UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

DIN CRAIOVA

Cercetări privind identificarea din

surse naturale, sinteza și
caracterizarea fizico-chimică a unor
noi compuși bioactivi ai borului
–REZUMAT–

Conducător ştiinţific
Prof. univ. dr. Johny NEAMŢU

Doctorand
Carmen Nicoleta OANCEA

CRAIOVA
2018
 CUPRINS

Cuvinte cheie ................................................................................................................................... 3

1. Introducere ............................................................................................................................... 4
2. Compuşi naturali ai borului ..................................................................................................... 5
3. Identificarea acidului fructoboric din surse vegetale prin metoda LC-MS ............................. 6
4. Sinteza, izolarea, caracterizarea fizico-chimică şi determinarea cantitativă a acidului
fructoboric şi fructoboratului de zinc .............................................................................................. 7
5. Toxicitatea in vitro şi in vivo a celor doi compuşi sintetizaţi: acidul fructoboric şi
fructoboratul de zinc ....................................................................................................................... 9
6. Concluzii ................................................................................................................................. 11
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

Cuvinte cheie

 Bor
 Mineralogie
 Plante
 Bacterii
 Toxicitate
 Cromatografie
 Speciație
 Enzime
 Farmacologie
 Acid fructoboric
 Fructoborat de zinc
 FTIR
 UV-VIS
 LC-MS
 In vitro
 In vivo
 Histologie
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

1. Introducere

Borul este un element dinamic de o importanță esențială în biologia animală și umană. Acest lucru a
devenit din ce în ce mai evident întrucât ultimele cercetări au arătat că are acțiuni surprinzătoare și
semnificative pentru sănătatea animalelor și a oamenilor. Borul, al cincilea element al tabelului
periodic, din grupa 13, este singurul nemetal din această grupă. Fiind un atom mic cu trei electroni pe
ultimul orbital, borul folosește legături covalente pentru a-și completa conținutul acestuia. Atomul de
bor nu donează protoni, dar acceptă ioni hidroxil. Borul se leagă de diverse elemente, formând
aranjamente tetraedrice sau trigonale. Are o puternică atracție pentru oxigen, rezultând borații. Atunci
când borul se leagă de patru atomi de oxigen alcătuind o formă tetraedrică, compusul rezultat se
numește anion borat (B(OH)4-). Atunci când borul se leagă de trei atomi de oxigen, compusul rezultat
are un aranjament trigonal-planar, denumindu-se acid ortoboric (B(OH)3).
Borul are o tendință puternică de a forma complecși cu molecule organice care au grupări hidroxil
adiacente. Borul poate interacționa cu substanțe biologice importante, incluzând polizaharide,
piridoxine, riboflavine, acid dehidroascorbic și nucleotide pirimidinice. Formează o legătură puternică
cu cis-diolii furanozici precum eritritol, riboza și apioza, aceasta din urmă fiind prezentă în pereții
celulari ai plantelor. Dinucleotida adenin nicotinamidă (NAD+ – nicotinamide adenine dinucleotide)
și fosfatul de dinucleotidă adenin nicotinamidă (NADP+ – nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate) conțin componenți ai ribozei. Aceste molecule sunt active în metabolismul energetic și de
aceea legarea lor va avea repercusiuni asupra proceselor diferitelor căi metabolice. Chimia unică a
borului îi permite acestuia să reacționeze cu mulți alți metaboliți și enzime, astfel fiind capabil să
modifice metabolismul mineral și energetic la plante, la animale și la oameni. Borul are doi izotopi
frecvent întâlniți 10B și 11B. Datorită unei suprafețe mari de captură de neutroni, 10B este un excelent
absorbant al acestora. În natură, borul nu există sub formă elementală, ci sub forma de compuși a căror
structură chimică este una complexă. Cele mai cunoscute forme de compuși sunt boraxul, acidul boric,
oxidul de bor, etc.
Semnificația borului pentru prevenirea bolilor cronice la om este cunoscută de ceva timp în cadrul
comunității globale. Simptomele deficienței de bor sunt nespecifice, incluzând artrită, pierderi de masă
osoasă, scăderea imunității și osteoporoza. Este sugerat faptul că borul afectează mineralele osoase
prin modularea nivelelor serice ale hormonilor steroizi (estrogen și testosteron) și metabolismul
acestora. Mai mult, nivelul de bor în oase și sânge crește cu vârsta și starea de sănătate și scade cu
stările de boală.
Ținând cont de cele prezentate mai sus, utilizarea fructoboratului de calciu în terapeutică, devine din
ce în ce mai interesantă. Un alt compus important a fost identificat în natură fiind vorba de acidul
fructoboric. Obținerea prin sinteză în laborator a acidului fructoboric, identic compușilor naturali,
poate duce la folosirea acestuia ca și supliment nutritiv.

