PROTEINE

ef lucrri dr. Irena GRIEROSU

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii II. Clasificarea proteinelor

III. Structura primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinelor

IV. Functii generale ale proteinelor

V. Metode de studiu ale proteinelor

VI. Insulina, mioglobina - hemoglobina, colagen, ADN si ARN

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii

A. Forma si dimensiunile moleculelor B. Macromoleculele sunt structuri complexe C. Mecanisme de asociere a monomerilor D. Forme naturale rezultate din asocierile moleculare

A. Forma i dimensiunile
moleculelor
Moleculele care alctuiesc fiinele vii au 2 caracteristici foarte diferite de cele studiate n chimia organic:
1. Ele sunt continuu formate i distruse, chiar dac prezint o concentraie constant = rennoire 2. Multe dintre moleculele vieii au dimensiuni mari = macromolecule

O macromolecul:
- mas - relief - volum - suprafa extern - n contact cu moleculele vecine - micri interne i flexibilitate

B. Macromoleculele sunt
structuri complexe
sunt alctuite din molecule elementare (denumite uniti sau, mai bine, subuniti glicogenul este alctuit din subuniti de glucoz)

- o subunitate este denumit i monomer (gr. monos = singur, meros = parte) dimer, trimer, tetramer oligomer (gr. oligos = puin) polimer (gr. polys = muli) dimer / polimer omogen - dac subunitile sunt identice eterogen - dac subunitile sunt diferite

- indice de polimerizare = numrul de monomeri prezent ntr-o molecul complet de polimer

Polimerii pot fi de 3 tipuri

I. II. III.

Polimeri lineari Polimeri ramificai Polimeri globulari

I. Polimeri lineari - alctuii din

monomeri reunii, fiecare, prin dou legturi simple (asemenea verigilor dintr-un lan) ex.: lanul polipeptidic

ABADGAA A A A A A A A sau (A)n

II. Polimeri ramificai - la nivelul crora,

n anumite puncte lanul de monomeri prezint o ramificaie, punct de plecare pentru un nou lan de monomeri; monomerul situat la nivelul ramificaiei prezint 3 legturi cu monomerii vecini.

III. Polimeri globulari - rezult de

regul prin asocierea de oligomeri sau polimeri mici; fiecare subunitate este n contact cu mai multe alte subuniti.

Pentru studiul structurii unui oligomer sau polimer

-

structura monomerului (sau a monomerilor) natura legturii dintre monomeri

C. Mecanisme de asociere
a monomerilor
2 tipuri de mecanisme de asociere 1. prin legturi covalente
2.

prin legturi non-covalente

Gruparile amino si carboxil ale a.a. se ionizeaza usor la pH fiziologic (gruparea amino fixeaza un proton, iar gruparea carboxil pierde un proton). Rezultatul este un zwitterion, adica o molecula ionizata care are ambele sarcini, pozitiva si negativa, dar sarcina totala este zero.

prin legturi covalente

2 modaliti diferite - monomerii se leag fr pierderea de atomi, - legare cu pierdere de atomi, de ex. H i OH, sau a unui radical mai complex.

prin legturi non covalente (leg. fizice)

Caracteristici:

fore de legtur relativ slabe (1/10 fa de legtura covalent), de aceea se stabilesc n numr mare (pentru un efect atractiv suficient), suprafeele moleculelor trebuie s fie complementare (pentru apropiere suficient), aceste legturi fizice pot fi situate: - n structura intern a macromoleculei, - asocieri ale unor subuniti identice sau de tipuri diferite.

NATURA legturilor non covalente

sarcini electrice ale moleculelor, de ex. funcia carboxilic (-COO-) sau amin (-NH3+) care dau legturi saline (acid-baz)
sarcini pariale ca dipolii C=O (electronii mai apropiai de O, negativ, n timp ce C este uor pozitiv)

-- prin cuplarea n sens opus a

acestor dipoli C=O se formeaz legturi prin schimb de dipoli (dipolare)

-- legturi de hidrogen

NATURA legturilor non covalente

fore de coeziune apolare

- molecule care nu se dizolv, nu se amestec cu apa, deoarece conin doar radicali saturai CH2(se comport n mediul apos din organism asemenea unei brci pe ap, care nu se scufund deoarece este mpins n sus, conform principiului lui Arhimede), - dac dou zone saturate (denumite i hidrofobe) ale unei aceleiai molecule sau a dou molecule diferite se situeaz una n faa alteia formeaz o legtur hidrofob, intramolecular n primul rnd i intermolecular n cel de al doilea caz.

