ENZIME REDOX

DEHIDROGENAZE

OXIDAZE

Enzime
continand
FAD/FMN

-FMN oxidaze
ex. L-amino acid
oxidaza
-FAD oxidaze
ex. D-amino acid
oxidaza
-Metalo FAD oxidaze
ex. Glucoz oxidaza
Xantin oxidaza

Enzime
continand
Cu

Enzime
continind
cofactor legat

PEROXIDAZE

Enzime utilizind
NAD/NADP drept
cofactor solubil

-Tirozinaza
-Lacaza
-Ascorbat oxidaza
-Citocrom c
oxidaza
-Galactoz oxidaza

Enzime
continind
PQQ

Enzime
continind
FAD/FMN

-Alcool dehidrogenaza
- Glucoz dehidrogenaza
- Glutamat dehidrogenaza
- Aminoacid dehidrogenaza
-Testosteron 17
dehidrogenaza
- Lacat dehidrogenaza

-FAD dehidrogenaze
-Metanol
dehidrogenaz
a
-Glucoz
dehidrogenaz
a
-Fructoz
dehidrogenaz
a

ex. lipoil dehidrogenaza

-Metalo-FAD dehidrogenaze
ex. colin dehidrogenaza
-Metalo-FMN
dehidrogenaze
ex. L-lactat dehidrogenaza
(citrocrom b2)

Clasificarea oxido-reductazelor

-Peroxidaza din hrean

-Citocrom c oxidaza
-Ascorbat peroxidaza
-Lactoperoxidaza

Problema care se pune este legata de posibilitatile de

reoxidare a centrului activ al enzimelor
din clasa oxdo-reductazelor.
Acest lucru se poate realiza prin:

Folosirea unor proteine redox naturale (citocromii)

Folosirea suprafetei electrozilor cu conditia de a se realiza un transfer
eficient de electroni de la cofactorul unuei enzime redox spre suprafata
electrodului si invers la un potential aplicat mic!

Centrul activ
al enzimei

e-

Transferul direct de electroni blocat

datorita impiedicarilor de ordin
steeric sau al restrictiilor cinetice

electrod
A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes , J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587.

BIOELECTROCATALIZA

EXIST DOU POSIBILITI DE A

CUPLA UN PROCES DE ELECTROD
CU O REACIE ENZIMATIC

Realizarea
Realizareaunui
unuitransport
transport
de
deelectroni
electronimediat
mediatcare
care
presupune
presupuneutilizarea
utilizareaunor
unor
compui
compuiredox
redoxcu
cumas
mas
molecular
molecularmic
miciicare
care
particip
la
schimbul
particip la schimbulde
de
electroni
electroni

Realizarea
Realizareaunui
unuitrasport
trasport
direct
directde
deelectroni
electroni(nemediat)
(nemediat)
cara
carapresupune
presupuneutilizarea
utilizarea
unor
unorenzime
enzimeredox
redoxcare
careau
au
capacitatea
capacitateade
deaaschimba
schimba
direct
directelectronii
electroniicu
cusuprafaa
suprafaa
electrodului
electrodului

Transportul de electroni mediat

Procesul catalitic implic transformarea enzimatic att a substratului ct i a mediatorului;

Procesul de electrod (regenerarea mediatorului) nu este unul catalitic el realizndu-se
fr a fi necesar aplicarea unui suprapotenial

Cataliza enzimatic i regenerarea electrochimic

(reversibil) a mediatorului pot fi privite ca
reacii separate ale procesului electrocatalitic

M.F. Cardosi, A.P.F. Turner, in "Advances in Biosensors", Ed. By A.P.F. Turner, JAI Press, London, 1991, p. 125.

Trasferul direct de electroni

(nemediat)
Electronii sunt transferai direct de la electrod la molecula de substrat (i invers) prin
intermediul centrului activ al enzimei!
Transformarea redox a substratului (procesul cuplat) poate fi considerat ca un
proces de electrod catalizat enzimatic (electroenzimatic);
Procesul de electrod (transformarea substratului) este unul catalitic.

