CAPITOLUL

Cap.51 XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM. SUINELE TRANSGENICE CA SURSÃ DE

51
ORGANE

XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM. SUINELE

TRANSGENICE CA SURSÃ DE ORGANE
Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU

1. INTRODUCERE. ISTORIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1163

2. FERMA DE PORCI „SPECIFIC PATOGEN FREE” (SPF) –
PRIMA CONDIÞIE PENTRU OBÞINEREA DE ANIMALE TRANSGENICE . . . . . . . . . . .1166
3. METODOLOGIA OBÞINERII ANIMALELOR TRANSGENICE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1168
3.1. Microinjecþia de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1169
3.2. Transferul genic prin retrovirusuri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1169
3.3. Transfer genic prin celule “stem” embrionare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1169
4. CLONAREA PORCULUI TRANSGENIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1170
5. PATOLOGIA PORCILOR TRANSGENICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1172
6. REACÞIA NATURALÃ ANTIGEN-ANTICORP A XENOGREFELOR . . . . . . . . . . . . . . . .1172
7. ACTIVAREA COMPLEMENTULUI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1173
8. PROTEINELE REGLATOARE ALE COMPLEMENTULUI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1173
9. REJETUL HIPERACUT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1173
10. REJETUL VASCULAR ACUT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1174
11. MECANISMELE CELULARE IMUNE ALE REJETULUI XENOGREFELOR . . . . . . . . .1175
12. CREªTEREA COMPATIBILITÃÞII ORGANELOR DE PORC CU CELE DE OM . . . . .1175
13. STANDARDIZAREA NOMENCLATURII PENTRU ANIMALELE TRANSGENICE . . . . .1176
14. CONCLUZII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1177
BIBLIOGRAFIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1177
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
1. INTRODUCERE. ISTORIC
Transplantul de la animal la om este legat indisolubil de
întreaga istorie ºi evoluþie a ideii de transplant, în
general, de-a lungul timpurilor.
Ideea în sine se pare cã este foarte veche, dacã
luãm în considerare centaurii din mitologia greacã –
jumãtate oameni ºi jumãtate cai. Cel mai faimos dintre
centauri, Cheiron, a fost, de altfel, profesorul lui Esculap,
“pãrintele” medicinei.
În epoca modernã, la începutul secolului XX
Princetau, în Franþa, introduce fragmente de ficat porcin
în rinichiul unui copil cu nefritã în stadiu terminal. La
nivel clinic s-a constatat o ameliorare tranzitorie a
funcþiei renale, chiar dacã bolnavul a decedat dupã 16
zile.
Alte transplante cu rinichi de oaie sau de porc nu
au avut o soartã mai bunã, fenomenele de rejet apãrând
în mod constant ºi ducând la compromiterea rezultatului
(Neuhof 1923).
Odatã cu reuºita transplantului renal la nivel clinic
(Murray 1953), a început sã se punã problema unei
surse de organe care sã acopere necesitãþile.
În anii ’60, înainte de stabilirea criteriilor morþii
cerebrale ºi de acceptarea acestei noþiuni de cãtre
lumea medicalã ºi de cãtre publicul larg, xeno-
transplantul a fost considerat o soluþie pentru rezolvarea
problemei donatorului.
În acea perioadã a fost trecut chiar ºi pragul de la
etapa experimentalã la cea clinicã, deºi imunosupresia
de transplant în general se afla doar în etapa “copilãriei”
(ciclosporina nu fusese încã descoperitã).
Rezultatele celor câteva transplante de rinichi ºi
de cord nu au fost însã pe mãsura aºteptãrilor.
Supravieþuirea cea mai lungã a fost obþinutã de cãtre
Reemtsma1, cu o grefã renalã de la cimpanzeu.
Bolnavul a decedat dupã 9 luni, având însã o grefã
funcþionalã. Examenul histopatologic al grefei nu a
evidenþiat semne de rejet.1
În afara cimpanzeului a mai fost utilizat ca sursã
de organe ºi babuinul, dar supravieþuirea cea mai lungã
a unui organ de babuin transplantat a fost de numai
douã luni (Starzl 1964).2
Pentru rinichi, necesitatea de a apela la un organ
de animal pentru a salva viaþa pacientului a încetat o
datã cu apariþia rinichiului artificial.
Acolo unde nu existã însã aceastã posibilitate,
xenotransplantele au continuat.
În 1984 în SUA a fost efectuat un transplant de
cord de la babuin la o fetiþã de 16 zile (Baby Fae). Ca
imunosupresie s-au folosit ciclosporina, azatioprina ºi
globulina antitimocitarã (ATG). Cu toate acestea, micuþa
51
pacientã a dezvoltat un rejet hiperacut ºi a decedat în
ziua 21 de la transplant prin oprire cardiacã.3
Depãºirea obstacolului reprezentat de rejetul
hiperacut a fost, de altfel, una dintre cele mai dificile
probleme cu care s-a confruntat xenotransplantul. Încã
de la început s-a dovedit cã acesta este de tip umoral,
fiind deci mediat de sistemul complementului.
În cazul ficatului, istoria xenotransplantului se
leagã, încã o datã, de numele lui Thomas Starzl. Acesta
a efectuat trei transplante pentru trei pacienþi pediatrici
cu atrezie biliarã. A fost utilizat ficat de cimpanzeu, dar
supravieþuirile obþinute au fost foarte scurte: 14 zile, 9
zile ºi, respectiv 26 de ore. În primele douã cazuri cauza
principalã a decesului a fost sepsisul, în timp ce în cel
de-al treilea caz decesul a survenit prin hemoragie.
Aceastã ultimã cauzã de deces a conturat încã de
pe atunci o altã problemã importantã în cazul transplan-
tului unui ficat de animal la om ºi anume aceea dacã
ficatul animal produce exact acelaºi tip de proteine
(inclusiv cele cu rol în coagulare) ca ºi omul. Este o
întrebare care nici în prezent nu ºi-a gãsit un rãspuns
satisfãcãtor.
Ca imunosupresoare au fost utilizate azatioprina,
prednisonul ºi serul antilimfocitar. Examenul histo-
patologic al ficatului prelevat necroptic nu a evidenþiat
semne de rejet.
Încã ºase transplante au fost efectuate ulterior,
între 1969 ºi 1974: Bertoye (1969), Leger (1970), Marion
(1970), Poyet (1971), Motin (1971) - toate cu ficat de
babuin ºi din nou Starzl, de la cimpanzeu în 1974.
Apariþia unor criterii precise ale morþii cerebrale ºi
publicitatea în favoarea donãrii de organe (care a
condus la creºterea numãrului donatorilor) pãreau sã
ofere, în cele din urmã, soluþia problemei.
Odatã ce transplantul hepatic s-a impus însã ca
metodã terapeuticã acceptatã (dupã introducerea
ciclosporinei în protocoalele de imunosupresie clinicã ºi
dupã conferinþa de consens de la National Institute of
Health din 1983), s-a dovedit cã numãrul donatorilor
aflaþi în moarte cerebralã este cu mult mai mic decât
necesarul. Aceastã disproporþie era valabilã în mod
particular pentru programele pediatrice. Apariþia
transplantului de la donator viu precum ºi posibilitatea
de împãrþire a ficatului (“split liver transplantation”) au
contribuit substanþial la rezolvarea problemei.
Pe de altã parte, posibilitatea transmiterii unor
infecþii retrovirale de la animal la om, alimentatã mediatic
de scandalul maladiei “vacii nebune”, a determinat mulþi
cercetãtori sã tragã un semnal de alarmã în ceea ce
priveºte transplantul unui organ de la animal la om ºi
chiar sã instituie un moratoriu asupra oricãrui
experiment clinic de acest gen.
1163
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
Xenotransplantul pare a fi intrat momentan într-un
con de umbrã.
Din pãcate însã, problema donatorilor rãmâne
departe de a fi rezolvatã, chiar ºi pentru bolnavii cu
indicaþie unanim acceptatã. Cu atât mai mult aceasta
este valabilã în cazul bolnavilor cu indicaþie marginalã
cum ar fi, de exemplu, bolnavii cu cancer sau cei cu
infecþie cu HIV.
De altfel, existenþa acestei categorii de bolnavi cu
indicaþie relativã a condus ºi la cele douã xeno-
transplante hepatice, de la babuin la om, efectuate în
1992 ºi 1993 la Pittsburgh sub conducerea lui Thomas
Starzl.4 Dupã decesul celui de-al doilea bolnav
programul de xenotransplant a fost din nou oprit ºi nu a
mai fost reluat ulterior.
Analiza celor douã cazuri a relevat însã o serie de
date interesante.
Alegerea babuinului (Papio cynocephalus) ca
donator s-a bazat pe câteva considerente:
• babuinul este un animal mai uºor de obþinut
pentru experimente decât cimpanzeul
• ficatul de babuin este rezistent la infecþia cu virus
B, de aceea constituie o alegere excelentã la
pacienþii cu o astfel de etiologie a cirozei; ambii
bolnavi transplantaþi aveau infecþie cu virus B
• sistemul antigenic ABO este asemãnãtor omului
ºi, ca atare, se poate obþine o compatibilitate de
grup sangvin între donator ºi primitor, ceea ce s-a
ºi obþinut în cazul celor doi pacienþi
Deºi pericolul rejetului hiperacut nu a fost
subestimat, s-a þinut cont, totuºi, de constatãrile clinice
care arãtau cã ficatul este un organ mai rezistent faþã de
acest tip de rejet. Pentru imunosupresie au fost utilizate
Ciclofosfamida, Prostaglandina E1, FK506 ºi cortizonul.
A fost efectuat un screening complet pentru
retrovirusuri precum ºi pentru toate virusurile care sunt
determinate la un donator uman (virusul herpetic,
virusurile hepatitice, citomegalovirusul).
Tehnica chirurgicalã a fost tehnica “piggy-back” cu
utilizarea “by-pass”-ului veno-venos. Alegerea acestei
metode a fost determinatã în primul rând de volumul
redus al ficatului donor (600 cm3 în primul caz ºi 450 cm3
în al doilea).
În ambele cazuri reperfuzia ficatului s-a produs
uniform iar ficatul a început imediat sã producã bilã.
De notat cã primul bolnav fusese splenectomizat
în antecedente (în urma unui accident), în timp ce la cel
de-al doilea a fost efectuatã o splenectomie la 4 zile
dupã transplant în scopul îmbunãtãþirii imunosupresiei.
Primul bolnav transplantat a fost detubat la 17 ore
de la operaþie ºi a supravieþuit 70 de zile, având în acest
timp o condiþie clinicã acceptabilã.
1164
Cel de-al doilea bolnav a rãmas însã intubat ºi
ventilat mecanic pentru tot restul celor 26 de zile cât a
supravieþuit, perioadã în care nu ºi-a recãpãtat
cunoºtinþa.
Biopsiile hepatice efectuate în aceastã perioadã
nu au arãtat semne de rejet la nici unul din bolnavi. Cu
toate acestea, au fost evidenþiate prin imunofluorescenþã
depozite de imunoglobulinã ºi complement la nivelul
endoteliului vascular.
În ambele cazuri s-a constatat un proces de
regenerare semnificativ la nivelul ficatului transplantat.
Astfel, volumul ficatului în cazul primului pacient a
crescut de la 600 cm3 la 1555 cm3 în 26 de zile, iar
volumul ficatului celui de-al doilea pacient a crescut de
la 450 cm3 la 1741 cm3 în 14 zile.
Cocteilul de medicamente imunosupresoare
utilizat a reuºit sã împiedice rejetul hiperacut, de tip
umoral, caracteristic xenotransplantului, în ambele
cazuri, iar biopsiile efectuate nu au pus în evidenþã
semne de rejet acut, de tip celular.
Decesul primului pacient s-a datorat unei
hemoragii subarahnoidiene cauzatã de o aspergilozã,
iar decesul celui de-al doilea s-a datorat unui sepsis de
origine bacterianã.
O particularitate interesantã în ambele cazuri a
constituit-o prezenþa de limfocite T (atât de tip CD4 cât ºi
de tip CD8) precum ºi de celule NK pe membrana
bazalã a canaliculelor biliare. Aceastã constatare a fost
interpretatã ca datorându-se colestazei intrahepatice
care a fost întâlnitã în ambele cazuri, fãrã a avea însã o
explicaþie plauzibilã.
Primul bolnav era infectat cu HIV. În momentul
intervenþiei statusul sãu imunologic a fost apreciat ca
imunocompetent. Retrospectiv este foarte greu de
apreciat dacã în perioada postoperatorie el s-a încadrat
în categoria unui imunodeficient (ceea ce ar fi constituit
un avantaj din punct de vedere al acceptãrii ficatului) sau
s-a comportat ca un pacient cu imunitate normalã.
În cazul celui de-al doilea pacient, dupã implan-
tarea noului ficatul, s-a efectuat intraoperator o tranfuzie
de celule medulare osoase de la babuinul donator.
În primul caz, la necropsie s-a evidenþiat ADN de
la donator la diverse niveluri (inimã, plãmâni, ganglioni
limfatici), iar în cel de-al doilea caz ADN de la donator a
fost evidenþiat constant în sângele primitorului. Aceasta
pare sã confirme teoria microhimerismului a lui Starzl,
conform cãreia migrarea celulelor prezentatoare de
antigen (în mod particular a celulelor dendritice) din
ficatul donatorului în organele ºi þesuturile primitorului
stã la baza fenomenului de acceptare a grefei ºi, în final,
poate conduce la obþinerea toleranþei imune.
În ceea ce priveºte calitatea proteinelor sintetizate
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
de noul ficat, experimentele pe animale au demonstrat
cã existã diferenþe notabile între structura proteinelor
produse de ficatul unor specii diferite. Cu toate acestea
