Universitatea Politehnica București

Testarea biocompatibilității

Curs 6
Prof. Dr. Ing. Habil Iulian ANTONIAC
 Testarea proprietăților biologice
Conform principiilor generale enunţate, se convine să se aplice următoarele
principii metodelor de evaluare biologică a dispozitivelor medicale:
 a) testele trebuiesc efectuate pe produsul finit sau eşantioane reprezentative ale
produsului finit sau ale materialelor;
 b) alegerea metodelor de testare trebuie să ţină seama de:
 natura, gradul, durata, frecvenţa şi condiţiile de expunere sau de contact cu
suprafeţele corpului uman cu dispozitivele în utilizarea normală prevăzută;
 natura fizică şi chimică a produsului finit;
 potenţialul toxic al componentilor chimici în formula produsului finit;
 faptul că anumite teste (de exemplu cele destinate să estimeze efectele sistemice)
pot să nu fie aplicabile în absenţa substantelor extractibile, sau atunci când aceste
substanţe extractibile au un caracter toxic cunoscut şi acceptat;
 relaţia dintre suprafaţa dispozitivului şi talia corpului celui căruia îi este aplicată;
 informaţia existentă bazată pe literatura, experienţa şi testările preclinice;
 protecţia omului ca prim scop al acestui document; al doilea scop fiind legat de
protecţia animalelor de experienţă, reducerea numărului şi expunerii ale animalelor.
Testarea proprietăților biologice

 a) Dacă se pregatesc extracte din dispozitive, se convine ca

solvenţii şi condiţiile de extracţie utilizate să fie corespunzătoare
naturii şi utilizării produsului finit;

 b) pregatirea martorilor pozitivi şi negativi atunci când sunt

necesari.

 Dat fiind că nici un rezultat nu poate asigura contrarul unui

potenţial de risc biologic, se convine ca, în investigaţiile
biologice efectuate, să fie observate cu atenţie, reacţiile adverse
neaşteptate sau incidente, constatate la pacientul uman, în
timpul utilizării clinice a dispozitivului.
Metode de testare a caracteristicilor de biocompatibilitate

Procedeele experimentale recomandate, având ca

scop evaluarea biocompatibilităţii unui material,
ţin cont de tendinţa lui degradare, de interacţiunea
lui cu mediul înconjurator în condiţiile reale de
expunere care duc la deteriorarea celor două
componente.
Metode de testare a caracteristicilor de biocompatibilitate

 Din păcate, măsurătorile experimentale sunt limitate pentru că,

deşi există metode puternice pentru examinări in vitro,
realizarea condiţiilor modelului de experimentare in vitro, astfel
încât să fie cât mai aproape de condiţiile in vivo reale este foarte
greu şi uneori chiar imposibil datorită compoziţiei extrem de
complexe a mediului real. Substanţele prezente în concentraţii
foarte mici joacă un rol important în comportarea degradării
biomaterialului metalic. Acest lucru se aplică următoarelor
specii :

 speciilor care formează complecşi puternici cu ionii metalici;

 speciilor care influenţează proprietăţile redox ale sistemului;
 speciilor care modifică comportarea la frecare şi uzură.
Metode de testare a caracteristicilor de biocompatibilitate

Analizarea tendinţei de degradare a biomaterialelor

metalice ar trebui să conţină următoarele etape de
examinare, care sunt caracterizate de o scădere a
cantităţii de materiale utilizate:
analizarea coroziunii in vitro şi a uzurii într-un mediu
anorganic;
analizarea coroziunii in vitro şi a uzurii într-un mediu mixt
organic-anorganic;
analizarea folosind culturi de celule şi de organe;
analizarea in vivo bazată pe implantare în organisme
animale.
Metode de testare a caracteristicilor de biocompatibilitate
 În timpul ultimilor ani multe activităţi au avut ca scop combinarea
avantajelor metodelor de măsurare electrochimică în timp real,
concomitent cu observaţiile biologice celulare (Schade şi Liefeith,
1995).

