– EVALUAREA TOXICOLOGICĂ

A MEDICAMENTULUI –

CURS NR. 4 - FARMACIE

 Evaluarea unui nou medicament este un proces laborios ,

îndelungat şi costisitor, ce implică:

1. Evaluarea calităţii

2. Evaluarea securităţii utilizării – interesează toxicologia

3. Evaluarea eficacităţii

Se estimează că doar una din 1000 de substanţe investigate ajunge

să fie utilizată ca medicament.

Înainte de începerea studiilor, se efectuează o documentare
asupra substanţei privind:
identitatea;
structura chimică;
proprietăţile fizico-chimice;
rezultate ale unor teste prealabile in vitro sau in vivo;
date toxicologice despre substanţe care se aseamănă
structural;
presupusa utilizare a substanţei.
Studiile întreprinse pot fi grupate în 3 etape:

etapa preclinică – implică:

studiul farmaceutic – studiul analitic al substanţei-test şi

obţinerea unei forme farmaceutice;

cercetarea toxicologică şi farmacologică pe animale

de laborator

etapa clinică – implică studii clinice, în vederea evaluării

raportului beneficiu / risc

etapa administrativă – implică înregistrarea medicamentului şi

obţinerea autorizaţiei de punere pe piaţă
 CERCETAREA TOXICOLOGICĂ ŞI
FARMACOLOGICĂ PE ANIMALE DE
Implică: LABORATOR
studii de toxicologie – pentru evaluarea securităţii substanţei-
test
scopuri:
identificarea structurilor şi funcţiilor fiziologice
afectate de substanţă;
oprirea în aceasta fază a substanţelor care nu
prezintă securitate pentru studiile clinice

studii de farmacocinetică şi farmacodinamie – pentru evaluarea

eficacităţii
 STUDIILE DE TOXICITATE

A. Studii de toxicitate convenţională:

● toxicitatea acută

● toxicitatea pe termen scurt după doze repetate

● toxicitatea subcronică

● toxicitatea cronică

B. Studii de toxicitate specială:

● mutagenitatea

● cancerogenitatea

● toxicitatea asupra funcţiei de reproducere

C. Studii de toxicitate alternativă – studii in vitro

 STUDIILE DE TOXICITATE ACUTĂ

● doză unică
● doze repetate în interval de 24 ore
Obiective:

 definirea toxicităţii substanţei şi încadrarea în clasa de

toxicitate

 identificarea ţesuturilor şi a organelor ţintă

 estimarea toxicităţii la om

 selectarea dozelor pentru cercetările toxicologice

ulterioare şi pentru studiile farmacologice
 DOZA LETALĂ

Exprimă toxicitatea acută a substanţei pătrunsă oral sau parenteral:

- doza letală 0 = doza maximă tolerată = doza care determină

efecte toxice, dar nu letale;
- doza letală 25 (DL25) = doza letală minimă = doza care
determină moartea a 25% din animalele din lotul de experienţă;
- doza letală 50 (DL50) = doza letală medie = doza unică,
determinată prin metode statistice, care determină moartea a 50% din
animalele din lotul de experienţă; se utilizează mai frecvent la
diferenţierea claselor de toxici;
- doza letală 100 (DL100) = doza letală absolută = doza care
determină moartea a 100% din animalele din lotul de experienţă.
Pentru administrarea pe cale respiratorie, se stabileşte CL50 –
concentraţia letală medie – toxicitate acută la inhalare.

Animalele folosite se aleg funcţie de:

posibilităţile de creştere pentru specia respectivă;
rapiditatea dezvoltării;
uşurinţa manipularii în timpul experimentelor;
informaţii disponibile despre specia respectivă privitoare la
toxicitate.
Toxicitatea acută se investighează:
● pe animale din cel puţin două specii de rozătoare -
şobolani, şoareci, iepuri, cobai (pentru toxicitatea cutanată se
preferă şobolani, cobai, iepuri);
● pe loturi de 20 de animale (sau 5 animale pentru acelaşi
nivel de doză) (numărul de animale/lot poate varia în funcţie
de metoda folosită, calea de administrare şi toxicitate);
● folosind cel puţin două căi de administrare – orală,
parenterală, respiratorie – o cale preconizată a fi utilizata,
cealaltă cale care să asigure o biodisponbilitate de 100% sau
cât mai apropiată de aceasta.
Selecţia animalelor:
- animale sănătoase;
- aceeaşi rasă, origine;
- aceeaşi vârstă (8 – 12 săptămâni);
- număr egal de masculi şi femele negestante (după caz
se pot utiliza doar femele, care sunt mai sensibile la acţiunea
toxică, sau numai masculi);
- aceeaşi greutate sau cu o variaţie de maxim ± 20%
(fiecare animal este cântărit înainte şi după experiment).
Înainte (5 zile, pentru aclimatizare) şi pe toată durata experimentului,
animalele sunt menţinute în condiţii standard de vivariu:
● temperatură +22oC (±3oC);
● umiditate : minim 30 % - maxim 70%;
● iluminat artificial, cu o frecvenţă de 12 ore lumină / 12 ore
întuneric;
● dietă convenţională şi apă de băut la discreţie;
● în cuşti pe grupuri de doză, în număr adecvat astfel încât să nu
deranjeze observarea fiecărui animal.