4
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

2. Compuşi naturali ai borului

Multe dintre țările lumii au în sol un conținut scăzut de bor, în timp ce o cantitate ridicată există în țări
precum SUA, Turcia, Brazilia, Rusia sau China.
Borul este prezent îndeosebi în sol și apă. Scoarța terestră conține cantitatea cea mai mare, borul având
o concentrație de 10–20 ppm în sol.
Borul este prezent pretutindeni în natură, chiar și în atmosferă, unde are o concentrație de 0.5 ng/m³
de aer. În apă are diferite concentrații, mai mici de 0.3 mg/l la suprafața apelor, și o medie de 0.03 mg/l
în apa potabilă. În plante, cantitatea de bor variază în funcție de cantitatea de bor din sol, aceasta
putându-se îmbunătăți adăugând îngrășăminte pe bază de bor. Acestea au acțiune mai ales la nivelul
solurilor alcaline.
Pentru oameni, sursa principală de bor este hrana. Cele mai bogate surse de bor sunt fructele și
legumele. Produsele lactate, carnea precum și majoritatea cerealelor reprezintă surse mai puțin
importante de bor. În esență, cantitatea optimă de bor pentru organism poate fi obținută printr-o dietă
bogată în vegetale. Deși nu a fost demonstrată o doză zilnică admisibilă, diverse cercetări asupra
subiecților umani și a animalelor au sugerat o doză necesară de 1–13 mg/zi (WHO/FAO/IAEA, 1996).
Totuși, un număr considerabil de persoane consumă mai puțin de 1 mg bor/zi .Persoanele care au în
dieta zilnică cantități adecvate de legume și fructe pot acumula până la circa 6 mg/zi de bor. Întrucât
dietele obișnuite nu asigură cantitatea optimă pentru sănătatea populației, se impune nevoia de a se
descoperi metode adjuvante pentru aportul de bor precum suplimentele alimentare.
Compușii cu bor se găsesc de asemenea într-o gamă largă de produse de consum, precum obiectele din
sticlă cu bor și silicați, săpunuri, detergenți, conservanți, adezivi, porțelanuri, cosmetice, emailuri,
piele, covoare și chiar pietre prețioase.

