I.

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE i prezentarea antigenului limfocitelor T

As.Univ.Dr.As.SAMACA GABRIEL Catedra de IMUNOLOGIE UMF CLUJ, mai 2012

http://chimerasthebooks.blogspot.com/2011_10_01_archive.html

http://www.youtube.co m/watch?v=lrYlZJiuf18

DESCOPERIREA MHC
MHC (Major Histocompatibility Complex) esutul transplantat de la un Incompatibilitate de esut

organism la alt organism genetic diferit este rejectat Gravitatea rejectului de gref depinde de diferenele dintre donator i primitor Incompatibiltatea dintre diferite

Antigene majore de histocompatibilitate Antigene minore de histocompatibilitate

esuturi variaz, n sensul c, gazda elimin grefa uneori rapid (violent) sau alteori mai lent

Jean Dausset - premiul Nobel pentru Medicin n 1980 -

http://pathmicro.med.sc.edu/ghaffar/mhc2000.htm

ANTIGENE DE HISTOCOMPATIBILITATE MHC

Transplantare

CROMOZOMUL 6 1974

Reacia imun

SLA - PLA

H-2
Cromozomul 17

OLA

RbH1

DLA

RT1

GENELE MHC/HLA

MHC clasa I: HLA-A, HLA-B, HLA-C. MHC clasa II: HLA D: DP, DQ, DR. MHC clasa III conine gene care codific factorul de necroz tumoral, limfotoxina, i dou componente ale sistemului complement (C2 i C4). - antigenele de clasa III nu particip la rejetul de gref.
http://www.oculist.net/downaton502/prof/eb ook/duanes/pages/v4/v4c034.html

LOCALIZAREA GENELOR MHC

MHC clasa I i II EXTREM DE POLIMORFIC

gene loci

alele

*
-pentru fiecare gen exist alele multiple. -se datoreaz numrului mare de alele (polialelism) pentru fiecare din genele HLA

TRANSMITEREA CODOMINANT A MHC I/II

DQ1

Haplotipul matern
DP3 DP1 DQ2 DR4 B7 C2 A30 A30 DP3 DQ1 DR13 B8 C7 A11

C7

C2 DR4 A11

Haplotipul patern
DP1 DR13 B8 DQ2 B7

- din fiecare haplotip se exprim cte o alel pentru fiecare locus - fiecare alela de pe fiecare cromozom are o expresie pe membrana celular

STRUCTURA MOLECULELOR HLA

HLA clasa I

HLA clasa II

STRUCTURA MOLECULELOR HLA Proprieti generale

1.anuri despicate de legare a peptidelor extracelulare polimorfismul rezidurilor de

aminoacizi 2.Lanurile sunt legate prin puni disulfidice asemntoare

imunglobulinelor - situsuri de legare a CD4, CD8 3.Domenii transmembranare i

intracitoplasmatice

STRUCTURA MOLECULELOR HLA CLASA I

-un lan greu, polimorf, glicozilat, codificat de MHC -

2 3

1 2m

lanul (43-45kDa) - un lan uor, nonpolimorf (constant), codificat de o gen de pe cromozomul 15 - 2 microglobulina (12kDa), moleculei. care are doar rolul de stabilizare a

Extracelular Intracitoplasmatic

Extracelular, lanul are trei bucle care formeaz trei domenii: domeniile 1, 2 i 3, meninute prin puni S-S, deci prezint o structur similar cu cea a imunoglobulinelor.

Ancorarea celular

STRUCTURA TRIDIMENSIONAL HLA CLASA I

Buclele formeaz un an ntre 1 i 2 (ca o ni), n care sunt legai diverii epitopi din antigenul care vor fi prezentai receptorilor specifici de pe membrana limfocitelor T. Lanul

Peptide

Lanul

anuri

Structura

- 6 la 16 reziduri de aminoacizi n lungime -

STRUCTURA MOLECULELOR HLA CLASA II

- un lan , care are extracelular dou

1 2

1 2

domenii (1, 2) i este complet diferit de lanul omonim al moleculelor HLA de clasa I (34kDa); - un lan , tot cu dou domenii (1, 2) extracelulare (28kDa).

Extracelular

Fiecare lan prezint trei regiuni distincte: extracelular (expus mai sus),

Intracitoplasmatic

transmembranar i intracitoplasmatic.

Ancorarea celular

STRUCTURA TRIDIMENSIONAL HLA CLASA II Peptide

Lanul

Lanul

Structura
antul este format din amndou lanurile i b. Nia este mai lung dect cea a MHC-I

anuri
- pn la 30 reziduri de aminoacizi in lungime sau chiar mai mult -

reziduri peptide

SPECIFICITATEA DE LEGARE - REZIDURI POLIMORFICE -

Aa-numitele buzunare interacioneaz cu reziduri complementare ale peptidelor legate, rezultnd reziduuri de ancorare. Alte reziduri MHC polimorfice i unele reziduri de peptid nu sunt implicate n obligatoriu n legarea moleculelor MHC, dar formeaz structuri recunoscute de celulele T.

