Diminuarea emisiilor de metan ruminal prin controlul microorganismelor din rumen

Cuprins: 1. Caracterizarea speciilor de bacterii prezente n rumen 2. Clasificarea speciilor metanogene Archaea 3. Metode de inhibare a bacteriilor metanogene: utilizarea biotehnologiilor (vaccinare, serumizare), furaje, aditivi...prezentare pe scurt 4. folosirea anticorpilor IgY ca inhibitori ai metanogenezei (prezentare pe larg) Concluzii 1. Caracterizarea speciilor de bacterii prezente n rumen

A. Facultativ anaerobe- speciile facultativ anaerobe izolate din rumen aparin genurilor Flavobacterium, Pseudomonas, Proteus i Micrococcus. 1. Bacilii coliformi (Coliform bacilli)- acetia nu par s aibe o importan deosebit pentru rumen deoarece s-au gsit ntr-un numr mic n lichidul ruminal (103-106 per ml de lichid ruminal la oi i vaci i ntr-un numr mai mare la viei de 3 sptmni). Hobson i Mann au gsit foarte puini bacili coliformi folosind anticorpi fluoresceni. Heald a sugerat c aceste bacterii pot fi importante n procesul de fermentare a xilozei deoarece au fost izolate din lichidul ruminal n prezena xilozei i au nceput foarte repede s o fermenteze. Cele mai multe specii de coliformi gsite n rumen aparin speciei Escherichia coli dar au fost izolate i alte specii cum ar fi Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae. E. coli este o bacterie facultativ anaerob, gram negativ i nonsporulat. Celulele sunt de obicei sub form de bastonae i au aproximativ 2 microni n lungime i 0,5 microni n diametru. Bacteria produce acid lactic, succinic, etanol, acetat i dioxid de carbon.

Fig.1 Escherchia coli (www.remedic.ro) 2. Bacili (Bacilli)- specii de bacili au fost izolate din rumen n numr foarte mic. Aceste specii sunt B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. circulans. Se pare c aceste bacterii sunt importante n digestia proteinelor. 3. Propionibacteria- Elseden a izolat tulpini de Propionibacteria care fermenteaz lactatul din lichidul ruminal preluat de la oi i vaci. Mai trziu, Gutierrez a izolat un numr mare de bacterii proteolitice i propionice din rumenul unor vaci dar i din sol i fn. Aceste bacterii erau identice cu Corynebacterium acnes cu excepia c produceau acid lactic. 4. Lactobacilli- Hungate i colab. au observat c bacterii similare cu Lactobacillus brevis erau prezente n rumenul unei oi care a fost furajat cu fn i creia i-a fost administrat 3 lb de glucoz. Rodwell a izolat o tulpin de lactobacillus heterofermentativ de la o oaie furajat cu gru. Jensen i colab. au izolat L. brevis, L. buchneri, L. fermenti, L. plantarum, L. acidophilus i L. casei de la o vac furajat cu furaje grosiere. Perry i Briggs au gsit mai multe specii de Lactobacillus n rumenul vieilor dar i a vacilor mature. L. fermenti era predominant la viei furajai cu concentrate din fn, L. acidophilus era predominant la vaci furajate cu concentrate din fn iar L. casei predomina la vaci furajate cu silozuri. Studiile au artat c lactobacilii capabili de cretere n condiii aerobice pot fi de o importan funcional n rumen dar sub anumite condiii. Cercetrile realizate de Perry i Briggs demonstreaz c lactobacilii sunt printre cele mai importante bacterii prezente n rumen chiar i la animale care sunt furajate cu furaje grosiere. Hobson i Mann nu au putut demonstra prezena speciilor brevis, fermenti sau acidophilus n lichidul ruminal preluat de la viei sau oi furajai cu furaje

pentru aduli. Totui, o specie de Lactobacillus a fost descoperit la viei de 7-10 zile care au avut o diet bazat pe lapte.

Lactobacillus casei ( www.bioweb.usu.edu) Chiar dac Lactobacillus sp. sunt n general inofensive, exist cteva excepii care produc edeme pulmonare acute i anemie hemolitic. 5. Streptococci- acestea sunt probabil cele mai studiate i izolate bacterii din rumen. Cea mai repezentativ specie este S. Bovis, cu celule gram-pozitive, nemotile, cu form oviod pn la form de coc, formeaz lanuri, iar celulele btrne pot fi gram-negative. Sunt considerate facultativ anaerobe, existnd tulpini strict anaerobe dar i tulpini aero-tolerante. Intr-un studiu, Hungate a comparat caracteristicile a 27 de tulpini izolate din lichidul ruminal preluat de la cteva vaci furajate cu fn i concentrate. Numrul era de 0,2-140 de milioane per ml. Gutierrez a artat numrul de streptococi amilolitici, facultativ anaerobi crete foarte mult la vacile furajate cu cereale. Tulpinile acestor bacterii se asemnau cu S. bovis cu excepia c acestea nu aveau toleran la temperaturi ridicate, erau puternic gram-pozitive doar 4 sau 6 ore, i reduceau nitraii. S-a artat c aceste culturi, la fel ca i alte patru tulpini de S. bovis au abilitatea de a se ataa de de amidonul din cereale. Dain i colab. au artat c mzga produs din sucroz (produs de S. bovis) este o polizaharid care conine glucoz i arat c este nevoie de dioxid de carbon pentru producerea ei cnd microorganismul este crescut n mediu aerob. Trei varieti de

