Biochimie Medicală Şi Aplicată În Clinică

1|Page
 Protecţia în laboratorul de biochimie clinică

Activităţile desfăşurate în laboratorul de biochimie clinică expun personalul la o serie de

potenţiale pericole, atât în ce priveşte interacţiunea cu diverse substanţe chimice cu efect toxic
sau/şi coroziv, a riscurilor asociate cu folosirea diferitelor aparate de laborator, cât şi în privinţa
posibilităţii de contractare a unor infecţii provenite direct de la pacienţi sau de la probe biologice
contaminate.
În toate laboratoarele de biochimie clinică trebuie afişate la vedere posibilele riscuri la
care sunt expuşi cei care lucrează în aceste locuri, cu specificarea zonelor de risc (exemplu:
reactivi chimici periculoşi/ pericol de electrocutare/ risc biologic, etc.). De asemenea, este
obligatorie afişarea la loc vizibil a regulilor de protecţie a muncii, potenţialelor pericole pentru
mediul înconjurător, a regulilor de protecţie împotriva incendiilor şi a calamităţilor naturale.
Fiecare laborator trebuie dotat cu extinctor şi dulap de prim ajutor.
De regulile de bună practică în laborator beneficiază atât cei care îşi desfăşoară
activitatea în laborator, cât şi pacienţii. O gestionare atentă a riscurilor şi o respectare a legislaţiei
în vigoare pot reduce la minim evenimentele nedorite.
Deşi lipsa de experienţă poate fi în multe cazuri cauza evenimentelor neplăcute în
laborator, ignorarea regulilor de comportament specifice laboratorului de biochimie, neglijenţa
în activităţile desfăşurate, graba sau neatenţia sunt circumstanţe agravante şi incriminante
pentru producerea de accidente.
De aceea: concentrarea asupra sarcinilor de lucru, păstrarea ordinii şi curăţeniei la
postul de lucru, respectrea protocoalelor puse la dispoziţie, alături de purtarea echipamentului
adecvat, reprezintă principalele cerinţe pentru cei care lucrează în laboratorul de biochimie
clinică.

2|Page
 Reguli de protecţie în laboratorul de biochimie

1. Sunt esenţiale în laborator păstrarea ordinii şi a curăţeniei precum şi organizarea

judicioasă a lucrului.
2. În laborator nu se mănâncă, nu se bea, nu se fumează, nu se machiază.
3. În laborator nu se depozitează haine şi bagaje.
4. Glumele proaste sunt interzise.
5. Echipamentul necorespunzător şi expedientele reprezintă primul pas spre un accident. În
timpul lucrului, în laborator este obligatorie purtarea halatului complet încheiat.
6. În laborator se execută numai lucrările indicate. Orice alte lucrări se fac numai cu
acordul şi sub îndrumarea unui cadru didactic.
7. Masa de lucru se menţine în permanenţă curată. În acest scop, fiecare student trebuie să
aibă o cârpă de laborator.
8. Nu lăsaţi nesupravegheat niciodată un experiment în desfăşurare, în timp ce se efectuează
o operaţie de încălzire, de centrifugare sau când reacţia are loc rapid.
9. În laborator nu se poartă:
1. pantofi decupaţi sau sandale;
2. blugi tăiaţi;
3. lentile de contact sub care pot pătrunde substanţe chimice volatile şi iritante;
4. îmbrăcăminte prea largă care poate intra în contact cu substanţele sau cu focul
deschis;
- părul lung desfăcut.
10. Sticlele cu reactivi se astupă imediat după utilizare pentru a se evita schimbarea dopurilor
de la o sticlă la alta.
11. Reactivii din laborator nu se gustă şi nu se miros puternic.
12. Acizii se păstrează în sticle cu dop rodat ; acidul fluorhidric se păstrează în recipiente de
polietenă sau de ebonită;
13. Soluţiile de hidroxizi se păstrează în sticle de polietenă prevăzute cu dopuri de cauciuc ;

3|Page
14. Pipetarea substanţelor toxice, volatile, corozive nu se va face niciodată cu gura ci numai
cu ajutorul pompiţelor de cauciuc.
15. Pentru evitarea impurificării reactivilor, surplusul rămas în pipetă sau în alt vas nu se pun
niciodată înapoi în vasele din care au fost scoşi ,ci se aruncă astfel :
substanţele solide – în recipiente pentru reziduuri ;
lichidele solubile-în chiuvetă , lăsând să curgă apă în exces ;
lichidele insolubile în apă-se depozitează în recipiente speciale ;
16. În cazul lucrului cu substanţe toxice şi/sau corozive se vor purta mănuşi de cauciuc şi
ochelari de protecţie.
17. Substanţele toxice, corozive şi cele volatile se vor depozita şi manipula numai în nişă
prevăzută cu instalaţie de ventilaţie. După manipulare, ventilaţia va fi pornită minimum
10 minute.
18. Se va evita orice contact al reactivilor cu ochii şi mucoasele.
19. Întotdeauna se adaugă acizii în apă şi niciodată apa în acizi ;
20. Sticlele şi recipienţii cu reactivi se astupă imediat după folosire ;
21. În chiuvetă nu se aruncă substanţe corozive (acizi, alcalii).
22. În chiuvetă nu se aruncă hârtii, cioburi chibrituri etc.
23. Examinaţi cu atenţie sticlăria înainte de a o utiliza. Nu o utilizaţi dacă este murdară,
zgâriată, ciobită, plesnită.
24. Nu amestecaţi acid sulfuric şi apă în cilindri gradaţi deoarece căldura reacţiei îi poate
sparge.
25. Nu folosiţi vase cu fundul plat la instalaţii de vacuumare deoarece apare pericolul
imploziei. Fac excepţie flacoanele Kitasato, speciale pentru astfel de manipulări.
26. Nu încălziţi vase de sticlă direct pe flacără, ci pe sită de azbest.
27. În cazul supraîncălzirii lichidelor se folosesc bucăţele de piatră ponce sau porţelan
poros , care provoacă o fierbere progresivă şi liniştită a lichidelor ; piatra ponce sau
porţelanul poros se vor introduce întotdeauna în lichidul rece şi nu în cel fierbinte;
28. Nu apucaţi şi nu transportaţi vasele de sticlă de gât, dop sau braţul lateral ci de baza lor.
29. Nu forţaţi introducerea dopurilor de cauciuc sau a manşoanelor nelubrifiate în vase sau
tubulaturi din sticlă.
30. Nu răciţi şi nu încălziţi brusc sticlăria.

4|Page
31. Nu încălziţi direct la flacără sticlăria gradată (cilindri, baloane cotate, pipete, etc.).
32. Pentru etanşarea instalaţiilor folosiţi vaselină siliconată.
33. Dacă s-au spart vase de sticlă, cioburile mari se îndepărtează cu o mătură, iar cioburile
mici, cu ajutorul unei cârpe ude, care se aruncă ulterior.
34. Aparatele electrice trebuie să aibă izolaţie perfectă şi prize împământate. Nu se
manevrează cu mâinile ude.
35. La terminarea lucrărilor fiecare student trebuie să spele toată sticlăria utilizată, cu
detergent şi cu apă caldă şi s-o clătească cu apă distilată. Instalaţiile de gaz şi robinetele
de apă vor fi închise iar aparatele electrice deconectate de la reţea.
36. Înainte de părăsirea laboratorului spălarea mâinilor cu apă şi săpun este obligatorie.
37. În orice moment fiti atenti la ceea ce faceţi!

5|Page
 Măsuri de biosiguranţă specifie laboratorului de
biochimie clinică

Expunerea la surse de contaminare biologică cu bacterii, virusuri, paraziţi sau alte entităţi
biologice patogene constituie un pericol care nu trebuie neglijat în laboratorul de biochimie
clinică. Această expunere poate avea loc prin ingestie accidentală, inoculare, prin intermediul
mâinilor sau prin inhalare. Sursele de contaminare pot fi, după caz, pacienţii, probele lor
biologice, diverse materiale şi ustensile de laborator care au fost în contact cu acestea. O altă
sursă poate fi constituită din deşeurile provenite în urma prelevării şi analizării probelor
biologice, atunci când evacuarea acestor deşeuri este prost gestionată. Răspândirea hepatitei
virale B sau C, virusului imunodeficienţei umane sau a tuberculozei constituie un real pericol şi
de aceea se impune o respectare riguroasă a măsurilor de biosiguranţă recomandate celor care
lucrează în laboratorul de biochimie clinică.

1. Halatele de laborator trebuie purtate tot timpul cât se lucrează în laborator.

2. Mănuşi corespunzătoare de protecţie trebuie purtate în timpul tuturor procedurilor care pot
implica contactul direct sau accidental cu sânge, cu alte umori sau fluide ale organismului, cu
alte materiale potenţial infecţioase sau cu animale infectate. După utilizare, mănuşile se scot
aseptic şi se spală mâinile.
3. Studenţii trebuie să se spele pe mâini după manipularea materialelor infecţioase şi înainte de
părăsirea zonei de lucru a laboratorului.
4. Ochelarii de protecţie, ecranele de protecţie facială sau alte dispozitive de protecţie trebuie
purtate ori de câte ori este necesară protecţia ochilor şi a feţei de stropi, obiecte impactante şi
surse artificiale de radiaţii ultraviolete.
5. Este interzisă purtarea îmbrăcăminţii protectoare de laborator în afara laboratorului, de
exemplu în cantine, camere de oficiu, biblioteci, toalete, etc.
6. Încălţămintea decupată în partea din faţă (sandale) este improprie purtării în laborator.
7. Consumul de alimente, băuturi, machiajul şi manipularea lentilelor de contact sunt interzise în
zonele de lucru ale laboratorului.
8. Depozitarea de alimente sau băuturi oriunde în zona de lucru a laboratorului este interzisă.

6|Page
9. Echipamentul va fi ales luând în considerare câteva principii generale, de exemplu:
- Să fie conceput astfel încât să prevină sau să limiteze contactul dintre operator şi materialul
infecţios.
- Să fie confecţionat din materiale impermeabile la lichide, rezistente la coroziune şi
corespunzătoare ca structură.
- Să fie confecţionat astfel încât să nu aibă asperităţi, margini ascuţite şi părţi mobile neprotejate.
- Să fie proiectat, construit şi instalat pentru a facilita operarea simplă şi întreţinerea, curăţarea,
decontaminarea şi testarea în vederea certificării; ori de câte ori este posibil, se va evita utilizarea
sticlăriei şi a altor materiale casante.

Evitarea ingestiei de material infecţios şi a contactului cu pielea şi ochii

1. Particulele mari şi picăturile cu diametrul mai mare de 5 μm, apărute în timpul
manipulării materialului microbiologic, trebuie îndepărtate rapid de pe suprafaţa de lucru
şi de pe mâinile operatorului. Trebuie purtate mănuşi de unică folosinţă. Lucrătorii din
laborator trebuie să evite atingerea gurii, ochilor şi a feţei.
2. Este interzisă depozitarea şi consumul de alimente şi băutură în laborator.
3. Este interzisă introducerea în gură a oricăror obiecte (creioane, pixuri, gumă de
mestecat).
4. Este interzisă aplicarea cosmeticelor în laborator;
5. Faţa, ochii şi gura trebuie protejate cu un ecran sau prin alte modalităţi, în timpul oricărei
operaţii care se poate solda cu împroşcarea de material infecţios.

Utilizarea pipetelor şi a dispozitivelor de pipetare

1. Dispozitivul de pipetare trebuie utilizat întotdeauna. Pipetarea cu gura este interzisă.
2. Nu trebuie suflat niciodată într-un lichid care conţine agenţi infecţioşi.
3. Materialul infecţios nu trebuie niciodată amestecat prin aspirare şi expulzare alternantă,
prin pipetă
4. Lichidele nu trebuie niciodată expulzate forţat din pipete.
5. Pipetele gradate neterminal sunt preferabile altor tipuri de pipete deoarece nu necesită
expulzarea ultimei picături.

7|Page
 6. Pipetele contaminate vor fi imersate complet într-un dezinfectant adecvat, aflat într-un
container incasabil. Ele trebuie lăsate în dezinfectant atâta timp cât este necesar înainte de
a fi scoase din laborator.
7. Containerul pentru pipete folosite trebuie plasat în interiorul hotei de siguranta biologica,
nu în afara ei.
8. Pentru a evita dispersia picăturilor de material infecţios din pipetă, pe suprafaţa de lucru
va fi aşezat un material absorbant ; după utilizare acesta va fi evacuat ca material
infecţios.

Procedurile
1. Nici un material nu trebuie dus la gură. Etichetele nu trebuie umectate cu limba înainte de
lipire.
2. Toate procedurile tehnice trebuie efectuate într-un mod care să reducă la minimum formarea
de aerosoli şi picături.
3. Toate stropirile accidentale şi expunerile evidente sau posibile cu material infecţios trebuie
raportate responsabilului laboratorului. Se va păstra o evidenţă scrisă a acestor accidente şi
incidente.
4. Lichidele contaminate trebuie decontaminate (chimic sau fizic) înaintea evacuării lor în
reţeaua de canalizare. În funcţie de riscul evaluat se poate dezvolta un sistem de tratare a acestor
lichide.
Zonele de lucru ale laboratorului
1. În laborator trebuie păstrată curăţenia şi ordinea, eliminându-se toate materialele care nu sunt
necesare pentru munca desfăşurată în laborator.
2. Suprafeţele de lucru trebuie decontaminate după fiecare vărsare de materiale potenţial
periculoase precum şi la sfârşitul zilei de lucru.
3. Toate materialele contaminate, probele şi culturile, trebuie decontaminate înainte de a fi
îndepărtate sau curăţate pentru refolosire.
Echipamente esenţiale pentru asigurarea biosiguranţei
1. Dispozitive de pipetare, pentru a evita pipetarea cu gura.
2. Hotele de biosiguranţă, ce trebuie folosite ori de câte ori:
- se manipulează materiale infecţioase; aceste materiale pot fi centrifugate în spaţiul deschis

8|Page
al laboratorului dacă se folosesc cupe de centrifugă cu dispozitiv de securizare şi dacă sunt
introduse şi descărcate într-o hotă de biosiguranţă
- există risc crescut de infecţii aerogene
- se folosesc proceduri cu potenţial ridicat de producere de aerosoli: centrifugarea, mojararea,
secţionarea, agitarea sau mixarea viguroasă, dezintegrarea sonică.
4. Tuburi şi flacoane cu capace prevăzute cu filet.
5. Autoclave sau alte mijloace folosite pentru decontaminarea materialului infecţios.