Animalele sunt marcate pentru identificare individuală.

Niveluri de doze testate (mg/kg corp):
● 0.1 – 1
● 5
● 50
● 300
● 2000
● 5000.
Se aleg 3-4 niveluri , în funcţie de valoarea DL50 ce se aşteaptă a fi obţinută.
Dacă nu se observă letalitate la 5000 mg/kg corp, nu se recomandă
determinarea DL50 ci a dozei maxime tolerate.

Pentru studiile de toxicitate orală, substanţa-test se administrează prin

gavaj, cu ajutorul sondei gastrice (după prealabilă perioadă de post). Dacă
doza nu se poate administra o dată, se împarte în fracţii mai mici ce se
administrează pe parcursul a 24 ore.
După administrare, animalele se urmăresc la intervalele (periodic):
30 minute
primele 4 ore
primele 24 ore
zilnic, timp de 7 – 14 zile.

Observarea animalelor presupune:

examen clinic – modificări la nivelul pielii, blănii, mucoaselor,
aparatului respirator, sistemului circulator, SNC, activităţii somato-
motorii, comportamentului;
● cele mai importante semne sunt: convulsii, hipersalivaţie,
diaree, letargie, somnolenţă, comă;
bilanţul mortalităţii – permite calcularea DL50 prin metode clasice sau
cu ajutorul unor programe informatice.
Animalele muribunde sau care suferă intens de durere trebuie
eutanasiate, iar la interpretarea rezultatelor se vor considera decedate
în timpul testului.

Starea muribundă – se referă la starea de a fi incapabil de a supravieţui,

chiar dacă animalul este tratat.

Moarte iminentă – se referă la starea muribundă sau când moartea este

aşteptată în următorul timp de observare (perioadă). Simptomele care
indică această stare la rozătoare sunt: convulsii, poziţia laterală, poziţia
culcat, tremor.

Moarte prevăzută – prezenţa semnelor clinice care indică moartea într-

un timp prevăzut, înainte de sfârşitul experimentului (exemplu:
incapacitatea a a ajunge la apă sau mâncare).
Substanţele-test, respectiv dozele, care posedă acţiune corozivă sau
iritantă sau care pot provoca dureri mari şi suferinţă nu se
administrează.

Animalelele decedate sunt autopsiate, iar ficatul, rinichii şi organele

care prezintă modificări macroscopice sunt supuse examenelor
histopatologice.

Unele substanţe-test pot determina o moarte întârziată (după

terminarea experimentului), ceea ce duce la erori de interpretare.
Metodele moderne evită dozele letale şi iau în calcul, ca reper final,
toxicitatea evidentă – simptome certe de toxicitate după administrarea
substanţei-test, astfel că la următorul nivel de doză apar: durere mare
sau suferinţă puternică, stare muribundă sau moartea animalelor.

Metodele moderne permit încadrarea substanţei-test pe categorii de

toxicitate, conform Sistemului Global de Clasificare a Substanţelor
Chimice şi a Amestecurilor – Globally Harmonised Classification System
for Chemical Substances and Mixtures (GHS).
STUDIILE DE TOXICITATE DUPĂ ADMINISTRARE REPETATĂ

Obiective:

 identificarea ţesuturilor şi a organelor ţintă

 determinarea relaţiei doză – răspuns, inclusiv a nivelului

NOAEL

 identificarea diferenţelor între specii

 evaluarea potenţialului toxic la administrare repetată,

respectiv a riscului

 stabilirea criteriilor de evaluare pentru testele de

toxicitate ulterioare.
Organul ţintă – organul cu sensibilitatea mai mare la acţiunea
toxicului sau organul în care toxicul se găseşte în concentraţie
mai mare.

Nivelul la care nu se observă nici un efect advers (NOAEL – No

Observed Adverse Effect Level) – cea mai mare doză de
substanţă care induce efect terapeutic, dar nu produce nici un
efect advers.
Risc – frecvenţa presupusă cu care apar efecte
nedorite, ca urmare a administrării unei
substanţe.

Potenţial de toxicitate – parametru care ţine

cont de numărul de molecule implicat în
procesele fiziopatologice.