Lipidele, ndeosebi, se leag prin legturi hidrofobe, datorit constituenilor eseniali, acizii grai, ale cror molecule nu sunt udate de ap. De asemenea, anumite domenii apolare ale proteinelor pot reaciona ntre ele n acelai mod.

Lanturile laterale polare, frecvent participa la formarea legaturilor

de H (90%)

caracter hidrofil

- polar neionizat (1/2 din a.a.) - polar ionizat (5 a.a.), la pH neutru

20 de aminoacizi
caracter hidrofob

Legaturi non-polare =
- legaturi disulfidice (de tip cross-linking), - rigiditate a lantului polipeptidic - cisteina, metionina 2 a.a. care contin un atom de S

5 din 20 de a.a. lantul lateral are sarcina electrica (aspartat si glutamat - , histidina, lizina si arginina + ) =

legaturi saline

Efectul hidrofobic contribuie cel mai mult la stabilizarea structurii proteinei

D. Forme naturale rezultate din asocierile moleculare

1. Asimilarea formelor naturale cu figuri

geometrice

Structurile naturale, rezultate din formarea de oligomeri, polimeri sau asocieri moleculare sunt ntotdeauna complexe. Asemnarea formelor moleculare cu figuri geometrice este: - aproximativ, - moleculele se pot deforma pentru ndeplinirea funciilor biologice, ca rspuns la aciunea unor fore.

2. Tipuri de figuri geometrice

a) sfer (glob) este structura care confer
stabilitate (soliditate): ex. forma celulei libere (explicaie termodinamic) ribozomii.

b) foaie-foi
structur foarte rspndit, de ex. membrana celular, a crei matrice este alctuit din dou straturi de fosfolipide (la nivelul crora se inser proteinele); - membranele extracelulare membrana bazal, constituite dintr-o reea de colagen de tip IV, dispus ca ochiurile unei plase, la nivelul creia se afl glicoproteine i proteoglicani.

c) bastona (fibril, fibr) form de

cilindru a crui lungime este net superioar diametrului se obine prin asocierea longitudinal a unor subuniti lineare prin asocierea unor subuniti globulare ntr-o singur direcie --- asocierea mai multor bastonae n aceeai direcie a spaiului formeaz o fibril --- fibrele i fibrilele se orienteaz n funcie de forele de tensiune tendoane, fibre osoase miofibrile esut muscular --- arhitectura celulelor, esuturilor, organelor (tensegritate)

d) elice - dispoziie elicoidal, spiralat

-

acizii nucleici, proteinele serie de polimeri glucidici.

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii II. Clasificarea proteinelor

III. Structura primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinelor

IV. Functii generale ale proteinelor

V. Metode de studiu ale proteinelor

VI. Insulina, mioglobina - hemoglobina, colagen, ADN si ARN

CLASIFICAREA PROTEINELOR

BIOCOLOIZI - proteine circulante,

proteine solubile din citoplasma

MACROMOLECULE DE STRUCTURA

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii II. Clasificarea proteinelor

III. Structura primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinelor

IV. Functii generale ale proteinelor

V. Metode de studiu ale proteinelor

VI. Insulina, mioglobina - hemoglobina, colagen, ADN si ARN

Structura primar

Structura secundar

Structura teriar Structura cuaternar

Structura primar

- - Ala Glut Ser His Leu Pro Gly - -

Structura primar

Structura primar

Structura primara a lizozimului este reprezentata de un lant polipeptidic de 129 aminoacizi.

Structura secundar -helix

Dubla elice ADN. Moleculele de adenina (A) intotdeauna se opun moleculelor de timina (T), iar guanina (G), citozinei (C).

Structura secundar -helix

Structura secundar - pliat

Plierea unui singur lant polipeptidic intr-o forma tridimensionala = structura tertiara a proteinei
3 principii importante:
1. Lanturile secundare sunt consecinta, in principal, numeroaselor legaturi de hidrogen.

2. Structurile secundare de tip -helix si -pliat se asociaza frecvent pentru a forma proteine.
3. Lanturile au tendinta de a se plia in spatiu pentru a ocupa mai putin loc.