în xenogrefele experimentale nu s-au înregistrat
complicaþii hemoragice.
În cazul celor douã transplante de la babuin la om,
s-a constatat acelaºi lucru: profilul coagulãrii la receptor
a devenit acelaºi cu al babuinului donator, dar timpul de
protrombinã ºi capacitatea de coagulare au rãmas
normale.
Producþia de proteine a noului ficat poate de
asemenea sã interfereze cu numeroase alte cãi
metabolice la om, unele dintre ele putând avea, cel puþin
teoretic, consecinþe extrem de grave. Deºi astfel de
consecinþe grave nu au fost înregistrate în cazul celor
doi bolnavi, în schimb au fost observate modificãri în
metabolismul purinelor, albuminei, colesterolului ºi
trigliceridelor. O particularitate interesantã o constituie
secreþia de complement specific babuinului de cãtre noul
ficat. Teoretic, aceasta ar constitui un avantaj, deoarece
ar oferi o anume protecþie faþã de rejetul hiperacut
(mediat de sistemul uman al complementului dar nu ºi
de cel de babuin).
Analiza rezultatelor celor douã xenotransplante a
fost fãcutã în cadrul Academiei de Medicinã din New
York de cãtre acelaºi grup de experþi care îºi dãduse
iniþial avizul pentru un numãr de patru xenotransplante.
Concluzia a fost cã datele prezentate permit continuarea
programului de xenotransplant.
Deºi de atunci ºi pânã în prezent nu a mai fost
efectuatã nici o astfel de operaþie la nivel clinic, echipa
de la Pittsburgh este pregãtitã sã reia acest program
atunci când cercetãrile, care au continuat neîntrerupt în
laboratoarele acestui institut, vor produce rezultatele
aºteptate de clinicieni.
Schimbarea cea mai importantã care a avut loc
între timp o reprezintã însã renunþarea la primate ca
sursã de organe (ele au fost preferate iniþal datoritã marii
asemãnãri genetice cu omul) ºi orientarea catre porcul
modificat genetic.
Ca furnizor de organe, porcul exclude total
transmiterea unor agenþi virali extrem de periculoºi
pentru om, de tip SIDA, Ebola, etc., pe care simienii îi
posedã în mod oarecum “natural”.
Porcul este un animal care ajunge la maturitate
(când poate fi socotit bun pentru transplant) în circa 6
luni, are o perioadã de gestaþie de 4 luni, iar o scroafã
produce la o fãtare între 3 ºi 13 purcei.
În anul 1993, Makowka ºi coll.5 la Spitalul Cedar
Sinai din Los Angeles au efectuat un transplant auxiliar
de porc la o femeie tânãrã cu insuficienþã hepaticã
terminalã. Intenþia a fost de “brigde” (“punte”) pentru un
51
transplant cu ficat uman, imediat ce acesta ar fi fost
disponibil. Înainte de transplant s-a efectuat plasma-
fereza ºi perfuzia extracorporealã a rinichilor de porc
pentru a reduce nivelul de anticorpi anti-porcini. Ficatul
transplantat pãrea sã funcþioneze bine iniþial, lucru
probat de producþia de bilã ºi de ameliorarea unor
constante biochimice. Ulterior însã, titrul de anticorpi a
crescut rapid ºi s-au instalat fenomene de rejet
hiperacut, care au condus la decesul bolnavei la 36 de
ore de la operaþie.
Tot în anii ’90 compania americanã Circe
Biomedical a dezvoltat un ficat artificial ataºând la un
aparat de dializã un cartuº ce conþinea hepatocite de
porc încapsulate. În studii de faza I-II au fost observate
ameliorãri clinice (scãderea gradului de encefalopatie) ºi
biochimice la bolnavi cu insuficienþã hepaticã. Nu au fost
observate semne de activitate sinteticã, în mod
particular referitoare la factorii de coagulare.6
Ficatul de porc a mai fost utilizat pentru perfuzie
extracoporealã la bolnavi cu insuficienþã hepaticã acutã,
fie ca “bridge” pentru transplant, fie cu speranþa
recuperãrii ficatului nativ. Cinci bolnavi au fost trataþi cu
aceastã metodã la Universitatea Duke ºi doi bolnavi la
Universitatea Charleston (Carolina de Sud). Au fost
observate ameliorãri tranzitorii ale funcþiei hepatice. În
toate aceste cazuri a fost utilizat ficat de porc normal
(nemodificat genetic).
Prima modificare transgenicã a porcului a fost
realizatã încã în 1985 de cãtre Hammer ºi col.7
Animalele au fost transformate prin fuziune genicã,
devenind purtãtoare ale promoter-ului metaltioninei-l,
legatã de gena structuralã a hormonului de creºtere
uman (hCU). Genele fuzionate au determinat o creºtere
a concentraþiei sanguine a hCU, ceea ce s-a observat ºi
la nivel fenotipic printr-o dezvoltare acceleratã a
purceilor ºi îmbunãtãþirea randamentului de folosire a
hranei.8 În plus, s-a remarcat o întrerupere a ciclului
estrogenic ºi scãderea semnificativã a procentului de
grãsime din carne.
Rezultatul practic imediat a fost interesul
crescãtorilor de porci, care, prin finanþãri ale programelor
de cercetare au dezvoltat ulterior o serie de tematici
pentru producerea de porci transgenici noi. Aceste
programe au determinat în egalã mãsurã dezvoltarea
cunoºtinþelor ºi a metodologiei extrem de sofisticate de
construcþie ºi inserare de transgene în materialul genetic
porcin.
O altã realizare importantã a fost obþinerea de
scroafe transgenice, al cãror lapte produce proteina C,
cu activitate anticoagulantã binecunoscutã ºi respon-
sabilã de o serie de sindroame clinice. Aceastã proteinã
poate ajunge pâna la 1g/L în laptele de scroafã.9
1165
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
Producerea de cãtre suinele transgenice a
hemoglobinei umane funcþionale deschide noi posibilitãþi
de rezolvare a unor hemopatii.10
Perspective imense se deschid, de asemenea, în
producerea de celule “stem” transgenice. Avantajul
constã în transferul nuclear pe un suport citoplasmatic
nou. Himerele celulare astfel obþinute se pot multiplica
“în vitro” reducând enorm timpii de producere a unor
generaþii transgenice ºi implicit perioadele de transfer în
practica terapeuticã.
O altã cale terapeuticã cu implicarea porcului
transgenic ar putea fi transferul unor gene producãtoare
de anticorpi fãrã afectarea sistemului imun umoral
propriu. Producerea în sângele porcului transgenic a
unor anticorpi anti 4-hydroxy-3-nitrofenil acetat11 sau
antifosforilcolinici specifici ºoarecelui,12 demonstreazã
cã este posibil sã perfecþionãm în mod dirijat sistemul de
apãrare imun al organismului uman prin stimularea
producerii de noi anticorpi.
Modificarea geneticã specificã obþinerii unor porci
transgenici cu posibilã utilizare în xenotransplant constã
în suprimarea genei Gal(1-3)Gal, implicatã în sinteza
galactozil-transferazei, care, la rândul ei este un puternic
activator al sistemului complementului. În acest fel se
sperã ca rejetul hiperacut, de tip umoral, mediat de
complement, sã nu se producã.
Un asemenea animal a fost obþinut de cãtre firma
scoþianã de biotehnologii PPL Therapeutics, aceeaºi
care a clonat ºi celebra oaie „Dolly”.
Ficatul unor porci transgenici care exprimã
proteine reglatoare ale sistemului complementului la om
(hCD55 ºi hCD59) a fost utilizat pentru perfuzie
extracorporealã la doi pacienþi. Porcii transgenici au fost
produºi de compania Nextran, iar metoda a fost utilizatã
clinic de cãtre Goran Klintmalm la Dallas (Texas).
Perfuzia extracorporealã a durat 6,5 ºi, respectiv, 10 ore
ºi a fost urmatã de transplant hepatic cu alogrefã
umanã, cu supravieþuirea ambilor pacienþi.13
Foarte recent, ficat de porc transgenic (hDAF) a
fost transplantat la babuin. Cea mai lungã supravieþuire
obþinutã a fost de 8 zile. În acest interval de timp
coagularea ºi echilibrul acido-bazic ale receptorului au
fost menþinute în limite acceptabile, în timp ce albumine-
mia a rãmas scãzutã.14
Toate cercetãrile actuale conduc la ideea cã
porcul este animalul cel mai potrivit pentru
xenotransplant, atât din considerente etice ºi fiziologice
cât ºi datoritã preþului de cost redus.
Totuºi diferenþele imunogenetice enorme între
porc ºi om presupun o reacþie de respingere cu mult mai
puternicã decât în cazul alogrefei umane. Astfel încât,
înainte de continuarea oricãror aplicaþii clinice trebuie
1166
perfect înþelese ºi controlate bazele imunologice ale
rejetului. Cunoºtintele acumulate pânã în prezent permit
o serie de concluzii privitoare la principalele tipuri de
rejet.
2. FERMA DE PORCI „SPECIFIC PATOGEN FREE”
(SPF) – PRIMA CONDIÞIE PENTRU OBÞINEREA DE
ANIMALE TRANSGENICE
Porcul axenic, gnotobiotic ºi specific patogen-free a fost
desemnat ca fiind în prezent singura sursã potenþialã de
organe, pentru xenotransplant.15
O calitate deosebitã a porcului, care permite
obþinerea prin cezarianã a purceilor “germ free”, este
placentaþia cu 6 straturi difuze epiteliocoroidale care
opresc transmiterea agenþilor patogeni de la scroafã la
fetuºi.
Existã urmãtoarele nivele ale statusului microbian
specifice porcului:
1. Axenic (germ-free) pig – menþinut liber de orice
germene cunoscut
2. Gnotobiotic – purtãtor al unei flore microbiene
cunoscute
3. Specific pathogen-free (SPF) – liber de anumiþi
agenþi patogeni cunoscuþi.
Primele 2 categorii de animale nu sunt disponibile
comercial datoritã condiþiilor deosebite în care este
necesar sã fie crescute. Animalele SPF sunt realizate
folosind metodele axenice sau gnotobiotice, pentru ca
ulterior sã fie folosite procedeele de creºtere conven-
þionalã.
Primele operaþiuni constau în efectuarea de ceza-
riene la scroafe pentru a se evita fãtarea naturalã.
Purceii sunt introduºi în incubatoare speciale prevãzute
cu filtrare germicidã.
Urmeazã apoi hrãnirea purceilor cu lapte “germ
free”, supus unei sterilizãri gamma de 4,5 megarazi. Se
are în vedere evitarea contaminãrilor cu micoplasme,
mucegaiuri, ciuperci, protozoare, helminþi ºi, pe cât
posibil, agenþi virali.
Þãrile dezvoltate ºi-au dezvoltat programe proprii
de creºtere a porcilor SPF. Existã o serie de agenþii
guvernamentale ºi private care controleazã fermele de
porci SPF. În SUA cel mai important organism de control
este „National SPF Swine Accrediting Agency”, înfinþatã
încã din anul 1950. Ulterior au fost agreate ºi alte agenþii
guvernamentale (1960), pentru ca în 1964 acestea sã
fuzioneze pentru a se creea National SPF Agency.16
Procesul de acreditare a fermei SPF este relativ
complicat, iar controalele animalelor se efectueazã de
cãtre forul competent la fiecare 90 zile. Controlul
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
Tabelul 1 Sindroamele bolilor interzise în sistemul de creºtere a porcilor SPF (dupã Safron J. si col.17).
exercitat de „National SPF Agency” se efectueazã pe
baza unui indicator de sindroame prezentate în Tabelul 1.
În Europa, cele mai dezvoltate programe SPF au
fost realizate în Danemarca ºi Elveþia. Pentru Europa,
cea mai eficientã agenþie pentru porci SPF este Agenþia
“Dalland”. Un program zonal SPF a fost iniþiat ºi în nord-
estul Franþei.
Se considerã cã în scurt timp se vor produce porci
complet liberi de germeni patogeni pentru om
(Salmonella, Campylobacter ºi Yersinia enterocolitica).
Una din condiþiile esenþiale de întreþinere a
porcilor SPF este aceea de a nu se folosi vaccinãri sau
insecticide.
Însãmânþarea artificialã, transferul embrionar,
cezarienele la scroafe nu pot fi efectuate decât numai în
laboratoarele acreditate de agenþii SPF.
Halele de creºtere a animalelor trebuie sã aibã
sisteme de izolare fonicã ºi microbianã pentru a menþine
populaþia de animale într-o stare de sãnãtate impusã de
normele SPF.
Evaluarea ºi controalele se efectueazã efectiv
prin teste diagnostice ºi nu se limiteazã numai la nivel de
simptome. Se controleazã aparatura de securitate
51
microbianã, mãsurile de “biosecuritate” la nivel de
personal, vizitatori, aparaturã, dezinfectanþi.
Fermele trebuie sã fie izolate fizic (recomandabil
30 km) de alte ferme porcine, cu surse de apã, hranã ºi
alte utilitãþi prevãzute cu mãsuri de protecþie. Mijloacele
de transport intern se dezinfecteazã iar circulaþia se
limiteazã pe anumite sectoare.
Este interzisã pãtrunderea ºi existenþa în fermã a
pãsãrilor, insectelor sau rozãtoarelor.
Aplicaþiile imediate ale porcilor SPF se regãsesc
în douã din recomandãrile Asociaþiei internaþionale “Islet
Foundation” (Tabelul 2).
Pentru studii medicale ale unor maladii acute sau
subacute, se recomandã porcul miniatural SPF (cu
greutãþI de pânã la 35 kg). Pentru modelele de boli
cronice se folosesc porcii de carne normali (pânã la 100
kg), cu vârsta de aproximativ 6 luni. Cercetãtorii preferã
de obicei rasele de porci albi pentru accesul mai uºor la
vena auricularã.
Diferenþele de folosire a xenogrefelor celulare sau
de organe vascularizate, sunt prezentate în Tabelul 3.
Datoritã calitãþilor pe care le au ºi în principal prin
lipsa agenþilor patogeni, mulþi dintre porcii SPF sunt
1167
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM

