare). Rezultatele obinute reprezenta astfel
media aritmetic a citirilor efectuate (Tabelul 10, Tabelul 11).
Tabelul 10 - Valorile medii ale ritmului fotosintetic i respirator la Dioscorea batata
pe parcursul perioadei de vegetaie a anului 2010 (frunze din vr, respectiv de la baz)

110

B fr. baz
Q leaf

72

72

72

72

72

0.17

0.17

0.45

0.33

0.28

0.45

0.21

0.18

0.18

3.69

3.27

3.59

3.69

0.71

A fr. vrf
Q leaf

95

108

113

110

0.26

0.18

0.26

0.1

0.21

0.18

Tabelul 11 - Valorile medii ale ritmului fotosintetic i respirator la Dioscorea japonica

pe parcursul perioadei de vegetaie a anului 2010 (frunze din vr, respectiv de la baz)

A fr. vrf
Q leaf

110

110

105

105

110

0.18

0.11

0.12

0.36

0.36

0.38

0.36

0.36

0.36

0.36

B fr. baz
Q leaf

49

46

46

46

49

0.19

0.1

0.27

0.41

0.24

0.39

0.44

0.49

0.49

0.52

Datorit portului caracteristic al plantelor, gradul de iluminare al frunzelor este oarecum uniform, inducnd un ritm
echilibrat al celor dou procese de baz, fr diferene semnificative funcie de poziionarea frunzelor pe lstari. n acelai
timp ambele specii ating valori, n mrime absolut a celor doi parametri, destul de asemntoare.
Nu s-a putu realiza, deocamdat, o corelaie vizibil ntre intensitatea celor dou procese msurate i gradul de
dezvoltare a microorganismelor din filosfera proprie (astfel de date nu au fost regsite nici n literatura de specialitate).
La Ardisia crenata, specie cultivat n spaii protejate, investigaiile noastre au evideniat valori fotosintetice i
respiratorii foarte asemntoroare pentru toate frunzele analizate, care au beneficiat, la rndul lor, de condiii mult mai
uniforme de iluminare (condiii de cultivare n ser), respectiv de temperatur i umiditate (Tabelul 12).
Nici n acest caz nu ne putem pronuna nc (datele noastre au caracter preliminar), dac ar putea exista o
corelaie ntre intensitate proceselor analizate i gradul de dezcoltare a nodulilor foliari, a cror microorganisme ar putea
furniza susra azotat necesar unui cilcu nutriional normal frunzelor n interiorul crora se cantoneaz.
Tabelul 12 - Valorile medii ale ritmului fotosintetic i respirator la Ardisia crenata
cultivat n condiii protejate

Q leaf

57

51

54

46

44

0.23

0.19

0.27

0.32

0.32

0.72

0.65

0.78

0.83

0.83

Bibliografie selectiv
Artenie V., Tnase E., 1982, Practivum de Biochimie, Ed. Univ. Al. I. Cuz Iai.
Basher, K., Ozek, T., Demirchakmak, B., Abduganiev, B., Nuriddinov, K., Aripov, K., Doriev, A. and Karataeva, C., 1997.
"Essential oil of Perovskia angustifolia from Kyrgyzystan." Chemistry of Natural Compounds 33(3): 296-298.
Burt, S., 2004. "Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review." International Journal of
Food Microbiology 94(3): 223-253.
Dunca, S., Ailiesei, O., Nimitan, E. and tefan, M., 2004. Microbiologie aplicat. Iasi, Editura Tehnopress.
Horner, H. T., Lersten N. R.. 1972. Nomenclature of bacteria in leaf nodules of the families Myrsinaceae and Rubiaceae. Int. J.
Syst. Bacteriol. 22: 117-122.
Jurkevitch, E. and Shapira, G., 2000. "Structure and colonization dynamics of epiphytic bacterial communities and of selected
component strains on tomato (<i>Lycopersicon esculentum</i>) leaves." Microbial Ecology 40(4): 300-308.
Karamanoli, K., Vokou, D., Menkissoglu, U. and Constantinidou, H. I., 2000. "Bacterial Colonization of Phyllosphere of
Mediterranean Aromatic Plants." Journal of Chemical Ecology 26: 2035-2048.
Lebard S., Belin-Depoux M., 2003. Structure and ontogeny of foliar bacterial nodules of Ardisia crenata Sims (Myrsinaceae).
Acta Botanica Gallica, 150, 1933.
Lersten, N. R., Horner H. T. 1967. Development and structure of bacterial leaf nodules in Psychotria bacteriophila Val.
(Rubiaceae). J. Bacteriol. 94: 2027-2036.
Lersten, N. R., Horner H. T., 1976. Bacterial leaf nodule symbiosis in angiosperms with emphasis on Rubiaceae and
Myrsinaceae. Botanical Review, 42: 145-214.
Lindow, S. E. and Brandl, M. T., 2003. "Microbiology of the Phyllosphere." Appl. Environ. Microbiol. 69(4): 1875-1883.
Miehe, H. 1911. Die sogenannten Eiweissdrusen an den Blittern von Ardisia crispa A. Ber. deut. Bot. Ges. 29: 156-157.
Miller, I. M., Scott, A., Gardner, I. C., 1978. Pleomorphism of the endophyte in leaf nodules ofArdisia crispa. Microbios Ltters, 9:
133-137.
Miller I. M., 1990. Bacterial leaf nodule symbiosis. Advances in Botanical Research Incorporating Advances in Plant Pathology
17, 163234.
Morris, C. E., Nguyen-The, C. and Nicot, P. C., 1996. Aerial Plant Surface Microbiology (The Language of Sc
ience),
Springer
Thompson, I. P., Bailey, M. J., Ellis, R. J., Lilley, A. K., McCormack, P. J., Purdy, K. J. and Rainey, P. B., 1995. "Short-term
community dynamics in the phyllosphere microbiology of field-grown sugar beet." FEMS Microbiology Ecology 16(3): 205-212.
Saikkonen K., Wali P., Helander M., Faeth S. H., 2004. Evolution of endophyte-plant symbioses. Trends in Plant Science, 9,
275280.
Tsavkelova, E. A., Cherdyntseva, T. A., Botina, S. G. and Netrusov, A. I., 2007. "Bacteria associated with orchid roots and
microbial production of auxin." Microbiol Res 162(1): 69-76. VARMA A, ABBOT L., WERNER D., HAMPP R., 2004. Plant
surface Microbiology. Ed. Springer Berlin, Heidelberg, New york, Hong kong, London, Milan, Paris, Tokyo:145-157.