Streptococcus bovis au fost descoperite prin folosirea de mzg, de fermentaia manitolului i de reaciile produse n mediul cu agar (snge de cal) . Ford i cloab. au descoperit c nici una dintre cele 26 de tulpini de S. bovis nu are nevoie de vitamina B cnd crete n condiii anaerobe, cu excepia tiaminului care a stimulat creterea a 5 tulpini. n mediu aerob, cteva tulpini au nevoie de acid nicotinic, biotin i tiamin. S. bovis este indubitabil implicat n degradarea amidonului i a altor carbohidrai solubili din rumen. Deoarece S. bovis este capabil de producerea unei cantiti foarte mare de acid lactic, ceea ce poate duce la diferite boli la rumegaroarele care sunt furajate cu furaje bogate n amidon i zaharuri (acidoz, balonare), se recomanda o diet pe baz de drojdie uscat, astfel acesta nu este capabil s prolifereze foarte repede. Alte specii de strptoccoci izolai dar gsite n numr mai mic n lichidul ruminal sunt: S. liquefaciens, S. faecalis i alte specii neclasificate. S-au descoperit deasemenea, i cteva specii de coci facultativ anaerobi care se pare c sunt implicai n procesul de fermentaie ruminal. Bauman i Foster au gsit bacterii similare cu cele din genul Pediococcus n diluaia lichidului ruminal preluat de la vaci furajate cu cereale. Civa cercettori au observat la microscop i au izolat o grupare sarcina, gram-negativ din lichidul ruminal de la oi. Mann a descoperit c sarcina este facultativ anaerob, care degradeaz glucoza i crete doar n ap peptonat. A fost numit Sarcina bakeri. B. Anaerobe 1. Sporulate-cele mai multe studii realizate asupra bacteriilor sporulate, celulolitice, anaerobe au dus la concluzia c acestea nu se dezvolt n rumen. Bullen i colab. au realizat c o specie de clostridium, C. perfringens a fost foarte repede distrus cnd a fost introdus n rumen. O alt concluzie care s-a desprins n urma studiilor afost aceea c bacteriile sporulate anaerobe nu sunt la fel de importante ca i cele nonsporulate pentru procesul de fermentaie din rumen. Totui cteva specii au fost caracterizate ca fiind semnificante. Acestea sunt: C. lochheadii, C. longisporum, C. butyricum, C. sporegenes.

Clostridium perifringens (www.microbewiki.kenyon.edu) 2. Nonsporulate a. Lactobacilli- Civa cercettori au izolat lactobacili anaerobi, homofermentativi din rumen dar doar cteva specii au fost bine carcaterizate. Mann i Oxford au descoperit tulpina unei bacterii (Organismul 123) care produce acid lactic. Au considerat c este o varietate de Lactobacillus lactis, strict anaerob. Bryan i colab. au descoperit aceai bacterie care predomina la viei de 3 i 6 spmni dar nu a fost gsit i la animale mai tinere, mai nvrst sau mature. Mai trziu, cercettorii au izolat o alta specie anaerob care produce acid lactic (grupul +R3), de la viei de 3-6 sptmni. Aceast specie difer de celelalte specii studiate. Alte specii izolate sunt: L. ruminis i L. vitulinis. b. Ramibacteria-Bryant i colab. au izolat dou specii gram-pozitive de bacterii care aparin genului Ramibacterium. Grupul +R1 a fost gsit printre bacteriile izolate de la un viel de 1 sptmn. Acest bacterie produce o cantitate mare de acid succinic i cantiti mai mici de acid lactic n mediul cu glucoz. Deasemenea prezenta cteva similariti cu L. bifidus. Cealalt specie de Ramibacterium izolat din rumenul unor viei era strict anaerob, producea acid lactic, acetic i formic n mediul cu glucoz i degrada lactoza. c.Eubacteria- Bryant i Burkery au izolat dou grupuri de bacterii anaerobe i gram-pozitive. Grupul +SR-Ggxc a fost studiat n detaliu i a fost plasat n genul Eubacterium. Aceste specii produc gaz i acid acetic, formic i lactic n proporii similare n mediul cu glucoz. Difer de

unele specii prin faptul c nu produc acid butiric i propionic sau amoniac i de altele (E. biforme i E. aerofaciens) prin fermentaia carbohidrailor, lichefierea n gelatin, i producerea unei cantiti mari de acizi grai volatili. Cellalt grup izolat de Bryant i Barkery, grupul +CR-GXC a fost studiat prin mai multe metode. 20 de tulpini au fost izolate de la 8 vaci furjate diferit. Toate tulpinile erau nonmotile cu multe celule aproape cocoidale. Erau aranjat n principal cte una, n perechi i n lanuri scurte, ocazional n lanuri de 20 de celule. Erau slab gram-pozitive n 16 ore de cultur iar multe celule nu reineau cristalul violet. Culturile mai btrne erau gram-negative. Coloniie de suprafa formate pe mediul cu agar erau netede, convexe, translucide pn la opace avnd diametrul de la 2 pn la 4 mm dup 3 zile de incubare. Toate tulpinile au crescut la 30-37 de grade C i erau strict anaerobe. Nici o tulpin nu a produs catalz sau indol, nu a lichefiat n gelatin, nu a hidrolizat celuloza sau amidonul, nu a descompus glicerolul, manitolul sau lactoza. In urma studiile realizate pe aceste dou grupuri de Eubacteria s-a ajuns la concluzia c ultimul grup aparine speciei E. ruminantium. d. Methanobacteria- producerea metanului este una dintre cele mai cunoscute recii care se petrece m rumen. Culturile de Methanosarcinae, Methanobacterium formicicum i de Methanobacterium sohngenii au fost probail obinute din culturi pure inoculate cu un volum mare de lichid ruminal. Smith i Hungate au realizat culturi de bacterii metanogene, anaerobe, gram-pozitive, nonmotile din coninutul ruminal de la vaci i oi aflate n diferite locaii geografice. Puritatea unei tulpini a fost foarte evideniat prin faptul c utilza hidrogen i acid formic n formarea metanului. Tulpina a fost numit Methanobacterium ruminantium. e. Lachnospirae- Bryant i colab. au descris genul Lachnospirae ca i bacterii anaerobe, nonsporulate, slab gram-pozitive, care degradeaz glucoza i produc cantiti mari de etanol, acid lactic, formic i acetic. Specia L. multiparus produce o colonie filementoas cu unele celule aranjate n lanuri lungi cu tendina de a se curba. Aceste caracteristici, dar i reacia Gram, sugereaz o relaie cu ordinul Actinomycetales. Acest bacterie degradez pectina, fiind gram-pozitiv, n form de bastona curbat, lat de 0,5 microni i cu o lungime de 2-4 microni. Pentru dezvoltare are nevoie de vitamine din complexul B, cerina pentru acestea variind de la o tulpin la alta. f. Cillobacteria- o singur tulpin izolat din coninutul ruminal diluat de la o vac furjat natural pe pune, care era anaerob, gram-pozitiv a fost plasat genului Cillobacterium i a