POLIMORFISMUL MHC DISTRIBUIA GEOGRAFIC Exemple pentru frecvenele antigenelor HLA-A, B n trei grupuri populaionale

ANTIGEN A1 A2 A3 A11 A23 A24 A26 A28 A30 A31 A33

E 27 46 23 12 5 17 7 8 5 6 3

A 1 43 1 17 1 59 19 1 1 15 13

AA 7 27 14 1 20 6 7 17 28 4 9

ANTIGEN B7 B8 B13 B35 B39 B42 B44 B51 B52 B53 B54

E 17 16 6 18 4 1 22 13 3 2 0

A 11 1 4 14 6 1 13 16 21 0 14

AA 17 6 1 12 4 15 14 3 2 13 0

E = descenden european; A = descenden asiatic ; AA = descenden african

POLIMORFISMUL MHC ASOCIERI PATOLOGICE

HLA Spondilita ankilozant Diabetul zaharat tip 1 B27 DR3 DR4 DR3 or DR4 Scleroza multipl Artrita reumatoid Narcolepsia DR2 DR4 DR2

Patieni 90 % 52 % 74 % 93 % 86 % 81 % >95 %

Lot Martor 9% 23 % 24 % 43 % 33 % 24 % 33 %

ANTIGENE HLA DETECTATE PRIN TESTE SEROLOGICE

HLA clasa I
HLA-A HLA-B HLA-C HLA-E HLA-F HLA-G HLA-H HLA-J HLA-K HLA-L HLA-N HLA-S HLA-X HLA-Z

HLA clasa II
HLA-DRA HLA-DRB1 HLA-DRB2 HLA-DRB3 HLA-DRB4 HLA-DRB5 HLA-DRB6 HLA-DRB7 HLA-DRB8 HLA-DRB9 HLA-DQA1 HLA-DQB1 HLA-DQA2 HLA-DQB2 HLA-DOA HLA-DOB
DIVERSITATE

HLA-DMA HLA-DMB HLA-DPA1 HLA-DPB1 HLA-DPA2 HLA-DPA3 HLA-DPB2

POLIMORFISM

ALELE HLA DETECTATE PRIN TESTE DE BIOLOGIE MOLECULAR Exemplu: HLA-B*15170102 HLA-B * 15 17 01 02 Locusul genei alela a fost tipizat utiliznd teste de biologie molecular Grupul de alele Subgrupul de alele Numrul de variante de alele Numrul de mutaii

Nomenclatura HLA este fcut de WHO Nomenclature Committee:

Publications by Marsh et al.: HLA Nomenclature Reports - Tissue Antigens 2002, 60: 407-464 - Human Immunology 2002, 63: 1213-1268 - European Journal of Immunogenetics 2002, 29: 463-515 HLA Nomenclature Updates Tissue Antigens 2004, 63: 619 Human Immunology 2004, 65: 767 European Journal of Immunogenetics 2004, 31: 99

POLIMORFISMUL MHC clasa I i II

n populaia uman au fost identificate peste 1300 de alele MHC clasa I:

699 Numrul de polimorfisme

Clasa I
1318 alele 396
(998 n Octombrie 2003) (657 n Julie 2000)

198 8 A B C E 2 15 F G

Data from www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html September 2005

POLIMORFISMUL MHC clasa I i II

n populaia uman au fost identificate peste 700 de alele MHC clasa II

Numrul de polimorfisme

494

Clasa II
733 alele
(668 n Octombrie 2003) (492 n Julie 2000)

119 3
A B1

28

66

23

4
A

7 9 9
B A B

A1 B1 A1 B1

DR

DQ

DP

DM

DO

Data from www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html September 2005

LEGAREA PEPTIDELOR LA MOLECULELE MHC

MHC clasa I
Peptide Buzunar de legare a peptidei

MHC clasa II

Cell Membrane

AGENI PATOGENI

CELULE PREZENTATOARE DE ANTIGEN

CELULE PREZENTATOARE DE ANTIGEN

MHC Clasa I

Any nucleated cell

MHC Clasa I

MHC Clasa II

Macrofage

Celule B

Celule dendritice

Moleculele MHC sunt exprimate de celulele prezentatoare de antigen (APC) i au rolul prezentrii peptidelor derivate din proteinele antigenice.

UN MODEL AL RECUNOATERII PEPTIDICE

http://www.nephronpower.com/2010_06_01_archive.html

- peptidele se leag la moleculele MHC prin zone de ancorare, care asigur legarea n cavitatea (buzunarul) moleculelor MHC. - receptorul TCR al fiecrei celule T recunoate anumite resturi de aminoacizi ale peptidului dar i anumite resturi de aminoacizi (polimorfice) ale moleculei MHC.