Cataliza enzimatic i reacia de electrod cuplat nu pot

fi considerate ca reacii separate ale ntregului proces
electrochimic

L.Gorton, T.Ruzgas, E.Csoregi, J.Emneus, Anal.Chim.Acta, 330, 1996, 123

Enzime redox pentru care s-a dovedit existenta unor reactii cu DET cu suprafata electrozilor.
Cofactor

Substrat

Reactii
Redox

Lacaza

4 Cu

O2

Reducere

Ascorbat oxidaza

4 Cu

O2

Reducere

Superoxid dismutaza

Cu-Zn

O2

Citocrom c peroxidaza
Citocrom c peroxidaza
-Paracoccus denitrificans
Lactoperoxidaza din bovina
Microperoxidaza

Hem
Hem
Hem
Hem
Hem
2 Hem

H2O2
H2O2
H2O2
H2O2
H2O2
H2O2

Reducere
Reducere
Reducere
Reducere
Reducere
Reducere

cluster Fe-S

H2
H+

Oxidare
Reducere

FMN

NADH

Flavo-hem
FMN-hem
FAD-hem
FAD-hem
PQQ-hem
PQQ-4 hem
PQQ-4 hem
FAD- cluster Fe-S

p-cresol
lactat
etanol
etanol
etanol
succinat
fumarat
Alcool

FAD-hem- cluster Fe-S

D-gluconat

Enzima

Hidrogenaza
Diaforaza
Enzime bi-functionale
Citocrom b2
- Lactat dehidrogenaza
- Flavocitocrom c552
- Celobioz dehidrogenaza
- Phanerochaete
chrysosporium
- Sclerotium rolfsii
Alcool dehidrogenaza
Enzime tri-functionale
D-Gluconat dehidrogenaza

Oxidare

Oxidare
Oxidare
Oxidare
Oxidare
Oxidare
Oxidare
Oxidare
Reducere
Oxidare

Transformarea electrochimic a substratului catalizat enzimatic are loc prin:

interacia electrochimic dintre protein i electrod
i implic
scderea catalitic a barierei energetice pentru
transformarea electrochimic a moleculei de substrat

Bioelectrocataliza
este evideniat prin generarea unui
curent catalitic
i o reducere catalitic a suprapotenialului reaciei.
P.N. Barlett, P. Tebbutt, R.G. Whitaker, "Kinetic Aspects of the Use of Modified Electrodes and Mediators in Bioelectrochemistry",
Prog. React. Kinetics, 16 (1991) 55.

EXEMPLE DE ENZIME IMPLICATE N BIOELECTROCATALIZ

PEROXIDAZA
(conine hemul)
prezint activitate catalitic oxidnd un numr
mare de polifenoli i poliamine aromatice

LACAZA
(polifenol oxidaza care conine Cu)
prezint o specificitate de substrat similar cu peroxidaza POD.
Lacaza catalizeaz oxidarea polifenolilor i
polianilinelor aromate prin intermediul O2 molecular cu formare de H2O

CELOBIOZ DEHIDROGENAZA
(contine FAD si hemul) oxideaza celobioza)

n 1978 s-a demonstrat c LACAZA - conine Cu

poate cataliza electroreducerea oxigenului
molecular1:

Kulys i colab. au demonstrat c CITOCROMUL b2 (lacto-dehidrogenaza)

conine FMN i HEM- catalizeaz electroxidarea lactatului2:

1. A.I.Yaropolov et al., Doklady Phys.Chem., 240 (1978) 455

2. Kulys et al., Doklady Phys.Chem., 245 (1979) 208

Yapropolov i colab.1, n 1980 au demonstrat capacitatea HRP -conine HEM-ul

- de a cataliza reacia de electroreducere a H2O2

Recent2 s-a studiat CELOBIOZDEHIDROGENAZA (CDH) - conine HEM-ul i

FAD - n procesul de electrooxidare a celobiozei:

