Sunteți pe pagina 1din 70

Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj-Napoca Facultatea de Medicin

LUCRARE DE LICEN

ndrumator tiinific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan

2010

Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj-Napoca Facultatea de Medicin

LUCRARE DE LICEN EVALUAREA SINTEZEI DE OXID NITRIC I A STRESULUI OXIDATIV N TUMORILE RECTALE

ndrumator tiinific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan

2010

Cuprins

I TRODUCERE

CAPITOLUL 1 1.Fiziopatologia neoplaziilor 1.1Etiopatogeneza neoplaziilor. 1.2Teorii patogenetice n neoplazii. 1.2.1 Factorul genetic n apariia neoplaziilor. 1.2.2 Ereditatea n patogeneza cancerelor. 1.2.3 Ageni carcinogeni chimici. 1.2.4 Efectele radiaiilor ionizante. 1.2.5 Virusurile oncogenice. 1.2.6 Implicarea sistemului imunitar n oncogenez 1.3 Fiziopatologia cancerului de colon 2 3 6 6 7 8 9 9 10 11

CAPITOLUL 2 2.Oxidul nitric 2.1Sinteza oxidului nitric. 2.2 Aciunea NOS. 2.2.1Structura NOS. 2.2.2 NO-sintetazele(NOS). 2.3 Efecte fiziologice ale oxidului nitric. 2.3.1 Rolul imunitar al NO. 2.3.2 Aciunea asupra musculaturii netede. 2.3.3 Oxidul nitric i inflamaia 2.3.4 NO i efetele sale asupra sistemului nervos. 2.3.5 Importana NO n uciderea germenilor patogeni. 2.3.6 NO i longevitatea. 2.4 Implicarea oxidului nitric n fiziopatologia neoplaziilor. 13 14 14 14 15 18 18 18 19 19 20 20 21

CAPITOLUL 3 3.Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale 3.1 Scopul studiului 3.2 Materiale i metode 3.2.1 Grupurile de studiu 3.2.2 Reactivii folosii. 3.2.3 Determinarea nitriilor 3.2.4 Determinarea rspunsului antioxidativ total (TAR). 3.2.5 Determinarea statusului oxidativ total . 3.2.6 Indicele de stres oxidativ. 3.2.7 Analiza statistic. 3.3 Rezultate 3.3.1 Analiza demografic a pacienilor. 3.3.2 Analiza general a lotului de studiu. 3.3.3 Analiza sublotului de femei 3.3.4 Analiza sublotului de brbai 3.3.5 Analiza pe grupe de vrst 3.4 Discuii Concluzii
Bibliografie

24 25 25 25 26 27 28 30 31 31 32 32 32 35 38 41 51 58
60

II

Introducere

Introducere
Cancerul colorectal se afl pe primele locuri n lista incidenei cancerelor n lume.Din acest motiv,anual se revizuiesc metodele de screening i recomandrile de diagnostic i tratament

.Proporional cu incidena cancerului colorectal s-au dezvoltat i studiile referitoare la mecanismele celulare i moleculare implicate n patogeneza acestui tip de cancer.

Se tie c diveri factori pot s influeneze incidena cancerului colorectal.Printre acetia cei mai frecvent menionai sunt obezitatea,antecedentele familiale,vrsta,inactivitatea fizic,consumul de alcool i alimentaia.

Studiile efectuate n ultimii ani au pus n eviden diveri factori de risc moleculari.Printre cei mai studiai factori de risc implicai la nivel molecular se gsesc cei implicai n stresul oxidativ.

Avnd n vedere aceste aspecte,studiul de fa i-a propus evaluarea unor parametrii ai stresului oxidativ n tratamentul cancerului colorectal,respectiv dup tratamentul chirurgical i nainte i dup tratamentul combinat radioterapie i chimioterapie.

Alegerea acestor etape terapeutice ca i momente de studiu s-a fcut pornind de la constatarea c stresul oxidativ acioneaz diferit n diferite etape ale canncerogenezei,ceea ce oblig la descrierea unor indicatori care s fie adaptai pentru fiecare stadiu evolutiv al bolii.

n urma studiului se dorete a se evalua posibilitatea ca aceti parametri ai stresului oxidativ urmrii s fie n viitor folosii ca parametri de screening n evaluarea postchirurgical a pacienilor cu cancer colorectal operat.

Capitolul 1
Fiziopatologia neoplaziilor

Capitolul 1 1.1Etiopatogeneza neoplaziilor.

Fiziopatologia neoplaziilor

Neoplaziile reprezint o problem de o covritoare importan in sntatea mondial la momentul actual.De aceea cunoaterea etiopatogenezei acestui tip de afeciuni este esenial[2,3]. Neoplaziile rezult din alterri ale proceselor de cretere i difereniere celular,din acestea rezultnd esutul canceros.Acesta crete n mod necontrolat i autonom datorit lipsei regulatorilor creterii i dezvoltrii celulare n esutul neoplazic[1]. Exist o varietate deosebit a a proceselor de cancerogenez n funcie de localizarea neoplaziei,ns multe din caracterele acestora sunt totui comune.Principalele trsaturi comune sunt legate de multiplicarea factorilor care intervin n oncogenez i de trecere unei perioade lungi de timp ntre prima influen i apariia bolii propriu-zise.Se disting factori interni i externi[4]. La nceput,rezultatul aciunii factorilor externi i interni este apariia prin transformare sau mutaie a unei celule care are potenialul de a deveni canceroas.Acesta este faza de iniiere a oncogenezei.Sunt necesare intervenii suplimentare pentru a-i permite acestei celule s se modifice i s se multiplice pentru a forma o clon cu potenial canceros.Aceasta este faza de promoie.Factorii care favorizeaz prima faz a oncogenezei sunt numii iniiatori iar cei care o favorizeaz pe cea de-a doua sunt numii promotori.Oncogeneza are o evoluie de lung durat,ncepnd cu influena exercitat de factorii cancerigeni si apariia primei celule canceroase,care se multiplic apoi excesiv.Pentru nceput avem de-a face cu o faz asimptomatic,faza preclinic.Cnd tumora va atinge greutatea de un gram,care corespunde existenei unui miliard de celule neoplazice ea va deveni decelabil[6,8]]. Celulele canceroase apar ca i rezultat al mutaiilor care au ,loc n timpul procesului de difereniere celular.Cnd mutaia apare la nceputul procesului de difereniere avem de-a face cu o tumor slab difereniat i cu malignitate crescut,n timp ce n cazul apariiei mutaiei mai trziu in acelai proces tumora este mai bine difereniat i cu o malignitate de nivel mai sczut.Lipsa unei bune diferenieri celulare n esutul neoplazic este denumit prin termenul anaplazie.Celulelor canceroase le lipsete funcionalitatea normal,i de asemenea nu mor la acelai termen cu celulele normal difereniate ale aceluiai organ sau sistem.Apar modificri ale funcionalitii i caracteristicilor acestor celule,cum ar fi alterri ale inhibiiei de contact,lipsa adeziunii celulare,defecte ale comunicrii intercelulare,exprimarea unor antigeni tisulari modificai sau elaborarea de enzime care faciliteaz i particip la procesele de invazie i metastazare[2,3].

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

Inhibiia de contact reprezint oprirea procesului de cretere celular cnd dou celule de tipuri diferite intr n contact.Aceasta nu se aplic ins i la celulele neoplazice,care cresc indiferente la contactul cu esuturile nconjurtoare sntoase.Celulele tumorale produc antigeni care nu sunt sintetizai n mod normal de ctre celulele corpului uman,aceti antigeni putnd fii folosii ca i markeri tumorali.n cadrul tumorilor se produc anumite enzime(n special proteaze i glicozidaze) care au rolul de a degrada matricea extracelular i de a o dezorganiza favoriznd astfel procesul de invazie tumoral[1,5]. Tumorile maligne au proprietatea de a crete prin infiltrarea i invazia esuturilor nconjurtoare.Datorit lipsei unei clare demarcaii ntre tumor i esuturile sntoase nconjurtoare extirparea lor prin metode chirurgicale este mult ngreunat[22]. Prin termenul de metastaz se nelege dezvoltarea unei tumori secundare la distan de tumora primar.Metastaza prezint multe din caracteristicile tumorii n care i-a avut originea.Este astefel posibil s determinm localizarea tumorii primare prin intermediul caracteristicilor celulare ale metastazelor date de aceasta.Metastazarea are loc prin intermediul circulaiei limfatice i sanguine.Astfel,n cazul n care metastazarea are loc prin intermediul cii limfatice celulele tumorale invadeaz la nceput ganglionii limfatici situai proximal de localizarea primar.O dat ajunse n circulaie unele celule canceroase se ataeaz la elemente figurate sanguine din fluxul sanguin,formnd emboli tumorali.Dup aceea celulele trebuie s prseasc sistemul circulator,s strabat matricea extracelular pentru a ptrunde n esutul int.O dat ajunse n esutul int celulele neoplazice secret factorul angiogenetic tumoral care ajut la apariia vaselor de neoformaie n tumor[2,6,9]. Rata creterii att n esuturile normale ct i n cele canceroase depinde de numrul de celule care trec prin ciclul celular sau se divid la un moment dat,durata ciclului celular i numrul de celule care sunt pierdute prin moarte celular comparativ cu cele care sunt produse.Numrul celulelor tumorale angajate la un moment dat n ciclul celular este de obicei foarte mare comparativ cu situaia celulelor normale.Durata ciclului celular la celulele canceroase nu este sesizabil mai sczut dect la celulele obinuite,ns moartea celulelor canceroase nu are loc programat.Exist un procentaj foarte mare de celule neoplazice care sunt active n cadrul ciclului celular,celulelor tumorale lipsidu-le factorul de cretere care lear opri n faza de repaos a ciclului celular(G0)[3,5]. Fracia de cretere ntr-un esut reprezint numrul celulelor n diviziune supra numrul celulelor n stare de rapaos.Timpul de dublare reprezint perioada de timp necesar dublrii numrului de celule din respectivul esut.Cu ct este fracia de cretere mai mare cu att mai scurt este timpul de dublare.n momentul n care celulele normale ating vrsta adult 4

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

este atins un echilibru ntre naterea i moartea celular.n schimb celulele canceroase i continu diviziunea pn cnd creterea le este inhibat de lipsa unei circulaii corespunztoare i a nutrienilor.O tumor este de obicei imposibil de detectat pn cnd nu i dubleaz volumul de 30 de ori i conine mai mult de un miliard de celule.Dup 35 de dublri de volum populaia de celule tumorale atinge 1 trilion,numr n general suficient pentru a ucide organismul gazd[9]. Din punct de vedere clinic,manifestrile iniiale ale cancerului se refer la locaia primar a afectiunii.Creterea tumoral afecteaz vasele sanguine cauznd apariia de ulceraii,necroze,sngerri care pot evolua pn la hemoraguii.De exemplu n cancerul colorectal un prim semnal de alarm este apariia scaunelor sanguinolente.n celulele canceroase se produc adeseori toxine i enzime care au proprietatea de a distruge esuturile din jur,afectnd de asemenea i procesele de vindecare tisular[1]. Prin invazia structurilor nconjurtoare i prin creterea lor necontrolat,tumorile comprim adesea structurile adiacente,ca de exemplu diferite viscere sau vase sanguine.n stadiile avansate cancerele devin dureroase,managmentul durerii fiind o problem esenial n terapia formelor incurabile i terminale de neoplazii[21]. De-alungul creterii i dezvoltrii tumorale apar tulburri ale metabolismului glucidic,lipidic i proteic.Astfel,n multe tipuri de neoplazii apare caexia,adic scderea accentuat n greutate ce apare nsoita de pierderi ale esutului grsos i scdere a nivelului proteinelor din organism.Caexia nu poate fi explicat doar prin reducerea poftei de mncare i tulburri ale analizatorului gustativ care nsoesc neoplaziile i sunt uneori accentuate i de tratamentele de care au parte pacienii.Se pare c este vorba de anumii factori produi fie de tumora malign,fie de organismul gazd care acioneaz fie direct asupra centrilor hipotalamici ai saietii sau n mod indirect prin lezarea unor esuturi care astfel elibereaz substane anorexigene.Prima citokin asociat pierderilor metabolice a fost caectina,care mai trziu s-a dovedit a avea aceeai structur ca i factorul de necroz tumoral(TNF),o citokin secretat de ctre macrofage ca i rspuns la proliferarea tumoral.TNF acioneaz asupra centrilor saietii i suprim secreia de lipoprotein-lipaz,enzim care ajut la eliberarea acizilor grai din lipoproteine,astfel nct acesteaacioneaz asupra centrilor saietii i suprim secreia de lipoprotein-lipaz,enzim care ajut la eliberarea acizilor grai din lipoproteine,astfel nct acestea s poat fi utilizate de esuturi,prin aceste efecte Tnf avnd un rol puternic anorexigen.O alt citokin secretat de macrofage,interleukina-1(IL-1) are i ea abilitatea de a contribui la iniierea caexiei[2,11,12].