Manipularea deşeurilor
Se consideră deşeuri toate materialele care se aruncă.
În laboratoare, în desfăşurarea activităţii cotidiene, decontaminarea deşeurilor şi eliminarea
finală a acestora sunt strâns legate. Un număr foarte mic de materiale contaminate necesită
îndepărtarea efectivă din laborator sau distrugerea. Majoritatea sticlăriei, instrumentelor şi
articolelor de îmbrăcăminte sunt refolosite sau reciclate.
Principiul general ce trebuie să funcţioneze este că toate materialele infecţioase vor fi
decontaminate, autoclavate sau incinerate în laborator.
In procesul de inlaturare a deseurilor se va tine seama de identificare şi de separare a
materialelor infecţioase şi a containerelor respective. Vor fi obligatoriu respectate reglementările
naţionale şi internaţionale în domeniu. Categoriile care se includ sunt următoarele:
1. Deşeurile necontaminate (neinfecţioase) care pot fi refolosite, reciclate sau eliminate ca
deşeuri generale sau menajere
2. Obiectele ascuţite (tăietoare-înţepătoare) contaminate (ex. ace hipodermice, bisturie, cuţite şi
cioburi de sticlă); acestea vor fi întotdeauna colectate în containere rezistente la înţepare-tăiere,
prevăzute cu capace şi vor fi tratate ca infecţioase.
3. Materialul contaminat destinat decontaminării prin autoclavare urmată de spălare şi refolosire
sau reciclare.
4. Materialul contaminat destinat autoclavării şi eliminării.
5. Materialul contaminat destinat incinerării directe.

9|Page
 Acordarea primului ajutor

Orice accident trebuie anunţat imediat cadrului didactic îndrumător!

Procedurile de prim ajutor după expunerea accidentală la agenţi chimici

1. Dacă v-aţi stropit pe piele cu substanţe corozive şi/sau toxice hidrosolubile, spălaţi-vă cu
multă apă rece.
2. Dacă v-aţi stropit cu substanţe toxice şi /sau corozive liposolubile, utilizaţi pentru clătire
soluţii de polietilen glicol.
3. Dacă v-aţi stropit hainele cu substanţe corozive şi/sau toxice scoateţi-le imediat şi, în
măsura posibilităţilor, spălaţi-le cu multă apă.
4. Substanţele corozive pătrunse în ochi trebuiesc cu grijă îndepărtate prin clătirea ochilor în
jet de apă nu prea puternic, apoi, folosindu-se paharul spălător de ochi şi pipeta, se
neutralizează cu soluţie 3% bicarbonat de sodiu sau 2% acid boric, după cum arsura se
datoreşte acizilor sau alcaliilor. După aceea, ochii se rotesc în toate direcţiile pentru a
verifica eficienţa clătirii.
5. În cazul arsurilor chimice, se îndepărtează îmbrăcămintea, se spală cu apă din abundenţă
regiunea arsă, apoi se neutralizează arsura astfel:
-arsurile provocate de acizi se spală cu o soluţie rece de 2% NaHCO3;
-arsurile provocate de alcalii se spală cu soluţie 4% acid boric sau 2% acid acetic.
După neutralizare, se unge cu grijă rana cu jecolan şi se pansează.
-arsurile cu brom sau acid bromhidric se tamponează local cu soluţia 2% tiosulfat de
sodiu.
6. Dacă acidul a pătruns în gură, se clăteşte gura cu multă apă şi apoi se bea lapte. Nu se
provoacă vomă!
7. Dacă bazele tari au pătruns în gură, se clăteşte gura cu multă apă şi apoi cu oţet diluat
sau cu suc de lămâie. Se provoacă vomă prin administrarea de ulei vegetal.

10 | P a g e
 8. În cazul arsurilor provocate prin căldură, se îndepărtează resturile de îmbrăcăminte şi
apoi, în funcţie de gradul arsurii, se va proceda după cum urmează:
- la arsurile de gradul 1 (roşeaţă) se tamponează rana cu alcool şi se unge cu jecolan, ulei
de peşte, Bioxiteracor, etc.;
- la arsurile de gradul 2 (băşici), se tamponează rana cu o soluţie 3% permanganat de
potasiu sau cu o soluţie 5% tanin proaspăt preparată;
- la arsurile de gradul 3 (distrugerea ţesutului), se acoperă rana cu pansament steril şi se
aşteaptă medicul.
9. În cazul intoxicaţiilor acute, primul ajutor constă în scoaterea accidentatului din mediul
toxic şi transportarea lui într-o încăpere bine aerisită. Accidentatul este aşezat în poziţia
culcat şi i se îndepărtează îmbrăcămintea dacă aceasta este imbibată cu substanţă toxică.
Se anunţă urgent medicul.
10. Pentru intoxicatiile cu arsen sau stibiu se provoacă vomă cu ajutorul unei soluţii de sulfat
de magneziu. Se administrează un antidot constând din: 300 mL apă+ 100 g sulfat feric+
suspensie de 20 g oxid de magneziu frecat cu 300 mL apă. Soluţia antidot se agită
puternic şi se administrează în porţii mici.
11. Pentru intoxicaţiile cu compuşi ai mercurului se administrează rapid trei ouă crude
amestecate cu cca 1 L lapte apoi se provoacă vomă.
12. Pentru intoxicatii cu compuşi ai plumbului se bea o cantitate mare de soluţie de sulfat de
magneziu.
13. Pentru intoxicaţiile prin ingestie de solvenţi organici i se dă accidentatului să bea ulei de
parafină.
Componentele trusei de prim ajutor:
 soluţie apă oxigenată 3%
 soliţie acid boric 4%
 fiole cafeină
 fiole Algocalmin
 tinctură de iod
 soluţie carbonat acid de sodiu 2%
 soluţie diluată de permanganat de potasiu
 un tub Jecolan

11 | P a g e
 un flacon Emetiral
 un flacon Lizadon
 vată hidrofilă
 comprese sterile
 faşă tifon
 leucoplast
 foarfece
 pahar ocular

12 | P a g e
 Procedurile de prim ajutor după expunerea
accidentală la material infecţios

Primul ajutor în caz de expunere accidentală la material real / potenţial infecţios constă în
aplicarea imediat după eveniment, de către o persoană avizată, a tratamentului medical adecvat,
chiar la locul producerii accidentului.
Primul ajutor se acordă respectând metoda aprobată pentru o anumită expunere, urmând
ca îngrijirile să fie continuate de către un medic de specialitate pentru tratarea consecinţelor
accidentului.
1. Înţeparea, tăierea, zgârierea, abraziunea accidentală
• Se consideră ca fiind un risc de expunere semnificativ orice leziune cu corpuri ascuţite, tăioase,
chiar dacă nu sunt urme de sânge vizibile la locul leziunii şi tegumentul nu pare a fi fost lezat
serios.
• Se spală imediat abundent zona afectată cu un jet de apă, apoi cu apă şi săpun.
• Se dezinfectează zona cu un antiseptic activ, eficient, proaspăt preparat; aplică un pansament
steril dacă este necesar.
2. Contactul accidental cu material infecţios
Categoria include orice contact neprotejat al tegumentului prezentând soluţii de continuitate, a
mucoasei bucale, nazale sau a globului ocular cu material potenţial infecţios.
• Se spală abundent imediat zona tegumentară cu jet de apă şi săpun. Se foloseşte doar apă pentru
cavitatea bucală şi, respectiv, ser fiziologic steril pentru globul ocular.
3. Acţiuni imediate după expunerea accidentală
Indiferent de potenţialii agenţi microbieni patogeni, conţinuţi de materialul infecţios implicat în
expunerea accidentală potenţial infectantă, se impun câteva măsuri imediate:
• Se va preleva o probă de sînge de la accidentat pentru testări de bază (afirmarea / infirmarea
unei / unor infecţii preexistente accidentului cu etiologie: HBV, HCV, HIV, Treponema
pallidum, etc.).
• O contraprobă de ser se va păstra în congelator pentru investigaţii suplimentare.

13 | P a g e
• Se va preleva (dacă este posibil) o probă de sânge de la subiectul de la care provine materialul
biologic potenţial infectios (teste paralele cu accidentatul).
Raţiunea pentru care se fac aceste prelevări este de :
- a stabili caracterul profesional / neprofesional al unei / unor îmbolnăviri ulterioare;
- a se adopta o atitudine terapeutică imediată, raţională şi eficientă faţă de accidentat;
- a stabili durata de urmărire/ supraveghere clinică şi de laborator a accidentatului (în general, pe
durata maximă de incubaţie a agentului/ agenţilor infecţioşi potenţial / real existenţi în materialul
infecţios implicat în accident.
• În cursul investigării unei izbucniri epidemice, trebuie stabilite proceduri adecvate, specifice,
de prevenţie şi tratament şi de urmărire pe durata maximă de incubare (pentru agentul etiologic
incriminat) a personalului implicat în acţiune.
• În cursul unei izbucniri epidemice suspectate de a fi o febră hemoragică, personalul implicat în
investigarea focarului va fi monitorizat de două ori pe zi, timp de trei săptămâni, pentru starea
generală şi temperatură.
• Dacă un detaliu procedural este identificat drept cauza generatoare a accidentului, este necesar
a se întreprinde o acţiune corectivă.

14 | P a g e
 Reguli pentru prelevarea, procesarea şi conservarea
probelor pentru analize
Etapa de preanaliză se referă la toate operaţiunile complexe care se efectuează înaintea
analizei propriu-zise a probei biologice. De-a lungul anilor, o serie de studii au identificat
posibile surse de eroare în această etapă, ceea ce a impus elaborarea de protocoale stricte pentru
prelevarea, procesarea, manipularea şi conservarea probelor biologice destinate analizelor
biochimice.
Aceste erori includ atât variabile referitoare la pacienţi (vârstă, sex, regim alimentar), cât
şi la modalitatea de recoltare a probelor, la etichetarea lor neglijentă, la conservanţii şi
anticoagulanţii folosiţi, la condiţiile de transport a probelor, de prelucrare şi/sau de conservare.
Cele mai frecvente erori includ umplerea improprie a tuburilor de prelevare, recoltarea
probelor de sânge pe anticoagulanţi nepotriviţi pentru investigaţia solicitată, sau în containere de
recoltare nepotrivite.

Tabelul 1. Lista celor mai frecvente 10 erori care apar la recoltarea probelor biologice

1. Identificarea greşită a pacientului

2. Neetichetarea probei imediat după recoltare
3. Recoltarea unei cantităţi insuficiente de probă şi un raport incorect între volumul probei
şi volumul de anticoagulant
4. Neomogenizarea probelor de sânge cu soluţia de anticoagulant, ceea ce conduce la
coagularea probei
5. Alegerea greşită a anticoagulantului
6. Hemolizarea probei
7. Hemoconcentrarea probei, datorită stocării îndelungate
8. Expunerea probelor la lumină sau la temperaturi extreme (exp. congelarea probelor de
sânge integral)
9. Aducerea cu întârziere a probelor în laborator după recoltare

15 | P a g e
 10. Centrifugarea incompletă a probelor, depozitarea lor improprie

Erorile survenite în etapa preanalitică induc necesitatea re-analizării probei, ceea ce

conduce la majorarea costurilor manoperei şi la solicitarea suplimentară a pacientului.
Recoltarea corectă a probelor biologice este esenţială şi pentru a reduce la minim
expunerea pacienţilor la durere şi stress.

Factorii care pot influenţa rezultatele analizelor de laborator

Factorii fiziologici

Variaţia circadiană a concentraţiilor unor compuşi

Această problemă poate fi întâlnită în cazul dozării unor hormoni endocrini, dar şi a
fierului, activităţii fosfatazei acide şi a excreţiei urinare a electroliţilor (sodiu, potasiu, fosfat).
Activitatea fizică a pacientului
Activitatea fizică intensă depusă de un pacient înaintea recoltării probelor poate influenţa
rezultatele analizelor de laborator. De exemplu, concentraţia acizilor graşi liberi în serul sanguin
poate creşte şi de 300 de ori după efort fizic. La fel este cazul activităţii creatin kinazei, aspartat
aminotransferazei (AST) sau a lactat dehidrogenazei. Aceste modificări sunt datorate
intensificării activităţii căilor metabolice generatoarea de energie.
Regimul alimentar
Acest factor poate afecta foarte mult rezultatelel analizelor de laborator. Efectul său este
însă trecător şi poate fi uşor controlat. Glucoza şi trigliceridele provenite din aport alimentar îşi
cresc concentraţia în sânge imediat după ingestia de alimente. După 48 ore de post bilirubina
serică creşte. Un post de 72 ore scade concentraţia de glucoză în sânge până la 45 mg/dL (2,5
mmol/L) la femeile sănătoase, pe când la bărbaţi creşte concentraţia de trigliceride, glicerol şi
acizi graşi liberi. Când sunt determinaţi metaboliţi cum ar fi: glucoza, trigliceridele, colesterolul
şi elctroliţii, recoltarea probelor de sânge trebuie făcută după o perioadă de repaus alimentar de

16 | P a g e
cel puţin 8-12 ore. In caz contrar, datorită prezenţei compuşilor lipidici în cantitate mare, probele
de ser sanguin pot prezenta turbiditate accentuată, care poate interfera în rezultatele analizelor.
Testele de detectare a unor pierderi de sânge prin fecale sunt alterate de ingestia de carne,
peşte, preparate cu fier, hrean, cauzând valori fals positive.
Unele regimuri alimentare pot afecta constituienţii serici sau urinari. S-a raportat faptul
că o dietă vegetarian menţinută pe termen lung pot duce la scăderea lipoproteineloe LDL, VLDL
şi a lipidelor totale, colesterolului şi trigliceridelor. O alimentaţie bogată în carne şi în alte surse
de proteine poate duce la creşterea ureei şi a acidului uric. Alimentaţia bogată în proteine şi
săracă în glucide, cum ar fi dieta Atkins, creşte substantial concentraţia de corpi cetonici în urină
şi creşte concentraţia de azot în sânge. Alimentele cu conţinut mare de acizi graşi nesaturaţi şi
polinesaturaţi par să conducă la scăderea concentraţiei de cholesterol în sânge, pe când o dietă
bogată în baze azotate purinice duce la creşterea concentraţiei de acid uric în sânge.
Alimente cum sunt bananele, ananasul, tomatele şi avocado sunt bogate în serotonină.
După ingestia lor s-au observant creşteri semnificative ale concentraţiei de acid 5-hidroxi
indolacetic, principalul metabolit rezultat în urma degradării serotoninei.
Băuturile bogate în cafeină cresc concentraţia plasmatică de acizi graşi liberi şi induc
sinteza şi eliberarea de catecolamine.
Ingestia de alcool etilic conduce la creşteri ale concentraţiilor sanguine de: acid lactic,
acid uric, trigliceride. Abuzul cronic de alcool a fost asociat cu creşteri ale concentraţiilor
sanguine de: HDL-colesterol, gamma-glutamil transpeptidază, acid uric.
Stressul