Structura tertiar

Trioz-fosfat-izomeraza

Trioz-fosfat-izomeraza

Structura cuaternar

Structura cuaternar - hemoglobin

Structura cuaternar - mioglobin

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii II. Clasificarea proteinelor

III. Structura primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinelor

IV. Functii generale ale proteinelor

V. Metode de studiu ale proteinelor

VI. Insulina, mioglobina - hemoglobina, colagen, ADN si ARN

1. Enzime: catalizeaz ruptura

sau formarea unor legturi covalente (mii)
Ex: - pepsina

- ADN-polimeraza
- ribonucleaza - tripsina

- alcooldehidrogenaza

2. Proteine structurale:
susinerea mecanic a celulelor i a esuturilor
Ex: - colagenul i elastina - tubulina i actina

- - keratina
- proteoglicanii

keratina

3. Proteine de transport:
transportul unor molecule mici sau a unor ioni
Ex: - Hb. oxigen
transferina - fier

albumina - lipide
proteine de transport membranar: H2, glucoz (GLUT), Ca2+

4. Proteine motrice:

genereaz micare n celule i esuturi

Ex: miozina, actina, kinezina, dineina

5. Proteine de stocare:
a unor molecule mici sau ioni

Ex:

- feritina
- ovalbumina

6. Proteine semnal: transmit

semnale de la celul la celul
Ex: - hormoni (insulina, tirotropina etc.) - factori de cretere: NGF, EGF

7. Proteine receptoare:
detecteaz semnale i le transmit mainriei celulare
Ex: -rodopsina,
- receptorul pentru acetilcolin al celulei musculare primete semnale chimice

8. Proteine reglatoare ale genelor: se leag de ADN pentru a

induce sau a inhiba expresia genelor

9. Proteine cu rol particular

Ex: -proteinele antigel ale petilor de la polii Nord-Sud
-proteine fluorescente - proteine cu funcie de adeziv

lumina produsa = rezultatul reactiei intre luciferina si ATP (sub actiunea unei enzime, luciferaza).

Funciile proteinelor membranare

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii II. Clasificarea proteinelor

III. Structura primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinelor

IV. Functii generale ale proteinelor

V. Metode de studiu ale proteinelor

VI. Insulina, mioglobina - hemoglobina, colagen, ADN si ARN

A. Detectarea proteinelor B. Determinarea structurii proteinelor C. Purificarea proteinelor D. Alte metode

A. Detectarea proteinelor
Western blot Imunoprecipitare Spectrofotometrie ELISA

Spectrofotometrie

B. Determinarea structurii proteinelor

- cristalografie
- NMR

Cristalografie

razele X descoperite in1895 rol fundamental in intelegerea structurii si simetriei unui cristal difractia cu pulberi metoda simpla si necostisitoare de identificare a mineralelor (indeosebi sub forma de granule fine) difractia cu cristal unic utila pentru determinarea simetriei

Lungimea de unda a razelor X - de acelasi ordin de marime ca si distantele interatomice (in solide, circa 0,1 nm). (razele-X) = 0,01-100 nm (~1 )

Difractia cu raze X este o metoda analitica care poate fi utilizata pentru studiul segmentelor regulate ale unor molecule (structura conformationala a proteinelor).

Cristalografie

Difractia razelor X pe o structura ordonata este un fenomen de difuzie. Pentru simplificare, Bragg considera difractia razelor X ca un fenomen de reflexie selectiva. Intensitatea maxima a radiatiei difractate se obtine cind unghiul de incidenta este egal cu cel de reflexie.

Difractia cu raze X
2d sin = n
ecuaia Bragg
BC + BD = n BC = BD = AB sin AB = d

2d sin = n
A C

D B

Condiia maximului de interferen se realizeaz pentru cazul n care diferena de drum a celor dou raze este un multiplu ntreg al lungimii de und, adic BC + BD = n.

difractograma

We have discovered the secret of life

2003 / 1953

Difractia cu raze X
- metoda cu pulberi -

Preparatul este pulverizat sub forma de pulbere intr-un spatiu inchis (tub capilar cu pereti subtiri), astfel incit razele X (monocromatice) vor interactiona cu particulele sub toate unghiurile posibile. Fasciculele de raze X vor fi difractate de acele cristale ale caror plane sunt intimplator orientate sub un unghi de incidenta care satisface ecuatia Bragg.