1. A.I.Yaropolov et al., Doklady Phys.Chem., 249 (1980) 1077

2. A. Lindgren, L. Stoica, T. Ruzgas, A. Ciucu, Lo Gorton,
"Development of a Cellobiose Dehidrogenase Modified Electrode for Amperometric Detection of Diphenols",
The Analyst, 124 (1999) 527

IPOTEZ1
Procesele catalitice i cu transfer de e- sunt
asociate cu diferiii cofactori ai enzimei
substratul este iniial oxidat la nivelul FAD-ului,
proces urmat de un transfer rapid de e- intramolecular ctre hem,
hem-ul este oxidat n final la suprafaa electrodului

POD conine numai HEM-ul

drept grupare prostetic.
Ipotez: molecula proteic poate
aciona ca acceptor primar de e-.

1. T. Larsson, A. Lindgren, T. Ruzgas, L. Gorton, L, "Bioelectrochemical characterisation of cellobiose dehydrogenase modified

graphite electrodes" Electroanal. Chem. , 482 (2000) 1-10

Studiile asupra transformrilor

redox ale gruprilor prostetice
sugereaz:

Transformarea
Transformarea
electrochimic
electrochimicaa
gruprilor
gruprilorprostetice
prostetice
nu
nupoate
poatefificorelat
corelat
cu
cumanifestarea
manifestarea
proprietilor
proprietilor
electrocatalice
electrocataliceale
ale
enzimei
enzimei

Gruparea
Grupareaprostetic
prosteticaa
enzimei
enzimeinu
nupoate
poatefifi
considerat
consideratca
cafiind
fiindun
un
mediator
redox
mediator redox
intramolecular
intramolecular

Orientatarea proteinelor redox la suprafata

electrodului

J. E. Frew, H. A. O. Hill, Eur. J. Biochem.,172 (1988) 261-269

F. A. Armstrong, H. A. O. Hill, N. J. Walton, Acc. Chem. Res., 21 (1988) 407-413.
L. H. Guo, H. A. O. Hill, Adv. Inorg. Chem., 36 (1991) 341- 375

Relaia dintre distana care separ centrul activ al

enzimei de suparafaa electrodului i viteza electroacatalizei

Bioelectrocataliza la interfaa unui electrod modificat cu POD coninnd

un strat intermediar lipidic cu orientari diferite a) orizontal, b) vertical

d = 20 eficiena electrocatalizei este constant

d< 20 procesul limitativ al electroreducerii H2O2 este reacia enzimatic
d> 20 procesul limitativ pentru ntreaga reacie de electrod este transferul e-

CONCLUZII
Corelarea acestor studii cu investigaiile relative la structura enzimelor i
cu analiza suprafeei de electrod
va conduce la nelegerea procesului de bioelectrocataliz.
Mecanismul bioelectrocatalizei nu a fost investigat n detaliu:
nu este clar care parametrii:

Structurali

sau

Cinetici

determin
determinposibilitatea
posibilitateaunei
uneienzime
enzimede
deaacataliza
catalizareacia
reaciade
deelectrod
electrod

Studiul electrochimic al proteinelor redox implicate n procese cu

transfer direct de electroni a permis examinarea:
structurii proteinelor
mecanismelor de transformare redox ale proteinelor
proceselor metabolice implicnd transformri redox
electrochimiei unor enzime redox

Demonstrndu-se:
Demonstrndu-se:
Posibilitatea realizrii unui transfer direct de e- (DET)
ntre suprafaa electrodului i substrat (i invers)
n cadrul unor reacii catalizate enzimatic
Importana orientrii proteinelor la suprafaa electrodului

Bioelectrocataliza
a condus la introducerea conceptului de
"traductor molecular".

