Raport tiinific 2014 GENESIS PCCA_1153_2011 (contract 229/2013)

Raport tiinific privind rezultatele obinute n cadrul proiectului PCCA_1153b (contract

229/2013)
Evolutie Genetica: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.
O calatorie biomoleculara n jurul Carpatilor din Antichitate pna n Evul Mediu
n perioada ianuarie-decembrie 2014
Cuprins:
1. Rezumat
2. Sinteza rezultatelor obinute n perioada ianuarie decembrie 2014
3. Anexe I Rezultatele principalelor direcii de cercetare n anul 2014
a. Studiul I
Utilitatea spectroscopiei FT-IR n determinarea randamentului extraciei de ADN din
oase arheologice
b. Studiul II
Diagnosticul molecular al tuberculozei la o populaie gotic din Gherseni, Romnia
c. Studiul III
Diversitatea genetic reflectat de analiza regiunii de control mitocondriale la o
populaie de secol X din Capidava (Constana, Romnia)
d. Studiul IV
Optimizarea diagnosticului molecular al sexului la probe arheologice umane
e. Studiul V
Diagnosticul interdisciplinar al unui caz de diabet din perioada neolitic
f. Studiul VI
Mormntul 10 din Biserica Sf. Nicolae Domnesc de la Curtea de Arge
g. Studiul VII
Copilul de la Mlieti (MMPP)
4. Anexe II Rapoarte de antropologie fizic pentru loturile procesate n anul 2014
Raport arheozoologic Miercurea Sibiului 2014
Raport antropologic - Capidava 2014
Raport antropologic Cristian 2014
Raport antropologic - Mlieti 2014
Raport antropologic - Miceti 2014
Raport antropologic - Toboliu 2014
Raport antropologic - Turda 2014
5. Lista publicaiilor i participrilor la conferine tiinifice n anul 2014

Raport tiinific 2014 GENESIS PCCA_1153_2011 (contract 229/2013)

REZUMAT
n etapa II a proiectului PCCA-1153b contract 229/2013 (perioada 1 ianuarie - 31 decembrie
2014) au continuat cercetrile demarate n anul 2013.
Grupurile de antropologie fizic (P1 i P2) continu analiza loturilor recepionate n anul 2013 i
a celor recepionate n anul 2014. Analizele antropometrice constituie analize preliminare care
evideniaz cazurile speciale ce vor primi prioritate n ceea ce privete analizele moleculare. n
Anexele II ale acestui raport tiinific sunt date ca exemplu cele mai relevante necropole studiate din
punct de vedere al antropologiei fizice n cadrul etapei II a proiectului i pentru care a fost redactat
un raport pentru echipa de arheologi.
Cele mai relevante rezultate moleculare obinute n cadrul acestei e tape au fost evideniate n
cadrul studiilor I-VII ce formeaz Anexa I. Dintre acestea, amintim: 1. optimizarea unei metode de
atribuire mai sigur a vrstei la momentul decesului folosind tehnica FTIR (Fourier Transfor
Infrared Spectroscopy), confirmarea prin analize genetice a unui diagnostic de tuberculoz (studiu
pentru care la finalul etapei I nu existau dect rezultate preliminare), identificarea primelor
haplogrupuri mitocondriale de Epoca Bronzului i medievale din diverse necropole de pe teritoriul
Romniei (Capidava, Mireasa - Constana; M10 din Curtea de Arge; copilul nou-nscut din
Mlieti). Majoritatea haplogrupurilor mitocondriale caracterizate pentru populaiile istorice pn n
acest moment sunt forme genetice rare, sau relativ rare n populaia modern ceea ce ridic noi
ntrebri despre contribuia acestora la alctuirea structurii genetice a populaiei moderne.
Tot n aceast etap a continuat efortul de datare radiometric i de analizare a izotopilor stabili
de C i N, cu rezultate n curs de interpretare.
n cadrul proiectului, ncepnd cu finalul acestei etape au fost demarate patru doctorate (3
biologie, 1 arheologie) cu subiecte din aria tematic vizat de proiect.

Raport tiinific 2014 GENESIS PCCA_1153_2011 (contract 229/2013)

SINTEZA REZULTATELOR OBINUTE N PERIOADA IANUARIE DECEMBRIE 2014

Obiectivele etapei II sunt:
1. Documentare i schimburi tiinifice
(vezi lista de participri la conferine i deplasrile de documentare)
2. Investigaii paleo-osteologice
(vezi Anexele II)
3. ADN vechi secvenializare i genotipare
(vezi Studiile I-VII)
4. Analize izotopi stabili ai carbonului (C) i azotului (N), pentru caracterizarea dietei
(2014 - datri radiometrice i analiza izotopilor stabili de C i N n cadrul
studiilor II, III, VII)
5. Analize complementare (SEM, spectroscopie etc.)
(vezi studiile I, II, V)
6. Sapaturi arheologice i procesarea inventarului material
(vezi deplasrile pe antiere arheologice)
7. Studii de arhiva
(studiul VI)
Obligaiile asumate de partenerii proiectului prin semnarea Actului Aditional nr. 2 din 2014
pentru acest etap sunt:
1.
2.
3.
4.

Depunerea raportului anual aferent etapei II

Depunerea raportului tiinific aferent etapei II
Depunerea raportului financiar aferent etapei II
Participarea la conferine tiinifice

28

n plus fa de indicii asumai au fost publicate 8 articole n reviste indexate n baze de date
internaionale, acceptat spre publicare 1 articol n reviste indexate n baze de date internaionale,
publicat 1 articol n revist n curs de indexare n bazele de date (primul numr n anul 2014) i
publicat 1 articol (proceedings) n volumul unei conferine internaionale (Arheovest, decembrie
2014, Timioara).
A fost organizat, la Cluj-Napoca, n data de 7-8 noiembrie 2014, Workshopul Abordarea
biocultural i tiinele biomedicale care a oferit studenilor arheologi i biologi oportunitatea de
a observa procedurile practice aplicate n laboratoare de antropologie fizic i molecular, de a
demara un schimb de idei ntre oameni formai n discipline umanist e i reale i a identifica
posibiliti de colaborare.
ncepnd cu lunile octombrie 2014, respectiv noiembrie 2014 au demarat 4 doctorate (3
biologie, 1 arheologie) cu subiecte din aria acoperit de proiect.

Studiul I.
Utilitatea spectroscopiei FT-IR n determinarea randamentului extraciei de
ADN din oase arheologice
Populaia analizat n acest studiu aparine unei necropole de lng satul Mireasa din
comuna Silitea, judeul Constana i aparine Epocii Bronzului, defuncii fiind ngropai n
poziie fetal (chircit), pe o parte (Figura 1). Pentru a afla vrsta exact a acestora, unul dintre
indivizi a fost testat prin radiometrie.
Datarea cu 14C arat c proba testat aparinea unui individ care a murit ntre anii 2580 i
2490 .e.n, perioad ce coincide cu epoca timpurie a bronzului pe teritoriul Romniei.

n acest studiu, notarea indivizilor este

urmtoarea:
M2 A
M7 G
M3 B
M11a H
M4 C
M11b J
M5a D
M115A K
M5b E
M160 -L
M6 F

Fig.1. Fotografiile celor 11 morminte din necropola Mireasa care au fost atribuite Epocii
Bronzului. Toate scheletele sunt aezate n poziie chircit.

Dup analiza markerilor de sex i vrst (creast nucal, proces mastoid, margine
supraorbital, glabel, i eminen mental, precum i a markerilor de pe oasele coxale, dar i
lungimea unor oase lungi) observabili la scheletele indivizilor necropolei Mireasa, Epoca
Bronzului, a fost fcut o aproximare a vrstei acestora la momentul morii, precum i o atribuire
ct mai exact a sexului (Tabel 1). Astfel, majoritatea rmielor aparin unor brbai, excepie
fcnd (M5a D), de sex feminine. Indivizii studiai au vrste variate, de la nou-nscut, copii,
tineri i aduli. n cazul M5b (E), unde e vorba de osemintele unui infans, nu au putut fi
caracterizai markerii amintii mai sus din cauza slabei reprezentri i conservri a oaselor (Tabel
1).
Tab.1. Valorile aproximative ale vrstei indivizilor din necropola Mireasa, sexul lor, valoarea
medie a strii de reprezentare (scorul 3 nsemnnd c peste 75% din os este disponibil, 2
aproximativ 50%, 1 sub 25% i scorul 0 pentru oasele lips ) i procentul de oase disponibile
calculat pe baza strii de reprezentare.
Numr
mormnt

Cod individ

Sex

Vrst

M2

20-23 ani

Stare de
reprezentare
(medie)
1.296875

M3

26-70 ani

0.65625

16%

M4

15-25 ani

2.265625

57%

M5a

11-15 ani

0.953125

24%

M5b

bebelu

M6

17-19 ani

0.28125

7%

M7

33-42 ani

1.15625

29%

M11A

21-53 ani

1.65625

41%

M11B

7-12 ani

0.546875

14%

M115A

20+ ani

1.328125

33%

M160

26-39 ani

2.4375

61%

Procentul de oase
salvate din individ
32%

Dup cum se observ din tabelul 1, valoarea medie a strii de reprezentare a scheletelor
este n mare parte sub 50%, ceea ce reduce mult acurateea determinrii vrstei i sexului, multe
dintre poriunile cu rol de marker de diagnostic lipsind. Pentru o confirmare absolut a sexului se
pot face analize moleculare, ns vrsta morii este deocamdat o informaie ce nu poate fi
verificat i confirmat prin metode de biologie molecular. Analizele spectroscopice, ns,
manifest un potenial puternic n creterea acurateii determinrii vrstei.

Spectroscopia FTIR i rolul ei n analiza oaselor arheologice

Indicii FTIR folosii pentru evaluarea diagenezei osoase
IRSF
Istoric, primul indice FTIR folosit pentru evaluarea cristalinitii hidroxiapatitei a fost
funcia de despicare (splitting function), un raport arie/arie caracteristic despicrii degenerative
a peak-ului de la 600 cm-1 propriu ndoirii antisimetrice a fosfatului odat cu sporirea ordinii
atomilor (Termine i Posner, 1966). Uneori numit index de cristalinitate CI, alteori factor de
despicare n infrarou IRSF (Infrared splitting factor), raportul dintre suma absorbanelor
valorilor celor dou peak-uri ale despicturii i valoarea corespunztoare vii dintre ele
(A595+A605)/A588 codific informaii referitoare la gradul de diagenez al unui os. Cu ct faza

organic a osului este degradat chimic sau microbiologic, reeaua mineral din jurul ei sufer i
ea disoluii, mai ales ale cristalitelor mai mici i mai instabile din punct de vedere termodinamic,
care se vor recristaliza pe suprafaa cristalelor deja existente, mai mari i mai stabile, conform
condiiilor fizico-chimice discutate mai sus. Nielsen-Marsh i Hedges (2000) afirmau c cele
dou procese, disoluia i recristalizarea pot participa mpreun la creterea valorii IRSF. Astfel,
cristalinitatea crete, i chiar dac la nivel macroscopic nu se observ diferene, reorganizarea
microscopic poate fi urmrit cu ajutorul acestui parametru (Rogers i colab., 2010). O corelare
direct ntre IRSF i mrimea medie a cristalitelor a fost artat de Truman i colab. (2004),
mpreun cu o modificare n forma cristalitelor odat cu maturarea, de la o form planar nspre
una acicular: 163 x 28 x 5 nm (Berna i colab., 2004).
Mai multe colective au calculat IRSF pentru os modern n comparaie cu oasele
arheologice pe care le studiau la acel moment, artnd o cretere clar a valorii indicelui odat cu
degradarea osului: 2.7 peste 3 (Mller i colab., 2011); sub 2.8 ntre 2.7 i 3.4 (Trueman i
colab., 2004); 3.4 ntre 3.5 i 3.8 pentru un loc de nmormntare i ntre 3.1 i 4.6 pentru un
altul (Lebon i colab., 2010); 2.6 3 (Nielsen-Marsh i Hedges, 2000) i Berna i colab., (2004)
au evideniat o gam i mai larg de valori: ntre 2.6 i 3 pentru oase in vivo, pn la 3.4 pentru
oase puin afectate la suprafaa solului, pn la 4.1 pentru oase fosile i un IRSF de 7 a fost
determinat pentru fosile puternic alterate (Figura 2). Pentru comparaie, IRSF pentru
hidroxiapatita sintetic este 5.4. O explicaie pentru care cristalinitatea ntr-un os poate fi mai
mare dect ntr-o hidroxiapatit standard va fi dat imediat.

Fig.2. Valori ale IRSF i gradul de recristalizare pentru diferite tipuri de apatite. Apatita
carbonatat exogen este mineralul ce se formeaz cel mai des prin reacia ntre fosfatul eliberat din
degradarea materiei organice i carbonatul de calciu prezent n sedimente. (din Berna i colab.,
2004)

Cnd structura chimic original a apatitei geologice este alterat, ntregul complex va fi
mai destins (mai lax), mai solubil i deci mai puin cristalin, asemenea alterri se ntmpl cnd
CO3 nlocuiete parial PO4 sau OH, sau cnd Ca este substituit de ali atomi, ca Na sau Mg.

Figura 3 arat spectre ale unor tipuri distincte de diagenez, graficul negru corespunznd unui os
depozitat n mediu carbonatat (vezi peak-ul masiv al carbonatului, de la 1415 cm-1): se observ
slaba despicare a peak-ului la 595 605 cm-1, susinnd explicaia de mai sus. Situaia opus
pentru hidroxiapatit este atunci cnd OH este nlocuit de un atom de flor. Floroapatita
[Ca10(PO4)6(F)2] este chiar mai strns mpachetat fr gruparea hidroxil, conferind mineralului
insolubilitate, cristalinitate i rezisten la pH mic, cu un IRSF de pn la 7. n os, hidroxiapatita
carbonatat leag florul, devenind francolit [Ca10(PO4,CO3)6(F)2], un mineral cu un peak
specific de absorbie n infrarou, la 1096 cm -1, uor de recunoscut pe spectru prin umrul de
francolit de lng peak-ul principal al fosfatului. Graficul rou din Figura 3 este un exemplu de
spectru al unui os care a absorbit flor, avnd distinctivul umr de francolit i un IRSF mai mare,
dup cum despicarea de la 600 cm -1 sugereaz.

Fig.3. Exemple de spectre de absorbie FTIR ale unor oase cu tipuri de diagenez diferite (discuie
n text) (imagine proprie)

ntr-un sit arheologic s-a observat c oasele indivizilor nmormntai n zona cu sol mai
umed a sitului prezentau semne de francolit (King i colab., 2011), ceea ce se explic prin
afinitatea mare a florului pentru ap (Greenwood i Earnshaw, 1998). Fosilele foarte vechi, ca
cele de dinozauri, au IRSF de aproape 7 i un coninut crescut de flor, altfel nu ar fi putut
supravieui n timp (Berna i colab., 2004).
Totui, nici un IRSF mic i nici un timp de depoziie scurt nu se pot corela cu o
conservare bun a organicului, cci toi ceilali factori descrii mai sus depesc contribuia
vrstei cronologice (Weiner i Bar-Yosef, 1990). Hagelberg i colab. (1991) ofer un exemplu n
acest sens: o groap comun din perioada Rzboiului Civil nu a avut randament la obinerea de
ADN pentru analize genetice, ns un cimitir saxon mai vechi dect precedentul a dus la rezultate
ADN interpretabile. Nici Salamon i colab. (2005) nu au reuit s gseasc o corelare ntre
randamentul amplificrii ADN i vrsta probei, ns Allentoft i colab. (2012) subliniaz c dac
toate celelalte variabile ar fi constante, conservarea ar fi o funcie de timp, aa cum ne ateptm,
conform datelor de chimie fizic pur.

C/P
Coninutul de carbonat, msoar raportul absorbiilor peak-urilor CO3/PO4 de la 1415 i
1035 cm-1 respectiv. Wright i Schwartz (1996) au stabilit o bun corelare ntre raportul C/P i
procentul de mas (wt%) al CO32- msurat prin eliminarea de CO2 la disoluie acid.
C/P este un parametru disputat, mai ales n domeniul etichetrii izotopice, orice carbonat
exogen din esutul osos examinat ducnd la rezultate greite legate de vrsta geologic, migraii,
diet, clim (King i colab., 2011).
n ceea ce privete diageneza, raportul C/P arat doar raportul cantitativ ntre anioni. El
poate crete n timp, dac concentraia carbonatului n mediu este mare, astfel nclinnd balana
echilibrului termodinamic mpotriva tendinei naturale a hidroxiapatitei de a elimina carbonatul.
Asemenea cazuri vor prezenta pe spectru un peak specific calcitului la 712 cm -1 (Figura 5), dac
calcitul reprezint minim 3% din mineralul osului (3% fiind limita de detecie) (Nielsen-Marsh i
Hedges, 2000; Mller i colab., 2011). O valoare C/P mic indic pierderea CO 3 prin disoluie
i/sau absorbia de PO4 n structura cristalin; deci o valoare medie, de os modern, a indicelui
C/P ntr-un os antic indic nspre ambele procese: (a) o depunere de calcit (CaCO3) n i pe os i
adsorbie pe suprafaa cristalelor de apatit, i (b) o cretere local a perfeciunii cristalitelor prin
fixarea PO4 (Nielsen-Marsh i Hedges, 2000).
Lebon i colab. (2010) au argumentat problema valorii fluctuante a raportului C/P pentru
probe arheologice prin existena mai multor procese ce contribuie la valoarea lui final, indicele
variind ntre 0.15 i 0.35, pe cnd probele moderne au o deviaie standard mult mai mic, cu o
valoare medie a C/P de 0.28.
Indicele C/P ridic nite probleme din cauza vibraiilor organice C-H crora li se
suprapune frecvena de absorbie cu cea a gruprii CO 3, ducnd la o supraestimare a carbonatului
odat cu coninutul de matrice organic (Truman i colab., 2004). n Figura 5, spectrul probei
carbonatate are i un peak nalt la Amida I (Amida I este legtura C=O din lanul polipeptidic),
sprijinind aceast observaie.
CC
Coninutul de colagen CC este indicele ce msoar conservarea proteic a matricei
osoase, calculat ca raportul valorilor de absorbie ale amidei I i fosfatului (A1640/A1035). Valori
de 0.2 corespund la 15 wt% material organic n os, i un CC de 0.8 la 30 wt% (Truman i
colab., 2004). Cu ct semntura proteic este mai puternic, cu att fraciunea organic a
supravieuit mai bine trecerii timpului ntr-un anumit os.
Nielsen-Marsh i Hedges (2000) au artat o corelare ntre CC i IRSF explicat prin
strnsa legtur dintre matricea mineral i cea organic, pierderea materialului organic ducnd
la disoluia mineralului, corelare neobinut i de Lebon i colab. (2010), probabil din cauz c
lotul investigat de acetia avea i ali factori care au influenat valorile indicilor, ca prezena
florului.
Deplasarea peak-ului 1PO4
Un alt indice, propus de Lebon i colab. (2010), este deplasarea unei benzi de absorbie a
fosfatului de la 960 cm-1 nspre 963 cm-1, deplasare corelat liniar cu pierderea carbonatului i
creterea perfeciunii reelei cristaline, odat cu excluderea ionilor strini. Acest indice pare s
fie mai sensibil la pierderea carbonatului i modificri ale tensiunii n reeaua mineral dect
IRSF, care se refer mai ales la mrimea cristalelor. Unele probe au avut acest peak deplasat i
peste 963 cm-1, dar numai acompaniat de un coninut crescut de flor, care confer floroapatitei
mai mult ordine atomic dect are hidroxiapatita.
Apatitele dopate cu ioni ca Ba2+, Mn2+, Sr2+ au acest peak deplasat sub 960 cm-1, artnd
c acest indice ar putea fi folosit pentru detectarea substituiilor ionice n reeaua mineral de-a
lungul diagenezei (Thomas i colab., 2007).

Concluzii
Procesul de diagenez afecteaz ambele componente ale esutul osos, fraciunea mineral
trecnd prin disoluii i recristalizri succesive, n timp ce partea organic sufer degradare
chimic i digestie microbian. Procesele de diagenez ale celor dou componente osoase sunt
interdependente, ele protejndu-se una pe cealalt.
ADN nu poate fi observat a priori n oasele antice, deci estimarea lui se face pe baza altor
componente, mai accesibile (mineral i proteic).
Din spectrele FTIR se pot obine date privind mrimea cristalitelor din os
[(565+605)/588], raportul carbonat/fosfat (1415/1035), coninutul de colagen (1640/1035), dar i
alte informaii, ca prezena fluoroapatitei sau a calcitului.
Prin interpretarea informaiilor oferite de spectroscopia FTIR privind diferite oase,
molecularistul poate alege osul cel mai potrivit pentru a extrage ADN i a avea un randament ct
mai bun n procesele ulterioare (PCR, Q-PCR, secveniere).

Corelarea indicilor FTIR cu concentraia de ADN extras

Pentru fiecare prob de extracie de ADN din fiecare individ au fost calculai indicii
IRSF, C/P, CC. Datele indic o corelare clar ntre valoarea concentraiei de ADN extras (citit
prin spectrometrie UV) i cei 3 indici. Raportul C/P i coninutul de colagen CC sunt direct
proporionale cu cantitatea de ADN extras, iar indicele IRSF este n relaie invers (Figura 4.F
individul M6-F). Corelarea nu este la fel de evident la toi indivizii, dar proporionalitatea
invers a IRSF rmne valabil n mai multe cazuri (Figura 4.B individul M3-B). De precizat
este faptul c gradul de corelare ntre date se menine doar cnd se analizeaz cte un individ pe
rnd, astfel c la combinarea datelor ntre indivizii B i F graficul nu mai are aceeai simetrie
(Figura 5). IRSF i menine invers proporionalitatea fa de C/P i CC, ns relaia acestora cu
concentraia de ADN extras din probe nu se pstreaz la compararea inter-individual, fapt ce se
explic prin condiiile diferite n care au fost depozitate oasele. Chiar dac toi indivizii studiai
aici provin din aceeai necropol i condiiile climatice de-a lungul secolelor au fost aceleai
pentru toate scheletele, este posibil ca proprietile solului i hidrologia local s fie diferite chiar
i la distane de civa metri.
F

F2

F56

F8

F10

F11

B
CONC

CONC

IRSF

IRSF

C/P

C/P

CC

CC

B2

B3

B6

B8

B11

Fig.4. Corelarea direct proporional a indicilor C/P i CC i invers proporional a IRSF cu

concentraia de ADN extras. F = individul M6, B = individul M3. Pe axa absciselor sunt probe
din oase diferite. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.

CONC
IRSF
C/P
CC

F11

F8

F2

F10

B3

B11

F56

B2

B8

B6

Fig.5. Corelarea indicilor cu concentraia de ADN dispare atunci cnd se compar indivizi
diferii. Indicii FTIR i pstreaz relaia de simetrie, dar valorile concentraiei de ADN nu
coincid cu modelul individual. F = individul M6, B = individul M3. Pe axa absciselor sunt probe
din oase diferite. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.

Corelarea indicilor FTIR cu vrsta

Metoda pantei graficului CC-ADN
Ipoteza de la care s-a pornit n studiul de fa este c supravieuirea ADN n oase este
proporional cu cea a colagenului. Deci indicele CC ar trebui s fie decisiv n luarea deciziei de
a aprofunda studiul unui anumit os prin extracia de ADN. Figura 6 aduce mpreun toate
valorile indicelui CC i concentraiile de ADN extras. Liniile punctate sunt trendline-uri pentru
cte un individ i respect codul de culori de la legend. La cele mai multe probe, trendline-ul
arat o proporionalitate direct ntre valoarea CC i concentraia ADN, dar exist i indivizi
pentru care dreapta este nclinat invers sau este orizontal. Oricum, i la indivizii cu
proporionalitate direct se observ diferite grade de corelare, liniile din grafic fiind nclinate la
unghiuri foarte variate. Aadar, valoarea CC nu pare s prezic nicicum concentraia de ADN din
probe.
A
B

CC

D
E

F
G
H
J
-20

20

40

60

80

100

Concentraie ADN extras

120

140

160

K
L

Fig.6. Slaba corelare dintre valoarea CC i concentraia de ADN obinut pentru toate probele
studiate. Fiecare individ este reprezentat cu un alt simbol, iar axele de trend corespund codului de
culori. Se observ o variaie a unghiului dintre trendline i axa ox.

S-a observat o legtur ntre nclinarea axei dintre CC i concentraiile de ADN extras
per individ i vrsta acestuia. Ecuaiile axelor de trend sunt notate n tabelul 2, ordonate cresctor
dup panta lor. Astfel, axele cele mai orizontale sunt ale datelor de la indivizii M3-B i M160L, de 26-70, respectiv 26-39 ani. La individul L, ns, graficul a fost trasat din doar dou puncte,
deci e probabil ca unghiul trendline-ului s fie mai mare n realitate. Aadar vrsta lui de maxim
39 de ani nu ar mai contrazice teoria propus aici. n ordinea cresctoare a unghiurilor trendlineurilor urmeaz indivizii M7-G i M11a-H care au vrstele cuprinse ntre 33-42 respectiv 21-53
ani. Urmtoarele drepte sunt ale indivizilor M115A-K i M2-A, aproximai ca avnd 20+ i 2023 de ani. Urcnd nspre vertical, urmeaz dreptele indivizilor M4-C i M6-F, de 15-25 respectiv
17-19 ani. Dreapta cu cea mai mare pant din aceast serie de drepte este cea a individului M5bE, infans. Exist i dou axe puternic deviate, unde relaia dintre CC i concentraia de ADN este
invers, dar acestea aparin tot unor copii i unghiul de nclinaie e n continuare dependent de

vrsta lor: M5a-D avnd vrsta de 11-15 ani i M11b-J de 7-12 ani. Aadar, fie individual infans,
fie cei doi copii prezint erori de la modelul urmat n acest grafic. Oricum, este important de
subliniat aceast legtur n cazul fiecrui individ, ntre unghiul de nclinaie al axei dintre
valorile CC i concentraie, legtur ce poate reda informaii privind vrsta individului.
Tab.2. Ecuaiile dreptelor de trendline ale funciilor dintre valorea CC i concentraia ADN pentru
fiecare individ studiat, i vrsta atribuit indivizilor prin metode antropologice i antropometrice.
Datele sunt ordonate cresctor dup valoarea pantei dreptei.
Individ
Ecuaia dreptei
Vrsta
B

y = -0.0075x + 10.43

26-70

y = 0.0427x + 5.2831

26-39

y = 0.0819x + 4.5159

33-42

y = 0.0944x + 9.2929

21-53

y = 0.1191x + 10.716

20+

y = 0.3105x - 0.4069

20-23

y = 0.3502x + 9.7025

15-25

y = 0.3749x + 3.514

17-19

y = 0.9444x + 14.056

bebe

y = -0.9112x + 54.206

11-15

y = -0.1399x + 21.16

7-12

La indivizii tineri coninutul de colagen este mult mai mare raportat la cantitatea de
ADN, n comparaie cu cazurile de oseminte adulte, unde valoarea CC crete mai lent cu
creterea concentraiei de ADN. Probabil explicaia const n strnsa relaie dintre fraciunile
mineral i organic ale osului. Cu ct un individ este mai avansat n vrst, oasele i sunt mai
mineralizate, iar la momentul morii acest element pare s aib un efect de protejare a ADN. La
indivizii foarte tineri, coninutul de colagen raportat la cel de hidroxiapatit este mai mare, de
unde i valori superioare ale indicelui CC, dar cantitatea de ADN ce supravieuiete trecerii
timpului este redus, posibil din cauza lipsei proteciei minerale.
Dintr-o reprezentare grafic a intervalelor de vrst determinate prin standarde
antropologice i a valorii pantei axelor obinute din graficul CC-concentraie ADN, se obine
figura 11. Cu negru sunt reprezentate intervalele de vrst conform analizei antropologice, cu
maximul la 70 de ani, iar cu albastru sunt valorile pantelor axei de trend pentru fiecare individ,
ordonate descresctor. ntre indivizii K-B, valorile pantelor scad aproximativ liniar, aa c s-a
considerat c diferena de vrst ntre ei este una cu variaii mici. La fel este cazul i ntre
indivizii F-C-A, ns diferena de vrst dintre individul F (17-19 ani) i infans E este brusc.
Pentru a completa acest grafic pn la o liniaritate pe tot intervalul este necesar investigarea
unui numr mai mare de indivizi tineri. Exist posibilitatea ca n zona de sub 18 ani relaia
vrst-pant s nu mai fie liniar, ci exponenial, ns asta nu se poate clarifica deocamdat.
Poate din acest motiv indivizii J i D (7 12, respectiv 11 15 ani) prezint deviaii att de
puternice de la grafic. Considernd, aadar, o relaie de liniaritate, s-au trasat (cu albastru) drepte
paralele cu dreapta de variaie a pantei, drepte care ndeplinesc condiia de a trece prin toate
intervalele de vrst determinate clasic. Pe baza acestui grafic s-au dedus vrstele cele mai
probabile ale indivizilor dintre 17 i 90 de ani. Valorile deduse se regsesc n tabelul din figura 7.

Individ

Vrsta estimat
prin metoda
descris

17-19

19-21

21-23

30-35

32-36

33-37

34-39

36-40

Fig.7. A. Metoda de deducie a vrstei indivizilor pe baza pantei funciei CC-concentraie ADN. Cu
negru sunt reprezentate intervalele de vrst deduse prin metode antropologice. Cu albastru sunt
valorile pantelor funciilor corespunztoare fiecrui individ. Prin trasarea unor drepte paralele cu
valorile pantelor astfel nct acestea s se intersecteze la fiecare individ cu intervalul dedus anterior,
se pot obine intervale mult mai restrnse ale vrstei indivizilor B.

Excepii ale valorilor indicilor FTIR la oasele de copii

n cutarea corelrii dintre indicii FTIR i concentraia de ADN extras din diferite tipuri
de oase, n cazul coastelor i a oaselor craniului s-a observat o anomalie. Figura 8 arat indicii
C/P i CC n relaie cu concentraia de ADN din coastele diferiilor indivizi. Punctul unde apare
o cretere a valorilor indicilor corespunde osemintelor unui individ nou nscut.
5

(coaste)

4
3
2

C/P

CC

K9

E45

F56

D56

G67

A8

Concentraii cresctoare de ADN (ng/ul)

Fig.8. Indicii C/P i CC n relaie cu concentraia de ADN extras din coastele diferiilor indivizi.
Individul E, la care apare o aberaie n grafic, este un nou nscut.

Figura 9 conine valorile indicilor FTIR pentru probe preluate din oasele craniului ale
indivizilor investigai. Se poate observa creterea valorilor C/P i CC i scderea lui IRSF fa de
restul probelor n dou cazuri. Individul E (M5b) este acelai nou nscut evideniat n graficul
anterior, iar individul D (M5a) este un copil de 11-15 ani. Restul indivizilor reprezentai n aceste
dou grafice au vrste mai mari (Tabel 3).

(craniu)

IRSF
C/P

B2

2
G

A2

3
G

B3

A3

34

34
D
12

F2

C
12

H
23

K3
E1
23

CC

Concentraii cresctoare de ADN (ng/ul)

Fig.9. Indicii FTIR n relaie cu concentraia de ADN extras din oasele craniilor. Probele aparinnd
indivizilor D (M5a) i E (M5b) prezint aberaii fa de trendline.
Tab.3. Vrstele indivizilor reprezentai n figurile 12 i 13. Cu rou sunt ncadrate probele care
prezint anomalii de la grafic. Cu verde e evideniat proba care n oasele craniului prezint
diferene de la linia general dar n coast nu.
Proba

Vrsta
individului
20+

Proba

K9

Concentraia
ADN (ng/ul)
4.8

K3

Concentraia
ADN (ng/ul)
0.4

Vrsta
individului
20+

E45

11.8

F56

38.6

nou nscut

E123

1.6

nou nscut

17--19

H23

21--53

D56

40.3

11--15

F2

2.6

17--19

G67

55.7

33--42

C1234

3.7

15--25

A8

71.1

20--23

D1234

5.1

11--15

A3

31.2

20--23

B3

33

26--70

G3

46.7

33--42

A2

52.4

20--23

G2

53.8

33--42

B2

78.2

26--70

Oasele craniului au prezentat o cretere a valorilor C/P i CC la indivizi sub 15 ani, efect
observat la oasele costale doar la indivizi sub 11 ani. Prin diferena de osificare ntre anumite
oase ale corpului i prin compararea cu date de osteologie juvenil se poate determina vrsta
unui individ la momentul morii. Rezultatele acumulate aici sunt insuficiente pentru formarea
unui etalon complet, dar indic spre o metod alternativ de determinare a vrstei la oasele
arheologice, acolo unde rmiele umane sunt incomplete, lipsind markeri eseniali ai
determinrii vrstei. Desigur, pentru o analiz comprehensiv, sunt necesare mult mai multe
probe dect am avut noi la dispoziie i indivizi aflai n etape ale vieii mai apropiate ntre ele,
pentru a forma o linie continu. Probele ar trebui alese astfel nct s se urmreasc toate oasele
corpului, mai puin prile de articulaii care deja sunt folosite n analiza antropologic la
determinarea vrstei, unde analiza ar fi redundant.
S-au mai fcut ncercri de corelare a vrstei cu proprieti ale spectrelor FTIR a oaselor
i s-a artat c odat cu naintarea n vrst are loc o intensificare a mineralizrii n esuturile
osoase animale (Alvarez-Lloret i colab., 2006).