fost numit C. cellulosolvens. Difer de alte specii ale genului prin degradarea celulozei i prin producerea de acid lactic homofermentativ. g. Bacterioizi-acid succinic- bacteriile strict anaerobe, nonmotile, gram-negative care produc o cantitate mare de acid succinic sunt printre cele mai importante bacterii prezente n rumen. Trei specii aparinnd grupului au fost numite: B. succinogenes, B. amylophilus, B ruminicola. Primul nume al bacteriei Bacterioides succinogenes nu este prea aproape filogenetic de Bacterioides sp. i de aceea a fost redenumit Fibrobacter succinigenes. Aceasta este cea mai rspndit bacterie din rumen. La vacile furajate cu paie din gru, F. succinogenes reprezint 20% din totatul bacteriilor iar la cele furajate cu alte furaje, aceasta reprezint numai 5%. n unele studii a fost raportat c aceasta contribuie cu 5-6% din totalul procariotic 16S rRNA din coninutul rumenal al vacilor. La prima izolare, celulele sunt predominant sub form de bastona ns n cultur ele devin cocoidale sau sub form de lmie, cu diametrul ntre 0,81,6 microni. De obicei celulele sunt singulare, dar se pot observa i lanuri scurte sau rozete. Pentru cretere au nevoie de valerat sau izobutirat dra i de biotin i acidul p-aminobenzoic (PABA). Este relativ rezistent la antibioticele orale dra este sensibil la metaboliii secundari ai plantelor. Are complexe de enzime fibrolitice i este una dintre microorganismele care degradeaz amidonul cristalin. Bacterioides amylophilus- prin secvenierea oligonucleotidic 16S r RNA, Stackenbrandt i Hippe au propus ca numele de Bacterioides amylophilus sa fie schimbat n Ruminobacter amylophilus. Chiar dac se observ destul de rar se spune c este responsabil de digestia amidonului. Degradarea amidonului nu necesit amilaz extracelular, moleculele din amidon adernd la receptori celulari i sunt transportate n celul pentru hidroliz. R. amylophilus are form de bastona de la oval pm la lungui. In cteva substraturi produce acid, fermentez glicogenul i dextrinele. Produsele de fermentaie sunt acetatul i succinatul, iar dioxidul de carbon i amoniacul sunt eseniale pentru cretere. h. Bacterioide-acid butiric- Bryant a izolat din rumenul unor viei bacterii anaerobe, gramnegative, nonmotile sub form de bastonae care produc gaz, acid butiric, acetic i propionic n mediul cu glucoz. Bacteriile aparin genului Bacterioides dar puteau fi plasate i genului Sphaerophorus cu singura diferen dintre aceste genuri c Sphaerophorus spp. sunt mai multe pleomorfice.

Doetsch i colab. au descoperit nite bacterii anaerobe, gram-negative, nonmotile, sub form de bastona care produceau acid butiric i acetic dar i acid lactic i propionic n cantiti mai mici n descompunerea xilozei. Aceast bacterie a fost numit Bacterioides amylogenes. Forma curbat a celulelor le face s fie asemntoare cu bacteriile din genul Desulfovibrio dar absena flagelilor i faptul c nu reduce sulfat elimin aceast ipotez. i.Fusobacteria- Huhtanen i Gall au descoperit un grup de bacterii gram-negative, anaerobice sub form de bastona tr-un coninut ruminal diluat. Aceste bacterii produc acid, gaz i un miros urt n mediul cu glucoz. Aceste caracteristice indic faptul c bacteria face parte din genul Fusobacterium. Bryant a izolat, deasemenea, o specie nonmotil care aparine genului Fusobacterium din lichidul ruminal preluat de la viei de 1 i 3 sptmni dar nu a gasit bacterii asemntoare la alte animale. Caracteristicile tulpinilor variau n producerea de indol, lichefierea n gelatin, hidroliza amidonului, creterea la 22 i 45 grade Celsius, dar caracteristicile morfologice i fiziologice se asemnau. Acest grup era asemntor cu unele tulpini de Fusobacterium fusiforme . j.Butyrivibrio- ntr-un studiu realizat asupra bacteriilor celulolitice din rumen, Hungate a izolat bacterii sub form de bastona curbat, gram-negative care degradau o gam variat de carbohidrai i produceau dioxid de carbon, hidrogen, acid butiric i formic. A fost stabilit c bacteriile aparin genului Butyrivibrio i speciei B. fibrisolvens. Genul include bacterii anaerobe, nonsporulate, gram-negative, avnd form de bastona curbat care degradeaz glucoza i formeaz acid butiric. B.fibrisolvens este una dintre cele mai comune specii de bacterii din rumen. Pe lng rolul pe care l are n degradrea granulelor de amidon, ea degradeaz i fibrele vegetale, mai ales a xilanelor datorit coninutului de xilanaz. Are cea mai mare activitate metabolic putnd utiliza glucide simple, amidon de toate tipurile, polizaharide pectinice dar i ali polimeri necelulotici. k. Succinivibrio- bacteriile care fac parte din acest gen sunt anaerobe, nonsporulate, gramnegative, sub form de bastona curbat, monotrihe, i care produc o cantitate mare de acid succinic. Bryant i Small au studiat 7 tulpini preluate de la o vac i pe toate le-au inclus n aceai specie, S. dextrinosolvens. l. Desulfovibrio- n timpul unui studiu asupra bacteriilor din rumen care degradeaz lactoza, Gutierrez a izolat bacterii gram-negative, sub form de bastona curbat care produceau colonii