Stressul fizic şi mental induce sinteza de hormon adenocorticotrop (ACTH), cortisol şi

catecolamine. Colesterolul total creşte în cazul unui nivel mediu de stress, pe când HDL-
colesterolul scade cu peste 15%. Hiperventilaţia afectează balanţa acido-bazică a sângelui şi
creşte concentraţia de acid lactic şi de acizi graşi liberi.
Postura
Postura unui pacient în timpul recoltării probelor de sânge poate influenţa rezultatele
analizelor de laborator. Statul în picioare creşte presiunea hidrostatică, conducând la scăderea
volumului plasmei şi la creşterea concentraţiei de proteine. Nivelele albuminei şi calciului pot
creşte dacă pacientul îşi schimbă poziţia în timpul prelevării de sânge. În general, metaboliţii

17 | P a g e
care îşi alterează valorile în funcţie de postura pacientului sunt: albumina serică, proteinele
totale, enzimele, calciul, bilirubina, colesterolul, trigliceridele. Aplicarea garoului la colectarea
probei de sânge pentru măsurarea concentraţiei de acid lactic poate conduce la valori fals
crescute. Prelungirea timpului de aplicare a garoului poate conduce la creşterea eronată a
valorilor activităţilor enzimatice, colesterolului, calciului şi trigliceridelor, ca rezultat al
hemoconcentrării.
După o perioadă îndelungată petrecută la pat, hemoglobina poate avea valori fals scăzute,
efect care poate fi amplificat şi de administrarea intravenoasă de lichide.
Pacienţii trebuie sfătuiţi să evite: modificări în dieta alimentară, consumul de alcool şi
exerciţiile fizice extenuante cu 24 ore înainte de recoltarea probelor pentru analize medicale.
Vârsta
Vârsta unui pacient influenţează semnificativ valorile parametrilor sanguini. Au fost
definite patru grupe de vârstă, după cum urmează: nou-născuţi, copii şi adolescenţi, adulţi, adulţi
vârsnici. La nou-născuţi valorile bilirubinei cresc la naştere şi scad după 5 zile. In caz de maladie
hemolitică, valorile bilirubinei continua să crească şi după 5 zile de la naştere. De asemenea,
concentraţia acidului uric este crescută la nou-născut şi scade treptat în primele 10 zile de viaţă.
Copiii au valori ale glicemiei mai scăzute faţă de adulţi, datorită rezervelor mai scăzute de
glicogen. O data cu dezvoltarea scheletului şi cu dezvoltarea musculaturii creşte activitatea
fosfatazei alcaline şi concentraţia de creatinină serică.
La instalarea menopauzei la femei şi andropauzei la bărbaţi apar creşteri ale
colesterolului total seric şi de trigliceride de aproximativ 2 mg/dL pe an.
Sexul
După vârsta pubertăţii băieţii în general au valori mai mari ale fosfatazei alcaline,
transaminazelor, creatin kinazei şi aldolazei, comparativ cu fetele. Aceasta se datorează masei
musculare mai mari. Femeile au concentraţii mai scăzute de magneziu, calciu, albumină,
hemoglobină, fier seric şi feritină. Valorile mai scăzute ale fierului se datorează pierderilor
lunare de sânge.

Tabelul 2. Exemple de analize biochimice afectate de variaţia circadiană, postură şi

stress

18 | P a g e
 Cortisol Cea mai mare valore între 4-6 dimineaţa, cea
mai mică valoare între 8-12 seara, creşte cu
stressul
ACTH Scade noaptea, creşte cu stressul
Fosfataza acidă Creşte după amiaza şi seara
Fierul Creşte dimineaţa, scade cu peste 30% în
timpul zilei
Calciul Scade la recoltarea sângelui în poziţia culcată

Alţi factori
Fumatul
Fumătorii au cantităţi mari de carboxi-methemoglobină în sânge şi nivele crescute de
catecolamine şi cortisol. Modificarea concentraţiilor acestor hormoni conduce la scăderea
numărului de eozinofile şi la creşterea numărului de neutrofile şi monocite. De asemenea,
concentraţia de acizi graşi liberi din plasmă creşte. Cresc şi concentraţiile serice de acid lactic şi
de insulină.
Tratamentele medicamentoase
Metodele analitice bazate pe reacţii de oxido-reducere pot fi influenţate de ingestia unor
substanţe cum ar fi acidul ascorbic. Medicamentele pot avea efecte neprevăzute asupra acurateţei
rezultatelor analizelor biochimice. În funcţie de metoda abordată, rezultatele pot fi puternic sau
mai puţin afectate.

Prelevarea şi procesarea probelor de sânge

Prelevarea probelor de sânge integral sau plasmă sanguină se face în
vacuumteinere speciale (cu anticoagulant specific), în funcţie de analizele care urmează să fie
făcute.
Pentru obţinerea plasmei sanguine, în scopul prevenirii hemolizei este necesară o
cât mai grabnică separare a plasmei prin centrifugare la turaţie mică.
Pentru anumiţi parametri există diferenţe semnificative între rezultatele obţinute la
testarea din ser şi cea din plasmă (potasiu, magneziu, fosfor, proteine totale, lactat).
Diferenţele dintre valorile obţinute din ser şi din plasmă se datorează unor cauze cum ar fi:

19 | P a g e
- substanţa respectivă poate fi transformată în timpul procesului de coagulare (fibrinogen,
glucoză);
- substanţa poate fi eliberată din celule în timpul coagularii (potasiu, lactat dehidrogenaza, fosfor,
lactat);
- anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare ( gamma glutamil transpeptidaza).
Probele de sânge total nu se congelează!
Prelevarea probelor de ser sanguin se face în vacuumteinere fără anticoagulant. Pentru
exprimarea serului, probele se menţin la temperatura laboratorului (25°C). Serul separat de
coagul se centrifughează pentru îndepărtarea cât mai completă a eritrocitelor. Astfel prelevat, el
se pretează la depozitare prin refrigerare sau congelare.
Erori survenite la recoltarea probelor de sânge

La recoltarea probelor de sânge se poate produce hemoliza ca rezultat al stângăciei

recoltatorului în realizarea puncţiei venoase. Hemoliza se mai poate produce din cauza folosirii
unor ace de puncţie cu lumenul prea îngust, a puncţionării venei înainte de evaporarea de pe
tegument a alcoolului utilizat pentru dezinfectare, sau a agitării prea energice a probei prelevate.
Hemoliza poate conduce la valori fals crescute ale potasiului, magneziului, fierului, fosforului,
amoniacului şi proteinelor totale. Datorită importanţei potasiului în activitatea cardiac, această
creştere falsă a valorilor concentraţiiilor de potasiu, datorate hemolizei, poate creea mari
probleme, mai ales pentru pacienţii aflaţi la secţia Urgenţe,
O altă situaţie specială o reprezintă pseudo-hiperkalemia care apare în cazul bolnavilor de
leucemie acută sau galopantă. Limfoblaştii prezenţi în număr mare în sângele acestor pacienţi
sunt celule extrem de fragile, care pot liza uşor, eliberând potasiul intracelular în plasma.
Pentru a evita problemele de hemoconcentraţie sau de hemodiluţie care pot apărea, se
recomandă ca pacientul să stea întins pe pat cu 15-20 minute înainte de recoltarea probelor de
sânge. O aplicare de prea lungă durată a garoului poate cauza hemoconcentrare, cu creşterea
concentraţilor unor metaboliţi.
Atunci când se recomandă recoltarea sângelui pe anticoagulant, este de maximă
importanţă să se respecte exact anticoagulantul adecvat, iar amestecarea sângelui cu
anticoagulantul să se facă cu mişcări lente. În lipsa omogenizării sângelui cu soluţia de
anticoagulant se pot forma cheaguri, proba de sânge devenind improprie pentru analiză.

20 | P a g e
 Tabelul 3. Modificările survenite în concentraţiile serice/activităţile enzimatice din
cauza hemolizării probelor de sânge

Metabolitul/activitatea Raportul între concentraţia Procentul de modificare a

enzimatică din eritrocite şi concentraţia rezultatelor în urma lizei a
serică 1% din eritrocite calculate
pentru un hematocrit de 0,50
Lactat dehidrogenaza 16:1 +272,0
Aspartate aminotransferaza 4:1 +220,0
(AST)
Potasiu 23:1 +24.4
Alanin aminotransferaza 6,7:1 +55,0
(ALT)
Glucoză 0,82:1 -5.0
Fosfat anorganic 0,78:1 +9,1
Sodiu 0,11:1 -1
Calciu 0,10:1 +2,9

Timpul la care se face colectarea

Uneori probele de sânge trebuiesc colectate la un anumit timp. Nerespectarea exacta a
timpului recomandat pentru colectare poate duce la rezultate eronate şi la greşeli de interpretare
şi diagnosticare. Este cazul monitorizării anumitor markeri cardiaci pentru stabilirea schemei de
tratament.
O altă situaţie este cea în care se provoacă o hiperglicemie la pacienţii suspicionaţi de diabet
zaharat. În acest caz este necesară respectarea riguroasă a intervalelor de prelevare a probelor de
sânge pentru acurateţea diagnosticului.

Prelucrarea primară
Materialele biologice cele mai variate (sânge, urină, lichid cefalo-rahidian) care intră
pentru determinări în laboratoare sunt de multe ori prelucrate ca atare, dar sunt şi cazuri când ele

21 | P a g e
necesită unele pregătiri preliminare. Pe un anumit material biologic, care urmează să fie supus
analizelor biochimice, nu se pot efectua simultan toate determinările necesare, acesta trebuind
împărţit in prealabil în mai multe părţi şi pregătit în mod corespunzător pentru fiecare tip de
determinare.
Manipulările pre-analitice ale eşantioanelor trebuie să urmărescă preîntâmpinarea oircărui proces
capabil să denatureze calitatea acestora.
Stocarea şi conservarea probelor de sânge

În timpul stocării concentraţiile constituenţilor sanguini din probele prelevate pentru

analize se pot modifica din diferite cauze, cum ar fi: adsorbţia la nivelul pereţilor de sticlă sau
plastic ai tuburilor de prelevare, denaturarea proteinelor, evaporarea compuşilor volatili, trecerea
apei în celule, având ca efect hemoconcentrarea serului sau plasmei, precum şi datorită
metabolismului limfocitelor şi eritrocitelor. Aceste schimbări se petrec în proporţie diferită la
temperatura ambiantă, dar şi la temperatura scăzută din frigidere. Cerinţele de stocare diferă în
funcţie de compusul analizat.
Studiile au arătat că modificările semnificative în concentraţia diferiţilor analiţi survin în
special atunci când serul sau plasma sanguină rămân în contact prelungit cu celulele sanguine.
Dacă se separă faza lichidă de elementele figurate, analiţii sunt mai stabili în plasmă sau în ser.
De exemplu, concentraţia de glucoză în sângele integral recoltat scade rapid în primele 24 ore şi
mai lent după aceea. Pentru a preîntâmpina acest efect, se recomandă separarea imediată a
serului sau plasmei de elementele figurate ale sângelui sau recoltarea sângelui pe fluorură de
sodiu, care inhibă glicoliza în eritrocite.
În cazul plasmei rămasă neseparată de elementele figurate sanguine, s-au observat după
24 ore de la recoltare creşteri semnificative ale concentraţiilor de uree, bilirubină, albumină,
calciu, magneziu, proteine totale. Aceste creşteri sunt atribuite fenomenului de hemoconcentrare
survenit în urma trecerii apei din mediul fluid în celulele sanguine.

Tabelul 4. Conservabilitatea probelor după prelevare

Metabolitul/activitatea Proba analizată +4°C -20°C

enzimatică

22 | P a g e
Acid uric ser sanguin 5 zile 6 luni
Aldolază ser sanguin 5 zile 15 zile
Amilază ser sanguin, 7 zile 7 zile
urină 10 zile 7 zile
Bilirubină ser sanguin, 4 zile la întuneric
plasmă
Colesterol ser sanguin, 6 zile 7 luni
plasmă
Corpi cetonici sânge total, 2 ore
urină 2 ore
Electroforeză – proteine ser sanguin 2 zile
serice
Fosfolipide ser sanguin - 30 zile
Glucoză sânge total -2-3 zile după 10 zile
deproteinizare cu TCA
- 4 ore nedeproteinizat
Gamma glutamil ser sanguin 7 zile -
transpeptidază plasmă
GOT ser sanguin 3 zile 7 zile
plasmă (scade 8 %)
GPT ser sanguin 3 zile 7 zile
(scade 10 %)
Acid lactic plasmă 6 zile (fluorură/EDTA) 14 zile
Lactat dehidrogenază ser sanguin 3 zile nu se
(scade 8 %) pretează la
congelare
Lipide totale ser sanguin 7 zile -
Proteină totală ser sanguin 6 zile 10 zile
urină 6 zile
Trigliceride ser sanguin 3 zile >10 zile

23 | P a g e
 Uree ser sanguin 3 zile -
plasmă

Principii generale de prelevare, prelucrare şi stocare a probelor de urină utilizate în

laboratorul de biochimie

Pentru a avea certitudinea unor rezultate corecte, colectarea şi stocarea probelor de urină
pentru examene de laborator trebuie să respecte cu stricteţe regulile prevăzute în protocoalele de
lucru. Examenul de urină cuprinde trei tipuri de teste de laborator: chimice, bacteriologice şi
microscopice. Există câteva tipuri de colectare, recomandate după caz, pentru probele de urină:
- Urina de dimineaţă, recoltată pentru examenul chimic în recipiente curate;
- Urina de 24 ore, recoltată în recipiente speciale de plastic, curate, având capcitatea de 4
L;
- Urina recoltată prin cateter;
- Urina recoltată steril pentru examenul bacteriologic în recipiente speciale, sterile.
Stocarea şi conservarea probelor de urină în condiţii oprime este esenţială pentru acurateţea
rezultatelor analizelor. Probele de urină sunt susceptibile de descompunere sub influenţa
bacteriilor, ceea ce induce modificări chimice inerente.

Table 3-13 lists common changes that occur as urine decomposes.

