Capitolul I-IV

Ecotoxicologie
Maria Prisecaru, Roxana Voicu
Capitolul 1 CONSIDERAII GENERALE
1.1.
NOIUNEA DE TOXIC ; RELAIILE TOXICULUI CU ORGANISMUL VIU I MEDIUL NCONJURTOR
Istoria toxicologiei arat cu prisosin locul i contribuia deosebit a acestei tiine n viaa contemporan. n prezent, toxicologia nu se limiteaz la studiul toxicilor consacrai, deoarece numeroase substane, folosite n cele mai variate domenii ale activitii umane, n aparent nenocive, pot deveni potenial toxice, aspect dovedit pe msura perfecionrii mijloacelor de investigaie. n prezent situaia n toxicologie poate fi privit sub mai multe aspecte: a) CARACTERIZAREA TOXICULUI. n toxicologia clasic se pleca de la toxic, cutnd s se acumuleze date i probe. Treptat s-au considerat urmtoarele puncte de vedere: Analitic: la nceputul toxicologiei tiinifice, ctre mijlocul secolului XIX, n cadrul medicinei legale, cteva otrviri celebre (cazurile Lafarge, Bocarne etc) au artat marea dificultate a identificrii i dozrii unui toxic n produse biologice. Ulterior aportul metodelor chimice, chimico-fizice i fizice, a fost considerabil i continu s se lrgeasc i n prezent. n plus, se practic tot mai mult, n vederea stabilirii unui diagnostic, aplicarea mai multor sisteme analitice (spectrfotometrie, U.V., cromatografie, reacii chimice sensibile, microscopie etc), ca i a unor metodologii tot mai elaborate. Sensibilitatea i specificitatea metodelor toxicologice este esenial n probleme de poluarea a mediului, din cauza complexitii frecvente a acesteia; este ns adesea dificil s se identifice totalitatea componenilor unei atmosfere i cu att mai mult s se dozeze. Biologic: cunoaterea toxicului a condus la elucidarea i interpretarea localizrii, acumulrii, metabolizrii i eliminrii sale, ca i la studierea compoziiei materiei vii. S-a conturat astfel toxicologia metabolic sau xenologia, domeniul toxicologiei care studiaz procesele fiziologice i biochimice de transformare a substanelor strine, naintea ajungerii lor la celule sau puncte de impact pe care le-ar putea leza, precum i citotoxicologia care studiaz modificrile specifice generate de diferite toxine la nivel celular i subcelular, ca i consecinele acestora asupra organismului. Studiul relaiilor reciproce dintre toxic, organism i mediu, ca i aciunea agresiv a substanelor toxice asupra mediului, constituie domeniul ecotoxicologiei. Experimental: acest studiu este indispensabil oricrei tiine. Iniial s-a practicat n special observarea aspectelor histologice pe animale de experien. Ulterior s-a trecut la studiul funciilor diferitelor organe. Progresul tehnic a condus i n acest domeniu la rezultate remarcabile (microscopia electronic). b) RELAIILE DINTRE TOXIC I ORGANISMUL VIU Mai nti este necesar s se aprecieze c nu exist un compus toxic n sine: toxicitatea se exprim prin rspunsul dat de organismul viu cu care vine n contact. Se consider c orice molecul instabil termodinamic la o temperatur superioar temperaturii absolute, poate manifesta efecte toxice n anumite condiii. Toate organismele vii se afl n echilibrustabil cu mediul nconjurtor. Acest echilibru este rezultanta a dou fore contradictorii: o for entropic tinde s fac s dispar individul prin egalizarea energiilor (conform celui de-al doilea principiu al termodinamicii), iar alt for, metabolismul, const dimpotriv, s menin diferenierea necesar fa de mediu. Din acest punct de vedere, se pot defini, n sens larg:
Ecotoxicologie
Toxic orice factor care are tendina s rup echilibru ntre un individ i mediul nconjurtor; factorul poate fi de natur chimic, fizic sau chiar psihic; Medicament poate fi considerat, din contra orice factor capabil s readuc la normal situaia perturbat. Efectul toxic trebuie privit n raport cu organul, celula sau molecula int. Este necesar de asemenea cunoaterea importanei intei fa de organism n ntregime, cci lanurile biosintetice sunt strns legate ntre ele. Explorarea unor astfel de organisme reprezint desigur tehnica viitorului care deja se ntrezrete. n decursul timpurilor, cnd individul a ajuns n conflict cu mediul a avut mai multe soluii: lupta, fuga sau adaptarea. Adaptarea la condiiile de mediu a fost dintotdeauna preferat de organismele vii, ns adaptarea reuete atunci cnd factorul de mediu nu variaz mai repede dect timpul necesar adaptrii biologice. n fine, n cazul substanelor cancerigene, exist o acumulare a efectelor, nct urmele aciunii nocive persist chiar atunci cnd toxicul a disprut. c) RELAIILE DINTRE TOXIC I MEDIUL NCONJURTOR n prezent comportarea toxicilor n mediu i n special la nivelul lanurilor alimentare este o preocupare general i major. Toxicologia clasic se preocup n deosebi de toxic. Toxicologia modern i-a lrgit enorm sfera de aciune. Dintr-o tiin descriptiv apoi preventiv, toxicologia a devenit n prezent selectiv, ca urmare,s-a dezvoltat o ramur a toxicologiei ecotoxicologia care prin studiul ei tinde s elimine sau cel puin s controleze ceea ce este duntor n mediul nconjurtor pentru organismul uman (dar i animal, vegetal) fr a crea, pe ct posibil, un dezechilibru ecologic. Prin urmare, pe plan practic, toxicologia este o tiin care amelioreaz calitatea vieii umane, iar pe plan teoretic, ncearc s modifice comportarea unei celule (protozoar, bacterie sau chiar receptor fiziologic afectat) fr a afecta alte celule sau receptori fiziologici.
1.2.