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

Pe lng semnele i simptomele pe care boala canceroas le produce n situl de origine i n organele unde apar determinri secundare mai apar manifestri ale cancerului n zone care nu sunt direct afectate de neoplazie,aceste manifestri fiind de o mare diversitate i purtnd numele generic de sindroame paraneoplazice[4]. Carcinogeneza se refer att la aspectele moleculare ale apariiei i multiplicrii celulelor neoplazice ct i la dezvoltarea i rspndirea prin organism a masei tumorale.Cancerele nu au cum s aib o singur cauz ci mult mai probabil apar ca efect al interaciunii dintre diferii factori carcinogenetici sau ca efect al expunerii repetate la un anumit agent carcinogenetic.Au fost descoperii i studiai multiplii factori de risc ai cancerului,care ar putea avea un rol cauzal n declanarea bolii,constituindu-se diferite teorii patogenetice ale neopalaziilor[1,3,20].

1.2Teorii patogenetice n neoplazii.

Referitor la neoplazii exist n medicina actual numeroase teorii care ncearc s lmureasc apariia i rspndirea acestor afeciuni,unele dintre cele mai grave i controversate patologii cu care se confrunt omenirea n aceast er[6]. Dintre factorii de risc,care au un rol deosebit de important n iniierea apariiei cancerelor au fost menionate vrsta,factorul genetic,ereditatea,factorii carcinogeni chimici i ambientali,viruii cu rol n oncogenez i defectele imunologice[5]. Marea majoritate a neoplaziilor(76%)apar la persoane cu vrsta de la 75 de ani n sus.n Statele Unite ale Americii se estimeaz o dublare a cazurilor de cancer pn n 2050 datorit mbtrnirii populaiei[1]. Variabilitate n incidena i prognosticul cancerelor se ntlnete i referitor la ras,zon geografic sau nivel socio-economic.Factorii de mediu,precum i expunerea la diferite toxine i ali factori referitori la diet au o contribuie evident,dei nc incomplet explicat n oncogenez[2].

1.2.1 Factorul genetic n apariia neoplaziilor.

Cauzele majoritii cancerelor rmn necunoscute,ns cercetrile n domeniul biologiei moleculare au nceput s deceleze ci complexe care duc la creterea celulelor canceroase,a tumorilor i metastazarea.S-au descoperit legturi ntre proliferarea celular anormal i mutaii ale unor secvene de ADN care duc la expresia anormal a 6

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

protooncogenelor sau la deleia unor gene supresoare tumorale.Majoritatea tumorilor prezint diferite anormalitti cromozomiale cum ar fi deleii,inversaii,translocaii sau duplicaii[5,7]. Achiziia unei singure mutaii genetice nu poate s transforme celule normale n celule canceroase,aceast transformare prnd s necesite activarea mai multor gene independente mutante.Proto-oncogenele sunt importante pentru o cretere i proliferare normal a celulelor organismului sntos.Ele sunt implicate n procesul de oncogenez prin apariia unei mutaii la nivelul esutului int,aceasta transformnd proto-oncogena n oncogen[17,18]. Anti-oncogenele au rolul de a opri proliferarea celular n cadrul tumorilor.n momentul n care aceste celule sunt inactivate dispare semnalul genetic care inhib proliferarea cauznd astfel debutul creterii neregulate a celulei.Una din genele supresoare ale cancerului care a fost identificat este gena p53,localizat pe braul scurt al cromozomului 17.Mutaia acestei gene este implicat n dezvoltarea neoplaziilor pulmonare,de sn i colon.De asemenea gena p53 pare s fie iniiatoarea apoptozei celulelor tumorale afectate de radio- i chimioterapie[14]. Transformare celulelor normale n celule canceroase trece prin trei stadiiiniierea,promoia i progresia.Iniierea implic dozele necesare ale unui agent

carcingenetic,care acionnd asupra celulelor le face susceptibile la transformarea malign.Dup aciunea acestui agent carcinogenetic schimbrile n genomul celulei sunt ireversibile.Promoia cuprinde inducerea unei creteri neregulate i accelerate ale celulelor trecute prin faza de iniDup aciunea acestui agent carcinogenetic schimbrile n genomul celulei sunt ireversibile.Promoia cuprinde inducerea unei creteri neregulate i accelerate ale celulelor trecute prin faza de iniiere prin intermediul diferitelor substane chimice i a unor factori de cretere.Celulele care au trecut prin faza ireversibil de iniiere pot parcurge faza de promoie chiar i dup perioade foarte lungi de laten.Unii carcinogeni chimici sunt numii carcinogeni complei deoarece pot s iniieze precum s i promoveze transformarea neoplazic.n faza de progresie celulele tumorale i nsuesc schimbri ale fenotipului care le permit s aib capacitatea de a invada,de a metastaza i de a prezenta o dezvoltare autonom i o crescut instabilitate la nivelul cariotipului[8,9,10].

1.2.2 Ereditatea n patogeneza cancerelor.

O predispoziie ereditar a fost descoperit n aproximativ 50 de tipuri de cancer.De exemplu cancerul de sn are o important component ereditar,aprnd mult mai frecvent la femei care au mai avut cazuri n familie.Procentul de pacieni oncologici care mai au o rud 7

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

de gradul 1 afectat de boal este de 10%,la cei care au doi membrii ai familiei afectai este de 15%,iar la cei cu trei membrii ai familiei bolnavi procentul urc la 30%.n cazul femeilor de peste 65 de ani cu istoric familial de cancer de sn riscul urc pn la 50%[7,19].

Exist unele tipuri de cancer care se transmit prin mecanism autozomal dominant.De exemplu,predispoziia pentru retinoblastom este transmis prin acest tip de

mecanism.Ameninarea genetic n retinoblastom este ridicat,95% dintre purttorii genei dezvoltnd cel puin o formaiune tumoral.Un alt exemplu de acest fel este reprezentat i de polipoza adenomatoas familial a colonului,n care gena este de asemenea transmis prin mecanism autozomal dominant.La aceti pacieni se pot dezvolta sute de polipi adenomatoi,unii dintre acetia evolund inevitabil ctre malignitate[10].

1.2.3 Ageni carcinogeni chimici

Din cele peste ase milioane de elemante chimice identificate pn n ziua de azi se estimeaz c mai puin de 1000 au fost examinate pentru a li se descoperi eventualul caracter carcinogen.Ageni chimici carcinogeni pot fi mprii n dou grupe,direci i indireci.Cei direci nu necesit activere pentru a deveni carcinogeni,n timp ce ceilali cunoscui ca i procarcinogeni sau iniiatori sunt capabili de carcinogenez doar dup conversia metabolic.Din aceste substane chimice se formeaz specii cu reactivitate crescut,care acioneaz asupra materialului genetic al celulei int cauznd mutaii ale celulei sau alterri n sinteza de enzime i proteine de structur modificnd replicarea celulei.Aciunea agenilor carcinogeni este augmentat de anumite substane numite promoteri,care singure nu ar avea efect carcinogen,dar astfel uureaz aciunea carcinogenilor propriu-zii prin creterea sintezei de ADN,accelernd dezvoltarea materialului genetic i dunnd bunei comunicri intercelulare[11,13].

Fumul de igar conine att procarcinogeni ct i elemente promotoare,fiind direct asociat cu cancerele de laringe i pulmonar i contribuind la apariia cancerelor esofagiene,pancreatice,renale ale colului uterin i vezicii urinare.Anumite elemente din diet,ca de exemplu anumite hidrocarburi policiclice sunt transformate n ageni carcinogeni dac sunt gtite prin refolosirea uleiului.[13]

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

Cancerul de colon se asociaz cu un consum ridicat de grsimi,proteine i carne de vit mpreun cu un consum deficitar de fibre .O diet bogat n grsimi crete nivelul acizilor biliari primari din materiile fecale.Acetia sunt transformai de flora bacterian a colonului n acizi biliari secundari,care par a fii promoteri tumorali[14].

Efectele procarcinogene ale elementelor chimice sunt

de obicei dependente de

doz,crescnd direct proporional cu doza i timpul de expunere.Unii ageni chimici pot aciona n colaborare cu ali carcinogeni,cum ar fi radiaiile ionizante sau viruii.n general trec undeva nter 5 i 30 de ani de la momentul expunerii la agentul cancerigen i pn la apariia propriu-zis a bolii[14].

1.2.4 Efectele radiaiilor ionizante.

Efectele acestui tip de ageni carcinogeni au fost foarte bine investigate la supravieuitorii atacurilor cu bombe atomice de la Hiroshima i Nagasaki.Cele mai rspndite neoplazii la acest populaie au fost leucemiile i epitelioamele maligne,rata mortalitii leucemiei la supravieuitorii atacurilor nucleare fiind de 30 de ori mai ridicat dect valorile normale[13,16].

Tipul de cancer care se dezvolt ca urmare a aciunii radiaiilor ionizante depinde de doza de radiaii,de sexul persoanei i de vrsta la care a avut loc iradierea.Perioada dintre momentul expunerii i aparitia neoplaziei este n relaie cu vrsta individului.De exemplu dac un copil este expus radiaiilor nainte de natere,acesta prezint un risc crescut de a dezvolta leucemii n primii 2,3 ani de via,perioada de laten crescnd la 5-10 ani n cazul expunerii postnatale[8,11]

Asocierea ntre expunerea direct la radiaiile solare i cancerele de piele este cunoscut de mai bine de 100 de ani.Efectele razelor ultraviolete este aditiv i trece o lung perioad de timp ntre expunere i momentul n care cancerul poate s fie diagnosticat[13].

1.2.5 Virusurile oncogenice.

Virusurile sunt mici particule conintoare de material genetic(ADN sauARN) care ptrund n celula gazd unde se ncorporeaz n materialul genetic al acesteia.O mare parte a 9

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

virusurilor au fost relaionate cu producerea de neoplazii la animale,ns la om puine au putut fi incriminate de participare n carcinogenez.Printre acestea se numr virusul papilloma(HPV),virusul Epstein-Barr(EBV),virusul hepatitei B(HBV) i virusul leucemiei cu limfocite T de tip 1(HTLV-1)[16].

Exist mai mult de 60 de tipuri diferite de HPV,din punct de vedere genetic.Unele din acestea s-au dovedit a fii implicate n producerea cancerului de col uterin.Este vorba de HPV tip 16 i 18 i mai rar tipurile 31,33,35 i 51.Ele au fost descoperite n 85% din cazurile de cancer scuamos de col i precursori ai acestuia(displazia sever i carcinomul in situ)[16]..

EBV,membru al familiei virusurilor herpetice ezuri este implicat n producerea a patru tipuri de neoplazii:limfom Burkitt,cancer de nazofaringe,limfomul cu limfocite B la imunosuprimai i n unele cazuri de limfom Hodgkin[1]

HBV,agentul etiologic al hepatitei B este implicat i n apariia cirozei i a carcinomului hepatocelular.Mecanismul exact prin care virusul contribuie la apariia carcinomului nu a putut fi nc decelat ns se pare c este un rezultat al distrugerii i regenerrii prelungite a ficatului produse prin aciunea HBV[1]

1.2.6 Implicarea sistemului imunitar n oncogenez Exist tot mai multe dovezi care certific participarea sistemului imunitar n lupta mpotriva rspndirii cancerului n organism.Imunoterapia este folosit pentru a augmenta rspunsul imun general al pacientului i asfel a crete distrugerea esutului tumoral[18].

Dezvoltarea neoplaziilor ar putea fi asociat cu deficiene ale sistemului imunitar,cum ar fi de exemplu la pacienii cu boli care afecteaz imunitatea(SIDA asociat cu apariia sarcomului Kaposi) sau la cei care au organe transplantate i primesc tratament imunosuprimant[21].