5
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

3. Identificarea acidului fructoboric din surse vegetale

prin metoda LC-MS

Acidul fructoboric este un complex esteric glucid-borat cu o moleculă de bor legată de una sau două
molecule de fructoză pentru a forma mono sau diesterul fructoborat. Acest complex este obținut
industrial prin reacția acidului boric cu fructoza. Esteri naturali identici ai fructoboratului se găsesc în
unele fructe și legume. Numeroase studii au arătat că borații sunt esențiali în procesele de creștere a
plantelor cum ar fi dezvoltarea normală a peretelui celular, funcția membranei și biosinteza ligninei;
de asemenea, este important și pentru sănătatea umană. Acidul fructoboric are activitate antioxidantă.
Studi recente au sugerat că borații pot ajuta la reglarea hormonilor și a vitaminei D într-un aport pe
termen scurt. Scorei și colab. au constatat o corelație negativă între aportul de borați și incidența unor
probleme de sănătate umană.
Deoarece s-a demonstrat că borul este esențial pentru creșterea plantelor, s-au dezvoltat diferite metode
pentru a caracteriza complecșii de glucid-borat din plante. Matoh și colab. au purificat complexul de
bor-poliglucid din rădăcinile de ridiche, hidrolizându-l mai departe și au caracterizat borul în complex
prin RMN. Hu și colab. au utilizat desorbție de matrice asistată laser cuplată cu spectrometria de masă
cu transformare Fourier pentru a analiza complecșii de bor solubili, cu verificarea prin cromatografie
lichidă de înaltă performanță și cromatografie în fază gazoasă cuplată cu spectrometria de masă. Pentru
a înțelege în continuare funcțiile primare ale complecșilor glucid-borat din plante și sănătatea umană,
este necesară o metodă de screening mai eficientă pentru a identifica acest compus complex în diferite
probe, în special la concentrații scăzute.
În acest studiu, am stabilit o metodă analitică pentru a identifica fructoboratul folosind cromatografia
lichidă cuplată cu spectrometria de masă. Metoda a fost optimizată prin utilizarea acidului fructoboric
drept standard și apoi a fost aplicată pentru a identifica complexul fructoborat prezent în mod natural
în diferite pulberi de fructe. Condițiile cromatografice de bază au fost concepute și selectate după
testarea diferitelor condiții care afectează analiza HPLC. Coloana XBridge BEH Amide a fost utilizată
datorită reținerii bune pentru fructoborat. Fază mobilă cu acetonitril și acetat de amoniu 0.1 M (9:1) a
fost utilizată ca pentru a obține un pic și o rezoluție bună. Screening-ul acidului fructoboric în probele
de caise și stafide demonstrează potențialul acestei metode analitice pentru identificarea și
cuantificarea acidului fructoboric la concentrații scăzute în probele de fructe, legume, nuci și semințe.
În viitor, metoda ar putea fi optimizată în continuare pentru a cuantifica acidul fructoboric în diferite
probe de plante, precum și în probe biologice.

6
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

4. Sinteza, izolarea, caracterizarea fizico-chimică şi

determinarea cantitativă a acidului fructoboric şi
fructoboratului de zinc

În prezent, în industria suplimentelor alimentare, singurele produse disponibile pe bază de bor sunt
complexul de fructoborat de calciu (CaFB), citratul de bor, aspartatul de bor, chelații de glicinat de
bor, ascorbatul de bor, acidul boric și tetraboratul de sodiu.
Cel mai studiat din punct de vedere științific și singurul supliment nutrițional de bor găsit în natură
este acidul fructoboric, un ester natural glucid-borat care oferă potențial pentru sănătatea umană.
Acidul fructoboric conține trei forme de borat (diester, monoester și acid boric) și toate sunt biologic
active, atât la nivel intracelular (sub formă de acid boric liber) cât și la nivelul extracelular (ca diester
fructoză-borat și monoester). La nivel celular și molecular, acidul fructoboric este superior acidului
boric/boratului, prezentând un efect complex "de protecție" împotriva răspunsului inflamator. Acidul
fructoboric administrat oral este eficient în ameliorarea simptomelor răspunsului fiziologic la stres,
inclusiv în inflamația membranelor mucoaselor, disconfortului asociat cu tulburările osteoartritei și
pierderea osoasă, precum și pentru susținerea sănătății cardiovasculare. Studiile clinice au arătat
capacitatea acidului fructoboric de a modula efectiv markerii moleculari asociați cu mecanismele
inflamatorii, în principal la nivelurile serice crescute ale proteinei C reactive (CRP).
Un complex cu calciul este disponibil în comerț în SUA (FruiteX-B®), un compus care pe lângă
efectele fructoboratului însumează și efectele favorabile ale calciului asupra sănătății omului.
Cercetări recente s-au orientat și spre obținerea unor complecși cu zincul, un element extrem de
important pentru sănătatea umană. Scăderea concentrației de Zn în sângele persoanelor în vârstă se
corelează cu inflamația în aproape toate organele. Este bine cunoscut faptul că inflamația este primul
pas în dezvoltarea bolilor neurologice, diabetului, aterosclerozei și cancerului. Absorbția intestinală a
Zn este îmbunătățită prin prepararea macropolimer-complecșilor de Zn, cum ar fi orotatul de Zn. Cu
toate acestea, s-a identificat faptul că acest compus stimulează dezvoltarea cancerului hepatic la
modele animale. Prin urmare, alți polimeri de chelatare ai Zn sunt necesari pentru suplimentare.
În consecință, toate aceste date ne indică faptul că suplimentarea alimentației cu complecși ai acidului
fructoboric cu zincul, poate împiedica dezvoltarea cancerului și a diferitelor boli inflamatorii.
La sinteza celor doi compuși s-a folosit fructoză și acid boric ce au provenit de la firma Merck
Millipore (Darmstadt, Germania), iar zincul pulbere de la firma Sigma-Aldrich (St. Loius, United
States).
Esterii de tip Zn–fructoborat (mono- și diester) au fost sintetizați pe baza metodei generale de obținere
a diverșilor fructoboraţi.
Pentru determinarea cantității de Zn din complexul nou format am ales utilizarea metodei
spectrofotometrice UV-VIS. Analiza a fost realizată cu un spectrofotometru T80 UV/VIS de la PG
Instruments (Leicestershire, United Kingdom).

