Universitatea POLITEHNICA din Bucureti Facultatea de Chimie Aplicat i tiina Materialelor

C Catedra d d de tiin ii a i Ingineria i i Materialelor i l l Oxidice O idi i Nanomateriale i l

BIOMATERIALE
Curs 2 - continuare

INTERACIUNEA CU MEDIUL FIZIOLOGIC

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
Testarea presupune ntotdeauna existena mai multor variabile care depind de condiiile experimentale, numrul acestora crescnd cu ct este mai complex sistemul (organismul uman n comparaie cu o cultur de celule). celule)
Se utilizeaz metode statistice, pentru a:
o o determina numrul de teste necesare; prelucra rezultatele.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
Testarea biomaterialelor poate s nu fie relevant:
n ceea ce privete comportamentul dispozitivului realizat din acesta, n mediul de implantare; avnd n vedere timpul limitat n care se realizeaz, n comparaie cu durata de via a unui implant, care se poate msura n zeci de ani.

mai ieftin i mai uor de realizat.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
Clasificare:
In-vitro: n condiii de laborator, n general pe culturi de celule;
o o relativ uor de realizat, limiteaz utilizarea animalelor n astfel de experimente; p ; pot s apar diferene fa de comportarea n mediul fiziologic, mult mai complex. trebuie utilizate animale care s fie similare cu omul, i totui este posibil ca datele obinute s nu fie valabile alabile pentru pent acesta; acesta se cere minimizarea utilizrii animalelor n experimente, asigurndu-ne c rezultatele ob binute i t sunt t relevante l t i ob binute i t n condi diii de d tratament adecvat al subiecilor.

In-vivo: In vivo: testarea pe animale;

o

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
Evaluarea siguranei lansrii pe pia a oricrui dispozitiv medical const n decelarea efectelor adverse rezultate n urma utilizrii lui normale, nu greite. Testarea T t preclinic li i a poten t ialului i l l i toxic t i al l biomaterialelor componente minimalizeaz efectele neateptate. teptate

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
n prezent exist teste biocompatibilitate stabilite de: de

ISO (International Organization for Standardization) FDA (Food & Drug Administration) care permit predicii privind modul n care un biomaterial va reaciona la contactul cu un esut viu.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
ISO a publicat un ghid ISO al biocompatibilitii (Biocompatibility Testing Matrix), care cuprinde diferite teste n funcie de:
tipul ti l de d contact t t biomaterial-om; bi t i l durata contactului; utilizarea clinic.

Pentru o anumit categorie de dispozitive se recomand un numr de teste de biocompatibilitate.

Majoritatea testelor trebuiesc realizate n condiii de laborator controlate, controlate conform GLP (Good Laboratory Practices).

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
n Europa, pn recent, diferitele ri aveau reglementri proprii privind fabricarea i comercializarea co e c a a ea d dispozitivelor spo e o pe pentru uu uz u uman. a Din ianuarie 1995, aceste dispozitive sunt comercializate n Uniunea European conform reglementrilor EU Medical Devices Directive 93/42/EEC, care specific cerinele evalurii biocompatibilitii. (http://eur (http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:3 1993L0042:EN:HTML). n prezent, prezent evalurile de biocompatibilitate ale dispozitivelor medicale se realizeaz conform recomandrilor standardului ISO 10993-1/EN 30993 1. 30993-1

Lista prilor ISO 10993

Parte 1. 2. 3. 4. 5 5. Titlu Evaluare i testare Cerine de ntreinere a animalelor Teste de genotoxicitate, carcinogenicitate i toxicitate reproductiv Selectarea testelor pentru interacia cu sngele Teste de citotoxicitate metode in vitro Teste pentru efectele locale dup implantare Reziduurile sterilizrii cu oxid de etilen Investigarea clinic a dispozitivelor medicale Degradarea g ada a materialelor a a o pentru p u testarea biologic Parte 10. 11. 12. 13. 14 14. Titlu Teste pentru iritare i sensibilitate Teste pentru toxicitatea sistemic Prepararea probei i materiale de referin Identificarea i dozarea cantitativ a produilor de degradare din polimeri Identificarea i dozarea cantitativ a produilor de degradare din ceramice Identificarea i dozarea cantitativ a produilor de degradare din metale i aliaje Schema studiului toxico-cinetic al produilor de degradare eliberai Reziduri R id i d de glutaraldehid l t ld hid i formaldehid n dispozitive medicale sterilizate industrial

6. 7. 8. 9 9.

15. 16. 17.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
Protocolul evalurii biologice a unui dispozitiv medical depinde de:
natura materialelor utilizate la construcia lui; ; natura contactului cu organismul uman; durata contactului cu organismul uman.