TOXIC, TOXICITATE, DOZ n accepiunea curent prin toxic se definete acel produs care are proprietatea ca, ptruns n organismul viu, indiferent de cale i de mod de administrare, s provoace de la o anumit doz, prin procesele fizico-chimice pe care le declaneaz, perturbri funcionale i de structur care genereaz o stare patologic numit intoxicaie. Substana sau produsul cu propriti agresive asupra organismului viu poart denumirea de toxic (etimologic provenind de la taxon, arc cu sgei otrvite) sau otrav de la termenul slavon otraviti care nseamn a amr viaa cuiva). Imensul numr de substane i produse existente n prezent care sunt capabile s provoace intoxicaii a dus la ncadrarea lor sistematic pe diverse criterii de clasificare: dup origine (minerali, vegetali, animali, organici de sintez sau semisintez, etc), dup starea de agregare (gazoi, volatili, lichizi, solizi), dup simptomele principale (convulsivani, asfixiani, halucinogeni, stimuleni, depresivi, etc), dup leziunile anatomo-patologice (leziuni locale, postresorbie, leziuni specifice, nespecifice, etc), dup domeniul de utilizare (toxici industriali, casnici, de origine medicamentoas, din sectorul agricol, etc). Intoxicaiile sunt i ele clasificate n: accidentale i intenionale (sinuciderile, inclusiv toxicomaniile, omuciderile). Din punct de vedere al intensitii cu care se manifest, de desfurarea lor n timp limitat i n raport direct cu doza de toxic, intoxicaiile se mai clasific n: acute (cu formele supra-acut i sub-acut) i cronice. Toxicitatea este o caracteristic aparte a unor produi, diferit de proprietile lor curente (stare fizic, culoare, constante fizico-chimice, etc); ea reprezint o comportare biochimic a substanei fa de un organism viu i este condiionat de o serie de factori prioritari, ca de exemplu: a) de organismul asupra cruia acioneaz (om, pasre, animal, etc);
Ecotoxicologie b) de doza ptruns n organism; c) de unii factori care modific gradul de toxicitate.
a) Organismul asupra cruia acioneaz produsul. Reacia biochimic rezultat din aciunea asupra organismului viu este, n unele situaii, legat de specia respectiv: de exemplu sunt substane foarte toxice pentru om i practic netoxice pentru alte vieuitoare (psrile mnnc cantarida care este foarte toxic pentru om; unele ierbivore pasc plante foarte toxice pentru om, ca de exemplu, digitala, mtrguna, convalaria). n cealalt extrem sunt substanele deosebit de toxice pentru unele specii i practic netoxice pentru om (de exemplu, diverse insecticide de uz casnic - gospodresc). b) Doza ptruns n organism. Cantitatea de produs care acioneaz asupra organismului este cea care, n general, determin prin ea nsi efectul toxic. Pe linie de protecie antitoxic sau stabilit de-a lungul anilor att cantitile de produs nepericuloase pentru organisme, inclusiv cel uman, cr i cele care produc o stare patologic. Deci, doza reprezint relaia dintre cantitate i efect. Aciunea asupra organismului poate fi, n cazul medicamentelor, terapeutic sau toxic; de aici i cele dou tipuri de doze cu referire la medicaie: - doza maxim pentru o dat; - doza maxim pentru 24 de ore. (tot n sector terapeutic mai apare i doza de atac i doza de ntreinere, aplicat la medicaia prelungit). Efectele toxice cu sfrit letal pentru toate substanele cu potenial toxic se exprim prin aprecierea cantitativ a unei doze minime (DML = doza minim letal) capabile s provoace moartea unei persoane adulte. Prin DML se nelege deci cantitatea minim de toxic care administrat n doz mic poate provoca moartea unei persoane adulte. Aceast doz a fost stabilit, de obicei, prin extrapolarea la om a dozelor rezultate din studii experimentale pe animale care se apropie de reactivitatea organismului uman. Doza experimental se exprim prin DL50 (doza letal medie) i reprezint cantitatea de toxic, exprimat n g/kg corp animal, care provoac, la administrare n doz unic, moartea ntr-un timp determinat, a 50% din animalele unui lot pe care se practic determinarea toxicitii acelei substane. n funcie de valoarea DL50 i DML este apreciat i gradul de toxicitate al unei substane, ncadrnd-o din acest punct de vedere n diverse grupe. Astfel s-au elaborat diverse moduri de ncadrare a acestei toxiciti, unele exemplificate n tabelele 1, 2 i 3. Tabelul 1. Gradul de toxicitate i relaiile cantitative ntre dozele toxice la animal i la om (dup THIENES - HALVEY) Doza posibil mortal la om DL50/g/kg animal Gradul de toxicitate (70kg) sub 0,001 Toxic foarte periculos cteva centigrame 0,001 - 0,01 Toxic puternic 0,20 - 1g 0,01 - 0,05 Toxicitate marcat 1 - 5g 0,05 - 0,5 Toxicitate apreciabil 5 - 20g 0,5 - 5 Toxicitate redus 20 - 200g 5 - 15 Toxic slab peste 200g
Ecotoxicologie
Tabelul 2. Gradul de toxicitate n funcie de DL50 (dup HODGE i STEANER) Categoria de toxice DL50 la obolan, per os Substane Extrem de toxice Sub 1 mg/kg Alcaloizi Foarte toxice 1 - 50 mg/kg Derivai organo-fosforici, organo-mercuriali, de arsen Moderat toxice 50 - 500 mg/kg Metale grele Slab toxice 500 - 5000 mg/kg Ni, Fe, aditivi alimentari, colorani Practic netoxice 5000 - 15000 mg/kg Unii acizi organici, NaCl Relativ fr nici un efect peste 15000 mg/kg Substane alimentare Tabelul 3. Gradul de toxicitate al unor pesticide (dup normele internaionale n vigoare) Nr. grupei de Denumirea gradului de DL50 la obolan toxicitate toxicitate (mg/kg-corp) Grupa I Produse extrem de toxice sub 50 Grupa II Produse puternic toxice 50 - 200 Grupa III Produse moderat toxice 200 - 1000 Grupa IV Produse cu toxicitate redus peste 1000 Ca un criteriu orientativ de stabilire a toxicitii unor medicamente se apreciaz de unii autori c DML este de circa 10 ori mai mare dect doza maxim terapeutic. Precizm c aceste valori de DML se refer la indivizii aduli (se exclud extremele copiii i btrnii), n greutate corporal medie (circa 70 