PRIN "TRADUCTOR MOLECULAR"

SE DEFINETE COMPLEXUL FORMAT NTRE ENZIMA
ELECTROCATALITIC ACTIV I INTERFAA ELECTROD-ELECTROLIT,

A. Ciucu, A. Nica, P. Balea, L. Gorton, "Kinetic Study of Electron Transfer in

Reactions Catalyzed by Horseradish Peroxidase Using a Rotating Disk
Electrode",

ROLUL "TRADUCTORULUI BIOMOLECULAR"

N CADRUL ELECTROZILOR ENZIMATICI
TRADUCTORUL
BIOMOLECULAR
ESTE DIRECT RESPONSABIL DE
TRANSFORMAREA
SEMNALULUI CHIMIC N SEMNAL
ELECTRIC

Permite construcia unor

biosensori electrochimici
care necesit adugarea
numai a analitului n schema
de determinare

Reprezentarea schematic a cuplrii dintre dou enzime:

traductorul molecular bazat pe peroxidaz i glucozoxidaz,
conducnd la formarea unui sensor pentru glucoz

Procesul bioelectrocatalitic permite detecia electrochimic att a curentului

catalitic generat ct i a reducerii catalitice a supra-potenialului electrodului
A. Ciucu, A.G. Nica, L. Gorton, "Wall-Jet Peroxidase-Modified Electrode
System for Detection of Hydrogen Peroxide", Rom. J. Biochem., 39 (1), (2002).

APLICAIILE TEORETICE I PRACTICE ALE CUNOTINELOR

DIN DOMENIUL ELECTROENZIMOLOGIEI

n prezent acest domeniu de cercetare este foarte activ dat fiind comercializarea biosensorilor

K.Nakamura, M.Aizawa, O. Miyawaki, "Electroenzymology Coenzyme Regeneration", Springer-Varlag, New York, 1988

Aplicatiile electro-enzimologiei in monitorizarea mediului.

Detectia:
Peroxizilor anorganici si organici (POD,CDH)
Fenolilor (Tyr, POD,CDH)
Pesticidelor (ChE)
Metalelor grele (oxidazele)

REACTII CU TRANSFER DIRECT DE ELECTRONI"

intre electrozi (de preferat pe baza de carbon)
si
peroxidaze
au fost demonstrate in prezenta
H2O2

Reducerea bioelectrocatalitica a H2O2 prin intermediul

unui electrod de carbon/HRP fara mediatori redox

POD-azele din plante si ciuperci contin

1 singura catena polipeptidica (300 resturi de aminoacizi),
pliati sub forma a 10 -elici
formind o structura impartita in doua domenii
continind hemul inclus legat necovalent (protoporfirina IX)
+ 2 Ca2+ si 4 punti S-S

COO

OOC

H2C

CH
H2C
H3C
H2C

CH2
CH3

N
Fe
N

C
H
H3C

CH3
C
H

CH2

Feriprotoporfirina IX

VOLTAMOGRAME CICLICE
redind transferul direct de electroni POD/electrod de grafit

Electrod garfit nemodificat

a1 in tampon
a2 in tampon+ H2O2

Bioelectrocataliza
este evideniat la suprafata unui electrod
prin generarea unui curent catalitic i
o reducere catalitic a suprapotenialului reaciei.

HRP adsorbita
pe grafit solid
b1 in tampon
b2 in tampon + H2O2

Start + 600 mV vs. Ag/AgCl ( pH 5,0-8,0)

Maxim - 50 mV vs. Ag/AgCl
HRP in pasta pH = 7.0, Eappl. = -50 mV vs Ag/AgCl

G. Jonsson, L. Gorton, Electroanalysis, 1 (1989) 465-468.

Ciclul reactiei bioelectrocatalitice de reducere a H2O2 catalizata de HRP

si de inactivare a acesteia

uzual
neselectiv

Enzima schimba direct electroni cu electrodul (electrodul substituie

substratele donoare de electroni din ciclul obisnuit de reactie al HRP).