Practic capacitatea de a eradica celulele canceroase este prezent la toate celulele componente ale sistemului imunitar,aici menionnd limfocitele T i B,anticorpii,macrofagele i celulele NK.Limfocitele T sunt direct implicate n uciderea celulelor tumorale i de asemenea au rolul de a activa celelalte componente ale sistemului imunitar[22,23]. 10

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

Un sistem imunitar slbit uureaz procesele de cretere i rspndire ale tumorilor n organism[22].

1.3 Fiziopatologia cancerului de colon Cancerul de colon reprezint a doua cauz de mortalitate prin neoplazii n Statele Unite ale Americii.Marea majoritate a cancerelor de colon sunt adenocarcinoame,care tind s formeze fie mase tumorale voluminoase fie leziuni de form inelar,constrictive[23].

Aproximativ 85% dintre cancerele colorectale prezint pierderea funciei uneia sau mai multor antioncogene(p53,APC sau DCC) prin apariia diferitelor mutaii spontane asociate cu instabilitate cromozomial i aneuploidie.Un procent de 15% din cazuri apar la pacienii cu instabilitate microsatelit,datorit inactivrii genelor reparatoare ale ADNului.Marea majoritate a cazurilor apar la pacieni cu vrsta peste 50 de ani,vrful de inciden aprnd n jurul vrstei de 70 de ani[25].

Factorii ereditari sunt implicai n producerea a 20-30% din totalul cancerelor colorectale.Riscul este proporional cu numrul i vrsta rudelor de gradul 1 bolnave de cancer de colon[24,27].

n cazul pacienilor suferinzi de afeciuni inflamatorii intestinale,cum ar fi rectocolita ulcerohemoragic sau boala Crohn riscul de apariie a cancerului apare la 7-10 ani dup declanarea bolii inflamatorii.Tratamentul cu ageni 5-ASA i folai este asociat cu o scdere a riscului de neoplazie la aceti pacieni[26,30].

Un important factor de risc n cancerul colorectal este prezena polipozelor ereditare,respectiv polipoza familial,sindromul Gardner,sindromul Turcot,pacienii cu aceste tipuri de afeciuni prezentnd risc crescut de aparie a neoplasmului i sindromul PeutzJeghers,cu un risc moderat[23,28].

Adenocarcinoamele de colon prezint o cretere lent i pot fi prezente perioade lungi de timp fr a fi detectate,deoarece rmn asimptomatice.Unele dintre tumorile acestea pot fi totui detectate prin apariia de sngerri oculte n materiile fecale.Simtomele depind de localizarea carcinomului.n cazul prezenei neoplaziei pe colonul drept,hemoragiile cronice 11

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

pot s produc anemie feripriv,manifest prin oboseal i slbiciune.Obstrucia n acest caz este rar ntlnit,datorit diametrului crescut al colonului drept i a consistenei lichide a materiilor fecale care l strbat.Uneori pot aprea dureri abdominale necaracteristice,dar prezena acestora nu este raportat dect de o parte a pacienilor,alii fiind complet asimptomatici[33,34]

Leziunile colorectale stngi sunt adesea circumfereniale,inelare.Deoarece aici diametrul intestinal este mai sczut iar consistena materiilor fecale este mai tare,apar simptome obstructive,nsoite de durere abdominal colicativ i uneori de modificri semnificative ale defecaiei obinuite a pacientului.Perioadele de constipaie alterneaz de multe ori cu perioade n care este prezent diareea.n scaune se poate observa snge uneori,dar nu se produc de obicei sngerri nsemnate cantitativ,putndu-se constata prezena sngelui doar la suprafaa scaunului[31,32] Cea mai frecvent clasificare a cancerelor rectale este clasificarea Duke[2](tabelul I).

Tabelul I-Clasificarea Duke a cancerelor colorectale

Pacienii cu boala n stadiile Duke A i B pot fii tratai eficient chirurgical. Cancerele rectale mai pot fi clasificate i prin intermediul clasificrii TNM[2](tabelul II). Tabelul II-Clasificarea T M a cancerelor colorectale
Stagiu Clasificare T M I IIA IIB IIIA IIIB IIIC IV T1-2, N0, M0 T3, N0, M0 T4, N0, M0 T1-2, N1, M0 T3-4, N1, M0 T(oricare), N2, M0 T(oricare), N(oricare), M1

12

Capitolul 2
Oxidul nitric

13

Capitolul 2

Oxidul nitric

2.Oxidul nitric

2.1Sinteza oxidului nitric. Oxidul nitric(NO) este prezent n multe esuturi ale organismului uman,unde acioneaz ca molecul de semnalizare,asigurnd reglarea multor procese fiziopatologice.Sinteza oxidului nitric se face din molecula aminoacidului l-arginin cu ajutorul enzimelor din familia

sintetazelor oxidului nitric(NOS)(fig 2.1.1)[35].

Aceste enzime(NOS) convertesc l-arginina n citrulin,n urma procesului rezultnd oxid nitric.Oxigenul i NADPH-ul sunt cofactori necesari procesului[37,43].

Figura 2.1.1-Sinteza oxidului nitric

2.2 Aciunea OS

2.2.1Structura OS Proteina NOS funcional este un dimer format din dou subuniti identice.Fiecare subunitate conine cte 3 domenii-domeniul reductazei,domeniul ligandului de calmodulin i domeniul oxigenazei[36,41].

Domeniul reductazei conine FAD i FMN i are rolul de a transfera electroni de la NADPH la domeniul oxigenazei de pe subunitatea opus a dimerului[41].

Legarea calmodulinei este necesar pentru activitatea tuturor tipurilor de NOS,deoarece detecteaz modificrile nivelului calcemic intracelular,funcia sa exact fiind ns diferit la fiecare din cele trei izoforme de NOS(fig 2.2.1-Structura general a NOS)[48].

14

Capitolul 2

Oxidul nitric

Domeniul oxigenazei conine situsul de legare al tetrahidrobiopterinei,hemului i argininei,i catalizeaz conversia l-argininei la citrulin i NO[39].

Figura 2.2.1-Structura general a OS

2.2.2 O-sintetazele( OS)

NOS sunt un grup de enzime care efectueaz sinteza oxidului nitric din atomul de nitrogen terminal al l-argininei,n prezena oxigenului i a cofactorilor NADPH(nicotinamidadenin-dinucleotid-fosfat),FAD(flavin-adenin-dinucleotid),FMN(flavin-mononucleotid),hem tetrahidrobioptrin[35]. i

NOS au fost descoperite n 1980 de ctre Furchgott,i de atunci se clasific n:

-NOS neuronal(NOS1) -NOS inductibil(NOS2) -NOS endotelial(NOS3)

Cele trei izoforme ale NOS prezint unele diferene legate de funcia individual a fiecreia.Reglarea transcripional i post-transcripional a activitii catalitice este distinct pentru fiecare dintre izoforme[41].

15

Capitolul 2

Oxidul nitric

n OS( OS1)

Enzima nNOS este prezent n sistemul nervos central i periferic i n muchii scheletici.Dei nNOS este considerat a fi o enzim constitutiv,exprimarea ei este influenat de ctre anumii stimuli psihologici,ca de exemplu stresul[38]. Sintetaza neuronal a oxidului nitric este asociat cu proteina post-sinaptic de densitate(PSD-95) la nivelul membranei neuronale.Ca rspuns la creterea nivelului de calciu intracelular nNOS reacioneaz cu calmodulina[48].Complexul calciu-calmodulin,n combinaie cu BH4 se leag de nNOS,inducndu-i acesteia translocaia ctre citoplasm.Defosforilarea nNOS prin calcineurin iniiaz producia de oxid nitric.NO activeaz apoi guanilil-ciclaza i diferitele reacii reglate de ctre cGMP(fig 2.2.2-aciunea nNos).nNOS este apoi inactivat de ctre proteinkinaza A sau C prin fosforilare[38].

Figura 2.2.2-aciunea n os i OS( OS2)

Aceast izoform a fost inial izolat din citoplasma macrofagelor unde activitatea ei aprea ca rspuns la unii stimuli cum ar fi aciunea endotoxinelor sau a citokinelor proinflamatorii.Acum enzima a fost descoperit ca exprimndu-se ntr-un numr mare de celule ale organismului[39,43].

16

Capitolul 2

Oxidul nitric

La nivelul macrofagelor NO este generat de iNOS,ca urmare a expunerii la anumite citokine cum ar fi de exemplu interferonul(IFN).Receptorii pentru IFN transmit semnalul prin intermediul JAK(Janus kinaze) i STAT(transductori de semnal i activatori ai transmisiei).Dup activarea STAT asociai acetia trec printr-un proces de translocaremajungnd la nucleu unde cresc expresia factorului de transcripie IRF-1 care se leag de regiunea din ADN-ul celular cu rol de promoter al iNOS,pentru a crete exprimarea respectivei gene.iNOS nu este dependent de creterea nivelului de calciu intracelular pentru a se putea activa(Figura 2.2.3-activarea iNOS (11).Gena iNOS se afl sub control transcripional,care este influenat de mecanisme de control care influeneaz stabilitatea mARN,degradarea proteinelor,translaia i disponibilitatea substraturilor i cofactorilor.Oxidul nitric produs de ctre macrofage este o molecul efectoare cu rolul de a ucide sau inactiva celulele int[40,44].

n anumite patologii avem de-a face cu o supraproducie de NO prin intermediul iNOS,ca de exemplu n ocul septic.Excesul de NO duce la scderea sever a presiunii arteriale i disfuncii ale unor organe.Avnd att rol de imunomediator ct i de molecul efectoare oxidul nitric poate avea i efecte benefice ct i efecte duntoare,n funcie de circumstane[47].

Figura 2.2.3-Activarea i OS

17

Capitolul 2

Oxidul nitric

e OS( OS3)

Enzima eNOS se gsete n endoteliul vascular,n cardiomiocite i n epiteliul pulmonar,la nivelul membranei bazale a microtubulilor ciliari[36].

n vasele de snge NO produs prin intermediul eNOS are rol de vasodilatator,reglnd fluxul sanguin i presiunea arterial,n timp ce la nivel cardiac influeneaz contractilitatea[45].

Calmodulina legat este necesar pentru activarea eNOS,iar legarea ei are loc la creterea concentraiei de calciu intracelular.Cercetri recente au relevat rolul esenial al eNOS n procesele de angiogenez i vasculogenez(de novo)[51,62].

n sistemul cardiovascular eNOS are un rol protector.De asemenea eNOS are un rol de protecie fa de ischemia cerebral,pstrnd fluxul sanguin cerebral.n ateroscleroz i inflamaii,concentraia sczut de NO previne moartea prin apoptoz a celulelor

endoteliale,astfel contribuind la pstrarea integritii endoteliului[45,52].

2.3 Efecte fiziologice ale oxidului nitric. Pe lng efectul cunoscut de a produce vasodilataie,oxidul nitric mai are i alte efecte fiziologice n organism.Este vorba de implicarea n apoptoz,rolul n relaie cu sistemul imunitar,sistemul nervos,relaxarea muchiilor netezi,angiogenez i sarcin[44,45,46].

2.3.1 Rolul imunitar al O. Macrofagele activate prin aciunea citokinelor pot produce oxid nitric n concentraie mare pentru ca acesta s acioneze asupra celulelor int,cum ar fi de exemplu celulele tumorale sau bacteriile.Oxidul nitric acioneaz n celulele int prin interaciunea cu ciclul Krebs,ntrerupnd sinteza ADN-ului i perturbnd funcia mitocondriilor[49].

2.3.2 Aciunea asupra musculaturii netede. NO relaxeaz musculatura neted a tractului gastrointestinal,astfel contribuind la buna desfaurare a micrilor peristaltice intestinale.Deficitul de oxid nitric la acest nivel este implicat 18

Capitolul 2

Oxidul nitric

n anumite afeciuni care se manifest prin lisa peristaltismului normal,ca de exemplu boala Hirschprung,achalazia, sau pseudoobstrucia cronic intestinal[44,45].

Oxidul nitric are rol de inhibitor al contraciei la nivelul musculaturii uterine.Astfel,la apropierea momentului naterii,secreia de NO scade[48].