CARACTERISTICI ALE INTERACIUNII DINTRE PEPTIDE I MHC

PROCESAREA ANTIGENELOR INTRACELULARE

PROCESAREA ANTIGENELOR HLA CLASA I Proteine intracelulare

ANTIGENELE PREZENTATE DE MHC CLASA I SUNT RECUNOSCUTE DE CELULELE T

Kills

MHC I

Cytotoxic T cell

Virusinfected cell

Apoptotic cell

LTC recunosc antigenele prezentate de MHC I i le omoar

http://www.youtube.com/watch?v=Jg_21iSYwBc&feature=related

PROCESAREA ANTIGENELOR EXTRACELULARE

PROCESAREA ANTIGENELOR HLA CLASA II Proteine extracelulare

ANTIGENELE SUNT RECUNOSCUTE DE CELULELE T

Activates

Activates

TH1

MHC II

TH2 Macrophage Dead intracellular bacteria

MHC II

B cell

Anti-toxin antibodies LTH2 recunosc antigenele prezentate de MHC II i activeaz LB

LTH1 recunosc antigenele prezentate de MHC II i activeaz macrofagele

http://www.youtube.com/watch?v=M48qu5c7Cfg&feature=related

LIMFOCITELE T

De ce este necesar polimorfismul MHC?

Necesar pentru a face fa diversitii structurale a agenilor patogeni. Manifestat prin abilitatea de a prezenta o gam larg de peptide antigenice derivate din agenii patogeni. Rezult din expresia alelelor multiple ale moleculelor MHC codificate n cadrul locusurilor multiple ale regiunii MHC de pe cromozomul 6. Protejeaz mpotriva epidemiilor letale Supravieuire crescut a populaiei datorit diversitii alelelor.

http://twistedbacteria.blogspot.com/

= susceptibili

POLIMORFISMUL MHC Exemplu: Dac MHC X a fost singurul tip de molecul MHC

MHC XX

Agentul patogen se sustrage MHC X

Supravieuirea individual ameninat

Populaia ameninat cu dispariia

POLIMORFISMUL MHC Exemplu: n cazul n care fiecare individ prezint dou molecule MHC, MHC X i Y

MHC XX
Agentul patogen se sustrage MHC X dar are secvene care se leag de MHC Y

MHC YY

MHC XY

Impactul asupra individului depinde de genotip

Populaia supravieuiete

POLIMORFISMUL MHC Exemplu: n cazul n care fiecare individ prezint dou molecule MHC, MHC X i Y ...... i patogeni mutani

MHC XX
Agentul patogen se sustrage MHC X dar are secvene care se leag de MHC Y . Dar dezvolt mutaii pentru a se sustrage MHC Y

MHC YY

MHC XY
Populaia ameninat cu dispariia

Supravieuirea individual ameninat

Sfrit partea I

II.IMUNITATEA DE TRANSPLANTARE (rspunsul imun fa de gref)

As.Univ.Dr.As.SAMACA GABRIEL Catedra de IMUNOLOGIE UMF CLUJ, mai 2012

http://www.bidmc.org/Research/Departments/Medicine/Divisions/TransplantImmunology.aspx

Oameni din SUA care triesc cu grefe de organe funcionale

TERMINOLOGIA N TRANSPLANTARE

Transplantare = prelevarea unui organ (esut, celule) de la un donator i implantarea lui la alt individ, denumit primitor, cu restabilirea

continuitii vasculare. (1).Dac organul transplantat este plasat n locul de unde a fost ndeprtat organul bolnav,
http://celioscopy.blogspot.com/

transplantul se numete ortotopic, (2).iar dac este plasat n alt regiune anatomic fa de locul de unde a fost ndeprtat cel bolnav, este denumit transplant heterotopic (de exemplu transplantarea rinichiului sntos n fosa iliac, nu n loja renal).

http://en.wikipedia.org/wiki/Transplantable_organs_and_tissues

BARIERE GENETICE ALE TRANSPLANTRII

Molecule MHC alogenice - molecule responsabile de rejetarea rapid a grefei

Autogrefa dintr-o parte a corpului n alta. - grefe de piele (acceptate de regul)

Izogrefa (singrefa) ntre indivizi identici din punct de vedere genetic. - gemeni identici (acceptate permanent)

Molecule care sunt recunoscute ca fiind strine pe alogrefe sunt numite aloantigene. Alogrefa (homogrefa) ntre indivizi diferii ai aceleiai specii. - de la un om la altul (rejetul apare dac Limfocitele i anticorpii donatorul i primitorului care reacioneaz primitorul nu sunt cu aloantigenele strine sunt compatibili). descrise ca fiind aloreactive. Xenogrefa (heterogrefa) ntre membri ai unor specii diferite. - sunt totdeauna rejetate.

MEMORIA IMUNOLOGIC Recunoaterea aloantigenilor

MECANISME IMPLICATE N REJETARE Faza de recunoatere - mecanisme moleculare

MECANISME IMPLICATE N REJETARE Faza recunoatere - mecanisme celulare

MECANISME IMPLICATE N REJETARE Faza recunoatere - mecanisme celulare

vascularizaie!!!

MECANISME IMPLICATE N REJETARE

lipsa vascularizaie!!!

HLA INCOMPATIBILE!!!

ZONE PRIVILEGIATE!!!