Prag – doza sub care probabilitatea de răspuns

este egală cu zero.
Indicele terapeutic (factorul relativ de securitate) –
raportul între doza medie letală (DL50) şi doza medie eficientă
(DE50).

IT = DL50 / DE50

DE50 – cantitatea de substanţă capabilă să determine

un efect terapeutic la 50% dintre animalele folosite în
experiment.
 IT < 1 – substanţa nu poate fi folosită ca
medicament, fiind prea toxică;
 IT = 1-7 – utilizarea substanţei ca medicament
este periculoasă – risc toxic ridicat;
 IT = 7-10 – pot apare reacții adverse ce necesita
tratament specific
 IT > 10 – substanţa poate fi folosită ca
medicament
 TIPURI DE STUDII DUPĂ
ADMINISTRARE REPETATĂ

TOXICITATEA STUDIATĂ DURATA ADMINISTRĂRII

SUBSTANŢEI-TEST
Toxicitate pe termen scurt 14 – 28 de zile, zilnic

Toxicitate subcronică 90 de zile

Toxicitate cronică 3 – 12 luni (minim 10% din durata de

viaţă a speciei respective)
Animalele utilizate pentru studii de toxicitate cu administrare
repetată trebuie să fie din cel puţin două specii:
o specie de rozatoare (şobolan) – 10-20 animale/sex/doză;
o specie de nerozătoare (câine, primate sau mini-porcul –
porcuşor de Guineea) – 4-6 animale/sex/doză.

Nivelurile de doze – minim 3, alese încât să evidenţieze:

efectul toxic
reversibilitatea sau nu a acţiunii toxice
efectul cumulativ sau retard
organul (organele) ţintă.

Calea de administrare – cea preconizată a fi folosită la om sau la

animalele țintă (cea mai frecventă, cea orală – în dietă, apă, prin
gavaj sau capsule).
EVALUAREA TOXICITĂŢII ÎN STUDIILE DE TOXICITATE DUPĂ
ADMINISTRARE REPETATĂ (I)

Pe animalul viu:
semnele vizibile de toxicitatea (modificarea aspectului, funcţiilor
vitale, a comportamentului) (modificări de piele, blană, mucoase,
tulburări respiratorii, tulburări de mers, postură sau răspuns, convulsii
tonice sau clonice) sau mortalitatea;
greutatea corporală;
consumul de alimente;
rezultatele examenului oftalmologic; ecografic, radiologic
datele de patologie clinică (parametrii hematologici, enzimatici,
biochimici, analiza urinei);
în cazul toxicităţii cronice – în plus funcţia cardiovasculară şi absorbţia
substanţei în organism.
EVALUAREA TOXICITĂŢII ÎN STUDIILE DE TOXICITATE DUPĂ
ADMINISTRARE REPETATĂ (II)

Post-mortem:
greutatea organelor;
aspectul histopatologic al organelor (ficat,
rinichi, glande suprarenale, ovare, tiroidă,
splină, creier, inimă).
Mutagenitatea – inducerea de leziuni la nivelul materialului
genetic – la nivelul acizilor nucleici ADN şi ARN
(genotoxicitate), cu apariţia de mutaţii.

Cancerogeneza – inducerea de leziuni neoplazice (creşterea

anormală a unui ţesut, cu diviziune anarhică şi invadarea
organismului – metastază).
STUDII DE MUTAGENITATE ● peste 100 de teste

Teste in vitro pe:

bacterii – testul AMES pe Salmonella typhimurium (urmăreşte
sinteza de histidină în urma mutaţiilor)
culturi de celule de mamifere (ex.: celule de limfom de
şoarece, hepatocite de şobolan, celule de plămân sau ovar de
hamster chinezesc)
culturi de celule umane (ex.: limfocite)

Teste in vivo pe:

insecte - Drosophilla melanogaster
rozătoare
mamifere
organisme umane
Clasificarea testelor de mutageneză, după tipul de efect asupra
materialului genetic pe care-l evidenţiază:
teste care evidenţiază mutaţiile genice
teste care evidenţiază mutaţii cromozomiale
teste care evidenţiază alterări primare ale ADN-ului.
STUDII DE CANCEROGENITATE ● sunt de durată şi costisitoare

Se realizează când:
structura chimică sugerează un potenţial cancerogen;
substanţa urmează a fi administrată o perioadă lungă de timp;
există risc de acumulare;
mecanismul de acţiune toxică este discutabil;
rezultatele de la studiile de mutageneză şi /sau de toxicitate a
reproducerii sunt pozitive.
Animale utilizate – rozătoare (şoareci sau şobolani), mai rar câini sau
primate.

Niveluri de doză – 2-3.