negre n prezena sulfatului feros. Deoarece au fost gsite n numr foarte mic nu s-au considerat importante pentru rumen. m. Selenomonas Selenomonas ruminantium- se ntlnesc cel mai des la animale furajate cu semine de cereale, acestea reprezentnd 22-51% din numrul total de nicroorganismele viabile. Celulele sunt gram-negative, curbate n form de banan, bastonaele avnd 0.9-1.1 microni i 3-3.6 microni, iar motilitatea este rezultatul flagelilor (n numr de 6) aflai n mijlocul prii concave a celulelor. n unele condiii, cum ar fi excesul de glucoz sau deficiena de fosfor, se poate observa pierderea de flageli i o morfologie spiralat. Chiar dac sunt strict anaerobe, cteva tulpini de S. ruminantium sunt tolerante la cantiti mici de oxigen i cel puin o tulpin posed oxidaza NADH solubil, aceasta fiind capabil de reducerea oxigenului la ap. n ciuda faptului c are o structur celular specific pentru bacterii gram-negative, prezint asemnri n secvena 16S r ADN cu bacteria gram-pozitiv Clostridium. Cerinele nutriionale depind de tulpin i de sursa de energie, dar de obicei includ n-valeratul, dioxidul de carbon i vitaminele din complexul B. Tulpinile care utilizeaz lactatul au cerine crescute pentru aminoacizi, n special pentru aspartat i p-aminobenzoat. Chiar dac nu pot s degradeze pectinele sau xilanele, cele mai multe tulpini pot s utilizeze pentru cretere produii de descompunere ai acestor polimeri. Tulpina S. ruminantium HD4 utilizeaz oligozaharide maltozice ns are o capacitate redus pentru degradarea amidonului. n cultur, unele tulpini pot s utilizeze amidonul solubil pentru cretere. S. ruminantium produce cantiti mici de hidrogen n cultur pur, dar adevrata metanogenez se desfoar n co-cultur cu metanogeni. (Henderson, 1980) O alt activitate important a S. ruminatium este decarboxilarea succinatului la propionat. (Strobel i Russel, 1991) La S. ruminantium este evideniat prezena plasmidelor. Abilitatea de a utiliza lactatul este transmisibil, acest fapt fiind evideniat n cteva studii, chiar dac plasmidele mari erau prezente n tulpina donoare, acestea aparent nu erau transferate la receptori utilizatori de lactat, mecanismeul de transfer rmnnd necunoscut. Bacteria se poate gsi i n alte ecosisteme anaerobe i are un rol important n formarea de granule n reactoare anaerobe. n. Borrelia- Bryant a izolat cteva tulpini de microorganisme din lichidul ruminal colectat de la oi i vaci i a studiat din punct de vedere fiziologic i caracteristic o singur tulpin pe care

a plasat-o genului Borrelia. Microorganismul era strict anaerob, care avea nevoie de substane necunoscute din rumen pentru a crete. Fermentaz glucoza i n urma aestui proces se formeaz o cantitate mare de acid succinic i acetic i o cantitate mai mic de acid lactic, formic, etanol i dioxid de carbon. o. Succinimonas- Succinimonas amylolytica a fost izolat din lichidul ruminal de la vaci furajate cu amestecuri de cereale.

3. Cocci a. Peptostreptococci- P. Elsdeniib. Ruminococci- cele mai importante microorgansime din rumen aparin cocilor anaerobi celulolitici. Foarte muli au cercetat aceste microorgansime i au stabilit ca genul Ruminococci include bacterii gram-pozitive, nonmotile, nonsporulate, sub form de coci anaerobi, care fermentez celuloza i produc cantiti mari de acid succinic. Cele trei tulpini studiate au aparinut speciei R. flavefacines. Acetia sunt ruminococci care produc acid succinic i un pigment galben pe stratul de celuloz, fermenteaz celuloza i celobioza. O a doua specie, Ruminococcus albus include tulpini care nu produc acid succinic. Caracteristicile acestei specii sunt variabile dar cele mai multe tulpini difer prin producerea sau nu a pigmentului galben. Celulele sunt singulare sau aranjate n perechi sunt gram-negative dar i gram-variabil, i de obicei noniodofilice. Produii de fermentaie sunt hidrogenul, dioxidul de carbon, etanol, acid acetic, acid formic i acid lactic. (articol) Celulele de R. albus i R. flavefaciens prezint protuberane cnd sunt crescute pe substrat de perete celular de la plante i absente la celulele crescute pe celobioz, ele putnd reprezenta complexe se enzime asemntoare celulosomelor altor bacterii celulozolitice. (Miron i colab. ,1989).

c. Veillonellae- folosind un mediu de lactat, Johns a izolat Veillonella alcalescens din rumenul unei oi. Deoarece a fost gsit n numr mic (to 7.4 X 106 per ml,) microorganismul nu prezint importan pentru rumen.