2.3.3 Oxidul nitric i inflamaia Inflamaia n vasele de snge este inhibat prin aciunea NO produs de eNOS de a opri exocitoza de mediatori ai inflamaiei din celulele endoteliale.Exocitoza din alte tipuri de celule,cum ar fi limfocitele T ar putea s fie i ea blocat prin intervenia NO[47].

Oxidul nitric poate aciona i ca mediator n anumite procese inflamatorii,prin stimularea efectelor ciclooxigenazelor i stimularea produciei de eicosanoizi pro-inflamatorii.Anumii factori cu implicare n procesul inflamator,cum sunt interferonul gamma,interleukinele,alfa-TNF i LPS(factor de virulen bacterian proinflamator) pot stimula producia de NO prin intermediul iNOS[47].

2.3.4 O i efetele sale asupra sistemului nervos. La nivelul sistemului nervos,oxidul nitric are rolul de transmitor de semnal al neuronilor nonadrenergici i noncolinergici.n accidentele vasculare se pare c prezena de NO n exces contribuie la afectarea neuronal ce apare ca i consecin a AVC[42].

Unii neuroni parasimpatici de tip motor folosesc i ei NO ca i neurotransmitor,mediind probabil aciunile NO care influeneaz erecia sau peristaltismul intestinal[48].

Hemoglobina transport NO deodat cu oxigenul,descrcarea lor n esuturi avnd loc simultan.Celulele medullei oblongata reacioneaz n cazul scderii severe a aportului de oxigen,datorit sensibilitii lor la oxidul nitric,cauznd o respiraie cu frecven si amplitudine mrite[49].

S-au efectuat studii experimentale pe animale de laborator pentru a se vedea ce efect are oxidul nitric asupra creierului.S-a demonstrat astfel legtura dintre NO i stimularea receptorilor NMDA implicai n nvare i memorare.La nivelul sinapselor NO poate s i augmenteze efectul,deorece eliberarea sa ntr-o sinaps afecteaz i sinapsele din vecintate.La obolanii

19

Capitolul 2

Oxidul nitric

crora le-au fost inoculai inhibitori ai NOS s-au vzut ncetiniri ale achiziiei rspunsului condiionat[50].

2.3.5 Importana O n uciderea germenilor patogeni NO contribuie la uciderea agenilor patogeni n lizozomii macrofagelor.La oarecii crora le-a fost sistat abilitatea de a sintetiza NO n macrofage s-a descoperit creterea susceptibilitii la infecii produse de bacterii intracelulare.Celulele t-helper de tip 1 au proprietatea de a secreta oxid nitric[62].

Bacteriile comensale din faringe transform nitraii ingerai prin hran n nitrii.n stomac,cu ajutorul sucului gastric din aceti nitrii este generat NO,care distruge aproape n totalitate bacteriile din hran[64,65].

2.3.6 O i longevitatea Att deficiena ct i excesul de oxid nitric sunt duntoare bunei funcionari a organismului,avnd implicri n multiple stri patologice.Tonusul vascular este influenat puternic de nivelul oxidului nitric,un deficit n acest sens fiind asociat hipertensiunii.Funcia endotelial anormal are i ea printre manifestri un nivel sczut al NO,iar aceast disfuncie endotelial apare n patologiile aterogene:hipertensiune,diabet zaharat,hiperlipidemii[47].

Nitraii exogeni sunt folosii n terapia afeciunilor coronariene.Este vorba de nitroglicerin,isosorbid dinitrat i mononitrat,sau nitroprusiat care sunt toate metabolizate n oxid nitric.Din punctul de vedere al aparatului respirator oxidul nitric poate fi folosit n tratamentul hipertensiunii pulmonare persistente a nou-nscutului,la concentraii de 10-40 ppm.De

asemenea i-ar putea demonstra utilitatea n tratamentul vasoconstriciei pulmonare din hernia diafragmatic concenital,hipertensiunea pulmonar primar sau sindromul de detres respiratorie.Trebuie ns acionat cu grij deoarece inhalarea NO n concentraii mai mari poate fii toxic[39].

20

Capitolul 2

Oxidul nitric

n concluzie,oxidul nitric a fost demonstrat a fii un transmitor endogen care ndeplinete diferite roluri fiziologice.Asta n ciuda faptului c pentru mult timp oxidul nitric a fost considerat a fi un produs nociv de combustie[48].

Se efectueaz n prezent cercetri privitoare la reglarea secreiei de NO i a sintetazelor sale(NOS),iar concluziile acestora ar trebui s duc la completarea cunotinelor referitoare la rolul jucat de oxidul nitric n patogeneza a diferite afeciuni.Studiul oxidului nitric se poate dovedi eficient i n nelegerea rolului jucat de alte micromolecule ce funcioneaz ca biotransmitori[37].

2.4 Implicarea oxidului nitric n fiziopatologia neoplaziilor. Toate cele trei tipuri de NOS au fost detectate n celulele tumorale n cursul diverselor studii,dar rolul oxidului nitric n biologia tumoral nu este nc nici pe departe complet elucidat[46].

Dintre efectele oxidului nitric activitatea citotoxic a acestuia i participarea la neoformaia vascular au importan n biologia neoplaziilor.Angiogeneza este un proces de maxim importan pentru cretere i dezvoltarea neoplaziilor,n timp ce efectul citotoxic al oxidului nitric poate contribui la eradicarea celulelor tumorale care apar n organism[46].

Cercetrile efectuate au relvat att efecte de promovare ct i efecte inhibitorii asupra dezvoltri cancerelor.Mutaiile antioncogenei p53 au efecte adverse asupra organismului gazd prin creterea produciei de NO.Exist i o ipotez conform creia oxidul nitric ar induce mutaii ale oncogenelor myc i p21 iar astfel ar ajuta la progresia tumoral[61,63].

ns s-au descoperit i efecte antitumorale al NO,care ar produce moartea celulelor tumorale prin citotoxicitatea sa.Mecanismele posibil implicate n acest proces sunt afectarea direct a ADN-ului,inhibarea sintezei de ADN,inhibiia ribonucleotid-reductazei i alte efecte toxice intracelulare[67].

Prima form de NOS implicat n uciderea celulelor canceroase mediat de macrofage a fost iNOS.iNOS a fost detectat mai ales n macrofagele peritumorale i intratumorale.De asemenea eNOS a fost descoperit n cancerul de sn invaziv.Este posibil ca oxidul nitric generat prin activarea eNOS s contribuie la supravieuirea celulelor neoplazice n diferite condiii de 21

Capitolul 2

Oxidul nitric

stres,ca de exemplu hipoxia.Prezena oxidului nitric i a NOS a mai fost demonstrat i n cazul altor localizri,de exemplu:carcinomul ductal,de colon,de creier,al capului i gtului,carcinomul cu celule renale,cancerul esofagului,pulmonar,de vezic,prostat,gastric sau cel cu localizare ginecologic[59].

Cercetrile n domeniul cancerului de cap i gt s-au concentrat pe carcinomul epitelial scuamos din aceast localizare.Cercetrile lui Rosbe au demonstrat prezena izoformelor de NOS la acest carcinom,iar Brennan a descoperit o exprimare crescut a iNOS n aceste tumori.Gallo a efectuat cercetri pe acelasi tip de carcinom,concluzionnd existena unui rol important al iNOS generator de NO pentru angiogeneza tumoral i de aemenea i pentru metastazare[59].

Expresia diferitelor NOS este crescut att n tumori benigne(adenom pleomorf) ct i n tumori maligne(adenocarcinoame).n cancerul oral invaziv s-a sugerat existena unui rol al iNOS n transformarea malign al displaziei epiteliale[59].

n cancerul colorectal s-a constatat o cretere a exprimrii iNOS n comparaie cu mucoasa normal,existnd de asemenea o corelaie ntre acest nivel crescut al iNOS i metastazarea tumorei.Cercetrile lui Ahn i Oshima au demonstrat o relaie cauz-efect specific ntre creterea exprimrii genei pentru iNOS i cancerul colorectal.Tumorile derivate din adenocarcinoame colorectale modificate n laborator pentru a produce continuu oxid nitric au o vascularizaie evident mai bogat i sunt mai invazive dect celelalte[23,25].

n legtur cu neoplaziile,oxidul nitric prezint aadar un caracter dual.Aceast molecul are att rol de promoie tumoral ct i de inhibiie a dezvoltrii neoplaziei.Se pare c apariia unuia sau altuia dintre aceste efecte este n relaie direct cu concentraia NO[59].

La concentraii crescute oxidul nitric inhib creterea i proliferarea tumoral,n timp ce prezena unor concentraii sczute ale oxidului nitric creterea cancerului este stimulat[61].

Supraproducia de NO endogen ar cauza citotoxicitate la nivelul tumorei,ar induce apoptoza celulelor canceroase i ar avea rol de prevenie a angiogenezei tumorale.n schimb oxidul nitric produs n microambientul tumorei,n concentraie mult mai mic,joac un rol important n angiogeneza tumoral i dilatarea vaselor de snge care deservesc tumora[61].

22

Capitolul 2

Oxidul nitric

Reglarea creterii tumorii,care se poate face fie de ctre oxidul nitric nsui,precum i printr-un inhibitor al producerii sale ar putea aduce beneficii utile pentru eficiena terapiei anticancerose[59,64].

23

Capitolul 3
Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

24

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

3.1 Scopul studiului Interesul pentru studiul stresului oxidativ a crescut exponenial n ultimele dou decade,unul dintre motive fiind acela c efecele speciilor reactive ale oxigenului sunt duale,pe de o parte benefice iar pe de alt parte duntoare. Efectele benefice sunt determinate de implicarea speciilor reactive de oxigen n fiziologia celular ca rspuns la hipoxie.Efectele nocive ale speciior reactive de oxigen sunt determinate de ctre producerea lor n exces,ceea ce induce leziuni moleculare i celulare. n condiii fiziologice,efectele nocive sunt contracarate de ctre aciunea substanelor cu rol antioxidant. n condiii patologice,cel mai studiat efect al speciilor reactive ale oxigenui este efectul mutagen,deoarece acesta poate s fie un bioindicator al carcinogenezei.Una dintre etapele critice ale oncogenezei este reprezentat de ctre mutaiile survenite n ADN.Se pare c leziunile oxidative ale ADN sunt legate de iniierea transformrilor maligne. Un alt mecanism de implicare a speciilor reactive ale oxigenului n cancerogenez este reprezentat de ctre implicarea lor n semnalizare,pe calea proliferrii celulare. n concluzie,leziunile,mutaiile i alterarea expresiei genice din ADN reprezint procese cheie n fiziopatologia cancerogenezei. Stresul oxidativ este implicat de asemenea i n tratamentul neoplaziilor,prin toxicitatea indus n timpul radioterapiei. Avnd toate acestea n vedere,studiul de fa i-a propus determinarea unor parametrii de stres oxidativ la pacienii cu cancer colorectal operat,nainte i dup tratamentul combinat constnd n radioterapie i chimioterapie,pentru a evalua dac aceti parametri pot s fie utilizai ca parametri de screening n monitorizarea postchirurgical.

3.2 Materiale i metode 3.2.1 Grupurile de studiu Sngele recoltat pe anticoagulant EDTA a fost a fost centrifugat la 5000g X min, timp de 10 minute. Supernatantul a fost prelevat i pstrat la -80C pn la citirea probelor. Pacienii inclui n grupul de studiu au fost selectai pe baza criteriilor de includere respeciv de excludere:

25

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Criterii de includere: pacieni diagnosticai cu cancer gastric confirmat la Institutul Oncologic Profesor Doctor I. Chiricu, Cluj Napoca, n stadiul postoperator.

pacieni care au urmat radioterapie i chimioterapie; radioterapia s-a efectuat folosind acceleratorul liniar n doze de 50 Gray administrate n 25 de fraciuni i chimioterapia a constat n administrarea de acid folinic i 5 fluoro-uracil

consimmntul informat al pacienilor de a fi inclui n lotul de studiu acordul Comisiei de Etic al Universitii de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu, Cluj Napoca

Criterii de excludere: cancer colorectal inoperabil refuzul pacienilor de a participa n studiu boli sistemice grave ( colagenoze, hepatite cronice, ciroze, insuficien renal, insuficien cardiac, deficite imune) alte tipuri de neoplazii tratamente ce pot influena stressul oxidativ i sinteza de oxid nitric

Conform acestor criterii au fost selecionai 30 de pacieni. 3.2.2 Reactivii folosii. Sulfat de amoniu feros, orto-dianisidin dihidroclorhidrat ( 3-3V-dimetoxibenzidina, analogol hidrosolubil al vitaminei E ( Trolox; 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acid carboxilic) a fost de la Sigma-Aldrich Chemical Co. Toate chimicalele au fost de grad ultra pur i s-a folosit reactiv de tip I ap deionizat. Trolox-ul a fost dizolvat n tampon de fosfat ( 10mm, pH 7,4 ).Xylenol orange [ ocresosulfonftaleina-3,3-bis (metiliminodiacetat de sodiu )], diclorhidrat de orto dianisidin ( 3-3'-dimetoxibenzidin), sulfat feros de amoniu, hidrogen peroxid ( H2O2), acid sulfuric, acid clorhidric, glicerol, au fost achiziionate de la Sigma Co. i Meck Co. Toate chimicalele au fost de grad ultra pur i s-a folosit reactiv de tip I ap deionizat.