Difractia cu raze X
- metoda cu cristal turnant -

Cristalul este rotit usor, si doar pentru anumite unghiuri se obtin maxime de difractie, care vor fi inregistrate pe filmul fotografic. Rezolutia metodei = 5 - 6 . Imaginea de difractie, inregistrata pe film, corespunde pozitiei atomilor din reteaua cristalina.

Figura de difractie
- Fasciculul care trece nedeviat impresioneaza puternic placa fotografica (centrul figurii de difractie), - Daca atomii probei sunt dispusi neregulat, pe placa apare un halou innegrit difuz in jurul petei centrale,

- Daca atomii sunt dispusi ordonat (cristal), radiatiile reflectate interfera in functie de diferenta de faza dintre ele (constructiv sau distructiv) si vor impresiona placa fotografica sub forma de linii sau puncte. Pozitia acestora in raport cu pata centrala (fasciculul nedeviat) se numeste diagrama de difractie a razelor X si furnizeaza relatii cu privire la pozitia atomilor difractanti, lungimea legaturilor si unghiurile de legatura.

Profiluri de densitate electronica

- Deoarece radiatiile X interactioneaza cu electronii, reprezentarea structurii proteinei ca un aranjament de atomi punctiformi, dispusi intr-un sistem de coordonate (X, Y, Z) este artificiala.
- Mai aproape de realitate este reprezentarea unei distributii continue de sarcina electronica, cu inaltimea proportionala cu numarul atomic Z (deci cu nr. de electroni). Acesta este un profil de densitate electronica. Pozitiile atomilor individuali corespund maximelor.

Limitele tehnicii de difractie cu raze X

- Se obtin informatii numai cu privire la zonele ordonate ale proteinei (care uneori reprezinta o parte redusa din structura sau nu contin situsurile functionale). - Intr-un cristal proteic deshidratat (uscat) proteina tinde sa adopte o structura dezordonata. De aceea se obtin in prezent cristale umede. - Structura unei proteine membranare (mediu hidrofob) poate fi diferita de cea obtinuta dupa purificare si cristalizare in prezenta apei. - Diagrama de difractie a razelor X duce la reprezentarea unei imagini statice a structurii proteinei. Aceasta isi modifica insa conformatia cu o frecventa de 1012 - 1015 ori pe secunda. De aceea se foloseste in prezent inregistrarea spectrelor RMN pentru obtinerea unei imagini in dinamica a structurii proteinei.

Etapele de studiu ale unei proteine: a) difractograma (raze X) b) harta densitatii electronice (computer) c) modelul conformational al structurii proteinei

Aranjare tetraedrica a atomilor de carbon; leg. cov.

Aranjare hexagonala a atomilor de carbon

C. Purificarea proteinelor
- Metode cromatografice
- Metode electroforetice
- Electrofocusarea

Cromatografie

Electroforeza

Electrofocusare

D. Alte metode
- marcarea cu radioizotopi - marcarea cu markeri
fluorescenti

- utilizarea de markeri
metabolici

Utilizarea de markeri fluorescenti

I. Caracteristici particulare ale macromoleculelor din structurile vii II. Clasificarea proteinelor

III. Structura primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinelor

IV. Functii generale ale proteinelor

V. Metode de studiu ale proteinelor

VI. Insulina, mioglobina - hemoglobina, colagen, ADN si ARN

Insulina

INSULINA - 51 acizi aminati (lantul A = 21 aa, lantul B = 30 aa)

1. struct. primara

Lantul A

7 a.a. terminali indispensabili functionarii ca hormon

Lantul B

2. struct. secundara

Diferen. intre ins. umana si cea de la o serie de specii animale

Mioglobina si Hemoglobina

- analogie structurala si functionala = capacitatea de a fixa reversibil O2 - Hb 4 lanturi tertiare: 2 lanturi (141 a.a.) si 2 lanturi (146 a.a.) - fiecare lant are fixat un grup heminic prin leg. necov.

MIOGLOBINA

HEMOGLOBINA lantul

Colagenul

-1/3 din proteinele totale

- nu se poate etira
- tripla elice = tropocolagen

ADN-ul si ARN-ul (acizi nucleici)

< de 36

10 nucleotizi

Spirala se stabilizeaza prin legaturi de hidrogen ARN mesager, de transfer, ribozomal