kg), netrarai fizic. Pentru stabilirea DML la copii s-au propus o serie de tabele i formele bazate pe vrst sau pe greutate corporal. De exemplu, Jane propune formula: V DML la copii = -------- x DML adult V+12 n care V = vrsta copilului Ca o consecin a polurii mediului prin procese tehnologice i de chimizare i pentru a se evita riscurile unor intoxicaii prin expuneri repetate la anumite substane s-au stabilit n timp concentraii maxime admise din aceste substane cu caracter agresiv asupra vieii, ca de exemplu: - CMA (concentraia maxim admis) pentru ape, exprimat n mg/dm3; - CMA (concentraia maxim admis) pentru aer, exprimat n mg/m3. Din analiza cazurilor de intoxicaie, provocate mai ales pe cale respiratorie, s-au stabilit i concentraiile capabile s provoace moartea. Numeroase tabele cuprind astfel de concentraii i doze legate de toxicitatea substanelor (prezentate n partea special). c) Factorii care modific toxicitatea. Toxicitatea prin faptul c reprezint nu o caracteristic fizico-chimic a toxicului sau a substanei, ci a comportare biochimic fa de organismul viu, poate suferi modificri legate de diveri factori dependeni att de substan n sime ct i de organismul asupra cruia i exercit aciuna; de asemenea, aceast toxicitate este legat i de relaia toxic organism (subcap. 2.5). 1.3.POLUAREA I DEZECHILIBRELE ECOLOGICE N NATUR Poluarea reprezint alturi de dezvoltarea tehnologic i demografic, cauza major a crizei ecologice mondiale care se manifest n prezent, concretizat prin alterarea ecosistemelor naturale terestre i acvatice, scderea ngrijortoare a resurselor. n ansamblul lor, aceti factori au modificat profund raportul dinte om i natur. Poluarea sau alterarea mediului natural are un caracter istoric, fiind determinat de numeroase cauze, de origine natural i antropic, avnd consecine reduse (poluri locale) sau
Ecotoxicologie
mai extinse (poluri regionale, continentale) sau chiar planetare. Pn la dezvoltarea civilizaiei industriale din secolul al -XIX lea perturbrile ecosistemelor naturale erau puin importante, iar poluarea cu excepia celei de origine microbian inexistent. Industrializarea a determinat progresiv tulburri n desfurarea fluxurilor de energie i a ciclurilor substanelor n natur, explicat prin creterea deosebit a consumului de energie folosit (petrol, crbuni, gaze naturale) i mai recent folosirea materialelor radioactive. Producerea intens de energie a fost i este nsoit de eliminarea n ecosistemele naturale a unui numr considerabil de poluani foarte toxici i nebiodegradabili care contamineaz n multe cazuri ireversibil ecosistemele naturale. Interveniile omului asupra naturii s-au amplificat pe msura progresului i a revoluiilor tehnice. Voina uman a introdus mecanismul de control i reglare, care au dus la o artificializare a condiiilor naturale, afectnd solul, apele, atmosfera ct i speciile vegetale i animale. Consecinele biologice i ecologice ale polurii sunt foarte complexe, afectnd calitatea sau distrugnd mediul natural i echilibrul biologic. 1.3.1. Poluarea mediului terestru O important cauz a polurii solului este aplicarea n practica agricol a pesticidelor i ngrmintelor chimice. Pesticidele cuprind numeroi compui organici de sintez destinai luptei contra paraziilor animali sau vegetali care atac culturile (insecticide, fungicide, erbicide etc). Dintre insecticide, compuii organoclorurai ca: lindan, dieldrin, DDT etc., sunt poluani puternici deoarece, fiind puin sau deloc biodegradabili, se acumuleaz direct n ecosisteme. Administrarea pesticidelor contamineaz direct solurile cultivate i indirect lanurile trofice. Concentraiile insecticidelor organoclorurate cresc odat cu creterea pe vertical a nivelurilor trofice. mprtierea pesticidelor este nsoit i de trecerea lor n atmosfer i n ape, iar prin curenii atmosferici pot contamina solurile aflate la mii de Km distan. ngrmintele chimice utilizate ca fertilizani n agricultur, mai ales azotai, fosfai i sruri de potasiu reprezint o surs de poluare, datorit impuritilor toxice pe care le conin (arsenic, cadmiu, mercur) i care trec din sol n plante. Poluarea radioactiv a solului se poate produce ca urmare a irigrii culturilor cu ape contaminate radioactiv. Utilizarea necorespunztoare a apei la irigarea terenurilor agricole, asociat cu o evaporare foarte mare, urmat de acumularea de sruri n straturile superficiale ale solului, a dus la distrugerea prin salinizare a unor vaste suprafee de terenuri irigate, mai ales n rile cu climat arid (China, Egipt, Irak etc). Exploatarea forestier masiv a dus la distrugerea unor suprafee imense de pduri. n prezent, dup datele culese prin satelii, suprafaa pdurilor defriate depete 200.000 Km/an, afectnd mai ales pdurile tropicale pluviale, pdurile mediteraneene i pdurile boreale de conifere (taigaua). Lemnul obinut n urma defririlor era folosit drept combustibil, n construcii, mobil. De exemplu n rile srace terenurile rezultate n urma defririlor sunt transformate n puni pentru creterea excesiv a animalelor i de asemenea pentru culturi agricole. n felul acesta sunt practic epuizate, degradate. Incendiile accidentale sau provocate constituie o alt cauz a distrugerii solului, cu implicaii asupra ciclului apei i prin aceasta asupra climei. Eroziunea hidric i eolian, ct i alunecrile de teren sunt consecine nefaste ale defririlor. Activitatea uman, prin punat i supraexploatarea resurselor naturale duce la degradarea solurilor i ecosistemelor, antrennd o mpuinare a vegetaiei i naintarea deertului (deertificare). 1.3.2. Poluarea atmosferic Dezvoltarea civilizaiei industriale a dus la amplificarea fenomenului de poluare a atmosferei care a devenit un fenomen global. Asistm la extinderea rapid a polurii din zonele industrializate spre cele mai ndeprtate zone considerate pn nu demult nepoluate.