MECANISME IMPLICATE N REJETARE Faza efectoare

LT CD8 Recunoaterea moleculelor

MHC de clas I exprimate pe toate celulele donatorului Efecte citotoxice directe

LT CD4 Recunoaterea moleculelor

MHC de clas II pe celulele dendritice (CD), macrofage

(alorecunoatere indirect)

http://www.nature.com/nm/journal/v8/n3/fig_tab/nm0302-220_F1.html

MECANISME IMPLICATE N REJETARE Faza efectoare

IL-2, IFN-g, TNF

CD4+
Th1

CD8+
srutul morii

Clasa II Macrofage
LT CD8 Efecte citotoxice directe

Clasa I

Celulele grefei ADCC

Aloanticorpii fixai pe celulele grefonului se leag de celulule NK, monocite/macrofage - atac doar celulele lipsite de MHC de clasa I.

LT CD4 eliberarea de TNF+IFN+IL2 induce activare macrofagic i distrucie nespecific

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

1) Rejetul hiperacut: - apare la cteva ore dup transplant - la un individ cu anticorpi preformai, fie datorit incompatibilitii de grup sanguin, fie datorit sensibilizrii anterioare, prin transfuzii de snge sau alte transplante 2) Rejetul acut: - apare dup 10-30 de zile de la transplantare - este mediat mai ales de LT 3) Rejetul cronic sau tardiv: - apare dup luni sau ani

http://www.discoverymedicine.com/Jeffrey-LPlatt/files/2010/08/discovery_medicine_platt_no51_figure_1.jpg http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0952791500001394

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejetul hiperacut

anticorpii

preformai

din

organismul

primitorului,

reacioneaz

cu

endoteliul

vascular,

activeaz complementului i declaneaz tromboza intravascular rapid i necroza peretelui vasului.

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet hiperacut al unei grefe renale

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet hiperacut al unei grefe renale

- un prejudiciu endotelial - trombi de trombocite i trombin - infiltrarea neutrofilelor n glomerul.

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet acut vascular

- limfocitele T CD8+ reacioneaz cu aloantigenii de pe celulele endoteliale producnd distrugeri ale celulelor parenchimale; - anticorpi aloreactivi formai dup transplantarea grefei pot contribui, de asemenea, la un prejudiciu vascular.

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet acut vascular al unei grefe renale

- edem - inflamaie

http://www.wikidoc.org/index.php/Transplant_rejection

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet acut vascular al unei grefe renale

B. Rejectul acut al unei grefe renale cu celule inflamatorii n esutul conjunctiv din jurul tubilor i ntre celulele epiteliale de la nivelul tubilor. C. respingerea acut mediat de anticorpi, cu reacie inflamatorie distructiv a stratului endotelial al unei artere. D. respingerea acut mediat de anticorpi, cu depunerea complementului C4d n vase.

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet cronic

- arterioscleroza grefei, prejudiciul al peretele vasului duce la proliferarea celulelor musculare netede intime i ocluzia lumenului. Aceast leziune poate fi cauzat de o reacie DTH (delayed-type hypersensitivity) cronic la aloantigenii din peretele vasului.

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE I PREVENIREA LOR

Rejet cronic

Respingere cronic n alogrefa de rinichi, cu arterioscleroza grefei. Lumenul vascular se

nlocuiete cu o acumulare de celule musculare netede i esut conjunctiv, n intima vaselor.

PREVENIA N REJECTUL DE ALOGRAF

A. Selectarea primitorului 1. Compatibilitate AB0 (nu identitate). Respectarea identitii AB0 doar pentru a se evita aglomerarea bolnavilor care ateapt i au grupa 0. 2. Compatibilitate, ct mai apropiat posibil, n special HLA de clasa II 3. Cross-match negativ al serului primitorului fa de limfocitele T ale donatorului 4. Alte criterii: - vrst, sex - grefe anterioare - transfuzii anterioare - infecii severe - coagulopatii - alte boli B. Selectarea donatorului Donatori post mortem 1. Funcie bun a organului ce va fi grefat 2. Lipsa infeciilor septice sau transmisibile (HIV, HBV, HCV) 3. Lipsa tumorilor maligne (cu excepia celor cerebrale) 4. Lipsa bolilor de sistem (diabet, hipertensiune, leucemie etc.) 5. Lipsa anomaliilor anatomice ale organului 12. Timpul de ischemie la cald scurt Donatori n via 1. Organul pereche s aib funcie bun 2. Starea de sntate perfect 3. Starea psihologic adecvat 4. Lipsa bolilor transmisibile 5. Lipsa anomaliilor vasculare 6. Restul criteriilor specificate anterior la cadavre

monitorizarea primitorului se realizeaz prin urmrirea atent a evoluiei clinice i mai ales prin biopsii