Tabelul 5. Lista modificărilor care survin în probele de urină descompuse deoarece nu au

fost analizate la timp

Schimbarea produsă Cauza

Modificarea culorii Degradarea sau alterarea compuşilor
cormogeni (hemoglobină, melanină, porfirine,

24 | P a g e

Modificarea mirosului
Creşterea turbidităţii
Scăderea falsă a pH-ului
Creşterea falsă a pH-ului
Rezultat fals negativ la identificarea glucozei
Rezultat fals negativ la identificarea corpilor
cetonici
Rezultat fals negativ la identificarea
bilirubinei
Rezultat fals negativ la identificarea
urobilinogenului
Rezultat fals negativ la identificarea nitriţilor
Rezultat fals pozitiv la identificarea nitriţilor
Dezintegrarea celulelor
acid homogentisic)
Dezvoltarea florei bacteriene, descompunerea
constituienţilor
Dezvoltarea florei bacteriene, formarea de
cristale, precipitarea substanţelor amorfe
Transformarea glucozei în compuşi acizi în
urma glicolizei desfăşurate de bacterii
Descompunerea bacteriană a ureei cu formare
de amoniac
Glicoliza bacteriană
Volatilizarea acetone, descompunerea
bacteriană a acetil acetatului
Fotodescompunerea bilirubinei, oxidarea la
biliverdină
Fotodescompunerea urobilinogenului
Transformarea nitriţilor în azot
Producerea de către bacterii a nitriţilor
Urină alcalină sau/şi hipotonică

Pentru prevenirea dezvoltării bacteriilor în probele de urină, probele trebuiesc puse la

frigider imediat după recoltare şi, atunci când este necesar, suplimentate cu conservanţi adecvaţi.
În special pentru urina recoltată în 24 ore este necesară adăugarea conservanţilor. Dacă se
utilizează conservanţi cu caracter puternic acid, introduşi în vasul de colectare înainte de
recoltare, este obligatoriu ca acest lucru să se specific pe eticheta probei, pentru a avertiza
pacientul care va recolta proba şi a preîntâmpina eventuale accidente.
Se recomandă analizarea probelor de urină în cel mai scurt timp posibil după recoltare,
pentru a împiedica descompunerea sau alterarea constituienţilor, în mod ideal, la mai puţin de o
oră.

25 | P a g e
 La temperatura ambientului urina devine sediul unei masive colonizări bacteriene, care se
soldează cu modificări ale pH-ului şi deci, ale sedimentului. Unele componente ale sale sunt fie
volatile (corpi cetonici), fie suferă descompunere rapidă (glucide, sediment organic, bilirubină).

În cazuri fortuite urina se poate stoca în recipienţi închişi la 4°C sub protecţie de
antibiotic (penicilină- streptomicină) sau de formol (1 mL formol la 10 mL urină). Fluorura de
sodiu se poate adăuga în probele de urină colectată în 24 ore pentru determinarea glucozei, în
scopul de a inhiba dezvoltarea bacteriană şi glicoliza (0,5 g fluorură de sodiu la 3-4 L urină).
Urina poate fi şi îngheţată, păstrată astfel pentru a fi analizată mai târziu, sau ca şi contraprobă.
La decongelare se va efectua analiza completă, fără ca proba să mai fie recongelată ulterior.

Tabelul 6. Lista conservanţilor admişi pentru probele de urină de 24 ore

Conservantul Analizele care pot fi efectuate

Fără conservanţi, numai cu refrigerare Aminoacizi, amilază, calciu, cloruri, citrat,
cupru, creatinină, glucoză, metale grele, acid
metil malonic, fosfor, mucopolizaharide,
porfobilinogen, porfirine, potasiu, proteine,
uree, acid uric
Acid boric Cortizol, aldosteronă
Acid clorhidric 6N Catecolamine, acid homovanilic,
hidroxiprolină, oxalaţi
Fluorură de sodiu Glucoză

26 | P a g e
6. Capitolul I. Explorarea funcţională a rinichiului
Prezentare generală a aparatului excretor, patologie
Parametrii biochimici în explorarea funcţională a rinichiului.

27 | P a g e
 DETERMINAREA CREATININEI

Alături de ATP, creatinfosfatul reprezintă un veritabil compus macroergic. Acesta din

urmă se poate acumula în anumite limite în muşchi constituindu-se ca o “rezervă” de legături
macroergice. Depozitarea se face în starea de repaus şi în condiţiile excesului de ATP.
Creantinfosfatul serveşte pentru furnizarea rapidă de energie, hidroliza ATP necesitând timp mai
lung. Sinteza şi utilizarea creatinfosfatului în muşchi se fac prin intermediul reacţiei reversibile
catalizată de creatinkinază:

creatină creatin fosfat

Raportul creatină/fosfocreatină creşte în cursul activităţii musculare prin utilizarea

fosfocreatinei.
Creatinina este metabolitul creatinei şi fosfocreatinei şi se formează în urma reacţiei:

28 | P a g e
 Creatinina este excretată pe cale renală. Concentraţia ei va creşte în sânge în cazul
insuficienţei renale.

Principiul metodei

Creatinina (anhidrida acidului metil-guanidinacetic) formează cu acidul picric în mediu

alcalin picratul de creatinină de culoare galbenă portocalie (reacţia Jaffe), fotometrabil.

Reactivi:

1. Soluţie acid picric 1,2g%

2. Soluţie NaOH 10%
3. Soluţie standard de creatinină 2 mg/dL

Mod de lucru

Reactivi (mL ) Probă Standard

Ser sau urină diluată 1:99 0,5 -
Soluţie acid picric 1 1
Soluţie standard - 0,5
Agitare, repaus 10 minute la temperatura camerei
Soluţie NaOH 0,1 0,1
Agitare, repaus 5min., citire la 530nm. faţă de apă distilată

Calcul
ΔAp/ ΔAst x 2= mg/ dL ser creatinină

29 | P a g e
Valori normale şi interpretare

a) În ser, acestea variază între 0,6 - 1,2 mg % pentru bărbaţi şi 0,5 - 1 mg% pentru femei.
În nefritele cronice, când ureea trece de 50%, creatinina sanguină poate depăşi 5 mg%, indicând
astfel un prognostic sever. În unele forme de nefrită cronică şi în obstrucţia căilor urinare se pot
întâlni valori de 10 - 15 mg % în ser.
Valori scăzute se întâlnesc în distrofii musculare, ca urmare a intensificării
catabolismului muscular.
Concentraţia creatininei nu este influenţată de regimul alimentar sau de efort fizic.
b) În urină, valorile normale variază între 0 - 40 mg/ 24 ore la femei şi 0 - 80 mg/ 24 ore la
bărbaţi. Excreţia urinară este direct porporţională cu masa musculară. Sunt eliminaţi aporximativ
0,5 moli creatinină / kg masă musculară.
Creatinina nu este detreminată în sânge sau urină în mod obişnuit. Creşteri ale creatininei
au fost observate doar în distrugeri musculare intense.

30 | P a g e
 DETERMINAREA UREEI

Ureea se formează în ficat prin intermediul ciclului ureogenetic din amoniacul produs prin
dezaminarea oxidativă a aminoacizilor.
Excreţia ureei se face prin rinichi.
Sursa principală a creşterii ureei în sânge este alterarea funcţiei renale.
Concentraţia ureei în sânge este determinată de balanţa dintre asimilarea şi catabolizarea azotului
proteic.
În cazul unei diureze reduse, rinichii nu pot excreta tot azotul rezultat din catabolismul proteic,
astfel că va rezulta o creştere a uremiei.

Principiul metodei
Ureea condensează cu diacetil monoxima în mediu acid, dând un compus colorat.
Reactivi

1. Diacetil monoximă:
1g diacetil monoximă (2,3 butandion - monoximă)
0,2g tiosemicarbazidă
9g Na Cl
Se dizolvă în apă şi se aduce la 1000mL

60 mL H2SO4 concentrat
10 mL acid fosforic 85%
100 mL apă distilată
Se omogenizează şi se adaugă 0,1g clorură ferică
Se aduce la 1000mL cu apă distilată
3. Soluţie standard stoc (129 mg/dL uree)
0,644g uree se dizolvă în 500mL din următoarea soluţie:
2g acid benzoic

31 | P a g e
0,8mL H2SO4 concentrat
Adus la 1000 mL cu apă distilată
4.Soluţie standard de lucru (64,5 mg/dL uree)
Se dizolvă soluţia stoc 1:2 cu apă distilată.

Mod de lucru
Se poate lucra pe ser nedeproteinizat dacă nu este hemolizat.

Reactivi (mL ) Probă Martor Standard

Reactiv diacetil 3 3 3
monoxină
Reactiv acid 3 3 3
Ser 0,05 - -
Standard lucru - - 0,05
Apă distilată - 0,05 -
Încălzire la 100°C timp de 15min
Răcire, citire la 520nm faţă de martor

Calcul

uree mg/dL

Valori normale şi interpretare

Valorile normale sunt cuprinse între 25-50 mg/dL.

Creşterea concentraţiei ureei în sânge se întâlneşte în glomerulonefrită acută sau cronică şi în alte
maladii renale ca urmare a unei excretii defectuoase. Accelerarea ritmului de catabolizarea a
proteinelor tisulare (stări febrile, arsuri) determină creşteri uşoare ale uremiei. După ingerstia
unor cantităţi mari de proteine se constată o creştere tranzitorie a concentraţiei ureei serice.
Scăderea concentraţiei ureei în sânge este legată de alterări profunde ale funcţiei hepatice, ficatul
fiind organul care sintetizează ureea. Valori scăzute ale ureei se întâlnesc în atrofia galbenă a
ficatului, necroza hepatică, intoxicaţii cu fosfor, cloroform, tetraclorură de carbon.

32 | P a g e
 DETERMINAREA ACIDULUI URIC

La om şi la maimuţele antropoide produsul final al catabolizării bazelor purinice este

acidul uric care se elimină prin urină.
La pH fiziologic el se află în sânge ca monourat de sodiu. Creşterea cantităţii de acid uric
sanguin peste pragul de solubilitate duce la depunerea acestuia ca săruri la nivelul articulaţiilor
(artrită gutoasă).
Hiperuricemia se poate datora fie tulburărilor genetice ale metabolismului nucleotidelor
(gută primară, metabolică), fie este efectul secundar al unor maladii (guta secundară).

Principiul metodei

Acidul uric reduce reactivul fosfo- wolframic în mediu alcalin, formând un complex de culoare
albastră, fotometrabil.

Reactivi

1. soluţie acetat de uranil 1,55 %

2. soluţie carbonat de sodiu 22 %
3. reactiv fosfowolframic
50g wolframat de sodiu
30mL apă distilată
20mL acid ortofosforic 85 %
se refluxează amestecul 2 ore.
În final se adaugă o picătură de brom lichid.
Se mai fierbe câteva minute, se răceşte si se aduce la 1000 mL cu apă.
4. soluţie standard stoc acid uric:
1g carbonat de litiu se dizolvă în 500mL apă distilată într-un balon
cotat de 1000 mL ; se adaugă 0,5 g acid uric; după dizolvare se adaugă 5
mL . formaldehidă 40 % şi se ajustează pH-ul la 5,5 cu acid acetic.
5. soluţie standard de lucru: se diluează soluţia 4. 1:10 obţinându-se o
concentraţie de 5mg/dL acid uric.

33 | P a g e
Mod de lucru

Într-o cupă de centrifugă se pipetează:

1mL ser
3mL apă distilată
1mL soluţie acetat de uranil
se centrifughează la 3000 rpm., 10min.

Reactivi (mL ) Probă Standard Martor

Supernatant 2 - -
Soluţie standard de lucru - 2 -
Reactiv fosfowolframic 0,1 0,1 0,1
Soluţie Na2CO3 0,9 0,9 0,9
Omogenizare, repaus, 10min, citire faţă de martor la 610 nm.

Calcul

acid uric

Valori normale şi interpretare

Valorile normale se situează între 2-5 mg/dL. În funcţie de alimentaţie, sex, vârstă, factori
genetici, valorile acestui parametru pot varia între nişte limite normale.
Alimentaţia bogată în acizi nucleici determină creşterea uricemiei şi creşterea excreţiei
lui prin urină.
La nou născuţi uricemia este mai crescută decât la adulţi iar la copii este mai scăzută.
De asemenea, la bărbaţi uricemia este mai mare decât la femei.
Patologic, valori crescute se întâlnesc în: gută, insuficienţă renală cronică, afecţiuni care
generează degradarea exagerată tisulară sau leucocitară, intoxicaţii cu Pb sau Hg.
Valori scăzute se întâlnesc în maladia Wilson şi după tratamentele cu citostatice.

34 | P a g e
 CAPITOLUL II DIABETUL ZAHARAT

Prezentare generală a disfuncţiei metabolice

Diabetul zaharat este o patologie metabolică caracterizată de o hiperglicemie cronică, cu

pereturbări ale metabolismului glucidic, lipidic şi proteic. Aceste perturbări sunt în relaţie directă
cu o deficienţă de secreţie şi/sau de acţiune a hormonului insulină. Este o patologie frecvent
întalnită (aproximativ 1-2% în societatea occidentală). În unele cazuri –relativ rare- diabetul
poate constitui o patologie secundară, consecinţă a unei pancreatite sau a unei intervenţii
chirurgicale la nivelul pancreasului, sau a unei hipersecreţii a hormonilor cu acţiuni antagonice
insulinei (exemplu: sindromul Cushing, acromegalia).
Diabetul primar este de două tipuri:
-diabetul de tip I, în care are loc o destrucţie a celulelor pancreatice, care conduce la o
diminuare şi în final la o încetare a secreţiei de insulină. Aproximativ 10% dintre diabetici suferă
de diabet zaharat de tip I. Diabetul zaharat de tip I apare în general la subiecţii tineri şi debutează
acut, în câteva zile sau în câteva saptamâni. Totodată, se semnalează o fază preliminară bolii, de
pre-diabet, de câteva luni, în care se observă anomalii de creştere la copii, un deficit de răspuns
al organismului la acţiunea insulinei, diferite anomalii imunologice, diabetul zaharat de tip I fiind
considerat o boală autoimună;
-diabetul de tip II, în care secreţia de insulină este insuficientă, sau apare un fenomen de
rezistenţă a organismului la acţiunea insulinei. Din aceste motive, apare o hiperglicemie
persistentă. Diabeticii cu diabet de tip II sunt trataţi prin dietă alimentară adecvată, asociată sau
nu cu tratament cu antidiabetice administrate oral. Numai în anumite cazuri se poate institui
terapie de substituţie cu insulină, pentru o mai bună echilibrare a glicemiei. Diabetul de tip II
evoluează mult mai lent, la subiecţi cu vârste de peste 50 de ani (deşi în ultimul timp se
semnalează cazuri din ce în ce mai frecvente la subiecţii tineri, obezi), cu simptomatologie care
se dezvoltă timp de cateva luni sau chiar ani. Prevalenţa diabetului zaharat de tip II creşte cu
vârsta în rândul populaţiei din societăţile de tip occidental, ajungând la peste 10% din populaţia
trecută de 75 de ani. Patogeneza diabetului zaharat de tip II este incomplet cunoscută. Pe lângă