Ecotoxicologie
n parcul naional Smoky Montain (SUA), departe de zonele industrializate, cea groas ntlnit frecvent nu este un fenomen natural, ea conine numeroase particule n suspensie precum i sulfai provenii din arderea conbustibililor fosili n zonele urbane. Ceaa arctic din Alaska conine particule i gaze identice cu cele din atmosfer marilor orae americane. n timpul sezonului ploios sau n timpul primverii boreale, acest val de poluare deosebit de gros acoper zonele polare i subarctice pe suprafee imense. Atmosfera cuprinde mai multe zone care se succed n altitudine i n care presiunea descrete progresiv: troposfera, stratosfera, mezosfera, termosfera i exosfera. Primele dou straturi prezint un interes deosebit din punct de vedere al circulaiei i dispersiei poluanilor. Troposfera este ptura cea mai joas a atmosferei, se extinde pn la altitudinea de 815 km i cuprinde circa 80-90% din masa gazelor din atmosfer. Temperatura scade progresiv i rapid ajungnd la -600C la limita superioar a troposferei numit topopauz, situat la 9 km la poli, 15 km la ecuator. Stratosfera se ntinde de la nivelul tropopauzei pn la altitudinea de 35-50 km, aerul este rarefiat, iar temperatura atinge -800C, chiar la 18 km deasupra regiunilor ecuatoriale. n stratosfer ozonul are concentraii foarte ridicate formnd ptura sau ecranul de ozon. Concentraia maxim a ozonului n stratosfer este atins la 30 de km n regiunea ecuatorial i la 18 km n regiunea polilor. Cantitatea de vapori de ap din stratosfer este foarte mic, datorit temperaturilor sczute la aceast altitudine. n atmosfer compoziia chimic a aerului este relativ constant fiind format din azot (78,01%), oxigen (20,95%), argon (0,93%), bioxid de carbon (0,032%) i alte gaze (0,08%). Tabelul 4. Principalii poluani ai atmosferei i sursele lor de emisie (dup Ramade, 1992) Natura poluantului Sursa de emisie 1. GAZE Vulcanism, respiraie, combustibil solizi 1.1. Bioxid de carbon 1.2. Monoxid de carbon Vulcanism, motoare cu ardere intern 1.3. Hidrocarburi Plante, bacterii, motoare cu ardere intern 1.4. Compui organici Industria chimic, incineratoare de gunoaie, bacterii, combustibili solizi 1.5. Derivai de azot Bacterii, diferite combustii 1.6. Radionuclizi Centrale atomice, explozii nucleare 2. PARTICULE SOLIDE Vulcanism, eroziune colian, activitate 2.1. Metale grele i compui minerali industrial, motoare cu ardere intern 2.2. Compui organici naturali i de Incendiide pdure, industria chimic, sintez incineratoare de gunoaie, pesticide 2.3. Radionuclizi Explozii nucleare Compoziia atmosferei prezint schimbri care se datoresc pulberilor i gazelor provenite din erupiile vulcanice (poluare natural), ct i din activitile umane. n ultimele decenii s-a produs o cretere a concentraiei gazelor legate de utilizarea combustibililor fosili (crbuni, petrol, gaze naturale) sau de combustia biomasei vegetale. Efectele polurii atmosferei se manifest adeseori pe teritoriul altor ri, situate la mari deprtri de locul unde s-a produs poluarea. n felul acesta, se poate spune c poluarea atmosferei nu are frontiere, ci funcioneaz la scar planetar. Ca urmare a activitii industriale, a nclzirii imobilelor i a transporturilor auto rezult n orae o concentrare a poluanilor atmosferici. Aceti poluani, reprezentai mai ales prin oxizi de carbon, de sulf i de azot au un efect toxic asupra organismelor i degradeaz construciile prin coroziunea prilor metalice i prin maladia pietrei sub efectul apei de ploaie poluate. Poluarea atmosferei din orae se amplific n anumite situaii: absena vnturilor i inversiunile termice care favorizeaz stagnarea gazelor toxice i mpiedic circulaia liber a aerului.
10
Ecotoxicologie
Prin circulaia aerului, poluanii atmosferici sunt transportai la mare distan de locul polurii i pot reveni la sol ignornd frontierele administrative, sub forma ploilor acide coninnd n special acid sulfuric i acid azotic. n acest fel, anumite ri devin exportatoare a polurii acide, n timp ce altele devin importatoare, de exemplu Scandinavia import poluarea provenind din zonele industriale ale Germaniei, Angliei, Poloniei. Creterea folosirii combustibililor fosili n ultimele decenii este cauza apariiei ploilor acide, cu consecine ecologice grave: acidifierea apelor continentale, urmat de scderea i chiar dispariia organismelor acvatice, degenerescena pdurilor, degradarea monumentelor istorice etc. Deosebit de important este poluarea radioactiv artificial, care rezult din diferite activiti industriale, militare i medicale. Elementele radioactive difer prin cantitatea, energia i natura radiaiilor emise, ct i prin timpul de njumtire a nucleilor radioactivi. Unele elemente radioactive se acumuleaz n organisme i se concentreaz n lanurile trofice. Astfel, stroniu 90, analog calciului, este fixat n esutul osos, iar cesium 137, analog potasiului, este fixat n muchi, avnd grave consecine biologice i genetice prin producerea de mutaii. Catastrofa nuclear de la Cernobl (Ucraina) din 26 aprilie 1986 a dus la eliminarea n atmosfer a unui nor radioactiv coninnd iod i cesium radioactiv, care ndreptndu-se spre vest nord vest a fcut de cteva ori nconjurul emisferei nordice. Au fost contaminate radioactiv atmosfera, solul i ecosistemele naturale. O problem ecologic planetar, aprut tot prin activiti antropice se refer la creterea temperaturii medii globale prin creterea concentraiei gazelor de ser. Acestea sunt reprezentate de Co2, metan, oxid de azot, precum i vapori de ap. Aceste gaze au o aciune de absorbie a radiaiilor infraroii calorice, pe care le reflect spre suprafaa pmntului, amplificnd efectul de ser prezent n condiii naturale. Astfel, dac la nceputul secolului al XIX concentraia CO2 n atmosfer era estimat la 270 p.p.m., n anul 1990 concentraia acestui gaz a fost de 354 p.p.m. Acest fenomen reprezint o perturbare global a ciclului carbonului, indus de consumul crescut de combustibili fosili, petrol i gaze naturale n activitile industriale. Se apreciaz c o dublare a coninutului n CO2 duce la creterea cu 2,80C pn la mijlocul secolului XIX, cu perturbri n regimul de precipitaii, creterea nivelului mrii cu cca. 1,20 m prin topirea parial a calotelor glaciare, cu distrugeri n ecosistemele naturale i umane i consecine socio-economice grave. De asemenea s-a constatat o cretere impresionant a metanului care absoarbe de 20-30 ori mai mult cldur dect CO2. Acest gaz rezult i din intensificarea culturilor de orez care reprezint culturi inundate i ca produs al fermentaiei ruminale la animalele rumegtoare. Protoxidul de azot rezultat prin utilizarea fertilizanilor minerali n agricultur, rmne activ n atmosfer timp de 180 de ani. Pe lng aceti compui naturali, din activitile exclusiv umane se elimin compui de sintez care amplific efectul de ser. Astfel, freonul sau clorofluorocarbonul (CFC) este un gaz utilizat la refrigeratoare, n industria materiilor plastice i la spray-urile cu aerosoli cosmetici. Acest gaz are o durat de existen de cca. 400 de ani i absoarbe de 2000 de ori mai mult cldur dect CO2. CFC prin disociere elimin atomi de clor, care se combin cu ozonul stratosferic pe care l disociaz. Ozonul formeaz un strat de cca. 3 mm grosime, situat la 25 Km altitudine i are capacitatea de a reine o parte din radiaiile UV solare, nocive pentru biosfer. Ozonul este un component natural al atmosferei, aflat n concentraii cuprinse ntre 15 ppb deasupra zonelor de deert i 200 3000 ppb deasupra regiunilor muntoase. Concetraia lui crete odat cu altitudinea, atingnd maximum n stratosfer la 18 km n regiunea polilor i 30 km n regiunea ecuatorial. n atmosfera marilor orae poluate cu smog fotochimic s-a pus n eviden creterea concentraiei de ozon n toposfer pn la 1 ppm, cu efecte negative asupra organismelor vegetale i animale. n ultimii 50 de ani se constat o scdere cu circa 30% a cantitii de ozon din stratosfer (Rudler, 1986) iar n zona Antarcticii, n perioada primverii australe, chiar o reducere cu 50% (Stolarski, 1988).