TRATAMENTUL N REJECTUL DE ALOGRAF Suprimarea reactivitii imune a donatorului

Medicamentele imunosupresoare inhib sau distrug limfocitele T -ciclosporina i FK506 (tacrolimus), inhibitori de calcineurin, inhib transcrierea unor gene din celulele T, cum ar fi IL-2. - rapamicina (sirolimus), inhib proliferarea celulelor T Agenii antiinflamatori, sunt frecvent utilizai pentru a reduce reacia inflamatorie la alogrefele de organe. - corticosteroizi Anticorpi, care reacioneaz cu structurile de pe suprafaa celulelor T, diminueaz sau inhib celulele T i sunt utilizai pentru tratarea episoadelor acute de respingere -OKT3 Antimetabolii, toxine metabolice, distrug celulele proliferante T sunt utilizate n combinaie cu alte medicamente - mycophenolate mofetil Blocani de ci costimulatoare reduc rejetului acut. - CTLA4

TRATAMENTUL N REJECTUL DE ALOGRAF Suprimarea reactivitii imune a donatorului

TRATAMENTUL N REJECTUL DE ALOGRAF Efecte secundare ale medicamentelor imunsupresoare

Toxicitate (nefrotoxicitate) Scderea rezistenei la infecii Risc crescut pentru maligniti boala limfoproliferativ post-transplant (PTLD)

(asociat cu virusul Epstein-Barr)

METODE DE REDUCERE IMUNOGENITII ALLOGREFEI Minimalizarea diferenelor aloantigenice dintre donator i primitor

Persoanele care exprim un antigen ABO sunt tolerante la acel antigenul, dar persoanele care nu exprim antigenul produc anticorpi naturali care recunosc antigenul.

Jesica SANTILLAN (26 decembrie 1985 - 22 februarie 2003) a fost un cetean mexican care a murit dup o operaie de transplant de organe, n care ea a primit inima i plmni de la un pacient a crui tip de snge nu s-a potrivit cu al ei. Medicii de la Duke University Medical Center nu au reuit a verifica compatibilitatea nainte de nceperea interveniei chirurgicale. Dr. James Jaggers, a declarat, Sper c noi, i alii, poate vom nva din aceast greeal tragic. Dup moartea lui Jesica, familia SANTILLAN a fost abordat de ctre spital pentru a stabili dac organele ei ar putea fi donate pentru a fi utilizate la transplantul altor pacieni. La sfatul avocailor lor, familia a refuzat.

Jesica a avut grupa de snge O, iar donatorul grupa de snge A

METODE DE REDUCERE IMUNOGENITII ALOGREFEI Minimalizarea diferenelor aloantigenice dintre donator i primitor

Tipizarea HLA a pacientului i donatorului Tipizarea serologic a limfocitelor Tipizarea ADN prin metode de tip PCR Screening-ul serului pacientului pentru anticorpi HLAspecifici Crossmatchul ntre serul pacientului i celulele donatorului

http://www.stanford.edu/dept/HPS/transplant/html/hla.html

ANTIGENE DE TRANSPLANTARE

Pacientul: HLA-A1,A2;B7,B35;DR1,DR4
Tipul HLA Donator 1 Donator 2 Donator 3 Donator 4 Donator 5 Donator 6 A1,A2;B7,B35;DR1,DR4 A1,A2;B35,-;DR1,A1,A2;B35,-;DR4,DR17 A2,A11;B8,B35;DR1,DR5 A2,A25;B7,B37;DR7,DR15 A3,A26;B8,B38;DR4,DR17 Numrul antigenelor incompatibile 0 0 1 3 4 6

Criteriile actuale de compatibilitate HLA se bazeaz pe numrarea antigenelor incompatibile de clas I A, B i de clas II DR ale donatorului.

METODE DE REDUCERE IMUNOGENITII ALLOGREFEI Minimalizarea diferenelor aloantigenice dintre donator i primitor

METODE DE REDUCERE IMUNOGENITII ALOGREFEI Minimalizarea diferenelor aloantigenice dintre donator i primitor

1/500 milioane

http://uwmedicine.washington.edu/PatientCare/`

TOLERANA LA TRANSPLANT

Visul oricrui medic implicat n ngrijirea bolnavilor transplantai.

Multe

modele

experimentale

de

transplant

au

prezentat supravieuirea permanent a grefei datorit inducerii toleranei imunologice. Mecanismele inducerii toleranei la transplant:

anergie, supresie, deleie. Unele transplante incompatibile continu s

funcioneze i dup ncetarea imunosupresiei.

Mecanismul prin care celulele T mature care recunosc antigenii proprii din esuturile periferice sunt redate ca incapabile de a rspunde la aceste antigene.

XENOTRANSPLANTUL N CLINIC

Donatori poteniali: porcul, babuinul.

http://www.actasurologicas.info/v32/n01/E G/3201OR14.htm

Problema major nr. 1: anticorpii preformai mpotriva xenoantigenelor (rejet hiperacut).

Problema major nr. 2 ??: Infecia cu virusuri endogene de la xenogrefe

http://www.ndt-educational.org/cozzislide2007txt.asp

TRANSPLANTUL DE MDUV HEMATOGEN

Procesul prin care hematopoieza normal este restabilit prin perfuzia i.v. de celule stem

http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcance r/StemCells/AllPages/Print

pluripotente.