Clasificarea dispozitivelor utilizate n scopuri medicale, n funcie de natura contactului cu organismul

CATEGORII DE DISPOZITIVE Piele Superficiale Membrane mucoase Suprafee cu l i i/ compromise leziuni/ i Indirect, sangvin Comunicare C i extern flux EXEMPLE electrozi, proteze externe, benzi de fixare, bandaje de comprimare, monitoare lentile de contact, catetere urinare, dispozitive intravaginale i intraintestinale, tuburi endotraheale, bronhoscop, proteze dentare, dispozitive ortodontice dispozitive de vindecare sau bandajare, pansamente ocluzive l i garnituri de transfer sau extensie, administrare de snge, soluii, etc. utilizate n

Comunicare C i esuturi, os, dentin Flux sanguin

laparoscoape, artroscoape, l t sisteme i t d drenare, de d cimenturi i t i dentare, materiale de umplutur dentare, capse piele catetere intravasculare, electrozi pacemaker temporari, tuburi i acceso tubu accesorii pe pentru t u oxigenatoare o ge atoa e i d dializ a cuie i plci ortopedice, implanturi subperiostal i de sn, nlocuire de articulaii i tendoane, proteze osoase, cimenturi i dispozitive intraosoase i de eliberare de medicamente senzori i stimulatori neuromusculari, medicamente, neuromusculari laringe artificial, cleme de legare electrozi pacemaker, fistule arteriovenoase artificiale, valve cardiace, , g grefe vasculare, , catetere interne de eliberare medicamente, dispozitive de asisten ventricular

Dispozitive implant esut/os / Implanturi Snge

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Generaliti
n funcie de durata contactului organismul deosebim dispozitive cu contact:
limitat (<24 ore) - A; prelungit (24 ore - 30 zile) - B; permanent (>30 zile) - C. C

cu un

Un dispozitiv destinat unui contact superficial, o perioad limitat de timp, nu este necesar s p acelorlai cerine n ceea ce p privete rspund biocompatbilitatea, ca un implant obinut din acelai material i folosit permanent.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Matrice de testare a biomaterialelor
Toxicitate cronic Carcinogen nicitate Hemocompatibili ate ta Genotoxicitate Citotoxic citate Sensibilitate Implant tare

Toxicitate mic sistem

Toxicitate ut subacu

CATEGORII DE DISPOZITIVE

Durata contactului

Iritaii

A Piele B C A Superficiale Membrane mucoase B C Suprafee cu leziuni/ compromise A B C

Teste ISO Teste FDA

 Teste ISO

Teste FDA

Matrice de testare a biomaterialelor

Toxici itate cronic c Carcinogenicitat te Geno otoxixicitat te Hem mocompatibilitate Cito otoxicitate Sensibilitate Im mplantare To oxicitate sistemic oxicitate To subacut

CATEGORII DE DISPOZITIVE

Durata D contactului

Iritaii

Indirect, g sangvin

flux

B C

Comunicare extern

Comunicare esuturi, , os, , dentin

A B C A

Flux sanguin

B C A

Dispozitive Di iti implant esut/os Implanturi Snge

B C A B C

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Pregtirea probelor
Proba de testat trebuie s reprezinte un specimen reprezentativ pentru dispozitivul produs n cantiti industriale. industriale
Ea trebuie s fie finisat sau tratat (acoperit sau sterilizat) n acelai mod ca i dispozitivul comerciabil.