26

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

3.2.3 Determinarea nitriilor Serul, prelevat de la pacieni, a fost deproteinizat nainte de analiza metabolitului NO. Deproteinizarea s-a fcut cu un amestec de metanol/dietileter. Dup deprotenizare serul a fost centrifugat 10 minute la 5000 Xg i supernatantul a fost utilizat pentru determinarea nitriilor i nitrailor serici.

Nivelurile de nitrat/nitrit au fost msurate folosind metoda Griess. Pe scurt, 100l de VCl3 au fost adugai la 100l de prob, urmat imediat de adugarea reactivului Griess ( 50l sulfanilamid + 50l dihidroclorid de etilendiamin). Dup ce au fost inute 30-45 min la temperatura camerei, la ntuneric, a fost msurat absorbia la 540nm cu ajutorul unui spectrofotometru (CECIL 3021). [ ] Calcularea concentraiei de nitrii i nitrai s-a fcut

utiliznd o curb standard obinut prin diluii succesive de nitrit de sodiu i s-a exprimat n milimol/L.[68]

Curba standard pentru nitrii

27

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

3.2.4 Determinarea rspunsului antioxidativ total (TAR). Principiul metodei O soluie standard a unui complex de Fe2+ i o-dianisidin reaconeaz cu o soluie standard de hidrogen peroxid ( H2O2) printr-o reacie de tip Fenton, rezultnd ionul OH-. Acesta oxideaz moleculele de o-dianisidin la culoarea galben-maronie a radicalilor dianisidil la pH sczut[69].

Reacia de oxidare progreseaz ntre radicalii dianisidil i se dezvolt n continuarea reacii de oxidare. Antioxidanii din probe supreseaz reaciile de oxidare i formarea culorii. Aceste reacii pot fi monitorizate prin spectrofotometrie(tabel III)[69]. Reactivii metodei:

Reactivul 1 Soluia Clark i Lubs ( 75 mM, pH 1,8 ) a fost preparat dup cum urmeaz: 5.591 g de KCl a fost dizolvat n 1000 ml de ap deionizat (concentraia final a fost de 75 mM). Gradul de reactiv de reactiv acid clorhidric ( 36,5%, 6,41 ml) a fost diluat cu 1000 ml cu ap deionizat ( concentraie final, 75mM). Soluia preparat de KCl (800 ml) a fost amestecat cu 200 ml soluie de HCl sub un pH metru (pH final, 1,8). Diclorhidratul de ortodianisidin (3,17 g) a fost dizolvat n aceast soluie (concentraia final a fost de 10.0 mM), i ulterior 0.01764 g de Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O a fost dizolvat n aceast soluie (concentraia final, 45 AM). (ATENIE: o-dianisidina este o substan demonstrat toxic i carcinogenetic. Asigurai-v c folosii mnui de cauciuc i purtai masc facial n momentul manipulrii acestei substae.). Reactivul astfel preparat a fost folosit ca Reactiv 1 n textul testului. Acest reactiv este stabil pentru cel puin 6 luni la 4C.

Reactivul 2 Soluia de hidrogen peroxid (7,5 mM) a fost preparat dupa cum urmeaz: 0,641 ml soluie de H2O2 comercial (35%, Merck) a fost diluat n 1000 ml cu soluie Clarck and 28

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Lubs. Concentraia de hidrogen peroxid a fost confirmat spectrofotometric prin absorbie la 240nm. Aceast soluie este stabil pentru cel putin 1 lun la 4C. Tabelul III Volumul reactivului 1 Volumul probei Volumul Reactivului 2 Lungimea de und 444 nm Msurarea la punctul de sfrit. Prima absorbie este luat inainte amestecarea R1 cu R2 (ca prob control) i ultima absorbie este Punctul de citire luat cnd reacia ajunge la o linie de platou (aproape 3-4 min dup amestecare) 800 l [reactiv 1: o-dianisidin(10 mM),ionul feros (45 AM) n soluia Clarck i Lubs (75 mM, pH 1,8)] 29 l (ser sau alte fluide, pure sau soluii de complexe de antioxidani) 40 l [reactivul 2: H2O2 (7,5 mM) n soluia Clarck i Lubs]

Tipul de calibrar

Linear

Rezultatele se exprim raportat o curb standard trasat cu diluii consecutive de trolox (milimol trolox Equiv./L).

Curba standard trasat cu trolox

29

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

3.2.5 Determinarea statusului oxidativ total . Principiul metodei: Oxidanii prezenti n probe oxideaz complexul ion feros-o-dianisidin la ion feric. Reacia de oxidare este consolidat de moleculele de glicerin, care sunt prezente din abunden n mediul de reacie. Ionul feric formeaz un complex colorat cu xylenol orange ntr-un mediu acid. Intensitatea culorii, care poate fi determinat spectrofotometric(tabel IV), este legat de cantitatea total de molecule de oxidani prezente n probe. Evaluarea se calibreaz cu ap oxigenat i rezultatele se exprim n uniti micromolare de echivaleni/litru de ap oxigenat (mol H2O2 Equiv./L)[69]. Reactivii folosii:

Reactivul 1 Reactivul 1 a fost preparat prin dizolvarea 114 mg de xylenol orange i 8,18 g de NaCl n 900 mL de soluie de H2SO4, ,25 mM. 100 ml de glicerol au fost adugai n soluie. Reactivul final a fost compus din 150 M xilenol orange, 140 mM NaCl i 1,35 M glicerol. Valoarea pH-ului reactivului este stabil cel puin 6 luni la 4 grade Celsius..

Reactivul 2 Reactivul 2 a fost preparat prin dizolvarea a 1,96 g de sulfat de amoniu feros i 3,17 g de diclorhidrat de o-dianisidin n 1000ml de soluie de H2SO4, 25 mM. Reactantul final a fost constituit din 5 mM sulfat de amoniu feros i 10 mM diclorhidrat de o-dianisidina. Acest reactiv este stabil pentru cel puin 6 luni la temperatura de 4 grade Celsius.

30

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale Tabel IV

Volumul reactivului 1 Volumul probei Volumul reactivului 2 Lungimea und

900l (reactivul 1: xilenol orange 150M, NaCl 140 mM i glicerol 1,35 M n 25 mM de soluie de H2SO4 , pH 1,75) 140 l (ser sau alte fluide, pure sau soluii de complexe de antioxidani)

44 l (reactivul 2: ion feros 5mM i 10 mM o-dianisidina n 25 mM de soluie de H2SO4 de Principala lungime de und 560 nm, secundara lungime de und 800 nm (Biocromatic) Msurarea la punctul de sfrit. Prima absorbie este luat inainte amestecarea R1 cu R2 (ca prob control) i ultima absorbie este luat

Punctul de citire

cnd reacia ajunge la o linie de platou (aproape 3-4 min dup amestecare)

Tipul calibrare

de Linear

3.2.6 Indicele de stres oxidativ. Un alt parametru calculat a fost OSI(indicele de stres oxidativ).Acesta se calculeaz fcnd raportul dintre capacitatea oxidativ total i capacitate antioxidativ

total(TOS/TARx100)[69].

3.2.7 Analiza statistic. Toate rezultatele au fost exprimate ca medii SEM. Comparaia loturilor a fost efectuat cu testul ANOVA. O valoare p mai mic dect 0.05 a fost considerat a fi semnificativ. Analiza corelaiilor dintre parametrii s-a realizat cu testul Pearson. Analiza statistica a fost relizat cu programul SPSS 18.0[69].

31

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

3.3 Rezultate.

3.3.1 Analiza demografic a pacienilor. n lotul de studiu au fost selecioni conform criteriilor de includere/excludere treizeci de pacieni cu cancer colorectal operat dintre care treisprezece au fost femei iar aptesprezece brbai.Pentru fiecare parametru studiat grupul a fost submprit n funcie de sex i categorii de vrst.

Dei numrul pacieniilor din subgupe nu a fost statistic semnificativ,fiind sub 30 de pacieni/subgrup,am fcut o analiz preliminar i a acestor subgrupe.(Tabel 3.1)

Nr pacieni total 40-50 ani 50-60 ani 60-70 ani 70-80 ani

Tabel 3.1 Datele demografice ale lotului de studiu TOTAL FEMEI/BRBAI 30 13/17 6 2/4 7 3/4 11 3/8 6 2/4

3.3.2 Analiza general a lotului de studiu. La pacienii din grupul de studiu,statusul oxidativ total(TOS) a sczut foarte semnificativ dup tratamentul combinat,radioterapie i chimioterapie(p0,01)(fig 3.3.1).

32

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Statusul oxidativ total


300 micromoliH2O2equiv./L 250 200 150 100 50 0 TOS1 TOS2 p<0,001

Figura 3.3.1 Statusul oxidativ total Rspunsul antioxidativ total(TAR) al pacienilor din studiu nu a fost influenat semnificativ de ctre terapia combinat(p0,05)(fig 3.3.2).

Rspunsul antioxidativ total


0,3 milimoli Trolox Equiv./L 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 TAR1 TAR2

p>0,05

Figura 3.3.2 Rspunsul antioxidativ total

33

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

La pacienii din lotul de studiu indicele de stres oxidativ(OSI) a sczut semnificativ dup tratament(p0,001,fig 3.3.3)

Indicele de stres oxidativ


16 14 12 10 8 6 4 2 0 OSI1 OSI2 p<0,001

Figura 3.3.3 Indicele de stres oxidativ

Oxidul nitric total


116 114
micromoli/L

112 110 108 106 104 102 GRIESS1

p<0,01

GRIESS2

Figura 3.3.4 Oxidul nitric total

34

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Cantitatea de nitrii i nitrai serici ai pacieniilor din studiu au sczut semnificativ dup radioterapie i chimioterapie(p0,001)(fig 3.3.4).

Corelaiile dintre cei trei parametri au fost nesemnificative att nainte ct i dup tratament(r0,5).

3.3.3 Analiza sublotului de femei

La grupul de femei semnificativ(p0,001)(fig 3.3.5).

din studiu statusul oxidativ total a sczut foarte

Status oxidativ total-feminin


350 300 micromoliH2O2Eq./L 250 200 150 100 50 0 TOS1 TOS2 p<0,001

Figura 3.3.5 Statusul oxidativ total la femei

La femeile din grupul de studiu,rspunsul antioxidativ total nu s-a modificat semnificativ(p0,05)(fig 3.3.6).

35

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Rspuns antioxidativ total feminin


0,25 0,2 p>0,05 0,15 0,1 0,05 0 TAR1 TAR2

Figura 3.3.6 Rspusul antioxidativ total la sexul feminin

mmoli Trolox eq./L

n cazul pacienilor din sublotul de sex feminin nivelul indicelui de stres oxidativ a nregistrat o scdere semnificativ(p0,001,fig 3.3.7)

Cantitatea total de nitrai i nitrai la pacienii de sex feminin a crescut uor dup tratamentul combinat radioterapie i chimioterapie(p0,05)(fig 3.3.8).

36

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Indicele de stres oxidativ-feminin


25 20 15 10 5 0 OSI1 OSI2

p<0,001

Figura 3.3.7 Indicele de stres oxidativ-feminin

Oxidul nitric total-feminin


113 112,5 112 111,5 111 110,5 110 109,5 109 108,5 108 107,5 GRIESS1

micromoli/L

p<0,05

GRIESS2

Figura 3.3.8 Oxidul nitric total la sexul feminin

37

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Corelaii semnificative s-au sesizat doar nainte de tratament ntre statusul oxidativ total i cantitatea total de nitrai i nitrii(r=-0,77).