7
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

Analiza termică a celor doi compuși s-a efectuat cu o termobalanță PerkinElmer DIAMOND TG/DTA,
care achiziționează simultan curbele TG, DTG, DTA şi DSC. S-a aplicat un regim de încălzire liniară
cu viteza de 10 K/min., în atmosferă oxidantă (de aer) până la 1000°C. Debitul de gaz a fost în ambele
cazuri de 150 cm3/min-1, ceea ce produce o uniformitate a câmpului de temperatură în probă și asigură
îndepărtarea produșilor descompunerii. Sau folosit creuzete de α-alumină, atât ca referință, cât și
pentru probă. S-au trasat, de fiecare dată, liniile de bază pentru curbele dorite, în aceleași condiții ca și
la măsurătorile cu probă. Prin scăderea liniilor de bază din curbele trasate experimental pentru probă
se elimină efectul instrumental asupra măsurătorii, rămânând numai cel datorat probelor studiate.
Pentru analiză s-a utilizat un spectrofotometru FTIR – FRONTIER TWO, controlat de un software
specializat, Spectrum v.10.5.1 (Perkin Elmer Inc.). Softul permite atât analiza calitativă, prin
identificarea benzilor caracteristice în comparație cu substanțe asemănătoare aflate în baza de date,
SPECTRUM SEARCH, cât și analiza cantitativă, SPECTRUM QUANT, care folosește pentru
determinare fie legea Lambert–Beer la o anumită lungime de undă, fie metode chemometrice, PCR,
PLS sau PLS+, în care se poate folosi întreg domeniu spectral obținut.
Probele au fost analizate folosind ca tehnică de analiză metoda ATR cu cristal de ZnSe, care permite
înregistrarea unui spectru IR în domeniul 4000–650 cm-1 sau KRS 5, care permite înregistrarea unui
spectru IR în domeniul 4000–400 cm-1. S-au efectuat câte 16 scanări, cu rezoluţie de 4 cm-1, în
domeniile sus-menționate.
Optimizarea sintezei de laborator a fructoboratului de zinc, prin reacția dintre acidul fructoboric şi Zn
metalic activat, s-a realizat prin efectuarea mai multor încercări, în care cele mai bune randamente s-
au obținut folosind reactorul Büchi.
În urma optimizării sintezei de laborator, ca produse finite s-au obținut două substanțe de puritate food-
grade, fructoboratul de zinc și, respectiv, acidul fructoboric, care au fost caracterizate conform
normelor Farmacopeii Române ediția a X-a (1993), sub forma unor fișe tehnice de calitate.