11
Ecotoxicologie
Cauzele reducerii stratului de ozon din atmosfer par a fi ridicarea oxizilor de azot provenii din combustie, industrie i agricultur i a freonilor la altitudini de 25-50 km, urmat de reducerea ozonului la oxigen molecular prin diferite reacii. NO + O2 NO2+O2
rad. UV
CFClx -----> FClx-1 + Cl-1 Cl- + O3 ClO + O2 ClO + O-2 O2 + ClLanul se repet i fiecare ion Cl- face s dispar din atmosfer circa 100.000 molecule de O3. nclzirea atmosferei i deteriorarea stratului de ozon afecteaz ecosistemele naturale i umanitatea n ansamblul ei. Fiind probleme ecologice la scar planetar, rezolvarea acestora nu poate fi rezolvat dect la nivel mondial. 1.3.3. Poluarea apelor Apele dulci de suprafa (lacuri i ape curgtoare) i subterane freatice cuprind un volum ce reprezint 0,01% din rezerva de ap a lumii. Sunt folosite n scopuri domestice, industriale i agricole. Poluarea apelor dulci se produce cnd este depit capacitatea de autopurificare sau autoepurare n condiii naturale. Ca i aerul, calitatea resurselor de ap este o problem global. Omul prin activitile sale, intervine ca factor ecologic, accelernd i amplificnd fenomenul de poluare natural. Deversarea n mediul acvatic a reziduurilor menajere umane, ct i cele rezultate din activitile industriale, agricole modific parametrii privind calitatea apei. Tipurile de poluare care amplific gradul de poluare a apelor ca urmare a activitilor umane sunt grupate n: - poluare cu pesticide; - poluare cu fertilizani (azotai, fosfai); - poluare cu detergeni (ageni tensioactivi); - poluare cu metale i metaloide toxice (mercur, plumb, aluminiu, arsenic etc); - poluare microbiologic (cu bacterii, virusuri enterice, ciuperci etc); - poluare cu hidrocarburi (petrol brut care produce mareea neagr i derivai din industria petrolier); - poluare termic, prin eliminarea apelor calde de la centralele electrice; - poluare radioactiv cu izotopi rezultai de la instalaii nucleare. Poluarea apelor produce schimbri profunde n repartiia speciilor, o nmulire a plantelor acvatice, n special algelor microscopice (fenomenul de nflorire a apelor), urmat de dispariia prin asfixiere a vieii vegetale i animale. n mediile acvatice nchise (lacuri, heletee) are loc oxigenarea lent, iar mbogirea apei prin aport de substane organice determin fenomenul de eutrofizare, caracterizate prin proliferarea plantelor acvatice. Acest fenomen natural este accelerat considerabil de om, prin deversarea n mediul acvatic a substanelor acvatice i a reziduurilor bogate n azotai i fosfai. Aceast eutrofizare accelerat prin activitile umane este cunoscut sub denumirea de distrofizare. n aceste condiii se nmulesc excesiv algele microscopice i filamentoase la suprafa; descompunerea aerob a substanelor organice duce la consumarea oxigenului dizolvat la fundul apei. Lipsa oxigenului i apariia fermentaiilor anaerobe duc la degajarea de amoniac (NH3) i hidrogen sulfurat (H2S), iar organismele vii dispar progresiv. 1.3.4. Efectul substanelor nocive de origine antropic asupra organismului viu n mediul natural sunt prezente substane chimice, ntr-o concentraie diferit, compui naturali sau rezultai n urma activitilor antropice. Substanele chimice produse ca urmare a unor procese naturale, s-au pstrat n limite normale, dar apariia de noi compui (xenobiote),
12
Ecotoxicologie
precum i a unei distribuii de compui peste limit, supun mediul natural la presiuni actuale i poteniale. n prezent s-au identificat 10.000.000 de compui chimici naturali i artificiali, din care 6.000.000 au fost sintetizate, cele mai multe n secolul al XX-lea. Anual se sintetizeaz aproximativ 1.000 de noi compui chimici, dintre care 200 300 primesc ntrebuinri practice. n prezent se comercializeaz pe piaa mondial aproximativ 100.000 substane chimice, iar producia mondial de chimicale este de aproximativ 400 milioane tone (R, Lngren, 1992). Aceste substane apar n mediul nconjurtor fie prin: - aplicare direct: utilizarea pesticidelor n agricultur; - prin evacuare direct: courile de evacuare industrial, termocentralele, metalurgia, consumul casnic, emanaiile depozitelor de deeuri, incineratoarele, etc. Transportul natural al substanelor chimice determin o dispersie n ecosisteme, astfel substanele nocive se acumuleaz i n alte compartimente ale mediului dect n cele n care s-a produs eliberarea iniial. Mare parte din substanele chimice evacuate sunt transportate prin procese de degradare biotic i abiotic n compui chimici netoxici, dar unele pot suferi transformri, producnd substane cu un potenial toxic mai ridicat dect n situaia iniial (exemplu: metilmercurul rezultat din metilarea biologic a mercurului); altele prin bioacumulare, n lanurile trofice, realizeaz o mare concentraie toxic pentru ultima verig (prdtorii de vrf) sau pot conduce la expuneri pe termen lung ale organismelor. Efectele substanelor nocive asupra mediului nu sunt cunoscute n totalitate, se tie foarte puin despre cile de trasnport n mediu i efectele ecotoxicologice. Pn n 1960 evacuarea riscurilor substanelor nocive aborda doar efectele asupra oamenilor, cele asupra mediului fiind tratate sumar, ignorndu-se capacitatea sa limitat de asimilare. Foarte puin se tia i despre bioacumularea unor substane chimice n lanul trofic i consecinele acestora asupra funcionrii ecosistemelor. Prezena substanelor chimice i impactul lor asupra mediului determin: schimbri climatice, diminuarea stratului de ozon, diminuarea biodiversitii, acidifierea i eutrofizarea cursurilor de ap. Dispersia substanelor nocive n mediu Tendina substanelor nocive de a migra de la locul de producere i penetrare n mediul nconjurtor asupra tuturor compartimentelor acestuia poart numele de dispersie. Aceasta se produce prin transport n atmosfer, n cadrul circuitului hidrologic, transport biologic, activiti umane de transport. Dispersia depinde de proprietile chimice ale substanei, precum: volatilitatea, punctul de nghe, de topire, solubilitate n ap, capacitate de absorbie. Persistena Rezistena substanelor pentru un anumit interval temporal, n starea iniial ptrunderii n mediul natural, fr a fi modificat de procesele fizice, chimice, biologice, poart denumirea de persisten. Exist dou tipuri de persisten: urmrit atunci cand substana chimic atinge o persisten optim, ce i permite pstrarea calitii atta timp ct este ntrebuinat, apoi fiind degradat n compui netoxici (exemplu: detergenii biodegradabili dup folosire sunt deversai n apele naturale i sunt degradai). Se urmrete i realizarea unei persistene ndelungate. nedorit persistena proprietilor substanelor chimice i manifestarea acestora asupra elementelor de mediu pentru un interval mai lung de timp (exemplu: DDT). Timpul de njumtire biologic, reprezint timpul necesar degradrii unei jumti din cantitatea de substan ce a penetrat mediul nconjurtor, n urma unor procese fizice, chimice i