Deoarece potenialul toxic al materialelor i dispozitivelor depinde de gradul de eliberare a unor componente solubile, toxice, sunt testate uzual extracte din p proba de analizat. Totui unele teste necesit o evaluare n condiiile normale de folosire a dispozitivului, dispozitivului i atunci se testeaz direct citotoxicitatea unei piese din acesta.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Pregtirea probelor
n cazul solubilizrii unor componente din dispozitiv se utilizeaz o serie de soluii cu o polaritate descresctoare pentru a asigura o extracie corespunztoare a compuilor cu diferite solubilit i. Cele mai comune medii de extracie utilizate sunt:
ser fiziologic; fi i l i ulei vegetal; dimetilsulfoxid; ; etanol; mediul de cultur al celulelor - pentru testarea citotoxicitii in vitro.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Pregtirea probelor
Temperatura de extracie este un factor important n evaluarea citotoxicitii unor materiale.
Unii compui solubilizai din prob sunt alterai chimic la temperaturi nalte, nalte motiv pentru care se recomand ca extracia s fie realizat la 37C (temperatura corpului), timp de 72 ore. Pentru testele de citotoxicitate in vitro se recomand extracia la 37C timp de 24 ore, deoarece unii constitueni din mediu sunt relativ labili.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Culturi de celule
Cultura de celule (sau de esut) i are originile n secolul al XIX-lea, cnd oamenii au nceput s examineze n detaliu esuturile i organele din organism n recipiente de sticl. Termenul in vitro nseamn literal n sticl, dei n prezent majoritatea culturilor celulare se realizeaz n sau pe plastic. Prima ncercare, ncununat de succes, de a cultiva celule izolate din organismul vertebratelor a fost realizat n anul 1907 de ctre Ross Harrison, care era interesat n diferenierea neuronilor.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Culturi de celule
n prezent, culturile celulare reuesc s reproduc condiiile existente in-vivo, pentru a permite celulelor normale (netumorale) s creasc n cultur.
I Ini iial, i l celulele l l l prelevate/izolate l t /i l t din di orice i ti de tip d esut, de la diferite organisme, au fost cultivate n laborator pentru studii de morfologie i fiziologie. Ulterior, culturile celulare au progresat de la examinarea celulelor izolate care mor dup un numr limitat de diviziuni (culturi primare), ) la cultura de lung durat (linii celulare), ale cror celule supravieuiesc un numr mare de generaii, datorit unui proces de transformare spontan sau indus.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Culturi de celule
Astfel, culturile celulare se preteaz foarte bine pentru studiile de dezvoltare i df diferen iere, dar d i liniile l l celulare, l l care pstreaz capacitatea de a se diferenia, in vitro, sunt utilizate pentru evaluarea interaciei implant mediu fiziologic.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Culturi de celule
Odat separate din esut, exist 2 modaliti de baz prin care celulele pot fi cultivate:
ntr-o cultur de mas, cnd n recipientul de cultur celulele sunt nsmnate la o concentraie mare i formeaz un monostrat de celule relativ uniform dup cteva generaii;

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Culturi de celule
Odat separate din esut, exist 2 modaliti de baz prin care celulele pot fi cultivate:
ntr-o cultur clonal, cnd un numr relativ mic de celule (diluie mare) este adugat n recipientul de cultur, fapt care permite fixarea pe substrat la o anumit distan.
o proliferarea celulelor determin formarea de colonii individuale d d l sau clone l celulare, l l ai cror membri b sunt derivai din aceeai celul iniial.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Culturi de celule
n prezent, lista celulelor crescute n cultur este extrem de larg i include:
elemente ale esuturilor conjunctive (fibroblaste, osteoblaste, condrocite); celule musculare; celule epiteliale (de la nivelul ficatului, plmnului, pielii, snului, rinichiului); celule nervoase, etc.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in - vitro
Presupune evaluarea biomaterialelor prin metode care utilizeaz culturi de celule, , pentru a msura citotoxicitatea i compatibilitatea biologic a unui material. Citotoxicitatea identific efectele toxice la nivelul celulelor:
moartea celulelor; alterarea lt permeabilit bilitii membranei b i celulare; l l inhibiia enzimatic, etc.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste
Pentru studiile in vitro de caracterizare a biocompatibilitii materialelor se pot folosi culturi de osteoblaste, obinute:
din explante de os; din celule stem mezenchimale.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste
Citomorfologia osteoblastelor n cultur se testeaz n prezena i absena materialelor, prin:
microscopie n contrast de faz;
o pe tot parcursul realizrii experimentului;

microscopie de fluorescen;
o la sfritul perioadei de meninere n cultur a celulelor de regul 48-72 ore; o pentru vizualizarea celulelor n fluorescen cultura va fi tratat cu hipericin, care ptrunde n celule i le marcheaz fluorescent.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste
Estimarea numrului de celule viabile se realizeaz prin testul cu Albastru tripan.
albastru tripan este un colorant care permite identificarea celulelor moarte, n care ptrunde datorit deteriorrii structurii i permeabilitii membranei; celulele moarte - colorate n albastru se deosebesc d cele de l vii ii - incolore; i l numrarea se realizeaz cu ajutorul unui hemocitometru = lam de sticl mai g groas, n care este practicat o fant; n fant este plasat un volum mic din suspensia celular de evaluat.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste

Hemocitometru

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste
Etape de lucru:
se introduce proba de material n placa Petri i se sterilizeaz (8-10 ore) cu ajutorul lmpii cu ultraviolete, pe ambele suprafee alternativ; se sterilizeaz proba prin cufundare n soluie PBS (Phosphate Buffer Saline) steril (2-4 ore); se nsmneaz 100.000 celule/plac Petri, in l si n proba inclusiv p oba control ont ol (plac (pla Petri Pet i care a e nu n conine proba de material); se incubeaz culturile n atmosfer cu 5% CO2, la 37oC; dup 18-20 ore se vizualizeaz celulele la microscopul cu inversie i se fac poze n VIS (vizibil) cu o camer foto digital.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste
Etape de lucru:
culturile se incubeaz (n atmosfer cu 5% CO2, la 37oC) cu hipericin (1-2 ore) care ptrunde n celule i le marcheaz fluorescent; se ndeprteaz mediul care conine hipericin (pentru reducerea ecranrii semnalului de la celule datorat difuziei colorantului n mediu) i se adaug EMEM (Eagle (Eagle's s Minimal Essential Medium) proaspt; se vizualizeaz la microscopul cu inversie i se fac poze n VIS i UV (ultraviolet); se ndeprteaz probele i se spal celulele de 2 ori cu soluie PBS.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste
Etape de lucru:
se trateaz celulele cu soluie MTT [bromur de 3(4,5dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazoliu] i se incubeaz n atmosfer cu 5% CO2, la 37oC (2-4 ore); ); se ndeprteaz soluia MTT i se solubilizeaz formazanul obinut (culoare albastru-nchis) cu o soluie de izopropanol (15-20 minute); se citete densitatea optic a formazanului solubilizat la 595nm cu ajutorul unui spectrofotometru, obinndu-se o funcie absorban concentraie colorant numr de celule active metabolic din cultur.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste

Micrografie n contrast de faz a fibroblastelor CCD-1070Sk din control (obiective A-10x; B-20x; C-40x).

II

III

Micrografie n contrast de faz a fibroblastelor CCD-1070Sk din plcile Petri cu probele: I; II; III (obiectiv 10x).

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste

Micrografie n fluorescen a fibroblastelor CCD-1070Sk de pe suportul II (obiective A-20x; B-40x).

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro pe osteoblaste

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro n SBF
Pentru analiza comportamentului n mediul fiziologic g a materialelor, , p probe p pulverulente sau sub form de corp solid sunt imersate n SBF (simulated body fluid) i sunt meninute l 370C, la C urmnd d a fi extrase t i studiate t di t dup d diferite perioade de timp: 6 zile, 14 zile, 21 zile i 28 zile. zile Probele extrase sunt analizate prin microscopie electronic i difracie de raze X, X n vederea detectrii modificrilor compoziionale i microstructurale care apar.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro n SBF
Valorile concentraiei de ioni din SBF i plasma uman

Ioni

Concentraia ionilor [mmoli/l] SBF Plasm uman 142 103 27 5 15 1,5 2,5 1,0 0,5 142 126 27 5 15 1,5 2,5 1,0 0,5

Na+ ClHCO3K+ Mg2+ Ca2+ HPO42SO42-

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro n SBF
Materiile prime utilizate pentru obinerea SBF sunt: NaCl, Na2CO3, KCl, (NH4)H2PO4, MgCl26H2O, CaCl22H2O, Na2SO4. Materiile prime se adaug n ordinea prezentat t t, ntr-o t solu l ie i tampon, t ob binut i t prin dizolvarea TRIZMA (tri hidroximetil aminometan) n ap deionizat. Dup dizolvarea tuturor materiilor prime, dac este necesar, se regleaz pH pH-ul ul cu HCl, pentru a fi meninut n intervalul 7,2 7,4.

 Testarea in vitro n SBF

2500

Studii in vitro n SBF

70S - 28 zile SBF

CaSiO3 27-0088 HAp 46-0905 Ca3(PO4)2 01-0941 CaCO3 70-0095 NaCl 78-0751

2000

70S - 21 zile SBF

1500

70S - 14 zile SBF

1000

70S - 6 zile SBF

500

70S - iniial

0 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Spectre de difracie de raze X pentru o prob de biosticl, tratat termic la 1000OC / 2h, nainte i dup imersarea 6, 14, 21 i 28 zile n SBF

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro n SBF

Iniial

6 zile

14 zile

21 zile

28 zile

Micrografii de MEB pentru o prob de biosticl, nainte i dup imersarea timp de 6, 14, 21 i 28 zile n SBF

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vivo
Evaluarea comportamentului materialelor la implantarea in-vivo, pe animale, este necesar pentru determinarea urmtoarelor interaciuni biologice:
I Interac t iunea i dif it l tipuri diferitelor ti i de d celule l l cu implantul, i l t l sau unele cu celelalte; Aciunea factorilor endocrini sau p paracrini celulari; ; Interaciunea celulelor cu molecule solubile sau componente extracelulare insolubile ale matricei, care pot fi alterate de prezena implantului; Interaciunea cu celule, proteine, molecule din snge.

3. Evaluarea interaciunii implant p mediu fiziologic g

Testarea in vitro n SBF
Evaluarea bicompatibilitii presupune:
Determinarea compatibilitii material esut;
o o o o

rspunsul de vindecare a esutului, n faz acut; reacia de inflamaie cronic; remodelarea esutului, n faza de adaptare la implant; efectul local i sistemic al implantului.

Determinarea eficacitii dispozitivului, avnd n vedere funcia creia i este destinat. destinat