Valorile indicilor FTIR i concentraia de ADN, n funcie de tipul de os

Pentru a diferenia oasele cu cea mai mare ans de izolare a ADN, s-au calculat valorile
medii ale indicilor FTIR i ale concentraiilor de produs extras (Tabel 4). Cea mai mare cantitate
de material genetic a fost extras din probele de os spongios din corpurile vertebrale (50-60
ng/l), urmat de coaste (~45-50 ng/l) i de osul spongios al oaselor scurte i al epifizelor

testate (~40-46 ng/l). Urmeaz osul compact al diafizelor, cu valori ale concentraiei de
aproximativ 30-34 ng/l i osul craniului, cu ~28-33 ng/l. Valoarea mai mic a mediilor s-a
calculat folosind toate datele disponibile, iar cea mai mare ( Media ) s-a obinut eliminnd
valorile extreme ale unui individ, unde probabil diferena a rezultat dintr-o eroare de manipulare
n etapa de extracie.
Indicele CC se refer la coninutul de material organic dintr-un os. Valorile minime
(~0.11) s-au gsit la oasele nchise (diafize i craniu) acolo unde i cantitile de ADN extras au
fost cele mai mici, iar oasele spongioase i coastele au valori mai mari ale CC (0.15-0.18).
Explicaia ar fi faptul c n oasele spongioase exist contaminare cu material organic microbian.
n ciuda msurilor luate pentru a distruge urmele de ADN exogen, e foarte probabil ca n spaiile
din interiorul esutului spongios curarea s nu fi fost destul de eficient. Probele din oasele
compacte ale diafizelor i din osul craniului au fost preluate din adncime, deoarece grosimea
esutului a permis, astfel reducnd substanial ansa ca acolo s se fi dezvoltat bacterii.
Raportul C/P se distribuie, de asemenea, n aceleai dou direcii: valorile mici (0.17)
corespund oaselor cu CC i concentraie de ADN mai mici, iar cele mari (0.21-0.25) celeilalte
categorii. Valoarea mare a carbonatrii oaselor spongioase se poate datora carbonatului din sol,
care, dizolvat n ap, a putut ptrunde mai uor n spaiile din esutul spongios dect n oasele
compacte, recristaliznd pe suprafaa apatitei.
Indicele IRSF are valori de 3.3-3.6 pentru oasele compacte i 3.1-3.2 pentru oasele
spongioase, ceea ce nseamn c mrimea cristalitelor de hidroxiapatit din oasele compacte este
superioar celei din oasele spongioase, unde, conform deduciei de mai sus, o mare cantitate de
carbonat s-a ncorporat n reeaua mineral. Carbonatul, avnd structura diferit de a fosfatului,
reduce cristalinitatea prin dezordonarea structurii, nepermind cristalului s creasc natural, deci
pstrnd o valoare mai mic a indicelui IRSF.
Valorile medii ale indicilor FTIR se potrivesc cu modelul descris n subcapitolul
Corelarea indicilor FTIR cu concentraia de ADN extras, concentraia mai mare de ADN
corespunznd probelor cu CC i C/P mai mari i IRSF mai mic, i invers. Aadar, cele mai
potrivite oase pentru extracia de ADN sunt cele compacte, groase i nedeschise, astfel, se reduce
contaminarea cu bacterii i cu alte substane chimice inhibitoare din sol. Din aceste considerente,
n continuare se vor aprofunda i compara caracteristicile tipurilor de os cranian i a unor diafize.
Tab.4. Valori medii ale concentraiilor de ADN extras i ale indicilor FTIR pe grupe de oase.
Conc ADN (ng/ul)

Vertebre - S
Coaste
Spongios
Diafize - C
Cranii

CC

C/P

IRSF

Media

Media

Media

Media

Media

50.707

59.063

0.158

0.214

3.243

44.812

50.528

0.184

0.231

3.199

40.4

46.114

0.187

0.254

3.109

29.469

34.363

0.114

0.177

3.37

28.223

33.171

0.115

0.176

3.623

Oasele craniului
n cadrul osului craniului se disting straturile de os spongios i compact. S-au comparat
valorile indicilor FTIR i concentraia de ADN extras pentru cele dou tipuri de esut cranian la
civa indivizi, unde starea de reprezentare a permis acest lucru. La oasele indivizilor foarte
tineri, osul craniului este prea subire pentru a putea prelua cele dou tipuri de probe ntr-un mod

precis. Concentraia de ADN obinut din probele de os cranian compact i spongios se coreleaz
pozitiv cu valorile C/P i CC i negativ cu valoarea indicelui IRSF, corespunznd observaiilor
fcute mai sus (Figura 10). n grafic, datele sunt reprezentate relativ i nu ca valori absolute,
pentru a arta relaia ntre probele aparinnd aceluiai individ. Datele exacte sunt prezentate n
tabelul 5. Rndurile gri deschis reprezint oase compacte, iar cele gri nchis sunt oase
spongioase. Valorile foarte mici ale concentraiei ADN de la individul K le-am atribuit unei
greeli de manipulare n etapa de extracie, de aceea le-am eliminat de la calcularea valorilor
medii (mai sus), dar am considerat c pierderea a fost proporional la toate probele, deci n
discuia comparrii datelor intra-individual, rezultatele se pot lua n considerare.

(craniu)

Conc
IRSF
C/P
CC

A.C

A.S

B.C

B.S

K.C

K.S

G.C

G.S

Fig.10. Corelarea direct ntre concentraia de ADN extras i indicii CC i C/P i corelarea lor
invers cu IRSF, la indivizii A, B, K. Individul G prezint o neconcordan cu restul rezultatelor
observate. A = individul M2, B = individul M3, K = individul M115A, G = individul M7, C = os
compact, S = os spongios. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.
Tab.5. Valorile concentraiei ADN extras din poriunea compact (gri deschis), respectiv
spongioas (gri nchis) a oaselor craniene de la indivizii A, B, G i K, i valorile indicilor FTIR
corespunztori.
Individ

Conc (ng/l)

IRSF

C/P

CC

52.4

3.803

0.139

0.045

31.2

4.034

0.1

0.038

78.2

3.63

0.159

0.136

33

3.876

0.138

0.104

53.8

3.791

0.129

0.048

46.7

3.791

0.136

0.056

1.6

3.323

0.174

0.145

0.4

3.633

0.156

0.068

Dintre indivizii studiai, unul singur (M7-G) nu se supune modelului: n acest caz, indicii
FTIR au avut valorile IRSF i C/P aproape identice pentru osul spongios versus cel compact, iar
CC a fost invers proporional cu concentraia de ADN extras. Probabil c osul compact a suferit
o fosfatizare concomitent cu o decarbonatare, ceea ce a dus la scderea indicilor CC i C/P i la
creterea IRSF. Mormntul M7 are ntr-adevr o deosebire major fa de celelalte din
necropol, i anume prezena unor brne de lemn i a ocrului. Este posibil ca materialul organic

vegetal suplimentar s fi fost legat preferenial de carbonatul din vecintatea scheletului i astfel
exteriorul craniului s fie mai puin carbonatat dect stratul spongios profund.
n figura 11 sunt reprezentate spectre ale diferenei dintre spectrul osului compact i cel al
osului spongios pentru fiecare din indivizii testai. Spectrele explic datele prezentate n figura
10. Se observ diferena mare ntre valorile indicelui CC la individul K, prin nlimea peak-ului
amidei I n spectru i egalitatea indicilor la individul G, unde spectrul de diferen nu are un vrf
. n ceea ce privete indicele C/P, diferena se manifest la nivelul peak-ului fosfatului: pentru
indivizii A, B i K valoarea diferenei absorbiei ntre compact i spongios este o valoare
negativ, pe cnd la individul G osul compact are un coninut de fosfat mai mare dect cel
spongios. i pentru IRSF (cu detaliu n medalion) diferena se poate arta de pe spectru: la
individul A zona de diferen a spectrelor corespunztoare peak-ului despicat arat ca litera W,
i n contrast, la individul G spectrul este invers, ca un M.

Fig.11. Diferena dintre spectrele de absorbie ale osului compact i spongios pentru indivizii A, B,
K i G. Se observ diferenele de la nivelul amidei I, al carbonatului i fosfatului i din zona de
calcul a indicelui de cristalinitate IRSF, care se vede n detaliu n medalion.

Diafize
S-a comparat randamentul extraciei de ADN din osul compact a unor diafize degradate
diferit, aparinnd aceluiai individ. n cazul individului M7-G, indicii i concentraia de ADN
sunt n relaie identic cu a cazurilor prezentate mai sus i n concordan cu atribuirea vizual a
caracterului de degradare (Figura 12A). i pentru diafizele individului M3-B, concentraia ADN
extras a coincis cu degradarea macroscopica a osului (Figura 12B, Tabel 6), ns valorile
indicilor nu au corespuns: IRSF i CC au fost aproape identice pentru cele dou oase, iar C/P fost
inversat (Tabel 6). Totui, faptul c aici indicii FTIR nu aduc mult ajutor n alegerea osului mai
potrivit pentru extracie, este normal s alegem osul mai puin degradat dac urmrim purificarea
de ADN.

CONC
IRSF
C/P
CC

G9

G14

Fig.12. A. Corelarea dintre concentraia ADN extras din dou diafize ale individului M7-G (proba
G9 mai slab conservat dect proba G14) i indicii FTIR pentru oasele respective. B. Fotografie a
probelor din individul M3-B, unde proba B8 este vizibil mai bine conservat dect proba B11.
Tab.6. Valorile concentraiei ADN extras din probele de os compact lung pentru indivizii B i G i
ale indicilor FTIR n oase cu grade de degradare vizibil diferite. Pe rndurile gri deschis sunt
probele mai slab conservate i pe rndurile gri nchis sunt probele mai bine conservate.

Concentraie(ng/ul)

IRSF

C/P

CC

B11

35

3.554

0.165

0.082

B8

111.8

3.505

0.144

0.084

G9

54.9

3.421

0.152

0.093

G14

77.3

3.189

0.189

0.146

Extracia de ADN vechi

ADN-ul extras din probe arheologice este puternic degradat. Dup cum se vede n Figura
13, majoritatea materialului extras are lungimi sub 50 pb. Primele dou probe sunt extrase din
oasele craniului, compact i spongios. Toate celelalte probe (din corp vertebral, coast, dou
diafize compacte i o epifiz spongioas) prezint urme majore de contaminare cu ADN modern,
n partea de sus a gelului. ADN modern nu este la fel de degradat, deci nu migreaz la fel de
repede n gelul de agaroz. Contaminarea este cel mai probabil de origine microbian, n probele
extrase din os spongios fiind mult mai evident. Blankul de extracie nu conine ADN.

Fig.13. Gel de agaroz 2% cu ADN vechi extras din probe de os. Banda inferioar a
markerului are 50 pb.

Determinarea inhibitorilor PCR co-extrai cu ADN antic

Este un fapt bine cunoscut n literatur c ADN extras din probe antice conine inhibitori
ai PCR, ceea ce constituie o mare problem. Chiar i la adugarea unui l de extras ADN ntr -un
PCR cu ADN modern, reacia este inhibat (Kalmar i colab., 2000). S-a ncercat deducerea
substanelor ce rmn n extrasul de ADN i inhib reaciile ulterioare, pentru a putea dezvolta o
metod eficient i direcionat de purificare. Prin compararea spectrelor de absorbie FTIR (de
fapt de Transmisie) ale probelor de ADN extras cu ale substanelor folosite n etapa de extracie
ADN (sursa: chemicalbook.com), s-au exclus fenolul i cloroformul dintre potenialii inhibitori
(Figura 14). n intervalul 3000 1700 cm-1, fenolul are cteva peakuri care n probele noastre nu
apar, iar cloroformul are un peak puternic la 800 750 cm-1, peak ce nu se observ n probe.

Fig.14. Evidenierea diferenelor dintre spectrele de absorbie n IR ale fenolului (gri deschis) i
cloroformului (gri nchis) n comparaie cu spectrul specific al ADN antic extras (jos). Cu rou sunt
marcate peak-urile care infirm prezena acestor substane n produsul extras.

Substanele folosite n soluia de decalcifiere au fost de asemenea verificate prin

compararea spectrelor individuale (chemicalbook.com) cu spectrul probelor obinutue prin
extracie. SDS-ul iese din calcul din cauza peak-ului puternic de la 3000 2700 cm-1 i TRIS-ul
datorit peakului ngust de la 1040 cm -1. n schimb, EDTA pare s corespund spectrului de
absorbie al probelor investigate, avnd un peak puternic la 1600 cm-1, i mai multe mici ntre
1400 1000 cm-1, la fel ca probele de ADN extras (Figura 15).

Fig.15. Comparaie a spectrelor SDS (gri pal), EDTA (gri) i TRIS (gri nchis) cu al ADN-ului
antic extras (jos). Marcate cu rou sunt peak-urile care dovedesc absena SDS i TRIS n produsul
de extracie. Cu verde e evideniat EDTA, cu un spectru asemntor cu al probei.
Aadar, se pare c substana care rmne n probele de ADN i inhib amplificarea prin
PCR ar putea fi EDTA, un cunoscut inhibitor al polimerazei, ce acioneaz prin chelatarea ionilor
de magneziu, necesari enzimei pentru funcionare.
Pe lng culoarea maronie a probelor obinute, s-a observat c extractul de ADN are
fluorescen albastr n UV (Figura 16). Pe lng aceste dou observaii, Pbo spunea c
probele de ADN antic extras au un miros plcut, dulciu (2014). Aceste indicii conduc nspre
existena n probe a produilor Maillard.

Fig.16. Gel de agaroz n UV, pe care s-a migrat ADN antic. Se observ fluorescena albastr.

Produii Maillard copurificai cu ADN antic pot fi de origine endogen (din condensarea
colagenului cu zaharuri) sau pot proveni din sol. Principala component organic a solului sunt
acizii humici (Figura 17), molecule organice complexe de origine abiogen, ce se formeaz de-a
lungul timpului, prin reacie Maillard ntre molecule de resturi organice rmase n sol. n plus,
acizii humici sunt cunoscui ca fiind inhibitori ai polimerazei n PCR. Figura 18 arat spectre de
absorbie n IR ale unor acizi humici. Primele 2 casete conin imagini preluate din literatur,
caseta C conine spectrele IR ale acizilor humici conform chemicalbook.com, iar caseta D
conine spectrul de absorbie al probei G9 de ADN extras din os. Complexitatea i variaia
structurii chimice a acestor molecule duce la diferene n spectru n funcie de proprietile
solului din care provin. n plus, n probele studiate aici, acizii humici sunt n amestec cu ADN,
care contribuie i el cu mici diferene la proprietile spectrale, iar posibilitatea ca i EDTA s fi
fost copurificat nu trebuie omis.

Fig.17. Formula chimic general a acizilor humici.

Fig.18. Spectre de absorbie n IR ale unor acizi humici. A dup Rodriguez i colab., 2009; B
dup Fong i colab., 2006; C chemicalbook.com; D proba G9 de ADN extras din os.

nlturarea produilor inhibitori din extractul de ADN

S-a ncercat purificarea ADN-ului extras cu kitul SureClean Plus de la Bioline, dar fr
a folosi co-precipitantul roz, care ar fi putut da semnale spectrale care s interfereze cu
interpretarea datelor, i la UV i n IR. Diferena dintre spectrele de absorbie n IR ale probelor
nainte i dup purificare se poate observa n figura 19, unde spectrul de sus, negru, arat
transmitana probei D1 nainte de purificare, spectrul rou dup purificare, iar spectrul albastru
este diferena celor 2 spectre, fiind o vizualizare a cantitilor i tipurilor de contaminani
nlturai. Colorarea maronie a probelor a fost redus sau nlturat prin folosirea kitului, iar
spectrele confirm nlturarea unei pri din contaminani.

Fig.19. Spectrele de absorbie n IR ale probei D1, nainte i dup purificarea cu kitul SureClean
Plus de la Bioline (spectrul negru, respectiv rou) i diferena dintre acestea (spectrul albastru). Se
observ c peak-ul puternic de la 1600 cm-1 i peak-urile mai mici dintre 1400 1100 cm-1 dispar.

Valorile concentraiei de ADN citite prin spectrometrie UV nainte i dup etapa de

purificare ar trebui s fie corelate liniar, aa cum este n cazul probelor aparinnd indivizilor D

G
D

0 50 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Concentraia
nainte
0 00
00 00 00 00ADN
00 00
00 00de
00 00 00

purificarea

Concentraia ADN dup

purificarea produilor

Concentraia ADN dup

purificarea produilor

i G (Figura 20.1), dar nu ntotdeauna relaia se pstreaz (Figura 20.2). La indivizii A i B nu

exist o corelare ntre concentraiile ADN citite la spectrofotometru pentru fiecare prob. Se
poate ca din cauza faptului c nu s-a folosit co-precipitantul roz, ADN s fi fost aruncat din
anumite probe, astfel explicnd necorelarea. Cantitatea de ADN n aceste probe este prea mic
pentru a se forma un pellet vizibil, crescnd posibilitatea aruncrii materialului genetic. O alt
explicaie ar putea fi legat de degradarea ADN, fragmentele sub 100 pb fiind eliminate de kit.
Deci, dac o anumit prob coninea un raport mai mare de fragmente sub 100 pb, concentraia
de ADN dup purificare trebuie s fi sczut mai mult dect la o prob cu puine fragmente mici.
A
B

Concentraia ADN nainte de

purificarea

Fig 20.1. Corelarea liniar a concentraiilor de ADN nainte i dup purificarea cu kitul SureClean
Plus de la Bioline. 2. Probe pentru care corelarea liniar nu s-a pstrat.

Efectele etapei de purificare asupra randamentului PCR

Nu s-a reuit creterea randamentului PCR prin purificarea cu kitul SureClean Plus de la
Bioline. Urmeaz s se ncerce i alte metode de purificare a ADN, cum ar fi precipitarea cu
izopropanol (Hnni i colab., 1955), sau introducerea n procesul de extracie a PTB (Nphenacylthiazolium bromide), substan ce inverseaz reaciile Maillard.
Nici creterea concentraiei de MgCl 2 pn la 2.5 mM, i nici reducerea concentraiei
amorselor pn la 0.5 pmoli/l nu au avut efect pozitiv asupra reaciei de amplificare. Folosirea
adjuvanilor, ca BSA i 2x Polymate Additive TM (Bioline) nu au reuit s contracareze efectul
inhibitor al compuilor copurificai. S-au ncercat diferite diluii ale ADN, dar rezultatul a fost
ntotdeauna negativ. Pe toate gelurile s-au vzut dimeri de amorse, la ~50pb.
Totui, faptul c probele au fost curate eficient de compuii Maillard prin metoda
adoptat (dup cum demonstreaz rezultatele prezentate n lucrarea de fa) se contrazice cu
nereuita tuturor ncercrilor de a mbunti randamentul PCR. Se poate ca ntr-adevr ADN s
fie att de puternic degradat, nct reacia nu are matri de lungimea potrivit de la care s
porneasc, avnd n vedere faptul c populaia studiat aici are 4500 de ani vechime (conform
datrii radiometrice). Prin comparaie, la un individ ce dateaz din secolele IV V d.Cr (RusuBolinde i colab., 2014), deci cu o vechime de aproape o treime din cea a populaiei de la
Mireasa, s-au putut efectua amplificri ale fragmentelor HVR1 A, B, C, i D, folosind aditivii
BSA sau Polymate, cu 2.5 mM MgCl2 i o diluie a ADN matri de 1:30. Produsul de extracie
de la acest individ nu a fost purificat, dar tot a dat rezultate, n ciuda colorrii maronii. Aadar, se
pare c timpul petrecut de oseminte n sol are o influen asupra randamentului experimentelor
ulterioare, mai ales cnd diferenele de perioade sunt att de mari. Pentru indivizi datai la
intervale de timp apropiate, factorii de mediu sunt decisivi n procesul de diagenez, dar aici
diferena de vrst i spune cuvntul.

CONCLUZII
O comparaie ntre valorile indicilor FTIR la indivizi diferii nu se poate face n mod
relevant, fiecare dintre ei suferind un grad de diagenez diferit, n funcie de condiiile din
imediata vecintate. Se pot compara doar oase ale aceluiai individ pentru a alege varianta
optim pentru o extracie ulterioar.
n general, se recomand extragerea de ADN din oase lungi sau ale craniului, din zone
groase de os compact, care nu au fost deschise, deci au anse mult mai mici de contaminare, i n
niciun caz din oase spongioase, care dei par s conin mai mult ADN, acesta e n mare parte de
origine exogen, bacterian cel mai probabil.
O legtur impresionant s-a observat ntre valorile indicilor FTIR i vrsta indivizilor la
moarte. Astfel de tehnici pot veni cu mult n ajutorul metodelor clasice de atribuire a vrstei.
S-au identificat compuii colorai din extrasul de ADN, puternici inhibitori ai PCR, ca
fiind acizi humici, probabil n amestec cu EDTA.
Prin purificri suplimentare ale ADN se poate reduce cantitatea de substane coextrase
nedorite care inhib PCR, dar apare i riscul reducerii cantitii de material genetic din probe.
La populaia de la Mireasa, datnd din epoca Bronzului, nu s-a reuit amplificarea nici
unui fragment de ADN mitocondrial, motivul cel mai probabil fiind vechimea oaselor.

Studiul II.
Diagnosticul molecular al tuberculozei la o populaie gotic din Gherseni,
Romnia
Din necropola de la Gherseni, judeul Buzu, au fost deshumai doi indivizi, notai M3 i
M4, despre care s-a presupus c au fost afectai de boala lui Pott (tuberculoz osoas). Pentru c
au trit n aceeai perioad, o boal infecioas ar putea uor s explice distribuia acelorai
simptome ntr-o comunitate restrns. Dat fiind lipsa dovezilor patognomotice, scopul acestei
lucrri experimentale a fost confirmarea sau infirmarea prin metode moleculare a prezenei
tuberculozei. Lumea tiinific este preocupat de secvenarea ADN-vechi provenit din
organisme patogene deoarece astfel se poate identifica rata mutaiilor n situsuri implicate n
patogenitate. Dat fiind dezvoltarea n ultimele decenii a tulpinilor MDR i XDR de M.
tuberculosis, este important identificarea mecanismului de achiziie a rezistenei la antibiotice.
Dei experimentul n discuie nu va putea rspunde la aceast ntrebare, el i propune s
confirme existena tuberculozei n acea populaie antic i astfel va pune bazele unui studiu mai
aprofundat.
Analiza antropologic
Analiza antropologic s-a realizat pe baza unor standarde de antropologie fizic pentru
exist grile de atribuire a scorurilor pentru fiecare marker osteologic (Brickley i McKinley,
2004). Vrsta este determinat folosind suturile craniene, uzura suprafe ei auriculare i a simfizei
pubiene. Pentru stabilirea sexului se iau n calcul: markerii cranieni: glabela, protuberana nucal
i mental, linia supraorbital, procesul mastoid; markerii pelvieni: arcul ventral, concavitatea
subpubiana, aspectul ramurii ischiopubiene i al sulcusului. Se pot semnala i unele patologii
care afecteaz osul, dar toate caracterele determinate prin antropologie fizic sunt probabilistice.
n afar de vrst, celelalte ipoteze pot fi confirmate prin metode moleculare.
Pstrarea condiiilor de sterilitate
Pentru a se evita contaminarea probelor cu ADN-modern sunt urmate reguli stricte de
procedur n laboratoare. Etapele de burghiere a osului, extracie de ADN -vechi i amplificare
prin PCR i electroforez, sunt separate fizic, realizndu-se n laboratoare diferite. Toate
laboratoarele de ADN-vechi se afl la un etaj al institutului unde nu exist laboratoare n care s
se lucreze cu ADN-modern. Cele trei laboratoare de ADN-vechi sunt dotate cu filtre cu UV i
lmpi de UV. Filtrele funcioneaz non-stop iar lmpile de UV sunt pornite pe timpul nopii dar
i n timpul zilei atunci cnd se ncheie munca la un individ i se trece la altul. Se lucreaz n
hote cu presiune pozitiv i lmpi cu UV. Personalul este echipat cu combinezo ane, mti cu
filtru, mnui. Exist un circuit al personalului, astfel c nu se intr n laboratorul de extracie
dup ce s-a lucrat n cel de PCR.
Analiza FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy)
Probele pentru analiza FT-IR au fost prelevate din vertebre i coaste, zone preponderent
afectate de tuberculoz. n plus, s-au testat probe din oasele lungi (ex. radius) ca i control
negativ. 0,8 mg pudr de os s-au amestecat cu 150 mg KBr i s-au mojarat folosindu-se mojar i
pistil din agat. Proba se comprim cu ajutorul unei prese hidraulice pn la presiunea de 175
kg/cm2 pn cnd se formeaz o pastil translucid. n urma spectroscopiei se obine un spectru

ntre numerele de und 400 - 4000 cm-1. Pentru fiecare prob s-a fcut blank-ul cu o prob
compus doar din Kbr iar baseline-ul a fost corectat. Dup prelucrarea fiecrei probe s-au cutat
semnalele specifice date de acizii micolici. Oasele pentru extracia ADN au fost selectate pe
seama spectrului FT-IR. Pentru fiecare prob s-a calculat indicele de cristalinitate (infrared
splitting factor) ca raportul dintre absorbanele (A) la numerele de und (A565+A605)/A588.
Aceast valoare este important pentru c se afl n corelaie cu dimensiunea cristalelor de
hidroxiapatit. S-a calculat i raportu l dintre carbonat/fosfat (A1415/A1035) care ne spune ct
anume din carbonat s-a pierdut, probabil n urma dizolvrii n sol. Cantitatea de colagen pstrat
n oase se poate deduce pe seama raportului A1660-A1645/A1035. Aceast valoare este
proporional cu cantitatea de ADN-endogen pstrat. Toate aceste valori se folosesc atunci cnd
se alege o prob de os pentru extracia ADN.
Protocolul de extracia al ADN-vechi
Decontaminarea
Probele alese pentru extracia ADN-vechi au fost tratate pentru a ndeprta contaminarea
cu ADN modern de la suprafata oaselor. Oasele au fost splate cu ap UV/UP, uscate i iradiate
pe fiecare parte cu UV pentru 20 min. Suprafaa osului a fost ndeprtat cu o frez dentar
steril i osul a fost iradat pentru nc 10 min.
Decalcifierea i ndeprtarea colagenului de tipul I
Osul decontaminat a fost transformat n pulbere cu ajutorul unei freze dentare sterile i a
unui micromotor rulat la vitez mic pentru a se evita degradarea ADN-vechi prin nclzire. 200
mg pudr de os au fost incubate peste noapte la 56oC cu 1mL soluie de decalcifiere (0.5 M
EDTA pH 8.08.5; 0.5% SDS; 50 mM Tris HCl pH 8.0; 1 mg/ml proteinaza K).
Extracia cu fenol-cloroform
1. Probele incubate peste noapte au fost centrifugate 5 min la 6.000 rpm.
2. S-a transferat supernatantul ntr-un tub Eppendorf nou i s -a adugat un volum egal de fenolcloroform-alcool izoamilic (25:24:1) i s-a agitat.
3. Probele au fost centrifugate 15 min la 6.000 rpm.
4. S-a preluat faza apoas, fr s se ating faza organic, i s-a transferat ntr-un tub nou. S-a
adugat un volum egal de fenol-cloroform-alcool izoamilic (25:24:1) i s-a agitat. Probele au fost
centrifugate 15 min la 6.000 rpm.
5. S-a transferat faza apoas ntr-un tub nou i s-a adugat un volum egal de cloroform, apoi
tuburile s-au agitat. Tuburile au fost centrifugate 15 min la 6.000 rpm.
6. Faza apoas s-a transferat ntr-un tub nou. S-au adugat 1/10 volume de CH3-COONa 3M, pH
5.2 i 2,5 volume de etanol absolut.
7. Probele au fost inute la -80oC pentru 10 min (o alternativ: 30 min la -3oC).
8. Tuburile se centrifugheaz 15 min la 12.400 rpm.
9. Supernatantul s-a ndeprtat cu pipeta, iar pellet-ul s-a splat cu 1 mL etanol 80% i a fost
centrifugat 15 min la 12.400 rpm. S-a repetat pn cnd s-a format un pellet stabil*.
Deoarece ADN-vechi este foarte contaminat cu substane din sol, e posibil s fie necesari mai mult de trei
pai de splare.
*

10. Pellet-ul a fost uscat la 37oC pentru a se ndeprta orice urm de etanol.
11. ADN a fost resuspendat n 50 L ap PCR Grade sau tampon TE.

Cuantificarea ADN-vechi extras

Cantitatea de ADN din fiecare prob a fost cuantificat prin dou metode: electroforez
n gel de agaroz i spectrofotometrie.
Electroforez n gel de agaroz
Deoarece ADN-vechi este foarte degradat i se gsete aprope n totalitate n fragmente
de 50-200 pb, s-a preparat un gel cu concentraia de 2% agaroz. 100 mL tampon TAE se
amestec cu 2 g agaroz ntr-un pahar Erlenmeyer. S-a topit agaroza folosindu-se un cuptor cu
microunde. S-a lsat s se rceasc amestecul i s-au adugat 5 L bromur de etidiu (10mg/mL)
pentru a se ajunge la concentraia final de 0,5 g/mL. ADN-vechi s-a ncrcat n godeuri. Se
migreaz cu 5-10 V/cm (distana dintre electrozi). ADN s-a vizualizat prin iradierea gelului cu
UV ntr-un transiluminator (Barbas et al., 2001).
Spectrofotometrie
Acizii nucleici absorb radiaia luminoas cu lungimea de und de 260 nm, proteinele
absorb la 280 nm iar fenolul la 230 nm. Pentru aceast analiz este necesar proba de ADN ce se
dorete cuantificat, o prob martor (apa sau tamponul TE n care s -a resuspendat ADN) i un
spectrofotometru (NanoDrop Spectrophotometer). Suprafaa optic superioar i inferioar s -a
splat cu ap UV/UP. S-a deschis software-ul aparatului i s-a selectat modulul - acizi nucleici.
Mai nti se citete o prob de ap. Apoi se citete proba martor prin adugarea a 1 -2 L pe
suprafaa optic i selectarea butonului - Blank. Apoi s-au adugat cte 1-2 L din probele de
ADN i s -a selectat opiunea - Measure. Dup fiecare msurtoare suprafeele optice au fost
splate cu ap UV/UP. Pentru o cuv cu latura de 1 cm, o soluie pur de ADN dublu-catenar cu
concentraia de 50 ng/L are densitatea optic (OD 260) egal cu 1. Pe baza acestei corelaii,
aparatul afieaz concentraia de ADN existent n probe. Valoarea optim pentru raportul
260/280 este cuprins ntre 1.8 - 2. O valoare mai mic este interpretat ca o contaminare cu
proteine, iar una mai mare indic prezena ARN sau a ADN mono -catenar (Barbas et al., 2001).
PCR (Reacia n lan a polimerazei)
Pentru confirmarea tuberculozei s-a dorit amplificarea unor secvene de ~100 pb din
locii: pncA, oxyR, IS1081 i D1. Amorsele au fost concepute de Taylor i colab. (2005) cnd au
investigat cazul de la Tarrant Hinton. Acetia au descris i condiiile de reacie (Tabelul 1 ).
Tabelul 1. Condiiile de reacie descrise de Taylor i colab. (2005)

Pentru fiecare set de amorse s-a realizat un control pozitiv folosind ADN-genomic de la
M. tuberculosis primit de la Institutul Cantacuzino, Romnia. Reaciile pentru ADN modern i
vechi s-au realizat n laboratoare diferite (aflate la etaje diferite) ale institutului pentru a se evita
contaminarea i obinerea de rezultate fals-pozitive.
Pentru c randamentul reaciilor pe ADN-vechi este sczut, pentru fiecare set de amorse
s-au realizat dou reacii succesive, la al doilea PCR folosindu -se 1 L din produsul primului.
Am adaptat reaciile crescnd temperatura de aliniere la pncA i IS1018 cu 2oC. Aceasta ne-a
ajutat c cretem specificitatea reaciilor. Am folosit BSA (albumin seric bovin), PEG
(polietilen glicol) i DMSO (dimetil-sulfoxid) ca i aditivi pentru a crete randamentul reaciei.
Pentru fiecare PCR s-au realizat 30 de cicluri.
Purificarea ADN din gelul de agaroz
Produii PCR s-au migrat n gelul de agaroz urmnd metoda descris mai sus. Etapa de
purificare a ampliconilor din gel s-a realizat cu ajutorul kitului Agarose Gel extraction Kit, Jena
Bioscience.
Clonarea produilor PCR
Aceast etap s-a realizat folosind kitul CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo
Scientific. Am folosit protocolul de clonare cu capete boante (Blunt-End Cloning Protocol).
Prima dat s-au digerat capetelor adezive prin realizarea mixului: 2X tampon de reacie - 2 L,
H2O - 1.5 L i DNA Blunting Enzyme - 0.5 L. Amestecul s-a vortexat, centrifugat apoi s-a
incubat la 70oC pentru 5 min. Probele s-au rcit pe ghea. Reacia de ligare s -a realizat prin
adugarea la amestec a 0,5 l pJET1.2/blunt Cloning Vector (50 ng/l) i 0,5 l T4 DNA -ligase.
Tuburile s-au vortexat, centrifugat i incubat la temperatura camerei pentru 30-60 min. Pentru
clonare s-a realizat urmtorul amestec: KCM 5X - 20 L, H2O - 70 L, Produs de ligare - 10
L. Celulele competente s-au scos de la -80oC i s -au dezgheat pe ghea. 100 L suspensie de
celule competente s-au adugat la amestecul descris mai sus. Tuburile s-au pstrat pe ghea
pentru 20 min, apoi la temperatura camerei pentru nc 10 min. S-a adugat peste amestec 1 mL
mediu LB lichid. Tuburile s-au inut la 37 oC pentru 20 min. 200 L amestec s-a folosit pentru
inocularea plcilor cu agar. Acestea s-au incubat la 37oC pentru ~16 ore.
* Prepararea mediului LB (Lysogeny broth) - lichid: 25 g LB - 1000 mL H2O
- solid: 15 g agar la 1000mL H2O
- antibiotic - Ampicillin (100mg/mL) se adaug pentru un volum final de 100 g/mL.
* Prepararea KCM 5X: 2M KCl - 2.5 mL, 1M MgCl2 - 2.5 mL, 1M CaCl2 - 1.5 mL, H2O
- 3.5mL.
Pentru preculturi se toarn 5 mL mediu LB lichid cu Ampicilin n tuburi de 15 mL
pentru preculturi. Acestea se inoculeaz cu o colonie de pe placa Petri. Preculturile se incubeaz
la 37oC, cu agitare 200 rotaii/minut, pentru ~16 ore.
Purificarea de plasmide
Aceast etap s-a realizat utiliznd kitul Fast-n-Easy Plasmid Mini Prep Kit, Jena
Bioscience. ADN s-a eluat n 50 L tampon de eluie.

Secvenializarea ADN
Procedura de secvenializare a plasmidelor s -a realizat de ctre Macrogen Company,
Netherlands. Pentru reaciile de secvenializare s-au folosit amorsele specifice ale plasmidului
pJET 1.2.
Analizele bioinformatice
Produii PCR s-au identificat n interiorul secvenelor vectorilor prin cutarea amorselor
folosite la PCR utiliznd software-ul BioEdit 7.2.5. Fiecare secven s-a identificat prin
comparare cu cele existente n GenBank (NCBI) folosind instrumentul BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) cu opiunea blastn.
n cazul genei pncA, atunci cnd nu s-a obinut niciun rezultat folosindu -se parametrul
Highly similar sequences, am schimbat parametrii algoritmului astfel: Program selection:
Somewhat similar sequences; Expect threshold: 15; Word size: 7; Match/Mismatch Scores: 2,-3;
Gap Costs: existence 2, extension 2 i s-a deselectat Low complexity regions filter. Secvenele
obinute s-au aliniat cu toate secvenele omoloage din genul Mycobacterium din baza de date
Gene folosindu-se algoritmul Muscle n Mega 5. Ca i secven outgroup s-a folosit secvena
omoloag a genei pncA de la Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Alinierea a fost
exportat n formatul MEGA, necesar pentru construirea de arbori filogenetici. Am rulat n Mega
5 opiunea Models - Find Best DNA/Protein Models (ML) i am stabilit c trebuie folosit
modelul evolutiv Tamura 3 cu distribuie discret Gamma.
Istoria evolutiv a secvenelor a fost calculat prin metoda Maximum Likelihood
(Tamura, 1992). Arborele final este cel cu cea mai mare valoare log likelihood (-684.5563).
Procentul arborilor n care secvenele au fost asociate n acelai cluster este afiat n dreptul
ramurilor (valoarea Bootstrap). Lungimea ramurilor este proporional cu numrul de
substituii/situs. Toate poziiile cu gap-uri au fost eliminate astfel c n setul final au fost luate n
considerare 73 de poziii. Au fost analizate n total 45 de secvene nucleotidice (Tamura i colab.,
2011).
Analiza antropologic
Din necropola de la Gherseni au fost deshumate resturile osteologice a trei indivizi. Pe
baza standardelor de antropologie fizic s-au dedus urmtoarele aspecte:
Individul M3 (M - mormnt)
a. Reprezentarea. Din craniu s-a pstrat doar calota cranian. Vertebrele cervicale,
toracale i lombare, precum i coastele, s-au pstrat n proporie de 1/3. Sternul nu este
prezent. Dintre oasele lungi se pstrez partea proximal a humerusului de pe partea
stng, partea distal a celui de pe dreapta, regiunea medial i proximal a radiusului de
pe dreapta. Omoplatul drept este mai bine reprezentat dect cel stng. Clavicula de pe
partea dreapt este ntreag.
b. Conservarea. n general suprafaa oaselor arat bine, iar conservarea a primit scor
maxim.
c. Sexul. Patru din cei 5 markeri osteologici cranieni lipsesc (glabela, creasta nucal,
marginea supraorbital, mentonul). Mastoida a fost notat cu scorul 2 (1-feminin; 5masculin), valoare corelat cu genul feminin. Niciunul din markerii pelvieni nu este
reprezentat.
d. Vrsta. Markerii osteologici lipsesc. Aspectul general spune c individul a ajuns la
maturitate.

e. Patologia. Se observ o artroz puternic pe partea proximal a humerusului stng.