E. Csoregi si colab. J. Biotechnol. 30 (1993) 315

Potentialul aplicat pentru detectia H 2O2 Eappl. = 0,01 V

fata de Ag/AgCl la pH = 7,0;
Curenti de baza mici
Oxigenul molecular nu este redus
Interferente minime

MECANISMUL DE RE-REDUCERE A PEROXIDAZEI

(revenire la starea nativa)
POATE FI REALIZAT PRIN INTERMEDIUL
ELECTROZILOR (DET)
SI/SAU AL MEDIATORILOR (MET)

ks
Compus I + 2e- + 2H+

HRP (Fe3+) + H2O (DET)

(d)

Eappl (detectia H2O2) = 0,01 V vs. Ag/AgCl

k
ELECTR
2 SH
OD
s, m

2 SH* + 2 e + 2 H

(MET)

(e)

MECANISMUL REDUCERII BIOELECTROCATALITICE DIRECTE (DET)

A APEI OXIGENATE LA SUPRAFATA UNUI
ELECTROD MODIFICAT CU PEROXIDAZA

HRP=este enzima nativa in stare ferica (Fe3+),

compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata,
SH2 =substrat donor de electroni (sau mediatorul),
SH* =radical liber care este produsul reactiei de oxidare
a substratului,
k1, k2 si k3=constatele de viteza ale reactiei.

P+ reprezinta un radical cationic localizat pe

inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica

Potentialul aplicat pentru detectia H 2O2 Eappl. = 0,01 V

fata de Ag/AgCl la pH = 7,0;
Curenti de baza mici
Oxigenul molecular nu este redus
Interferente minime

MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI

reactie electrochimca (b)

reactie chimica (a)

experimental, observandu-se numai

reactiile (a si b)
redate schematic mai sus
ks = viteza transferului de electroni dintre RDE si formele oxidate ale enzimei (avand unitatile s -1).

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI

Compusi donori de electroni

OH

NH2

OH

OH

NH2

NH2

OH

NH2

NH2

OH

OH

NH2

OH

NH2

Mred si Mox sunt formele reduse si respectiv oxidate ale mediatorului

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI

Mediatorul (SH2) transporta electronii intre enzima si electrod.

Donorul oxidat enzimatic (SH) este redus de catre electrod.

APLICATII

APLICATIILE BIOANALITICE ALE BIOSENSORILOR

AMPEROMETRICI MODIFICATI CU PEROXIDAZE

DETECTIA APEI OXIGENATE SI A PEROXIZILOR ORGANICI

DETECTIA UNOR COMPUSI INHIBITORI SAU ACTIVATORI AI PEROXIDAZELOR

acidul cianhidric
2 mercapto-etanolul,
tioureea si etilentioureea
cationi metalici ca de ex. Ni2+, Co2+ si Mn2+ .

DETECTIA FENOLILOR SI AMINELOR AROMATICE

A SUBSTRATELOR SPECIFICE OXIDAZELOR

(enzime care conduc la formare de H2O2)

Determinarea p-aminofenolului folosind un electrod HRP-modificat

se injecteaza 90 M D-glucoza

Florentina-Daniela Munteanu, Annika Lindgren, Jenny Emneus, Lo Gorton, Tautgirdas Ruzgas, Elisabeth Csoregi, Anton Ciucu,
R. B. van Huystee,| Irina G. Gazaryan, and L. Mark Lagrimini, Bioelectrochemical Monitoring of Phenols and Aromatic Amines in
Flow Injection Using Novel Plant Peroxidases, Anal. Chem. 1998, 70, 2596-2600

Ipoteza:
Peroxidaza din tutun are cativa aminoacizi in centrul activ care pot interactiona cu
Ca2+ => mai putina accesibilitate la centrul activ.
Injectiari de Ca2+ in prezenta H2O2 => scaderea curentului

Dovada faptului ca ionii de Ca2+ induc modificari conformationale micsorand

accesul la centrul activ
A fost afectata numai reactia cu H 2O2 si nu cea cu electrodul

F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, L. Gorton, T. Ruzgas, J. Emnus, E. Csregi, I. V. Ouporov, E. A. Mareeva, A. Ciucu and L. M.
Lagrimini, Effect of Calcium Ions on Direct and Mediated Electron Transfer Catalyzed
by Anionic Tobacco Peroxidase, in manuscript.