Tabelul 2 Riscurile transplantului xenogeneic de organe obþinute de la animale SPF

Diabet Alterare funcþie renalã Alterare funcþie cardiacã

Organul transplantat Insule pancreatice Rinichi Inimã
Animalul donor Porc SPF Porc SPF Babuin SPF
Imunosupresia Absentã Sistemicã (toatã viaþa) Sistemicã (toatã viaþa)
Rejectarea grefei Revenirea la injecþii cu insulinã Dializã Moarte
Sursa: The Islet Foundation
Tabelul 3 Diferenþe în folosirea xenogrefelor celulare ºi de organ

folosiþi nu numai în cercetãrile medicale dar ºi pentru
refacerea ºeptelelor ºi repopularea fermelor de porcine
dupã epizotii.
3. METODOLOGIA OBÞINERII ANIMALELOR
TRANSGENICE
Pentru a reuºi efectuarea unui xenotransplant porc-om
existã toretic urmãtoarele cãi:
• Introducerea în genomul de porc a unor gene
specific umane care sã împiedice rejetul
hiperacut, care distruge organul transplantat în
perioade de minute sau ore dupã implantare;
• Eliminarea sau neutralizarea genelor porcine care
determinã sinteza unor proteine cu valoare de
antigen anti-om;
• Identificarea factorilor ce determinã rejetul
vascular hiperacut sau acut.
În literaturã nu se poate gãsi o descriere amãnunþi-
tã a procedurilor tehnice de obþinere a porcului transgenic
cu caractere imunologice umane deoarece porcul trans-
genic, ca furnizor de organe ºi bioreactor viu cu posibilitãþi
de replicare, reprezintã, pentru firmele de profil, una din
cele mai mari afaceri ale biotehnologiei moderne.
Pentru o înþelegere mai profundã a tehnicilor care
stau la baza obþinerii porcului transgenic vom apela la
experienþele efectuate în acest domeniu pe ºoarece,
care sunt prezentate mult mai complet în literatura de
specialitate.18,19
ªoarecele reprezintã unul dintre primele animale
evoluate care au fost transformate transgenic.20,21 De
fapt, aceste cercetãri au deschis posibilitãþile de transfer
a metodologiei ºi la animalele de fermã.
Tehnicile pentru transfer genetic cuprind una din
urmãtoarele metode:
• microinjecþii de ADN;
• transfer mediat de cãtre retrovirusuri;
• transfer mediat de cãtre celulele “stem”
embrionare (ES);
Condiþiile de reuºitã a transferului depind de:
• modalitatea tehnicã de prelucrare a ADN sau se-
parare a genelor;
• mecanismele de integrare în genomul gazdã;
• caracteristicile de exprimare a genelor transferate.