Artroza a afectat i vertebrele cervicale i toracale, ducnd la distrugerea plato ului
superior i inferior. Dou din vertebrele toracale sunt unite - corpurile vertebrale lipsesc
dar procesele spinoase se pstreaz (Figura 1). Procesele spinoase sudate, o vertebr
cervical i dou coaste (stnga i dreapt) au fost supuse analizelor fizice i moleculare.

Figura 1. A. Epifiza proximal a humerusului stng afectat de artroz; B. Apofizele spinoase a dou
vertebre toracale sudate ntre ele; C. Platouri vertebrale afectate de artroz; D. Faa anterioar a unei
vertebre cervicale afectat de artroz.

Individul M4
a. Reprezentarea. Pentru c scheletul este aproape complet vom meniona doar oasele
care lipsesc: oasele minii (dreapta i stnga), vertebrele cervicale C1, C3, C5 i toracale
T1, T12, ischiumul i pubisul, femurul stng, patelele, talusul i calcaneul (dreapta i
stnga), oasele labei piciorului (dreapta).
b. Conservarea. n general conservarea este foarte bun.
c. Sexul. Scorurile acordate markerilor osteologici sunt prezentai n Tabelul 2. Se
presupune c individul avea genul feminin dar acest aspect urmeaz a fi clarificat prin
tehnici moleculare.
Tabel 2. Scorurile acordate individului M4 markerilor osteologici asociai genului.

CRANIU
Creasta nucal
Mastoida
Marginea supraorbital
Glabela
Mentonul

Scor (1=; 5=)

3
3
3
3
4

PELVIS
Concavitatea subpubian
Unghiul subpubic
Ramura ischio-pubian
Arcul ventral
Arcul compozit
Incizura sciatic
Sulcusul preauricular

Scor (1=; 9=)

4
2
6
7
7
9

d. Vrsta. Vrsta individului s-a estimat pe baza markerilor din Tabelul 3 ca fiind
cuprins ntre 38-58 ani.

Tabel 3. Estimarea vrstei individului M4 pe baza markerilor osteologici.

Marker osteologic
Capetele sternale
Simfiza pubian
Suprafaa auricular
Sinostoza suturilor
Uzura dentar

Vrsta estimat
43-58
38
45-47
45-56
40-45

e. Patologia. Se observ sudarea urmtoarelor perechi de vertebre: C6 i C7, T7 i T8,

T10 i T11. Platoul inferior al vertebrei lombare L5 este complet distrus, la fel i platoul
superios la S1. n aceste regiuni esutul compact lipsete iar cel spongios este expus
(Figura 2). Aceste modificri s-a presupus c ar fi cauzate de boala lui Pott (tuberculoz
localizat n oase).

Figura 2. Probe din care s-a extras ADN pentru confirmarea diagnosticului de tuberculoz. A. Vertebra
L5 cu platoul inferior distrus n comparaie cu (B) o vertebr sntoas; C. Vertebre toracale sudate
versus dou vertebre dispuse anatomic.

Individul M5
a. Reprezentarea. Din individul M5 se pstreaz n mic msur calota cranian,
vertebrele toracale, lombare i coastele. Manubriul este ntreg dar din corpul sternal s -a
conservat doar jumtatea superioar. Omoplatul drept este ntreg, la fel ca i humerusul ,
radiusul i ulna de pe partea dreapt. Clavicula stng este prezent n ntregime.
b. Conservarea. Oasele sunt conservate foarte bine, avnd scor maxim.
c. Sexul. Se pstreaz un singur marker osteologic asociat sexului, creasta nucal, creia i
s-a acordat scorul maxim masculin.
d. Vrsta. Estimarea vrstei la 33-42 ani s-a realizat doar pe baza capetelor sternale ale
coastelor, fiind singurul marker existent.
e. Patologia. Individului M5 nu i s-a asociat nicio patologie.

Analiza FT-IR
Datorit deformrilor osoase ale indivizilor M3 i M4 s-a presupus c ambii ar fi putut
suferi de tuberculoz. Acesta este un diagnostic realist deoarece o boal infecioas ar fi o bun
explicaie pentru aceeai simptomatologie existent n aceeai perioad i ntr -o singur
necropol. S-au prelevat probe pentru FT-IR din aceti doi indivizi, att din oase afectate de
boal ct din cele care preau neafectate. n spectrul obinut s -au identificat peak-uri asociate
acizilor micolici (Figurile 3, 4), precum: absorbana gruprii metilen la 2955 cm-1, a gruprii
metil la 2860 cm-1i deformarea lanurilor alifatice cu caten lung la 722 cm -1 (Coates, 2000;
Mark i colab., 2009; Rafidinarivo i colab., 2009). Aceste rezultate ns, nu au valoare de
diagnostic. Mark i colab. (2009) au testat probele lor pentru confirmarea tuberculozei i prin
MALDI-TOF-MS. Minnikin i colab. (2011a, 2011b) i Gernaey i colab. (2001) s -au folosit de
tehnica HPLC pentru stabilirea patologiei. Datele obinute de noi la FT-IR s-au folosit n
selectarea oaselor din care s-a extras ADN, pe baza raionamentului c dac exist acizi micolici
n acestea, probabil se gsete i ADN-vechi provenit de la MTBC.

Figura 3. Spectrul FT-IR al unui individ sntos versus M3, presupus a fi infectat cu MTBC.

Figura 4. Spectrul FT-IR al unui individ sntos versus M4, presupus a fi infectat cu MTBC.

Spectrul FT-IR se utilizeaz i pentru stabilirea indicelui de cristalinitate (CI) a

hidroxiapatitei. Acesta se calculeaz ca raportul (A 595+A605)/A588 dintre suma absorbanelor
fosfatului (atunci cnd legturile covalente P-O sunt ndoite antisimetric, iar aceasta rezult ntro degenerare a semnalului de la numerele de und 600 cm -1, la 595 cm-1i 605 cm-1), i valoarea
minim dintre ele (Termine i Posner, 1966). Aceast valoare se coreleaz cu gradul de
diagenez suferit de esutul osos astfel c, cu ct acest raport este mai ma re, cu att este mai mare
dimensiunea cristalelor. Comparaiile ntre oasele actuale i cele antice au artat c CI n cazul
primelor nu depete valoarea de 2,7 pe cnd cele vechi au n general peste 3. Oasele fosilizate
pot avea valori de pn la 4,1 sau chiar 7 n cazul dinozaurilor (Berna i colab., 2004). Totui, n
cazul indivizilor afectai de tuberculoz, acest raport este diminuat fa de valoarea ateptat
(Nagy i colab., 2008). Valoarea CI a individului M3 este de 3.04 iar a lui M4 de 2.65.
Un alt parametru calculat este raportul carbonat/fosfat (C/P) care indic ce cantitate de
fosfat s-a pierdut din HA i a fost nlocuit de carbonat. n cazul oaselor infectate cu MTBC s-a
observat o modificare a acestui parametru. Aceast raport are media n jurul valorii de 0,23 la
indivizii sntoi, dar n infeciile cu tuberculoz valoarea medie este mult crescut datorit
calcifierii oaselor. Nagy i colab. (2008) au calculat o medie de 0.47 a raportului C/P pentru
indivizi afectai de tuberculoz, iar media calculat de noi pentru indivizii de la Gherseni este de
0.50 (M3) i respectiv 0.53 (M4).
Coninutul de colagen (C/C) este un alt indice care se poate calcula din spectrul FT-IR.
Acesta reprezint cantitatea de colagen pstrat n matricea osoas. Se calculeaz ca raportul
dintre absorbanele amidei I i PO 4 (A1640/A1035). O valoare de 0,2 corespunde la 15 wt%
(procente de mas) iau una de 0,8 la 30 wt% materie organic n os (Lebon i colab., 2010). Noi
am presupus c exist o relaie proporional ntre cantitate de colagen din os i cea de ADNvechi. Indivizii M3 i M4 au avut valoarea C/C de 0,3 respectiv 0,5, acestea sugernd c exist
posibilitatea izolrii ADN-vechi endogen.

Extracia de ADN-vechi
Dup extracia cu fenol-cloroform conform protocolului descris, ADN a fost precipitat cu
i
etanol s-a observat depunerea unui precipitat brun-negricios. Acesta s-a resuspendat n 50 L
ap PCR Grade, iar 8 L au fost migrai n gel de agaroz 1,5% (Figura 5).

Figura 5. Electroforegrama obinut n urma migrrii ADN-vechi extras din individul M4; 1.
ADN extras dintr-o coast; 2. ADN extras din vertebre sudate; 3. control negativ de extracie.

Deoarece s-au obinut rezultate similare la extracii succesive din acelai individ, M4, dar
i din M3, s-a ataat doar Figura 9. Se poate observa n gelul de agaroz un smear de ADN
datorat degradrii n diagenez, astfel c majoritatea fragmentelor au o dimensiune mai mic de
50 pb. Mai mult, s-a observat n lumin UV o fluorescen albastr. Numeroase surse au raportat
acest aspect i s-a artat c fluorescena este datorat produilor Maillard. Acetia se formeaz n
timpul diagenezei, prin cross-linkarea colagenului de tipul I cu acizii humici infiltrai din sol n
oase. Acetia migreaz mpreun cu ADN n gelul de agaroz iar n PCR au un efect puternic
inhibitor. Kalmr i colab. (2000) i Hnni i colab. (1995) au ncercat ndeprtarea acestor
compui n timpul extraciei prin nlocuirea eta nolului cu izopropanol i au observat o diminuare
a semnalului fluorescent, dar inhibiia PCR poate fi evitat i prin diluarea ADN de 10 - 100x
(Herrmann i Hummel, 1994).
Rezultatele amplificrilor prin PCR
Hnni i colab. (1995) au testat inhibiia produilor Maillard prin realizarea unui PCR
unde au adugat 1L ADN-vechi la mixul de reacie, iar ca ADN matri au pus ADN-modern.
Ei au observat c acel 1 L a fost suficient pentru a inhiba reacia, chiar dac ADN- matri era
intact. Pentru a stabili la ce diluii activitatea polimerazei este restabilit, am diluat ADN-vechi
extras din dou vertebre sudate ale individului M3 de 25x, 50x, 75x, 100x. Iniial, la migrarea
ADN-vechi n gelul de agaroz s-a observat o puternic fluorescen albastr. Rezul tatul acestui
PCR se poate observa n Figura 6. Astfel, atunci cnd o prob de ADN-vechi extras avea o
fluorescen albastr puternic, s-a stabilit ca la PCR s se folosea o diluie a acestuia de 50x.

Figura 6. Amplificarea fragmentului de 117 pb din gena pncA cu amorsele F2-R2; se observ c diluia
de 50x este suficient pentru ca inhibiia datorat produilor Maillard s fie depit; se observ c diluia
de 75x i 100x este prea mare, motiv pentru care ADN -matri lipsete.

Gena pncA (pirazinamidaza/nicotinamidaza)

Dup mai multe testri s-a constatat c 3 L de ADN-vechi sunt suficieni pentru o
amplificare PCR ntr-un volum final de 25 L. S-au realizat dou amplificri succesive cu
amorsele F2-R2 (vezi Tabelul 2). n prima reacie s-a adugat BSA la un volum final de 1
mg/mL. Acest aditiv nu las ca ADN matri s adere la pereii tubului n care are loc reacia,
aspect important mai ales atunci cnd concentraia acestuia este sczut, i scade efectul inhibitor
al acizilor humici (Pbo i cola b., 1988; Farell i Alexandre, 2012; Simonovi i colab., 2012).
Alinierea amorselor s-a fcut la 60oC n prima reacie i la 62 oC n cea de-a doua, pentru a se
crete specificitatea. n a dou reacie s-a folosit ca i matri 1 L din produsul reaciei
precedente. Electroforegrama pentru amplificarea pncA F2-R2 folosindu-se ADN extras din M4
poate fi observat n Figura 7.

Figura 7. Produii PCR amplificai cu amorsele pncA F2-R2 i cu ADN matri extras din individul M4;
s-a obinut amplificare specific doar din oase afectate de tuberculoz (coast i vertebr); a fost testat i
ADN extras din radius, dar nu s-a obinut amplificare; controalele de extracie i de PCR sunt curate,
dovedind lipsa contaminrii cu ADN modern; benzile cu dimensiune mai mic de 50 pb s-au constatat a fi
dimeri de amorse.

Rezultate similare au fost obinute i pentru M4. Produii au fost purificai din gelul de
agaroz folosindu-se kitul Agarose Gel extraction Kit - Jena Bioscience, apoi au fost clonai cu
ajutorul kitului CloneJET PCR Cloning Kit - Thermo Scientific.
Pseudogena oxyR
n reacia de amplificare a fragmentului de 110 pb din pseudogena oxyR s-au folosit 2 L
de ADN matri. Concentraia final n mixul de reacie a MgCl 2 a fost crescut de la 1,5 mM la
2mM deoarece iniial nu s-a obinut nicio amplificare. Ca i n cazul pncA s-a adugat ca i

aditiv BSA (1 mg/mL) n reacia iniial. n a doua reacie s -a folosit 1 L din produsul primului
PCR. Rezultatele pot fi observate n Figurile 8 i 9 .

Figura 8. Electroforegrama produilor de PCR oxyR F3-R1 pentru individul M3; se observ c cea mai
bun amplificare a rezultat din ADN provenit din vertebra afectat diluat de 50x; exist amplificare i n
controlul de extracie, dar controlul de PCR este curat, ca urmare se exclude posibilitatea contaminrii cu
ADN-modern.

Figura 9. Electroforegrama produilor de PCR oxyR F3-R1 pentru individul M4; v - vertebr; s-a obinut
amplificare specific pentru probe din coast, vertebre, dar i n controlul de PCR. Deoarece nu exist
amplificare n controlul de extracie, se consider c nu a existat contaminare cu ADN -modern, dar
probabil a intervenit o eroare de manipulare.

Produii PCR au fost purificai din gel cu kitul de la Jen a Bioscience. Pn acum au fost
i
clonai secvenializai doar cei de la individul M3, cei de la individul M4 urmnd a fi clonai
ulterior.
Deleia TbD1
S-a ncercat amplificarea unui fragment care flancheaz deleia D1, folosindu-se
amorsele F-R2. Deoarece la concentraia de 2 mM MgCl 2 nu s-a obinut nicio amplificare, s-a
crescut concentraia la 2,5 mM. S -au folosit 2 L ADN matri, iar n cazul ADN extras din
vertebr s-a folosit o diluie de 50x. Ca i n cazurile anterioare, n prima amplificar e s-a folosit
BSA (1 mg/mL) (Figura 10).

Figura 10. Electroforegrama ampliconilor D1f F-R2 pentru individul M3; c - coast, v - vertebr, r radius; se observ c s-au obinut trei ampliconi de marimi diferite; fiecare band a fost purificat din gel,
urmnd a fi clonat; controalele de extracie i de PCR sunt curate, de aceea se elimin posibilitatea
contaminrii cu ADN-modern.

Prezena deleiei TbD1 face diferena ntre cele dou tipuri de tulpini M. tuberculosis:
ancestrale i moderne. De fapt, ambele tipuri exist astzi, aa cum arat un studiu realizat n
India, ar responsabil pentru 21% din cazurile globale de tuberculoz. Stavrum i colab. (2009)
au testat 65 de izolai de M. tuberculosis i au realizat c 26,2% aveau regiunea TbD1 intact.
Pn acum, am reuit obinerea unor produi PCR folosind amorse care flancheaz deleia, dar
testm i un set de amorse interne. Pn acum am obinut o amplificare specific n blankul de
extracie. Presupunem c n probe nu avem amplificare datorit produilor Maillard. Urmeaz s
optimizm reacia prin diluii succesive i utilizarea aditivilor. Dei avem un rezultat pozitiv n
controlul negativ de extracie nu credem c poate fi vorba de o contaminare cu ADN modern de
M. tuberculosis din controlul pozitiv deoarece acesta a fost testat anterior i este TbD1 +.
Analiza bioinformatic
Toate plasmidele secvenializate au fost prelucrate cu software-ul BioEdit 7.2.5.
Ampliconii PCR identificai au fost comparai cu cei din GenBank (NCBI) folosindu -se opiunea
blastn. Atunci cnd nu s-a obinut niciun rezultat folosind setrile automate ale blastn, ele au fost
modificate conform descrierii de la materiale i metode. n continuare vor fi descrise analizele
bioinformatice pentru fiecare amplicon PCR n parte.
Gena pncA
Fragmentele pncA obinute de la secvenializare au fost cu 10 nucleotide mai scurte dect
fragmentul ateptat. Parametrii blastn au fost modificai, aa cum s-a descris la Materiale i
metode, astfel nct s se conformeze unui ADN-vechi foarte degradat ca urmare a diagenezei.
Primele 22 de rezultate blastn pot fi observate n Figura 11.

Figura 11. Rezultatele obinute la blastn prin compararea secvenelor pncA F2 -R2 cu secvenele din
GenBank.

Dei primele rezultate nu aparin grupului MTBC ele pot fi excluse deoarece alinierile au
acoperire mic. Singurele rezultate cu acoperire de 100% aparin speciei M. tuberculosis, i au o
identitate de 68-70% cu fragmentul omolog modern pncA.
Ulterior, pentru a susine ncadrarea secvenelor de ADN-vechi la grupul MTBC, am
descrcat toate secventele genei pncA ale genului Mycobacterium depuse n baza de date Gene.
Am descrcat att secvenele speciilor patogene ct i a celor ambientale. Am aliniat secvenele
obinute de noi, din oase, extracii sau indivizi diferii cu cele existente n bazele de date. Pentru
aliniere am folosit algoritmul ClustalW n Mega 5 (Figura 12).
Se pot observa din aliniere, trei deleii care se pstreaz n dreptul situsurilor 29-31, 53-57
i 95-96. Acele deleii nu puteau aprea n diferite zone din corp i mai ales la indivii diferii ca
urmare a diagenezei pentru c acesta este un proces randomic. Dar ele ar putea fi explicate de
apariia buclelor n moleculele monocatenare de ADN. Aa cum se poate observa n Figura 9,
ADN-vechi extras de noi este deja foarte degradat i fragmentat. Forma cea mai stabil a ADN
este aceea de dublu-helix supra-rsucit, dar n momentul fragmentrii orice supra-rsucire este
nlturat. Astfel, ADN este mult mai uor de denaturat (Cox i colab., 201 0). Mai mult, se tie
c extracia cu fenol - cloroform - alcool izoamilic este una agresiv (Ausubel i colab., 1995) iar
fenolul oxidat cauzeaz degradarea i ruperea catenelor de ADN. De aceea am presupus c n
timpul extraciei s-ar putea forma monocatene de ADN, care ar putea adopta structuri secundare
(Liang i colab., 2006).
Toate PCR s-au realizat cu Taq-polimeraza, iar o serie de articole au analizat activitatea
acesteia n momentul n care ntlnete o bucl n molecula de ADN-matri (Viguera i colab.,
2001; Canceill i Ehrlich, 1996; Levinson i Gutman, 1987 ). S-a artat c polimeraza poate ignora
nucleotidele implicate n formarea buclei astfel c n molecula rezultat va exista o deleie
aproximativ egal cu dimensiunea buclei (Figura 13).

Figura 13. Reprezentarea schematic a modelului prin care Taq-polimeraza induce la locul de formare a
unei bucle apariia unei deleii n molecula de ADN (dup Viguera i colab., 2001)

Pentru a observa dac fragmentul de 117 pb formeaz structuri secundare de tipul

buclelor am folosit aplicaia DNA Folding Form a The Mfold Web Server. S-a setat concentraia
MgCl2 folosit n PCR. Rezultatul modelrii 2D poate fi observat n Figura 14. Se poate observa
c cele trei bucle evideniate (A, B i C) se suprapun peste cele trei deleii n alinierea multipl
din Mega 5.

Figura 14. Modelarea 2D a fragmentul de 117 pb al genei pncA de la M. tuberculosis folosind aplicaia
DNA Folding Form a The Mfold Web Server.

Datorit divergenei observate n alinierea multipl ntre secvenele de ADN -vechi i cele
moderne, ncadrarea secvenelor de ADN-vechi n MTBC are nevoie de dovezi suplimentare.
Astfel s-a formulat ipoteza c dac ntru-un arbore filogenetic secvenele noastre s -ar grupa cu
cele ale MTBC i nu cu secvenele provenite de la specii ambientale, atunci cel mai probabil
divergena este cauzat de degradarea din timpul diagenezei i nu este datorat apartenenei lor la
o specie diferit.
Pentru a se afla modelul evolutiv care ar putea explica cel mai bine datele observate, am
rulat n Mega 5 opionea Find Best DNA/Protein Models (ML). S-a folosit n construcia
arborelui prima opiune raportat: Tamura 92 (Tamura 3 - parameter cu distribuie discret
Gamma) cu cel mai mic scor BIC (Bayesian Information Criterion).Un scor BIC mic implic
existena unui numr sczut de variabile explicative necesare pentru justificarea datelor obinute
(Baxevanis i Ouellette, 2001).

Figura 12. Alinierea multipl a secvenelor pncA obinute de noi i a celor din baza de date Gene ale genului Mycobacterium.

Arborele a fost realizat prin metoda Maximum Likelihood. Referitor la modul n care
urmau s fie tratate cele trei deleii, am ales opiunea Complete deletion - Gap/Missing Data
Treatement. Alegerea este justificat prin faptul c am pornit de la ipoteza conform creia
deleiile sunt produsul activitii Taq-polimerazei, i nu al evoluiei sau al diagenezei.
Pentru c modificrile n secvena nucleotidic (exceptnd deleiile) sunt produsul
degradrii post-mortem a ADN, am considerat c n construcia arbo relui secvenele nucleotidice
ar trebui tratate ca secvene non-codificatoare. Dac n schimb, am fi selectat opiunea automat Protein coding - doar primele dou poziii din codon ar fi fost analizate pentru a se evita
influena celui de-al treilea nucleotid, care poate varia fr a influena secvena proteic. Aadar,
nici n acest caz diferenele nu sunt produsul mutagenezei i al seleciai naturale, ci al diagenezei.
Mai mult, poriunea de 117 pb a genei pncA codific n lanul polipeptidic o regiune de
39 de aminoacizi nalt conservat. Lanul polipeptidic formeaz un buzunar care susine un ion
de Fe2+ prin intermediul a apte aminoazici: H51, H57, H71, D49, D8, C138, K96. Patru dintre
acetia sunt codificai de poriunea amplificat de noi: D49, H51 , H57, H71 (Petrella i colab.,
2011). n Figura 15 se observ structura 3D a proteinei prelucrat n Rastop 2.2 astfel nct s fie
evideniat buzunarul i aminoacizii implicai n susinerea fierului.

Figura 15. Structura 3D a pirazinamidazei de la Mycobacterium tuberculosis prelucrat n Rastop 2.2; se

observ buzunarul catalitic i cei patru aminoacizi implicai n susinerea Fe 2+.

Histidina din poziia 57 este substituit de acidul aspartic la M. bovis ca urmare a unei
mutaii punctiforme, aceast specie devenind astfel rezistent la tratamentul cu pirazinamid.
Deoarece existena acestor patru poziii este esenial pentru funcia enzimei, este puin probabil
ca modificrile observate n alinierea multipl s fi survenit n timpul evoluiei.
Pentru ca relaia dintre secvenele obinute de noi i secvenele moderne s fie stabilit cu
o mai mare certitudine am construit un arbore filogenetic prin metoda Maximum Likelihood.
Aceasta poate reconstitui relaiile filogenetice dintre taxonii analizai i ofer suport statistic

(Bootstrap sau Jack-knife) (Harrison i Langdale, 2006). Arborele rezultat pe baza alinierii din
Figura 12 poate fi observat n Figura 16.

Figura 16. Arborele filogenetic realizat prin Maximul Likelihood: Bootstrap 100, modelul evolutiv
Tamura 3 cu distribuie discret Gamma, poziiile cu gap-uri s-a eliminat din analiz.

Pentru ca arborele realizat s fie relevant s-au ters din alinierea multipl o parte din
secvenele amorselor, pstrndu-se secvena minim unic de nucleotide de la captul 3', adic 6
nucleotide. Pentru a fi siguri c topologia arborelui nu este nfluenat de secvena conservat a
amorselor, am pstrat de la captul 3' doar 5 nucleotide. S-a fcut aceast alterare bazandu-ne pe
raionamentul c acele nucleotide sunt necesare pentru legarea amorselor de catena matri i
pentru activitatea Taq-polimerazei. Dup cum se poate observa n Figura 16, secvenele obinute
de noi sunt evideniate prin romburi, culorile diferite reprezentnd indivizi diferii, iar ele
formeaz un cluster care se pstreaz n toi arborii generai (Bootstrap 100). Apoi, acest cluster
este legat de un alt grup ce cuprinde secvenele pncA ale tuturor speciilor din MTBC, scorul
Bootstrap fiind tot 43. Speciile ambientale i care cauzeaz boli similare tuberculozei la animale,
formeaz un grup separat, n care majoritatea valorilor Bootstrap sunt reduse, deci cu o stabilitate
mai sczut. Ca i secven outgroup am ales fragmentul omolog pncA de la Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032. Pentru a echilibra diferenele observate n lungimea ramurilor am
ncercat s utilizm un cluster de secvene outgroup, format din mai multe fragmente pncA ale
genului Corynebacterium. Rezultatele nu au fost satisfctoare, obinndu-se un arbore cu valori
Bootstrap sczute. Acest aspect nu este surprinztor deoarece nu ne putem atepta ca rata
evolutiv s fie aceeai n dou grupuri taxonomice diferite, chiar dac genurile sunt nrudite
(Luo i colab., 2010). Aadar, gruparea secvenelor de ADN-vechi cu MTBC este susinut
statistic i putem concluziona c divergena observat se datoreaz diagenezei i nu unei
amplificri PCR nespecifice.

Pseudosena oxyR
La bacterii, oxyR codific principala protein reglatoare a rspunsului la stresul oxidativ,
dar surprinztor, la speciile din MTBC aceasta a fost inactivat. La Escherichia coli i
Salmonella typhimurium proteina este un factor de transcriere cu rol n activarea transcrierii
proteinelor implicate n rspunsul la stresul oxidativ, dar la speciile din MTBC secvena oxyR
omoloag conine numeroase deleii i inserii frame shift mutations (Figura 17).

Figura 17. Organizarea genetic a regiunii oxyR-ahpC la M. tuberculosis comparativ cu M. leprae;

segmentele n dungi - zone unde au avut loc deleii masive; triunghiurile - mutaii care au schimbat cadrul
direct de citire; romburile - inserii; ptratul - muatie n codonul start (dup Pagn-Ramos i colab.,
2006).

Una dintre genele aflate sub controlul OxyR este ahpC, care codific alchilhidroperoxid reductaza, implicat n metabolizarea peroxidului de hidrogen i a acidului azotic (Springer i
colab., 2001). S-a observat c la speciile care nu mai au gena oxyR funcional, nivelul expresiei
ahpC este foarte sczut, dar nefiind complet inactivat, se presupune c ea ar avea un rol
funcional. Deoarece oxyR nu se mai extrim n MTBC, i deci nu mai este supus seleciei
naturale, ea a putut acumula mutaii i astfel, pe baza polimorfismului din poziia 285 a
pseudogenei se poate face diferena dintre M. tuberculosis i M. bovis (Sreetvansan i colab.,
1996). Noi am amplificat o poriune adiacent acestui SNP, cu amorsele F3-R1 prezentate n
Tabelul 1, cu scopul de a obine un amplicon pe baza cruia s stabilim specia din MTBC care a
cauzat boala.
Dup ce am purificat i clonat produii de PCR, acetia au fost secvenalizai. Secvenele
obinute au fost comparate cu toate celelalte secvene din baza de date GenBank (NCBI) i s-a
obinut o similaritate de 99-100% cu secvena omoloag modern (Figura 18).
`
Figura 18. Alinierea multipl a secvenelor oxyR de ADN-vechi i a fragmentului omolog de la M.
tuberculosis CCDC5180 realizat n Mega 5.1 cu ClustalW.

Secvenele au fost obinute pn acum doar de la individul M3 i aa cum se observ n

Figura 8, controlul negativ de PCR este curat, de aceea, dei similaritatea cu ADN-modern e
surprinztoare, contaminarea este puin probabil. Aceasta demonstreaz prezena lui M.
tuberculosis n oasele cu remodelri asociate tuberculozei. Fragmentele obinute din M4, i
observate n Figura 9, urmeaz a fi clonate i secvenalizate.

CONCLUZII
Rezultatele analizei antropologice au indicat posibilitatea ca indivizii M3 i M4 din
necropola de la Gherseni s fi fost afectai de boala lui Pott. Am ncercat confirmarea acestui
diagnostic utiliznd tehnici fizice (FT-IR) i de biologie molecular. Astfel, n spectrele FT-IR
au fost identificate peak-uri asociate acizilor micolici dar s-au determau fost identificate i
modificri ale indicilor de cristalinitate i a rapoartelor C/P specifice tuberculozei.
Am reuit amplificarea prin PCR a secvenelor pncA din ambii indivizi i secvenalizarea
acestora, iar analizele bioinformatice ne-au ajutat s ncadrm secvenele n MTBC, chiar dac
ADN-vechi a suferit schimbri datorate diagenezei.
Mai mult, au fost obinute secvene ale pseudogenei oxyR cu similaritate de 99-100% cu
secvenele omoloage moderne. Deoarece controlul negativ de PCR este curat, posibilitatea
contaminrii cu ADN modern este nlturat.
n continuare se dorete obinerea secvenelor TbD1 externe i interne.

Studiul III.
Diversitatea genetic reflectat de analiza regiunii de control mitocondriale la
o populaie de secol X din Capidava (Constana, Romnia)
Antropologia fizic
naintea efecturii analizelor moleculare, s-a realizat o analiz osteologic a scheletelor
provenite din necropola de la Capidava pentru a evalua starea de reprezentare i conservare a
oaselor, pentru a identifica sexul indivizilor si pentru a estima vrsta la care acetia au decedat.
Pentru determinarea acestor caracteristici s-au utilizat protocoalele descrise n Standards for data
collection from human skeletal remains (Buikstra i Ubelaker, 1994).
Sexul indivizilor a fost atribuit pe baza trsturilor morfologice de la nivelul craniului
(marginea supraorbital, glabela, mental) i de la nivelul pelvisului (concavitatea subpubic,
arcul ventral, incizura sciatic, sulcusul preauricular). Pentru fiecare din aceste trsturi s-a
atribuit un anumit scor, conform protocolului standard, care reflect gradul de siguran cu care a
fost identificat sexul. n cazul indivizilor subaduli, sexul nu a putut fi determinat pe baza
analizelor de antropologie fizic, deoarece, fiind nc n curs de dezvoltare la momentul morii,
resturile osoase nu prezint trsturile specifice unui anumit sex.
Pentru estimarea vrstei la momentul morii au fost examinai mai muli markeri
osteologici printre care sinostoza suturilor craniene, simfiza pubic, suprafaa auricular a
iliumului i capetele sternale ale coastelor. Pentru stabilirea vrstei subadulilor s-a folosit un set
diferit de criterii. Acestea au inclus caracterizarea stadiului de dezvoltare al danturii precum i
msurtori ale oaselor realizate cu ublerul electronic, fie cu placa osteometric.
n plus, a fost examinat gradul de artroz al articulaiilor pentru a aprecia dac individual
folosea frecvent anumite pri ale corpului n activitile sale fizice, fapt ce poate reflecta stilul
de via. Informaiile legate de nutriie care ilustreaz condiia social pot fi deduse prin
evaluarea strii de afectare a dentiiei, o alt caracteristic analizat. n acelai timp a fost
urmrit eventuala apariie a unor stri patologice speciale cum ar fi tuberculoza sau sifilisul,
precum i prezena traumelor care indic starea de sntate a indivizilor i uneori posibila cauza
a morii.
Prevenia contaminrii i autentificarea rezultatelor
Pe lng degradarea molecular, studiile de ADN se confrunt cu o alt dificultate
major. Din moment ce ADN-ul modern uman i microbial este ubicuitar, riscul contaminrii cu
ADN exogen apare n fiecare etap a procesrii probelor de ADN vechi. Astfel, pentru a evita
contaminarea n laborator au fost urmate reguli i protocoale stricte (Yang i Watt, 2005).
Extracia ADN-ului i amplificarea PCR au fost realizate n laboratoare separate fizic,
destinate doar pentru lucrul cu probe de ADN vechi. n aceste ncperi au fost montate filtre de
aer dotate cu lmpi UV care au fost utilizate naintea nceperii fiecrui proces pentru meninerea
unui mediu de lucru steril. Toat aparatura, suprafeele de lucru, precum i ustensilele din
laborator au fost curate n mod regulat cu Cl, ap ultra-pur i etanol 70%, iar apoi iradiate cu
UV. Tot personalul care a intrat n laborator a purtat combinezon, masc, nclminte de
protecie i mnui de unic folosin pentru a minimize, pe ct posibil, riscul de contaminare.