8
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

5. Toxicitatea in vitro şi in vivo a celor doi compuşi

sintetizaţi: acidul fructoboric şi fructoboratul de zinc

Zincul (Zn) este un element esențial, care este extrem de necesar în funcțiile celulare. Este implicat în
transmisia glutaminergică (moleculă de semnalizare) în creier, în răspunsul antioxidant și este un
cofactor al multor enzime și factori de transcripție.
Homeostazia anormală a Zn provoacă o diversitate de probleme de sănătate, inclusiv întârzierea
creșterii, imunodeficiența, hipogonadismul și disfuncții neuronale și senzoriale. Experimentele pe
animale au arătat că, în timpul îmbătrânirii, poate să apară o deficiență de Zn care este asociată cu o
scădere a funcției creierului. Homeostazia zincului este realizată prin intermediul transportorilor de Zn
și canalelor permeabile, subliniind relevanța fiziologică a Zn în viață. Un studiu bioinformatic al
genomului uman a arătat că aproximativ 10% din toate proteinele se pot lega de Zn.
Suplimentarea fiziologică cu Zn la vârstnici restabilește activitatea endocrină a timusului și răspunsul
imun înnăscut (citotoxicitatea celulelor NK) și crește rata de supraviețuire la șoarecii vârstnici. Prin
urmare, suplimentarea cu Zn este utilă pentru a crește longevitatea, deoarece proteinele care leagă Zn
își pot recâștiga sarcina de protecție originală împotriva daunelor oxidative, cu un impact benefic
asupra răspunsului imun.
Interacțiunea dintre Zn și acidul boric a fost caracterizată de toxicitatea acută scăzută a boratului de
zinc (ZB) cu o valoare LD50 mai mare de 10 g/kg corp la șobolani comparativ cu tetraboratul de sodiu
pentahidrat cu un LD50 (doză letală medie) de 3.3 g/kg corp. (ZB și tetraborat de sodiu pentahidrat au
concentrație echivalentă de bor).
Nu au existat dovezi privind efecte toxice la administrarea a 1000 mg ZB/kg corp/zi într-un studiu de
toxicitate prin gavaj administrat pe doză repetată de 28 de zile, care corespunde unei doze echivalente
de 50 mg bor/kg corp.
Cel mai scăzut nivel al efectelor adverse observate (LOAEL) pentru rezultatul testicular este de 26 mg
B/kg corp. Nivelul de Zn recomandat la om, poate interacționa cu borul pentru a reduce riscul
producerii efectelor toxice. Nivelul de zinc din țesutul moale la om este de două ori mai mare decât în
același tip de țesut la animalele de laborator. De asemenea, s-a demonstrat că Zn protejează împotriva
toxicității testiculare a cobaltului și cadmiului.
În consecință, toate aceste date indică faptul că suplimente nutritive pe bază de bor-zinc activ pot
întârzia îmbătrânirea. Prin urmare, am testat citotoxicitatea in vitro a noului complex zinc-bor,
fructoboratul de zinc.
IC50 determinat pentru ZnFB a fost de 0.195 ± 0.005 mM. ZnFB afectează viabilitatea și morfologia
celulelor cultivate numai la o concentrație egală sau mai mare de 0.5 mM. Comparând cu celelalte
studii, ZnFB a prezentat o toxicitate relativ scăzută, comparabilă cu cea a histidinatului de zinc (IC50
0.3 mM).

9
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

Din punctul de vedere al toxicității acute, ținând cont de valoarea DL50 (>5000 mg/kgcorp) la
administrare p.o., la șoareci rasa BALB/c, ZnFB şi FBA se încadrează în clasa substanțelor cu
toxicitate foarte mică (Categoria V, practic netoxice).
Din punct de vedere histopatologic, în cazul celor trei experimente toxicodinamice (acut, subcronic și
cronic), pentru toate organele interne analizate s-au evidențiat aspecte normale.
Zincul este necesar pentru multe procese metabolice ca un ion structural, regulator sau catalitic. Studiul
nostru arată că ZnFB, un nou complex natural activ de zinc-bor, are un efect citotoxic scăzut asupra
celulelor renale Vero. Nivelul de toxicitate este mai mic decât cel al suplimentelor utilizate în cea mai
mare parte, cum este orotatul de zinc. În concluzie, ZnFB ar putea fi utilizat cu succes ca o nouă sursă
de suplimentare a Zn2+.