1168
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
3.1. Microinjecþia de ADN
Microinjecþia de ADN la mamifere a fost realizatã ºi
perfecþionatã de Gordon ºi colab.20-22 Prin aceastã
metodã se microinjecteazã o anumitã cantitate de ADN
în nucleul unui ovul fecundat obþinut de la o femelã
superovulatã. Femelele superovulate se obþin prin câte
3 injectãri succesive pe sãptãmânã cu hormoni ce
declanºeazã ºi menþin ovulaþii. Injectãrile se efectueazã
consecutiv timp de 48 de sãptãmâni.
Ovulul purtãtor de gene este ulterior implantat în
uterul unei femele pregãtite pentru gestaþie (Fig.1)
Unul din avantajele acestei metode este simpli-
tatea ºi posibilitatea de aplicare la un numãr mare de
specii de mamifere la care este posibilã vizualizarea
pronucleilor.7
Eficienþa acestui gen de transfer genetic se
situeazã la aproximativ 30% din animalele nãscute vii ºi
poate depãºi chiar 90%, în cazul în care se foloseºte
plasmida pBR322, supusã în prealabil digestiei cu PstI.
Embrionii pot muri în diferite perioade de dezvol-
tare dacã gena inseratã poartã un mesaj patologic letal,
de exemplu o oncogenã.
Trebuie semnalat faptul cã în cursul integrãrii,
genele suferã o rearanjare a secvenþelor în genomul
gazdã, deºi locul de inserare este aleatoriu. Acest fapt
determinã uneori disfuncþionalitatea genicã a gazdei prin
întreruperea secvenþelor de plasare a acestora. Apar
aºa-numitele “mutaþii inserþionale”, care pot avea uneori
manifestãri patologice.23,24
Deplina exprimare a genelor inserate poate fi
influenþatã de diverºi factori. S-a demonstrat cã
secvenþele procariotice de transfer (bacteriofagi sau
plasmide) inhibã exprimarea transgenelor.
Fig.1 Transfer de gene prin injectãri de ADN în nucleul
ovulului fecundat.
51
Fig.2 Transfer de gene mediat prin retrovirusuri.
3.2. Transferul genic prin retrovirusuri
Încã din anul 1976 Jaenish ºi col.25 au demonstrat cã
retrovirusurile pot infecta celulele embrionare ºi pot
include copii de ADN proviral în genomul lor format din
ARN (Fig.2). Metoda este relativ simplã ºi constã din
expunerea zonelor embrionare “free” la un mediu ce
conþine particule virale de retrovirus recombinat.
Metoda are avantajul cã produce relativ puþine
rupturi ale materialului genetic gazdã, uneori oferind
posibilitatea integrãrii chiar al unei singure gene.
Aceste tehnici nu sunt folosite în mod curent,
deoarece prezintã dezavantajul de a nu permite
inserarea mai multor secvenþe de gene, în special
datoritã limitãrii impuse de genomul viral (9 kd). Nu
trebuie ignorat nici pericolul pe care particulele virale le
reprezintã pentru animalul gazdã sau personalul care le
manevreazã.
3.3. Transfer genic prin celule “stem” embrionare
Transferul prin celulele embrionare “stem” reprezintã
metoda cea mai dificilã dar ºi cu eficienþa cea mai
ridicatã. S-a constatat cã celulele embrionare “stem”
(ES) derivã din inelul blastocistic embrionar. Transfor-
marea geneticã a acestora poate fi conservatã prin
cultivare ºi injectarea ulterioarã în cavitatea blastocisticã
a unui alt embrion. Datoritã caracterului lor pluripotent,
celulele “stem” pot dezvolta ulterior toate categoriile de
organe, þesuturi sau celule, inclusiv germinale.26,27 Aici,
noile celule îºi desfãºoarã programul genetic creat.
Organul astfel transformat are caracter de himerã,
conþinând ºi celulele gazdei cu genom netransformat.
Atenþia se îndreaptã în prezent asupra producerii de
1169
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
Fig.3 Transfer genic mediat prin celule “STEM” embrionare.
celule germinale transformate ºi folosirea acestora în
reproduceri ulterioare ale organismului transgenic (Fig. 3).
Deletarea unei anumite funcþii genetice prin
controlul genetic al proceselor de dezvoltare embrionarã
poate oferi posibilitatea studierii implicãrii acestora în
maladiile congenitale. De exemplu, dacã protooncogena
c-myb este deletatã, fetusul modificat genetic este
incapabil sã transfere mecanismul eritropoezei cãtre
ficat iar fetusul moare datoritã anemiei.28
Un alt exemplu este gena retinoblastomului (Rb),
care produce la om forma cunoscutã de tumorã, pe când
la ºoarece produce o tumorã a glandei pituitare.29
Aceastã diferenþã, ca ºi altele înregistrate pe parcursul
cercetãrilor în domeniu, au demonstrat cã animalele nu
reprezintã o sursã demnã de încredere atunci când se
efectueazã anumite studii genetice.
4. CLONAREA PORCULUI TRANSGENIC
Din anul 1995, când a fost obþinut primul animal clonat
prin transfer nuclear dintr-o populaþie de celule cultivate,
au existat o serie de numeroase alte reuºite pentru
diverse specii de animale, cum ar fi; ovine,30,31 taurine,32
ºoareci de experienþã33 ºi caprine.34
Tehnica folositã a fost asemãnãtoare în toate
aceste cazuri ºi constã în transferul unui nucleu diploid
într-un ovocit enucleat ºi activat în stadiul MII sau dupã
transfer. Dupã aceastã operaþiune embrionii sunt
cultivaþi ºi selecþionaþi, pentru a fi transferaþi la femelele
receptoare, care duc gestaþia pânã la fãtare.
Dintre toate speciile la care s-a practicat clonarea,
porcul este cel la care s-au obþinut rezultatele cele mai
puþin încurajatoare.35 Modificarea relativ recentã a
metodologiei de transfer a nucleelor de cãtre Polejaeva
ºi col.36 a determinat o creºtere importantã a reuºitelor.
1170
Este de semnalat faptul cã fiecare laborator folo-
seºte o anumitã tehnicã de transfer, iar factorii ambi-
entali în care se desfãºoarã operaþiunile sunt diferiþi. În
plus, la porc, faþã de alte specii, calitatea embrionilor
trebuie sã fie excelentã.
S-a mai sugerat transferul de coparteneri
embrionari normali pentru a menþine gestaþiile la
parametrii funcþionali normali, precum ºi asocierea cu
tratamentul hormonal al scroafelor.
Etapele asupra cãrora trebuie sã se concentreze
atenþia sunt :
• activarea
• alegerea donatorului
• cultivarea embrionilor
• injectarea
• menþinerea gestaþiei
La toate speciile la care se folosesc ovocite MII ca
receptori trebuie acordatã o mare atenþie activãrii. La
porc, operaþiunea de activare constã în formarea
pronucleilor, clivaj ºi dezvoltarea pânã la stadiul de
blastocist.
Se poate afirma cã, în prezent, nu existã o
metodologie adecvatã care sã controleze în totalitate
operaþiunea de clonare, indiferent de specie. Existã o
influenþã notabilã a proceselor oxidative care au un
caracter destructiv, cu implicãri în metabolismul celular,
instabilitate genomicã ºi patologie cromozomialã. Se fac
eforturi foarte mari pentru stãpânirea acestor procese în
cursul operaþiunilor de izolare ºi cultivare.
Folosirea celulelor de granuloasã de cãtre
Polejaeva ºi col.36 prin modificarea metodei folositã în
mod uzual37 pare sã fi rezolvat o serie de impedimente
ridicate de clonarea porcului (Fig.4).
Un avantaj major al clonãrii la porc este cã
embrionii reconstruiþi cu nuclei proveniþi din celule
somatice se pot dezvolta în condiþii optime în stadiile de
preimplantare, folosirea celulelor somatice fiind extrem
de valoroasã în manipulãrile genetice la porcul
transgenic.38
O altã cale pentru folosirea embrionilor transgenici
clonaþi este posibilitatea de implantare directã a þesuturi-
lor embrionare la pacienþi cu maladii neurodegenerative.
Celulele nervoase supravieþuiesc, creeazã sau primesc
sinapse ºi nu prezintã un fenomen semnificativ de rejet.39
Rejetul, în aceastã situaþie, pare a fi condiþionat de
reacþia celulelor T împreunã cu sistemul complementului
ºi cu mediatorii imuni.
Cât de extinse ºi cât de implicate sunt procesele
de rejet în grefele xenogenice de þesut, rãmâne un
domeniu încã de elucidat.
Aceste cercetãri devin cu atât mai importante cu
cât majoritatea guvernelor interzic clonarea umanã, deci
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI 51

Fig.4 Prezentarea procedeului de transfer dublu nuclear pentru clonarea porcilor folosind celule de granuloasã cultivate ca
donatoare de nuclei (dupã Irine A. Polajaeva ºi col.33).