Din acelai motiv, persoanele care au lucrat ntr-o anumit zi cu probe moderne nu au avut acces
n ziua respectiv n laboratoarele de ADN vechi.
Totodat, fiecare intrare n laborator a fost realizat conform unui program bine-organizat
i a fost manipulat o prob de la un singur individ o dat. Pentru fiecare extracie au fost coextrase sistematic blank-uri de control, iar pentru fiecare amplificare enzimatic au fost rulate
controale negative de PCR pentru a monitoriza o posibil contaminare a substanelor folosite. De
asemenea, pentru a detecta contaminarea cu ADN modern provenit de la personalul care are
acces n aceste laboratoare, rezultatele obinute au fost comparate cu o baz de date ce conine
secvenele genetice de interes ale cercettorilor din instituie (Sampietro et al. 2006).
Din cauza faptului c, n ciuda respectrii tuturor acestor msuri de precauie, exist ansa
de contaminare n laborator, se recomand replicarea independent a analizelor ntr-un laborator
separat de ADN vechi (Gilbert et al. 2005; Pbo et al. 2004; Willerslev and Cooper 2005). n
acest context, pentru fiecare schelet analizat n acest studiu, au fost trimise cel puin cte un dinte
ntreg, fr carii sau fisuri la un laborator de ADN vechi din Spania cu scopul de a autentifica
rezultatele obinute.
Pregtirea probelor i extracia ADN
Extracia ADN-ului din probele osteologice a fost realizat prin dou metode diferite,
ambele frecvent utilizate n astfel de studii. Una dintre ele este extracia cu fenol-cloroform
(Hervella et al. 2012), iar cealalt metod implic utilizarea unor coloane cu silica (Anderung et
al., 2008; Yang et al., 1998). Extracia ADN a folosit ca i surs att oase ct i dini, n cazurile
n care acestea au fost gsite intacte. Au fost alese ca probe pentru acest proces cele mai bine
conservate oase, mai exact diafiza humerusului pentru 4 dintre indivizi: M1, M3, M4, M5.
Extracia din dini a fost efectuat pentru 3 dintre indivizi: M4, M5, M8.
Pentru eliminarea contaminanilor din sol, , a fost curat mai nti suprafaa
osului/dintelui cu Cl 10% i ap ultra-pur. Apoi, ntreaga suprafa a osului, respectiv a dintelui
a fost iradiat UV n UVIlink crosslinker (Uvitec Cambridge) pentru a reduce riscul de
contaminare cu ADN exogen. Din acelai motiv, n cazul probelor reprezentate de piese osoase
au fost nlturai 1 -2 mm din partea extern a osului, cu micromotorul dentar. Ulterior, cu
ajutorul acestui instrument a fost obinut pulberea osoas n cantitatea necesar extraciei. n
cazul utilizrii dinilor, a fost deschis camera pulpar i recoltat sub form de pulbere tot
coninutul. Burghierea electric a fost realizat la vitez mic pentru prevenirea distrugerii ADNului datorit nclzirii excesive (Adler et al., 2011). O singur prob provenind de la un anumit
individ plus un control de extracie au fost prelucrate n acelai timp (nu au fost prelucrate
concomitant probe de la indivizi diferii).
Pentru extracia cu fenol-cloroformau fost utilizate 20 mg de esut osos sub form de
pulbere. Acesta a fost incubat peste noapte la 56 oC n soluie de decalcifiere ce conine: 0.5 M
EDTA pH 8.0-8.5, 0.5% SDS, 50mM TrisHCl pH 8.0 i 1 mg/ml Proteinaz K (Ginther et al.,
1992; Hagelberg i Clegg, 1991). Soluia a fost apoi centrifugat, iar ADN-ul a fost extras din
supernatant, urmrind protocolul de extracie cu fenol-cloroform (Hervella et al., 2012). Au fost
efectuate dou extracii succesive cu un volum egal de 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl
Alcohol (Calbiochem), urmate de adiia cloroformul la faza apoas pentru a nltura urmele de
fenol. Ulterior, ADN-ul a fost precipitat folosind dou volume de etanol absolut (1 ml etanol
absolut la 500 ml supernatant) i 1/10 volume de acetat de sodiu 3 M. Prin centrifugare, a fost
obinut un pellet de ADN care a fost splat de 2 ori cu 1 ml de etanol 80%, apoi acesta a fost

uscat la 56oC timp de 10 minute i resuspendat ntr-un mililitru de ap PCR Grade. ADN-ul a
fost purificat i concentrat prin trecerea soluiei prin centricoane de tipul Amicon Ultra - 0.5 mL
30K Centrifugal Filters (Merck Millipore) (obinandu-se 50-70ul soluie final). ADN-ul eluat a
fost stocat n alicote de 20 l la o temperatur de -20oC pentru o scurt perioad de timp, astfel
nct s nu se degradeze pn la efectuarea amplificrii.
Probele reprezentate de dini au fost supuse extraciei printr-o metod simpl i eficient,
ce nu implic folosirea solvenilor organici. Metoda presupune purificarea i concentrarea ADNului din probe osteologice antice prin intermediul unor coloane cu silica (QIAquicky, QIAGEN)
(Anderung et al., 2008; Yang et al., 1998). Aceasta a fost adaptat la condiiile i aparatura
disponibil n laborator. Digestia pulberii obinute din dini a fost realizat prin adugarea a 100
l Proteinaz K (20 mg/ml) i a unui tampon de extracie alctuit din 0,5 M EDTA pH 8 i 5%
SDS. Amestecul a fost pstrat la 55oC peste noapte, iar apoi la 37oC timp de 24 de ore. Dup ce
amestecul a fost centrifugat, supernatantul a fost preluat i mprit n alicote de 250 l, n tuburi
de 2 ml. Peste acestea au fost adugate 5 volume de PB Buffer (1250 l) i amestecat. Ulterior,
cte 750 l din soluie au fost ncrcate succesiv pe coloan i centrifugate 1 minut la 12400 g.
La terminarea amestecului, ADN-ul legat de particulele de silica a fost splat prin adugarea a
750 l PE Buffer, iar apoi a fost eluat n 100 l Elution Buffer.
Amplificarea PCR i electroforeza
Strategia de amplificare a secvenelor ADN de interes a fost bazat pe utilizarea unor
seturi de amorse proiectate pentru amplificarea unor fragmente nucleotidice scurte, care tind s
fie mai numeroase chiar i n probele arheologice degradate (Gabriel et al. 2001; Pbo et al.
2004). n acest mod, exist mai multe anse de a produce copii suficiente de secvene autentice.
Pentru fiecare specimen, secvenele din regiunea hipervariabil I (HVR-I) i regiunea
hipervariabil II (HVR-II) ale genomului mitocondrial au fost determinate prin amplificarea a 8
segmente care se suprapun pe ntreaga regiune hipervariabil. Dimensiunea acestor segmente
este cuprins ntre 126 de perechi de baze i 170 de perechi de baze (Gabriel et al. 2001)
(Tabelul 1).
Tabelul 1. Design-ul amorselor pentru amplificarea HVR-I i HVR-II (Gabriel et al. 2001)
Intervalul
secvenei
informative
ADN

Temp. de
aliniere

F: 5-CCC AAA GCT AAG ATT CTA AT-3

R: 5-TAC TAC AGG TGG TCA AGT AT-3

16009-16138

50

126

F: 5-CAC CAT GAA TAT TGT ACG GT-3

R: 5-TGT GTG ATA GTT GAG GGT TG-3

16132-16217

50

133

F: 5-CCC CAT GCT TAC AAG CAA GT-3

R: 5-TGG CTT TAT GTA CTA TGT AC-3

16210-16302

46

Fragm.
amplificat

Dimensiunea
ampliconului
(pb)

HVR-I A

170

HVR-I B

HVR-I C

Secvena amorsei

HVR-I D

143

F: 5-CAC TAG GAT ACC AAC AAA CC-3

R: 5-GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC-3

HVR-II A

126

HVR-II B

162886390

48

F: 5-GGG AGC TCT CCA TGC ATT TGG TA-3

R: 5-AAA TAA TAG GAT GAG GCA GGA ATC3

57135

54

132

F: 5-GCA CCC TAT GTC GCA GTA TCT GTC-3

R: 5-TAT TAT TAT GTC CTA CAA GCA-3

133219

46

HVR-II C

142

F: 5-CTA TTA TTT ATC GCA CCT-3

R: 5-ATT TTT TGT TAT GAT GTC T-3

169273

46

HVR-II D

158

F: 5-TGC TTG TAG GAC ATA ATA AT-3

R: 5-GTG TTA GGG TTC TTT GTT TT-3

240357

47

Au fost utilizate mai multe tipuri de ADN polimeraz, disponibile comercial, printre care
MangoTaqTM (Bioline), MyTaqTM (Bioline), PlatinumTaq (Invitrogen). Fiecare reacie PCR a
fost optimizat prin variaia concentraiilor substanelor folosite pentru amplificare, n funcie de
calitatea i cantitatea de ADN extras. n majoritatea cazurilor, ADN polimeraza MangoTaq TM
(Bioline) s-a dovedit a fi cea mai eficient pentru amplificarea secvenelor degradate de
ADNvechi. S-au obinut rezultate constante atunci cnd urmtorul design de PCR a fost folosit
pentru o reacie de 25 l: 5 l tampon de reacie colorat MangoTaq, 2.5 mM MgCl 2, 0.2 mM
fiecare dNTP, 0.5 M fiecare amors, 1.25 uniti de MangoTaq TMpolimeraz i, de obicei, 2 l
de ADN matri. Pentru a depi dificultile ntmpinate la amplificare, datorit prezenei
urmelor de fenol i ai inhibitorilor PCR n ADN-ul extras conform protocolului cu fenolcloroform, acesta a fost, de regul, diluat de cel puin 5 ori naintea folosirii pentru amplificare.
Programul de PCR standard folosit a presupus: denaturarea iniial 95 oC 5 min, urmat de 35 de
cicluri: 95oC 30 sec, 46-50oC (n funcie de amorse), 72oC 30 sec i elongarea final 72oC timp
de 5 min. Monitorizarea unei posibile contaminri a reactivilor folosii s-a realizat prin adugarea
controalelor negative de PCR.
La finalul PCR-urilor s-a verificat faptul c au fost amplificate fragmentele de interes prin
intemediul electroforezei n gel de agaroz. Aceast metod analitic presupune separarea
moleculelor de acizi nucleici care migreaz n cmp electric n funcie de dimensiunea pe care o
au. Astfel, cunoscnd dimensiunea ampliconului, n urma migrrii sale ntr-un gel de agaroz
colorat cu bromur de etidiu, se poate vizualiza la UV prezena ADN-ului de mrimea ateptat.
Un exemplu n acest sens se regasete n figura 4 care ilustreaz amplificarea segmentelor HVR-I
A i HVR-I B de la individual M4, vizualizat in gel de agaroza (Fig. 1).

Fig. 1. Electroforeza n gel de agaroz

Segmentele de ADN de interes obinute n gel au fost purificate, n vedea clonrii lor. n
acest scop s-au utilizat kit-uri speciale pentru purificare din gel (FavorPrep GEL Purification
Kit, Favorgen Biotech Corp) i s-a respectat protocolul disponibil n kit. n situaiile n care s-a
remarcat prezena amplificrii n controlul de extracie, acesta a fost de asemenea purificat pentru
a identifica sursa de contaminare. Totodat, atunci cnd au aprut amplificri n controlul negativ
de PCR, probele nu au fost purificate. n schimb a fost repetat acel pas, utiliznd alicote noi de
reactivi ne-contaminai.
Clonare i secvenializare
nainte de secvenializare, produii PCR purificai au fost clonai (CloneJet PCR Cloning
Kit, Thermo Scientific), ceea ce permite, ulterior, realizarea distinciei dintre mutaiile autentice
specifice fiecrui individ i greelile induse de alterarea post-mortem a integritii moleculelor de
ADN. Avnd n vedere faptul c produii PCR au avut capete coezive 3-dA generate de Mango
Taq polimeraza s-a urmarit protocolul de clonare din kit, specific pentru ndeprtarea acestor
capete (Sticky-End Cloning Protocol), nainte de ligare. Bacteriile competente DH5 alpha, una
din cele mai frecvent utilizate tulpini de E coli. n clonarea de rutin, au fost transformate cu
produii de ligare, iar apoi depuse pe plci de cultur. Doar clonele recombinate care conin
insertul au crescut pe plci, datorit proprietii vectorului pJET1.2/blunt de a exprima o enzim
de restricie letal dac se recircularizeaz dup transformare. Cte 6 colonii izolate de pe fiecare
plac au fost folosite pentru preculturi.
Dup ce bacteriile au crescut timp de aproximativ 15 ore la 37 oC cu agitare, ADN-ul
plasmidic a fost purificat conform instuciunilor din kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo
Scientific). Cantitatea i puritatea ADN-ului plasmidic obinut au fost determinate
spectofotometric. Totodat, pentru a certifica prezena insertului de dimensiunea ateptat, a fost

realizat digestia probelor cu enzima de restricie Bgl II (Thermo Scientific) conform

recomandrilor i au fost vizualizate pe gel de agaroz.
Un minim de 5 clone care au coninut insertul au fost secvenializate (Macrogen, Korea),
folosind amorsa standard pJET1.2 R. Secvenele care au rezultat au fost aliniate cu ajutorul
programului BioEdit i comparate cu secvena ADNmt de referin (revised Cambridge
Reference Sequence; Andrews et al. 1999). De asemenea, rezultatele obinute au fost comprate
att cu secvenele provenite de la personalul implicat n acest studiu, pentru a elimina
posibilitatea contaminrii, ct i cu secvenele regsite n bazele de date.

Rezultate i discuii
Antropologie fizic
Analizele de antropologie fizic efectuate pe cele 9 schelete recuperate din necropola de
la Capidava au pus n eviden faptul c 3 dintre ele aparin unor femei (M1, M3, M8), unul este
al unui individ de sex masculin (M4), iar restul aparin unor indivizi subaduli (M2, M5, M6,
M9, M10) al cror sex nu a putut fi determinat prin metode de antropologie fizic. n cazul
adulilor a fost remarcat prezena a mai mult de 75% din schelet ceea ce semnific o
reprezentare foarte bun. n acelai timp, aceste schelete sunt foarte bine conservate, fiind
alterat mai puin de 25% din suprafaa osoas sub aciunea solului. Nu se poate spune acelai
lucru despre gradul de reprezentare i conservare a scheletelor indivizilor subaduli. n afara
resturilor osoase ale individului M10 care sunt reprezentate i conservate moderat, celelalte
schelete sunt slab pstrate.
Pe baza markerilor osteologici analizai, a fost estimat vrsta la momentul morii pentru
individual M1, de sex feminin, ntre 38-48 de ani. Nu au fost identificate patologii speciale, dar a
fost observat existena unei fracturi oblice vindecate la nivelul humerusului stng, n zona
diafizei proximale. Celei de-a doua femei (M3) i s-a atribuit o vrsta cuprins ntre 43-56 de ani,
iar pentru cea de-a treia femeie (M8) s-a stabilit vrsta n intervalul 20-24 de ani. n cazul
individului M8 s-a identificat o traum la nivel cranian, parietal stng. Cel mai probabil aceasta
este datorat unei lovituri antemortem cu un obiect contondent. De asemenea, a fost remarcat
existena unei fracturi oblice la nivelul unei coaste de pe partea stng, vindecat, fr urme de
infecie. Vrsta pentru individul M4 a fost aproximat n intervalul 33-43 de ani i s-a constatat
c dantura sa a fost pstrat intact, ntr-o stare foarte bun, fr carii sau abcese, fapt ce reflect
o stare de sntate relativ bun. Scheletele M2 i M5 aparin unor indivizi tineri, preaduli cu
vrsta cuprins ntre 9-12 ani. Cu toate c resturile osoase ale indivizilor M6, M9 i M10 sunt
puternic alterate, a putut fi determinat vrsta lor pe baza erupiei dentare i a lungimii oaselor.
Astfel, M6 este cel mai tnr individ, avnd 38-40 sptmni prenatal, M8 0-2 luni postnatal, iar
M9 2,6-4 ani.
Analiza molecular
Dintre cei 9 indivizi ale cror rmie osoase au fost recuperate din situl arheologic
Capidava au fost analizai prin metode moleculare doar 5 dintre acetia. Au fost analizai mai
nti adulii (M1, M3, M4, M8), deoarece piesele osoase sunt bine pstrate, fapt ce permite
extragerea ADN-ului. Prezena dinilor intaci, fr carii sau fisuri, care pot fi folosii pentru
extracia ADN reprezint un motiv suplimentar pentru alegerea fcut. Spre deosebire de aduli,

scheletele indivizilor tineri sunt slab conservate, iar dinii permaneni au rdcinile deschise,
fiind n curs de dezvoltare, fapt ce ridic dificulti n analiza secvenelor de ADN provenite din
astfel de probe, datorit riscului crescut de contaminare cu ADN exogen. Totui, a fost efectuat
analiza de genetic molecular pentru subadultul M5 care prezint un interes deosebit, deoarece
a fost gsit n vecintatea mormintelor M3 i M4, iar o astfel de analiz poate reliefa o eventual
relaie de rudenie ntre aceti indivizi.
Rezultate obinute prin extracia ADN cu fenol-cloroform (M1, M3, M4, M5)
Extracia ADN a fost realizat prin dou modaliti distincte, una bazat pe fenolcloroform, iar cealalt prin intermediul coloanelor cu silica. Pentru extracia cu fenol-cloroform
s-a prelevat pulbere ososas de la indivizii M1, M3, M4 i M5. Cantitatea i calitatea ADN-ului,
astfel obinut au permis doar amplificarea celor 4 segmente din regiunea hipervariabil I (HVRI) a genomului mitocondrial. Avnd n vedere faptul c s-a remarcat prezena urmelor de fenol n
ADN-ul extras, precum i a anumitor inhibitori de PCR cum ar fi acizii humici, fiecare
amplificare enzimatic a fost optimizat i s-au testat diferite concentraii de ADN matri n
amestecul de PCR. Din aceast cauz, ADN-ul rezultat n urma unei extracii unice nu a fost
suficient pentru obinerea rezultatelor pentru cel de-al doilea segment hipervariabil din regiunea
de control.
Primul dintre indivizii analizai este M3. Pentru 3 din 4 fragmente clonate i
secvenializate, blank-urile de extracie au fost curate, adic nu au rezultat amplificri,
fragmentul HVR-I D fiind singurul care a prezentat amplificare n blank, cel mai probabil
datorit unei erori de manipulare. Secvenele obinute au fost comparate cu secvena de referin
(rCRS) pentru a identifica mutaiile specifice acestui individ. A fost evideniat o tranziie C-T n
poziia 16069 n toate clonele analizate. Pe lng aceasta au fost idendificate nc 2 polimorfisme
n poziiile 16111T i 16126C. Interesant este faptul c n secvenele n care s-a regsit una dintre
aceste mutaii (de exemplu 16111T) nu a fost prezent cealalt (16126C), fapt ce indic cel mai
probabil existena a dou surse de ADN. De asemenea, s-a constat prezena unor mutaii
punctiforme, caracteristice moleculelor vechi de ADN care sunt supuse degradrii post-mortem.
Acestea sunt mult mai frecvente n acele secvene care conin substituia 16111 C-T, ceea ce
sugereaz c acestea provin de la individul M1. Aceast idee este susinut i prin faptul c
mutaia 16111T apare pentru prima dat n setul de analize efectuate n laboratorul nostru. Cu
toate acestea, rezultatele pentru M1 trebuie autentificate prin replicarea analizelor i investigarea
mutaiilor din HVR-II care s confirme ncadrarea ntr-un anumit haplogrup.
n secvenele obinute de la individul M1 nu s-au semnalat diferene fa de rCRS, ceea
ce implic ncadrarea acestuia n haplogrupul european H2a2. Pentru certificarea acestei
ncadrri se vor analiza i secvenele pentru HVR-II, precum i un segment nucleotidic care s
includ poziia 7028, poziie definitorie pentru ncadrarea n haplogrupul H (Dissing et al.,
2007).
n cazul indivilor M4 i M5 s-au obinut dou seturi de rezultate, primul n urma analizei
ADN-ului extras cu fenol-cloroform. Dei au fost obinui produi de amplificare pentru HVR -I,
rezultatele de la secvenializarea clonelor sunt inconclusive. Unul dintre factorii care a contribuit
la acest aspect este cel mai probabil conservarea slab a ADN-ului n rmiele osoase. Este
bine cunoscut faptul c gradul de pstrare al moleculelor de ADN este influenat de factorii de
mediu i s-a observat c acesta poate varia chiar n rndul specimenelor excavate din acelai

complex arheologic (Burger et al. 1999). Din acest motiv analizele au fost repetate, folosind
dinii biradiculari (premolari) ca surs de ADN.
Rezultate obinute pentru extracia ADN cu coloane silica (M4, M5, M8)
Iniial, s-a ncercat extracia ADN -ului prin aceast metod din os, dar metoda s-a
dovedit a fi ineficient, iar ca urmare, s-au utilizat dinii foarte bine conservai ca surs de ADN.
n acest mod, s-a reuit recuperarea unei cantiti suficiente de ADN pentru amplificarea tuturor
celor opt segmente care cuprind cele dou regiuni hipervariabile ale genomului mitocondrial.
Totodat, prin folosirea coloanelor cu silica la extracia ADN s-au eliminat dificultile
ntmpinate la amplificarea enzimatic din cauza prezenei urmelor unor solveni organici. n
plus, nu au rezultat amplificri n probele de control folosite la extracie, fapt ce indic absena
unei contaminri cu ADN exogen sau chiar cu ADN din prob n timpul manipulrii lor. De
asemenea, toate controalele negative de PCR au fost curate. Secvenele nucleotidice pentru
fiecare segment amplificat au nucleotide ncorporate greit (Fig. 2) ceea ce sugereaz c acestea
provin de la specimene antice care au fost supuse degradrii post-mortem.Toate aceste aspecte
cresc gradul de siguran ce reflect autenticitatea rezultatelor.

Fig. 2. Alinierea clonelor secvenializate pentru segmentul HVR-I D, individul M4

Pentru fiecare dintre cei trei indivizi, M4, M5 i M8 s-au analizat cte ase clone. n
secvenele pentru HVR-I provenite de la individul M4 s-au identificat 4 mutaii ce apar n toate
clonele analizate, dup cum urmeaz: 16126C, 16278T, 16299G, 16362C. Pe baza acestor
mutaii, individul M4 poate fi ncadrat n haplogrupul R0a2i cu o probabilitate de 80.2 %
conform aplicaiei on-line de atribuire a haplogrupului, cunoscut sub numele de Haplogrep
(http://haplogrep.uibk.ac.at/about.html). Dintre acestea, 16278T este substituia definitorie pentru
ncadrarea n haplogrup, iar 16299G este considerat o mutaie local privat. n regiunea HVRII s-au identificat 6 puncte de divergen comparativ cu rCRS: 39T, 58C, 60.1T, 64T, 263G i
315.1C. Aceste puncte de diagnostic confirm ncadrarea secvenelor de ADN mitocondrial ale
individului M4 n haplogrupul R0a2i. Dintre mutaiile regsite n semntura genetic a lui M4,
16126C este singura care a fost identificat n probele de ADN modern analizate n laborator, dar
ea a aprut ntotdeauna n conjuncie cu 16069T i conduc spre clasificarea ntr-un haplogrup
distinct, i anume J. Acest fapt confer un plus de ncredere rezultatelor obinute.
Datele de secvenializare ale individului M8 conin motivele nucleotidice
caracteristice haplogrupului U3a. Pe intervalul investigat (15989-16410, 34-377) din regiunea de
control s-au evideniat 7 mutaii, dup cum urmeaz: 16343G, 16390A, 39T, 73G, 150T, 263G i
315.1C. Primele 6 dintre acestea fac posibil ncadrarea cu o siguran de 100% n haplogrupul
U3a, iar inseria din poziia 315 este considerat un hot-spot mutaional
(http://haplogrep.uibk.ac.at/about.html). Acest tipar gentic a fost comparat cu o baz de date ce
conine informaia genetic mitocondrial a tuturor cercettorilor implicai n acest studiu,

precum i cu probele moderne analizate n laborator i nu s-au descoperit similariti, fapt ce

sporete ncrederea n rezultatele obinute.
Succesiunea nucleotidic care include HVR-I i HVR-II de la individul M1
conine variaiile specifice (16261T, 263G) haplogrupului H7a1. Gradul de confiden al acestei
ncadrri este 58,7% conform HaploGrep, din pricina faptului c restul mutaiilor care l definesc
se afl n afara regiunii examinate. Drept consecin, pentru confirmarea acestei ipoteze se vor
analiza SNPs definitorii cuprinse n regiunea codificatoare a genomului mitocondrial.
Modificarea din poziia 16261 a fost ntlnit ntr-o singur prob de ADN modern, dar asociat
cu alte cteva mutaii care contribuie la un diagnostic diferit al haplogrupului, ceea ce exclude o
posibil contaminare a probei M5.
Informaiile oferite de aceste rezultate preliminare subliniaz c indivizii analizai
poart semnturi genetice distincte. Fiind clasificai n haplogrupuri diferite, pe baza variaiei n
cadrul secvenelor nucleotidice, este sugerat absena unor relaii de rudenie pe linie matern
ntre indivizii analizai. Totui, alte legturi de tip familial, cum ar fi cel de so-soie, nu pot fi
excluse. Aceste aspecte au o importana deosebit pentru nelegerea organizrii sociale a
populaiei medievale de la Capidava. Contextul arheologic i distribuia mormintelor n situl
arheologic reflect ipoteza existenei a dou grupuri sociale distincte. Unul dintre ele cuprinde
indivizii M3i M4, singurii care au avut inventar funerar. Descoperirea mormntului subadultului
M5 n vecintatea acestor aduli, conduce spre ideea existenei unui ansamblu de tip familial.
Datele moleculare actuale aduc informaii suplimentare n acest sens, prin eliminarea ipotezei
prezenei unor legturi maternale ntre aceti indivizi.
Compararea datelor cu ADN-ul populaiilor moderne
Clasificarea variaiei ADN-ului uman mitocondrial n grupuri genealogice care au un
ancestor matern comun este utilizat n studiile de genetica populaiilor pentru urmrirea
migraiilor populaionale majore din trecutul istoric. Aceste informaii sunt deduse prin
compararea distanelor genetice observate cu cele din rndul populaiilor moderne, precum i cu
cele ilustrate n alte studii de ADN vechi.
Haplogrupul mitocondrial U3a din care face parte individul M8 reprezint o ramur a
haplogrupului major U i se deosebete de U3b prin prezena unei mutaii specifice (16390A)
ntlnit n regiunea HVR-I (Achilli et al., 2005). Prezena acestui haplogrup a fost detectat n

Fig. 3. Distribuia haplogupului mitocondrial U3 n Europa, Orientul Apropiat i Nordul

Africii (http://www.eupedia.com/europe/maps_mtdna_haplogroups.shtml#U3)

numeroase populaii actuale din Europa i vestul Asiei, cele mai ridicate frevene fiind ntlnite
n rile din preajma Mrii Negre (Bulgaria, Georgia) i Caucaz (iranieni, armeni, avari, turci),
dup cum se poate observa i n imaginea de mai jos (Fig. 3).
De asemenea, frecvene mari ale acestui haplogrup s-au distins n populaii actuale de
romi, ai cror strmoi au migrat prin teritoriul Armeniei i al Imperiul Bizantin n ruta lor spre
Europa (Malyarchuk et al., 2006). Mai mult, o frecven sporit a acestui haplogrup mitocondrial
a fost remarcat pe teritoriul Romniei, mai exact n cadrul unor indivizi de etnie romn din
Ploieti (Bosch et al., 2006). Studiul relaiilor genetice pe linie matern ce privesc legturile
dintre populaiile evreieti subliniaz, de asemenea, existena grupului genealogic U3a n rndul
acestora (Behar et al., 2008). Datele arheologice legate de populaia medieval de la Capidava,
sugereaz c probabilitatea ca aceast populaie s aib vreo conexiune cu cele evreieti este
extrem de mic, din moment ce indivizii au fost nmormntai dup un ritual cretin.Considernd
contribuia haplogrupului U3a la fondul genetic actual se poate deduce faptul c acesta a avut un
rol n istoria populaiilor strvechi, marcnd numeroase valuri de migraie din diferite perioade.
Zona Caucazian, situat ntre Levant i Europa, poate fi considerat una dintre potenialele rute
de colonizare a Europei de ctre omul modern (Schnberg et al., 2011). De asemenea, este foarte
posibil ca dispersia major din regiunea Caucaz nspre Europa de-a lungul bazinului Dunrii s
se fi realizat n timpul exapnsiunii neolitice, dei diversitatea genetic curent este influenat i
de amestecul ulterior al populaiilor (Quintana-Murci et al., 2004).
Analiza haplotipurilor mitocondriale umane din cadrul populaiilor moderne ilustreaz
frecvene ridicate pentru haplogrupul vest Eurasiatic, R0a, n numeroase din regiunile geografice
n care s-a remarcat o frecven crescut a haplogrupului U3a. Acest fapt este evideniat n cele
dou imagini (Fig. 3., Fig. 4) care surprind distribuia acestor haplogrupuri.

Fig. 4. Distribuia haplogupului mitocondrial R0 (HV) n Europa, Orientul Apropiat

i Nordulhttp://www.eupedia.com/europe/maps_mtdna_haplogroups.shtml#HV

Prezena haplogrupului R0a, cunoscut anterior drept HV, este ntlnit cel mai adesea n
structura
genetic
a
populaiilor
din
Turcia,
Iran,
Yemen
i
Bulgaria
(http://www.eupedia.com/europe/european_mtdna_haplogroups_frequency.shtml).
Prezena celor mai ridicate frecvene ale acestui grup mitocondrial n peninsula arab se
poate datora faptului c n aceast regiune a avut loc o diversificare intern a sa, ca urmare a
expansiunii demografice de dup ultima glaciaiune (ern et al., 2011). n acelai timp, s-a

observat o frecven de 48% a haplogrupului R0a n cadrul aromnilor de pe teritoriul romnesc

i una de 34% pentru romnii din Constana, zona geografic n care se regsete situl arheologic
Capidava (Bosch et al., 2006). Cele dou hri ale distribuiei frecvenelor celor dou tipuri de
varieti mitocondriale oglindesc prezena unor hotspot-uri n partea sudic a Belarusului i n
sud-vestul Ucraninei. O explicaie plauzibil pentru acest aspect ar fi expansiunea nordic a
populaiilor culturii Cucuteni din regiunea pontic , n neoliticul trziu, ca urmare a invadrii
teritoriului lor de ctre indo-europeni (Nikitin et al., 2011).
Compararea datelor cu alte studii de ADN vechi
n ceea ce privete studiile de ADN vechi, literatura de specialitate despre evoluia
ADNmt este puternic dominat de probe foarte vechi care dateaz din Paleolitic, Neolitic, Epoca
Bronzului, Epoca fierului.
Acelai tipar genetic ca i n cazul individului M8 a fost semnalat prin analiza resturilor
osoase ale unui individ descoperit ntr-o peter din regiunea Levantului, un important coridor de
comunicare, migraie i comer (Salamon et al., 2010). Datarea cu carbon a osemintelor plaseaz
mormintele din aceste peteri n Epoca Bronzului (mileniul 5-4 naintea erei noastre). Un alt
haplotip identic a fost pus n eviden n cazului unui schelet din Epoca Fierului, aflat ntr-o
aezare stveche din Danemarca (Melchior et al., 2008). O frecven ridicat a liniei materne U3
a fost constatat n cadrul unei populaii Bizantine din situl arheologic Sagalassos din sudul
Anatoliei, ce dateaz din secolele 11-13 AD (Ottoni et al., 2011). Rezultatele discutate n acest
studiu subliniaz afinitatea genetic a populaiei din Sagalassos cu cea a populaiilor Balcanice, o
consecin a interaciunilor frecvente dintre ele n trecutul istoric. Mai mult, sunt prezentate dou
ipoteze pentru originea liniei mitocondriale U3. Una dintre ele identific U3 ca fiind o
component levantic, fapt explicat prin schimburile comerciale intense stabilite ntre populaii,
din cele mai vechi timpuri, dar aceasta nu exclude posibilatatea unei origini caucaziene.
Studiile de ADN vechi care s fac referire la modul n care haplogrupul R0a2i a
contribuit la diversitatea genetic a populaiei actuale sunt aproape inexistente. n literatura
actual exist un singur studiu care atribuie haplogrupul R0 unui individ descoperit n petera
Paglicci din sudul Italiei i care datez de acum 24000 de ani (Caramelli et al., 2003).
Din contextul istoric i arheologic al populaiei de secol 10-11 AD de la Capidava pot fi
deduse mai multe ipoteze pentru apartena acestora la un anumit grup populaional. Printre
acestea se numr: bulgari, turci (bizantini), avari, armeni, cumani, pecenegi, slavi. Prin
corelarea datelor moleculare cu cele istorice i arheologice se poate restrnge intervalul acestora.
Astfel, cel mai probabil indivizii analizai provin dintr-un fond bulgresc sau turanic, avnd
originea n zona Caucazului. Rezultatele genetice actuale nu exclud posibilitatea ca cei doi
indivizi s provin din acelai fond etnic. Informaii suplimentare care s ofere o imagine mai
comprehensiv asupra situaiei din regiunea Dobrogei n secolul X, pot fi ilustrate prin analiza
diversitii genetice a mai multor indivizi din necropolele din aceast zon. De asemenea, tiparul
de migraie i modul n care micrile demografice au lsat amprente n fondul genetic actual
poate fi completat prin integrarea datelor moleculare cu cele obinute prin analize de izotopi
stabili, mai exact stroniu.

Concluzii
Studiile de ADN vechi au poteialul de a oferi indicii despre modul n care evenimentele
din trecutul istoric au modelat fondul genetic actual, precum i despre legturile genetice inter i
intra populaionale. Datele de ADN vechi disponibile la ora actual sunt infinitezimal de mici,
datorit eforturilor, costurilor i dificultilor pe care o analiz de acest tip le presupune. Astfel,
cele mai multe informaii pot fi deduse logic din datele de ADN modern, corelate cu cele istorice
i arheologice.
Rezultatele moleculare din acest studiu pun n lumin informaii legate de originea
populaiei medievale excavate din situl arheologic de la Capidava, precum i despre relaiile de
rudenie dintre indivizi. Aadar, aceast populaie i are originea cel mai probabil n zona
Caucazului i face parte dintr-o populaie turanic sau bulgar. Totodat, datele moleculare
indic faptul c cei trei indivizi, M4, M5 i M8 nu mprtesc o relaie de rudenie apropiat pe
linie matern, dei alte relaii de tip familial nu pot fi excluse. Estimarea diversitii genetice a
acestei populaii este limitat de prezena n numr mare a indivizor subaduli, n cazul crora
ADN-ul este slab conservat.
O imagine mai cuprinztoare asupra trecutului istoric al acestei populaii poate fi
conturat prin integrarea datelor moleculare cu cele obinute prin analiza izotopilor stabili
(stroniu) i datarea cu carbon radioactiv.