35 | P a g e
genetică, stilul de viaţă par a fi cei doi factori favorizanţi. Cu siguranţă, este vorba de o patologie
heterogenă, în care disfuncţia celulelor β-pancreatice coexistă cu fenomenul de rezistenţă la
insulină. O genetică deficitară constituie, conform tuturor observaţiilor de până acum, un
important factor de risc. S-a calculat că riscul individual de diabet de tip II este mai mare de 50%
pentru un subiect ai căror părinţi sunt ambii diabetici. Au fost identificate mai multe deficite
monogenice, mai ales la formele ereditar dominante care se dezvoltă la subiecţii tineri (Maturity-
Onset-Diabetes-of the-Young, MODY). În aceste cazuri, mutaţia cel mai des întâlnită afectează
gena responsabilă de sinteza enzimei glucokinază. Glucokinaza este enzima care reglează
metabolismul glucidic la nivelul celulelor β-pancreatice, acţionând ca un senzor de glucoză,
constituind un element cheie în reglarea secreţiei de insulină. Totuşi, faţă de incidenţa acestei
mutaţii, frecvenţa apariţiei bolii este mult mai mare, ceea ce demonstrează că afectarea genetică
este poligenică, iar ereditatea joacă un rol important, dar nu decisiv.
Factorii de mediu şi de stil de viaţă sunt la fel de importanţi: mulţi dintre pacienţii cu
diabet de tip II sunt obezi, cu o semnificativă depunere adipoasă pe viscere (intrabdominal),
cunoscută de clinicieni ca fiind un factor asociat cu insulino rezistenţa. Sedentarismul provoacă
de asemenea insulino rezistenţă, la fel ca şi unele medicamente, cum ar fi: corticosteroizii, β-
blocantele, tiazolidinele.
Această dublă etiologie este relevată de observaţii privind incidenţa bolii în anumite
grupuri etnice, spre exemplu, populaţiile din insulele din Pacific care au adoptat un stil de viaţă şi
de alimentaţie occidental. Se presupune că genotipul acestor persoane a fost programat pentru
stocarea de energie sub formă de depozite lipidice, cu scopul de a rezista cât mai indelung unor
perioade de deprivare alimentară, fapt care survenea frecvent în timpul în care strămoşii acestor
presoane duceau modul lor originar de viaţă şi se alimentau în mod tradiţional (genotip de
economisire). O alimentaţie abundentă, cu mulţi compuşi glucidici, conduce rapid la obezitate şi
la intoleranţă la glucoză în cazul membrilor acestor populaţii. Există şi o ipoteză a aşa-numitului
fenotip de economisire, care prevede că o greutate mică la naştere predispune la apariţia
diabetului zaharat de tip II la maturitate, aflată în relaţie cu faptul că o disfuncţie a celulelor β-
pancreatice poate fi indusă de o malnutriţie în perioada fetală.
Manifestările clinice ale diabetului zaharat se împart în două categorii: cele direct legate
de disfuncţia metabolică şi cele survenite după un timp îndelungat, ca şi complicaţii ale bolii.

36 | P a g e
 Hiperglicemia în diabetul zaharat rezultă în principal din exacerbarea gluconeogenezei
hepatice, asociată cu insuficienta utilizare a glucozei de către celelalte ţesuturi. La nivel renal,
glucoza este complet reabsorbită de tubii proximali, dar pentru glicemii mai mari de 180 mg/dL
(10 mM) mecanismele de reabsorbţie sunt saturate şi glucoza trece în urină (glucozurie).
Glucozuria determină o diureză osmotică, adică o amplificare a eliminării de apă din organism
pe cale renală. Aceasta provoacă o creştere a osmolarităţii plasmatice, cu scoatere a apei din
compartimentele intra celulare, pentru încercarea echilibrării. Acest mecanism stimulează centrul
setei. Se declanşează astfel două dintre simptomele clinice ale diabetului: poliurie (volum mare
de urină) şi polidipsie (sete intensă). Simptomele descrie nu sunt însa caracteristice doar
diabetului, ele se manifestă şi în diabetul insipid, în hipercalcemii, hipokalemii cronice,
insuficienţă renală cronică sau în ingestie excesivă de apă (potomanie). Netratate, aceste
perturbări metabolice se agravează şi se dezvoltă o acidoză metabolică, care poate pune în
pericol viaţa pacientului.
Complicaţiile pe termen lung ale diabetului zaharat sunt de două tipuri: complicaţii de tip
microvascular (nefropatii, neuropatii şi retinopatii) şi complicaţiile de tip macrovascular în
legătură cu ateroscleroza. Ateroscleroza apare la ambele tipuri de diabet zaharat. Prevalenţa
acestor complicaţii creşte cu evoluţia în timp a bolii. Dacă echilibru glicemic nu este
supravegheat prin respectarea tratamentului şi a dietei, riscul de complicaţii microvasculare
creşte. Există însă şi aici excepţii, unii pacienţi nedezvoltând niciodată astfel de complicaţii, pe
când alţii sunt afectaţi precoce, chiar dacă aparent este menţinut echilibrul glicemic.
Caracteristica patologică în cazul complicaţiilor microvasculare constă în contractarea
lumenului vaselor capilare, aflată în relaţie directă cu expunerea prelungită la concentraţii mari
de glucoză. Fenomenul este complex şi insuficient înţeles, două elemente părând a fi importante:
-creşterea concentraţiei de sorbitol, compus derivat din glucoză sub acţiunea aldoz-
reductazei, cu acumularea acestuia în celule. Acest compus provoacă dezechilibre osmotice,
alterează statusul oxidativ celular şi scade concentraţia celulară de inozitol;
-formarea de produşi cu grad de glicare ridicat. Glucoza poate reacţiona cu grupările
amino din lanţurile polipetidice ale proteinelor, formând proteine glicate plasmatice şi tisulare.
Acestea se pot ataşa şi depune pe interiorul pereţilor vasculari, producându-le degradări
structurale şi funcţionale.

37 | P a g e
 Creşterea riscului de apariţie a aterosclerozei la pacienţii diabetici are de asemenea cauze
multifactoriale. Dislipidemiile care însoţesc diabetul şi glicarea lipoproteinelor, care induce
alterarea funcţiilor lor, au o mare importanţă.
Alt factor care este asociat cu degradarea structurii şi funcţionalităţii endoteliului vascular
este stressul oxidativ celular.
Complicaţiile pe termen lung ale diabetului zaharat sunt responsabile de creşterea
morbidităţii şi mortalităţii în rândul acestor pacienţi.
O altă disfuncţie metabolică asociată cu diabetul zaharat constă în acidoza metabolică,
survenită în urma exacerbării cetogenezei. Deficitul de insulină provoacă o amplificare a ratei de
desfăşurare a lipolizei, cu o eliberare accentuată de acizi graşi din ţesutul adipos în sânge şi cu o
diminuare a lipogenezei. La nivelul ţesutului hepatic acizii graşi sunt fie complet oxidaţi (β-
oxidarea acizilor graşi), fie re-esterificaţi cu glicerol şi eliberaţi în sânge, fie transformaţi în corpi
cetonici (cetogeneza). Cetogeneza este favorizată în diabetul zaharat decompensat de către
diminarea raportului insulină/ glucagon. Glucagonul inhibă sinteza malonil-CoA, compusul-
cheie din sinteza de novo a acizilor graşi, inhibând astfel această cale metabolică.
Exacerbarea producerii de corpi cetonici, cu caracter acid, consumă rezerva alcalină şi
interferă în mecanismele de homeostazie a pH-ului sanguin.
Urmărirea evoluţie bolii, cu posibilele complicaţii care pot surveni, implică o strânsă
colaborare între specialiştii din domeniul biochimiei clinice şi medicii clinicieni.

Diagnosticul diabetului zaharat

Diagnosticul se face prin determinarea glicemiei şi punerea în evidenţă a glucozuriei. În

absenţa altor simptome, o glicemie de peste 7 mM în sângele venos, cu priză a jeun, necesită o
repetare de câteva ori a determinării pentru certificarea diagnosticului. Chiar şi în cazul
pacienţilor care manifestă şi simptome clinice, diagnosticul de diabet zaharat este discutabil,
dacă valorile glicemiei sunt sub 5,5 mM în sângele venos. Pentru subiecţii care prezintă valori
ale glicemiei a jeun constant peste aceste limite, se consideră un statut de hiperglicemie a jeun.
În cazul lor este necesară evaluarea răspunsului lor la o hiperglicemie provocată pentru a
certifica un diagnostic.

38 | P a g e
 Tabelul . Schema de lucru pentru testul de hiperglicemie provocată pe cale orală pentru
certificarea diagnosticului de diabet zaharat. Prelevarea de sânge se face a jeun şi la 120 minute
după ingestia de glucoză.

Indicaţii
Verificarea glicemiei a jeun
Glicozurie de etiologie necunoscută, mai ales
în perioadele de sarcină
Semne clinice de diabet zaharat sau de
complicaţii specifice
Protocol
Alimentaţie normală, conţinând minimum 250
g glucide /zi timp de trei zile. Repaus
alimentar de 12 ore.
Prelevare de sânge venos pentru determinarea
glicemiei a jeun.
Priză orală de 75 g glucoză dizolvată în apă.
Prelevare de sânge venos la 60 de minute şi la
120 de minute pentru determinarea glicemiei.
Pacientrul rămâne în repaus pe toată perioada
testului. Nu este permis să fumeze, dar poate
bea apă.

Interpretarea rezultatelor testului de hiperglicemie provocată poate certifica un daignostic

de diabet zaharat la pacienţii cu suspiciune. Testul poate identifica o categorie de hiperglicemie
numită intoleranţă la glucoză, neechivalentă cu diabetul, dar care reprezintă un stadiu
premergător bolii. Acest stadiu defineşte un risc însemnat de dezvoltare a diabetului în viitor.
Aceşti pacienţi ar trebi să-şi modifice stilul de viaţă şi alimentaţia şi să-şi supravegheze valorile
glicemiei. În acest fel este posibil ca unii dintre ei să revină la o toleranţă normală la glucoză. Se
pare, de asemenea, că aceşti pacienţi au un risc la fel de ridicat ca şi diabeticii de dezvoltare a
unui infarct de miocard sau a unui accident vascular cerebral. Riscurile microvasculare nu sunt
însă la fel de mari.
Urmărirea evoluţie bolii şi a eficienţei tratamentului se face în plan clinic prin
examinarea pacientului de către medicul specialist şi în plan biochimic prin dozarea periodică a
concentraţiei de glucoză din sânge şi prin urmărirea altor markeri biochimici.

39 | P a g e
 Dozarea hemoglobinei glicate (glicozilate) constituie un mijloc eficient de evaluare
retrospectivă a echilibrului glicemic pe o perioadă mai lungă. Hemoglobina suferă procesul de
glicare in vivo proporţional cu concentraţia de glucoză sanguină. Compusul format, hemoglobina
glicată (HbA1c) ramâne în celulă până la moartea acesteia. Proporţia de hemoglobină care este
glicată reprezintă o reflectare a valorilor glicemiei pe o perioadă de 6-8 săptămâni. Valoarea de
referinţă a HbA1c este sub 6%, pe când în diabetul decompensat poate atinge valori de peste 10%.
În cazul pacienţilor cu anemie hemolitică, la care durata de viaţă a hematiilor este scurtată,
interpretarea rezultatelor trebuie să fie rezervată.
Hemoglobina glicată poate da de gol în faţa medicului curant un pacient care nu-şi
respectă în general tratamentul şi regimul alimentar şi care face un efort de a le respecta numai
cu câteva zile înaintea consultului. În acest caz glicemia poate fi scăzută, dar hemoglobina
glicată indică o istorie de hiperglicemie.
Există şi alte proteine care suferă procesul de glicare, fructozamina plasmatică
constituind un indice al glicării proteice, mai ales a albuminei serice, care reflectă controlul
glicemic, dar acest parametru este mult mai puţin utilizat în clinică.
Alţi parametri biochimici care pot oferi informaţii importante pentru evoluţia bolii sunt:
microalbuminuria (indicator al unui început de nefropatie diabetică), creatinina plasmatică
(indicator al unei complicaţii renale mai vechi), compuşii lipidici (indicatori ai procesului
aterosclerotic) şi de aemenea corpii cetonici urinari (cetonuria).
Dislipidemiile în diabetul zaharat apar ca o consecinţă a diminuării secreţiei de insulină.
Acest hormon endocrin joacă un rol cheie în controlul metabolismului lipidic, ambele tipuri de
diabet având drept consecinţă apariţia perturbărilor gestiunii compuşilor lipidici. În cazul
diabetului zaharar de tip I, o dată cu deteriorarea echilibrului glicemic, apar hiper
triacilglicerolemii accentuate, cu creşterea concentraţiei VLDL şi frecvent şi a chilomicronilor,
în legătură cu diminuarea activităţii lipoprotein-lipazei stimulate de insulină şi a creşterii
activităţii lipazelor hormon-sensibile, care sunt inhibate de insulină. Aceste evenimente conduc
la amplificarea în sânge a fluxului de acizi graşi liberi proveniţi din ţesutul adipos. Prezenţa
insulinei re-echilibrează procesele metabolice, diminuând conţinutul lipidic al sângelui.
Şi în diabetul zaharat de tip II hiper triacilglicerolemia apare frecvent, chiar dacă nu este
atât de severă ca în diabetul zaharat de tip I. În acest caz cauza principală constă în amplificarea
sintezei hepatice de triacilgliceroli. VLDL conţin mai mulţi triacilgliceroli şi colesterol esterificat

40 | P a g e
în comparaţie cu apoproteinele specifice acestor particule lipoproteice. Particulele devin astfel
mai mici şi mai dense şi în consecinţă mai aterogene.
În ambele tipuri de diabet s-a observat o scădere a cantităţii de particule HDL. De
asemenea, în ambele tipuri de diabet, glicarea apoproteinei B, specifice LDL, poate creşte
aterogenicitatea particulelor LDL, prin scăderea afinităţii acestei proteine pentru receptorul său
specific. În acelaşi timp are loc o exacerbare a afinităţii receptorului scavenger al macrofagelor.

13. Determinarea glucozei sanguine

cu orto-toluidină

În istoricul biochimiei clinice, acest compus constituie unul din primii determinaţi din
sânge şi din urină.
Concentraţia glucozei în sânge este legată de factorii de reglare (hormoni pancreatici şi
corticoizi). În principal, factorul reglator vizat în această determinare este insulina, legată direct
de buna funcţionare a pancreasului endocrin. Creşterea frecvenţei diabetului în societatea
modernă obligă măsurarea acestui parametru în orice test de screening.

Principiul metodei

Cu o-toluidina, glucoza formează la cald, în mediu puternic acid, un compus colorat cu

maxim de absorbţie la 650 nm. Acest compus este o bază Schiff, formată prin condensarea
grupării aldehidice cu toluidina.