Numărul animalelor pe lot – 50/sex/doză.

Durata administrării – 18 luni la şoarece / 24 de luni la şobolan.

Calea de administrare – cea prevăzută a fi utilizată la om.

Examene efectuate:
● evaluarea clinică;
● verificarea apariţiei oricăror mase tisulare neobişnuite;
● evaluarea mortalităţii;
● autopsierea;
● examenul microscopic al tumorilor.
STUDII DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII

Studii de fertilitate la femele

Studii de toxicitate a dezvoltării – embriotoxicitate, fetotoxicitate,
teratogenitate
Studii peri- şi post-natale.

Teratogeneza – apariţia de defecte structurale, prin efecte toxice

exercitate în perioada embrionară sau fetală (malformaţii congenitale).

Studiile de teratogeneză sunt printre cele mai importante.

Animale utilizate – 2 specii de animale, dintre care una de ne-
rozătoare; femelele să fie adulte, tinere, gestante, primipare.

Administrare – în perioada organogenezei.

Se analizează:
la femele gestante – semnele de toxicitate, numărul de corpi
galbeni, numărul de implantări, numărul de resorbţii;
la fetuşi (extraşi chirurgical cu o zi înainte de naştere) – numărul
de fetuşi vii sau morţi, sexul, greutatea şi dimensiunile, anomaliile
existente.
În reglementările privind drepturile animalelor ale Consiliului
Europei, apar două principii importante
testele care determină animalelor durere severă sau o altă formă
de suferinţă nu sunt acceptate;
testul este acceptat doar dacă aduce un beneficiu substanţial
pentru sănătatea oamenilor.

Se cunosc 3 alternative – cei 3 “R”:

Reduction – reducerea numărului de animale utilizate;
Refinement – rafinament – protejarea animalelor utilizate, prin
administrare de analgezice, anestezice în vederea reducerii
suferinţei;
Replacement – înlocuirea testelor pe animale cu teste in vitro.
Pentru testele in vitro se pot folosi:
modele celulare – culturi de celule sau organe izolate;
modele acelulare – fracţiunea S9 din ficatul de şobolan,
mitocondrii izolate, enzime purificate.

Testele in vitro nu pot înlocui, în totalitate, modelul animal.

Criterii nespecifice care pun în evidenţă leziuni nespecifice ce apar la
diferite tipuri de celule (toxicitate generală):
● evaluarea integrităţii celulare (modificări de integritate şi
permeabilitate membranară);
● măsurarea creşterii celulare (modificări ale proliferării celulare);
● determinare activităţii funcţionale a celulei (alte metode).

Criterii specifice tipului de celule sau ţesut (toxicitate selectivă):

● hepatotoxicitate
● neurotoxicitate
● nefrotoxicitate
● imunotoxicitate
● capacitate iritantă
● teratogeneza
Testele de citotoxicitate au în vedere determinarea unor parametri:
 morfologici
 biochimici
 metabolici

 Parametrii morfologici:
● prin microscopie fotonică – formarea culturii celulare (ataşarea
sau detaşarea de celule), leziunile nucleare şi citoplasmatice
(acumularea de vacuole, picături de lipide);
● prin microscopie electronică – leziuni ale structurilor celulare fine.
  Parametrii biochimici:
● integritatea membranară:
 numărul de celule
 conţinutul în proteine totale sau ADN
 testul de incluziune cu tripan bleu
 LDH, transaminazele
 eliberarea de Cr51 din roşu neutru
● permeabilitatea membranară:
 fluxul de ioni sau molecule mici (K+, Ca2+)
 acumularea de molecule exogene
  Parametrii metabolici:
● testul MTT (obţinerea formazanului de către dehidrogenazele
mitocondriale)
● conţinutul în ATP
● sinteza proteică totală (prin incorporarea unui aminoacid
radioactiv)
● raportul lactat / piruvat
● concentraţia în glutation
● peroxidarea lipidică (determinarea malondialdehidei)
● fixarea covalentă
Scopul evaluării toxicităţii generale este determinarea concentraţiei
inhibitorii 50 – CI50.

CI50 – concentraţia care produce o reducere sau inhibiţie de 50% a

unui parametru măsurat sau o scădere de 50% a unei activităţi.
Nu se efectuează studii pe animale de laborator fără acordul
Comisiei de Etică Instituţională.

Cercetătorii estimează că, în viitorul apropiat, se va reuşi

înlocuirea completă a studiilor pe animale de laborator cu o
strategie in vitro, integrată şi validată, pentru determinarea
toxicităţii acute la om (Proiectul A-Cute-Tox al Comunităţii
Europene).
VĂ MULȚUMESC
PENTRU
ATENȚIE!!!!