Studiul IV.
Optimizarea diagnosticului molecular al sexului la probe arheologice umane
Scopul prii experimentale a lucrrii de fa este acela de a testa patru amorse nou concepute
pentru a amplifica fragmente din genele pentru amelogenin prezente pe cromozomul X,
respectiv Y, n vederea determinrii sexului, pe baza ADN-ului extras din dini sau oase
aparinnd indivizilor de diverse vrste, descoperii n diverse situri arheologice, fiind datai n
secole diferite. Totodat se urmrete standardizarea unui protocol, n vederea obinerii de
rezultate constante, indiferent de particularitile fiecrui individ analizat. Mai muli pai sunt
urmrii n obinerea datelor.
1. Extracia ADN-ului
Oasele sau dinii sunt utilizai n extracia ADN-ului. Cum problema contaminrii este foarte
serioas i poate influena ntr-o msur covritoare datele obinute, sunt luate msuri pentru a
diminua cantitatea de ageni contaminani care vin n contact cu fiecare prob analizat. Au fost
puse la punct dou protocoale de extracie: unul pe baz de fenol-cloroform (Harvella et al.,
2012, Hagelberg and Clegg, 1991, Ginther et al., 1992) i un altul care utilizeaz coloane cu
membran de siliciu (Yang et al., 1998, Anderung et al., 2008). Trsturile ADN-ului vechi
legate de cantitatea redus a acestuia, calitatea sczut i prezena inhibitorilor sunt luate n
calcul atunci cnd este elaborat un protocol de extracie.
a) Curarea probelor
Fiecare prob utilizat pentru extracie este mai nti splat cu ap ultrapur. Urmeaz apoi
splarea suprafeelor oaselor cu clor, respectiv imersarea dinilor n clor pentru 10-15min. Din
nou, se utilizeaz ap ultrapur pentru ndeprtarea clorului. Probele sunt ulterior lsate la UV
timp 10-15min pe fiecare parte.
b) Decalcifierea i ndeprtarea substanelor organice
Probele astfel curate sunt introduse n hot, unde cu ajutorul unui micromotor i al frezelor
dentare se obine 0,2g de pulbere din osul compact, dupa ce suprafaa acestora a fost ndeprtat,
respectiv din pulpa dentar n cazul dinilor, preferai n extracia realizat cu ajutorul coloanelor
cu membran de siliciu. Peste pulbere se adug soluia de decalcifiere. Pentru extracia cu fenol
soluia conine: 0,5M ETDA (ethylene diaminetetra-actic acid), cu rol n chelatarea ionilor de
calciu, 0,5% SDS (sodium dodecyl sulfate), 50mM TrisHCl i 1 mg/ml proteinaz K, pentru
digestia proteinelor. pH-ul soluiei se aduce la 8. Peste fiecare 0,2g pulbere os/dinte se adaug
1ml din soluia de decalcifiere, lsndu-se peste noapte la 56C. n ceea ce privete extracia cu
ajutorul coloanelor cu membran de siliciu, soluia de decalcifiere are o compoziie uor diferit:
0,5M EDTA, 5%SDS i 20mg/ml proteinaz K, aducndu-se pH-ul la 8. Se adaug 1 ml de
soluie peste pulberea de dinte. Se las peste noapte la 55C, iar apoi 24h la 37C. Pentru a
verifica gradul de contaminare cu ADN modern n timpul extraciei soluia de decalcifiere se
aplic i ntr-un tub gol, care nu conine pulbere de os sau dinte, utilizat ca i control negativ de
extracie. Dup acest pas, controlul negativ de extracie va suferi acelai tratament ca probele
propriu-zise.

c) Extracia cu fenol-cloroform
Extracia propriu-zis a ADN-ului se realizeaz ntr-o ncpere separat fizic de cea n care sa realizat extracia materialului osos/dentar sau de cea destinat PCR-ului, dotat cu o hot cu
presiune pozitiv. Principiul extraciei cu fenol-cloroform este acela al extraciei lichid-lichid
bazat pe separarea moleculelor pe baza gradului lor de solubilitate n medii lichide nemiscibile.
ADN-ul se gsete n fiecare etap n stratul apos, superior.
Probele coninnd pulberea de os sau dinte sunt centrifugate, prelundu-se supernatantul care
se amestec cu un volum egal de fenol-cloroform (fenol:cloroform:alcool izoamilic 24:25:1,
v/v), prelundu-se n urma unei centrifugri supernatantul. Procedeul se repet. Dup cea de-a
doua centrifugare, supernatantul se amestec cu cloroform, cu rolul de a ndeprta fenolul n
exces legat de ADN. Se preia din nou supernatantul, urmnd precipitarea ADN-ului cu etanol
absolut. Urmeaz dou splri cu etanol 80%, dup care probele sunt uscate, apoi rehidratate i
trecute prin centricon (Amicon Ultra- MILLIPORE), cu rol n concentrarea i purificarea
acestora.
Protocoale de extracie a fost testate pe o serie de indivizi aparinnd unor necropole
localizate n diferite zone geografice din Romnia, avnd vechimi diferite. Localizarea
geografic diferit presupune condiii tafonomice diferite, aciunea degradant a factorilor de
mediu diferind n funcie de amplasare. Extracia cu fenol-cloroform a fost testat pe 7 indivizi
dup cum urmeaz:

I1
I2
I3
I4
I5
I6

Localizarea sitului
arheologic cruia aparine
Suplacu de Barcu
Coconi
Gheorghieni
Mireasa
Capidava
Capidava

I7

Histria

Individ

Datare

Surs de
ADN

Mil IV . Hr.
Secol X d.Hr
Secol X d. Hr
Secol X d. Hr
Secol IV-V d.
Hr

Sex atribuit dup

analiza antropologic
brbat

humerus
vertebr
molar
molar
molar

posibil femeie
brbat
brbat
femeie

craniu

brbat

d) Extracia cu coloane cu membran de siliciu QIAquick PCR Purification Kit Protocol

(QIAGEN)
Metoda de extracie care implic utilizarea coloanelor se bazeaz pe proprietatea particulelor
de siliciu de a reine ADN-ul (Hss and Pbo, 1993). Membranele permit reinerea fragmentelor
cu dimensiuni cuprinse ntre 100pb i 10kb, excluznd nucleotidele, proteinele i srurile.
Fragmentele de ADN vechi au n general cteva sute de perechi de baze, fiind preponderent
scurte, fragmentele de dimensiuni mari, provenind de fapt de la organisme care vin n contact,
postmortem, cu dinii sau oasele analizate. Metoda este mult mai specific pentru ADN,
sczndu-se cantitatea de produi coextrai, avnd de cele mai multe ori efect inhibitor asupra
PCR-ului. Eliminarea compuilor organici din procesul de extracie, n special al fenolului, care
interfereaz n special cu determinarea spectofotometric exact a cantitii de ADN extras i
mai apoi n reacia de PCR, cresc ulterior ansa de a obine amplificarea fragmentelor de interes.
Protocolul de extracie utiliznd coloane cu membran de siliciu a fost aplicat asupra a trei
indivizi caracterizai n tabelul de mai jos.

Individ
I8
I9
I10

Localizarea sitului
arheologic cruia aparine
Curtea de Arge
Capidava
Capidava

Datare
Secol XIV d.Hr
Secol X d.Hr
Secol X d.Hr

Surs de
ADN
molar
molar
molar

Sex atribuit dup

analiza antropologic
brbat
femeie
brbat

e) Determinarea spectrofotometric a concentraiei de ADN din probe cu ajutorul

Spectrophotometer Nano Drop ND 1000
Spectrofotometrul permite cuantificarea cantitii de ADN la absorbana de 260nm.
Nanodropul, spre deosebire de un spectrofotometru normal, necesit un volum redus de prob
pentru a stabili concentraia acesteia. Utiliznd 1l din compusul de analizat, pe baza peak-ul de
absorbie se stabilete concentraia de acid nucleic din prob. Amplitudinea vrfului de aborbie
este proporinal cu cantitatea de acid nucleic analizat.
f) Electroforeza acizilor nucleici n gel de agaroz
Pentru a verifica dac exist ADN n probe, dup extracie, a fost realizat migrarea lor, sub
aciunea curentului electric n gel de agaroz. Moleculele migreaz cu viteze diferite n funcie
de mrimea lor, cele mai mici migrnd mai uor printre porii gelului spre deosebire de cele mai
mari.
2. Amplificarea fragmentelor de interes
Amplificarea prin PCR a fragmentelor caracteristice cromozomilor X i Y n vederea
determinrii sexului poate fi problematic atunci cnd este folosit ca matri ADN-ul vechi. Au
fost testate o serie de amorse, corelate cu diverse polimeraze ncercndu-se i adugarea unor
aditivi n vederea mbuntirii productivitii i specificitii reaciei.
a) Amorse
Amplificarea genelor pentru amelogenin corespunztoare cromozomul X i Y a avut loc
printr-un PCR multiplex. Aceeai amors forward (M4) a fost conceput pentru amplificarea
AMELX ct i pentru amplificarea AMELY. Amorsele reverse (M5 pentru AMELX, M6 pentru
AMELY) sunt specifice fiecrui cromozom (Faerman et al., 1995). Fragmentele intite sunt de
330pb pentru cromozomul X, respectiv 218pb pentru Y. Amorsa M7 a fost conceput ulterior ca
alternativ la M5 (Faerman and Bar-Gal, 1998) pentru a duce la amplificarea unui segment mai
scurt, de 270pb pe cromozomul X.

Nume amors

Secven

Tm(C)

Cromozom X
M4(F)

5-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3

60

M5(R)

5-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3

62

M7(R)

5-GTGACTATCTTAGAATCAGGAG-3

62

Cromozom Y

M4(F)

5-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3

60

M6(R)

5-GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3

62

Pornind de la ideea intirii unor fragmente ct mai scurte, dorite n cazul studiului ADN-ului
vechi, patru noi amorse forward (NP_1, NP_2, NP_3, NP_4) au fost concepute ca substitute ale
lui M4. Dimensiunile fragmentelor amplificate sunt: utiliznd NP_1 243pb pentru cromozomul
X i 131pb pentru cromozomul Y, utiliznd NP_2 204pb pentru X i 92pb pentru Y, utiliznd
NP_3 181pb pentru X i 69pb pentru Y i utiliznd NP_4 212pb pentru X i 100pb pentru Y. M5
i M6 sunt folosite n continuare ca amorse reverse.

Nume amors

Secven

Tm(C)

Cromozom X
NP_1(F)

5-CCTCCTAAATATGGCYGTAAG-3

60

NP_2(F)

5-CRTCTCAGGRAGGYTCCATC-3

60

NP_3(F)

5-AGGGCAAAAAGTMAACTCTGAC-3

62

NP_4(F)

5-CATGAACCACTRCTCAGGRAG-3

62

M5(R)

5-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3

62

Cromozom Y
NP_1(F)

5-CCTCCTAAATATGGCYGTAAG-3

60

NP_2(F)

5-CRTCTCAGGRAGGYTCCATC-3

60

NP_3(F)

5-AGGGCAAAAAGTMAACTCTGAC-3

62

NP_4(F)

5-CATGAACCACTRCTCAGGRAG-3

62

M6(R)

5-GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3

62

b) Polimeraze
O serie de polimeraze au fost testate n ncercarea de a amplifica segmentele intite constant.
Probele de ADN obinute utiliznd kitul de extracie cu coloane cu membran de siliciu au dat
frecvent i constant amplificare atunci cnd a fost utilizat MangoTaqTM DNA Polymerase
(BIOLINE). n cazul ADN-ului obinut prin extracia cu fenol-cloroform niciuna din
polimerazele testate nu au dat constant rezultate. Au fost ncercate: MangoTaq TM DNA
Polymerase (BIOLINE), GoTaq DNA Polymerase (Promega), IMMOLASE DNA
Polymerase (BIOLINE) i MyFiTM DNA Polymerase (BIOLINE).

c) Aditivi
2x PolyMate Additive (BIOLINE) poate fi utilizat alturi de oricare polimeraz termostabil
avnd rolul de a crete specificitatea i productivitatea PCR-ului. Este indicat de folosit n cazul
probelor dificile, cu un coninut ridicat de GC sau cu secvene repetitive.
Cantitile utilizate pentru multiplicarea fragmentelor de interes, utiliznd MangoTaq TM ca
polimeraz sunt menionate n tabelul urmtor.
Componente
H2O
Buffer (5X)
MgCl2(50mM)
dNTP(10mM)
NP_1/2/3/4(F)(10M)
M5(R) )(10M)
M6(F) )(10M)
MangoTaq(5U/10l)
ADN(40ng/react)

Volume (l)
10.5
5
1.25
0.5
1.5
1.5
1.5
0.25
3

Volum final 25l

Pentru celelalte n care sunt utilizate celelalte polimeraze difer doar tamponul cu care vine
nsoit enzima. n cazul n care este utilizat ca i aditiv 2x PolyMate Additive, acesta nlocuiete
cantitatea de ap adugat n mod normal.
Condiiile termice i numrul de cicluri necesare amplificrii segmentelor dorite sunt
urmtoarele:
Pasul din PCR
Denaturarea iniial
Denaturarea
Alinierea amorselor
Extensia catenelor
Extensia final

Temperatura
95C
95C
58C
72C
72C
4C

Timp
30 s
30 s
30 s
30s
5 min

Numar de cicluri
1
35/40
1
1

3. Electroforeza produilor PCR n gel de agaroz (1.5-2%)

4. Purificarea produilor PCR din gel de agaroz cu FavorPrep Gel/PCR Purification Kit
(FAVORGEN)
5. Autentificarea rezultatelor
Autentificarea rezultatelor presupune discriminarea fragmentelor amplificate de pe matria de
ADN vechi, respectiv cele amplificate de pe moleculele de ADN moderne, contaminante. Pentru
acesta, fragmentele obinute prin PCR, avnd dimensiunile ateptate au fost clonate utiliznd
protocolul Sticky-end cloning protocol (Thermo Scientific). Pentru transformare au fost folosite
celule de E. coli, tulpina DH5, rezistent la amplicilin.
Plasmidele au fost purificate utiliznd kitul GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Dup
verificarea prezenei fragmentelor de interes, plasmidele au fost secvenializate (Macrogen,

Coreea). Pentru ca secvenele obinute s fie atribuite amplificrii de pe matria de ADN vechi
este urmrit prezena substituiilor aprute post-mortem n interiorul secvenelor analizate.
Prezena substituiilor n clonele aceluiai fragment atest faptul c acesta a fost amplificat
pornind de la ADN-ul vechi extras din osul sau dintele analizat.

Rezultate i discuii
Utiliznd amorsele propuse de Faerman, nu s-a reuit amplificarea cu succes n niciuna
din probele de ADN vechi testate (Figura 1.). Fragmentele intite, de 330pb pentru cromozomul
X, respectiv 218pb pentru Y sunt prea mari. n general, fragmentele din probele de ADN vechi
au lungimi medii de 150pb, fragmente ceva mai lungi, de 500-600pb putnd fi amplificate n
cazul indivizilor bine conservai i avnd ca int ADN-ul mitocondrial (Pbo et al., 1989).

Figura 1. Gel de agaroz coninnd produi PCR din probe extrase cu fenol-cloroform din individul I7 descoperit la
Histria. Au fost utilizate amorsele propuse de Faerman. Godeuri: 1-marker 100pb, 2- amplificare ADN extras din os
scurt, 3- amplificare ADN extras diafiza unui os lung, 4- amplificare ADN extras din epifiza unui os lung, 5amplificare control negativ de extracie, 6- control negativ PCR.Reacia de amplificare a fost realizat
utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase.Cantitatea de ADN extras i puritatea acestuia pentru fiercare din probele
2-5 a fost nregistrat spectrofotometric (2: conc ADN- 1089.9, 260/280-1.47, 260/230- 0.53; 3: conc ADN- 550.9,
260/280-1.42, 260/230-0.8; 4: conc ADN-855.3, 260/280-1.47, 260/230-0.44, 5(control negativ de extracie): conc
ADN-34.5, 260/280-13.03, 260/230-0.05) Valorile foarte mari ale concentraiei de ADN se datoreaz prezenei altor
compui care manifest absorban la 260mn ca n cazul acizilor humici prezeni n sol. Valorile sczute ale
indicelui 260/280 (1.5) fa de valoarea la care ADN-ul este considerat pur (1.8) indic prezena proteinelor,
fenolului i a altor compui organici fenolici. Indicele 260/230 este i el sub valorile care indic puritatea (2-2.2)
marcnd prezena fenolului i a acizilor humici. Pe lng lungimea fragmentelor intite, prea mare, pentru studiul
ADN-ului vechi, prezena fenolului i al altor substane organice co-extrase determin insuccesul reaciei de
amplificare.

Amorsele nou concepute au fost testate iniial pe probe de ADN modern pentru a se
stabili dac dimensiunea fragmentelor obinute este cea ateptat (Figura 2.). Amplificarea a avut
loc cu succes fiind obinute fragmentele dorite. Segmentele intite sunt mai scurte cu cel puin

90pb faa de amorsele testate anterior, motiv pentru care sunt mult mai potrivite pentru studiul
ADN-ului vechi.

Figura 2. Gel de agaroz care ilustreaz modalitatea de funcinare a amorselor nou concepute cnd ADN -ul modern
este folosit ca matri. Godeuri: 1. marker 100pb, 2. fragment de 243pb obinut prin amplificarea de ADN feminin
(cromozom X), 3. fragmente de 243pb i 131pb obinut prin amplificarea de ADN masculin (cromozom X, respectiv
Y), 4. fragment de 204pb obinut prin amplificarea de ADN feminin (cromozom X), 5. fragmente de 204pb i 92pb
obinut prin amplificarea de ADN masculin (cromozom X, respectiv Y), 6.fragment de 181pb obinut prin
amplificarea de ADN feminin (cromozom X), 7. fragmente de 181pb i 69pb obinut prin amplificarea de ADN
masculin (cromozom X, respectiv Y), 8. fragment de 212pb obinut prin amplificarea de ADN feminin (cromozom
X), 9. fragmente de 2124pb i 100pb obinut prin amplificarea de ADN masculin (cromozom X, respectiv Y), 10
control negativ de PCR. Reacia de amplificare a fost realizat utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase.

Dintre toate probele obinute prin extracie cu fenol-cloroform, singura amplificare

reuit n vederea determinrii sexului a fost posibil n cazul individului I3 (Figura 3.).
Rezultatele vin s confirme atribuirea sexului realizat prin analiza antropologic, remarcndu-se
n urma amplificrii doar banda caracteristic cromozomului X.

Figura 3. Gel de agaroz n care de gsesc produii PCR obinui prin analiza ADN-ului extras din individul I3.
Godeuri: 1. amplificarea probei utiliznd amorsa NP_1, 2. amplificarea probei utiliznd amorsa NP_2, 3.
amplificarea probei utiliznd amorsa NP_3, 4. amplificarea probei utiliznd amorsa NP_4, 5. marker 100pb, 6.
amplificarea controlului de extracie utiliznd amorsa NP_1, 7. amplificarea controlului de extracie utiliznd
amorsa NP_2, 8. amplificarea controlului de extracie utiliznd amorsa NP_3, 9. amplificarea controlului de
extracie utiliznd amorsa NP_4, 10. Control negativ de PCR. Reacia de amplificare a fost realizat
utilizndMyFiTM DNA Polymerase. Cantitatea de ADN extras i puritatea acestuia pentru prob i controlul de
extracie au fost nregistrate spectrofotometric (prob: conc ADN- 401.5, 260/280-1.52, 260/230- 0.6; control de
extracie: conc ADN- 0.4, 260/280- 0.62, 260/230-0.09).

O problem important a utilizrii noilor amorse este legat de faptul c tind s formeze dimeri
atunci cnd ADN-ul folosit ca matri este n cantitate redus (Figura 4.). Dimerii formai ajung

s aib dimensiuni comparabile cu cele ale fragmentelor scurte de 69 sau 92pb amplificabile de
pe cromozomul Y. Astfel de segmente s-au obinut n ncercarea de determinare a sexului pentru
individul I4, amplificarea dovedindu-se un eec atunci cnd au fost analizate secvenele (Figura
5.).

Figura 4. Gel de agaroz care ilustreaz presupuii produi de PCR n cazul amplificrii ADN-ului extras din
individul I4. Godeuri: 1. marker 50pb, 2. amplificare ADN din prob utiliznd amorsa NP_1,3. amplificare ADN din
controlul de extrecie utiliznd amorsa NP_1, 4. amplificare ADN din prob utiliznd amorsa NP_2, 5. amplificare
ADN din controlul de extracie utiliznd amorsa NP_2, 6. amplificare ADN din prob utiliznd amorsa NP_3, 7.
amplificare ADN din controlul de extracie utiliznd amorsa NP_3, 8. Amplificare ADN din prob utiliznd amorsa
NP_4, 9. amplificare ADN din controlul de extracie utiliznd amorsa NP_4, 10. Control negativ de PCR. Reacia de
amplificare a fost realizat utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase asociat cu aditivul PolyMate.Cantitatea de
ADN extras i puritatea acestuia a fost nregistrat spectrofotometric (prob: conc ADN- 8.8, 260/280-1.6, 260/2300.54; control de extracie: conc ADN- -0.7, 260/280- -0.91, 260/230- -0.9). Valorile indicelui 260/280, respectiv a
celui 260/230 sunt comparabile cu valorile obinute n extraciile anterior menionate, semnalnd prezena
inhibitorilor PCR. Totodat concentraia de ADN nregistrat este mult mai sczut. Absena amplificrii
segmentului specific cromozomului X, folosit ca i control pozitiv n PCR-ul multiplex de determinare a sexului
poate fi un indiciu c reacia de amplificare nu a funcionat. Totui este plauzibil i varianta ca doar segmentul
specific cromozomului Y s fie amplificat avnd n vedere faptul c fragmentul intit este mai mic.

Figuara 5. Analiza secvenelor presupuse ca fiind fragmentele obinute utiliznd amorsa NP_3 caracteristice
cromozomului Y pentru individul I4. Lungimea segmentelor se apropie de lungimea ateptat de 69pb, dar ele sunt
de fapt dimeri ai amorselor folosite NP_3, M6 i M5.

Pentru a se evita situaia analizrii dimerilor n locul segmentelor scurte potrivite de altfel
studiului ADN-ului vechi, pentru investigarea cromozomului Y se va folosi n continuare amorsa
NP_1 care permite amplificarea segmentului cel mai lung de 131pb. Deoarece NP_1 ar conduce
la amplificarea unui fragment de 243pb pe cromozomul X, sistemul multiplex de PCR nu va mai
fi folosit. Amplificrile vor fi realizate n tuburi separate, pentru cromozomul X folosindu-se ca
amors forward NP_3, ateptndu-se s fie amplificat un fragment de 181pb.
n ceea ce privete extracia cu coloane cu mebran de siliciu, s-a reuit amplificarea
fragmentelor de interes n toate probele analizate (Figura 6.).

Figura 6. Gel de agaroz care conine produii de PCR n cazul amplificrii ADN-ului extras cu coloane cu
membran de siliciu din individul I8. Godeuri: 1. amplificare specific cromozomului Y din prob, 2. marker
100pb,3. amplificare specific cromozomului Y din control de extracie, 4. control negativ PCR, 5. amplificare
specific cromozomului X din prob, 6. marker 100pb, 7. amplificare specific cromozomului X din prob, 8.
amplificare specific cromozomului X din controlul de extracie, 9. Contol negativ PCR.Reacia de amplificare a
fost realizat utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase. Cantitatea de ADN extras i puritatea acestuia pentru prob
respectiv controlul de extracie a fost nregistrat spectrofotometric (prob: conc ADN- 18.2, 260/280-1.75,
260/230- 2; control de extracie: conc ADN- 2.2, 260/280- -1.13, 260/230- -1.3). Valoriile indicilor 260/280 i
260/230 sunt mai apropiate de valorile care definesc puritatea. Nu este astfel deloc surprinztor faptul c ADN -ul
extras cu ajutorul coloanelor cu membran de siliciu este o matri mai bun n reacia de PCR.

Autentificarea rezultatelor presupune validarea secvenelor obinute ca fiind amplificate

de pe matria de ADN vechi extras i nu de pe alte molecule de ADN contaminante, care vin n
contact cu probele. n cazul individului I8 a fost clonat i secvenializat fragmentul caracteristic
cromozomului Y. Deoarece controalele de extracie, respectiv de PCR, nu au generat amplificri,
iar personalul laboratorului n care s-a realizat analiza molecular este n totalitate de sex
feminin, contaminarea cu ADN modern n timpul analizei moleculare desfurate n laborator
poate fi exclus. Din analiza secvenelor clonelor fragmentului analizat se poate remarca
prezena unei substituii CT la captul 5 al fragmentului analizat, caracteristic moleculelor
de ADN vechi (Figura 7.). Fragmentul analizat este scurt, prezena altor substituii caracteristice
fiind limitat de dimensiunea lui. O serie de alte teste moleculare viznd ADN-ul mitocondrial
sau nuclear au foat realizate asupra aceluiai individ, n cazul tuturor reaciilor realizate
controalele de PCR i extracie fiind neamplificabile. Corelnd lipsa de amplificare din
controalele negative de extracie i PCR, cu prezena substituiei CT i rezultatele obinute n
cazul celorlate, fragmentul obinut pentru cromozomul Y poate fi considerat ca fiind amplificat
de pe matria de ADN vechi prezent n prob.

Figura 7. Alinierea secvenelor fragmentelor caracteristice cromozomului Y obinute n cazul individului I8.

Concluzii
Utilizarea amorselor propuse de Faerman n determinarea molecular a sexului nu a
condus la amplificarea segmentelor dorite, cel mai probabil, dimensiunea segmentelor intite
fiind prea mare pentru studiul ADN-ului vechi. Amorsele nou propuse care vizeaz segmente
mai scurte au condus n unele probe la amplificri caracteristice.
n ceea ce privete standardizarea unui protocol n vederea determinrii constante a
sexului utiliznd amorsele noi, acesta nu a putut fi nc pus la punct. Inconstana cu care are loc
amplificarea fragmentelor de inters se datoreaz unei serii de factori legate n primul rnd de
calitile ADN-ului extras i de cantitatea de elemente co-extrase cu efect inhibitor asupra
reaciei de amplificare.
Cu siguran metoda de extracie a ADN-ului influeneaz gradul de reuit al
amplificrii ulterioare. n cazul extraciei cu fenol, o serie de substane (fenol, acizi humici) sunt
co-extrase avnd ulterior efecte negative asupra PCR-ului. Extracia cu coloane cu membran de
siliciu ofer un ADN ca matri cu mai puini contaminani. Sursa de extracie este i ea
important dinii oferind rezultate constant mai bune dect oasele analizate.
n ceea ce privete strict eficiena amoselor sintetizate, acestea au rezultatele scontate la
amplificare n cazul n care matria de ADN este n cantitate suficient. n condiiile n care
ADN-ul vechi este degradat, amorsele tind s formeze dimeri, de dimensiuni confundabile cu ale
fragmentelor ateptate, motiv pentru care nu pot fi utilizate n PCR multiplex aa cum au fost
concepute. Amplificarea ntr-o singur reacie a fragmentelor caracteristice att cromozomului X
cat i cromozomului Y reprezint o metod rapid i eficient de atribuire a sexului. Necesitatea
utilizrii separate a amorselor nou concepute, pentru a evita dimerii este un neajuns al acestora.
O constant tinde s se observe totui n ceea ce privete extracia ADN-ului cu ajutorul
coloanelor cu membran de siliciu. n toate cazurile, amplificarea a avut succes, ADN-ul extras
fiind mai pur dect cel extras cu fenol. Amorsele ns au fost testate separat, n reacii diferite,
specifice fiecrui cromozom. n cazul polimerazei, MangoTaqTM DNA Polymerase tinde s ofere
rezultatele dorite n cazul ADN-ului extras cu ajutorul coloanelor cu membran de siliciu.
Pentru standardizarea unui protocol de determinare a sexului va fi necesar analizarea
mai multor probe pentru a se putea trage concluzii mai elocvente. Tendina de constan apare n
cazul extraciei cu coloane cu mebran de siliciu, cu siguran mbuntirea cantitii de ADN
extras fiind soldat cu reuita atribuirii moleculare a sexului n urma PCR-ului multiplex.

Studiul V.
Diagnosticul interdisciplinar al unui caz de diabet din perioada neolitic
Situl arheologic Suplacu de Barcu se afl n judeul Bihor, la limita cu judeul Slaj. n
aceast zon se ntalnesc trei uniti geografice importante: Cmpia de Vest, Dealurile de Vest, i
o parte a Munilor Apuseni (fig. 1.). Complexitatea structurii g eologice determin o mare
varietate de roci utile: marmur, calcar, gresie, granit, tufuri, o mare parte din ele fiind utilizate
de comunitatea de la Suplacu de Barcu pentru producerea de unelte de piatr lefuit (Ignat,
1998).

Fig. 1. Localizarea sitului arheogic Suplacu de Barcu.

(www.maps.google.ro)

Zonele mpdurite erau dominate de fag, pe lng care apar molidul, bradul, gorunul,
carpenul, ulmul i frasinul. Aceste specii au fost folosite de comunitile neolitice ca materiale de
construcii (Ignat, 1998). n ceea ce privete agricultura, se practica cultivarea cerealelor, mai
ales a grului (au fost descoperite rnie, vase de provizii).
Fauna acestei zone era una tipic pentru regiunile deluroase i montane central-europene:
cerbul, cerbul loptar, ursul, mistreul, lupul, vulpea, rsul, i numeroase psri printre care
cocul de munte, corbul i fazanul. Cercetrile arheologice au identificat prezena oaselor de
psri de talie mare cum ar fi barza, cocorul i pelicanul. Deseori sunt prezente rpitoarele
(acvile i vulturi) i n mod permanent galinaceele i anatidele. Pe lng oasele de la speciile
slbatice au fost descoperite i specii domestice: boul, oaia i capra (Ignat, 1998).
Locuinele grupului cultural Suplacu se grupeaz n a ezri permanente i sezoniere.
Aezarea de la Suplacu de Barcu-Coru este una permanent format din locuie de suprafa.
Aezrile sezoniere sunt cele din peteri (la Vadu Criului- Deven, Petera Caprelor) sau din
zonele joase, inundabile (Ignat, 1998).

Modificarea dietei - presiune selectiv asupra genelor implicate n

metabolism
Impactul pe care l-a avut adoptarea agriculturii asupra comunitilor umane a fost major
i a afectat mobilitatea, comportamentul, dieta, dinamica populaiilor etc.

Pe de o parte evoluia tehnologic i surpl usul de hran a dus la o explozie demografic

prin creterea fertilitii i scderea timpului dintre nateri (Wells & Stock, 2007).
n acelai timp, efectul asupra strii de sntate a fost unul negativ. Trecerea de la o diet
divers (carne de vnat, fructe, rdcini, semine etc.) la o diet bazat n cea mai pare parte pe
carbohidrai (amidon din cerealele cultivate, lactoza din produsele lactate ale animalelor
domesticite) duce la o serie de rezultate negative pentru sntate care se reflect n frecven a cu
care se observ deficienele nutritive i cariile dentare la astfel de populaii. n plus, traiul n
aezri permanente sau semi-peremanente alturi de animale domestice crete prevalena
zoonozelor (Pinhasi & Stock, 2011).
Apariia unor modificri ale metabolismului par a fi rezultatul presiunii selective asociate
cu domesticirea animalelor i plantelor. n Neolitic, dup trecerea la agricultur, are loc selecia
legat de persistena lactazei (Burger et al.,2007) i de numrul de copii ale genei pentru amilaz
(Perry et al., 2007).
De aceea, i apariia patologiilor metabolice, cum este diabetul n cazul de fa, poate fi
explicat prin selecia anumitor variante genetice ca rspuns la stresul nutriional asociat cu
trecerea la agricultur.

Materiale i metode
Arheologie
Situl arheologic Suplacu de Barcu Coru a fost excavat ncepnd cu anul 1973 de D.
Ignat, iar n ultimii zece ani de G. Fazeca. Punctul central al spturilor arheologice a fost
aezarea care aparine grupului Suplacu, datat n perioada Neoliticului Mi jlociu. Campania
arheologic din 2012 a utilizat metode geofizice, ceea ce a dus la identificarea a 60 de complexe
arheologice, dintre care 53 au fost investigate. Printre acestea, a fost identificat un schelet
nhumat n poziie chircit. Pe baza stratigrafiei sitului, acest complex a fost datat la aproximativ
5000 . Hr.

Antropologie fizic
Pentru analiza osteologic a fost folosit un protocol bazat pe indicaiile descrise n
Standards For Data Collection from Human Skeletal Remains (Buikstra, Ubelaker 1994) i Data
Collection Codebook (Steckel et al., 2011).
Determinarea sexului s-a fcut pe baza morfologiei craniului i a pelvisului.
Vrsta a fost estimat pe baza morfologiei simfizei pubiene, a suprafeei auriculare a
sacrului i a capetelor sternale ale coastelor.
Modificrile patologie au fost analizate urmrind descrierile fcute de Ortner, 2003,
Aufderhaide i Rodriguez -Martin, 1998, Waldron, 2009 i Pinhasi i Mays, 2008.
Pentru obinerea mai multor detalii privind aspectul unor oase afectate de fenomene
patologice au fost realizate radiografii cu raze X.

ADN vechi- probleme specifice, limite

Exist dificulti ntruct dup moartea organismului mecanismele reparatorii nu mai
funcioneaz i ADN se degradeaz n timp. Acesta se gsete sub forma unor fragmente de

cteva sute de perechi de baze. n plus, apar modificri precum: monocatene i situsuri apurinice
datorate hidrolizei, dezaminarea citozinei i tranziia ei n timin, oxidarea care mpiedic reacia
de PCR i alchilarea ADN (Lamers, Hayter, & Matheson, 2009).
Datorit faptului c ADN vechi se gsete n cantitate mic i degradat sunt necesare
msuri de protecie pentru a evita contaminarea cu ADN modern. Toate experimentele s-au
desfoar n condiii standard de sterilitate, ntr-un laborator dedicat exclusiv acestui scop.
Laboratorul este separat de cel n care se lucreaz cu ADN modern, care se afl la un etaj diferit
n cadrul aceleiai cldiri. Toate probele au fost verificate, att n etapa de extracie ct i n cea
de PCR, prin una sau mai multe probe control.

Selecia genelor, proiectarea amorselor

Exist numeroase studii care i propun s descopere asociaia dintre unele mutaii i
apariia diabetului zaharat. Exist un numr de mutaii care sunt asociate consecvent cu un risc
crescut de apariie a diabetului. Dintre aceste mutaii au fost selectate cele de interes n acest
studiu.
Selecia s -a fcut innd cont de mai multe variabile: vrsta individului la momentul
morii, sexul brbtesc, caracteristicile dietei specifice Neoliticului european. n plus, deoarece
structura genetic a populaiilor neolitice europene este diferit de cea a populaiilor actuale,
trebuie luate n considerare rezultatele studiilor genetice obinute pentru o ct mai mare varietate
de populaii moderne.
Avnd n vedere c vrsta individului a fost estimat la 33-45 de ani, i c individul a trit
cu diabet suficient timp inct s dezvolte complicaiile osoase asociate, vrsta de debut se
ncadreaz n intervalul 20-40 de ani.
Un alt aspect important este dieta. Lund n considerare ceea ce se cunoate despre dieta
tipic a comunitilor neolitice (Richards et al., 2003) dar i faptul ca individul nu prezenta
markeri osoi asociai cu obezitatea, am ales s exclud mutaiile implicate n metabolismul
lipidic i obezitatea central care ar putea duce la apariia diabetului.
Avnd n vedere aceste informaii, analiza genetic a urmrit cteva SNP asociate cu
MODY, rezistena la insulin i diabet ul mitocondrial.
Termenul MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) este folosit pentru a descrie un
grup de forme de diabet non insulino-dependent, heterogen din punct de vedere al cauzelor
genetice. Mutaiile implicate n MODY afecteaz dezvoltarea/diferenierea sau funcionarea
celulelor pancreatice n diferite moduri; acestea se reflect n diferene n ceea ce privete
vrsta de debut, gravitatea hiperglicemiei i riscul apariiei complicaiilor (Ellard & Hattersley,
2008).
Mutaiile care duc la pierderea funciei n genele pentru glucokinaz (GCK) i factorul
nuclear hepatic 1 (HNF1A) sunt cea mai comun cauz a diabetului monogenic i apar la
aproximativ 80% din pacienii diagnosticai cu diabet monogenic n Marea Britanie (Ellard,
Thomas, Edghill, & Owens, 2007). Mutaiile care afecteaz gena HNF4A sunt de asemenea o
cauz pentru MODY (Molven & Njlstad, 2011).
SNP rs1799884 n gena GCK este unul din SNP relativ comune care au fost asociate cu
apariia diabetului de studiul DESIR (Data from the E pidemiological Study on the Insulin
Resistance Syndrome) realizat pe 3877 de indivizi caucazieni. Indivizii homozigoi A:A sau
heterozigoi A:G prezint un risc crescut de a dezvolta diabet de tip 2 (Vaxillaire et al., 2007).