41 | P a g e
 Reacţia nu este specifică glucozei, dar în sânge şi urină manoza şi galactoza se găsesc în
concentraţii mult prea mici. Aldopentozele dau în aceleaşi condiţii un produs cu absorbţie
maximă la 480 nm.

Reactivi

1. Reactiv o-toluidină: 1,5g tiouree se dizolvă în 400 mL acid acetic glacial. Se adaugă 60
mL o-toluidină proaspăt distilată şi 500 mL 2,3 butandiol. Se aduce la 1 L cu acid acetic glacial.
2. Soluţie acid tricloracetic 3%
3. Soluţie stoc glucoză (1000 mg/dL): 1 g glucoză anhidră se dizolvă în 80 mL soluţie
acid benzoic 1,4 g/L. Se aduce la 100 mL cu soluţie acid benzoic. Se păstrează la frigider.
4. Soluţie standard glucoză (100 mg/dL): se obţine prin diluarea soluţiei stoc 1:10 cu apă
distilată.

Recomandări pentru prelevarea probelor de sânge

Sângele pentru analiză trebuie recoltat de dimineaţă, după ce în prealabil pacientul nu a

mâncat nimic timp de minimum 8 ore, putând să bea doar apă. Există dovezi experimentale că

42 | P a g e
glicemia prezintă variaţii diurne semnificative, fiind mai crescută dimineaţa şi mai scăzută după-
amiaza.
Pentru a înlătura riscul major de scădere a concentraţiei de glucoză în proba de sânge,
după prelevare, datorită glicolizei care continuă la nivelul hematiilor, se recomandă separarea
imediată a plasmei de elementele figurate ale sângelui. Concentraţia de glucoză în proba de
plasmă sanguină nehemolizată rămâne astfel stabilă timp de 72 ore la 4°C.

Mod de lucru

Reactiv (mL ) - în tuburi de

Probă Martor Standard
centrifugă
Sânge 0,5 - -
Apă distilată - 0,5 -
Soluţie standard - - 0,5
Acid triclor acetic 3% 4,5 4,5 4,5
Agitare, centrifugare 5 minute la 3500 rpm
Supernatant
Reactiv o-toluidină 3,5 3,5 3,5
Agitare, fierbere 12 minute, răcire sub jet de apă rece citire la 630 nm faţă de
martor

Calcul
Ap /Ast x 100= glucoză mg/dL

Valori normale şi interpretare

Valorile normale pentru această metodă se situează între 70-110 mg/dL. La diabetici, în
funcţie de severitatea bolii se observă valori peste 180 mg/dL iar în pancreatite până la 150
mg/dL. Dezechilibrul metabolismului glucidic observat în diabet este cea mai frecventă cauză de

43 | P a g e
hiperglicemie. Totuşi, pentru o certificare a diagnosticului, se impune şi evaluarea hemoglobinei
glicate, precum şi a prezenţei glucozei în urină (glicozurie).
Valori crescute ale glicemiei se pot înregistra şi după administrarea de anestezice.
Hipoglicemia apare mai ales ca rezultat al: supradozajului cu insulină, hipotiroidismului,
bolii Simmons (hipopituitarism), bolii Addison sau afecţiunilor congenitale datorate perturbării
metabolizării glicogenului.

44 | P a g e
 14. Teste pentru evaluarea dislipidemiilor

Compuşii lipidici joacă un rol esenţial în organism, constituind elemente structurale ale
arhitecturii membranelor celulare, fiind implicaţi în căi metabolice importante şi constituind
precursori ai unor molecule-semnal esenţiale pentru buna desfăşurare a vieţii. Gestionarea
acestor compuşi în cadrul organismului este asigurată prin mecanisme complexe, împlicând
sistemul neuro-endocrin, al căror dezechilibru poate conduce la afecţiuni grave.
Datorită insolubilităţii acestor compuşi în apă, lipidele sunt transportate prin mediul apos al
sângelui prin intermediul unor ansambluri multimoleculare cuprinzând şi proteine specifice
(lipoproteine). Prin intermediul acestor lipoproteine compuşii lipidici proveniţi din sinteza în
organism sau de aport exogen (colesterol liber sau esterificat, acli-gliceroli, fosfo lipide) sunt
distribuiţi la nivelul diferitelor ţesuturi. Aceste lipoproteine sunt clasificate în funcţie de
densitatea lor, care este invers proporţională cu dimensiunea particulelor. Cu cât conţinutul
lipidic este mai mare în raport cu cel proteic, lipoproteinele sunt mai voluminoase dar au
densitate mai mică. Lipoproteinele au fost clasificate în patru mari categorii:
Chilomicronii -sunt cele mai puţin dense lipoproteine, au cel mai mare volum şi au rolul de
a transporta compuşii lipidici din aport alimentar de la nivelul intestinului subţire către celelate
celule ale organismului;
Lipoproteinele cu densitate foarte scăzută (VLDL) –transportă lipidele de provenienţă
endogenă de la nivelul ficatului către celelate celule ale organismului;
Liporoteinele cu densitate intermediară (IDL) –sunt forme tranzitorii, care derivă din
VLDL la trecerea acestora in LDL (liporoteine cu densitate scăzută). Toate aceste trei categorii
de liporoteine sunt bogate în trialcil gliceroli.
Lipoproteinele cu densitate scăzută (LDL) –transportă colesterolul la diferite celule şi
ţesuturi;
Lipoproteinele cu densitate ridicată (HDL) –sunt cele mai dense liporoteine şi sunt
implicate în transportul colesterolului de la diverse celule şi ţesuturi înapoi la ficat. LDL şi HDL
sunt liporoteine care conţin preponderent colesterol ca moleculă lipidică.

45 | P a g e
 O proastă distribuţie a compuşilor lipidici la nivelul peretelui endoteliului vascular poate
conduce la ateroscleroză, proces care induce riscul infarctului de miocard şi/sau al accidentului
vascular cerebral.
Dislipidemiile sunt definite ca modificări patologice ale concentraţiilor de compuşi lipidici
în sânge.
În diabetul zaharat hiperlipidemiile sunt de cauză secundară, survenind drept urmare a
perturbărilor metabolice induse de boală.
Pentru determinarea cu acurateţe a compuşilor lipidici din sânge se recomandă ca pacientul
să nu consume alimente timp de 12-14 ore înainte de prelevarea probei de sânge. Cu precădere
sunt afectate de nerespectarea acestei interdicţii valorile sanguine ale triacilglicerolilor şi ale
HDL-colesterolului.
Postura pacientului la prelevarea probei de sânge este de asemenea importantă, observându-
se că valoarea concentraţiei de colesterol poate creşte cu 10% dacă pacientul stă în picioare
atunci cand i se recoltează proba de sânge.
Bateria uzuală de teste pentru evidenţierea dislipidemiilor constă în: colesterol total,
triacilgliceroli şi HDL-colesterol.
Este recomandabil ca, în cazul identificării unor valori alterate ale parametrilor lipidici la un
pacient, testele să fie reluate după 3-4 luni, pentru certificarea unei eventuale dislipidemii.
O anamneză atentă a pacientului poate identifica sursa primară sau secundară a dislipidemiei
(diabet zaharat, obezitate, etc.).

46 | P a g e
 Determinarea lipidelor totale din ser
(metoda Künkel)

Este o metodă utilizată în procesul de triere (screening) pentru depistarea dislipidemiilor.

Totuşi, valorile acestui test, singure, nu pot da indicaţii suficiente din cauza nespecificităţii
modificărilor şi a variaţiilor structurale.

Principiul metodei

În prezenţa fenolului are loc precipitarea lipoproteinelor cu densitate joasă (beta şi pre-
beta).

Reactivi

1. Soluţie fenol: 10 g fenol şi 120 g NaCl se dizolvă în apă bidistilată caldă în balon cotat
de 1L. Se păstrează la rece maximum 20 zile.
2. Ser fiziologic: 9 g NaCl se dizolvă în apă distilată în balon cotat de 1L. Se păstrează la
rece maximum 2 săptămâni.
3. Soluţie standard stoc: 1g ulei de măsline se dizolvă în etanol absolut şi se aduce la 100
mL cu etanol.
4. Soluţie standard de lucru (500 mg/dL): Se diluează soluţia standard stoc 1:1 cu etanol.

Mod de lucru

Reactivi Probă Martor Standard

Ser 0,1 0,1 -
Soluţie standard de - - 0,1

47 | P a g e
 lucru
Soluţie fenol 3 - 3
Ser fiziologic - 3 -
Agitare, repaus 30 minute la temperatura camerei, citirea absborbanţei la
650 nm faţă de martor

Calcul
Exprimarea rezultatelor se face după următoarea formulă
(Ap/ Ast) x 500 = concentraţia de lipide (mg/dL)

Valori normale şi interpretare

Valorile normale sunt cuprinse între 450 - 850 mg/dL. Compoziţia lipidelor totale
cuprinde: trigliceride (50- 150 mg/dL), fosfolipide (160 - 260 mg/dL) şi colesterol (150 - 220
mg/dL)
Copiii sub un an au valori sub 300 mg/dL. Lipemia creşte mult după mese.
Valorile scăzute apar în: malabsorbţii, inaniţie, subnutriţie, hipertiroidism,
glomerulonefrită acută.
Valorile cresute apar in: hipotiroidism, sindrom nefrotic, diabet zaharat grav, icter
mecanic, ateroscleroza, obezitate morbidă.

48 | P a g e
 Determinarea colesterolului total
(metoda Rappaport- Eichorn)

Colesterolul este un compus sterolic cu funcţiune alcool, care se găseşte exclusiv în

organismele animale.

Constituie precursor pentru sinteza a numeroşi compuşi importanţi din organism, cum ar
fi acizii biliari şi hormonii cu structură steroidică.
Colesterolul seric cuprinde o fracţiune esterificată (70- 78 %) şi o fracţiune liberă (22- 30
%). Metoda de faţă dozează nediscriminator ambele tipuri de colesterol.

Principiul metodei

În prezenţa anhidridei acetice şi a acidului sulfuric colesterolul este deshidradat

obţinându-se un compus cu sistem polienic de culoare verde, în mediu acid. Prin adăugarea de
acid sulfosalicilic se realizează precipitarea proteinelor din ser.

Reactivi

49 | P a g e
 1. Acid sulfuric conc.
2. Anhidridă acetică
3. Acid sulfuric concentrat
4. Acid sulfosalicilic 1% în acid acetic glacial
5. Standard colesterol 250 mg/dL: se dizolvă 125mg colesterol în 30mL acid acetic
glacial, încălzind uşor şi se aduce apoi la 50 mL cu acid acetic glacial. Se păstrează maximum 6
luni la întuneric.

Mod de lucru

Reactiv (mL ) Probă Standard Martor

ser 0,1 - -
soluţie standard - 0,1 -
apă distilată - - 0,1
acid sulfosalicilic 0,6 0,6 0,6
anhidridă acetică 1,5 1,5 1,5
Agitare, răcire 10 minute în apă rece
acid sulfuric conc. 0,2 0,2 0,2
Agitare, 10 minute la întuneric
Citire faţă de martor la 610 nm

Calcul
AP/Ast x 250 = mg/dL colesterol

Valori normale şi interpretare

50 | P a g e
 Valorile normale sunt diferite în funcţie de sex şi vîrstă.

Vîrstă (ani) Bărbaţi(mg/dL) Femei (mg/dL)

20 110-250 110-250
30 120-290 120-290
40 135-315 120-290
50 150-340 135-330
60 140-320 145-355

După cum se observă, femeile au în general valori mai mici decât bărbaţii, dar după
menopauză proporţia se inversează.
Colesterolul creşte în diabet, boli renale, lipidoze, ateroscleroză.
Colesterolul scade în tuberculoză şi în stadiile finale de cancer.
Valorile colesterolului tind să varieze invers proporţional cu rata metabolică bazală, astfel
că pot fi obţinute relaţii cu funcţia tiroidiană. Concentraţia colesterolului variază invers
proporţional cu funcţia tiroidiană, dar există variaţii largi individuale. Colesterolul este influenţat
de dietă numai în timp îndelungat. Populaţiile care consumă multe alimente vegetale şi peşte au
valori mai mici decât cele care au o alimentaţie bazată pe grăsimi animale, amidon şi zahăr.

51 | P a g e
 Determinarea triacilglicerolilor serici

Triacilglicerolii reprezintă una din sursele bogate în energie ale organismului, fiind
principalul combustibil metabolic pe teremen lung. Prin arderea lor completă se obţin un număr
mult mai mare de kcal/g comparativ cu glucoza. În organism provin din aport alimentar sau prin
sinteză la nivel hepatic, de unde trec în plasma şi sunt transportate cu ajutorul lipoproteinelor şi
depozitate în ţesutul adipos şi în ţesutul muscular.

Principiul metodei

Triacilglicerolii serici se determină după hidroliza lor enzimatică cu lipoprotein lipaza.

Indicatorul este un compus chinonic de culoare roşu-violet, format în urma reacţiei dintre
peroxidul de hidrogen, 4-aminofenazona şi N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina sare
de sodiu dihidrat (TOOS), reacţie ce decurge în prezenţa peroxidazei.
Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia triacilglicerolilor din probă.

Triacilgliceroli + H2O Glicerol + Acizi graşi

GK
Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfat + ADP

GPO
Glicerol-3-fosfat Dihidroxiacetona + Fosfat + H2O2

2 H2O2 + 4-aminofenazona + TOOS Chinona + 4 H2O

Reactivi

52 | P a g e
Componentele Kitului Triglycerides liquid TOOS:
R1
R2, reactiv enzimatic conţinând: LPL, GK, GPO, POD, ATP, GOOD Buffer, TOOS, 4-
aminofenazona
R3, soluţie standard triacilgliceroli 200mg/dL(2,26 mmol/L)
Reactivul de lucru se obtine prin amestecarea a 19 mL R1 cu 1 mL R2

53 | P a g e
Mod de lucru

Reactivi (mL) Martor Standard Proba

Reactiv de lucru 2 2 2
Incubare 5 minute la 37 ° C
Apa distilata 0.02 - -
Standard - 0.02 -
Proba ser / plasma - - 0.02
Agitare si incubare 5 minute la 37 ° C. Citire fata de martor la 550nm.

Calcul

AP/Ast x 200 = mg/dL triacilgliceroli

AP/Ast x 2.26=mmol/L triacilgliceroli

Valori normale şi interpretare

40-165 mg triacilgliceroli/ dL ser

Valori crescute apar în tulburări ale metabolismului lipidic, ateroscleroză, boli cardiovasculare,
hepatite, sindrom nefrotic, hipotiroidie, alcoolism, diabet zaharat. Fiziologic, valori crescute apar
în timpul sarcinii.
Valori scăzute se înregistrează în neoplasme, hipertiroidie si malnutriţie.