13
Ecotoxicologie
biologice. Substanele persistente se njumtesc n ani, iar cele nepersistente n sptmni, zile i chiar ore. Bioacumularea Creterea concentraiei unui toxic n organismul viu, ajungnd la un nivel superior dect concentraia substanei toxice n mediul nconjurtor poart numele de bioacumulare. Bioacumularea presupune ptrunderea toxinelor prin aerul respirat, hran i penetrare tegumentar n organism i apoi spre organele int, stocate temporar, metabolizate, o parte din ele neutralizate i eliminate n mod diferit de la specie la specie. Compuii toxici acumulai n organism, prezint o rat de ptrundere i de stocare mai mare dect rata de metabolizare i excreie. Bioconcentrarea reprezint un proces specific bioacumulrii prin care concentraia toxicului din organism devine mai mare dect cea din mediul nconjurtor. Acest termen se refer la substanele ecosistemului acvatic i reprezint ptrunderea toxicului prin branhii i tegument. Un alt aspect n procesul de bioacumulare l reprezint biomagnificarea animalele din vrful piramidei trofice concentreaz cantiti mai mari cu multe ordine de mrime fa de primele verigi ale lanurilor trofice sau productorii primari. n urma biomagnificrii, efecte se pot evidenia prin modificri de comportament, afectarea funciilor reproducerii sau pot fi letale. Etapele procesului de bioacumulare Omul i toate celelalte animale acumuleaz zilnic substane precum: vitamine (K, A, etc), aminoacizi, oligoelemente etc, ns pentru toxicologie de mare interes sunt acele substane ce pot cauza dereglri metabolice ale organismului. Intrrile reprezint nceputul procesului de bioacumulare, atunci cnd substana toxic a penetrat celulele organismului, prsind mediul nconjurtor, dup ce a fost eliberat aici de ctre o surs origine. Fenomenul este, nc, neelucidat. Substanele chimice se difuzeaz pasiv din zonele ce au o concentraie mai ridicat spre cele ce au o concentraie sczut. Fora sau presiunea de difuzie este numit potenial chimic (R, Mihilescu, 2001), acesta fiind sub influena unor factori (exemplu: unele chimicale nu se amestec cu apa fiind hidrofobe; altele tind s migreze din mediul extracelular n celulele esuturilor). Stocarea factorii ce introduc substanele n interiorul organismului, ngreuneaz rentoarcerea lor n mediul exterior. O parte din ele sunt dirijate spre anumite inte, stocate temporar i dizolvate n grsime sau legarea de proteine. n contextul unui ritm de intrare lent sau dac substana nu este reinut n celule, organismul o poate elimina. Compuii cu solubilitate mare n ap prezint un potenial sczut de bioacumulare, fiind mai greu absorbii de organism. Dac totui ptrund n organism sunt ndeprtai, excepia o reprezint celulele ce posed un mecanism specific de reinere a lor (metalele precum mercurul, cadmiul, cobaltul i alte substane solubile n mediul apos). Substanele lipofile ptrund n celulele organismului prin membranele celulare mai uor dect cele hidrosolubile. Dup ptrunderea n organism, ele trec prin sistemele de membranare ajungnd n esutul gras unde se acumuleaz. Stocarea toxicelor liposolubile n depozitele de grsime reprezint o detoxifiere temporar, protejnd, astfel, organele mai sensibile la toxicitate. Prin mobilizarea rezervelor de grsime (slbire), substanele stocate sunt reintroduse n circuitul metabolic i ncep s produc efecte toxice. Eliminarea se face prin metabolizare i excreie. Bioacumularea stare a echilibrului dinamic n timpul unei expuneri constante la substanele toxice se poate stabili un echilibru dinamic ntre cantitile de toxine ce au intrat i cele care prsesc organismul. Dac va crete concentraia din mediu va crete i concentraia din organism, ajungndu-se la un nou echilibru. O expunere pe durate mari la concentraii ridicate de toxine poate depi capacitatea organismului de aprare. Numai printr-o izolare de mediul toxic, exist posibilitatea eliminrii totale a toxinelor acumulate.
14
Ecotoxicologie
Factorii care afecteaz bioacumularea: rata de eliminare crescut reduce bioacumularea, respectiv una sczut, ce favorizeaz acumularea; durata de expunere influeneaz cantitile de substane ce ptrund n organism i rata de acumulare; caracteristicile speciilor indivizii longevivi i grai, speciile cu metabolism sczut vor acumula o cantitate mai mare de toxine fa de organismele de talie mic i via scurt (pstrvul de lac salmo trutta acumuleaz mai mult dect porcuorul Cotus gabio). Putem concluziona: ntre expunerea organismului i procesele de intrare, metabolizare, stocare, eliminare, exist un echilibru. O bioacumulare mare depinde de concentraia toxicului n mediu, de cantitatea ptruns n organism i de timpul de stocare, degradare i eliminare a toxicului. Proprietile toxicului (solubilitatea) afecteaz intrarea i stocarea n organism. De o mare importan este i capacitatea organismului de a metaboliza i excreta toxicul. Evaluarea riscului toxicologic Evaluarea severitii ameninri fiecrui chimical i a condiiilor de utilizare se numete evaluarea riscului, aceasta se poate realiza pe baza: evalurii relaiei doz-rspuns; evaluarea expunerii (efecte negative asociate cu un nivel particular de expunere) Impactul substanelor chimice nocive Substanele chimice care ptrund n esuturile corpului uman, pot cauza rniri, pierdute ale funcionalitii, modificri ale structurilor, pot afecta sistemul reproductor, nervos i imunitar, pot genera efecte mutagene, chiar efecte letale. Efectele pot afecta un individ sau pot afecta populaii ntregi, chiar cu efecte asupra generaiilor viitoare. Aceste substane nu afecteaz doar asupra oamenilor ci i asupra florei, faunei, afectnd echilibrul mediului. Ele pot avea efecte letale pentru unele specii, pot reduce capacitatea de supravieuire a altor specii sau se pot acumula n lanurile trofice. Unele substane pot cauza efecte globale: freonii, bioxidul de carbon i metanul, ce creaz efectul de ser. 1.3.5. Dispariia speciilor plante i animale Studierea evoluiei i diversitii speciilor (biodiversitatea) la scar geologic a artat c au existat dispariii masive de-a lungul timpului (ex. trilobiii, amoniii, dinozaurieni etc.). Cu toate acestea, prin aciunile umane s-a produs n ultimele decenii creterea ritmului extinciei sau dispariiei speciilor. Pe aceast linie menionm aciunile directe ale omului, cum ar fi prelevrile excesive prin vntoare i pescuit, modificarea mediului prin defriri, poluarea ecosistemelor, distrugerea habitatelor naturale prin urbanizare, ci de comunicaie, turism. Introducerea necontrolat a speciilor de ctre om n anumite medii naturale a dus indirect la regresia sau dispariia unei pri din flora sau fauna indigen.