SNP rs2144908 n gena HNF4a a fost asociat cu riscul crescut pentru diabet de tip 2 n
studii realizate pe populaii de evrei a shkenazi (Love-Gregory et al., 2004) i finlandezi (Silander
et al., 2004). De asemenea, este una din mutaiile vizate de studiul DESIR (Vaxillaire et al.,
2007).
SNP rs1169288 n gena HNF1a a fost asociat cu apariia MODY 3 n studii realizate pe
pacieni din Suedia i Finlanda (Giuffrida et al., 2009).
SNP rs3792267 n gena CAPN 10 a fost asociat cu diabetul de mai multe studii realizate
pe populaii europene din Germania, Finlanda, Danemarca, Marea Britanie, Polonia, Cehia i
Frana (Tsuchiya et al., 2006).
O alt mutaie pe care am urmrit-o n acest studiu este i cea mai comun mutaie n
ADN mitocondrial asociat cu diabetul: A3243G n gena care codific ARNt Leu (MTTL1)
(Janssen et al., 2007).
Tabel 1. Sumarul mutaiilor analizate

Gena

SNP

Element codificat

Funcia n celul

Asociat cu

GCK

rs1799884
GA

Glucokinaza

Fosforileaz glucoza la
glucoz-6-fosfat

MODY

MTTL1

3243
AG

ARNt Leu
mitocondrial/

ARNt pentru sinteza

proteinelor

HNF4A

rs2144908
GA

Factorul nuclear
hepatic 4

Factor de transcriere

Diabet i surzenie
transmise pe linie
matern
MODY

rs1169288
TG
CAPN10 rs3792267
GA

Factorul nuclear
hepatic 1
Calpain 10

Factor de transcriere

MODY

Proteaz activ n
pancreas

Rezisten la insulin

HNF1A

Tabelul 1 sumarieaz informaiile despre SNP selectate pentru a fi detectate n analiza

cazului de la Suplacu.
Avnd n vedere vechimea rmielor arheologice (6000 de ani) secvenializarea genelor
n ntregime nu este o strategie fezabil. Cel mai probabil, ADN este degradat i fragmentat ,
majoritatea fragmentelor avnd lungimi de cteva sute de perechi de baze. De aceea, am ales s
folosesc amorse care s amplifice fragmente de 100-150 de perechi de baze n jurul mutaiei de
interes. Amorsele au fost proiectate cu ajutorul aplicaiei NCBI primer BLAST tool
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Amorsele folosite se regsesc n tabelul 2.
Tabel. 2 Amorsele folosite pentru amplificarea secvenelor int

Gena
GCK

SNP

Amorse

rs1799884 Forward:CACATCCTAGCCTGCTTCCC
Reverse:TGGTCACCATGACAACCACA

Lungimea produsului
PCR
132

Forward: GGTGTGGAGGGGGGATTCT
Reverse:TTGCCACCAGTCCCAGTTTTA
MTTL1
A3243G Forward: TTATACCCACACCCACCCAAG
Reverse: TACAATGAGGAGTAGGAGGT
HNF4A rs2144908 Forward:CCGTGGGGAACAAGGATGTAA
Reverse:AGAGTCAGGAGATCAGGCCC
HNF1A rs1169288 Forward: CCCTGTGGCAGCCGAG
Reverse: TTCTCCAGCCAGGAGGTAGG
CAPN10 rs3792267 Forward: ACACCGGATGCCAGAGAGTT
Reverse: CATCCTCACCAAGTCAAGGCT

143
143
131
141
111

Analiza izotopic
Datarea cu radiocarbon a fost metoda folosit pentru a confirma vechimea estimat a
scheletului de la Suplacu de Barcu.
Analiza izotopilor stabili de carbon i azot din colagenul din oase este folosit n studiile
de bioarheologie pentru reconstrucia dietei/ nutriiei.
Se poate stabili dac sursa primar de proteine din diet era de origine animal, vegetal
sau o combinaie din cele dou. Proporia izotopilor 15N la 14N indic nivelul trofic al unui
organism. Animalele ncorporeaz preferenial 15N din surse alimentare. Aadar, raportul 15N la
14
N crete pe niveluri trofice succesive.
Cantitatea de 13C raportat la 12C este o msur a dependenei alimentare de plante cu
metabolism C3 sau C4. Att planete C3 ct i plantele C4 sunt mai srace in 13C dect sursa lor
de carbon, CO2 atmosferic. Datorit diferenelor din fotosintez, plantele C3 ncorporeaz mai
puin 13C dect plantele C4 (Leatherdale, 2013).
Analiza a fost facut extern, de ctre Beta Analytic Inc (Florida, SUA).

Spectroscopie n infrarou cu transformat Fourier (FT-IR)

Spectroscopia n infrarou cu transformat Fourier este o tehnic prin care se poate obine
un spectru de absorbie pentru un domeniu larg de spectre , simultan. FT-IR este folosit pentru a
identifica i cuantifica gruprile funcionale polare din structura unei probe (White, 1990).
FT-IR este o metod potrivit pentru a evalua variaiile n compoziia chimic a osului.
Msuratorile cantitative ale compoziiei chimice a osului pot oferi informaii despre formarea
osului i pot indica eventuale patologii.
unor
anomalii
musculo -scheletale:
Diabetul
zaharat
determin
apariia
i
dificulti
n
vindecarea
oaselor
lezate
osteopenie/osteoporoz,
(Kim et al., 2001). Diabetul
poate afecta formarea si resorbia oaselor prin determinarea multor modificri metabolice ce
afecteaz echilibrul fosfo-calcic i acido-bazic.
ntr-un studiu realizat pe obolani diabetici s -a observat o scdere a coninutului total de
colagen n calusul format dup fracturi fa de grupul control. Cantitatea de colagen a fost
estimat prin msurarea raportului fosfat/carbonat detectat prin FT-IR (Boyar et al., 2003).
Pentru analiza FT-IR s-a folosit pulbere de os obinut mecanic prin frezare. 0,8mg de
pulbere de os au fost amestecate cu 150mg de KBr i presate la presa hidraulic la 175 kg/cm2.
Spectrele FT-IR au fost obinute cu ajutorul aparatului FT/IR JASCO 6000, folosind platforma
software Spectra Manager. S-a construit spectrul de absorbie ntre numere de und 400 i 4000

cm-1, cu 265 de scanri i rezoluie de 4 cm -1. Spectrele obinute au fost normalizate i prelucrate
cu ajutorul softului Essential FTIR (http://www.essentialftir.com/).
Un spectru tipic pentru os este prezentat n figura 2.

Fig.2. Spectru FT-IR tipic pentru os. (dup Kobrina et al.,

2010)

Raportul carbonat la fosfat a fost calculat ca raportul dintre suprafaa de sub maximul
pentru CO32- (850-890 cm-1) i PO 43- (900-1200 cm-1) (Boyar et al., 2003).

Metode moleculare
Extracia ADN
O caracteristic a lucrului cu ADN vechi este necesitatea de a evita contaminrile cu
ADN din surse externe. ADN vechi se gsete degradat i n caniti mici. n cazul unei
contaminri cu ADN extern, n reacia PCR va fi folosit ca matri ADN mai puin degradat. Din
aceast cauz n laboratoarele de ADN vechi trebuie s existe un circuit cu un singur sens:
extracia ADN, PCR, prelucrare post-PCR. Asta nseamn c laboratorul de extracie ADN este
izolat spaial de laboratorul de PCR.
Pentru a evita contaminarea ntre probe succesive, laboratorul este curat nainte de
fiecare utilizare cu o soluie de 5% Clor i iradiat cu UV. Extracia se face ntr -o hot nchis cu
presiune pozitiv i filtre de aer HEPA. Interiorul hotei se cur cu so luia de Clor nainte de
fiecare extracie, i lmpile UV funcioneaz minim 4 ore nainte de introducerea probelor.
Accesul n laborator se face individual; echipamentul standard este format din:
combinezon de unic folosin, acoperitori de nclminte , mnui din latex i masc cu filtru
pentru particule.
Toate tuburile de plastic folosite n procesul de extracie sunt sterilizate prin autoclavare
i iradiere cu UV.
Datorit nhumrii, n probe exist acizi humici din sol. Acetia, dar i calciul din oase,
sunt inhibitori ai reaciei PCR. Decalcifierea oaselor este o etap obligatorie nainte de extracia
propriu-zis.
Cum nu exist un protocol de extracie a ADN vechi care s fie eficient n orice situaie,
fiecare grup de cercetare i stabilete propriul protocol prin adaptarea celor deja existente. Am
folosit dou metode de extracie: una bazat pe un protocol clasic cu fenol -cloroform i cealalt

utiliznd un kit de purificare a produilor de PCR. Sursele de ADN folosit sunt oasele lungi
(femur, humerus) i molarii biradiculari.
Protocolul de extracie cu fenol cloroform a fost elaborat pe baza celor folosite de
Hervella et al., 2012, Ginther et al., 1992 i Hagelberg & Clegg, 1991:
Curarea oaselor
Splare cu soluie clor 5% i H 2O UP/UV.
Iradiere cu UV 20 minute
ndeprtarea suprafeei osului.
UV, 10 minute.
Osul sau dintele au fost apoi pulverizate cu ajutorul unei freze dentare, pulberea obinut
fiind folosit n etapele urmtoare.
1.

2.

Decalcifierea
Soluie de decalcifiere: EDTA 0,5M, SDS 0,5%,TrisHCl 50mM, proteinaz K
1 mg/ml, pH=9.
Pulberea de os este incubat cu soluia de decalcifiere timp de 24 de ore, la 56 oC.
3.
Extracia cu fenol -cloroform.
Centrifugare 5 min, 6.000x g.
1 vol. Supernatant + 1 vol. fenol:cloroform 1:1. Centrifugare 15 min, 6.000x
g.
1 vol. faza organic (superioar) + 1 vol. fenol:cloroform 1:1. Centrifugare 15
min, 6.000x g.
1 vol. faza organic + 1 vol. cloroform. Centrifugare 15 min, 6.000x g.
Precipitare cu etanol: 1 vol. faza organic + 2,5 vol. etanol absolut, 10 min la 4oC. Centrifugare 15 min, 12.400x g.
Splare cu etanol: Precipitatul + 1 mL etanol 80%. Centrifugare 5 min,
12.400x g.
Uscare la 56oC.
Precipitatul se resuspend n 1 mL H2O PCR-grade.
4.
Filtrare prin filtre Centricon 30k. Centrifugare 10 minute, 5.000x g.
Protocolul de extracie cu kit QIAQuick PCR Purification Kit (Quiagen) cu coloane cu
membran de silica (Yang et al., 1998; Anderung et al., 2008):
1.
Curarea oaselor se face prin aceeai metod ca n protocolul de extracie cu
fenol-cloroform .
2.
Decalcifiere
Soluie de decalcifiere EDTA 0,5M, SDS 5%, proteinaz K 20 mg/mL.
Pulberea de os este incubat cu soluia de decalcifiere timp de 24 de ore, la 55oC apoi
nc 24 de ore la 37 oC.
3.
Extracia ADN
Centrifugare 5 min, 2.000x g.
Supernatantul + 5 vol. PB Buffer.


4.

5.

Amestecul se filtreaz printr-o coloan cu silica prin centrifugare 1 minut la

12.400x g. Se arunc filtratul.
Splare
Se ncarc 750L PE Buffer n coloan i se centrifugheaz 1 minut la
12.400x g. Se arunc filtratul i se repet pasul de splare.
Se arunc filtratul i se centrifugheaz 1 min la 12.400x g pentru ndeprtarea
complet a etanolului.
Eluare.
Se transfer coloana n tub nou de 1,5mL i se adau g 100L Elution Buffer.
Se incubeaz la temperatura camerei timp de 5 miute.
Centrifugare 1 minut la 12.400x g.

Evaluarea randamentului extraciei a fost bazat pe determinarea spectrofotometric a

concentraiei ADN.
PCR
n laboratorul de PCR s-au urmrit aceleai condiii de sterilitate ca i n cel de extracie.
Pentru amplificarea fragmentelor de interes s-au folosit amorsele desrise n tabelul 2.
nainte de utilizarea lor n lab de ADN vechi, amorsele au fost nti testate pe probe
moderne de ADN uman.
Pentru optimizarea PCR cu ADN vechi, am testat o serie de polimeraze: MangoTaq
(Bioline), Kapa2G Robust HotStart (Kapa Biosistems), Kapa2G Robust (Kapa Biosistems),
Kapa HiFi HotStart (Kapa Biosistems), MyTaq (Bioline), PlatinumTaq (Invitrogen). Mango Taq
a dat cele mai bune rezultate, aadar a fost folosit n majoritatea reaciilor.
Protocolul de baz pentru volum final 25L.
Concentraia iniial Volum iniial Concentraia final Program
5x
5L
1x
Buffer
50mM
1L
2mM
MgCl2
10mM
0,5L
0,2mM
dNTP
95oC 5
10pmoli/L
1,25L
0,5pmoli/L
Forward
95oC - 30
10pmoli/L
1,25L
0,5pmoli/L
Reverse
Ta - 30
72oC 30
0,25L
1,25 U/reacie
MangoTaq 5U/L
95oC 5
1L
ADN
14,75L
H2 O
Optimizarea protocolului de PCR a fost fcut prin modificri ale concentra iei de MgCl2
(ntre 2 i 2,5mM), numrului de cicluri (ntre 30 i 40), cantitii de ADN (ntre 0,5 i 7 L).
Verificarea existenei ampliconului de dimensiunea ateptat s -a fcut prin electroforez
n gel de agaroz (1,5% agaroz).
n cazul n care exist ampliconul ateptat, banda a fost excizat din gel i ADN purificat
cu ajutorul kitului FavorPrep GEL Purification Kit (Favorgen).

Clonare si secvenializare
nainte de secvenializare este necesar o etap de clonare. Astfel se pot selecta pentru
secvenializare doar plasmidele care conin insertul de dimensiunea dorit; iar dupa obinerea
secvenelor se poate face distincia dintre o mutaie (care apare n toate clonele) i o eroa re
datorat degradrii postmortem (care apare doar n unele clone).
Pentru clonare a fost folosit kitul CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific).
Bacteriile competente folosite au fost E.coli XL1-Blue sau E. coli DH5.
Bacteriile transformate au fost inoculate pe plci cu mediu LB solid i ampicilin 100
mg/L. Au fost folosite 6 colonii/plac care au fost transferate n 4 mL de mediu LB cu 100 mgL
ampicilin i incubate la 37 oC cu agitare continu timp de 16 ore. Plasmidele au fost izolate cu
ajutorul GeneJET Plasmid MiniPrep Kit (Thermo Scientific).
Prezena insertului a fost verificat prin digestie cu enzima Bgl II i electroforez.

Interpretarea secvenelor
Pentru fiecare produs PCR de interes au fost secvenializate 6 clone de ctre Macrogen
Inc (Coreea de Sud).
Analiza secvenelor obinute a fost fcut cu ajutorul softului BioEdit.

Rezultate i discuii
Antropologie fizic
Scheletul aparine unui brbat cu vrsta cuprins ntre 33 i 45 de ani. Scheletul este bine
conservat, cu excepia cutiei craniene. Lipsesc 4 dini datorit proceselor postmortem.
Din 32 de dini permaneni rupi, individul a pierdut 11 n timpul vieii. n ceea ce
privete patologiile dentare, se pot observa 5 abcese i 4 carii. Uzura suprafeei molarilor este
moderat pn la sever (scoruri ntre 4 i 8 conform Data Collection Codebook, (Steckel et al.,
2011)). n plus, caninul maxilar stng prezint o uzur neobinuit pe latura lingual care
sugereaz o utilizare special, non-alimentar. (figura 3) Hipoplazia smalului nu exist sau nu a
putut fi observat din cauza numarului mare de dini pierdui.

Fig.3. Caninul maxilar stng.

n analiza scheletului au fost urmrii i o serie de markeri specifici pentru stresul

profesional, stresul nutriional sau patologii nespecifice.

Fig.4. Distribuia
proceselor degenerative

Au fost observate modificri degenerative n mai multe articulaii (figura 4). n ceea ce
privete membrele superioare, cel drept este mai afectat, procesele degenarative fiind prezente pe
capul humeral i oasele minii. n cazul membrelor inferioare, este afectat centura pelvian:
acetabulul i capul femural.
Toate regiunile coloanei vertebrale prezint osteofite de dimensiuni medii. n plus,
ultimele dou vertebre lombare sunt sudate ntre ele i cu prima vertebr sacral prin formaiuni
osoase specifice pentru DISH (Diffuse Idiopathic Skeletal Hyperostosis). DISH este caracterizat
prin osificarea ligamentelor longitudinale ale coloanei vertebrale ce rezult n fuziunea
vertebrelor afectate (Dupras et al., 2010). Poziia coloanei vertebrale este afectat de aceast
fuziune anormal a vertebrelor. (figura 5)

Pe suprafaa orbitei drepte se observ aspectul poros c aracteristic pentru cribra

orbitalia.(figura 6)

Fig. 5. DISH

Fig. 6. Cribra orbitalia

Pe diafizele tibiilor se observ urme de osteoperiosit.

Patru dintre coaste prezint fracturi antemortem remodelate. Starea precar de conservare
a coastelor nu a permis stabilirea poziiei acestora n cadrul cutiei toracice. Dei fracturile sunt
bine aliniate, n procesul de vindecare s-a produs calus osos n zona leziunii.
Cele mai notabile modificri patologice prezente pe acest schelet sunt leziunile litice
bilaterale pe calcanee. Leziunile sunt situate pe tuberozitatea calcaneului, n punctul de inserie al
tendonului lui Ahile. Calcaneul drept este cel mai afectat; leziunea msoar 18,5 x 23.6 mm.
Formarea exostozelor n jurul marginii leziunii sugereaz c piciorul a fost folosit dup
dezvoltarea infeciei. Trsturile morfologice indic faptul c infe cia era activ n mometul
morii individului. Modificrile observate pe calcaneul stng indic o infecie similar, dar ntr un stadiu mai puin avansat. Tuberozitatea calaneului stng prezint erodare, cu patru caviti de
dimensiuni mici (figura 7).

Fig. 7. Leziuni pe calcanee

Pentru a evalua gradul de extindere a leziunilor, au fost fcute radiografii pentru aceste
oase. (figura 8.)

Fig. 8. Radiografii cu raze X ale oaselor calcanee.

Diagnosticul diferenial
Individul a suferit o serie de modificri patologice i traume descrise n analiza de mai
sus. Pentru a le determina cauza, mai multe variante de diagnostic au fost luate n considerare:
osteomielita, tuberculoza, bruceloza i diabetul zaharat.
Punctul de plecare n acest diagnostic au fost leziunile de pe calcanee. Acestea ar putea fi
datorate piciorului diabetic, o complicaie comun a diabetului netratat.
Alte simptome asociate cu diabetul sunt capsulita adeziv (limitarea mobilit ii
articulaiei gleno-humerale) i DISH (Dupras et al., 2010).
Asocierea diabetului cu patologiile dentare este de asemenea un motiv n plus pentru
susinerea diagnosticului de diabet. Complicaiille diabetului netratat includ gingivita,
periodontita, cariile, xerostomia i pierderea dinilor (Dupras et al., 2010).

Analiza izotopic
Vrsta scheletului, determinat prin metoda datrii cu radiocarbon este 5890 30 ani.
Raportul 13C/12C n colagenul din oasele scheletului de la Suplacu este -20,7. Pentru
plantele C3, raportul este -27,1, iar pentru plantele C4, -13,1. De aici rezult ca ponderea
plantelor C3 i a celor C4 era echilibrat n dieta acestui individ.
Raportul 15N/14N este +10,1. n lipsa unor rmie scheletice din acelai sit, raportul
acesta poate fi interpretat prin comparaie cu o populaie de vechime asemntoare (Richards et
al., 2003). Raportul 15N/14N este mai mare dect al animalelor ierbivore, ceea ce indic o diet a
acestui individ bogat n proteine animale.

Spectroscopie n infrarou cu transformat Fourier (FT-IR)

Raportul carbonat la fosfat a fost calculat ca raportul dintre suprafaa de sub maximul
pentru CO32- (850-890 cm-1) i PO 43- (900-1200 cm-1).
Am comparat valorile raportului fosfat/carbonat ntre oase neafectate de patologii pentru
Suplacu i 3 indivizi din situl arheologic neoliti c de la Turda. Datele obinute sunt n tabelul 3 i
reprezentate n graficul 1.
10

Tabel 3. Raportul fosfat /

carbonat pentru oase neafectate

Proba
Suplacu
Turda 1
Turda 2
Turda 3

9.09

Fosfat/carbonat
3.8
9.09
5.88
5

P/C

7
6
5.88

5
4
3

5
3.8
Suplacu

Turdas 1

Turdas 2

Turdas 3

Grafic 1. Comparaia raportului fosfat/carbonat ntre individul de la Suplacu

i indivii aparent sntoi.

Pentru a evalua variaia ntre diverse zone ale scheletului, am comparat valorile obinute
petru oase neafectate vizibil (femur) i oase cu modificri patologice (vertebra L4, mandi bul).
Datele obinute sunt n tabelul 4 i reprezentate n graficul 1.

Tabel 4. Raportul fosfat / carbonat

pentru diferite zone ale scheletului

Proba
femur 1
femur 2
femur 3
L4 1
L4 2
L4 3
mandibula 1
mandibula 2
mandibula 3

Fosfat/carbonat
3.7
4
3.7
5.5
4.5
4.2
4
4.5
3.6
Grafic 2. Comparaia raportului fosfat/carbonat diferite zone ale
scheletului.

Modificarea raportului fosfat/carbonat n scheletul de la Suplacu poate indica o dereglare

a echilibrului fosfo-calcic ce poate fi explicat prin mobilizarea fosfatului din oase. Osteopenia
observat n radiografii este n concordan cu acest rezultat.
O dereglare a metabolismului fosforului se poate explica i prin corelaia cu o insuficien
renal datorat nefropatiei diabetice (Silva et al., 2013).

ADN
Extracia ADN prin metoda cu coloane cu membran de silica s-a dovedit a fi mai
eficient dect cea cu fenol-cloroform, din punct de vedere al concentraiei ADN, dar mai ales
prin lipsa contaminrii cu fenol i a randametului reaciilor PCR.
Amorsele au fost nti testate n reacii PCR cu ADN modern (3 probe i un control
negativ) (figura 9).

Fig. 9. Testarea amorselor cu ADN modern.

Fragmentele de interes au fost amplificate (figura 10) i clonate.

Fig. 10. PCR cu ADN vechi.

Secvenele obiute pentru MTTL1 (n reacii duplicat) i GCK nu indic prezena SNP
vizate. Repetarea secvenializrii pentru GCK a returnat secvene care se aliniaz parial cu
secvena de referin i conin deleii. Celelalte secvene nu au fost infor mative, fie pentru c nu
se aliniau n zona nucleotidului vizat, sau conineau amplificri nespecifice din ADN bacterian
din sol.

Discuii
Modificrile patologice observate pe scheletul individului de la Suplacu de Barcu sunt
asemntoare cu cele pe baza crora a fost diagnosticat cu diabet scheletul de la Dayr al-Barsha,
Egipt.
Rezultatele obinute prin FT-IR indic o afeciune care afecteaz ntreg scheletul
(sistemic).
Absena mutaiilor vizate indic , fie faptul c sunt mutaii mai rare, care au o frecven
mai redus n populaia contemporan , fie faptul c segmentele selectate pentru analiz nu conin
acele SNP care conduc la apariia diabetului la acest individ.

Concluzii
Analiza scheletului cercetat pe parcursul acestei teze a condus autorii spre un diagnostic
prezumptiv de diabet zaharat de tip 2 cu debut la maturitate pe baza analizei antropologice fizice.
Teza are ca obiect ncercarea de confirmare a diagnosticului prin metode de genetic molecular
prin analiza a cinci SNP dintre care unul apartinand genomului mitocondrial i patru genomului
nuclear.
Niciuna din mutaiile ateptate nu a fost revelat, fie datorit absenei sale, fie datorit
faptului c ADN vechi obinut a fost prea alterat pentru a conduce la amplificarea intelor.
Studiul va continua cu validarea rezultatelor obinute i extinderea analizei la alte
segmente int omise pana n acest moment.
Pe lang analiza antropologic fizic, care susine n continuare diagnosticul de diabet de
tip 2 cu debut la maturitate, i analizele FT-IR vin s ntreasc acest diagnostic.

Studiul VI.
Mormntul 10 din Biserica Sf. Nicolae Domnesc de la Curtea de Arge
(CO i P1 Adrian Ioni, Alexandru Simon, Beatrice Kelemen )

Obiectivele studiului preliminar

1. Analizarea regiunii de control a genomului mitocondrial n vederea prediciei
haplogrupului mitocondrial
2. Verificarea prin metode moleculare a sexului individului
3. Verificarea apartenenei individului la haplogrupul Y Ra1a, cel mai vechi haplogrup Y
descoperit la indivizi moderni purtnd numele Basarab
4. Verificarea prin metode moleculare a culorii ochilor (principal), prului (secundar)
pentru individul studiat
Extracia de ADN (realizat dup protocolul Yang et al, 1998) a permis recuperarea a 100
microlitri ADN total cu o concentraie de 18ng/microlitru.
1.
Dup amplificarea, clonarea i secvenializarea celor 8 fragmente care reconstruiesc
regiunea de control a genomului mitocondrial, pentru individul M10 de la Biserica Sf. Nicolae
din Curtea de Arge au fost identificate urmtoarele mutaii care l difereniaz de rCRS (revised
Cambridge Reference Sequence):
16093C 16291T 39T 73G 152C? 185A 263G
Analiza de predicie a haplogrupului mitocondrial a fost efectuat folosind platforma Haplogrep
(haplogrep.uibk.ac.at).
Cele mai probabile ncadrri sunt, n acest moment:
Haplogrup M5a1a - 73-185-263
Haplogrup H3v2 - 16093-73-263
Apartenena exact la unul din cele dou haplogrupuri va fi verificat dup o extracie ulterioar
de ADN prin amplificarea, clonarea i secvenializarea mutaiilor de diagnostic din regiunea
codificatoare a genomului mitocondrial.
Conform Eupedia haplogrupul M5a1a are o frecven crescut in populaia modern din
subcontinentul Indian, n timp ce haplogrupul H3v2 are frecven crescut n populaia modern
din Germania (rile German ice).
Secvena obinut pentru acest marker molecular la individul M10 a fost comparat cu singurele
date moleculare omoloage publicate pentru o comunitate cuman din punct de vedere cultural,
dar vestic din punct de vedere molecular (Bogacsi-Szabo et al, 2005). ntre cei 11 indivizi
analizai n cadrul acestui studiu, nu a fost semnalat prezena haplogrupului M5a1a, iar indivizii
majoritari, ncadrai n haplogrupul H, nu au fost ncadrai exact ntru -un subhaplogrup.

Pn la identificarea exact a haplogrupului/haplotipului mitocondrial, orice supoziie privind o

potenial ereditate matern legat de continental Asiatic i eventual migratori din aceast
regiune, nu poate fi verificat.
2.
ADN-ul extras a avut o calitate suficient de bun pentru a permite amplificarea unor
fragmente relevante din genele ce codifica amelogenina pe cromozomii X i Y n vederea
atribuirii prin metode moleculare a sexului. Rezultatul acestei amplificri a condus la concluzia
c individul M10 a aparinut sexului brbtesc. Dei inventarul individului i analiza de
antropologie fizic au preconizat aceast concluzie, atribuirea molecular a sexului ndeprteaz
orice fel de dubii n aceast privin.
3.
Pornind de la studiul publicat de Martinez-Cruz et al, 2012, i datorit cantitii limitate
de ADN genomic disponibil am verificat apartenena individului la cel mai vechi haplogrup Y
descoperit la purttori moderni ai numelui Basarab (i care, prin studii genealogice, pot s i
urmreasc ascendena n familia istoric a Basarabilor). Acest haplogrup Y, R1a1, este definit de
mutaiile M17 (rs3908 4G3G) i M56 (rs2032622 AT), care n urma investigaiilor nu au
fost descoperite la individual M10 din Curtea de Arge. Astfel, excludem relaia dintre individual
studiat i cei trei indivizi moderni purtnd numele de Basarab (1 din Ungaria, 2 din judeul Ilfov)
ncadrai n acest haplogrup. Analize ulterioare, dup o extracie viitoare de ADN genomic, vor
verifica apartenena lui M10 din Curtea de Arge la celelalte 10 haplogrupuri Y caracterizate
pentru indivizii moderni purtnd numele Basarab.
4.
Analiznd 6 mutaii punctiforme folosite n criminalistic i medicin legal pentru
reconstrucia culorii ochilor i prului (Rs12913832 (HERC2), Rs1800407 (OCA2), Rs12896399
(SLC24A4), Rs16891982 (SLC4A2), Rs1393350 (TYR), Rs12203592(IRF4)), se relev faptul
c ndividul M10 din Curtea de Arge a avut cu o probabilitate de 97,3 % ochi nchii la culoare i
cu o probabilitate de 99,0% pr de culoare castaniu nchis, ceea ce sus ine descoperire iniial a
unei uvie nchise la culoare la deschiderea iniial a morm ntului, dar i iconografia asociat
adesea cu indivizi aparinnd familiei Basarabilor.
Concluziile preliminare privind acest individ, bazate pe analiza contextelor arheologic, istoric i
biologic este c:
-

Aparine familiei Basarabilor, dar nu acelei ramuri care confer indivizilor moderni
haplogrupul Y R1a1
Nu este probabil, nici Vlaicu Vod, nici Radu Vod (ambele, nume sub care M10 a fost
identificat anterior)
Nu se pot trage concluzii privind o potenial ereditate cuman (cultural), asiatic (din
punct de vedere genetic) nici pe linie matern, nici pe linie patern.

Pentru detalierea acestor concluzii sunt necesare analize ulterioare, care sunt limitate n acest
moment, de absena unei cantiti suficiente de ADN genomic.

Studiul VII.
Copilul de la Mlieti (MMPP)
(CO i P1 Norbert Szeredai, Claudia Radu, Ioana Rusu, Beatrice Kelemen, Octavian Popescu)

Pentru analiza molecular a individului MMPP a fost extras ADN genomic din 5 coroane dentare
deciduale (1 incisiv central, 1 incisiv lateral, 2 canini i 1 molar). La momentul decesului acestea erau
incluse n maxilar i mandibul.
Dup curarea prin splri succesive n clor 30%, etanol 96%, ap ultrapur i uscare la UV,
probele nu au fost procesate suplimentar (folosirea frezei dentare, tiere etc.)
Pentru extractia de ADN genomic a fost folosit un protocol modificat dup Yang et al, 1998.
Modificrile au vizat perioada de digestie cu proteinaz K, care a fost crescut de la 24h la 60h.
n urma extraciei a fost obinut o cantitate de 100 microlitri ADN cu o concentraie de 54,80
ng/microlitru (Tabel 1).
Tabel 1. Cantitatea i calitatea ADN-ului genomic extras, n prob i blank
Sample Concentration (ng/l) 260/280
MMPP
54.8
1.47
Blank
1.9
1.17
Amorsele proiectate de Gabriel et al, 2002 au fost utilizate pentru amplificarea regiunilor
hipervariabile I i II din regiunea de control a genomului mitocondrial (Figura 2 a). Un exemplu de
amplificare obinut pentru fragmentul HVRIIA este ilustrat mai jos (Figura 2b).

HVRII A segment

200bp
100bp
MMPP

Blank

C-

Figura 2. Amorsele Gabriel et al, 2002 i exemplu de rezultat al amplificrii pentru fragmentul
HVRIIA.

Toate cele opt fragmente au fost amplificate cu success (n condiii de maxim monitorizare a
contaminrii: blancurile de extracie i controalele negative de amplificare nu au avut ampliconi), clonate
i secvenializate.
Analiza secvenelor a permis identificarea mutaiilor punctiforme relative la rCRS (revised
Cambridge Reference Sequence), care permit predicia haplogrupului mitocondrial)(Figure 3).

Mutaii reale

greeli, datorate degradrii postmortem a ADN-ului

Figure 3. Example of multiple alignment of HVRII clones versus rCRS
Mutaiile acestui individ, raportate la rCRS sunt:
HVRI 16069, 16193, 16278
HVRII 39, 73, 150, 152, 235
Pe baza acestora, utiliznd platforma Haplogrep (http://haplogrep.uibk.ac.at/), MMPP poate fi
ncadrat cu un grad mare de siguran n haplogrupul mitocondrial J2b1a (Figura 4).

Figura 4. Predicia haplogruului n platform Haplogrep .

J2b1a este un haplogrup mitocondrial relative recent, avnd o vechime de aproximativ 10000 de
ani, este relative rar, i se gsete aproape exclusive n populaia modern european, sau n populaii cu
origine european. Este distribuit mai ale n vestul Europei, de-a lungul coastei nordice a Mrii
Mediterane, n Spania i Portugalia. Frecvene populaionale mai mici au fost raportate n literatur pentru
Irlanda, Maroc, Grecia, Rusia i Moldova. Pala et al (2012) au analizat 27 de indivizi aparinnd acestui

haplogrup i au ajuns la concluzia ca distribuia actual a acestuia a fost puternic modelat de o

recolonizare post glacial a Europei din refugii din Orientul Apropiat.
Patologiile identificate pentru acest individ izolat (potenial thalassemie sau malarie) i distribuia
actual a haplogrupului J2b1a preponderaent n zone cu frecven e crescute ale ambelor patologii, cresc
gradul de interes pentru acest studiu. Prezentm mai jos o hart cu incidena malariei n perioada 19002002 (Figura 5).

Figura 5. Harta incidenei malariei n perioada 1900 -2002 (https://www.koshland-sciencemuseum.org/sites/all/exhibits/exhib_infectious/malaria_vector_control_05.jsp).