10
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

6. Concluzii

S-a reușit identificarea, separarea si producerea acidul fructoboric pentru prima data în lume. Acest
acid organic, este un acid natural noncarboxilic, care se găsește în plante.
Coloana XBridge BEH Amide a fost utilizată datorită reținerii bune pentru fructoborat. 90%
acetonitril/10% acetat de amoniu 0.1 M a fost utilizată ca fază mobilă pentru a obține un pic și o
rezoluție bună.
Screeningul acidului fructoboric în probele de caise și stafide demonstrează potențialul aceastei metode
analitice pentru identificarea și cuantificarea acidului fructoboric la concentrații scăzute în probele de
fructe, legume, nuci și semințe.
În viitor, metoda ar putea fi optimizată în continuare pentru a cuantifica acidul fructoboric în diferite
probe de plante, precum și în probe biologice.
Optimizarea sintezei de laborator a fructoboratului de zinc, prin reacția dintre acidul fructoboric și Zn
metalic activat, s-a realizat prin efectuarea mai multor încercări.
Metoda de analiza utilizata permite analiza cu ușurință a borului, fiind destul de simplă și puțin
costisitoare.
Metoda HPTLC cuplată cu MS, pentru identificarea acidului fructoboric din plante, este exactă,
precisă, rapidă, selectivă și sensibilă.
Determinarea compoziției moleculare și evaluarea stabilității acidului fructoboric şi fructoboratului de
zinc a fost efectuată prin analizele UV/VIS, FTIR și TGA.
Din punct de vedere al normelor de calitate, până în prezent acidul fructoboric nu are o monografie
care să cuprindă criteriile de identificare (puritate) și analiză cantitativă. Contribuind la acumularea
unor date noi cu privire la acidul fructoboric natural cercetările din cadrul tezei de doctorat deschid
calea către pregătirea unei monografii individuale, după normele farmacopeelor.
În urma optimizării sintezei de laborator, ca produse finite s-au obținut două substanțe de puritate food-
grade, fructoboratul de zinc și, respectiv, acidul fructoboric, care au fost caracterizate conform
normelor Farmacopeii Române ediţia a X-a (1993), sub forma unor fișe tehnice de calitate.
Formula moleculară [H3O]+[(C6H10O6)2B]–∙4H2O, considerată pentru acidul fructoboric, se dovedește
a fi în concordanță cu rezultatele analizei termice și ale spectroscopiei FTIR și MS.
Studiile efectuate cu ajutorul analizei elementale și al spectroscopiei FTIR, au condus la formula
chimica pentru fructoboratul de zinc – Zn(H2O)6[(C6H10O6)2B]2∙4H2O.

Studiile realizate pe linia celulară Vero privind efectele in vitro ale FBA și ZnFB au evidențiat
următoarele aspecte: (i) celulele sunt mai rezistente la acțiunea exercitată de FBA decât la ZnFB; (ii)
pentru FBA, viabilitatea celulară este afectată peste concentrația minimă toxică de 3 mM; (iii) pentru
ZnFB, cultura celulară este afectată atât din punct de vedere morfologic, cât și al viabilității (chiar în

11
Carmen Nicoleta OANCEA Rezumat teză de doctorat

măsură mai mare decât controlul pozitiv de citotoxicitate), peste concentrația minimă toxică de 0.5
mM.
Din punctul de vedere al toxicității acute, ținând cont de valoarea DL50 (>5000 mg/kg-corp) la
administrare p.o., la șoareci rasa BALB/c, ZnFB și FBA se încadrează în clasa substanțelor cu
toxicitate foarte mică (Categoria V, practic netoxice – OECD, 2012). Din punct de vedere
histopatologic, în cazul celor trei experimente toxicodinamice (acut, subcronic și cronic), pentru toate
organele interne analizate s-au evidențiat aspecte normale
Zincul este necesar pentru multe procese metabolice ca un ion structural, regulator sau catalitic. Studiul
nostru arată că ZnFB, un nou complex natural activ de zinc-bor, are un efect citotoxic scăzut asupra
celulelor renale Vero. Nivelul de toxicitate este mai mic decât cel al suplimentelor utilizate în cea mai
mare parte, cum este orotatul de zinc. În concluzie, ZnFB ar putea fi utilizat cu succes ca o nouă sursă
de suplimentare a Zn2+.

12