 Prin urmare, Liefeith (1994) şi Hildebrand (1995) au dezvoltat un sistem

de măsurare cu ajutorul cărora testele de coroziune in vitro pot fi
efectuate în electroliţi biologici. O extensie a acestui sistem ca un
bioreactor oferă informaţii despre adeziunea celulelor folosind
microscopie fluorescentă.

 Cu ajutorul spectroscopiei fluorescente induse de laser, este posibil să se

evalueze condiţiile fiziologice ale organismelor testate.
Laborator biologie celulară
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR
(A). Teste de evaluare iniţială
1. Citotoxicitate
 Prin utilizarea tehnicilor de cultură celulară, aceste teste
determină liza (moartea) celulară, inhibiţia creşterii
celulare şi alte efecte asupra celulelor provocate de
dispozitivele, materialele şi/sau extractele lor.

2. Sensibilizare
 Aceste teste evalueaza pe un model corespunzător,
probabilitatea sensibilizării la contactul cu materialele,
dispozitivele şi/sau extractele lor. Aceste teste sunt
adecvate, căci o expunere sau un contact chiar şi în
cantităţi minime de substanţă potenţial extractibilă, poate
să conducă la reacţii de sensibilizare sau alergie.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(A). Teste de evaluare iniţială

3. Potenţial iritant
 Aceste teste evaluează potenţialul iritant al dispozitivelor,
materialelor şi/sau extractele lor, utilizând zone
corespunzătoare sau ţesuturi de implantare ca pielea, ochiul
şi mucoasele, pe un model adecvat.

 Testul (testele) realizat(e) trebuie să adapteze zona de

aplicare (piele, ochi, mucoasă) şi durata expunerii cu
scopul de a determină efectele iritante ale dispozitivelor,
materialelor şi substanţelor potenţial extractibile.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR
(A). Teste de evaluare iniţială
4. Reactivitate intracutanată
 Aceste teste evaluează reacţia locală a ţesutului la extracte cu dispozitiv. Ele
sunt aplicabile atunci când determinarea potenţialului iritant prin testări
cutanate sau pe mucoase sunt neadecvate (de exemplu, pentru dispozitivele cu
acces la circuitul sanguin). De asemenea, aceste teste pot fi utile atunci când
substanţele extractibile sunt hidrofobe.
5. Toxicitate sistemică (acută)
 Aceste teste evaluează pe un model animal potenţialele efecte dăunătoare
datorate expunerii unice sau multiple, într-un timp mai mic de 24 h, a
dispozitivelor, materialelor şi/sau al extractelor lor. Ele sunt adecvate atunci
când contactul antrenează o absorbţie posibilă de substanţă extractibila toxică şi
produsele de degradare. Testele de pirogeniticitate sunt incluse pentru a detecta
pirogeniticitatea extractelor, dispozitivelor sau materialelor. O singură testare
nu poate diferenţia pirogeniticitatea indusă de către material, datorită
contaminării cu endotoxine.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(A). Teste de evaluare iniţială

6. Toxicitate subcronică (subacută)

 Aceste teste determină efectele unei expuneri simple sau multiple
a dispozitivelor, materialelor şi/sau extractelor lor pe o perioadă de
timp de cel puţin 24 h, la cel mult 10% din durata de viaţă a
animalului de experienţă (de exemplu, până la 90 zile).

7. Genotoxicitate
 Aceste teste utilizează culturi de celule de mamifere sau
nemamifere, sau altfel de tehnici pentru a deternima mutaţiile
genetice, modificări ale numărului şi structurii cromozomiale
precum şi alte efecte toxice asupra ADN-ului sau genelor,
provocate de către dispozitivele, materialelor şi/sau extractele lor.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(A). Teste de evaluare iniţială

8. Implantare
 Aceste teste evaluează efectele patologice locale asupra
ţesuturilor vii, atât la nivel macroscopic cât şi
microscopic, ale unui eşantion de material sau produs finit
plasat sau implantat într-o zonă de implantare sau un ţesut
corespunzător pentru aplicaţia prevazută. Se convine ca
aceste teste să fie adaptate zonei şi duratei de implantare.
Pentru un material, aceste teste sunt echivalente celor de
toxicitate subacută, dacă se studiază şi efectele sistemice.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(A). Teste de evaluare iniţială