3.3.4 Analiza sublotului de brbai La sublotul de brbai statusul oxidativ total a sczut foarte semnificativ dup tratamentul combinat radioterapie i chimioterapie.(p0,001)(fig 3.3.9)

Statusul oxidativ total-masculin


350
micromolimoli H2O2 Eq/L

300 250 200 150 100 50 0 TOS1 TOS2 p<0,001

Figura 3.3.9 Statusul oxidativ total la brbai

Rspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificri semnificative din punct de vedere statistic la pacienii de sex masculin participani la studiu.(p0,05)(fig 3.3.10).

La pacienii de sex masculin indicele de stres oxidativ(OSI) s-a diminuat semnificativ dup tratamentul combinat radioterapie i chimioterapie(p0,001,fig 3.3.11).

38

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Raspunsul antioxidativ total-masculin


0,35 0,3 mmoli Trolox Eq/L 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 TAR1 TAR2 p>0,05

Figura 3.3.10 Rspunsul antioxidativ total la brbai

Indicele de stres oxidativ-masculin


14 12 p<0,001 10 8 6 4 2 0 osi1 osi2

Figura 3.3.11 Indicele de stres oxidativ-masculin

39

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

n ceea ce privete cantitatea de nitrii i nitrai s-a nregistra o reducere uoar a cantitii acestora dup tratamentul combinat.(p0,05)(fig 3.3.12).

Oxidul nitric total-masculin


140 120
micromoli/L

100 80 60 40 20 0 GRIESS1

p<0,05

GRIESS2

Figura 3.3.12 Oxidul nitric total la brbai

Nu au existat corelaii semnificative ntre cei trei parametri la sublotul de brbai,nici nainte i nici dup tratament.( r0,5).

40

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

3.3.5 Analiza pe grupe de vrst

3.3.5.1 Grupa 40-50 de ani La pacienii cu vrste cuprinse ntre 40 i 50 de ani statusul oxidativ total a sczut semnificativ dup efectuarea tratamentului combinat(p0,001)(fig 3.3.13).

Rspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificri semnificative dup tratament la pacienii cu vrstele cuprinse n intervalul 40-50 de ani(p0,05)(fig 3.3.14).

Status oxidativ total 40-50 ani


600 micromoliH2O2 Eq/L 500 400 300 200 100 0 TOS1 TOS2

Figura 3.3.13 Statusul oxidativ total 40-50 de ani

41

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Raspuns antioxidativ total-40-50 ani


0,3 0,25
mmoli Trolox Eq/L.

0,2 0,15 0,1 0,05 0 TAR1

p>0,05

TAR2

Figura 3.3.14 Rspuns antioxidativ total 40-50 de ani n cazul pacienilor fcnd parte din grupa de vrst 40-50 de ani am avut de-a face cu un nivel semnificativ mai sczut al indicelui de stres oxidativ(OSI)(p0,001)(fig 3.3.15)

Indicele de stres oxidativ 40-50 ani


30 25 20 15 10 5 0 osi1 osi2 p<0,001

Figura 3.3.15 Indicele de stres oxidativ la 40-50 de ani

42

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Oxidul nitric total-40-50 ani


140 120
micromoli Eq/L.

100 80 60 40 20 0 GRIESS1

p<0,05

GRIESS2

Figura 3.3.16 Oxidul nitric total 40-50 de ani Nitriii i nitraii au nregistrat o cretere uor semnificativ la aceast categorie de vrst.(p0,05)(fig 3.3.16)

n ceea ce privete corelaiile dintre parametri nainte de tratament acestea au fost nesemnificative din punct de vedere statistic(r0,5),iar dup tratament ntre TOS i

TAR(r=0,84) i ntre TAR i GRIESS(r=0,68) corelaiile au fost semnificative.

3.3.5.2 Grupa 50-60 de ani La pacienii cuprini n studiu a cror vrst a fost cuprins ntre cincizezi i aizeci de ani statusul oxidativ total a prezentat o scdere uor semnificativ dup tratamentul oncologic.(p0,05)(fig 3.3.17).

Rspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificri semnificative la aceast grup de vrst dup tratamentul combinat radioterapie i chimioterapie(p0,05)(fig 3.3.18).

43

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Statusul oxidativ total 50-60 ani


250
micromoli H2O2 Eq/L.

200 150 100 50 0 TOS1 TOS2 p<0,05

Figura 3.3.17 Statusul oxidativ total 50-60 de ani

Raspunsul antioxidativ total 50-60 ani


0,35 0,3
mmoli Trolox Eq/L.

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 TAR1 TAR2 p>0,05

Figura 3.3.18 Rspunsul antioxidativ total 50-60 de ani Pacienii din grupa de vrst 50-60 de ani au prezent din punct de vedere al indicelui de stres oxidativ o scdere semnificativ din punct de vedere statistic(p0,01)(fig 3.3.19). 44

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Indicele de stres oxidativ 50-60 ani


12 10 8 6 4 2 0 OSI1 OSI2 p<0,01

Figura 3.3.19 Indicele de stres oxidativ 50-60 de ani

Oxidul nitric total 50-60 ani


108,7 108,65
micromoli/L.

108,6 108,55 108,5 108,45 108,4 GRIESS1

p>0,05

GRIESS2

Figura 3.3.20 Oxidul nitric total 50-60 de ani n cazul acestei categorii de vrst nitriii i nitraii totali nu au prezentat modificri semnificative din punct de vedere statistic.(p0,05)(fig 3.3.20). 45

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Din punct de vedere al corelaiilor,acestea nu au fost semnificative nainte de tratament(r0,5).Dup tratament ns TOS i TAR(r=0,6) i GRIESS i TAR(r=-0,6) s-au corelat uor semnificativ.

3.3.5.4 Grupa 60-70 de ani La pacienii aparinnd grupei de vrst 60-70 de ani statusul oxidativ total a prezentat o scdere foarte semnificativ dup tratamentul combinat(p0,001)(fig 3.3.21).

La aceiai pacieni rspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificri importante(p0,05)(fig 3.3.22).

Statusul oxidativ total 60-70 ani


250
micromoli H2O2 Eq/L

200 150 100 50 0 TOS1 TOS2

Figura 3.3.21 Statusul oxidativ total 60-70 ani

46

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Raspunsul antioxidativ total 60-70 ani

0,3
mmoli Trolox Eq/L.

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 TAR1 TAR2 p>0,05

Figura 3.3.22 Rspunsul antioxidativ total 60-70 de ani

La pacienii din ncadrai n categoria 60-70 de ani indicele de stres oxidativ(OSI) a prezentat o scdere semnificativ(p0,01)(fig 3.3.23)

Indicele de stres oxidativ 60-70 de ani


14 12 10 8 6 4 2 0 OSI1 OSI2 p<0,01

Figura 3.3.23 Indicele de stres oxidativ 60-70 de ani 47

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Oxidul nitric total 60-70 ani


118 116 114
micromoli/L.

p<0,05

112 110 108 106 104 102 GRIESS1 GRIESS2

Figura 3.3.24 Oxidul nitric total 60-70 de ani Cantitatea de nitii i nitrai serici la aceast grup de vrst a sczut uor semnificativ din punct de vedere statistic dup terapie.(p0,05)(fig 3.3.24).

La grupa de vrst 60-70 de ani corelaiile au fost nesemnificative din punct de vedere statistic att nainte ct i dup tratament(r0,5).

3.3.5.4 Grupa 70-80 de ani n cazul pacienilor din lotul de studiu cu vrsta cuprins ntre 70 i 80 de ani statusul oxidativ total s-a modificat foarte semnificativ dup tratamentul oncologic,prezentnd o important scdere(p0,001)(fig 3.3.25).

Cu privire la rspunsul antioxidativ total putem afirma c acesta nu a prezentat modificri semnificative dup terapie.(p0,05)(fig 3.3.26).

48

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Statusul oxidativ total 70-80 ani


450 400
micromoli H2O2 Eq/L.

350 300 250 200 150 100 50 0 TOS1 TOS2 p<0,001

Figura 3.3.19 Statusul oxidativ total 70-80 de ani

Raspunsul antioxidativ total 70-80 ani


0,3 0,25
mmoli Trolox Eq/L.

0,2 0,15 0,1 0,05 0 TAR1

p>0,05

TAR2

Figura 3.3.20 Rspunsul antioxidativ total 70-80 de ani

49

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

n ceea ce privete grupa de vrst 70-80 de ani,pacienii aparinnd aici au prezentat un nivel semnificativ sczut al indicelui de stres oxidativ(OSI)(p0,01)(fig 3.3.27)

Indicele de stres oxidativ 70-80 ani


18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 OSI1 OSI2 p<0,01

Figura 3.3.27 Indicele de stres oxidativ 70-80 ani

Oxidul nitric total 70-80 ani


160 140 120
micromoli/L.

p>0,05

100 80 60 40 20 0 GRIESS1 GRIESS2

Figura 3.3.28 Oxidul nitric total 70-80 de ani Nitriii i nitraii totali nu s-au modificat semnificativ la categoria de vrst peste 70 de ani n urma terapiei combinate(p0,05)(fig 3.3.28). 50

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

nainte de terapia combinat radioterapie i chimioterapie au existat corelaii semnificative statistic ntre TOS i GRIESS(r=-0,92).Dup tratamentul combinat au existat corelaii ntre GRIESS i TAR(r=0,79).

3.4 Discuii Rezultatele obinute n urma studiului efectuat au relevat faptul c statusul oxidativ total a prezentat o scdere semnificativ dup asocierea tratamentului combinat radioterapie i chimioterapie la tratamentul chirurgical.Avnd n vedere faptul c rolul TOS este de a aprecia n ansamblu toi produii oxidai ca urmare a stresului oxidativ,scderea TOS reprezint un indice global de reducere a stresului oxidativ,fr a ne oferi indicaii particulare asupra componentei specifice care a determinat aceast scdere[74].

Este important de semnalat faptul c scderea TOS a fost prezent la toi pacienii care au fost luai n studiu,indiferent de modul n care au fost acetia grupai ,indiferent de grupa de sex sau vrst din care au fcut parte[77].

Datele din literatur referitoare la implicarea speciilor reactive ale oxigenului n patologie au evideniat caracterul dual al acestora n ceea ce privete implicarea lor n cancerogenez[77].

Pe de o parte speciile reactive ale oxigenului(ROS) formate intracelular pot s acioneze ca mesageri secundari care induc i menin fenotipul oncogenic la nivelul celulelor de tip canceros[77].

Pe de alt parte,referitor la aceleai specii reactive ale oxigenului s-a constatat c pot induce apoptoza la nivel celular i astfel pot s aib i un rol de oprire a proliferrii tumorale[76,77].

Se pare c cele dou efecte contradictorii ale speciilor reactive ale oxegenului n relaie cu proliferarea tumoral depind de balana ROS i momentul n care are loc aciunea lor raportat la stadiul oncogenezei[77]. 51

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

S-a constatat c o cretere a stresului oxidativ raportat la momentul oncogenezei poate s determine cel puin trei tipuri de rspuns.O cretere uoar a stresului oxidativ poate avea un efect adjuvant asupra proliferrii tumorale.Dac apare o cretere moderat este posibil apariia mutagenezei,iar o cretere marcat a stresului oxidativ poate produce un efect de stimulare a apoptozei i a necrozei celulare(fig3.4.1)[77].

Figura 3.4.1 ivelul SO n relaie cu oncogeneza[77]

Principalele mecanisme identificate ca avnd o implicare n efectul procarcinogen al speciilor reactive ale oxigenului ar fi prima dat efectul mutagen care este produs prin modificri produse de ROS la nivelul ADN.Pe lng efectul mutagen pe ADN speciile reacive ale oxigenului(ROS) mai acioneaz i prin reacii cu speciile reactive ale azotului(RNS).Din aceste reacii se formeaz peroxinitriii,care la rndul lor sunt impicai n modificri la nivelul ADN producnd mutaii[74].

52

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Speciile reactive ale oxigenului mai sunt de asemenea implicate n carcinogenez prin reacia de peroxidare a lipidelor.Odat trecute prin acest proces,lipidele peroxidate pot avea i ele efect mutagen.Acesta este practic un efect mutagen indirect al ROS[77].