MMPP are n comun, cu un singur individ modern ncadrat n acest haplogrup, mutaia din poziia
235 a genomului mitocondrial (Pala et al , 2012) Numr de Acces GeneBank JQ797936, prob
identificat ca aparinnd unui evreu cu ereditate european). Acest aspect, ne ncurajeaz s atribuim
individului MMPP haplotipul J2b1a2a, extreme de rar, caracterizat pentru doar dou probe moderne de
ctre Pala et al (2012): JQ797936 (numit anterior) i JF93891 (un individ din Portugalia) (Figura 6).

Figura 6. Arbore MP pentru haplogrupul J2 publicat de Pala et al (2012). Sunt marcai cei doi
indivizi similari genetic cu MMPP.

Trei probe vechi, prezentnd haplogrupul J2b1a aparin grupului Schoningen (4100 -3950 BC),
culturii Salzmunde (3400-3100 BC) i culturii Unetice (2200 -1550 BC) i au fost descoperite n
Germania (Brandt et al, 2013). Acestea sunt mai diferite de haplotipul lui MMPP comparative cu cele
dou probe moderne menionate mai sus.
Toate aceste aspecte, indic faptul c individul MMPP a fost un imigrant, probabil dintr-o zon
peri-mediteranean. Momentul imigrrii nu poate fi dedus pe baza datelor existente n acest moment.

Raport de analiz arheozoologic asupra materialului osteologic de la Sibiu (neolitic)

Lajos Kiraly
(text parial)
Materialul arheozoologic analizat aparinnd neoliticului nsumeaz 1562 de resturi
osoase. Dintre acestea, bovinele sunt cele mai reprezentative cu un procentaj de 16,77%
(Tabel 1), dup numrul resturilor de oase identificate (NISP Number of Identifiable
Specimens). Ponderea att de mare a taurinelor, ne arat faptul c acest specie era crescut nu
doar pentru carne, ci i pentru traciune i produse secundare (lapte, piele). Menionm c a
fost identificat i un humerus care ar putea prezenta un caz patologic(diafiza osului are o
curbur mai accentuat).
n categoria cornutelor mici, ovicaprinele sunt reprezentate prin 75 fragmente
osteologice i doar prin 5 fragmente osoase, caprinele. De la capre au fost identificate doar
fragmente de coarne.
n cadrul lotului analizat, suinele ocup locul 3 ca importan alimentar n lotul speciilor
domestice evaluate. Cele mai multe resturi osoase provin de la mandibule i dentiii izolate (
Tabelul 2).
Au fost identificate 31 de fragmente aparinnd cabalinelor, majoritatea resturilor
(Tabelul 2) fiind dentiii izolate (12 fragmente) i metatars (5 fragmente, unele sunt ntregi).
Canidele ocup ultimul loc ca reprezentare n cadrul animalelor domestice evideniate
n lotul analizat , nsumnd un numr de 26 de resturi osoase (Tabelul 1), care aparin la cel
puin a doi indivizi, unul matur i unul tnr/ juvenil.
Dat fiind numrul prea mic de oase identificate, speciile slbatice sunt mai slab
reprezentate dect cele domestice. Dintre speciile slbatice, specia cea mai bine reprezentat
este cerbul (Tabelul 3) care se evideniaz prin 21 fragmente osteologice, dintre care cele mai
multe sunt coarne (19 fragmente), un fragment metatars distal i o falang proximal.
Majoritatea coarnelor de cerb au urme de prelucrare, unele dintre acestea sunt probabil
rebuturi rezultate n urma procesrii.
Au fost analizate 8 fragmente osoase aparinnd speciei Lepus europaeus (iepure)
aparinnd unui singur individ, iar 3 fragmente ( un craniu, un fragment de os coxal i un
femur) au fost atribuite unei specii de roztoare.
Cele mai puine resturi aparin cpriorului, cu un singur fragment de corn, bourul cu
un molar i un fragment de craniu (?), care prezint urme ale unor intervenii antropice i
mistreul de la care au fost identificai 2 canini inferiori..
n ceea e privete psrile i palmidele, acestea nsumeaz 50 de resturi osoase (Tabel
4), din care 7 fragmente provin de la gina domestic, iar alte 43 de la gsc. Raportul dintre
cele dou fiind de 0,44 % (Tabel 1), respectiv 2,75 %. Cu toate c din punct de vedere al
procentajelor specia Anser sp. predomin, aceasta se datoreaz faptului c cele 43 de resturi
osoase provin de la un schelet aproape complet.
Unele fragmente osoase prezint urme de tieturi (filetare) n anumite pri ale osului,
de exemplu: la nivelul articulaiilor tieturile sunt mai evidente fiind probabil rezultatul
aciunii de dezarticulare voit a scheletului; la nivelul apofizelor spinoase ale vertebrelor i la
nivelul diafizelor, tieturile sunt mai fine i sunt probabil rezultatul aciunii de descrnare a
osului. Menionm c pe cteva fragmente osteologice apar i urme de procesare termic
(arsur).

De asemenea, trebuie amintit faptul c n cadrul eantionului arheofaunistic, au fost

gsite i oase moderne; acestea au o culoare deschis i lucioas, cu o structur mult mai fin
dect ar fi trebuit s aib n mod normal, dac lum n considerare timpul petrecut n sol.
Aceste oase nu au fost luate n considerare la calcularea procentajelor.

Raportul analizei antropologice pentru materialul osteologic uman de la Capidava prelevat

n cadrul campaniei din 2014
Claudia Radu, Szeredai Norbert
Protocolul de lucru al Laboratorului de Antropologie Fizic utilizeaz urmtoarele metode:
Pentru determinarea sexului se observ morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,
marginea supraorbital, glabela i mentonul), respectiv a pelvisului (concavitatea
subpubic, unghiul subpubic, ramul ischiopubic, arcul ventral, arcul compozit, incizura
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora este realizat conform metodelor
descrise de Buikstra, Ubelaker (1994), Steckel et al. (2011), White, Black, Folkens
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (Ican,
Loth, Wright 1984), simfizei pubice (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011,
Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea vrstei la non-aduli se
observ erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011), se msoar
lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i se observ sinostoza epifizelor (Schaefer et al.
2009).
Statura este calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
(1965) i Breitinger (1937).
Patologia este analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998), Roberts, Manchester
(2005) i Waldron (2009). n cadrul analizei preliminare, pentru toate scheletele se
noteaz prezena artrozei articulaiilor, leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru
cribra orbitalia i cribra cranii, nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i
a aspectelor specifice rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor sunt
observate urmtoarele elemente: articulaia temporo-mandibular, cavitatea glenoid,
humerusul proximal i distal, radiusul proximal i distal, u lna proximal i distal, oasele
minii, fosa acetabular, femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula
proximal i distal, oasele piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar).
Pentru identificarea leziunilor periostitice se observ urmtoarele oase: clavicula,
humerusul, radiusul, ulna, femurul, tibia i fibula (bilateral).
Dentiia i patologia dentar se analizeaz conform standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile se analizeaz dup metodele descrise n Lovell (1997) i Buikstra,
Ubelaker (1994).
Cu toate c materialul osteologic a prelevat din 8 morminte, unele dintre acestea au coninut oase
de la mai muli indivizi (4 cazuri) . n aceste situaii, al doilea individ a fost notat cu litera B. n
cazul indivizilor non-aduli, vrsta a fost determinat pe baza erupiei dentare i a lungimii
oaselor. Deoarece n majoritatea cazurilor au existat diferene mari ntre cele dou rezultate, am
optat pentru vrsta determinat pe baza erupiei dentare. Acest lucru e motivat de studiile clinice
i bioarheologice care au scos n eviden faptul c, comparativ cu dezvoltarea dentiiei, creterea
i dezvoltarea scheletului este mult mai afectat de eventualele boli sau carene nutriionale la
care este expus copilul (Lewis 2007). Pentru indivizii sub 17 ani, sexul nu a fost determinat.

Mormntul 11
Cu toate c scheletul este relativ bine reprezentat, starea de conservare a oaselor este slab, n
cele mai multe cazuri compactul fiind distrus din sol. Am determinat vrsta la momentul morii
pe baza erupiei dentare, rezultatul fiind 7 -8 ani. Pe baza lungimii oaselor, vrsta a fost de 5 ani.
Scheletul pstreaz un numr de 29 de dini, dintre care 11 sunt deciduali erupi, 10 sunt
permaneni erupi iar 8 sunt permaneni neerupi. Pe molarul 2 decidual de pe partea dreapt a
maxilarului exist o carie interproximal. Pe dinii de pe corpul mandibular se poate observa
tartru slab. Periodontita este de asemenea moderat pe dinii maxilari. Att pe incisivii maxilari
i mandibulari ct i pe caninii maxilari se pot observa linii hipoplazice moderate. De asemenea,
pe toat dentiia decidual se observ uzur avansat, cu expunerea dentinei. Din 10 oase lungi
prezente, pe niciunul nu s-au observat leziuni periostitice. Nu am identificat porozitate specific
pentru cribra orbitalia i hiperostoza porotic. Dintre aspectele care pot indica prezena
scorbutului sau a rahitismului, acest individ nu a prezentat niciunul. De obicei, la indivizii att de
mici este greu s se observe prezena artrozei articulaiilor. n cazul individului M11, s -au
observat foarte clar schimbri degenerative pe ambii condilii mandibulari, parte a articulaiei
temporo-mandibulare.
Mormntul 12
Scheletul este moderat reprezentat, fiind prezente elemente din calota cranian i oase lungi;
scheletul axial este cel mai slab reprezentat. Conservarea acestora ns este bun. Din pcate nu
s-au pstrat dini, prin urmare vrsta a putut fi determinat doar pe baza lungimii oaselor. Pe baza
acestora din urm putem spune c acest individ a murit la natere, avnd o vrst perinatal (38
de sptmni prenatale). Din 10 oase lungi pstrate, niciunul nu prezint leziuni periostitice. Nu
s-au pstrat orbitele, deci nu am putut determina prezena cribrei orbitalia. Pe elementele calotei
craniene nu exist leziuni specifice pentru hiperostoza porotic. De asemenea, nu s-au identificat
aspecte patologice indicatoare pentru scorbut sau rahitism.
Mormntul 13
Individul M13A
Scheletul de non-adult este moderat reprezentat i conservat. Vrsta aproximat pe baza erupiei
dentare este ntre 18 i 24 de luni; pe baza lungimii oaselor rezultatul este inf erior, ntre 6 i 12
luni. Se pstreaz 10 dini deciduali erupi, 5 deciduali neerupi i 4 permaneni neerupi. Nu s -a
notat prezena tartrului, periostitei i a hipoplaziei smalului. Din 11 oase lungi prezente, pe unul
singur (tibia dreapt) s-au observat leziuni periostitice slabe. Orbitele nu s-au pstrat. Pe
suprafaa endocranian a occipitalului i a parietalelor exist distrugere de os, numit n literatur
hair-on-end lesions (Lewis 2004) (Fig. 1 i 2) . De asemenea, pe suprafaa exterioar a ca lotei
craniene exist porozitate accentuat. Alte aspecte patologice indicatoare pentru scorbut sau
rahitism nu s-au observat.
Individul M13B

Scheletul este foarte slab reprezentat: fragmente de arcuri vertebrale, coaste, poriunea proximal
a radiusului drept, scapula dreapt, fragment din clavicula dreapt. Pe baza lungimii scapulei,
vrsta la momentul morii a fost aproximat ntre 6 i 18 luni. Nu se pstreaz dini.
Mormntul 14
Scheletul este relativ bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii a fost determinat
pe baza erupiei dentare ca fiind ntre 6 i 9 luni. Pe baza lungimii oaselor, rezultatul este de 3 -6
luni. Se pstreaz 11 dini deciduali neerupi. Pe acetia nu am observat aspecte patologice. Din
14 oase lungi pstrate, niciunul nu prezint leziuni periostitice. Pe tavanul orbital nu exist
porozitate. S-a observat franjurarea capetelor costo-condrale, ns fr a fi afectat i cortexul
coastelor (Fig. 3). Att deasupra ct i sub spina scapular exist porozitate (Fig. 4). Parietalele i
occipitalul prezint de asemenea leziuni distructive pe suprafaa endocranian, ca i n cazul
individului M13A (Fig. 5).
Mormntul 15
Individul M15A
Scheletul este bine reprezentat, mai puin oasele lungi ale minilor. Pe baza erupiei dentare,
vrsta la momentul morii a fost aproximat ntre 5 -6 ani; lungimea oaselor a dat un rezultat
inferior, ntre 4 i 4.5 ani. Se pstreaz 17 dini deciduali, 3 p ermaneni erupi i 13 permaneni
neerupi. Nu s -a observat prezena tartrului sau a hipoplaziei enamelului. Se observ periodontit
att maxilar ct i mandibular. Uzura dinilor deciduali este accentuat, cu expunerea dentinei.
Din 8 oase lungi, 3 prezint leziuni periostitice: femurul drept, tibia dreapt i tibia stng.
Orbitele nu s-au pstrat. Pe suprafaa calotei craniene nu exist porozitate. Pe dintele axisului
exist un osicul, poziionat chiar n apexul dintelui (Fig. 6). Pe ambele femure, crista aspera este
pronuna t iar n zona anterioar a metafizei proximale se poate observa o faet produs prin
articularea cu fosa acetabular (Fig. 7). Pe femurul drept, pe metafiza distal, exist de asemenea
o cavitate poziionat pe locul de inserie al biceps femoris.
Individul M15B
Scheletul este slab reprezentat (falange, epifize, fibula, coasta). Vrsta la momentul morii
aproximat pe baza lungimii fibulei este ntre 0 i 1.5 luni postpartum.

Mormntul 16
Scheletul este bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii aproximat pe baza
erupiei dentare este ntre 3 i 4 ani; pe baza lungimii oaselor rezultatul este ntre 2 i 2.5 ani. Se
psreaz 19 dini deciduali. Nu s-au observat aspecte patologice pe acetia n afar de uzur

puternic pe incisivii centrali. Din 11 oase lungi analizate, pe niciunul nu am identificat leziuni
periostitice. Orbitele nu s-au pstrat. Pe craniu nu se observ porozitate. Capetele sternale ale
coastelor sunt franjurate, cortexul este distrus i afectate de porozitate (Fig. 8). Pe cortexul
corpului costal, se observ os nou depus, cu aspect neregulat i neorganizat. De asemenea i pe
metafiza femoral se poate observa acelai tip de franjurare i prezena porozitii. Lipsesc oasele
piciorului stng. Sutura metopic este deschis, cu prelungire pn la sutura coronar. Am
identificat un fragment de arc vertebral aparinnd unui copil cu o vrst i mai mic.
Mormntul 17
Individul M17
Scheletul bine reprezentat i conservat aparine singurului adult spat n aceast campanie.
Vrsta la momentul morii a fost determinat pe baza morfologiei capetelor sternale, simfizei
pubice i suprafeei auriculare, rezultatul fiind ntre 24 i 34 de ani. Pentru determinarea sexului,
am analizat att elementele craniene ct i cele ale pelvisului. Elementele craniene au o
morfologie masculin, dar cele pelviene sunt mai feminine. Rezultatul este posibil masculin.
Se pstreaz un numr de 32 de dini p ermaneni. Pe molarul 1 maxilar de pe partea stng
exist o carie interproximal i un abces dentar (Fig. 9). Pe mandibul exist tartru puternic.
Periodontita poate fi observat pe maxilar. Hipoplazia smalului este puternic pe toat dentiia,
att maxilar ct i mandibular (Fig. 10 i 11) . Uzura este moderat. Din 32 de elemente de
articulare analizate, 5 prezint modificri degenerative (humerus proximal dreapta, radiu distal
dreapta, oasele minii drepte, vertebrele cervicale, radius distal stnga). La ambele picioare,
falangele 2 i 3 de la al patrulea deget sunt unite. Pe axis exist o faet de articulare a dintelui cu
atlasul (Fig. 12). Din 13 oase lungi analizate pentru periostit, doar femurul de pe partea stng
prezint astfel de leziuni. Pe craniu exist porozitate. Orbitele nu au putut fi analizate. Statura
variaz n funcie de formulele aplicate: pentru formula lui Pearson (1899) pentru femur,
rezultatul este 155.28 cm; pentru formula lui Breitinget (1937) pentru femur, rezultatul este
161,91 cm.
Individul M17B
n timpul spturii, deasupra individului adult M17 s-au gsit, disparate, oase de la un subadult.
Scheletul acestuia este reprezentat doar de 4 coaste, fragmente de vertebre, scapula i humerusul
de pe partea stng i o fibul. Pe baza lungimii oaselor, vrsta acestui individ la momentul
morii este perinatal, 38 -40 de sptmni prenatale.

Mormntul 19

Materialul osteologic notat cu M19 era amestecat. Exist cu siguran cel puin doi indivizi, dar
faptul c acetia au aceeai vrst a ngreunat asocierea oaselor cu fiecare individ. Am fcut acest
lucru pe baza morfologiei i aspectului oaselor.
Individul M19A
Scheletul este bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii, determinat att pe baza
erupiei dentare ct i a lungimii oaselor, este perinatal, 38-40 de sptmni prenatale. Se
pstreaz 19 dini deciduali neerupi. Nu s-a identificat nicio patologie dentar. Din 12 oase lungi
prezente, pe niciunul nu exist leziuni periostitice. Tavanul orbital nu prezint schimbri
patologice. Pe craniu (occipital i temporal) i pe scapula stng se observ porozitate slab.
Metafizele oaselor lungi sunt slab franjurate, cu porozitate. De asemenea, diafiza tibiei de pe
partea stng pare a avea o curbur neobinuit. Sutura metopic este deschis i prelungit pn
la sutura coronar.
Individul M19B
Scheletul este reprezentat doar de coaste, diafizele humerale i femurul stng. Pe baza lungimii
oaselor, vrsta la momentul morii este perinatal, 38-40 de sptmni prenatale. Nu se pstreaz
dini. Cele trei diafize pstrate nu prezin leziuni periostitice sau aspecte patologice indicatoare
pentru scorbut i rahitism.
Alte oase
Printre oasele lui M16, am mai gsit un fragment de proces vertebral de la un copil (probabil
nou-nscut).
Printre oasele lui M17, pe lng oasele lui M17B, mai exist o falang de la un alt copil.

Imagini

Fig. 1. Individul M13A. Hair-on-end lesions pe suprafaa endocranian.

Fig. 2. Individul M13A. Detaliu cu leziunile endocraniene.

Fig. 3. Individul M14. Franjurare capetelor sternale.

Fig. 4. Individul M14. Scapula dreapt cu porozitate sub spina scapular (cu detaliu).

Fig. 5. Individul M14. Leziuni endocraniene (cu detaliu).

Fig. 6. Individul M15A. Axis.

Fig. 7. Individul M15A. Poriunea proximal a

femurului stng. Se observ faeta din zona trochanterului mare.

Fig. 8. Individul M16. Franjurarea capetelor sternale i os nou depus n zona leziunii (cu detaliu).

Fig. 9. Individul M17. Abces dentar (sgeat) pe maxilar n zona primului molar.

Fig. 10. Individul M17. Jumtatea stng a maxilarului. Se observ periodontita avansat
(sgeat) i liniile hipoplazice pe smalul dinilor (detaliu mai jos).

Fig. 11. (detaliu)

Fig. 12. Individul M17. Faet pe poriunea posterioar a dintelui axisului.

Raportul analizei antropologice preliminare pentru materialul osteologic de la Cristian

Claudia Radu, Szeredai Norbert

Protocolul de lucru al Laboratorului de Antropologie Fizic utilizeaz urmtoarele metode:

Pentru determinarea sexului se observ morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,
marginea supraorbital, glabela i mentonul), respectiv a pelvisului (concavitatea
subpubic, unghiul subpubic, ramul ischiopubic, arcul ventral, arcul compozit, incizura
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora este realizat conform metodelor
descrise de Buikstra, Ubelaker (1994), Steckel et al. (2011), White, Black, Folkens
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (I can,
Loth, Wright 1984), simfizei pubice (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011,
Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea vrstei la non-aduli se
observ erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011), se msoar
lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i se observ sinostoza epifizelor (Schaefer et al.
2009).
Statura este calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
(1965) i Breitinger (1937).
Patologia este analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009). n
cadrul analizei preliminare pentru toate scheletele se noteaz prezena artrozei
articulaiilor, leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru cribra orbitalia i cribra
cranii, nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i a afeciunilor specifice
rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor sunt observate urmtoarele
elemente: articulaia temporo -mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
distal, radiusul proximal i distal, ulna proximal i distal, oasele minii, fosa acetabular,
femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula proximal i distal, oasele
piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar). Pentru identificarea
leziunilor periostitice se observ urmtoarele oase: clavicula, humerusul, radiusul, ulna,
femurul, tibia i fibula (bilateral).
Dentiia i patologia dentar se analizeaz conform standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile se analizeaz dup metodele descrise n Lovell (1997) i Buikstra ,
Ubelaker (1994).
Materialul osteologic aparine unui numr de 6 indivizi. n unele cazuri s-a utilizat silicon dentar
de culoare portocalie pentru lipirea fragmentelor osoase. Statura nu a putut fi calculat pentru
niciun individ.
Mormntul 1

S-a analizat materialul osteologic de la doi indivizi, primii n cutii separate (complexul 019),
numii M1 defunctul 1 i M1 un defunct, acesta din urm fiind numit de noi M1B.
Scheletul individului M1 este slab reprezentat i conservat. Splarea oaselor i dizolvarea
pmntului cu ap a rezultat n numeroase fragmente osoase dar foarte puine dintre acestea au
putut fi reconstitute. Pentru a evita pierderea informaiei, materialul a fost analizat i nainte de
splare, cnd nc era inut n bulgrii de pmnt. Astfel am putut determina sexul individului,
care este masculin (rezultat dat de morfologia elementelor craniene) (Fig.1). De asemenea, am
notat faptul c lng mandibul, spre exemplu, am identificat diafiza unui humerus (Fig. 2). Pe
suprafaa orb itelor i a calotei craniene exist porozitate specific pentru cribra orbitalia i
hiperostoza porotic (Fig. 3 i 4).
S-a pstrat un numr de 25 de dini mpreun cu fragmente din mandibul i maxilar. Tartrul este
slab spre moderat. Pe coroana caninului mandibular se observ un defect al smalului, o linie
hipoplazic extins (2.15 mm n grosime) (Fig. 5). Pe caninii maxilari i pe incisivii mandibulari
nu exist astfel de defecte. Uzura molarilor este slab spre moderat. Pe fragmentele osoase
pstrate nu exist leziuni periostitice.
Individul M1B este i mai slab pstrat, fiind reprezentat de fragmente craniene, din coxal i de
oase lungi (Fig. 6). Pe lng acestea, mai exist 33 de dini, dintre care 9 sunt deciduali, 12 sunt
permanei erupi, iar 12 sunt permaneni neerupi. Tartrul este moderat att maxilar ct i
mandibular. Nu am observat linii hipoplazice pe incisivi i canini. Uzura molarilor deciduali este
puternic. Pe baza erupiei dentare, am determinat vrsta la momentul morii ntre 7 i 8 ani. Pe
fragmentele craniene nu se observ hiperostoza porotic.
Mormntul 2
Oasele umane ce compun materialul osteologic din acest mormnt aparin cel puin la doi
indivizi. Primul individ i cel principal (pe baza gradului de reprezentare a oaselor) es te probabil
un brbat (Fig. 10), cu o vrst la momentul morii ntre 20 i 25 de ani. Scheletul prezint un
grad de reprezentare moderat iar oasele se pstreaz ntr-o stare relativ bun (50-75%). De
asemenea, s-au pstrat 4 dini i fragmente din corpul mandibular i cel maxilar. Se observ
tartru i periodontit slab. Nu s-a putut nota prezena liniilor hipoplazice. Uzura dentar pe
molari este moderat, specific vrstei individului. Din 11 articulaii prezente, niciuna nu
prezint schimbri degenerative (artroza articulaiilor). Din 12 oase lungi prezente, fragmentare
sau ntregi, doar pe unul (tibia dreapt) s-au notat leziuni periostitce. Cu toate c orbitele nu s-au
pstrat pentru a se observa prezena cribrei orbitalia, pe craniu exist porozitate slab, specific
pentru hiperostoza porotic.
De asemenea, pe craniu am mai observat o serie de aspecte. n primul rnd, pe parietalul stng,
aproape de sutura sagital, exist o traum produs cu un obiect contondent i realizat
antemortem (Fig. 7 i 9). Diametrul traumei este de 8.40 mm, cu o adncime de 1.95 mm. Lng
aceast traum se observ i o fractur, lung de 72.2 mm (Fig. 8). Este posibil ca aceasta din

urm s fie o fractur radial cauzat de trauma iniial. Att trauma circular ct i fractura sunt
vindecate, de-a lungul fracturii existng i calus de dimensiuni moderate. n al doilea rnd, calota
cranian este ngroat anormal n unele locuri, ceea ce poate sugera boala lui Paget sau
hiperostoz frontal intern. Totui, aceste aspecte identificate pe calota individului din
mormntul 2 trebuie cercetate n continuare.
Cel de-al doilea individ, denumit de noi M2B, este slab reprezentat (oase lungi de la mn i
picioare, fragment de maxilar, oase de la picior). Scheletul aparine unui adult dar sexul rmne
indeterminat. O singur articulaie se pstreaz, dar aceast nu prezint schimbri degenerative.
Din 5 oase lungi pstrate fragmentar, pe niciunul nu se observ leziuni periostitice. S-au pstrat 2
dini n alveol, parte din corpul m axilarului, ceea ce ne-a permis s spunem cu siguran c acest
maxilar nu aparine individului M2. Nu s-au observat aspecte patologice, cu excepia tartrului
slab. Pe diafiza proximal a femurului drept, posterior, lng tuberozitatea gluteal, exist o
traum care taie locul de inserie al muchilor adductor magnus i gluteus maximus (Fig. 11).
Trauma msoar 15 mm i a fost realizat cu un obiect tios. Cronologia ei este antemortem,
fiind bine vindecat, fr urme de infecie.
Pe lng oasele indivizilor M2 i M2B, exist i oase de animale.
Mormntul 3 (complex 024, un adult i un copil)
Scheletul este reprezentat n special de fragmente de oase lungi, att superioare ct i inferioare.
Dinii lipsesc. Vrsta la momentul morii a fost determinat pe baza morfologiei suprafeei
auriculare, care ne indic o vrst ntre 35 i 39 de ani. Sexul nu a putut fi determinat datorit
lipsei elementelor de diagnostic. Prezena artrozei articulaiilor nu a fost notat pe cele 5 zone de
articulare prezente. Din 9 diafize de oase lungi prezente pentru observaie (unele doar n stare
fragmentar), doar pe femurul drept s-au observat leziuni periostitice slabe. Pe lng oasele
umane mai exist i dou fragmente de oase de animale.
Cel de-al doilea individ din mormntul 3 (M3 copil) este un non-adult. Acesta este reprezentat de
dini, fragmente din craniu i fragmente foarte mici de diafize. n ceea ce privete dinii, acetia
aparin att dentiiei deciduale (5 dini) ct i celei permanente, neerupte (9 dini). Dezvoltarea
dinilor indic o vrst la momentul morii de 2-3 ani. Pe incisivii deciduali maxilari de pe partea
stng se observ un defect al smalului.

Imagini

Fig. 1. Craniul individului din M1 nainte de splare.

Fig. 2. Craniul individului M1 nainte de splare. Lng mandibul se observ diafiza unui
humerus (n seciune).

Fig. 3. Hiperostoz porotic pe craniul individului M1.

Fig. 4. Cribra orbitalia (individul M1).

Fig. 5. Defect al smalului pe caninul mandibular drept al individului M1.

Fig. 6. Craniul individului M1B nainte de splare.

Fig. 7. Individul M2. Parietalul stng. Trauma circular este ncercuit cu rou. Linia roie indic
direcia fracturii (nu o suprapune, aceasta este n stnga linii roii).

Fig. 8. Detaliu cu fractura radial de pe parietalul stng al individului M2.

Fig. 9. Detaliu cu trauma circular identificat pe parietalul stng al individului M2.

Fig. 10. Occipitalul individului M2. Se observ creasta nucal foarte pronunat.

Fig. 11. Suprafaa posterioar a f emurul stng al individului M2B.

Fig. 12. Detaliu cu trauma de pe femurul individului M2B (n stnga liniei roii).

Raport antropologic Mlieti 2014

Szeredai Norbert, Claudia Radu
Materialul osteologic a fost analizat folosindu-se urmtoarele metode:

Pentru estimarea strilor de reprezentare i de conservare s-au aplicat standardele descrise

de Buikstra i Ubelaker (1994) i Steckel et al. (2011).
Pentru determinarea vrstei s-au aplicat metodele specifice pentru non-aduli, i anume
observarea erupiei dentare (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011) i msurarea
lungimii oaselor (Schaefer et al. 2009).
Patologia a fost analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009).
Dentiia i patologia d entar au fost analizate pe baza standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Msurtorile s-au realizat conform standardelor din Buikstra, Ubelaker (1994).

n urma analizei s-a determinat faptul c scheletul aparine unui c opil cu o vrst perinatal (0-2
luni), rezultat dat de observarea erupiei dentare i de lungimea oaselor (femur, illium). Starea de
conservare a scheletului este medie, puin peste 50%. Starea de reprezentare este bun (Fig. 2).
S-au identificat 10 dini deciduali neerupi (Sc1, Dc1, ?i2, ?i1, ?m1, ?m2, Dm2, Sm2, ?m1, ?i11).
Oasele lungi au fost analizate pentru identificarea unor leziuni periostitice, dar la non-aduli
acestea sunt dificil de difereniat de esutul fibros care reflect creterea i dezvoltarea normal a
osului (Lewis 2004, 2007). Totui, n cazul acestui copil, morfologia i distribuia esutului fibros
observat pe majoritatea oaselor sugereaz prezena unei boli infecioas e.
Oasele afectate sunt urmtoarele:
coaste
femur (stnga i dreapta)
humerus (stnga i dreapta)
ulna (stnga i dreapta)
radius
tibia
scapula
illium
clavicula (stnga i dreapta)
temporal (stnga i dreapta)
1

Aici am folosit modelul standard pentru notarea dinilor (White et al. 2012). Astfel, spre exemplu, LM1 reprezint
primul (1) molar (M) permanent (majuscule) mandibular (1) de pe partea stng (S). Rdm2 reprezint al doilea (2)
molar (m) decidual (litere minuscule i d) maxilar (2) de pe partea dreapt (D). Cnd am folosit semnul ?, nu s-a
putut stabili partea de pe care este dintele.

mandibula
frontal (endocranian)
occipital (baza craniului)
orbite
un metatarsian
vertebre

Pe aproape toate oasele prezente se observ os nou format cu aspect periostitic, a crui formare a
fost cauzat probabil de o inflamare subperiostal. Pentru diagnosticul diferenial al acestor
leziuni sunt foarte importante urmtoarele aspecte:
1. vrsta foarte mic (0-2 luni) a copilului;
2. aproape toate oasele scheletului sunt afectate;
3. printre oasele afectate se regsesc i mandibula, scapulele i claviculele;
4. patologia se manifest prin formare de os nou i nu prin distrugere osoas, cu toate c
cele dou procese pot fi ntlnite n cadrul aceleiai boli;
5. esutul patologic este localizat n special pe diafiza oaselor si nu pe metafiza acestora.
Vrsta foarte mic i gradul de afectare a scheletului (aproape toate oasele) ne indic faptul c
procesul infecios a fost iniiat nc din perioada intrauterin. Prin urmare, organismul copilului
s-a mbolnvit prin interaciunea cu organismul mamei, care e foarte probabil s fi suferit de
aceeai boal/condiie patologic. Faptul c toate oasele prezint aceste schimbri ne indic de
asemenea o afeciune sistemic i nu localizat. Modelul dup care este afectat scheletul acestui
copil ne-a fcut s lum n considerare pentru diagnosticul diferenial urmtoarele afeciuni:
scorbut (sau lipsa vitaminei C), anemie genetic (thalassemia major), sifilis endemic, malarie
congenital i hiperostoz cortical infantil.
Pentru argumentarea diagnosticului diferenial n continuare, vom realiza analiza SEM a oaselor.

Fig. 1. Clavicula stng.

Detaliu cu esutul periostitic,
comparativ cu esutul sntos
(stnga sus, de culoare
deschis).

Fig. 2. Starea de reprezentare a scheletului

(cu gri sunt colorate oasele prezente iar cu
alb cele absente).

Raport antropologic Miceti 2014

Claudia Radu, Szeredai Norbert
Materialul osteologic primit pentru analiz const n scheletele a trei indivizi provenind din situl
arheologic de la Miceti. Pentru analiza acestora s -au folosit urmtoarele metode:
Pentru determinarea sexului s-au observat morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,
marginea supraorbital, glabela i mentonul), respectiv a pelvisului (concavitatea
subpubic, unghiul subpubic, ramul ischiopubic, arcul ventral, arcul compozit, incizura
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora a fost realizat conform metodelor
descrise de Buikstra, Ubelaker (1994), Steckel et al. (2011), White, Black, Folkens
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli s-au observat capetele sternale (Ican, Loth, Wright
1984), simfiza pubic i suprafaa auricular (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011, Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel
et al. 2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea vrstei la subaduli
s-a observat erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011), s-a msurat
lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i s-a observat sinostoza epifizelor (Schaefer et
al. 2009).
Statura a fost calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
(1965) i Breitinger (1937).
Patologia a fost analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009). n
cadrul analizei preliminare pentru toate scheletele s-a notat prezena artrozei articulaiilor,
leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru cribra orbitalia i cribra cranii,
nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i a afeciunilor specifice
rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor au fost observate urmtoarele
elemente: articulaia temporo-mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
distal, radiusul proximal i distal, ulna proximal i distal, oasele minii, fosa acetabular,
femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula proximal i distal, oasele
piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar). Pentru identificarea
leziunilor periostitice au fost observate urmtoarele oase: clavicula, humerusul, radiusul,
ulna, femurul, tibia i fibula (bilateral).
Dentiia i patologia dentar au fost analizate conform standardelor din Buikstra,
Ubelaker (1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile au fost analizate dup metodele descrise n Lovell (1997) i
Buikstra, Ubelaker (1994).
Oasele sunt puternic afectate din sol att datorit activitii plantelor dar i datorit specif icului
solului, care rmne prins pe oase. O serie de elemente osoase au fost lipite pentru reconstituirea
osului folosindu-se silicon dentar de culoare portocalie. n cadrul analizelor antropologice
precedente s-a folosit pentru reconstituirea oaselor un material pentru lipit transparent. Din
pcate, degradarea post-mortem a scheletelor a limitat ntr-o oarecare msur observarea unor
aspecte patologice.