Alte specii de bacterii ntlnite n rumen

Megasphaera elsdenii aparine speciilor fermentative de lactat i glucide din rumen i intestin dar poate fi ntlnit i n intestinele omului i porcului. Acest coc gram-negativ, fr motilitate, ntlnit n perechi sau n lan pn la 20 de buci, poate s utilizeze att carbohidrai ct i acizi organici, fiind considerat unul dintre cele mai importante microorganisme cu rol n catabolismul acidului lactic. (Hungate,1966) Mitsoukella multiacidus, aparinnd iniial speciei Bacterioides ruminicola a fost redenumit deoarece aceste tulpini posedau citocrom b i erau capabile s utilizeze hidrogen (Hendelson, 1980). Tulpinile au secvene asemntoare cu cea 16S r ARN a Selenomonas ruminantium, utilizeaz substraturi asemntoare i produc lactat. Celulele sunt sub form de bastonae drepte, gram-negative, fr flageli. Anaerovibrio lipolytica- are dou propieti importante, cum ar fi hidroliza lipidelor i utilizarea lactailor, aceste avnd importan ecologic. Hobson i Mann au izolat-o de la oi furajate cu turte din semine de in. n acelai timp, Slyter i colab. au izolat-o n timpul schimbrii de la furaje concentrate, cnd utilizarea acidului lactic se mrete n organism. A mai fost izolat de la animale furajate cu furaje grosiere (Henderson, 1975) Celulele au form de bastonae bombate, gram negative de aproximativ 0,5 ori 1,2-3,6 microni, cu motilitate normal, dat de un singur flagel polar. Henderson a descris o bacterie lipolitic asemntoare cu A. lipolytica, ns flagelul era localizat pe parte concav a celulei. Substratele specifice utilizate sunt riboza, triacilgliceridele i fosolipidele, fiind fermentai i civa aminoacizi. Cei mai importani produi de fermentaie depind de substrat. Glicerolul este fermentat n propionat i succinat i n cantiti mici n hidrogen i lactat. Riboza i fructoza sunt fermentate n acetat, propionat i dioxid de carbon cu cantiti mici de succinat, hidrogen i lactat. DL-lactatul este fermentat deobicei n acetat, propionat i dioxid de carbon cu cantiti mici de succinat i hidrogen (Henderson, 1975). Bulele membranare eliberate de la suprafaa celular reprezint activitatea lipazic extracelular. Spirochetele Microorganismele spiralate au fost observate de multe ori n compoziia lichidului ruminal, n special cnd bacteriile celulolitice au fost izolate i studiate (Cheng i colab., 1984). Stanton i

Canale-Parola (1979) au calculat c Spirochetele se afl n pondere de la 1 % pn la 6% n totalul viabil de lichid ruminal. Paster i Canale-Parola (1982) au descris specii din rumen formatoare de succinat i etanol. Spirochetele din rumen sunt treponeme, care formez una sau ase grupuri filogetenice de spirochete (Paster, 1991). Treponema bryantii este gram-negativ, n form de bastonae helicale cu lungimea tipic de 3-8 microni, cu flagl periplasmatic aflat la un capt al celulei. Pentru cretere au nevoie de dioxid de carbon, izobutirat, 2-metilbutirat i vitamine din complexul B. T. saccharophilum a fost izolat din lichidul ruminal de la o vac de ctre Paster i CanaleParola (1985). Sunt celule helicoidale, mari, late de pn la 0,7 microni i lungi de 20 microni, cu un manunchi de flagele periplasmatice, care de obicei sunt n numr de 16.

Comunitatea Archaea din rumen

Comunitile care aparin domeniului Archaea din rumen contribuie la subunitatea 16S r RNA cu aproximativ 0,3-3,3%. Archaea are specii care se gsesc n mai multe habitate, dar cele din rumen sunt strict metanogene anaerobe. Multe specii metanogene pot crete folosindu-se de hidrogen i deasemenea cu ajutorul lui reduc dioxidul de carbon la metan. Unele specii pot crete cu ajutorul unor grupri metil i pot produce electroni care sunt folosii pentru reducerea grupriloe metil la metan. Alte specii pot crete cu acetat, reducndu-l la metan i dioxid de carbon. n funcionarea normal a rumenului, proteinele i carbohidraii reprezint cea mai mare surs de hran introdus i sunt fermetai de comunitile bacteriene la acizi grai volatili, metan, dioxid de carbon i hidrogen. Acizii grai volatili sunt preluai de ctre pereii rumenului i servesc ca surs de carbon i energie pentru rumegtoare. Bacteriile metanogene din rumen se prind de particulele materiale, de protozoare i se prind de epiteliul rumenului. Aceste specii de bacterii metanogene se pare c au o rat de cretere diferit din moment ce se elibereaz din rumen treptat. Bacteriile metanogene din rumen Bacteriile metanogene au fost clasificate n 28 de genuri i 113 specii dar mult mai multe specii se ateapt s fie n natur. Totui, foarte puine specii au fost izolate din rumen, acestea fiind n numr de 7 specii: Methanobacterium formicicum, Methanobacterium