54 | P a g e
 18. Capitolul III Explorarea funcţională a ficatului
Prezentare generală a metabolismului hepatic,
patologia hepatică

Ficatul este de importanţă vitală pentru metabolismul intermediar şi, de asemenea pentru
procesele de detoxifiere şi de eliminare a substanţelor toxice din organism. Acest organ are o
rezervă funcţională considerabilă şi de aceea examenele simple de evaluare a funcţionării sale,
cum ar fi de exemplu concentraţia serică de bilirubină sau de albumină, constituie indicatori
puţin sensibili ai eventualelor dereglări. Mai multă valoare au pentru explorarea funcţionării
ficatului determinările activităţilor enzimatice conexe cu acest organ. Rezultatele bilanţului
biochimic hepatic standard furnizează rareori un diagnostic precis în lipsa altor mijloace
diagnostice, în particular imagistica şi biopsia. Totuşi, parametrii biochimici clinici sunt de
interes pentru orientarea medicului în punerea unui diagnostic precis.
Ficatul are o dublă irigare sanguină: două treim din sângele care îl irigă provine din vena
portă, care drenează o mare parte a intestinului şi prin intermediul căreia nutrienţii proveniţi din
tubul digestiv ajung în ficat. O treime din sângele care irigă ficatul provine din artera hepatică,
care aduce oxigenul necesar proceselor metabolice care se desfăşoară în ficat. Sângele părăseşte
ficatul prin venele hepatice care converg în vena cavă inferioară.
Activitatea metabolică hepatică are loc în celulele parenchimatoase, care reprezintă 80%
din masa sa organică. Ficatul conţine de asemenea celule Kupffer ale sistemului reticulo-
endotelial. Celulele parenchimatoase sunt contigue de-a lungul sinusurilor venoase, care aduc
substanţele nutritive din tubul digestiv şi canaliculilor biliari, în care sunt secretate din hepatocite
substanţele destinate excreţiei. Aceste substanţe trec prin canalele intrahepatice şi ajung în
duoden prin canlul biliar comun.
Patologiile hepatice care survin cel mai frecvent sunt:
-hepatitele, caracterizate prin leziuni ale hepatocitelor;

55 | P a g e
-cirozele, în care un proces de fibroză duce la restrângerea ţesutului hepatic activ din punct de
vedere metabolic, având drept consecinţă diminuarea funcţiei hepatocelulare şi obstrucţia
fluxului biliar;
-tumorile, în majoritate de cauză secundară, cum ar fi de exemplu metastazele şi cancerul
intestinului gros, al stomacului sau al plămânilor.
Pacienţii care prezintă patologii hepatice au deseori simptome şi semne caracteristice, dar
semnele clinice sunt adesea nespecifice şi uneori o patologie hepatică se poate descoperi
întâmplător. Datorită relaţiei strânse dintre ficat şi sistemul biliar, patologiile biliare
extrahepatice se manifestă adeseori cu semne clinice care evocă o patologie hepatică, sau au
repercursiuni asupra funcţionării ficatului. Spre exemplu, obstrucţia canalului biliar poate
provoca un icter şi, dacă persistă, o formă de ciroză.

56 | P a g e
 Determinarea albuminei serice

Albumina serică este sintetizată exclusiv de ficat iar determinarea nivelului său seric este
utilă pentru explorarea funcţiei ficatului. Albuminemia scade mai ales în cazul afecţiunilor
hepatice cronice, rămânând la valori normale în hepatitele acute, datorită timpului său lung de
înjumătăţire. O concentraţie serică normală la un pacient cu o afecţiune hepatică cronică traduce
o funcţie sintetizatoare intactă a ficatului, pe când o diminuare a concentraţiei albuminei serice
arată că funcţia de sinteză a ficatului este alterată.

Principiul metodei

În mediu tamponat albumina reacţionează cel mai rapid dintre toate proteinele serice cu
verde de brom crezol.
Produsul reacţiei dintre albumină şi colorant trebuie citit imediat, altfel apar interferenţe
cu alte proteine sau cu bilirubina.

Reactivi

1. Tampon citrat pH=3,8

10,2g citrat trisodic
13,7g acid citric
0,2g azidă de sodiu
Se dizolvă în 1000mL apă bidistilată

2. Soluţie NaOH 0,1M

3. Soluţie Brij 20%:20g Brij 35 se dizolvă în 100mL apă distilată
4. Soluţie stoc verde de bromcrezol:
0.7g verde de brom crezol

57 | P a g e
 20mL NaOH 0,1M
Se aduce la 100mL cu apă distilată
5. Reactiv de lucru
100 mL soluţie tampon citrat
21 mL solulţie stoc verde de bromcrezol
25 mL soluţie Brij 20%
Se ajustează pH-ul la 3,8 cu citrat trisodic sau cu acid citric
6. Soluţie standard albumină serică bovină 2g/dL în ser fiziologic

Mod de lucru

Reactivi (mL ) Probă Martor Standard

Reactiv de lucru 3 3 3
Apă bidistilată - 0.05 -
Standard albumină - - 0.05
Ser 0.05 - -
Agitare, repaus 30 sec., citire la 637nm.

Calcul

albumină g /dL

Valori normale şi interpretare

Valorile normale sunt cuprinse între 4,2-5,5 g/dL.

58 | P a g e
Hipoalbuminemiile se pot instala datorita:
-sintezei deficitare la nivel hepatic ca urmare a unei disfuncţii hepatice (ex.: ciroza)
-pierderilor excesive întâlnite in cazul unor afecţiuni renale (ex. :sindrom nefrotic)
-diaree, arsuri, infecţii,, tumori
Hiperalbuminemiile sunt rar întâlnite in patologie si se pot datora unei deshidratări severe
cronice.
Corelând valorile obţinute din determinarea proteinelor serice si a albuminei serice se poate
aprecia mai exact componenta hepatica

59 | P a g e
 Determinarea bilirubinei serice

Producerea bilirubinei ca urmare a descompunerii hemoglobinei are loc în splină şi

celulele Kupfer din ficat.
Fiind un compus insolubil, circulaţia ei in sânge se face după conjugare cu acidul
glucuronic la nivel hepatic. De aici bilirubina conjugată trece in conductul biliar şi este secretată
in tractul gastrointestinal. Există şi o formă de albumina neconjugată, liberă, care circula in
torentul sangvin legata de albumina. Fiind insolubilă nu trece in mod normal prin rinichi in urina.
În mod normal bilirubina se găseşte în sânge în concentraţie foarte redusă.
Creşterea foarte mare a bilirubinei în ser poate avea cauze toxice, infecţioase sau
mecanice. Obstrucţia căilor biliare produce creşterea concentraţiei de bilirubină în sânge.

Principiul metodei

Bilirubina conjugată (directă) reacţionează cu acidul sulfanilic diazotat formând un complex

colorat în roşu în mediu acid sau neutru si un compus colorat in albastru in mediu alcalin.

Determinarea bilirubinei totale se realizează in prezenţa cofeinei deoarece bilirubina liberă,

insolubilă, nu reacţionează direct cu reactivul diazo ci prin adăugare de cofeină care accelerează
reacţia.

60 | P a g e
Reactivi

R1. Acid sulfanilic 29mmol/L

Acid clorhidric 0.17 N
R2. Azotit de sodiu 38.5mmol/L
R3. Cofeina 0.26mol/L
Benzoat de sodiu 0.52mol/L
R4. Tartrat 0.93mol/L
Hidroxid de sodiu 1,9N

61 | P a g e
Mod de lucru

Bilirubina totală

Reactivi(mL) Martor Proba

R1 Acid sulfanilic 0.2 0.2
R2 Azotit de sodiu - 1 pic (0.05mL)
R3 Cofeina 1 1
Ser sangvin - 0.2
Apa distilata 0.2 -
Agitare, repaus 10 min
R4 Tartrat 1 1

Agitare, citire dupa 20 min la 578 nm faţă de martor

Bilirubina directă (conjugată)

Reactivi (mL) Martor Proba

R1 Acid sulfanilic 0.2 0.2
R2 Azotit de sodiu - 1 pic
Ser fiziologic 2 2
Ser sangvin - 0.2
Apa distilata 0.2 -

Agitare, repaus 5 min , absorbanţa se citeste la 546 nm faţă de martor.

Calcul:

Bilirubina totală (µmol/L)= 185x ΔAp

(mg/dL)= 10.8x ΔAp
Bilirubina directă (µmol/L)= 246x ΔAp

62 | P a g e
 (mg/dL)= 14.4x ΔAp

BT-BD = bilirubină indirectă (BI) mg/dL

Valori normale şi interpretare

BT = < 17(µmol/L)
0,1 - 1 (mg/dL)

BD= < 4.3(µmol/L)

0 - 0.25(mg/dL)

Valori crescute ale bilirubinei conjugate (BD) indică faptul ca bila nu este excretată
normal putând fi prezentă
o obstrucţie la nivelul cailor biliare. Valori crescute întâlnindu-se în icter mecanic şi
ciroze.
Valori crescute ale bilirubinei libere (BI) indică fie faptul ca este degradată hemoglobina
in exces, fie o perturbare a mecanismelor hepatice de tratare a hemoglobinei si se întâlnesc în
icter hemolitic.
Ambii parametri cresc în icterul hepatocelular, hepatite, cancer hepatic.

63 | P a g e
 Determinarea transaminazelor serice

Transaminazele serice (alamin aminotransferaza ALT(GpT) E.C. 2.6.1.2. şi aspartat

aminotransferaza AST(GOT) E.C.2.6.1.1.) sunt enzime intracelulare care catalizează reacţia de
transfer al grupării amino de la alfa aminoacizi la alfa cetoacizi:

Glutamat + Oxaloacetat Alfa cetoglutarat + Aspartat.

Glutamat + Piruvat Alfacetoglutarat + Alanină.

HOOC-CH -CH -CH-COO- + HOOC-C-CH -COO-

2 2 2
glutamat NH2 oxaloacetat
O
- -
HOOC-CH -CH-COO +HOOC-CH -CH -C-COO
2 2 2
NH2 O
alfacetoglutarat aspartat

Reacţia catalizată de GOT

HOOC-CH 2-CH 2-CH-COO-+H 3C-C-COO-

NH 2 O
glutamat piruvat

HOOC-CH 2-CH 2-C-COO-+H 3C-CH-COO-

O NH 2
alfacetoglutarat alanina

Reacţia catalizată de GPT

64 | P a g e
 Ele nu au funcţie la nivelul plasmei sanguine, activitatea lor crescând în sânge numai în cazul
unor injurii ale ţesuturilor în care se găsesc în mod normal.
Distribuţia tisulară a celor două transaminaze este diferită:
-GOT este localizată în concentraţii mari în ţesutul hepatic şi în miocard;
-GPT este localizată în concentraţii mici în muşchii striaţi şi mari în ficat.

Principiul metodei

Cetoacidul format prin acţiunea enzimei asupra substratului reactionează cu 2-4 dinitrofenil
hidrazina si formează dintitrofenil hidrazonă de culoare roşie în mediu alcalin. Intensitatea
culorii este direct proporţională cu activitatea enzimei.

Reactivi

1. Soluţie tampon fosfat pH=7,4

15g fosfat disodic
1,099g fosfat monopotasic
Se aduce la 500mL cu apă distilată
2. Soluţie substrat GOT pH=7,4
0,029 g acid alfa cetoglutaric

2,66 g acid D,L aspartic

20mL soluţie NaOH1N
Se completează până la 100mL cu soluţie tampon fosfat
3. Soluţie substrat GPTpH=7,4
0,0292g acid alfa cetoglutaric
1,78g D, L alanină
Se completează până la 100mL cu soluţie tampon fosfat
4. Soluţie standard acid piruvic 2mM

65 | P a g e
 0,0176g acid piruvic
Se dizolvă în 100mL tampon fosfat
5. Soluţie NaOH 1M
6. Soluţie HCl 1N
7. Soluţie 2-4 dinitrofenilhidrazină
19,8 g 2-4 dinitrofenilhidrazină
100mL soluţie HCl 1N
Se încălzeşte uşor la 60°C până la dizolvare completă
8. Soluţie NaOH 0,4M

66 | P a g e
Mod de lucru

GOT GPT
Reactivi (mL ) Probă Martor Standard Probă Martor Standard
Substrat GOT 0,5 0,5 0,5 - - -
Substrat GPT - - - 0,5 0,5 0,5
Ser 0,1 - - 0,1 - -
Soluţie
- - 0,1 - - 0,1
standard
Apă distilată - 0,1 - - 0,1 -
Agitare, incubare 60min. la Agitare, incubare 30min. la
37°C 37°C
Soluţie 2,4
dinitrofenil 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
hidrazină
Agitare, repaus 5min. la Agitare, repaus 5min. la
temperatura camerei temperatura camerei
Soluţie NaOH
5 5 5 5 5 5
0,4 M
Agitare, repaus 5min. la temperatura camerei, citire faţă de
martor la 546nm.

Calcul

Activitate GPT min

67 | P a g e
Activitate GOT min

1unitate internaţională (UI) corespunde cantităţii de enzimă care transformă 1 mol

substrat/min

În mod curent se foloseşte 1mUI UI/mL

68 | P a g e
Mai jos este prezentat tabelul de conversie.

Absorbţie GOT GPT

0,02 3 3
0,04 6 5
0,06 10 8
0,08 14 12
0,10 18 15
0,12 23 19
0,14 28 23
0,16 34 27
0,18 41 31
0,20 50 35
0,22 60 40
0,24 72 45
0,26 86 50
0.28 55
0.3 61
0,32 68
0,34 75
0,36 83
0,38 93

Valori normale şi interpretare

Valorile normale sunt cuprinse între

2-19mU/mL (GOT)
3-17mU/mL (GPT)
Raportul normal este cuprins între 1- 1,2

69 | P a g e
Valori crescute pentru GPT se întâlnesc în special în hepatita virală acută şi în necroza toxică a
ficatului.
Hepatita anicterică are ca semn de diagnostic creşterea acestor enzime. În hepatita acută

activitatea GPT este mai mare decât a GOT iar raportul este subunitar.

În bolile hepatice cronice GOT şi GPT cresc moderat.

Activitatea GOT creşte în infarctul de miocard cu valori maxime în primele 24-48 ore şi cu
revenire la normal după 4-7zile.
Creşterea activităţii GOT la câteva zile după infarct indică o insuficienţă cardiacă dreaptă.
În cancerele hepatice se înregistrează creşteri ale ambelor enzime, în acest caz testul fiind foarte
sensibil pentru diagnostic .