15
Ecotoxicologie
Capitolul II CIRCUITUL SUBSTANELOR EXOGENE N ORGANISM

2.1. TRANSPORTUL PRIN MEMBRANELE BIOLOGICE Orice ptrundere din mediul exterior n interiorul organismului implic un schimb transmembranar. Prin urmare substanele exogene (toxici, medicamente, aditivi alimentari, poluani) trebuie s traverseze una sau mai multe membrane biologice nainte de a ajunge la centrii activi. Astfel, toxicii ptruni pe cale oral strbat mucoasele tractului gastro-intestinal; toxicii gazoi i volatili trec din aerul inhalant prin mucoasa cilor respiratorii; unii toxici aplicai pe tegumente sau mucoase traverseaz straturile lor superficiale. Traversarea membranelor este condiionat de: natura chimic i organizarea moleculelor constitutive ale membranei; proprietile fizico-chimice ale toxicului, structura fizico-chimic ale moleculelor mediului de o parte i de cealalt a membranei. 2.1.1. Definiia i clasificarea membranelor celulare Membranele celulare reprezint structuri complexe ce delimiteaz i compartimenteaz coninutul celular. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatic i membranele organitelor) prezint drept caracteristic comun asamblarea prin legturi necovalente a biomoleculelor componente (lipide i proteine) ntr-o structur dinamic i fluid. Elementul structural fundamental al membranelor celulare, dublul strat lipidic, definete modul de organizare al lipidelor i se comport ca o barier impenetrabil pentru majoritatea membranelor hidrofile (aqua-solubile). Proteinele membranare, asociate dublului strat lipidic, asigur funcionalitatea membranelor, ele fiind implicate n multiple procese: - transportul molecular i ionic transmembranar; - realizarea conexiunilor intercelulare i a ancorrii celulelor n matricea extracelular; - desfurarea reaciilor enzimatice asociate structurilor membranare; - controlul fluxului de informaie dintre celul i mediul nconjurtor prin recunoaterea, legarea i transmiterea moleculelor-semnal; - imunitatea celular. Grefarea seturilor distincte de proteine n dublul strat lipidic, ct i stabilirea unui anumit raport ntre principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare n trei tipuri: a) Membrana citoplasmatic (membrana plasmatic, plasmalena) este o structur bidimensional continu (grosimea 6-10nm), cu proprieti caracteristice de permeabilitate selectiv, ce confer individualitate celulei, separnd-o de mediul nconjurtor. b) Membranele interne ale celulelor eucariote (grosimea 6nm) compartimenteaz spaiul intracelular, delimiteaz organitele celulare (nucleu, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), crend astfel spaii adecvate reaciilor enzimatice celulare. c) Membranele speciale prezint particulariti structurale, n aceast categorie ncadrndu-se:
16
Ecotoxicologie -
teaca de mielin, o structur multimembranar derivat din membrana plasmatic a celulelor Schwann ce nconjoar i izoleaz axonul celulelor nervoase; discurile suprapuse localizate n regiunea extern a celulelor fotoreceptoare din retin.
Fig. 1. Structura inframicroscopic a celulei 1-membrana celular; 2-endoplasma (hialoplasma); 3-ergastoplasm; a-reea endoplasmatic (membrane cu dublu contur); b-granulaii fine (microzomi); 4-filamente intracelulare (descoperite n celule epiteliale, fibroblati, n celule nervoase); 5-vacuol; 6-granule lipidice; 7-centrul celular; 8-centrosfer; 9-nucleu; c-membrana nucleului; d-pori n membrana nucleului; 10-nucleol; 11-aparatul Golgi; 12-mitocondrii 2.1.2. Organizarea membranelor celulare n prezent se bucur de acceptare evasiunanim modelul n mozaic fluid lipido-proteic elaborat n 1971-1972 de ctre Singer i Nicolson care satisface condiiile de stabilitate termodinamic ale sistemelor membranare. Elementele care l-au impus constau pe de o parte n confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor i pe de alt parte, n definirea modului de asamblare a proteinelor n dublul strat lipidic. Autorii concep membrana celular ca pe un fluid structurat alctuit dintr-un bistrat lipidic aflat ntr-o stare de cristal lichid i care este penetrat local sau parial de proteine globulare cu caracter insular (fig. 2). Lipidele i proteinele membranare, relativ libere prezint mobilitate n planul membranei executnd micri de difuziune i rotaie n jurul propriilor axe. La componentele de baz ale
17
Ecotoxicologie
membranelor lipidele i proteinele se adaug constant carbohidraii, apa i o serie de ioni. Pe partea citoplasmatic membrana este susinut (n numeroase cazuri) de o reea de proteine fibrilare ce constituie un schelet.