bryantii, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter millerae, Methanobrevibacter olleyae, Methanomicrobium mobile, i Methanoculleus olentangyi. Deasemenea a fost izolat i Methanosarcina spp. dar aceste bacterii nu sunt aa numeroase n comunitatea Archaea. Studiul microorganismelor metanogene din rumen, dar i a ntregului domeniu Archaea a fost realizat cu ajutorul tehnicilor PCR. Acestea au ajutat la definirea secveei 16S r Rna de la Archaea iar apoi a urmat clonarea, folosind ca i gazd Escherichia coli. O evaluarea a grupurilor dominante de archaea din rumen poate fi realizat prin compararea secvenelor i a a genelor 16S r RNA. 2.Clasificarea speciilor metanogene Archaea Studiile realizate asupra speciilor metanogene din rumen au fost separate n dou categorii: studii privind numrul total de specii archaea i studii privind protozoarele asociate cu archaea. (tabel 1). Pentru studiul comunitilor archaea s-au realizat nou studii, incluznd celulele libere, particulele asociate cu celule i particule asociate cu alte microorganisme din rumen. Aceste 9 studii au fost divizate n 12 seturi de date care conin 294 de secvene combinate folositoare, acestea reprezentnd 1.026 de gene 16S r RNA clonate. Cinci alte studii se refer la protozoarele asociate cu archaea i cuprind 187 de secvene care reprezint 2.717 gene 16S r RNA clonate. Secvenele de gene 16S r RNA au fost descrcate din baza de date GenBank ntr-o alt alt baz de date global ntreinut cu ARB. (!) In plus, au fost incluse ca i secvenee de referin alte 138 de secvene de gene 16S r RNA preluate de la metanogene. Aceste secvene de referin aveau lungimea de 1.300 de nucleotide. n urma analizelor realizate asupra secvenelor a rezultat o dendogram (fig 1) care a permis alinierea final a tuturor secvenelor i a clonelor asociate a microorganismelor archaea din rumen. (tabelul 2) TABEL 1. Numrul de clone i de secvene din studiu (sintez) Obiect de studiu i autor Nr. set de Nr. secvene date >870pb <800pb Archaea n rumen Shin et al. Skillman et al. Tajima et al. Whitford et al. Wright et al. Wright et al. Wright et al. Wright et al. Yanagita et al. Protozoare asociate archaea Chagan et al. Irbis and Ushida Ohene-Adjei et al. 1 1 1 1 3 1 2 1 1 cu 1 1 1 0 0 0 8 14 139 91 2.398 139 104 10 8 41 43 la a 26 28 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 Nr. clone

104 10 23 41 405 78 241 104 20

Regensbogenova et al. Tokura et al.

1 1

11 0

9 6

20 69

a- 26 de secvene adiionale care reprezint 328 de clone nu au fost incluse

Abundena comunitii archaea n rumen In urma analizei datelor din bazele de date, majoritatea speciilor archaea (92,3%) prezente n rumen pot fi repartizate n trei grupuri sau genuri. Acestea sunt Methanobrevibacter (61,6%), Methanomicrobium (14,9), i un grup mare de specii neculturate plasate n clusterul C sau RCC (15,8%). Genul Methanobrevibacter este cel mai numeros din rumen iar secvenele clonate se mpart n dou calde majore: o clad definit de speciile M. gottschalkii, M. thaueri i M. millerae acestea coninnd cele mai multe clone de Methanobrevibacter. Aceste grupuri formeaz clada M. gottschalkii. O alt clad major este dat de M. ruminantium i M. olleyae, coninnd 27,3% din totalul speciilor archaea din rumen. Acestea aparin cladei M.ruminantium i au fost gsite aproape n toate seturile de date (tabel2). Alte specii care aparin genului Methanobrevibacter sunt M. smithii i M. wolinii, dar aceste specii sunt rare. Speciile care aparin altor grupuri de metanogene printre care Methanimicrococcus spp., Methanosphaera spp. i Methanobacterium spp. au aprut n seturile de date n abunden mic. Dou grupuri de archaea neculturate, care aparin grupului Qld26 i cladei Crenarchaeota au fost deasemenea gsite. Grupul Qld26 conine secvenele CSIRO-Qld26 i Ven-04 ale 16S r RNA i 9 secvenee asociate cu particule mari din rumen, detectate de Shin i colab. Caracteristicile fiziologice ale acestor grupuri nu sunt cunoscute. Variaiile n compoziia secvenelor la majoritatea cladelor sunt foarte mari. Cele mai multe variaii apar la M. gottshalkii din cauza erorilor de secveniere i a diversitii genetice a tulpinilor de Methanobrevibacter spp. Alte variaii majore apar i la alte subgrupuri, cum ar fi: Methanomicrobium, Methanosphaera, Qlde 26, Methanomicrococcus i majoritatea la M. ruminantium. Grupul RCC prezint variaii considerabile n tipurile de secvene. Diferena de 3% a secvenelor 16S r RNA de la procariote este foarte des folosit ca i indicator de separare a dou tulpini. Dac diferena este mai mic de 3% nu se poate folosi secevena genic 16S r RNA pentru a putea determina care tulpini aparin aceleai specii i care nu. Dighe i colab. susin c o diferen de 2 % la secvena genic 16S r RNA corelat cu similaritile de 70% a hibridrii ADN-ADN de la Methanobrevibacter poate fi folosit pentru a separa secvenele n dou specii. Speciile care aparin cladei Methanobrevibacter au diferene de 3 % la secveneele genice 16S r RNA iar decizia de a separa mai multe specii s-a bazat pe diferenele multiple n genom. Totui, bazndu-se pe diferenele prezente la rezultatele hibridrii ADN-ADN poate exista un numr mai mare de specii care aparin genului Methanobrevibacter sau chiar un numr mic (aproximativ patru). Analiza detaliat a genomului poate susine crae interpretare este corect, dei sfritul analizei depinde foarte mult de definirea speciilor procariote, n special dac genomul formez genotipuri. Este mult mai important s se detremine cte grupuri funcionale fac parte din aceste clade i care sunt diferenele biochimice i ecologice.