1171
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
ºi folosirea embrionilor în scop terapeutic.
În primele stadii celulele donatoare fuzioneazã cu
ovocite enucleate MII obþinute de la scroafe super-
ovulate.
Pseudo-pronucleele formate dupã primul transfer
nuclear embrionar, se transplanteazã ulterior într-un
zigot enucleat (al doilea transfer nuclear embrionar).
Cel de al doilea embrion cu transfer nuclear se
insemineazã în oviductul unei scroafe la douã ore dupã
fuzionare. Deoarece numãrul aºteptat de reuºite este
relativ mic, se recomandã transferul a aproximativ 100
embrioni reconstruiþi la o singurã scroafã. Aceasta este
stimulatã cu gonadotrofinã sericã (PMSG) de iapã ºi
gonadotrofinã corionicã umanã (hCG) pentru a se
menþine gestaþia. Prin respectarea acestor condiþii,
aproximativ 4 embrioni din 100 sunt viabili.
Coordonarea replicãrii ADN cu transformãrile
citoplasmatice asociate acestui stadiu este o condiþie
esenþialã pentru menþinerea viabilitãþii ºi a dezvoltãrii
ulterioare a embrionului.
5. PATOLOGIA PORCILOR TRANSGENICI
Patologia porcilor transgenici reprezintã o problemã
capitalã a xenotransplantului de organe. Infecþiile virale
la porc sunt considerate cele mai periculoase pentru om,
deoarce nu se cunosc cu exactitate modalitãþile de
activare ºi transmitere a unor agenþi virali aparent
inofensivi la porc, dar potenþial patogeni pentru om.
Prima problemã care a apãrut ºi pentru care au
fost cheltuite fonduri uriaºe de cercetare, a fost virusul
endogen porcin “porcine endogenous virus” (PERV).
Primul “semnal de alarmã” a fost cã acest virus
infecteazã “in vitro” o linie celularã umanã. Introducerea
lui sub formã purificatã la animale la care unele linii
celulare se infecteazã cu PERV nu a detrminat
producerea de anticorpi. Acelaºi rezultat l-a avut ºi
introducerea la animale a celulelor din liniile infectate.40
Existã, de asemenea, posibilitatea ca unii agenþi
patogeni virali, cum ar fi virusul hepatitei E (HEV) sã
treacã de la porc la om ºi invers.41 Astfel, porcii infectaþi
cu HEV pot fi asimptomatici pentru hepatitã, dar pot sã
prezinte viremie, anticorpi anti HEV ºi particule virale în
produºii de excreþie.
Porcii SPF („specific patogen free”) infectaþi cu
HEV porcin sunt anti-HEV pozitivi cu prezenþa
particulelor virale în fecale, ser ºi mucus dar clinic nu
manifestã boala.42 Injectarea porcilor SPF cu HEV
uman, dar din genotip Afro-asiatic sau Mexican, nu
produce îmbolnãvire,42 în timp ce injectarea cu HEV
izolat din SUA declanºeazã boala. Confirmarea a venit
1172
ulterior prin aceea cã virusul izolat de la porcii bolnavi s-
a dovedit a fi o tulpinã SUA.42
În etapa urmãtoare, virusul suin HEV, tulpina
SUA, a fost injectat la primate din specia rhesus ºi a avut
ca rezultat seroconversia, viremie ºi eliminarea prin
fecale. Deºi hepatita nu s-a manifestat evident, s-au
înregistrat totuºi unele creºteri ale activitãþii enzimelor
hepatice.
Injectarea viruºilor din tulpina SUA la
cimpanzeu,42 deºi a produs seroconversie ºi eliminare
prin fecale, nu a determinat viremie ºi nici semne de
îmbolnãvire. Faptul cã primatele non-umanoide pot sã
fie infectate cu HEV suin, sugereazã faptul cã oamenii,
la rândul lor, pot fi infectaþi cu HEV porcin.
Un program de cercetare desfãºurat în Taiwan a
demonstrat cã 37% din efectivele porcine din þara
respectivã erau pozitive la anti-HEV IgG.43
Prezenþa unui anticorp anti-HEV IgG la porci în
diferite þãri de pe glob poate indica faptul cã populaþia
porcinã din acea zonã constituie un rezervor probabil de
particule virale HEV.
În consecinþã, se pune, cu multã seriozitate,
problema ecologicã a contaminãrii apelor de suprafaþã
cu produse de dejecþie provenite de la fermele de porci.
Globalizarea ºi exportul necontrolat de carne sau
produse din carne de porc pot de asemenea sã
contribuie la rãspândirea în lume a virusului hepatitei E.
6. REACÞIA NATURALÃ ANTIGEN-ANTICORP A
XENOGREFELOR
Se admite cã existã o gamã diversã de anticorpi naturali
serici capabili sã recunoascã antigenele xenogeneice,
care diferã, la rândul lor, de la o specie la alta ºi uneori
chiar de la individ la individ.
Preocupãri recente demonstreazã cã anticorpii
umani xenoreactivi recunosc în principal un antigen
glucidic, Gal(1-3)αGal. De menþionat cã acest antigen
lipseºte la oameni, maimuþe sau babuini.
S-a demonstrat cã anticorpii anti Gal(1-3)αGal pot
fi eluaþi din organele porcilor prin perfuzare cu plasmã
sanguinã umanã. De asemenea, este posibilã o
degradare enzimaticã a acestora cu a-galactozã, care
are ca rezultat ºi o degajare a acestora de pe suprafaþa
celulelor din organele de porc. Se pare cã afinitatea
anticorpilor naturali faþã de Gal(1-3)αGal este relativ
micã iar structura de suprafaþã a celulelor nu este
suficientã pentru fixarea eficientã a complementului la
anticorpii xenoreactivi.44-46 Afinitatea IgM pentru
Gal(1-3)αGal este mai mare de 7 ori decât pentru alte
glicoproteine de suprafaþã.
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
Identificarea ºi clonarea genei responsabile de
sinteza Gal(1-3)αGal47 a deschis posibilitatea producerii
primului porc transgenic de cãtre TTL Therapeutics.
Variabilitatea individualã a porcilor pentru
exprimarea antigenelor naturale este deja cunoscutã ºi
studiatã.46 Aceasta este de 10 ori mai mare la unii
indivizi. Se recomandã deci o selectare prealabilã a
porcilor donatori de organe.
7. ACTIVAREA COMPLEMENTULUI
Pe baza a numeroase studii s-a constatat cã inhibarea
sau eliminarea complementului determinã o acceptare a
xenogrefelor.48-51 Majoritatea cercetãrilor au folosit venin
de cobrã, care distruge o mare parte din componentele
complementului din sânge, prin activarea cãii alternative
pe care o poate urma cascada complementului.
Relativ recent a fost descoperit un nou agent
solubil CR1 cu implicaþii asupra componentelor
complementului. Acest factor altereazã convertazele
active ale complementului ºi serveºte drept cofactor
pentru clivarea proteoliticã a acestor convertaze.52
Folosirea veninului de cobrã sau a factorului CR1
face posibilã depãºirea fenomenului de rejet hiperacut
vascular („hyperacute rejection” – HAR) dar nu exclude
rejetul acut („acute rejection” – AR).
O altã cale folositã în prevenirea rejetului este
administrarea de IgG uman purificat care funcþioneazã
ca acceptor pentru proteinele activate ale complemen-
tului, prin direcþionarea complexelor enzimatic-active în
alte zone decât endoteliul vascular al xenogrefei.
8. PROTEINELE REGLATOARE ALE COMPLEMEN-
TULUI
Conceptul activãrii heterologe a complementului a fost
propus pentru prima oarã de Dalmasso.53,54
Primele cercetãri au fost direcþionate în sensul
gãsirii unor posibilitãþi de a introduce proteinele umane
reglatoare de complement în organismele animalelor
donatoare, urmãrindu-se, prin aceasta, ameliorarea
efectelor activãrii complementului. O atenþie deosebitã a
fost acordatã ºi operaþiunilor de producere de
transgenici pentru genele umane reglatoare de
complement.
Cary ºi col.55 au produs ºoareci ºi ulterior porci
transgenici care exprimã genele ce controleazã “decay
accelerating factor” (DAF), controlând promotorul
acestuia.
Au fost creaþi ºi porci transgenici pentru expri-
51
marea unor combinaþii de CD59, “decay accelerating
factor” (DAF) ºi cofactorul proteic, prin controlul
diverºilor promotori.56-58
Efectuarea de cãtre Mc Curry59 a unor transplante
de la porci transgenici exprimând gena umanã CD59 ºi
DAF la babuini a demonstrat cã se poate evita rejetul
hiperacut, cu prelungirea timpului de acceptare a
xenogrefei. Analizele histologice au arãtat cã organele
nu prezentau leziuni extinse.
9. REJETUL HIPERACUT
Rejetul hiperacut („hyperacute rejection” – HAR) este
fenomenul cel mai dramatic cu care se confruntã
transplantul de organe, între animale îndepãrtate din
punct de vedere filogenetic. Xenogrefele sunt supuse
unui rejet rapid ºi violent, care stopeazã funcþiile
fiziologice ale organului pe parcursul a câtorva minute
sau ore.60-62
Imunopatologia rejetului organului demonstreazã
în mod invariabil prezenþa proteinelor complementului,
care altereazã puternic celulele epiteliului vascular,
determinând pierderea din acestea a heparan sulfatului.
Se produc astfel numeroase fisuri intercelulare ºi chiar
lize ale membranelor,63 cu dispariþia funcþiei antitrom-
botice pe care epiteliul vascular o are în mod normal.62
Importanþa acestui mecanism este demonstratã
de faptul cã grefele cardiace de la porc la babuinii nou
nãscuþi nu sunt rejetate, tocmai din cauza nivelului
scãzut de anticorpi, chiar dacã activitatea
complementului este intactã.
Mecanismul de activare al complementului este
declanºat probabil de lipsa factorului H plasmatic la
organismul receptor, care controleazã în mod normal
producerea pe suprafaþa celulelor xenogeneice a
enzimei C3bBb, care cliveazã C3. Din fericire, factorul H
la om pare sã controleze eficient activarea enzimelor de
suprafaþã celularã la porc ºi bovine.64
Un alt mecanism care împiedicã acceptarea
xenogrefelor, în special a celor dependente de
complement, este acela al proteinelor reglatoare –
“decay accelerating factor” (DAF) ºi CD59. Aceste
proteine, care sunt prezente la nivelul membranelor
celulare de mamifer, protejeazã aceste celule de lizã în
timpul activãrii complementului. De exemplu, dacã
complementul este activat pe suprafaþa unui
microorganism, se previne producerea unor compuºi
solubili care atacã membrana celulelor epiteliale
vasculare.
DAF ºi cofactorul proteic membranar inhibã
formarea ºi integritatea convertazei C3, un complex de
1173
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
Fig.5 Rejetul vascular hiperacut al grefelor de organ; DAF = “decay accelerating factor”.
enzime pivot strict necesare în activarea complemen-
tului. CD59 ºi factorul de restricþie omolog inhibã
proprietãþile litice ale C8 ºi C9.
Câteva proteine reglatoare de complement
controleazã activarea mult mai eficient decât
complementul heterolog.
Unul dintre mecanismele devastatatoare ale
rejetului de organ este liza celulelor endoteliale de cãtre
complexele C5b6789n numite ºi “complexe de atac
membranar”.
Am menþionat cã ºi alte componente ale
complementului, ce nu sunt implicate direct în liza
celulelor epiteliate, pot avea un rol important în rejetul
xenogrefelor. C5a împreunã cu heparan sulfatul, un acid
polizaharidic, pot proteja membrana celulei endoteliale
ºi preveni rejetul. Complexele C5667 pot fi implicate în
formarea fisurilor intercelulare.63
Formarea produsului proteolitic iC3b, cores-
punzãtor lui C3 pe suprafaþa celulei endoteliale,
stimuleazã aderarea neutrofilelor.65
Descoperirea de cãtre Duke ºi col. în 1995 a douã
gene umane – “decay accelerating factor” (DAF) ºi
CD59, care codificã proteine cu rol determinant în