Caracteristicile electrozilor modificati cu HRP pentru

detectia aminelor aromatice si a compusilor fenolici
Amine aromatice si
Compusi fenolici

S (A M-lcm-2)

LDL (M)

o-dianisidina
p-aminofenolul
N- acetil-p-aminofenolul
Benzidina
2-amino-4-clorofenolul
4-cloro-3-metilphenolul
p-cresolul
Anilina

14.6
6.1
3.96
0.97
0.085
0.014
0.0085
-

0.035
-

0.02
0.5
2
4
0.01

LR (M)

0.5
0.5-4
2-20
4-35
0.05-0.6

PEROXIDAZELE AU FOST UTILIZATE SI IN CONSTRUCTIA DE SENSORI

BI- SI MULTI-EZIMATICI
realizati prin

COIMOBILIZAREA PEROXIDAZELOR CU
OXIDAZELE (ENZIME CARE AU CA PRODUS FINAL DE RAECTIE H2O2 )

AU FOST OBTINUTI BIOSENSORI PENTRU DETERMINAREA

SUBSTRATELOR SPECIFICE ALE OXIDAZELOR

Combinarea dintre:
o oxidaza producatoare de apa oxigenata cu POD-aza
conduce la obtinerea unui grup de sensori selectivi
Enzimele pot fi co-imobilizate de exmplu in pasta de carbon
Principiul de detectie se bazeaza pe:
1. oxidarea substratului (S) de catre oxidaze din reactie rezultind H2O2:

2. in etapa urmatoare de reactie POD-aza reactioneaza cu H2O2

=>un curent proportional cu concentratia de S

CONSTRUCTIA DE SENSORI BI- SI MULTI-ENZIMATICI

Secvena de reacii electro-enzimatice care sta la baza determinarii substratelor oxidazelor prin
intermediul unui electrod de pasta de carbon modificat; se inregistreaza un curent proportional cu
concentratia de S

Substrate specifice pentru oxidazele producatoare de H2O2

Oxidaze care produc

H2O2

Substrat
(analit)

Glucoz oxidaza

Glucoza

Galactoz oxidaza

Galactoza,lactoza

Urat oxidaza (uricaza)

Acidul uric

Alcool oxidaza

Metanol, etanol

Colin oxidaza

Colina

Colesterol oxidaza

Colesterol

Lactat oxidaza

Lactatul

Piruvat oxidaza

Piruvatul

Oxalat oxidaza

Acidul oxalic

L-amino acid oxidaza

L-amino acizii

D-amino acid oxidaza

D-amino acizii

Avantajele coimobilizarri oxidazelor care au drept

produs de reactie H2O2 cu POD-azele sunt urmatoarele

permite determinarea substratelor specifice enzimelor din clasa oxidazelor

permite oxidazelor sa utilizeze in reactia catalizata de acestea a acceptorului

lor natural de electroni oxigenul molecular (O2)
neexistind o competitie intre mediatorul artificial si O2.

permite aplicarea unui potential in domeniul "optim de potentiale"

( -150 - +50 mV fata de ESC, pH 7.0) si prin aceasta
interferentele din matrici complexe sunt minime

transferul de electroni dintre electrod si peroxidza fiind unul

direct sau mediat, va influenta domeniul de raspuns si sensibilitatea biosensorului.

Electrozii modificati cu peroxidaze prezinta un

interes in studiile bioelectrochimice si in aplicatiile practice

Ruzgas, T; Csregi, E; Emnus, J; Gorton, L; Marko-Varga, G.

Anal. Chim. Acta (1996), 330(2-3)

Sensor pentru alcool (AOD + HRP)

Alcool oxidaza (AOD), este o flavin-enzima continind (FMN)

AOD catalizeaza reactia:

Viteza de reactie in prezenta acceptorilor artificiali de electroni este foarte mica

AOD prezinta activitate fata o serie de alcooli pezentind catene alifatice mici, ex.
metanol, etanol, propanol, izopropanol, butanol (precum si fata de alti compusi).
AOD este o enzima neselectiva

CHINOPROTEINE
Dehidrogenaze cu cofactor legat

TRANSFER DIRECT DE ELECTRONI

Implicand
CHINOPROTEIN DEHIDROGENAZE
Ex Celobioz dehidrogenaza