TABELUL 2 Clada

Detectarea n coninutul total ruminal Mean Maxim Nr. % % set de dat e (n 12) 14,9 2,4 33,6 0,1 27,3 0,1 0,5 3,7 0,2 15,8 1,3 0,2 85,6 14,6 81,2 0,8 60,0 1,0 5,6 26,8 2,9 80,8 8,7 2,9 4 3 10 1 10 1 1 5 1 5 3 1

Detectarea n protozoarele asociate cu archaea Mean Maxim Nr. % % set de date (n 5) 20,1 4,0 42,9 0 12,5 2,6 0,6 1,9 0,4 15,1 0 0 80,0 20,0 98,6 ND la c 62,6 12,8 2,9 4,0 1,1 74,1 ND ND 3 1 3 0 1 1 1 4 2 2 0 0

Methanomicrobium Methanimicrococcu s M. gottschalkii M. smithii M. ruminantium M. wolinii Alte Methanobrevibacter Methanosphaera Methanobacterium RCC Qld26 Crenarchaeota

Alte metode de identificare Probe de ARN au fost utilizate pentru a analiza comunitatea archaea din rumen, folosind hibridarea i nu extragerea de ARN sau a hibridrii fluorescente in situ (FISH). Aceste studii au ca rezultat faptul c membrii familiei Methanobacteriaceae (care include Methanobrevibacter spp., Methanobacterium spp. i Methanosphaera spp.) erau membrii dominani ai comunitii archaea din rumen (30-99%). Membrii ordinului Methanomicrobiales sunt cei mai puini (0-54%) iar membrii ordinului Methanosarcinales apar foarte rar (2-3%). Separarea genelor 16S r RNA n gelul electroforetic amplificate prin PCR confirm prezena n numr mare a speciilor de M. ruminantium, M. gottschalkii i a grupului RCC n lichidul ruminal preluat de la oi i vaci furajate pe pune. Deasemenea s-au descoperit i membrii ai Methanimicrococcus i Methanosphaera. Abundena speciilor se asemna cu cea din bazele de date globale. Specii de Methanococcales nu au fost determinate. Tatsuoka i colab. i Denman i colab. au evideniat prezena genei metil-coenzima M reductaza (mcrA) n rumenul vacilor. Aceast enzima i gena ei sunt buni evideniatori ai metanogenezei n rumen. n ambele studii, genele mcrA de la Methanobrevibacter spp. au dominat librriile i au fost generate cu ajutorul prime-rilor care au ca int secvenele mcrA. Denman i colab. au descoperit i un grup de secvene mcrA care aparineau unui grup nedefinit de archaea care a fost deasemenea descoperit i de Luton. Nu este cunoscut dac aceste secvene sunt derivate din unul dintre grupurile nedefinite de archaea detectate n

librriile 16S r RNA. n cele dou studii relizate nu au fost gsite gene mcrA pentru Methanococcales. Bacteriile metanogene care au fost gsite n rumen aparin cladei majore din bazele de date globale, cu excepia speciilor de Methanosarcina i a Methanoculleus olentangyi. Izolarea unui microorgansim dintr-un mediu anume indic prezena acestuia n acel mediu n timpul recoltrii, dar dac abundena acestuia este cuantificat, nu este posibil s se declare semnificaia numeric pe care microorganismul o are n comunitatea din care a fost preluat. Cu ajutorul secvenei 16S r RNA se pot detecta populaiile mari. Se poate considera faptul c Methanosarcina spp. i Methanoculleus spp. au fost gsite n probele preluate din rumen dar nu par s aibe o semnificaie numeric pentru comunitatea archaea din rumern. Structura comunitii Archaea Structura comunitii Archaea variaz n funcie de specie, de diet sau de metodele de extragere de AND i de primerii PCR folosii. Dou studii au fost realizate cu ajutorul acelorai metode de extragere AND i au folosit aceeai primeri PCR. Deasemenea au evaluat diversitatea Archaea din rumenul oilor. Comunitatea Archaea din rumenul acestor oi (crescute la Centrul de Cercetare CSIRO Yalanbee din vestul Australiei) era dominat de M. gottschalkii (75,3%) i de M. ruminantium (19,5%). In contrast, un studiu realizat pe oi din Queensland, Australia a evideniat prezena cladei RCC (80,8%), a M. gottschalkii (9 %) i a cladei de Methanomicrobium (7,7 %). Aceste diferene mari aprute ntre comuniti pot fi din cauza dietei, mediului, sntii animalelor, genotipului i a vrstei. Alte studii realizate de Shin i Tajima au evideniat dominana speciilor de Methanomicrobium (85,6%, respectiv 60,9%) n rumenul unor vaci. Witford, n urma unor studii a realizat c speciile de Methanosphaera (26,8%) i de Methanomicrococcus (14,6%) erau speciile abundente n rumenul vacilor iar speciile dominante aparineau de Methanobrevibacter (58,5%). Wright i colab. au descoperit, n urma unor studii realizate n Canada asupra unor vaci furajate cu loturi, c speciile dominante de archaea aparin grupurilor Methanobrevibacter (50-51,9%) i a grupului RCC (37,8-50%). Wright a realizat un studiu n urma cruia s-a stabilit c dieta animalelor are un efect asupra compoziiei comunitii metanogene din rumen. Trei grupuri de oi au fost furajate diferit cu treo diete: pune, ovz i lucern. A rezultat o variaie a cladelor de Archaea n aceste trei cohorte. Se cunoate faptul c dieta afecteaz compoziia bacterian din rumen, dar se ateapt ca bacteriile s intercioneze mai mult cu furajul din moment ce l folosesc ca i substrat de energie. Majoritatea speciilor Archaea din rumen folosesc hidrogenul i formatul ca i surs de energie, acestea fiind formate n timpul primei fermentaii a furajului de ctre bacteriile ruminale, fungi i protozoare. Dieta poate avea un efect major asupra metanogenezei datorit schimbrii pH-ului care poate afecta direct activitatea metanogenezei. Abundena speciilor Archaea asociate cu protozoarele Bazndu-se pe analiza librriilor de clone, majoritatea protozoarelor asociate cu archaea (93,8%) pot fi amplasate grupurilor dominante, adic genurilor Methanobrevibacter i Methanomicrobium i a grupului RCC. (tabel 2)