funcþionalitatea mecanismelor imune la om, a constituit
primul pas spre obþinerea de organe pregãtite genetic
pentru xenotransplant. Aceste proteine rup cascada
normalã a complementului în mecanismele de rejet ºi ar
putea astfel accepta celulele de porc transgenic.
În aceste condiþii intervalul de apariþie al rejetului
în xenotransplantul de cord de la porc la babuin a putut
fi prelungit pânã la 30 ore, faþã de câteva minute cât
dureazã rejetul inimii de porc nemodificat genetic.
La xenogrefele de organe provenite de la porc
1174
HAR este consecinþa acþiunii anticorpilor naturali ai
gazdei care se leagã specific de o structurã glucidicã
Gal(1-3)αGal specificã membranei celulelor endoteliale
de porc. Acest fapt are drept consecinþã activarea
complementului ºi rejetul rapid al grefei.
Liza celulelor endoteliale din organul transplantat
de cãtre factorii imuni circulanþi din sângele omului,
determinã declanºarea proceselor de coagulare,
formarea microtrombusurilor cu blocarea capilarelor
sanguine.
Atacul complementului este dat de activarea
mediatã a anticorpului de cãtre cascada comple-
mentului. Aceasta se realizeazã prin anticorpii umani
anti-porc, care se direcþioneazã asupra epitopului
Gal(1-3)αGal endotelial porcin. Din punct de federe
fiziologic acest fenomen este supus unui reglaj negativ,
printr-un set de proteine cunoscute ca specifice de
specie ºi reglatoare ale activãrii complementului (RCA).
Acestea sunt “decay accelerating factor” (DAF), proteina
cofactor de membranã (MCP) ºi CD59.
Rezultatul imediat al funcþionãrii acestor
mecanisme este crearea complexului de atac al
membranei endoteliale (MAC), formarea trombusului,
obstruarea vaselor ºi rejetul acut al organului (Fig.5).
10. REJETUL VASCULAR ACUT
Platt62 a fost primul care a descoperit acest fenomen la
grefele alogene om-om. El considerã cã rejetul vascular
acut („acute rejection” – AR) are un caracter determinant
în reuºita transplantului de organ ºi numai înþelegerea
mecanismelor prin care acþioneazã va oferi posibilitatea
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
de a transforma xenogrefa în realitate.
Se poate considera cã, dacã un receptor de
xenogrefã este depletat de anticorpii naturali sau
complement, rejetul hiperacut nu mai poate avea loc.
Dar aceasta nu exclude un rejet vascular lent, numit
rejet acut.49
Rejetul vascular acut se întâlneºte atât în cazul
alogrefelor cât ºi al xenogrefelor “concordante” ºi se
caracterizeazã prin balonarea celulelor endoteliale,
depozitarea excesivã de fibrinã, edemaþieri focalizate
precum ºi hemoragii asemãnãtoare HAR.
Se pare cã mecanismul AR se cantoneazã la
nivelul modificãrii unor funcþii ale celulelor endoteliale,
inclusiv producerea unor citokine inflamatorii sau
exprimarea unor molecule de adeziune celularã, cu
transformarea suprafeþelor celulare din anticoagulante
în procoagulante.62
În final apar microtrombusuri ºi infiltrãri de
leucocite, caracteristice acestui tip de rejet.
Au existat o serie de încercãri de stopare a
fenomenului, prin intervenþii la nivelul inhibitorilor
plachetari sau folosind anticorpi anti-molecule implicate
în aderenþa plachetarã.
11. MECANISMELE CELULARE IMUNE ALE
REJETULUI XENOGREFELOR
Studiile au început de la observaþia cã rejetul hiperacut
(HAR) este însoþit de o afluenþã limfocitarã din sâgele
primitorului.66
În prezent, se încearcã chiar ca o ultimã soluþie a
xenotransplantului de organ inducerea unei toleranþe
celulare T ºi B la primitori, prin producerea unui
himerism celular hematopoetic.
Una dintre complicaþiile ce apar în aceste situaþii
este microangiopatia tromboticã, asemãnãtoare
purpurei trombocitopenice.67
Forbes ºi col.68 au arãtat cã depleþia de neutrofile
nu are nici o influenþã asupra HAR.
Câteva experimente au sugerat cã celulele killer
se acumuleazã la nivelul grefei ºi s-ar putea sã aibã rol
în HAR.69
Implicarea celulelor T în rejetul xenogrefelor a fost
analizatã de unii autori.70
Rãspunsul celular imun diferã de la xenogrefã la
alogrefã. Una din diferenþele importante se referã la
activarea celulelor T; numãrul acestor celule care sunt
capabile sã recunoascã celulele xenogrefei este mult
mai mic.71
În plus, citochinele ºi moleculele responsabile de
adeziunea celularã, sintetizate de donator pot fi
51
ineficiente faþã de limfocitele T ale primitorului.
Este deci dovedit cã existã o reacþie celularã
imunã anti xenogrefã, dar este încã dificil de apreciat cât
de importantã este aceasta în spectrul general al
rejetului.
Experienþe pe porcii miniaturali72 au demonstrat
cã ºi în cazul rejeturilor cronice de alogrefe cardiace
(prin vasculopatii), este implicat în principal un proces de
recunoaºtere imunã celularã T. Animalele imunizate cu
antigene de tip leucocitar (alopeptide din clasa I)
prezintã “in vitro” un rãspuns proliferativ, iar “in vivo”
raspunsuri imune de tip întârziat. Aceste animale
suportã grefele ca ºi animalele neimunizate la care s-a
administrat ciclosporinã.
12. CREªTEREA COMPATIBILITÃÞII ORGANELOR
DE PORC CU CELE DE OM
Existã o serie de molecule glucidice care migreazã din
interiorul celulelor cãtre membranã ºi care determinã
recunoaºterea celulelor de porc de cãtre sistemul imun
uman. Aceste molecule sunt comune multor specii de
mamifere, cu excepþia primatelor ºi omului. Ele atrag
anticorpii circulanþi din sângele omului, având valoare de
“non self”.
Existã o cale de creºtere a compatibilitãþii
organelor de porc cu cele de om, cunoscutã sub
termenul generic de acomodare.
Acest fenomen se întâlneºte în unele cazuri când
se depãºeºte faza de HAR ºi se înregistreazã o depleþie
a anticorpilor xenoreactivi ai receptorilor. În aceastã
situaþie manipularea complementului poate determina
creºterea semnificativã a timpilor de supravieþuire a
grefei chiar dacã ulterior complementul ºi xenoanticorpii
se refac.54
Aceastã “acomodare” apare ca un fenomen
histologic normal; ea poate cuprinde imunoglobulinele
receptorului, dar nu evidenþiazã o activare a
complementului sau fenomene de trombozã.
Fenomenul de acomodare a fost observat pentru
prima oarã la transplantul de rinichi de la donatori cu
grupele sanguine A sau B, la primitori ce aveau anticorpi
anti aceste grupe.73,74 Depleþia temporarã a anticorpilor
anti-A ºi anti-B de la primitor determinã tolerarea grefei
chiar dacã titrul anticorpilor la primitor revine la normal.
Acomodarea a fost observatã ºi în unele cazuri de
xenogrefe experimentale porc - babuin, la care s-a
folosit plasmaferezã ºi terapie imunosupresoare.75
Trebuie recunoscut cã mecanismul acomodãrii nu a fost
elucidat pânã în prezent.
1175
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
13. STANDARDIZAREA NOMENCLATURII PENTRU
ANIMALELE TRANSGENICE
Standardizarea a fost realizatã de Comitetul pentru
Nomenclaura Transgenicã (Committee on Transgenic
Nomenclature, Institute of Laboratory Animal
Resources, Commission on Life Sciences of National
Research Council - SUA). Acest comitet îºi defineºte
misiunea prin a promova o cercetare eticã asupra
animalelor, o identificare validã ºi pertinentã a surselor
de animale de experienþã valoroase, în scopul aplicãrii
rapide ºi eficiente a tehnologiilor moleculare denumite ºi
tehnologii transgenice.
Dezvoltarea rapidã a unor linii de animale
transgenice a avut ca rezultat ºi apariþia unor deficienþe,
dupã cum urmeazã:
• Nu existã o standardizare a denumirii ºi implicit
a identificãrii animalelor transgenice;
• Nu existã norme privind creºterea, înmulþirea ºi
manipularea acestora;
• Nu existã strategia necesarã pãstrãrii ºi
menþinerii în patrimoniu stiinþific a animalelor
valoroase.
În ultimã instanþã se urmãreºte editarea ºi actuali-
zarea continuã a unui catalog care sã cuprindã sursele
de animale transgenice. Elaborarea acestui catalog se
va realiza de cãtre specialiºti cu experienþã în domeniul
producerii de animale transgenice, precum ºi de consul-
tanþi care sã ajute la crearea unei baze de date
internaþionale.
În prezent se presupune cã existã aproximativ
10.000 de linii transgenice, din care numai o parte sunt
valoroase. Existã pericolul iminent ca, din lipsã de
fonduri, unele laboratoare sã nu conserve tocmai acele
linii transgenice care ar putea servi în viitor la studii mai
aprofundate în anumite domenii ale geneticii moleculare.
Pornind de la acest deziderat, laboratoarele „Oak
Ridge National”, din Oak Ridge, Tennessee, au creat
prima bazã de date a animalor transgenice “Transgenic
Animal Data Base” (TADB). Pentru ca aceastã bazã de
date sã devinã eficientã ºi sã poatã fi dezvoltatã s-a
acceptat urmãtoarea nomenclaturã:
1. Se defineºte ca animal transgenic orice
organism în care a fost introdus material
genetic strãin în mod experimental la nivelul
celulelor seminale;
2. Noul material genetic nu este necesar sã fie
activ dar se presupune cã va fi moºtenit la
descendenþi;
3. Animalele la care materialul genetic a fost
inserat în celule somatice nu sunt considerate
transgenice;
1176
4. Excepþie de la regula 3 fac animalele la care
materialul genetic a fost inserat în celule stem
embrionare, deoarece acestea potenþial se pot
transmite în genomul descendenþilor;
5. Nomenclatura transgenicilor trebuie sã includã
metodele folosite ºi diversitatea genelor
introduse prin manipulãri moleculare;
6. Trebuie sã fie suficient de concisã pentru a fi
recunoscutã ºi memoratã uºor, un exemplu în
acest sens constituindu-l nomenclatura
standardizatã elaboratã de Lyon pentru
ºoarece.76
Pentru definirea transgenelor au fost emise o
serie de norme. Transgena se defineºte prin urmãtoa-
rele semne convenþionale:
SIMBOLUL – format din trei pãrþi, toate cu
caractere latine, dupã cum urmeazã:
TgX(YYYYYY)#####Zzz
Unde:
TgX = metoda de inserare;
(YYYYYY) = desemnarea segmentului inserat;
##### = numãrul asignat laboratorului;
Zzz = codul laboratorului.
La metoda de inserare Tg este abrevierea de la
transgenic. X poate fi:
• R pentru inserþie cu infecþie retroviralã;
• H recombinare omologã;
• N prin microinjecþie sau microporare.
Desemnarea genelor inserate se poate face prin
majuscule sau mixt, de preferat notaþiile standard ale
genei respective. Nu se admit sublinieri, liniuþe,
caractere italice etc.
Desemnarea genelor, plus numãrul asignat
laboratorului, nu trebuie sã depãºeascã 11 caractere.
Se folosesc abrevieri ca în exemplele de mai jos:
An (anonymous sequence)
Ge (genomic clone)
Im (insertional mutation)
Nc (noncoding sequence)
Rp (reporter sequence)
Sn (synthetic sequence)
Et (enhancer trap construct)
Pt (promoter trap construct).
Aceastã listã poate fi extinsã în funcþie de
necesitãþi. Pentru o înþelegere a codificãrii vom da
câteva exemple:
C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg
• clonã umanã genomicã CD8 (Ge)
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