Scheletul individului nr. 9

Att starea de reprezentare ct i cea de conservare a scheletului sunt medii. Sexul a fost
determinat pe baza morfologiei craniului (mastoid, marginea supraorbital, eminena mental)
iar rezultatul este posibil masculin. Vrsta a fost aproximat pornind de la observarea
morfologiei capetelor sternale, suprafeei auriculare i a uzurii dentare, rezultatul fiind o vrst
cuprins ntre 26 i 45 de ani la momentul morii. Scheletul pstreaz un numr de 15 dini
permaneni din 22 poziii dentare observabile. Nu s-a notat pierderea dinilor antemortem sau
abcese dentare. O carie interproximal exist pe primul molar mandibular stng (SM 1). S-a
observat tartru dentar moderat, att mandibular ct i maxilar, i periodontit slab. Pe caninii
maxilari i mandibulari exist linii hipoplazice. Uzura molarilor este moderat spre sever. Din
15 articulaii observabile, nici una nu prezint schimbri specifice artrozei. Am identificat leziuni
periostitice pe dou oase, tibia i fibula stng, cu manifestare moderat. De asemenea, pe calot
exist porozitate specific pentru hiperostoza porotic. Orbitele nu au putut fi analizate pentru
observarea cribrei orbitalia. Din pcate, doar o singur vertebr s-a mai pstrat astfel c nu am
putut stabili prezena artrozei vertebrale sau a nodulilor lui Schmorl. Nu s-au identificat traume
sau fracturi. Statura nu a putut fi calculat deoarece oasele lungi ale cror msurtori sunt
necesare nu s-au pstrat ntregi. Pe lng oasele umane, mai exist o msea de animal.
Scheletul individului nr. 1
Strile de conservare i reprezentare sunt medii. Pe baza morfologiei elementelor de pe craniu
(creasta nucal, mastoid, marginea supraorbital, eminena mental) i de pe pelvis (arc
compozit, incizura sciatic) s-a stabilit c individul este de sex feminin. Vrsta a fost determinat
pe baza uzurii dentare, morfologiei suprafeei auriculare i maturizrii scheletului (nc se mai
observ linile de sudare a epifizelor), rezultatul fiind o vrst cuprins ntre 25 i 34 de ani. S -au
pstrat 22 de dini i 30 de poziii dentare. Ca i n cazul scheletului nr. 9, nu s-au observat
pierderea antemortem a dinilor sau abcese dentare. Exist o carie dentar, interproximal, pe
primul molar mandibular stng (SM1). Tartrul este puternic pe mandibul dar slab pe maxilar,
diferen care poate fi dat de procesele postmortem. Hipoplazia smalului dentar a fost
observat doar pe caninii mandibulari. Uzura molarilor este moderat. Din 20 de articula ii
analizate, patru (humerus proximal, radius distal, radius proximal i femur distal, toate de pe
partea stng) prezint schimbri patologice specifice pentru artroz, cu manifestare moderat.
Am identificat leziuni periostitice moderate pe dou oase lungi (femur i tibie de pe partea
stng) din 7 observabile. Cribra orbitalia i hiperostoza porotic nu au putut fi observate din
cauza degradrii osoase. Vertebrele sunt de asemenea puternic distruse din sol. S-a observat pe o
singur vertebr lombar prezena unui nodul al lui Schmorl. Nu s-au identificat traume sau
fracturi. Statura a fost calculat pe baza lungimii femurului drept (432 mm) folosindu-se
formulele lui Pearson (1899), Trotter i Gleser (1958) i Bach (1965). Rezultatele sunt 156,86
cm, 16160,80 cm, respectiv 163,41 cm.

Scheletul individului nr. 9 (7)

Ca i n cazul celorlai doi indivizi, strile de reprezentare i conservare sunt medii. Sexul a fost
determinat pe baza morfologiei elementelor craniene (mastoid, eminena mental, creasta
nucal i marginea supraorbital), rezultatul fiind feminin. Vrsta a fost aproximat pe baza
morfologiei capetelor sternale, suprafeei auriculare, sinostozei suturilo r i a uzurii dent are,
rezultatul fiind o vrst cuprins ntre 24 i 45.2 ani. S-au pstrat 28 de dini i 32 poziii dentare.
Individul a pierdut un dinte antemortem i exist 3 carii dentare, una interproximal pe molarul 2
mandibular stnga i dou pe molarul 3 mandibular dreapta (una ocluzal i una interproximal).
Tartrul dentar este mediu att pe mandibul ct i pe maxilar. Pe caninii mandibulari am observat
linii hipoplazice. Uzura molarilor este medie. Din 21 de articulaii analizate, 8 prezint schimbri
artrozice (pe partea stng: fibula proximal, femur distal, acetabul, ulna proximal, radius distal,
humerus distal; pe partea dreapt: acetabulul; i pe vertebrele lombare). n toate cazurile,
schimbrile degenerative sunt moderate. Nu s-au observat leziuni periostitice dar pe craniu exist
porozitate specific pentru hiperostoza porotic. Nu am identificat traume sau fracturi. Statura a
fost calculat pe baza lungimii tibiei fr eminen (357 mm) folosindu-se formulele compuse de
Pearson (1899) i Trotter i Gleser (1958). Rezultatele sunt 157,87 cm, respectiv 165,06 cm. Pe
lng oasele umane mai exist un os de animal. De asemenea n materialul din umplutura
mormntului, am mai identificat 9 fragmente de oase i dini de animal i 3 fragmente de oase
umane (clavicul dreapta medial, humerus dreapta proximal, humerus stng distal). Acestea din
urm nu aparin individului principal din mormntul 9 (7).
Tabel 1. Distribuia datelor osteologice i patologice pentru fiecare schelet.
Nr.
mormnt

Sex

Vrst

Statur1 Carii
dentare

HSD2

Artroz3 Cribra
orbitalia

Hiperostoz
porotic

Periostit4

1
F
25-34
156,86 1
X
4 (20)
2 (7)
9
M
26-45
1
X
0 (15)
X
2 (6)
9 (7)
F
24-45,2 157,87 3
X
8 (21)
X
0 (8)
1
Aici am folosit rezultatele obinute din aplicarea formulelor lui Pearson (1899). Rezultatele sunt
in cm.
2
HSD= hipoplazia smalului dentar.
3
Numerele reprezint articulaiile afectate iar n parantez este dat numrul total al articulaiilor
observabile.
4
Numerele reprezint oasele lungi afectate iar n parantez este dat numrul total al oaselor lungi
observabile.
Discuii
n acest stadiu al cercetrii, datele osteologice i patologice pot fi interpretate la nivel preliminar.
Prezena linilor hipoplazice n cazul tuturor indivizilor este relevant pentru stresul nutritiv
susinut n perioada copilriei cnd smalul dentar se formeaz. Aceste linii reprezint perioade
de stagnare a mineralizrii smalului cauzat de deficiene nutritive severe. Hiperostoza porotic
este un aspect patologic care se manifest n copilrie i i are etiologia n anemia genetic sau
anemia megaloblastic (lipsa vitaminei B12). Statura este de asemenea un indicator pentru
aportul nutritiv din perioada de cretere i dezvoltare a corpului, dar n lipsa unui eantion
reprezentativ nu putem stabili dac staturile acestor indivizi sunt sub media specific pentru

populaia de care aparin. Prin urmare, putem doar s sugerm c este foarte posibil ca n timpul
creterii i dezvoltrii acestor indivizi s fi existat perioade de stres nutritiv dat de malnutriie,
foamete sau boli.

1
F
25-34
9 56
M
26-45
9 (7)
F
24-45,2
fig. 1. Distribuia artrozei articulaiilor (cu rou) i leziunilor periostitice (cu gri) pentru M9 (7),
M1 i M9 (de la stnga la dreapta).
Leziunile periostitice sunt indicatoare non-specifice pentru infecie. Distribuia lor limitat poate
sugera ca i etiologie o traum sau o infecie localizat (ulcer al pielii). O distribuie mai extins,
mai multe oase ale scheletului, este un indicator pentru o infecie sistemic. n cazul individului
din mormntul M9, limitarea distribuiei leziunilor pe tibia i fibula stng poate sugera o
inflamare a membranei interosoase. n ambele cazuri (M1 i M9), osul afectat de leziune este
remodelat spre os compact, ceea ce indic vindecarea infeciei.
Modelul de distribuie al artrozei articulaiilor nu este relevant dat fiind lotul mic analizat. Totui,
dac lum n considerare sexul indivizilor, este interesant faptul c individul de sex masculin nu
are nicio articulaie (dintre cele prezente, n=15) a fectat de schimbri degenerative, comparativ
cu cele dou femei care au cte 4, respectiv 9 articulaii afectate de artroz moderat.

Raportul analizei antropologice pentru materialul osteologic de la Toboliu

Claudia Radu
Protocolul de lucru al Laboratorului de Antropologie Fizic utilizeaz urmtoarele metode:
Pentru determinarea sexului se observ morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,
marginea supraorbital, glabela i mentonul), respectiv a pelvisului (concavitatea
subpubic, unghiul subpubic, ramul ischiopubic, arcul ventral, arcul compozit, incizura
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora este realizat confor m metodelor
descrise de Buikstra, Ubelaker (1994), Steckel et al. (2011), White, Black, Folkens
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (Ican,
Loth, Wright 1984), simfizei pubice i a suprafeei auriculare (Buikstra, Ubelaker 1994,
Steckel et al. 2011, Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker
1994, Steckel et al. 2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea
vrstei la non-aduli se observ erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011), se msoar lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i se observ sinostoza
epifizelor (Schaefer et al. 2009).
Statura este calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
(1965) i Breitinger (1937).
Patologia este analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009). n
cadrul analizei preliminare pentru toate scheletele se noteaz prezena artrozei
articulaiilor, leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru cribra orbitalia i cribra
cranii, nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i a afeciunilor specifice
rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor sunt observate urmtoarele
elemente: articulaia temporo-mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
distal, radiusul proximal i distal, ulna proximal i distal, oasele minii, fosa acetabular,
femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula proximal i distal, oasele
piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar). Pentru identificarea
leziunilor periostitice se observ urmtoarele oase: clavicula, humerusul, radiusul, ulna,
femurul, tibia i fibula (bilateral).
Dentiia i patologia dentar se analizeaz conform standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile se analizeaz dup metodele descrise n Lovell (1997) i Buikstra,
Ubelaker (1994).
Am analizat materialul osteologic din 8 morminte (mormintele 2, 3, 4, 6, 8 i contextele 5, 6 i
7). n fiecare mormnt am identificat doar cte un individ. Oasele au fost splate i, n unele
cazuri reconstituite folosindu-se silicon dentar. Aa cum rezult din descrierea metodelor, pentru
fiecare individ s-au stabilit gradul de reprezentare i conservare, s -au determinat sexul i vrsta,
s-a analizat patologia osoas i dentar i s-au efectuat diferite msurtori.

Mormntul nr. 8
Scheletul este foarte bine pstrat i conservat. Vrsta a fost determinat pe baza morfologiei
capetelor sternale, simfizei pubice i suprafe ei auriculare. Rezultatul este o vrst la momentul
morii ntre 30 i 42 de ani. Sexul a fost determinat pe baza morfologiei elementelor craniene
(creasta nucal, mastoid, margine supraorbital, glabela i eminena mental) i elementelor
pelvisului (ram ischiopubic, arc ventral, arc compozit, incizura sciatic), rezultatul fiind
Masculin. Statura din timpul vieii a fost calculat pe baza lungimii femurului drept (410 mm) i
folosindu-se formula lui Breitinger (1937), rezultatul fiind 161,75 cm.
Se pstreaz 22 de dini. Maxilarul este rupt n zona molarilor, prin urmare am notat prezena a
minim 28 de poziii; pe partea dreapt a maxilarului cu siguran nu a avut erupt molarul 3.
Faptul c mandibula i maxilarul s-au pstrat ntr-o stare bun ne-a permis s observm mai
multe patologii dentare. Individul a pierdut n timpul vieii 4 dini. Exist 3 carii dentare, una
interproximal pe primul molar mandibular de pe partea stnga, una interproximal pe molarul 2
mandibular de pe partea dreapt i una interproximal pe al doilea premolar maxilar de pe partea
dreapt. De asemenea, se pot observa 3 abcese dentare foarte puternice. Tartrul este moderat iar
periodontita este extins. Pe smalul incisivilor i caninilor att maxilari ct i mandibulari se
observ linii hipoplazice pronunate. Uzura molarilor este puternic. i pe incisivi i canini exist
uzur puternic. Pe molarii mandibulari de pe partea stng exist un defect pe suprafaa labial
a acestora, aproximativ la linia de ntlnire dintre smalul coroanei i cementul dentar (radicular).
De asemenea, exist 4 dini (al doilea premolar mandibular de pe partea stng, incisivul lateral
maxilar de pe partea stng, caninul maxilar de pe partea dreapt, i premolarul 1 sau 2 maxilar
de pe partea dreapt) cu o uzur foarte puternic, nu mai exist deloc coroana dentar iar
rdcina este de asemenea distrus. Este posibil ca acest lucru s fie o consecin a faptului c
aceti dini sunt de fapt deciduali; dac acestui individ i lipseau congenital mugurii pentru dinii
permaneni, este posibil s nu -i fi pierdut pe cei deciduali, ceea ce a dus la folosirea lor foarte
ndelungat i prin urmare uzura lor excesiv.
Una din cele mai evidente patologii observabile pe schelet e artroza avansat. Se pstreaz
pentru observaie 39 de elemente de articulaie. Dintre acestea, ase sunt afectate de artroz
puternic, cu deformarea conturului elementului i cu osteofite de mari dimensiuni, 27 sunt
afectate de artroz moderat iar 6 nu prezint schimbri degenerative. Cele mai afectate sunt
articulaia temporo-mandibular, fosa acetabular dreapt i femurul proximal drept, vertebrele
cervicale i cavitatea glenoid de pe partea stng. Vertebrele cervicale nr. 2 i 3 sunt unite,
posibil datorit unei fracturi prin comprimare (compression fracture).
Din 14 oase lungi prezente pentru obsevaie, pe niciunul nu se observ leziuni periostitce. De
asemenea, porozitatea specific pentru cribra orbitalia i hiperostoz porotic nu e prezent. Pe
suprafaa endocranian exist granulaii arahnoide. Pe omoplatul drept se observ parial o
traum circular (diametru de 16.11 mm) produs antemortem. Cu toate c nu exist urme de
infecie, vindecarea traumei nu a acoperit cavitatea produs.

n ceea ce privete markerii musculoscheletali, acetia au fost observai pe mai multe elemente
osoase. Pe ambele ulne, pe olecranon, locul de inseria al muchiului triceps brachii prezint
exostoze (osificri); pe ulna stng, n poriunea distal a diafizei, pe locul de inserie al
membranei interosoase sau a muchiului pronator quadranus se observ de asemenea exostoze
osoase. Pe femure e foarte pronunat locul de inserie al muchiilor plantaris i adductor
magnus; de asemenea, pe femurul stng, ntre trochanterul mare i gtul femural, pe locul de
inserie al obturator externus, exist exostoze osoase de mari dimensiuni (bony spurs). Pe
tuberozitatea calcaneelor se observ exostoze osoase. Pe ambele tibii, epifizele distale, anterior,
exist faete de ngenunchere ( squatting facets). Pe coxalul drept, acetabulul e nconjurat de
exostoze osoase, cu mult os nou format, pe locul de inserie al ligamentelor capsulare. Coxalul
stng nu prezint aceste modificri. Pe manubriu (parte a sternului), pe suprafaa posterioar, se
observ porozitate accentuat cu distrugerea i remodelarea cortexului.
Mormntul nr. 2
Scheletul este slab reprezentat i conservat. Pe baza lungimii oaselor, vrsta a fost stabilit ntre
32 i 34 de sptmni prenatale. Nu se pstreaz dini. Din 4 oase lungi analizate, niciunul nu
prezint leziuni periostitice. Nu s-au observat aspecte patologice indicatoare pentru scorbut sau
rahitism sau alte boal metabolic.
Mormntul nr. 3
Scheletul este moderat reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii a fost determinat pe
baza lungimii oaselor ca fiind ntre 34 i 36 de sptmni prenatale. Nu se pstreaz dini. Din 10
oase lungi, pe niciunul nu se observ leziuni periostitice. Nu exist porozitate specific pentru
hiperostoza porotic. n afar de porozitate slab prezent pe mandibul, nu exist alte aspecte
patologice indicatoare pentru boli metabolice.
Mormntul nr. 4
Scheletul este bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii a f ost determinat pe baza
erupiei dentare i a lungimii oaselor. Rezultatul este o vrst ntre 1.5 i 2 ani. Se pstreaz 18
dini deciduali i 4 dini permaneni neerupi. n afar de hipoplazie slab prezent doar pe canii
mandibulari, nu s-au notat alte patologii dentare. Din 12 oase lungi prezente pentru observaie,
pe 6 oase se observ leziuni periostitice avansate (pe femurul, tibia i fibula de pe partea dreapt
i tibia i fibula de pe partea stng). De asemenea, femurele i tibiile sunt curbate medial. Nu se
observ hiperostoz porotic. Pe ulne, proximal, sub tuberozitatea ulnar exist o zon cu os nou
format.
Mormntul nr. 6
Scheletul este slab reprezentat i conservat. Vrsta a fost determinat pe baza lungimii oaselor i
pe baza erupiei dentare, rezultatul fiind, ca i n cazul copilului din mormntul nr. 4, ntre 1.5 si

2 ani. Se pstreaz 15 dini deciduali i 1 dinte permanent neerupt. Nu se observ patologie

dentar. Din 6 oase lungi prezente pentru observaie, pe dou (cele dou tibii) exist leziuni
periostitice slabe. Pe suprafaa ventral a unor coaste se observ porozitate slab. Nu am notat
prezena cribrei orbitalia i a hiperostozei porotice.
Contextul 5
Scheletul este moderat reprezentat i conservat. Pe baza erupiei dentare, vrsta la momentul
morii a fost stabilit ntre 6 i 9 luni. Pe baza lungimii oaselor, vrsta determinat este mai mic,
ntre 1.5 i 3 luni, ceea ce indic o ntrziere a dezvoltrii scheletului postcranian. Acest lucru
este cauzat n general de deficiene nutritive sau de prezena unei boli. Se pstreaz 19 dini
deciduali neerupi. Din 13 oase lungi prezente pentru observaie, doar pe unul (tibia dreapt) s -a
observat periostit slab. Orbitele nu sunt prezente. Pe palatin, mandibul, sfenoid i temporal
exist porozitate slab.
Contextul 6
Scheletul este foarte slab reprezentat i conservat: se pstreaz fragmente de craniu, coaste, oase
de la mn i oase de la picior. Lipsesc elementele osoase sau dentare pe baza crora se poate
determina vrsta; totui putem spune c scheletul aparine un ui subadult.
Contextul 7
Scheletul este bine reprezentat i conservat . Am determinat vrsta pe baza erupiei dentare,
rezultatul fiind ntre 9 i 12 luni. Pe baza lungimii oaselor, ca i n cazul individului din Cxt 5,
vrsta este mai mic, ntre 3 i 6 luni. S-au pstrat 3 dini deciduali erupi, 15 deciduali neerupi
i 2 permaneni neerupi. Pe acetia nu s-a notat prezena vreunei patologii. Din 14 oase lungi
prezente pentru observaie, pe 6 exist leziuni periostitice: humerus, femur i tibie de pe a mbele
pri. Metafiza ambelor oase radius este puin deformat medial, cu franjurare slab. Pe palatin i
mandibul de asemenea se observ porozitate slab. De asemenea, pe craniu se vede foarte bine
activitatea unor insecte.

Raportul analizei antropologice pentru materialul osteologic de la Turda

Claudia Radu, Szeredai Norbert

Protocolul de lucru al Laboratorului de Antropologie Fizic utilizeaz urmtoarele metode:

Pentru determinarea sexului se observ morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,
marginea supraorbital, glabela i mentonul), respectiv a pelvisului (concavitatea
subpubic, unghiul subpubic, ramul ischiopubic, arcul ventral, arcul compozit, incizura
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora este realizat conform metodelor
descrise de Buikstra, Ubelaker (1994), Steckel et al. (2011), White, Black, Folkens
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (I can,
Loth, Wright 1984), simfizei pubice (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011,
Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea vrstei la non-aduli se
observ erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011), se msoar
lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i se observ sinostoza epifizelor (Schaefer et al.
2009).
Statura este calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
(1965) i Breitinger (1937).
Patologia este analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009). n
cadrul analizei preliminare pentru toate scheletele se noteaz prezena artrozei
articulaiilor, leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru cribra orbitalia i cribra
cranii, nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i a afeciunilor specifice
rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor sunt observate urmtoarele
elemente: articulaia temporo -mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
distal, radiusul proximal i distal, ulna proxim al i distal, oasele minii, fosa acetabular,
femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula proximal i distal, oasele
piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar). Pentru identificarea
leziunilor periostitice se observ urmtoarele oase: clavicula, humerusul, radiusul, ulna,
femurul, tibia i fibula (bilateral).
Denti ia i patologia dentar se analizeaz conform standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile se analizeaz dup metodele descrise n Lovell (1997) i Buikstra,
Ubelaker (1994).
Materialul analizat este puternic afectat de factori tafonomici care au dus la o stare de
reprezentare i conservare foarte slab a scheletelor. Metodele descrise mai sus au fost aplicate
ntr-o mai mic sau mai mare msur n funcie de gradul de reprezentare i conservare al
fiecrui schelet. n unele cazuri s-a utilizat silicon dentar de culoare portocalie pentru lipirea
fragmentelor osoase. Materialul osteologic cuprinde un numr de 5 indivizi. Att reprezentarea

redus a scheletelor ct i numrul lor mic ne mpiedic s interpretm din punct de vedere
biocultural datele osteologice obinute.
Scheletul C2054
Vrsta a fost determinat prin observarea suprafeei auriculare i a uzurii dentare, rezultatul fiind
o vrst cuprins ntre 25 i 35 de ani la momentul morii. Pe baza morfologiei elementelor
pelvisului (concavitatea subpubic, ramul ischiopubic, unghiul subpubic, arcul compozit i
incizura sciatic), sexul scheletului a fost determinat ca fiind posibil masculin. Scheletul
pstreaz un numr de 13 dini. Lipsa mandibulei i a maxilarului ne -a mpiedicat s observm
prezena abceselor sau a periodontitei. Dinii pstrai nu p rezint carii dentare, dar exist tartru
slab. De asemenea, pe incisivi i pe canini nu s-au observat linii hipoplazice. Uzura molarilor
prezeni este puternic. Schimbri degenerative specifice osteoartrozei au fost notate pe dou
zone de articulare (acetabulul drept i falangele de la mna stng) din 12 articulaii prezente
pentru observare. Pe niciun os lung nu au fost observate leziuni periostitice (din 13 oase prezente
pentru observaie ntregi sau fragmentare). Cribra orbitalia i hiperostoza porotic nu au putut fi
notate datorit lipsei oaselor craniului.
Un numr mic de oase au putut fi analizate pentru identificarea markerilor musculoscheletali. Pe
tibia dreapt muchiul tibialis anterior are o inserie pronunat. Pe ambele femure crista aspera
este foarte bine reliefat iar locul de inserie al gluteus maximus este remodelat (Fig. 1).
Humerusul stng prezint o curbur neobinuit n jumtatea proximal a diafizei, ceea ce ar
putea indica un defect de dezvoltare iniiat n perioada de cretere a osului sau probabil o
fractur vindecat cu mult timp n urm (Fig. 2). De asemenea, pe tibia dreapt, pe suprafaa
anterioar a epifizei distale, se observ o faet de ghemuire/ngenunchere (squatting facet)
(Fig.3).
Scheletul C201A
Scheletul aparine unui adult (rezultat dat de observarea general a oaselor). Sexul nu poate fi
determinat. S-au pstrat oase de la mn, tibie, humerus i femur, toate n stare foarte
fragmentar. Acest lucru a limitat puternic observaiile pe care le-am putut realiza. Nu s-a pstrat
nicio articulaie. Dintre diafizele de oase lungi prezente (tibia dreapt, humerus stng, femur
stng), pe cea femoral exist striaii indicatoare pentru o periostit remodelat, non-specific. Pe
lng oasele umane, am mai identificat dou fragmente de oase de animal.
Scheletul C1100B
Pe lng materialul osteologic exist o pung cu ceramic i crmizi. Fragmentele osoase sunt
foarte mici (<1 cm), ceea ce face imposibil identificarea unor aspecte patologice pe acestea. Se
pstreaz de asemenea i 8 dini, dintre care 3 sunt deciduali (1 canin, 2 molari) i 5 permaneni
neerupi (1 incisiv maxilar, 2 canini, 2 molari). Pe baza erupiei dentare, se poate estima vrsta la
momentul morii ca fiind ntre 3 i 4 ani.

Scheletul C144 M2
Se pstreaz doar fragmente foarte mici de os (ca i n cazul scheletului din C1100B) i amprente
de oase pe calupuri de pmnt. Exist de asemenea i 12 dini, dintre care 7 sunt deciduali (3
canini i 4 molari) i 5 sunt permaneni neerupi (2 canini, 1 incisiv maxilar, 2 molari). Pe baza
erupiei dentare, vrsta la momentul morii este aceeai ca i n cazul scheletului din C1100B, i
anume 3-4 ani.
Scheletul C1442
Se pstreaz mai multe fragmente dintre care se disting capetele femurale, fragmente de diafiz,
fragmente craniene i falange de la mn. nainte de a spla oasele, am observat n bulgrii de
pmnt care conineau oasele c acest ea erau deja amestecate, sugernd c nc din trecut
scheletul nu se mai afla n ordine anatomic (Fig. 4). Pe baza observrii scheletului n general,
putem spune c individul este un adult, dar sexul nu poate fi determinat. Nu se pstreaz dini. Pe
fragmentele osoase pstrate nu se observ nicio patologie.
Context
C2054

Vrsta
25-35 ani

Sex
Pos. M

C201A
C1100B
C144 M2
C1442

Adult
3-4 ani
3-4 ani
Adult

IND
IND
IND
IND

Observaii
Artroz slab pe dou zone de articulare, markeri
musculoscheletali, squatting facet

Imagini

Fig. 1. Individul C2054. Fragment din diafiza femurului drept.

Fig. 2. Individul C2054. Humerusul stng.

Fig. 3. Individul C2054. Faet de ngenunchere.

Fig. 4. Individul C1442. Imagine cu bulgrul de pmnt n interiorul cruia se observ diafizele
unor oase lungi.

List publicaii 2014

Nr.
Titlu articol
Crt.

An
Revista
aparitie

Autori

Status

Studia Universitatis
Babes-Bolyai
Biologia

- Tatar Andra-Sorina
- Ponta Oana
- Kelemen Beatrice Simona

Publicat

Publicat

Bone Diagenesis and FTIR

Indices: a Correlation

Techniques Used for the

Diagnostic of Ancient
Tuberculosis in Human
Remains

2014

Studia Universitatis
Babes-Bolyai
Biologia

- Chiriac Cecilia
- Tatar Andra-Sorina
- Radu Claudia
- Lupan Iulia
- Kelemen Beatrice Simona

The Evolution of Gender

Detection Protocols in
Bioarchaeological Studies

2014

Studia Universitatis
Babes-Bolyai
Biologia

- Mircea Cristina
- Kelemen Beatrice Simona

Publicat

Molecular Diagnosis of
Pathologies in Ancient
Human Remains. A Case
Study: the
Bioarchaeological Study of
a Neolithic Skeleton
Displaying Symptoms of
Diabetes

2014

Studia Universitatis
Babes-Bolyai
Biologie

- Mihalache Ioana
- Radu Claudia
- Kelemen Beatrice Simona

Publicat

A brief overview of the

mitochondrial DNA as
molecular marker in
bioarchaeology

2014

Studia Universitatis
Babes-Bolyai
Biologia

- Rusu Ioana
- Kelemen Beatrice Simona

Publicat

The Evolution and Genetic

Basis of Human
Pigmentation

2014

Studia Universitatis
Babes-Bolyai
Biologia

- Kocsis Eniko
- Kelemen Beatrice Simona

Publicat

Anthropological analysis of
a skeletal sample belonging
to the Sarmatian population
inhabiting the territory at
the east of the Pannonian
basin

2014

Journal of Ancient
History and
Archaeology

- Radu Claudia
- Szeredai Norbert

Publicat

Analysis of Kinship Using

Mitochondrial DNA: A
Case Study from a 10th
Century Medieval
Population in Capidava
(Constana, Romania)

2014

Annuaire Roumain
d'Anthropologie

- Rusu Ioana
- Radu Claudia
- Oltean Andreea
- Dobrinescu Catalin
- Kelemen Beatrice Simona

Publicat

Recent Research at the

Basilica Extra Muros in
Histria at 100 Years Since
the Initiation of

2014

- Rusu-Bolindet Viorica
Materiale i Cercetri
- Badescu Alexandru
Arheologice Serie
- Lazarescu Vlad Andrei
Nou
- Dima Mihai

2014

Publicat

Archaeological Research on
the Site

10

Anthropological data
regarding three adult
individuals from a middle
bronze age archaeological
context

- Radu Claudia
- Szeredai Norbert
- Kelemen Beatrice Simona

2014

Annales Universitatis - Radu Claudia

Apulensis. Series
- Szeredai Norbert
Historica

List participri conferine - 2014

Nr.
Crt.

Titlu

An

Tip

Publicatie

Modern and ancient mitochondrial

Proceedings WiBioSE Conference,
DNA genetic landscape of
Prezentare
2014
Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
maternal heredity in Eastern
Orala
February 02-08, 2014
Europe from Paleolithic onwards

Molecular Diagnosis of a
Tuberculosis Case from the LateRoman-Period

Proceedings WiBioSE Conference,

Prezentare
2014
Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
Orala
February 02-08, 2014

Testing for type 2 diabetes in an

ancient human skeleton using
molecular methods

2014

Proceedings WiBioSE Conference,

Prezentare
Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
Orala
February 02-08, 2014

MITOCHONDRIAL
HAPLOGROUP DIVERSITY IN
A 10th CENTURY AD
MEDIEVAL POPULATION
FROM MIREASA, CONSTAA,
ROMNIA

2014

Proceedings WiBioSE Conference,

Prezentare
Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
Orala
February 02-08, 2014

Mitochondrial haplogroup
diversity in a 10th century ad
medieval population from
Capidava, Constanta, Romania

2014

Proceedings WiBioSE Conference,

Prezentare
Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
Orala
February 02-08, 2014

A correlation between physical

analytical methods and the rate of
DNA extraction from ancient
human remains

2014 Poster

Proceedings WiBioSE Conference,

Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
February 02-08, 2014

Preliminary mitochondrial DNA

analysis of a 10th century
medieval population from
Capidava, Constanta, Romania

2014 Poster

Young Natural History Scientists'

Meeting

Determinig the sex of ancient

human remains using new primers
2014 Poster
to amplify X and Y amelogenin
alleles

Young Natural History Scientists'

Meeting

Acceptat

Neolithic diabetes? Tentative

interdisciplinary diagnosis.

10

Eye and hair color prediction from

Prezentare Young Natural History Scientists'
2014
ancient human remains
Orala
Meeting

11

How representative is a skeletal

assemblage? A discussion about
paleodemography and the
treatment of the dead

2014

Prezentare Archaeothanatology: An interdisciplinary

Orala
approach to death in Prehistory

12

Applying a biocultural approach

in the reconstruction of the
formation of a funerary
assemblage from a Bronze Age
barrow from Constanta county,
Romania

2014

Prezentare Homines, Funera, Astra. Time and cause

Orala
of death from Prehistory to Middle Ages

13

Mortality and morbidity profiles

for a non-adult sample from the
early medieval necropolis of
Mireasa (Constanta county,
Romania)

2014

Prezentare Homines, Funera, Astra. Time and cause

Orala
of death from Prehistory to Middle Ages

14

Reassembling the life of a neonate

Prezentare 3rd International Congress Biomedical
found in the balnea of a Roman
2014
Orala
Sciences in Archaeology
fort from Romania

15

APPLYING A BIOCULTURAL
APPROACH IN THE
ANALYSIS OF THE LATE
MEDIEVAL/EARLY MODERN
POPULATION FROM
GHEORGHENI (ROMANIA)

16

Subadult funerary treatment in the

Dacian culture. An extended
Prezentare European Association of Archaeologists
analysis of the necropolis from
2014
Orala
20th Annual Meeting
Hunedoara-the Castle's Garden
Plateau (Romania)

17

Exploring Life Quality Levels for

a 10th-Century Population from
Dobruja, Romania

2014

Prezentare
International Medieval Congress Leeds
Orala

18

Social and epidemiological

hypotheses regarding the
individuals buried in the 4th-th
centuries necropolis from
Boldesti-Gradiste, Romania

2014

International Scientific Communication

Prezentare
Session "Archaeology of the First
Orala
Millenium AD"

19

Identificarea relatiei dintre individ

Prezentare Simpozionul "Zilele Francisc I. Rainer"
si sistemul social pentru
2014
Orala
2014. Antropologie si Societate
populatiile arheologice

20

ANALYSIS OF KINSHIP USING

Prezentare Simpozionul "Zilele Francisc I. Rainer"
2014
MITOCHONDRIAL DNA: A
Orala
2014. Antropologie si Societate

2014 Poster

2014

Young Natural History Scientists'

Meeting

Prezentare Conference on Cultural Heritage and

Orala
New Technologies

CASE STUDY FROM A 10TH

CENTURY MEDIEVAL
POPULATION IN CAPIDAVA
(CONSTANA, ROMNIA)

21

A MOLECULAR APPROACH
TO INVESTIGATE
TUBERCULOSIS CASES IN A
GOTHIC POPULATION FROM
GHERSENI NECROPOLIS,
BUZU COUNTY

2014 Poster

22

Zooarchaeological analysis of an
animal sample from 10th century
Capidava. Inferences regarding
humananimal interaction

2014

Prezentare
Simpozion Arheovest 2014
Orala

23

Mormantul 1O de la biserica ,,Sf.

Nicolae" de la Curtea de Arges.
Despre geneza Tarii Romanesti

2014

Prezentare Al IX-lea simpozion de heraldica,

Orala
Chisinau, Republica Moldova

24

THE SHAFT-HOLE AXE FROM

YUNATSITE (BULGARIA)
AND THE CHRONOLOGY OF
Prezentare Bronze Age Chronology in the
THE SHAFT-HOLE AXES OF
2014
Orala
Carpathian Basin
P.AnURENI AND BALSA,
TYPES IN THE CARPATHIANBALKAN AREAl

25

European admixture analysis

inferred by Early Bronze Age
2014 Poster
human bones amtDNA sequencing

International Zoological Congress of

Grigore Antipa Museum

26

Analyses of a Funerary Context

and the Evaluation of DNA
Recovery from EBA Human
Bones by Different Isolation
Methods

2014 Poster

European Association of Archaeologists

20th Annual Meeting

27

Was Sigismund of Luxemburg a

"wiser man" at the end of his
reign? Ottoman and Eastern case
studies

2014

Prezentare
International Medieval Congress Leeds
Orala

28

The Hungarian Kingdom,

Transylvania, and the Cuman
Steppe between the battle of
Kalka, 1223 and the Great Tartar
Invasion 1241-1242

2014

Prezentare
International Medieval Congress Leeds
Orala

THE 32ND ANNUAL SCIENTIFIC

SESSION OF RSCB