Pe lng aceste mecanisme prin care ROS sunt implicate n oncogenez mai exist implicri ale stresului oxidativ i n etapa terapeutic.Radioterapia poate s fie de asemenea un mecanism de cretere a produciei de specii reactive ale oxigenului la nivel celular[71,72].

S-a constatat c n timpul radioterapiei att celulele iradiate ct i cele neiradiate sufer modificri genetice.Printre mecanismele implicate n aceast patogenie se numr i stresul oxidativ.Producerea stresului oxidativ secundar tratamentului cancerului prin radioterapie reprezint un mecanism cu toxicitate crescut.De aceea,practic scderea nivelului speciilor libere ale oxigenului indus de radioterapie ar putea s fie o metod de protecie mpotriva efectelor secundare ale radioterapiei[70,71].

Chimioterapia are n general ca efect o cretere a stresului oxidativ cu scopul de a crete citotoxicitatea.Asocierea dintre chimioterapie i radioterapie poate genera stres oxidativ n cantiti mai mari dect necesar ,ceea ce ar induce leziuni secundare nedorite[72].

Avnd n vedere

toate acestea,evoluia stresului oxidativ nainte i dup terapia

combinat radioterapie i chimioterapie la pacienii luai n studiu reprezint un rezultat favorabil prin reducerea semnificativ a statusului oxidativ total[74].

Avnd n vedere c n stresul oxidativ efectul final este dependent de balana dintre speciile reactive ale oxigenului i mecanismele antioxidante n cadrul studiului nostru am evaluat pe lng statusul oxidativ total i rspunsul antioxidativ total(TAR).n ceea ce privete efectul rspunsului antioxidativ total n legtur cu cancerul s-a constatat c multe dintre efectele biologice ale antioxidanilor nu sunt legate doar de capacitile de neutralizare ale radicalilor liberi,ci sunt determinate de capacitatea antioxidanilor de a modula ci de semnalizare intracelular[77].

53

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Cele mai importante mecanisme intracelulare modulate de ctre substanele antioxidante n cancer sunt:-reglarea ciclului celular -inhibarea proliferrii neoplazice -inducerea apoptozei -inhibarea dezvoltrii tumorale i a angiogenezei -inhibarea inflamaiei -stimularea unor enzime de detoxifiere -blocarea NF-kB[74]

Au fost efectuate studii n cadrul crora a fost analizat specificitatea anumitor molecule antioxidante.Astfel cercetrile privind superoxid-dismutaza(SOD) au relevat faptul c aceasta nu are aciune direct,ci acioneaz indirect,prin reducerea speciilor reactive de oxigen(ROS).Alte studii efectuate au evideniat c antioxidanii cu mobilitate mic sunt ns direct implicai[77].

Implicarea substanelor cu efect antioxidant n cancer,dei iniial se considera a avea un efect antitumoral,s-a constatat c poate s fie i protumoral.Deoarece speciile reactive ale oxigenului n cantiti mari determin apoptoza celulelor tumorale,reducerea ROS prin administrarea excesiv de antioxidani poate s stimuleze supravieuirea celulelor lezate,care au potenial de proliferare neoplazic.Astfel administrarea substanelor antioxidante poate s i stimuleze cancerogeneza,n loc s o blocheze[77].

Din toate acestea putem trage concluzia c antioxidanii pot s fie utili sau nocivi,n funcie de mai muli factori.Aceti factori sunt concentraia n care se administreaz substanele antioxidante,mediul n care are loc aciunea lor i stadiul evolutiv al cancerogenezei[74].

Din acest motiv am considerat foarte util i chiar necesar s determinm i rspunsul antioxidativ total(TAR) la pacienii inclui n studiu[74,77,79].

54

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Faptul c n cadrul rezultatelor obinute la toi pacienii nu s-a nregistrat o modificare semnificatic a rspunsului antioxidativ total dup tratamentul combinat radioterapie i chimioterapie,avnd n vedere c statusul oxidativ total a nregistrat o scdere remarcabil rezultatul obinut poate fi considerat unul favorabil[74].

n acelai timp acest rezultat ne permite s afirmm c scderea statusului oxidativ total nu s-a realizat prin aciunea de neutralizare a speciilor reactive ale oxigenului(ROS) de ctre substanele cu rol antioxidant[79]. Am considerat util s calculm i valoarea indicelui de stres oxidativ(OSI) pentru lotul general de studiu,precum i pentru subcategoriile n care au fost mprii pacienii n funcie de sex i vst[80].

Scderea indicelui de stres oxidativ dup tratament la grupul total,precum i la celelalte subgrupe n funcie de sex i vrst confirm faptul c stresul oxidativ(SO) s-a redus semnificativ postterapeutic[80].

Avnd n vedere implicarea stresului oxidativ n patologie(inclusiv n fiziopatologia cancerelor colorectale) acest rezultat reprezint un element pozitiv n evoluia

postterapeutic[80].

O alt molecul implicat prin intermediul stresului oxidativ,dar i prin aciune direct n patologia cancerului este i oxidul nitric.(NO).Rolul oxidului nitric n modificarea supravieuirii tumorale este o tem destul de controversat[23,32,25,73].

S-a constatat c efectul moleculei de oxid nitric depinde de:- concentraia acesteia -localizare -momentul secreiei -tipul celular -statusul redox al celulei

Concluzia general a fost ns c cele mai importante sunt modificrile posttranslaionale induse de oxidul nitric i c oxidul nitric poate s fie un factor reglator att n cancerogenez ct i n chimioterapia neoplaziilor[73].

55

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Aceste date ne-au determinat s asociem la statusul oxidativ total(TOS) i rspunsul antioxidativ total(TAR) evaluarea sintezei de oxid nitric prin dozarea nitriilor i a nitrailor serici.

La pacienii inclui n studiu s-au nregistrat scderi semnificative a sintezei de oxid nitric.

n ceea ce privete distribuia pe sexe reducerea sintezei de oxid nitric s-a nregistrat predominant la sexul masculin.Aceasta se poate atribui faptului c majoritatea cazurilor care au participat la studiu erau pacieni de sex masculin[32].

Un alt aspect interesant a fost c la pacienii inclui n categoria de vrst 40-50 de ani s-a constatat o uoar cretere a sintezei de oxid nitric,n timp ce la grupa ntre 60 i 70 de ani s-a constatat scderea sintezei de NO.

Aceste rezultate trebuie s le interpretm cu precauie avnd n vedere numrul mic de pacieni inclui n studiu.

Studiile referitore la implicarea oxidului nitric n cancer au relevat aspecte diferite.n general concentraiile crescute ale NO produse de expresia crescut a iNOS stimuleaz apoptoza[32,34,73].

n cancerul colorectal s-a constatat un deficit de exprimare a iNOS,ceea ce produce o reducere a apoptozei i prin aceasta favorizeaz proliferarea tumoral.Pe de alt parte s-a observat c creterea sintezei de oxid nitric n celulele endoteliului vascular promoveaz angiogeneza,ceea ce ar stimula creterea tumoral i metastazarea[23,25].

Un alt mecanism indirect prin care este stimulat angiogeneza tumoral este activarea ciclooxigenazei prin aciunea peroxinitriilor formai n cadrul reaciei dintre oxidul nitric i speciile reactive libere ale oxigenului[73].

56

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Alt aspect particular care a fost constatat n cancerul colorectal a fost faptul c la pacieni diferii exist nivele diferite de sintez a oxidului nitric.Acest fapt se datoreaz polimorfismului iNOS(NOS inductibil).Au fost identificate patru feluri de iNOS prezente la pacienii cu cancer colorectal[23,25].

Aceste constatri pot explica parial diferenele prezente la lotul luat n studiu,diferene legate de sex i respectiv de vrst[23,25].

Unul din factorii de reglare ai expresiei iNOS este i hypoxia inucible factor-1(HIF1).De aceea,n perspectiv.analiza sintezei de oxid nitric n cancerul colorectal ar implica identificarea att la nivel tumoral ct i peritumoral al HIF-1,iNOS i COX[81].

O alt consecin a creterii sintezei de oxid nitric n legtur cu cancerul colorectal este reprezentat de ctre efectul pe care molecula de NO o are asupra metaloproteinazelor matriceale.Aceste enzime au proprieatea de a distruge matricea celular,prin aceasta favoriznd procesul de metastazare[82].

Avnd n vedere aceste mecanisme,scderea sintezei de oxid nitric la pacienii aflai n studiu reprezint un alt motiv de apreciere pozitiv,deoarece scderea nivelului de nitrii i nitrai ar reduce i distrucia matricei celulare prin aciunea metaloproteinazelor(MMP)[82].

57

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

Concluzii

Pe baza rezultatelor obinute n urma studiului i a datelor din literatur am ajuns la urmtoarele concluzii:

1.Terapia combinat radioterapie i chimioterapie aplicat postchirurgical n cancerul colorectal determin reducerea semnificativ a TOS(statusul oxidativ total),parametru care cuantific totalitatea moleculelor oxidate de ctre speciile reactive ale oxigenului(ROS).

2.Reducere TOS(statusul oxidati total) nu a fost influenat de sexul sau de vrsta pacienilor.

3.Terapia combinat radioterapie i chimioterapie aplicat dup tratamentul chirurgical n cancerul colorectal nu a modificat semnificativ TAR (rspunsul antioxidativ total),indiferent de sex sau grup de vrst.

4.Faptul c TAR (rspunsul antioxidativ total) nu s-a modificat semnificativ n urma tratamentului indic faptul c scderea TOS(statusul oxidativ total) nu s-a datorat neutralizrii ROS (speciilor reactive ale oxigenului )de ctre AO(antioxidani).

5.Terapia combinat radioterapie i chimioterapie care a urmat tratamentului chirurgical al cancerului colorectal a determinat o scdere semnificativ a sintezei de O(oxid nitric),ceea ce reprezint o modificare favorabil n contextul scderii TOS(statusul oxidativ total).

6.Diferenele legate de sex i grupe de vrst n ceea ce privete sinteza de

O(oxid

nitric) constatat la pacienii din grupul de studiu ar putea s fie explicat parial prin existena polimorfismului i OS.

58

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric i a stresului oxidativ n tumorile rectale

7. n ansamblu,rezultatele obinute confirm faptul c nelegerea rolului stresului oxidativ i al oxidului nitric la nivel molecular n cancerul colorectal are implicaii profunde n terapia anticanceroas,contribuind la un diagnostic i tratament patogenetic mai complex al acestuia.

59

Bibiliografie

Bibliografie
1.McPhee Stephen J, Papadakis Maxine A.,Tierney Lawrence M., Current Medical Diagnosis & Treatment 2008, 2007 The McGraw-Hill Lange-oncology 2.Moasser Mark M.,in McPhee Stephen J., Ganong, William F., Pathophysiology of Disease: An Introduction to Clinical Medicine, 5th Edition, 2006 McGraw-Hill, Neoplasia: 90-114. 3. Ciro M et al: Profiling cancer. Curr Opin Cell Biol 2003;15: 213. 4. DeVita VT et al: Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2001. 5. Eng C et al: Genetic testing for cancer predisposition. Annu Rev Med 2001;52:371. 6. Hanash S: Integrated global profiling of cancer. Nat Rev Cancer 2004;4:638. 7. Mendelsohn J et al: The Molecular Basis of Cancer, 2nd ed. WB Saunders, 2001. 8. Peltomaki P: Deficient DNA mismatch repair: A common etiologic factor for colon cancer. Hum Mol Genet 2001;10: 735. 9. Trosko J.E.,Ruch R.J., Gap junctions as targets for cancer chemoprevention and chemotherapy, Curr. Drug Target. 3 (2002) 465482. 10.Guyton K.Z., Kensler T.W., Oxidative mechanisms in carcinogenesis, Br. Med. Bull. 49 (1993) 523544. 11. Ames B.N.,Gold L.S., Too many rodent carcinogens mitogenesis increases mutagenesis, Science 249 (1990) 970971. 12. Trush M.A., Kensler T.W., An overview of the relationship between oxidative stress and chemical carcinogenesis, Free Rad. Biol. Med. 10 (1991) 201209. 13. Hengartner M.O., The biochemistry of apoptosis, Nature 407 (2000) 770776. 14. Oren M., Decision making by p53: life, death and cancer, Cell Death Differ. 10 (2003) 431442. 15. Trosko J.E., The role of stem cells and gap junctional intercellular communication in carcinogenesis, J. Biochem. Mol. Biol.
60

Bibiliografie

36 (2003) 4348. 16. Trosko J.E., Chang C.C., Madhukar B.V., Dupont E., Oncogenes, tumor suppressor genes and intercellular communication in the oncogeny as partially blocked ontogeny hypothesis, in: O.H. Iversen (Ed.), New Frontiers in Cancer Causation, Taylor & Francis, Washington, DC, 1993, pp. 181197. 17. American Cancer Society. Estimated new cancer cases and deaths by sex for all sites, United States, 2000 (table).. Accessed March 13, (2001).

18. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Edited by Johns Hopkins University and developed for the World Wide Web by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), OMIM#137215.

19. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Edited by Johns Hopkins University and developed for the World Wide Web by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), OMIM*192090.

20. FERRI FRED F. , 2008 Ferri's Clinical Advisor. Instant Diagnosis and Treatment, 2008 MOSBY ELSEVIER, SECTION I 21. Silbernagl Stefan, Lang Florian, Color Atlas of Pathophysiology,2000,14-16 22.Ghidirim Nicolae,Actualiti n epidemiologia,etiopatogeneza,diagnosticul,tratamentul i profilaxia tumorilor maligne.Tratamentul complicaiilor cancerului gastric. 23.Fransen K. ,Elander N. ,Soderkvist P. ,Nitric oxide synthase 2 (NOS2) promoter polymorphisms in colorectal cancer , Cancer Letters 225 (2005) 99103 24.Thomas Hundley R. ,Basil R. , Nitric Oxide-Donating Aspirin Inhibits Colon Cancer Cell Growth via Mitogen-Activated Protein Kinase Activation , The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (2006) 316:2534 25.Liu Q., Chan S.T.F. , Ratha M., Nitric oxide induces cyclooxygenase expression and inhibits cell growth in colon cancer cell lines, Carcinogenesis (2003) vol.24 no.4 pp.637642

61

Bibiliografie

26.Whitlock E.P., Lin J.S., Liles E., Beil T.L., Fu R. , Screening for Colorectal Cancer: A Targeted, Updated Systematic Review for the U.S. Preventive Services Task Force, Ann Intern Med. (2008) ;149:638-658.

27.Hoensch H., Groh B., Edler L., Kirch W., Prospective cohort comparison of flavonoid treatment in patients with resected colorectal cancer to prevent recurrence, World J Gastroenterol (2008); 14(14): 2187-2193

28.Abdulkareem F.B., Abudu E.K., Awolola N.A., Elesha S.O.,Rotimi O., Akinde O.R., Atoyebi A.O., Adesanya A.A., Daramola A.O., Banjo A.A.F., Anunobi C.C., Colorectal carcinoma in Lagos and Sagamu, Southwest Nigeria: A histopathological review, World J Gastroenterol (2008); 14(42): 6531-6535

29.Malila N., Oivanen T., Malminiemi O., Hakama M., Test, episode, and programme sensitivities of screening for colorectal cancer as a public health policy in Finland: experimental design, BMJ (2008);337:2261

30.Merlin F., Prochilo T., Tondulli L., Kildani B., Beretta G.D. , Colorectal cancer treatment in elderly patients: an update on recent clinical studies, Clinical Colorectal Cancer (2008), Vol. 7, No. 6, 357-363

31.Smith R.A., Cokkinides V., Brawley O.W., Cancer screening in the United States, 2009: a review of current american cancer society guidelines and issues in cancer screening, CA CANCER J CLIN (2009);59:27-41

32.Cianchi F., Cortesini C., Fantappie` O., Messerini L., Schiavone N., Vannacci A., Nistri S., Sardi I., Baroni G., Marzocca C., Perna F., Mazzanti R., Bechi P.,Masini E., Inducible Nitric Oxide Synthase Expression in Human Colorectal Cancer - Correlation with Tumor Angiogenesis , American Journal of Pathology, (2003) Vol. 162, No. 3, 793-801

33.Fortes R.C., Recva V.L., Melo A.L., Novaes M.R.C.G. , Effects of dietary supplementation with medicinal fungus in fasting glycemia levels of patients with colorectal cancer: a randomized,double-blind, placebo-controlled clinical study, Nutr Hosp.( 2008);23(6):591-598

62

Bibiliografie

34.Xu W., Liu L.Z, Loizidou M., Ahmed M., Charles I.G., The role of nitric oxide in cancer, Cell Research (2002); 12(5-6):311-322 35.Nazarewicz R.R.,Zenebe W.J, A. Parihar, S.K. Larson, E. Alidema, J. Choi, P.Ghafourifar, Tamoxifen induces oxidative stress and mitochondrial apoptosis via stimulating mitochondrial nitric oxide synthase, Cancer Res. 67 (2007) 12821290. 36.Lin S, Fagan K.A, Li K.X, Shaul P.W., Cooper D.M, Rodman D.M, Sustained endothelial nitric-oxide synthase activation requires capacitative Ca2+ entry. J Biol Chem.2000;275(24): 17979-17985. 37. Van Faassen, E. E.; Vanin, A. F. (eds); Radicals for life: The various forms of Nitric Oxide. Elsevier, Amsterdam 2007. 38. Raines K.W, Cao G.L, Porsuphatana S, Tsai P, Rosen G.M, Shapiro P. Nitric Oxide inhibition of ERK1/2 activity in cells expressing neuronal nitric-oxide synthase. J Biol Chem. 2004; 279,3933-3940. 39. Miljkovic D, Trajkovic V. Inductible nitric oxide synthase activation by interleukin-17. Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15(1):21-32. 40. Hsieh J.S, Wang J.Y, Lin S.R, et al. overexpression of inductible nitric oxide synzhase in gastric mucosa of rats with portal hypertension: correlation with gastric mucosal damage. J. Surg Res. 2003; 115, 24-32. 41. Alderton W.K., Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001 Aud 1; 357(Pt3): 593-615. 42. Zokomori H, Oda M, Ogi M, Kamegaya Y, Tsukda N, Ishii H. Endothelial nitric oxide synthase and caveolin-1 are co-localized in sinusoidal endothelial fenestrae. Live. 2001 Jun; 21; 198-206. 43.Gong L, Pitari G.M, Schultz S, Waldman S.A. Nitric oxide signaling: systems integration of oxygen balance in defense of cell integrity. Curr Opin Hematol. 2004; 7-14. 44. Abu-Soud H.M, Hazen S.L. Nitric oxide is a physiological substrate for mammalian peroxidases. J Bio Chem. 2000;275(48): 37524-37532 45. Schor K, Woditsch I, Strobach H, Schroder H. Interaction between nitric oxide and prostacyclin in myocardial ischemia and endothelial cell cultures. Basic Res Cardiol. 1991; 86(Suppl 2); 117-25. 46. Stamler J.S., Singel DJ, Loscalzo J, Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms. Science. 1992;258: 1898-902.
63

Bibiliografie

47. Taylor BS, Alarcon LH, Billiar TR. Inductible nitric oxide syntase in the liver: regulation and function. Biochemistry (Mosc) 1998 Jul; 63(7): 766-81. 48. Tottrup A, Glavind EB, Svane D. Involvment of the L-arginine-nitric oxide pathway in internal anal sphincter relaxation. Gastroenterolgy. 1992; 102: 409-15. 49. Rajfer J, Aronson WJ, Bush PA, Dorey FJ, Ignarro LJ. Nitric oxide as a mediator of relaxation of the corpus cavernosum in response to nonadrenergic, noncholinergic neurotranmission. N Engl J Med. 1992;326:90-4. 50. Dawson TM, Dawson VL, Snyder SH. A novel neuronal messenger molecule in brain: the free radical, nitric oxide. Ann Neurol. 1992;85:2284-90. 51. Busse R, Mulsch A. Calmodulin-dependent nitric oxide sythesis in endothelial cytosol is mediated bz calmodulin. FEBS Lett. 1990; 265:133-6. 52. Benyo Z, Kiss J, Syabo C, Csaki C, Kovach AG. Importace of basal nitric oxide synthesis in regulation of myocardial blood flow. Cardiovas Res. 1991;25:700-3. 59.Jenkins D.C.,Charles I.G.,Thomsen L.L., Moss D.W., Holmes L.S., Baylis S.A., P. Rhodes, K. Westmore, P.C. Emson, S. Moncada, Roles of nitric oxide in tumor growth, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 43924396 60.Schonhoff C.M., Matsuoka M.,Tummala H., M.A. Johnson, A.G. Estevez, R. Wu, A. Kamaid, K.C. Ricart, Y. Hashimoto, B. Gaston, T.L. Macdonald, Z. Xu, J.B. Mannick, Snitrosothiol depletion in amyotrophic lateral sclerosis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 24042409. 61.Wiseman H,Halliwell B., Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer, Biochem. J. 313 (Pt 1) (1996) 1729. 62. Handy D.E.,Loscalzo J., Nitric oxide and posttranslational modification of the vascular proteome: S-nitrosation of reactive thiols, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2006) 1207 1214. 63.Jeannin J.-F.,Leon L., Cortier M., Sassi N.i, C. Paul,Bettaieb A., Nitric oxide inducedresistance or sensitization to death in tumor cells, Nitric oxide 19 (2008) 158163. 64. KRISHNA MT, CHAUHAN AJ, FREW AJ, HOLGATE ST. Toxicological mechanisms underlying oxidant pollutant-induced airway injury. Rev Environ Health 1998; 13: 59-71. 65. LEE WL, DOWNEY GP. Neutrophil activation and acute lung injury. Curr Opin Crit Care 2001; 7: 1-7.

64

Bibiliografie

66.Shigenaga M.K.,Gimeno C.J.,Ames B.N.,Urinary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989) 96979701. 67.Halliwell B.,Gutteridge J.M.C., Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed., Oxford University Press, 1999. 68.Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite. Nitric Oxide. 2001 Feb;5(1):62-71. 69.Asghar Muhammad Nadeem (2009) Oxidative Stress Status Evaluation at Chemical and Biochemical Levels using Novel/Improved and Contemporary Methods. PhD thesis, Govt. College University, Lahore. 70.Azzam E.I.,de Toledo S.M.,Little J.B., Stress Signaling from Irradiated to Non-Irradiated Cells, Current Cancer Drug Targets, 2004, 4, 53-64

71.AzzamE.I.,Little J.B., The radiation-induced bystander effect:evidence and significance, Human & Experimental Toxicology (2004) 23: 61-/65

72.Azzam E.I.,de Toledo S.M.,Little J.B., Oxidative metabolism, gap junctions and the ionizing radiation-induced bystander effect, Oncogene (2003) 22, 70507057,

73.Leon L.,Jeannin J. F.,Bettaieb A.,Post-translational modifications induced by nitric oxide (NO): Implication in cancer cells apoptosis, Nitric Oxide 19 (2008) 7783,

74.Valko .M.,Rhodes C.J.,Moncola J.,Izakovic M.,Mazura M., Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer, Chemico-Biological Interactions 160 (2006) 1-40,

76.de Toledo S. M.,Azzam E.I., Adaptative and bystander responses in human and rodent cell cultures exposed to low level ionizing radiation: the impact of linear energy transfer., Dose-Response, 4(4):291301, 2006,

77.Valko M.,Leibfritz D.,Moncola J.,Cronin M.T.D.,Mazura M., Telser J.,Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39 (2007) 4484

65

Bibiliografie

78.Heller A, Apoptosis-Inducing High CNO Concentrations Are Not Sustained Either in Nascent or in Developed Cancers, ChemMedChem 2008,3,1493 1499

79.Palmieri B.,Sblendorio V.,Oxidative stress detection: what for?, Eur Rev Med Pharmacol Sci 2006; 10 (6): 291-317

80.Hamra M.,Harma Me.,Ozcan E.,Increased oxidative stress in patients with hydatiform mole, Swiss Med Wkly 2003; 13 3: 563 566

81.Yu X.J.,Cui L.,Zhang Q.,Cheng H.,Ji P.,Expression of NOS and HIF-1 in human colorectal carcinoma and implication in tumor angiogenesis,World J Gastroenterol 2006 August 7;12(29):4660-4664

82.Yu B.,Dong X.S.,Sun W.,Yang Y,Effect of a nitric oxide synthase inhibitor NG-nitro-Larginine methyl ester on invasion of human colorectal cell line SL-174-T, World J Gastroenterol 2005;11(40):6385-6388

66