• inseratã în ºoarece C57BL/6 la Jackson
Laboratory (J);
• la cel de-al 23-lea ºoarece analizat dupã o
serie de microinjecþii efectuate la laboratoarele Jon W.
Gordon (Jwg).
Crl:ICR-TgN(SVDhfr)432Jwg
• inserare via SV40 a promotorului pentru
dihydrofolat reductazã de ºoarece gena (Dhfr) gene
• plasmidã de 4 kilobase
• al 32-lea animal realizat în laboratoarele Jon W.
Gordon (Jwg)
• outbredul pentru acest ºoarece a fost obþinut
de Laboratoarele Charles River (Crl).
Se pot folosi ºi abrevieri prim omisiunea inserþiei
ca în exemplu:
TgN(GPDHIm)lBir poate fi abreviat TgN1Bir.
Mutaþiile inserþionale ºi fenotipurile observabile se
pot delimita în funcþie de procedura folositã. De
exemplu:
hoTgN447Jwg = Inserarea unei transgene in
locusul hotfoot (ho).
xxxTgN21Jwg = Inserarea unei transgene care
determinã o mutaþie recesivã pentru o genã necunos-
cutã. Simbolul genei xxx se poate obþine din baza de
date a genelor.
Pentru înregistrarea unui laborator în baza de
date sunt necesare urmãtoarele informaþii:
BRS – Assigned Accession Number
DESG – Designation (Standardized Nomenclature) of
Transgenic Line
METH – Method Used
DNA – DNA Fragment Introduced
COPY – Copy Number
BACK – Genetic Background of Host Embryo or ES
Cells
EXPR – Expression of Transgene or Targeted Gene
PHEN – Phenotype Due to Expression of Transgene
or Targeted Gene
INTG – Description of Integration Site
CROS – Crosses with Other Transgenic Lines
IGEN – Genetics of Host Insertional Mutation
ICOM – Comments on Genetics of Host Insertional
Mutation
ICLN – Is Flanking Sequence Cloned?
ICHR – Is Mutant Locus Characterized?
IALL – Is Mutation Allelic with Existing Mutations?
IPHN – Phenotype of Insertional Mutation
FCOM – Further Comments Relating to Transgenic
51
Line
MNT – Is Line Being Maintained?
HNDL – Special Handling Instructions for the Animals
QDTE – Is This Line Presently Available to Other
Investigators?
CADD – Name and Address of Contact Person
GADD – Name and Address of Author(s) Entering This
Record
PUBL – References for Publications Relating to Line
DATE – Date Document Was Entered or Updated
14. CONCLUZII
Este de remarcat faptul cã organele transplantate de la
porci transgenici pentru “decay accelerating factor
uman” (hDAF), ca ºi pentru alte gene implicate în
mecanismele de rejet, depãºesc starea de rejet
hiperacut (HAR), fiind eliminate de organismul gazdã
prin rejetul acut (AR). Se poate admite cã elucidarea
mecanismelor ºi prevenirea acestei a doua faze a
rejetului va duce la reuºita transplantului de organe porc
transgenic-om.
BIBLIOGRAFIE
1. Reemtsma K: Renal heterotransplantation from
nonhuman primates to man. Ann N Y Acad Sci 162:412-418, 1969.
2. Starzl TE, Marchioro TL, Peters GN et al: Renal
heterotransplantation from baboon to man: experience with 6 cases.
Transplantation 12:752-776, 1964.
3. Bailey LL, Nehlsen-Cannarella SL, Concepcion W et al:
Baboon-to-human cardiac xenotransplantation in a neonate. JAMA
254:3321-3329, 1985.
4. Starzl TE, Fung J, Tzakis A et al: Baboon-to-human liver
transplantation. Lancet 341:65-71, 1993.
5. Makowka L, Cramer DV, Hoffman A et al: The use of a pig
liver xenograft for temporary support of a patient with fulminant hepatic
failure. Transplantation 59:1654-1659, 1995.
6. Watanabe FD, Mullon CJ, Hewitt WR et al: Clinical
experience with a bioartificial liver in the treatment of severe liver
failure. A phase I clinical trial. Ann Surg 225:484-491, 1997.
7. Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE, Jr. et al: Production
of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature
315:680-683, 1985.
8. Pursel VG, Pinkert CA, Miller KF et al: Genetic
engineering of livestock. Science 244:1281-1288, 1989.
9. Velander WH, Johnson JL, Page RL et al: High-level
expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine
using the cDNA encoding human protein C. Proc Natl Acad Sci U S A
89:12003-12007, 1992.
10. Swanson ME, Martin MJ, O'Donnell JK et al: Production
of functional human hemoglobin in transgenic swine. Biotechnology (N
Y ) 10:557-559, 1992.
11. Weidle UH, Lenz H, Brem G: Genes encoding a mouse
1177
51 Corneliu MATEESCU, Irinel POPESCU - XENOTRANSPLANTUL DE FICAT LA OM
monoclonal antibody are expressed in transgenic mice, rabbits and
pigs. Gene 98:185-191, 1991.
12. Lo D, Pursel V, Linton PJ et al: Expression of mouse IgA
by transgenic mice, pigs and sheep. Eur J Immunol 21:1001-1006,
1991.
13. Levy MF, Crippin J, Sutton S et al: Liver
allotransplantation after extracorporeal hepatic support with transgenic
(hCD55/hCD59) porcine livers: clinical results and lack of pig-to-
human transmission of the porcine endogenous retrovirus.
Transplantation 69:272-280, 2000.
14. Draft report on the state of the art in the field of
xenotransplantation. Council of Europe 2002.
15. Ye Y, Niekrasz M, Kosanke S et al: The pig as a potential
organ donor for man. A study of potentially transferable disease from
donor pig to recipient man. Transplantation 57:694-703, 1994.
16. Alexander TJL, Harris D: Methods of disease control. În
Diseases of Swine. Leman AD (ed.). Iowa State University Press.
Ames. 1992, 808-836.
17. Safron J, Gonder JC: The SPF Pig in Research. ILAR J
38:28-31, 1997.
18. Gordon JW: Transgenic Technology and Laboratory
Animal Science. ILAR J 38:32-41, 1997.
19. Feng YL, Gordon JW: Removal of cytoplasm from one-
celled mouse embryos induces early blastocyst formation. J Exp Zool
277:345-352, 1997.
20. Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ et al: Genetic
transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.
Proc Natl Acad Sci U S A 77:7380-7384, 1980.
21. Gordon JW, Ruddle FH: Integration and stable germ line
transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science
214:1244-1246, 1981.
22. Gordon JW, Ruddle FH: Gene transfer into mouse
embryos: production of transgenic mice by pronuclear injection.
Methods Enzymol 101:411-433, 1983.
23. Woychik RP, Stewart TA, Davis LG et al: An inherited limb
deformity created by insertional mutagenesis in a transgenic mouse.
Nature 318:36-40, 1985.
24. Krulewski TF, Neumann PE, Gordon JW: Insertional
mutation in a transgenic mouse allelic with Purkinje cell degeneration.
Proc Natl Acad Sci U S A 86:3709-3712, 1989.
25. Jaenisch R: Germ line integration and Mendelian
transmission of the exogenous Moloney leukemia virus. Proc Natl
Acad Sci U S A 73:1260-1264, 1976.
26. Evans MJ, Kaufman MH: Establishment in culture of
pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292:154-156, 1981.
27. Martin GR: Isolation of a pluripotent cell line from early
mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma
stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 78:7634-7638, 1981.
28. Mucenski ML, McLain K, Kier AB et al: A functional c-myb
gene is required for normal murine fetal hepatic hematopoiesis. Cell
65:677-689, 1991.
29. Lee EY, Chang CY, Hu N et al: Mice deficient for Rb are
nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.
Nature 359:288-294, 1992.
30. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J et al: Viable offspring
derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385:810-813,
1997.
31. Wells DN, Misica PM, Day TA et al: Production of cloned
lambs from an established embryonic cell line: a comparison between
in vivo- and in vitro-matured cytoplasts. Biol Reprod 57:385-393, 1997.
32. Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ et al: Cloned transgenic
1178
calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science
280:1256-1258, 1998.
33. Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M et al: Full-term
development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus
cell nuclei. Nature 394:369-374, 1998.
34. Baguisi A, Behboodi E, Melican DT et al: Production of
goats by somatic cell nuclear transfer. Nat Biotechnol 17:456-461,
1999.
35. Prather RS, Sims MM, First NL: Nuclear transplantation in
early pig embryos. Biol Reprod 41:414-418, 1989.
36. Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD et al: Cloned pigs
produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 407:86-
90, 2000.
37. Kwon OY, Kono T: Production of identical sextuplet mice
by transferring metaphase nuclei from four-cell embryos. Proc Natl
Acad Sci U S A 93:13010-13013, 1996.
38. Koo DB, Kang YK, Choi YH et al: Developmental potential
and transgene expression of porcine nuclear transfer embryos using
somatic cells. Mol Reprod Dev 58:15-21, 2001.
39. Barker RA: Porcine neural xenografts: what are the
issues? Novartis Found Symp 231:184-196, 2000.
40. Specke V, Tacke SJ, Boller K et al: Porcine endogenous
retroviruses: in vitro host range and attempts to establish small animal
models. J Gen Virol 82:837-844, 2001.
41. Meng XJ, Purcell RH, Halbur PG et al: A novel virus in
swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad
Sci USA 94:9860-9865, 1997.
42. Meng XJ, Halbur PG, Haynes JS et al: Experimental
infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus (swine
HEV), but not with human strains of HEV. Arch Virol 143:1405-1415,
1998.
43. Hsieh SY, Meng XJ, Wu YH et al: Identity of a novel swine
hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan
isolates of human hepatitis E virus. J Clin Microbiol 37:3828-3834,
1999.
44. Parker W, Bruno D, Holzknecht ZE et al: Characterization
and affinity isolation of xenoreactive human natural antibodies. J
Immunol 153:3791-3803, 1994.
45. Platt JL, Holzknecht ZE: Porcine platelet antigens
recognized by human xenoreactive natural antibodies. Transplantation
57:327-335, 1994.
46. Cotterell AH, Alvarado CG, Logan JS et al: Variation in
expression of porcine antigens recognized by human xenoreactive
natural antibodies. Transplant Proc 27:278-279, 1995.
47. Strahan KM, Gu F, Andersson L et al: Pig alpha 1,
3galactosyltransferase: sequence of a full-length cDNA clone,
chromosomal localisation of the corresponding gene, and inhibition of
expression in cultured pig endothelial cells. Transplant Proc 27:245-
246, 1995.
48. Gewurz H, Clark DS, Cooper MD et al: Effect of cobra
venom-induced inhibition of complement activity on allograft and
xenograft rejection reactions. Transplantation 5:1296-1303, 1967.
49. Leventhal JR, Matas AJ, Sun LH et al: The
immunopathology of cardiac xenograft rejection in the guinea pig-to-rat
model. Transplantation 56:1-8, 1993.
50. Pruitt SK, Baldwin WM, III, Marsh HC, Jr. et al: Effect of
soluble complement receptor type 1 on natural antibody levels during
xenograft rejection. Transplant Proc 24:477-478, 1992.
51. Platt JL: Xenotransplantation: The Need, The
Immunologic Hurdles, and The Prospects for Success. ILAR J 37:22-
30, 1995.
 Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI 51