9. Hemocompatibilitate
 Aceste teste evaluează, pe un model sau sistem
corespunzător, efectele dispozitivelor sau materialelor în
contact cu sângele, asupra sângelui sau componentelor
sanguine. Testele specifice de hemocompatibilitate pot fi,
de asemenea, imaginate pentru a simula geometria,
condiţiile de contact şi dinamica fluidelor, în dispozitivul
sau materialul supus aplicaţiilor clinice. Testele de
hemoliză determină gradul de liză a globulelor roşii şi
eliberarea hemoglobinei provocată de către dispozitiv,
materiale şi/sau extractele lor in vitro.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(B). Teste de evaluare complementară

1. TOXICITATE CRONICĂ
 Aceste teste determină efectele unei sau mai multor expuneri
ale dispozitivelor, materialelor şi/sau extractelor lor pe durata
unei perioade de cel puţin 10% din durata de viaţă a
animalului de experienţă (de exemplu, peste 90 de zile pentru
şobolan). Se convine ca aceste teste să fie adaptate zonei de
aplicare şi duratei de expunere.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR
(B). Teste de evaluare complementară

2. CARCINOGENITATE
 Aceste teste determină potenţialul onconogen al dispozitivelor, materialelor
şi/sau extractele lor, în urma unei sau mai multor expuneri sau contacte pe o
perioadă de timp acoperind toată viaţa animalului supus testării. Aceste teste
pot fi concepute în scopul examinării toxicităţii cronice şi caracterului
oncogen în cursul unui experiment. Testele de carginogenitate nu sunt în
general efectuate decât dacă există rezultate care converg şi care provin din
alte surse. Se convine ca aceste teste să fie adaptate zonei de aplicare şi
duratei de expunere.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(B). Teste de evaluare complementară

3.TOXICITATEA ASUPRA REPRODUCERII ŞI DEZVOLTĂRII (CREŞTERII)

 Aceste teste evaluează efectele potenţiale ale dispozitivelor, materialelor
şi/sau extractele lor asupra funcţiei de reproducere, dezvoltării embrionare
(teratogenitate) şi dezvoltarea prenatală şi postnatală precoce. Testele de
toxicitate sau testele biologice asupra reproducerii şi creşterii nu sunt în
general efectuate decât în cazul unde dispozitivul are o posibilitate de impact
asupra capacităţii de reproducere a subiectului. Trebuie să se ţină seama de
locul de aplicare a dispozitivului.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

(B). Teste de evaluare complementară

4. BIODEGRADARE
 Atunci când există posibilitatea de degradare şi/sau resorbţie, aceste
teste pot pune în evidenţă procesele de absorbţie, distribuţie,
biotransformare şi eliminare a substanţelor extractibile şi produsele de
degradare a dispozitivelor, materialelor şi/sau extractelor lor.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

Medii de testare utilizate pentru simularea mediului uman

 Medii anorganice
 soluţia fiziologică Ringer este adesea folosită în versiunea acidă (pH
mai mic de 2,5 prin adăugarea de HCl) pentru a simula scăderea pH-
ului cauzată de procesele inflamatorii.
 soluţie salină echilibrată Hanks, pH 7,4 (Hanks şi Wallace, 1949):
○ 0,185 g l-1 CaCl2
○ 0,40 g l-1 KCl
○ 0,06 g l-1 KH2PO4
○ 0,10 g l-1 MgCl26H2O
○ 0,10 g l-1 MgSO47H2O
○ 8,00 g l-1 NaCl
○ 0,35 g l-1 NaHCO3
○ 0,48 g l-1 Na2HPO4
○ 1,00 g l-1 D-glucoza
 o soluţie similară cu concetraţii reduse de ioni Ca şi HPO a fost
propusă de asemenea de Hanawa şi Ota (1991).
 