INDICAII
Tratamente cu doze mari (chimioterapie, raze X) Acestea distrug i hematopoieza pacientului Salvare cu perfuzie de celule stem

Un termen mai bun: Transplantul de celule stem

http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:A d9GcQ6BCgH3VxoeAk6 GC5SXS Gljuo6TEBIwrHkmFS3d7evjOp9Ptt

TRANSPLANTUL DE MDUV HEMATOGEN

Boli genetice tratabile prin transplant medular SCID Sdr. Wiskott-Aldrich Anemia Fanconi Sdr. Kostmann Boala granulomatoas cronic Osteopetroza Ataxia telangiectazia Sdr. Diamond-Blackfan Candidiaza cutaneo-mucoas Sdr. Chediak-Higashi Hipoplazia cartilagiu-pr Mucopolizaharidoze Boala Gaucher Thalasemia major Boli maligne tratabile prin transplant medular Transplant alogenic/singenic Cancer de sn Anemie aplastic Leucemii Leucemie acut mieloid Leucemie acut limfoid Leucemie cronic mieloid Mielodisplazie Mielom multiplu Limfom non-Hodgkin Limfom Hodgkin Transplant autolog Leucemii Leucemie acut mieloid Leucemie acut limfoid Mielom multiplu Limfom non-Hodgkin Limfom Hodgkin Tumori solide Sn Ovarian Testicular Neuroblastom

TRANSPLANTUL DE MDUV HEMATOGEN

Colectarea de celule progenitoare se poate face prin afereza mduvei hematogene.

Afereza procedura n timpul creia sngele este prelevat de la pacient, trecut printr-un aparat special care separ celulele alegndu-le pe cele necesare transplantului, restul celulelor fiind napoiate pacientului.

TRANSPLANTUL DE MDUV HEMATOGEN

Probleme legate de transplantul medular

Infecie Recderea bolii Eecul grefrii (reacie gazd contra gref)

http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/ StemCells/AllPages/Print

http://psychcentral.com/news/2010/06/0 1/immune-disorders-tied-to-mentalillness/14171.html

BOALA GREF CONTRA GAZD

GVHD, celulele transplantate atac celulele gazd

GVHD acut n primele 3 luni dup transplant Piele, tractul gastrointestinal, hepatosplenomegalie. GVHD cronic Dup 3 luni Piele, ficat, tract gastrointestinal Similitudini cu bolile esutului conjunctiv (de exemplu sclerodermia).

BOALA GREF CONTRA GAZD

GVHD, celulele transplantate atac celulele gazd

Reacii tisulare n GVHD Gra dul 1 Piele Ficat Tract gastrointestin al >500 ml diaree/zi

Rash maculopapular pe <25% din suprafaa corpului Rash maculopapular pe <25-50% din suprafaa corpului Eritrodermie generalizat

Bilirubina seric 2-3 mg/dl Bilirubina seric 3-6 mg/dl

>1000 ml diaree/zi

Bilirubina seric 6-15 mg/dl Bilirubina seric 15 mg/dl

>1500 ml diaree/zi

GVHD acut grad 4 la nivelul pielii (formare de bule)

Eritrodermie generalizat cu formare de bule i descuamare

Durere abdominal sever cu sau fr ileus

BOALA GREF CONTRA GAZD

GVHD, celulele transplantate atac celulele gazd

Profilaxie Grad nalt de compatibilitate HLA donator-primitor Toi pacienii care suport transplant medular

allogenic necesit profilaxia GVHD. Ciclosporin, depleie de LT Tratament n ciuda profilaxiei, muli pacieni dezvolt GVHD Tratament de prim intenie cu steroizi Alte tratamente: imunoglobulin antitimocitar, Metotrexat, Tacrolimus, steroizi,

anticorpi monoclonali

ASPECTE ETICE

Stephanie Fae Beauclair (14 octombrie 1984 - 15 noiembrie 1984), cunoscut sub numele de baby Fae, a fost un copil american nscut n 1984, cu sindromul hipoplastic cardiac stng. Ea a devenit obiectul primei proceduri de xenotransplant, primind o inim de babuin. Procedura, efectuat de ctre Leonard L. Bailey de la Loma Linda University Medical Center, iniial a prut s fie de succes, dar Fae a murit 21 zile mai trziu de o infecie a rinichilor. Procedura a fost supus la o dezbatere larg etice i juridice.

Sfrit partea II

III.TEHNICI DE HISTOCOMPATIBILITATE N LABORATOARELE HLA

As.Univ.Dr.As.SAMACA GABRIEL Catedra de IMUNOLOGIE UMF CLUJ, mai 2012

TIPURI DE GREFE

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/im ages/ency/fullsize/19083.jpg

http://health.rush.edu/HealthInfo rmation/graphics/images/en/140 76.jpg

http://t1.gstatic.com/images ?q=tbn:A d9GcTUn5MPQ 8dtMop1Cprz5_h_eelc1sJF Cq7pQ8zRyXOjuRMMlbbq

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:A d9GcS lRbvtZDmDCmdQn6ftLzdDzDxb4bCxKm9nE uBCbV9ow3h0 hIVhg

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:A d9GcRZ0gukuLRZ_4eSbOseKXvswg lXrjA3as1I9X2j6s hc15tt_Zs

http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:A d 9GcTkzW rJxUPEuWeesZliR3Vssk S3 3_7HsiJYA-GfyQbTM9uR_-

GREFELE DE PIELE, OS I CORNEE

Grefele de piele, os i cornee - grefe homostatice, care joac rolul unic de suport organic pentru celulele primitorului, care vin i colonizeaz brea tisular n timp ce celulele grefate sunt respinse.