Rolul n rumen Dintre cele 11 clade de Archaea detectate, 9 utilizeaz hidrogenul n metanogenez. Acestea aparin genurilor Methanobrevibacter, Methanomicrobium, Methanobacterium, Methanospaera i Methanomicrococcus. Nu este clar cum acestea coexist n rumen, dar se pare c exist diferene n abundena lor n diferite studii, acest lucru indicnd o influen dat de specia animalului i de hran. Speciile archaea din rumen deasemenea interacionez cu protozoare, cu alte bacterii i cu fungi. Fiziologia speciilor cladei Qld26 i a grupului C din clada RCC nu este cunoscut. Deoarece clada Qld26 se aseamn cu speciile de Methanobrevibacter, Methanobacetrium i Methanosphaera acestea pot fi utilizatoare de hidrogen. Grupul C din clada RCC a fost descoperit i n tractul digestiv dar i n alte medii anaerobe. Clada RCC a fost etichetat ca fiind parte din grupul metanogenelor dar sunt foarte puine dovezi care s evidenieze acest lucru. Limitarea activitii metanogenezei n rumenul animalelor domestice poate avea rezultate pozitive asupra productivitii animalelor dac procesul de fermentaie nu este afectat direct. Aceste strategii de limitare a cantitii de metan pot fi efectuate numai dup cunoaterea comunitilor de bacterii, n special a celor metanogene din rumen. 4.Folosirea anticorpilor IgY ca inhibitori ai metanogenezei (prezentare pe larg) +
Avian (IgY) anti-methanogen antibodies for reducing ruminal methane production: in vitro assessment of their effects (experimentele lui Cook-am gasit doar abstractul)

Oul de gin este cea mai mare celul cunoscut care provine ditr-o singur diviziune celular i care este compus din substane importante pentru via (nutrieni, proteine, lipide, carbohidrai i ali compui biologici). Cnd un ou fertilizat este inut la o temperatur de 37 de grade Celsius pentru 21 de zile eclozeaz. Totui, acest mediu optim pentru ecloziune este i un mediu optim pentru creterea bacteriilor i a virusurilor (Mujo Kim et al., 2000). Se cunoate foarte bine faptul c albuul i glbenuul oului au proprieti antibacteriale i antivirale. n cadrul imunologiei, anticorpii pe baz de ou au devenit forate studiai. Imunizarea pasiv, oral cu anticorpi pe baz de ou are efecte asupra infeciilor gastrointestinale. Anticorpii se refer cteodat la imunoglobuline (Igs) i sunt gsii n fluidele umorale (snge, saliv, lapte) ale vertebratelor. La oameni sunt cunoscute cinci clase de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) care sunt distincte n structur i funcie. Animalele produc anticorpi IgG aproape pentru toi antigenii (bacterii, virusuri, proteine). Acest imunitate umoral este un sistem biologic de aprare stabilit n evoluia animalelor. Psrile prezint trei tipuri de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM) care sunt transferate de ctre pasre la oule sale. IgA i IgM sunt secretate mpreun cu alte proteine i fac parte din albu iar IgG este transferat prin membrana glbenuului n glbenu n perioada de maturare. Anticorpii IgG din ou au o iminitate pasiv deoarece anticorpii originari de la gin sunt folosii pentru protecia puilor de unele boli. Anticorpii IgG de la gain sunt gsii n sngele puilor iar anticorpii IgA i IgM sunt prezeni n tracul digestiv (Mujo Kim et al., 2000).gg

Yolk Antibody

Anticorpii IgY sunt folosii n mai multe cmpuri de cercetare, imunizare i diagnosticare. Deasemena sunt folosii i n modularea microflorei intestinale sau ruminale pentru a reduce cantitatea de metan i a formrii acidozei ruminale (Christopher et al., -Keep bacteria under control: Dietary modulation of gut microflora in farm animals by use of hen egg yolk antibodies) S-au realizat foarte multe studii cu privire la diferenele structurale dintre anticorpii IgG mamalieni i cei aviari. Printre aceste diferene se numr: greutatea molecular a IgG aviar (1,8 ori 10 la a 4) este mai mare dect greutatea molecular a IgG mamalieni (1,5,ori 10 la 4); punctul izoelectric este mai mic la IgG aviar dect cel al IgG-ului; IgG aviar nu se asociaz cu complemenii mamiferi; IgG aviar nu se leag de proteina A de la Staphylococcus sau cu un factor reumatoid din snge. Bazndu-se pe aceste diferene, IgG provenit din galbenuul de ou se numete IgY (Mujo Kim et al., 2000).