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

Medii de testare utilizate pentru simularea mediului uman

 Medii anorganice

Cercetările folosind medii de testare pur anorganice reprezintă cele

mai simple teste şi ajută cel puţin la înţelegerea
comportamentului degradării a biomaterialelor metalice. Totuşi,
poate fi făcută o evaluare preliminară cu privire la rezistenţa la
coroziune pitting, urmată de o selecţie a materialelor.

 Mediile anorganice uzuale sunt următoarele:

 soluţie izotonică de NaCl: 9 g l-1 NaCl;
 soluţie fiziologică Ringer, pH 6,7 (Roche, 1993):
○ 8,00 g l-1 NaCl
○ 0,20 g l-1 CaCl2
○ 0,20 g l-1 KCl
○ 1,00 g l-1 NaHCO3
 
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

Medii anorganice-organice

○ Salivă artificială (Elagli, 1993);

○ Ser bovin (Browne şi Gregson, 1994; Good, 1996);

○ Mediul Eagle modificat (MEM) (Lacy, 1996);

○ Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) (Lacy, 1996).

 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR
Linii de celule şi culturi de organe
 Cercetările pe linii de celule şi culturi de organe sunt situate la graniţa dintre
testele de degradare şi cele de biocompatibilitate. Experimentele de acest tip
reprezintă o legătura importantă între analizele clasice in vitro şi cele in vivo. S-a
ajuns la concluzia că analizele pe culturi de organe sunt mai relevante decât
analizele pe linii de celule.
 Relevanţa rezultatelor acestor tipuri de teste este puternic influenţată de tipul
liniilor de celule folosite. Liniile permanente au avantajul comparării rezultatelor
din diferite laboratoare fără nici o dificultate .
 Culturile de celule primare au avantajul proprietăţilor mult mai aproapiate de cele
ale biosistemului complet. De aceea, rezultatele sunt şi mai elocvente. Recent, a
fost observată o deschidere mai mare spre folosirea culturilor de celule primare.
Tabelul 3.3 arată o imagine sumară a acestor studii recente. Totuşi, aceste
cercetări arată câteva dezavantaje, cum ar fi acela că potenţialul redox al
biosistemului complet nu este acelaşi cu cel din culturi.
 Evaluările experimentelor pe linii celulare pot fi făcute în moduri diferite. În timp
ce în anumite cazuri sunt analizate doar forma şi adeziunea celulelor, în alte
cazuri se studiază şi comportamentul de proliferare şi modificare a structurii
organelor, dar şi evaluarea sintezei proteinelor.
 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR

Vedere generala a liniilor de celule permanente folosite frecvent

Culturi de celule
Caracteristici
permanente

MG 63 Asemănătoare celulelor osteoblastice umane (Martin, 1995)

Balb/c 3T3 Celule fibroblaste (Wataha, 1993; Richards, 1995; Grant 1996)

MOLT 4 Asemănătoare celulelor fibroblaste umane (Berstein, 1992)

X3T3 F10 Keratinocite (Lacy, 1996)

 TESTAREA BIOLOGICĂ A
BIOMATERIALELOR
Vedere generală a liniilor de celule primare folosite
frecvent

Culturi de celule primare Aplicare

Celule umane de măduvă osoasă
Celule umane derivate din os
Celule umane fibroblaste gingivale
Celule osteoblaste din partea de sus a
de proteine pe Ti6Al4V, hidroxiapatită şi polistiren
craniului de şobolan
Răspunsul la produşii de coroziune Co-Cr
Fixare şi adeziune
Fixarea iniţială a celulelor pe diferite materiale
Structura şi chimia suprafeţelor de titan
Topografia suprafeţei de titan
Efecte comparative ale Ninitolului, Ni şi Ti
Răspunsul la diferiţi cationi metalici
Expresia genelor pentru fenotipul celular indus
Caracterizarea suprafetelor implanturilor de titan

Celule epiteliale gingivale de şobolan Efectele procedurii de scalare pe titan

Distrugerea celulelor cauzată de contactul direct
Celule fibroblaste de şobolan
cu aliaje
Interacţiunea cu titanul
Celule de măduva osoasă de şobolan
Potenţialul osteogenic al acoperirilor Ca/P