GREFA DE RINICHI

Grefa de rinichi: 1. determinarea Ag. eritrocitare n sistemul ABO, Rh. 2. determinarea Ag. HLA clasa I i a II-a 3.Compatibilitatea donatorului 4. Sreening periodic al serurilor de primitori pentru Ac. citotoxici. Rolul compatibilitatii pentru locusurule A i B este controversat datorit numrului mare de alele care ngreuneaz gsirea unor persoane HLA identice, compatibilitatea pentru locusul B fiind mai important dect pentru locusul A. - Ag. HLA C fiind foarte puin imunogene nu influeneaz soarta grefei. Rolul cel mai important pare sa fie al locusului DR, incompatibilitatea DR = stimulul major care declanseaz rspunsul imun n grefa renal; rolul compatibilitii DR crete la a doua, a treia grefare. direct (Cross-match) ntre serul primitorului i limfocitele

GREFA CARDIAC I GREFA DE FICAT

Grefa cardiac: Se respect n general compatibilitatea ABO i cross match negativ, din cauza lipsei unui organ artificial de nlocuire i a urgenei de gsire a unui donator. Grefa de ficat: Practic n situaii neurgen se respect compatibilitatea ABO i cross match negativ, fiind posibil ca n urgente grefa s fie fcut fr compatibilitate ABO i HLA.

GREFA DE MDUV

Donorii i primitorii sunt testai pentru antigenele HLA-A, -B, -C, -DP, -DQ i DR. Scopul este potrivirea perfect pentru cele 6 antigene ntre primitor i donor. Tipizarea ADN este realizat din probe att de la donor ct i de la primitor pentru o ct mai bun compatibilitate pentru clasa a II-a. Dei identitatea HLA rmne cea mai bun alegere pentru transplantul de mduv, se folosesc donori fr legtur direct, din Programul Naional al Donorilor de Mduva osoas (National Bone Marrow Donor Program).

http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:A d9GcSms RloBVs_oxcAAEUl2lJKOnd_DuWbP6EUKu8wV t EgjTMDMK7

http://www.x-ald.nl/treatment-options/hsct/

DETECIA ANTIGENELOR HLA

Reacii serologice (Reacia de microlimfototoxicitate)

Celulele CD8 + T de la donatorul X s reacioneze cu moleculele MHC de clasa I de la donatorul Y. Celule CD4 + T de la donatorul X s reacioneze cu moleculele MHC de clasa II de la donatorul Y.

DETECIA ANTIGENELOR HLA

Reacii serologice (Reacia de microlimfototoxicitate)

Pentru tipizarea HLA ABC (clasa I) Ag. se studiaz pe limfocite T totale izolate din: snge periferic recoltat pe anticoagulant (heparina / ACD) sau ganglioni limfatici 1.Cenrifugare n gradient de densitate pe limfocite totale, apoi incubarea lor cu o baterie de antiseruri-HLA, pentru formarea complexului AntigenAnticorp, n prezena complementului, care permeabilizeaz membrana celular a limfocitelor, astfel nct un clorant (eozina /albastru tripan) poate ptrunde n celule i le coloreaz. n cazul unei reacii pozitive serurile anti-HLA reacioneaz cu antigenele limfocitare corespunztoare i apare reacia de culoare. Reacia negativ celulele care nu reacioneaz cu anti-serurile nu nglobeaz colorant. = CITIRE la microscop inversat N CONTRAST DE FAZ - celulele vii mai deschise la culoare i mai luminoase (reacie negativ) - celulele moarte mai nchise la culoare i de dimensiuni mai mari (reacie pozitiv) 2.Cu Bile magnetice pe limfocite T i apoi colorare cu Acridin-orange i Ethidiumbromid = CITIRE N DUBL FLUORESCEN

DETECIA ANTIGENELOR HLA

Reacii serologice (Reacia de microlimfototoxicitate)

Pentru tipizarea HLA DR, DQ (clasa II ) Ag. se studiaz doar pe limfocite B izolate din sngele periferic sau fragmente de splin 1.Cu anticorpi monoclonali : - OKMI pentru liza monocitelor OCH pentru liza celulelor CD11+ recoltat pe ACD - OKT3 pentru liza celulelor CD3+ 2.Cu Bile magnetice invelite cu anticorpi monoclonali specifici pentru epitopul lanului beta monomorf al antigenelor HLA clasa II. Prin incubarea sngelui recoltat pe anticoagulant cu bilele, limfocitele purttoare de antigene HLA clasa a II-a formeaz rozete, pot fi apoi separate cu ajutorul unui separator magnetic i apoi splate. Limfocitele izolate pot fi folosite pentru tehnica de microlimfocitotoxicitate = dup adugarea limfocitelor pe plac, Ag. se vor liza n prezenta Ac. corespunztori i ai complementului. Colorarea se face cu acridin orange i ethidium bromid). CITIRE N DUBL FLUORESCEN: celulele vii sunt colorate n verde - celulele moarte (lizate) sunt colorate n rosu INTERPRETAREA REZULTATELOR: 0-10 % = scor 0, 10-30 % = scor 2, 30-60 % = scor 4, 60-80 % = scor 6, 80-100 % = scor 8