70 | P a g e
 Determinarea activităţii fosfatazei alcaline serice

Această enzimă este prezentă în concentraţii mari în ficat, ţesut osos (osteoblaste),
placentă şi în epiteliul intestinal. Aceste ţesuturi conţin fiecare câte o izoenzimă specifică
(izoformă) a acestei enzime. Activitatea sa optimă se desfăşoară la pH = 10.0 în prezenţa Mg 2+ şi
Zn2+ .
Creşterea patologică a activităţii serice a acestei enzime se întâlneşte cel mai frecvent în
colestaze hepatice sau în patologii osoase specifice în care creşte activitatea osteoblastelor (de
exemplu- maladia Paget).
Fiziologic se observă creşteri ale activităţii enzimei în sarcină, datorită izoenzimei
placentare şi în copilărie şi adolescentă, în perioada creşterii oaselor, datorită izoenzimei osoase.
Activitatea serică a fosfatazei alcaline este crescută la naştere, după care scade rapid. Totuşi,
rămâne crescută la copii faţă de adulţi în perioada creşterii, înregistrând un pic în perioada
pubertăţiii, când creşterea se accentuează, după care ajunge la valori normale atunci când
creşterea încetează. Uneori activitatea serică a fosfatazei alcaline creşte la persoanele în vârstă
sănătoase aparent. Aceasta poate reflecta forme subclinice ale maladiei Paget.
Activitatea serică a fosfatazei alcaline creşte mult (de 10 ori faţă de normal) în cazul
patologiilor maligne la nivel osos sau hepatic, creşterea fiind asociată cu prezenţa unor tumori
primare sau secundare ale acestor ţesuturi.
Activitatea fosfatazei alcaline este un parametru care apare frecvent pe buletinele de
analiză, datorită importanţei sale pentru diagnostic. Creşterea activităţii acestei enzime poate
constitui un semnal de alarmă, chiar în absenţa totală a simptomelor clinice a unei patologii
hepatice sau osoase, sau a altor valori alterate pe buletinul de analiză.
Pentru stabilirea originii tisulare a enzimei se poate recurge la o identificare a izoformelor
enzimatice sau, mai simplu, se determină suplimentar activitatea γ-glutamil transpeptidazei
serice. Această enzimă este specifică numai ţesutului hepatic, iar creşterea activităţii sale serice
are loc frecvent atunci când şi activitatea fosfatazei alcaline de origine hepatică creşte.

71 | P a g e
Principiul metodei
Prin hidroliza p-nitorfenilfosfatului se eliberează p-nitrofenolul, incolor în mediu acid,
galben în mediu bazic. Pentru determinare nu se pot folosi decât serul sanguin sau plasma
heparinizată, deoarece alţi anticoagulanţi inhibă fosfataza alcalină prin complexarea Mg2+.

Reactivi
-Soluţie tampon pH=10,5: 1,5 g glicină + 0,06 g MgSO 4 + 0,4 g NaOH se dizolvă pe rând
în 150 mL apă distilată. Se aduce la 200 mL cu apă distilată.
-Soluţie substrat: se dizolvă un comprimat de p-nitro fenil fosfat în 10 mL tampon.
-Soluţie NaOH 0,02 N
-Ser sanguin nehemolizat

Mod de lucru

Reactivi (mL) Probă Martor

Soluţie substrat 0,2 0,2
Preincubare 5 min. la 37°C
Ser sanguin 0,02 -
Incubare 30 min. la 37°C
Soluţie NaOH 0,02 N 2 2
Ser sanguin - 0,02

Citire faţă de apă distilată la 405 nm

Calcul
ΔEp x 227 = activitatea fosfatazei alcaline U.I.
Valori normale
Adulţi 13-45 U.I.

72 | P a g e
Copii (până la 15 ani) 38-140 U.I.
Femei gravide (ultimele trei luni) 28-115 U.I.

73 | P a g e
 Determinarea activităţii γ glutamil transpeptidazei (γ
GT)

Enzima γ glutamil transpeptidază este prezentă în concentraţii mari în ficat, rinichi şi

pancreas. Determinarea activităţii sale plasmatice constituie un marker sensibil al patologiei
hepatobiliare, chiar dacă nu permite diferenţierea dintre patologia colestatică şi cea
hepatocelulară.
În cursul unei obstrucţii biliare activitatea serică a γ GT poate creşte înaintea celei a
fosfatazei alcaline.
Activitatea serică a γ GT creşte în absenţa patologiei hepatice la pacienţii trataţi cu
anticonvulsivante de tip fentoină şi fenobarbital. Un efect similar îl poate genera rifampicina,
utilizată în tratamentul tuberculozei. În aceste cazuri creşterea activităţii enzimei se datorează
amplificării sintezei enzimei în celulele hepatice şi nu destrucţiei celulare.
Activitatea serică a acestei enzime creşte mult în cazul pacienţilor care prezintă o
patologie hepatică datorată consumului excesiv de alcool. Totuşi, activitatea enzimatică poate
creşte şi în cazul pacienţilor care consumă frecvent alcool, fără a prezenta patologie hepatică.
Aproximativ 70% dintre persoanele investigate prezintă astfel de creşteri ale activităţii enzimei,
dar, pe de altă parte, un mare număr de presoane alcoolice au activităţi enzimatice normale ale γ
GT.

Principiul metodei

Reactivi

Mod de lucru

74 | P a g e
Calcul
Valori normale

75 | P a g e
Capitolul IV Parametri biochimici clinici pentru
diagnosticarea infarctului miocardic
Modificări patologice şi semne clinice survenite în infarctul miocardic

Simptomele clasice ale infarctului de miocard constau în dureri intense la nivelul

toracelui, iradiind deseori de-a lungul braţului stâng sau înspre mandibulă, asociate cu modificări
caracteristice ale electrocardiogramei.
Cu toate acestea, infarctul de miocard poate să se manifeste într-un mod atipic şi uneori
chiar să fie asimptomatic, cu precădere la pacienţii vârstnici.
Determinarea activităţii enzimelor serice se utilizează pentru certificarea diagnosticului
de mai multă vreme. Prima enzimă care îşi creşte activtatea serică este creatin-kinaza, izoforma
MB, urmată de creatin-kinaza totală, aspartat aminotransferază (AST) şi de lactat dehidrogenază.
Multă vreme creatin-kinaza a fost considerată enzima de referinţă pentru diagnostic.
Cae mai mare parte a creatin-kinazei din muşchiul cardiac este izoforma MB (30%), spre
deosebire de muşchii scheletici, în care această izoformă se găseşte numai în proporţie de 1%.
Astfel, o creştere peste 5% din activitatea totală a creatin –kinazei MB, sugerează o afectare a
muşchiului cardiac.
În cazul pacienţilor cu semne clinice relevante pentru infarctul miocardic determinarea
activităţii serice a creatin-kinazei are mai puţină importanţă, ţinând cont şi de faptul că o creştere
semnificativă a activităţii enzimatice apare după 4-8 ore de la apariţia durerii toracice. Mult mai
important devine acest parametru de diagnostic în cazul pacienţilor fără simptome clare de
infarct miocardic. În aceste cazuri, o creştere cu peste 15% a izoformei MB a creatin-kinazei
după o perioadă de 4 ore cerifică infarctul. Mai departe, persistenţa valorilor ridicate ale emzimei
un timp mai lung sugerează o extindere a destrucţiei tisulare.
În cazul unui consult tardiv, la mai mult de 24 ore după ce infarctul miocardic s-a produs,
determniarea activităţii serice a lactat dehidrogenazei poate fi utilă, ţinând cont de faptul că
enzima îşi menţine activitatea crescută timp de mai multe zile după infarct.

76 | P a g e
 Pentru pacienţii care au suferit un infarct miocardic urmărirea parametrilor biochimici
serici este foarte importantă, oferind informaţii preţioase privind evoluţia bolii şi eficienţa
tratamentului.

Determinarea activităţii creatin kinazei

Forma activă a acestei enzime este un dimer, alcătuit din doi monomeri (M şi B). prin
combinarea celor doi monomeri se formează trei izoforme enzimatice: BB, MM, MB. Forma
majoritară din plasmă este MM. Creşterea activităţii creatin kinazei serice se datorează în
principal afectării musculare (scheletice sau cardiace). O creştere a raportului creatin kinază
MM/creatin kinază MB apare cel mai repede după un infarct miocardic (2-5 ore după apariţia
durerilor toracice).

Principiul metodei
Reactivi
Mod de lucru
Calcul
Valori normale

77 | P a g e
 Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei (LDH)

Lactat dehidrogenaza este o enzimă intracelulară tetrameră, cu subunităţi de două tipuri:

H şi M. Prin combinarea celor două tipuri de subunităţi se generază cele cinci izoforme
enzimatice, specifice diferitelor ţesuturi.
Creşteri ale activităţii lactat dehidrogenazei apar în multe patologii, cuprinzând afecţiuni
acute ale ficatului, afecţiuni renale, ale muşchilor scheletici, în anemiile megaloblastice şi în cele
hemolitice.
La nivelul ţesutului muscular cardiac forma enzimatică predominantă a lactat
dehidrogenazei este LDH 1 (H 4). Raportul LDH/LDH 1 creşte târziu după infarctul miocardic.

Principiul metodei
Reactivi
Mod de lucru
Calcul
Valori normale

78 | P a g e
 Capitolul V Micrometode pentru determinarea
rapidă a unor parametri biochimici sanguini

Determinarea lactacidemiei, glicemiei, colesterolemiei si traiacilglicerolemiei utilizand

dispozitivul portabil (micrometoda)

Determinarea lactacidemiei se realizează utilizând aparatul Accutrend Lactate iar pentru

determinarea glicemiei, colesterolemiei si triacilglicerolemiei se utilizează aparatul Accutrend
GCT. Metodele utilizate sunt rapide si neinvazive, oferind rezultate orientative ale parametrilor
determinaţi.

A Afişajul - arată toate elementele

79 | P a g e
B Buton memorie
C Buton de pornire-oprire
D Capacul - protejează sistemul optic
E fereastra de măsurare - locul unde se efectuează măsurătoarea
F Fanta pentru stripuri - aici se inserează stripul in partea de jos a aparatului
G Ghidajul pentru strip - menţine stripul in poziţia corecta
J Butonul pentru semnalul sonor
K Butonul pentru fixarea orei si datei

Pentru măsurare sunt necesare:

 Aparatele cu data si ora fixate şi cu semnalul sonor pornit
 Teste Accutrend pentru fiecare din parametrii determinaţi
 Înţepător

Modul de determinare (masurare)

 Iniţial trebuie sa va spălaţi pe mâini, ţinând cont că orice crema sau săpun care vin
în contact cu ţestul pot produce rezultate eronate.
 Pregătiţi înţepătorul : introduceţi acul in înţepător si alegeţi adâncimea de inţepare
 Porniţi aparatul apăsând butonul ON. Aparatul efectuează o verificare care
durează 2 sec. După care pe ecran apare afişat: GLU, CHOL, TG, in funcţie de
ultimul cod care a fost introdus in memoria aparatului. Numărul de cod, data si
ora apar afişate sub numele tipului de analiză. Cuvântul CODE clipeşte si aparatul
este pregătit pentru efectuarea unei măsurători.
 Scoateţi un strip din pachetul cu parametrul pe care vreţi sa îl determinaţi (ex:
strip de glucoza) si închideţi imediat flaconul.
 Cu clapa închisă introduceţi stripul in canal in direcţia indicată de săgeată
 Asiguraţi-vă ca stripul a fost introdus corect, iar cuvântul Glu de pe strip nu mai
este vizibil. Aparatul emite doua semnale sonore după ce recunoaşte testul si este
afişat cuvântul GLUC. Clipeşte cuvântul Code si începe sa clipească EV.0
 Daca aparatul nu a citit corect codul testului apar mesaje de eroare.

80 | P a g e
 Deschideţi clapa. Pe ecran clipeşte EV.0, împreuna cu timpul de măsurare: 12 sec
pentru GLUC, 180 sec pentru CHOL, 174 sec pentru TG.
 Frecaţi degetul pentru a facilita formarea picăturii de sânge
 Inepaţi degetul
 Lasaţi sa se formeze o picătura de sânge, aplicaţi cu grija picătura de sânge in
câmpul galben fără a atinge direct stripul cu degetul. Câmpul galben trebuie sa fie
complet acoperit cu sânge pentru a evita erorile. Daca este aplicată o picătura prea
mică de sânge, nu încercaţi sa o întindeţi cu degetul.
 In cazul in care aparatul este folosit pentru mai mulţi pacienţi, picătura de sânge
trebuie aplicată pe strip in afara aparatului, pentru a evita contaminarea clapei cu
sânge, si de asemenea pentru a evita riscul de infecţie. Se utilizează un ac pentru
fiecare persoana. Aparatul trebuie dezinfectat cu alcool după fiecare persoana care
s-a testat.
 Închideţi clapa imediat după aplicarea picăturii de sânge. Pe afişaj se desfăşoară
numărătoarea inversă pana la secunda 0. Valoarea măsurată (in mg/dL sau
mmol/L) apare afişată.

81 | P a g e
Accutrend GCT si Accutrend Lactate măsoară valori doar in următoarele intervale:
- glucoză: 20-600 mg/dl (1.1-33.3 mmol/l)
- colesterol: 150-300 mg/ml (3.88-7.76 mmol/l)
- trigliceride: 70-600 mg/ml (0.8-6.86 mmol/l)
- lactat: 0.8 – 22 mmol/l (sânge integral)
0.7 – 27 mmol/l (plasmă)

82 | P a g e
 Bibliografie selectivă

1. Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus, HENRY’S Clinical Diagnosis and Management

by Laboratory Methods, twenty-second edition, ELSEVIER Saunders 1600 John F. Kennedy
Blvd. Ste 1800 Philadelphia, PA 19103-2899 ISBN: 978-1-4377-0974-2
2. Harper’s Illustrated Biochemistry twenty-sixth edition, Lange Medical Books/McGraw-Hill
Medical Publishing Division ISBN 0-07-138901-6
3. William J. Marshall, Stephen K. Bangert, Biochimie medicale Physiopathologie et diagnostic
ELSEVIER, ISBN 2-84299-674-7
4. Martin A. Crook, Clinical Biochemistry and Metabolic Medicine CRC Press Taylor &
Francis Group, ISBN 978-1-4441-4414-7
5. Mihaela Mirela Bratu, Doina Paula Balaban, M. Crâşmaru, Îndrumar de lucrari practice de
biochimie - biochimie metabolică Ed. Ovidius University Press 1997 ISBN 973-9367-49-6
6. Mihaela Mirela Bratu, M. Crâşmaru, Îndrumar de lucrări practice de biochimie- ediţia a II-a
revizuită şi adăugită Ed. Ovidius University Press 2001 ISBN 973-614-019-9

83 | P a g e