52. Weisman HF, Bartow T, Leppo MK et al: Soluble human response of human T cells to mouse xenoantigens. J Exp Med
complement receptor type 1: in vivo inhibitor of complement 171:333-338, 1990.
suppressing post-ischemic myocardial inflammation and necrosis. 72. Lee RS, Yamada K, Houser SL et al: Indirect recognition
Science 249:146-151, 1990. of allopeptides promotes the development of cardiac allograft
53. Blakely ML, Van der Werf WJ, Berndt MC et al: Activation vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A 98:3276-3281, 2001.
of intragraft endothelial and mononuclear cells during discordant 73. Chopek MW, Simmons RL, Platt JL: ABO-incompatible
xenograft rejection. Transplantation 58:1059-1066, 1994. kidney transplantation: initial immunopathologic evaluation. Transplant
54. Platt JL, Vercellotti GM, Dalmasso AP et al: Proc 19:4553-4557, 1987.
Transplantation of discordant xenografts: a review of progress. 74. Alexandre GP, Squifflet JP, De Bruyere M et al: Present
Immunol Today 11:450-456, 1990. experiences in a series of 26 ABO-incompatible living donor renal
55. Cary N, Moody J, Yannoutsos N et al: Tissue expression allografts. Transplant Proc 19:4538-4542, 1987.
of human decay accelerating factor, a regulator of complement 75. Alexandre GP, Gianello JP, Latinne D et al:
activation expressed in mice: a potential approach to inhibition of Plasmapheresis and splenectomy in experimental renal
hyperacute xenograft rejection. Transplant Proc 25:400-401, 1993. xenotransplantation. In Xenograft 25. Hardy MA (ed.). Elsevier
56. Kooyman D, Byrne G, McClellan S et al: Erythroid- Science Publishers. New York. 1989, 259-266.
specific expression of human CD59 and transfer to vascular 76. Lyon MF: Nomenclature for transgenic mice. În Genetic
endothelial cells. Transplant Proc 26:1241 1994. Variants and Strains of the Laboratory Mouse. 1989, cap. Section 1.2.5
57. Diamond LE, Oldham ER, Platt JL et al: Cell- and tissue- (Rules and guidelines for gene nomenclature), 10-11.
specific expression of a human CD59 minigene in transgenic mice.
Transplant Proc 26:1239 1994.
58. Kagan D, Platt J, Logan J et al: Expression of
complement regulatory factors using heterologous promoters in
transgenic mice. Transplant Proc 26:1242 1994.
59. McCurry KR, Parker W, Cotterell AH et al: Humoral
responses to pig-to-baboon cardiac transplantation: implications for
the pathogenesis and treatment of acute vascular rejection and for
accommodation. Hum Immunol 58:91-105, 1997.
60. Auchincloss H, Jr.: Xenogeneic transplantation. A review.
Transplantation 46:1-20, 1988.
61. Perper RJ, Najarian JS: Experimental renal
heterotransplantation. I. In widely divergent species. Transplantation
4:377-388, 1966.
62. Platt JL, Saadi S, Ihreke NS: Pathophysiology of
xenograft rejection. Principles of immunomodulatory drug development
in transplantation and autoimmunity. Lieberman R, Morris R (eds.).
Raven Press. New York.1995.
63. Saadi S, Platt JL: Transient perturbation of endothelial
integrity induced by natural antibodies and complement. J Exp Med
181:21-31, 1995.
64. Edwards J: Complement activation by xenogeneic red
blood cells. Transplantation 31:226-227, 1981.
65. Vercellotti GM, Platt JL, Bach FH et al: Neutrophil
adhesion to xenogeneic endothelium via iC3b. J Immunol 146:730-
734, 1991.
66. Colman RW, Habal M, Hollenberg NK et al: Hyperacute
renal allograft rejection in the primate. Therapeutic limitations of
antiplatelet agents alone and combined with heparin. Am J Pathol
82:25-42, 1976.
67. Basker M, Buhler L, Alwayn IP et al: Pharmacotherapeutic
agents in xenotransplantation. Expert Opin Pharmacother 1:757-769,
2000.
68. Forbes RD, Guttmann RD, Kuramochi T et al:
Nonessential role of neutrophils as mediators of hyperacute cardiac
allograft rejection in the rat. Lab Invest 34:229-234, 1976.
69. Inverardi L, Samaja M, Motterlini R et al: Early recognition
of a discordant xenogeneic organ by human circulating lymphocytes. J
Immunol 149:1416-1423, 1992.
70. Geller RL, Turman MA, Dalmasso AP et al: The natural
immune barrier to xenotransplantation. J Am Soc Nephrol 3:1189-
1200, 1992.
71. Alter BJ, Bach FH: Cellular basis of the proliferative

1179