DETECIA ANTICORPILOR HLA

CDC i ELISA

Reaction scheme Biotest AbScreen/AbIdent

Colored product
PNP P

Substrate Anti-human IgG AB, enzyme labeled Anti-HLA antibody from patient sample HLA class I/II antigens (coated)
Class I: from Thrombocyte pool Class II: from B-Lymphocytes

Y Y

Y
Y

Y
Y

Y
Y

Microtiter plate (MTP)

http://www.youtube.com/watch?v=GsJHYeQy5SU&feature=related

DETECIA ANTICORPILOR HLA

CDC i ELISA

CDC SAU ELISA?

FORMA DE PREZENTARE

CDC Biotest Lymphoscreen Lymphoscreen ABC 60 [REF] 823 300 Screening and identification of antibodies against HLA class I antigens Lymphoscreen DR 30x2 [REF] 823 350 Screening and identification of antibodies against HLA class II antigens

ELISA Screening Biotest AbScreen HLA class I [REF]823 400 Screening for antibodies against HLA class I antigens Biotest AbScreen HLA class II [REF]823 410 Screening for antibodies against HLA class II antigens Identification Biotest AbIdent HLA class I antigens Biotest AbIdent HLA class II antigens [REF]823 430 Identification of antibodies against HLA class II [REF]823 420 Identification of antibodies against HLA class I

92

DETECIA ANTIGENELOR HLA

Reacii bazate pe DNA - prin biologie molecular

PCR-SSP = sequence specific primers (alele specific amplification). Folosete secvenele specifice de primeri care intesc o secven particular de ADN. Procedura cunoscut ca PCR-SSP se bazeaz pe aplicarea de specificiti nalte n momentul amplificrii, mai degrab dect n momentul hibridizrii. Pentru ca SSP au anumite inte specifice, prezena materialului amplificat indic prezena alelelor

corespunztoare.

PCR-SSP

PCR-SSP

SSP execution exemplified by the ABDR combitray

Negative control

HLA-A

HLA-B
PCR Cocktail

HLA-DR

PCR-SSP

For each typing a mastermix has to be prepared out of the following components
440 l PCR Cocktail 550 l H2O 7 l Taq Polymerase (5u/ l)

Mix well, then 10 l of the mastermix are added to the negative control (black label). After that add 110 l DNA (approx. 100 50 ng/ l)

PCR-SSP

Fr jede Typisierung mu zunchst ein Mastermix aus den folgenden Komponenten erstellt werden:
440 l PCR Cocktail 550 l H2O

Pipette 10 l of this mastermix in each well. To avoid contaminations with Gut mischen, anschlieend werden 10 l des Ansatzes zur primers, pipette the mastermix on the Negativkontrolle hinzu pipettiert (schwarze Markierung). side of the well as indicated. Danach Zugabe von 110 l DNA (approx. 100 50 ng/ l)

PCR-SSP

440 l PCR Cocktail

Seal the PCR tray using the enclosed foil.

550 l H2O

PCR-SSP

440 l PCR Cocktail 550 l H2O

Take care of sealing the tray tight.

PCR-SSP

440 l PCR Cocktail 550 l H2O

Transfer the tray into the thermocycler and start the PCR.

PCR-SSP

2 440 l PCR Cocktail 1.

2. 3 4 3.

4.

Prepare a 2% agarose gel by boiling 5 g agarose in 250 ml of 1 x TBE in a microwave oven or on a heating plate When the solution is clear, cool it down below 60C stirring Add 4 l ethidium bromide Subsequently pour the agarose solution devoid of bubbles - into a prepared and sealed gel tray. Place the combs (10 l pockets) and keep it at room temperature for at least 10 minutes.

PCR-SSP

1. After the agarose has solidified the gel is inserted into the gel chamber. The combs are removed and the gel is covered with 1 x TBE. 2. Pipette the entire PCR mixtures (10 l) into the gel pockets. 3. The electrophoresis takes place in 15 to 25 minutes at 8V/cm. 4. The gel is placed on an UV transilluminator and photographed for documentation and interpretation.

PCR-SSP

Sample application point

440 l PCR Cocktail 550 l H2O

Primer band

Control band Primermixspecific band

PCR-SSP

440 l PCR Cocktail 550 l H2O

Click onto the corresponding bands on the screen and press "typing"

PCR-SSP

440 l PCR Cocktail 550 l H2O

Sfrit

We love learning about MHC.

We will have an exam