Fig. 2. Structura unei membrane biologice (Stryr, 1991) a i b = proteine periferice de membran; c = protein de membran (tip lectinic): traverseaz bistratul lipidic; d = protein de membran (tip Ig): traverseaz bistratul lipidic Modelul mozaicului fluid ofer cadrul conceptual adecvat pentru explicarea att a funciilor de transport, ct i a plasticitii conformaionale a celulelor, a proceselor imunologice i a efectelor produse asupra membranelor de diferii ageni chimici (hormoni, mediatori chimici, medicamente, toxine, etc). Membranele biologice au structuri fluide dinamice n continu modificare; n fiecare moment, proteinele i lipidele din structura membranelor sunt nlocuite cu altele noi. Ribozomii i reticulul endoplasmic care sintetizeaz aceste proteine de membran nzestreaz aceste proteine cu capacitatea de a se ndrepta spre anumite inte ctre anumite sedii celulare (transport vectorial). n celula vie, sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membran) n cursul procesului de multiplicare celular (mitoza sau meioza), cnd celula mam transmite celor dou celule fiice, o dat cu zestrea celular i o anumit zestre de membran. Aceast motenire a pattern-urilor de membran de ctre celulele fiice de la celula mam reprezint un aspect al continuitii n timp i spaiu a sistemului de membrane. Aceste aspecte de continuitate asigur de fapt continuitatea de funcionare a celulei i, implicit, desfurarea normal a metabolismului celular. S-a dovedit c toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au via relativ scurt, fiind nlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puin rapid (slow turnover). Din acest aspect reiese c orice tip de membran biologic are o continuitate de organizare, dar nu i continuitate de substan, deoarece din stratul proteic sunt nlocuite n permanen un numr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunztoare, dei funcia respectivei proteine rmne n permanen nemodificat. 2.1.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare Lipidele membranare formeaz un dublu strat cu grosimea de 4 5 nm: un strat extern, orientat spre faa extern a membranei i un strat intern, orientat spre faa intern citoplasmatic a membranei. Lipidele sunt molecule insolubile n ap, dar nalt solubile n solveni organici (cloroform). ntr-un m2 de dublu strat lipidic se gsesc 5 x 106 molecule lipidice. Dei compoziia lipidic a diferitelor membrane variaz mult, fosfolipidele, colesterolul i glicolipidele
18
Ecotoxicologie
reprezint clasele de lipide cel mai frecvent ntlnite n structura membranelor biologice (tabelul 5). Tabelul 5. Procent din greutatea moleculara total a lipidelor membranare Membrana Membrana Membrana Membrana plasmatic a Teaca de extern i Lipide plasmatic a reticulului celulei mielin intern a eritrocitului endoplasmic hepatice mitocondriei Colesterol 17 23 22 3 6 Fosfolipide 54 60 42 76 67 Glicolipide 7 3 28 urme urme Alte lipide 22 13 8 21 27 Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo- i glicolipide, ele reprezentnd bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile, dei straturile sunt aproape fluide. Aceste lipide de membran sunt amfipatice , conin un cap hidrofilic care are o varietate de structur relativ mic i poart sarcini electrice i o coad hidrofob, format din 12 24 atomi de carbon, lipsit de sarcini electrice i cu o mare varietate de structur care se datoreaz unor acizi grai deosebii.Acizii grai pot fi saturai sau nesaturai,ei difer cantitativ i calitativ n raport cu specia,vrsta,condiiile de via etc.Cu ct gradul de nesaturare al acizilor este mai mare, cu att fluiditatea structurilor membranare este mai mare. Datorit acestui caracter amfipatic, lipidele, n mediu lichid, pot forma: - micelii (fig. 3a) - strat dublu linear (fig. 3b) - strat dublu circular (lipozomi, fig. 3c).
Fig. 3. Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide n mediu lichid datorit proprietilor lor amfipatice n acest strat dublu, capul hidrofilic este orientat spre exterior, iar coada hidrofob este orientat spre interior. Moleculele de lipide se deplaseaz foarte rapid rotindu-se n jurul propriului lor ax i difuznd lateral, n acest fel asigurnd fluiditate de membran. Fluiditatea este asigurat de prezena acizilor grai i a colesterolului. La eucariote, proporia fosfolipide / colesterol n membrana plasmatic este de 1/1, colesterolul aflndu-se la extremitatea hidrofil, prevenind scderea fluiditii membranelor. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic n mediu apos este un proces de autoasamblare, rolul major avndu-l fora de interaciune hidrofob (interaciune necovalent). Straturile bilipidice sunt nalt impermeabile pentru ioni i pentru cele mai multe molecule polare (cu excepia apei, care traverseaz foarte rapid aceast membran). Pentru traversarea stratului bilipidic, bstratificat, o molecul necesit o cantitate foarte mare de energie.
19
Ecotoxicologie
2.1.2.2. Componenta proteic a membranelor celulare n stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. Proteinele reprezint 50% din volumul de membran. n timp de lipidele au rol de barier de permeabilitate i de delimitare a componentelor biologice, proteinele mediaz aproape toate funciile, de exemplu, proteinele din membrana plasmatic au rol de pompe n transportul transmembranar, receptori, enzime, antigene de membran, iar proteinele din membrana intern a mitocondriilor i cloroplastelor au rol de transductori de energie. Membranele care ndeplinesc funcii diferite conin n structura lor i proteine diferite. Proteinele pot fi inserate n dublul strat lipidic n diferite moduri; acestea ptrund adnc sau chiar traverseaz stratul de lipide al membranei, numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig), altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele dou ale membranei lipidice (tip lecitinic) iar altele pot fi ataate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polar hidrofil a lipidele i se numesc periferice sau extrinseci. Proteinele sunt amfipatice, coninnd o regiune hidrofob care reacioneaz cu regiunea hidrofil lipidic (din interiorul stratului lipidic) i o regiune hidrofil situat la suprafaa intern i respectiv extern a membranei. n acest fel cele dou suprafee de membran difer ntre ele prin cantitatea de lipide i proteine, realiznd o asimetrie funcional. n regiunea transmembranar, proteinele de membran conin predominant regiuni hidrofobe cu structur secundar tip -helix i structuri teriare i cuaternare compacte. Proteinele de membran pot forma pete difuze, se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate n micarea lor lateral, rmnnd fixe n plan orizontal (formnd agregate care se ancoreaz de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla splare cu soluii saline sau prin modificri de pH (de exemplu, spectrina, localizat pe suprafaa citoplasmei eritrocitelor, sau actina, cu rol n contracia muscular). Proteinele integrale (intrinseci) interacioneaz strns cu hidrocarbonaii din lipidele de membran i nu pot fi disociate dect n prezena detergenilor i a solvenilor organici. 2.1.2.3. Mobilitatea lipidelor i proteinelor de membran Lipidele i proteinele de membran difuzeaz rapid n planul membranar, avnd o micare lateral constant, ceea ce face ca o membran biologic s nu fie o structur rigid. Proteinele prezint numai difuziune lateral; lipsa difuziei transverse face posibil pstrarea timp ndelungat a asimetriei de membran. O molecul lipidic poate cltori de la un capt la altul al celulei bacteriene n timp de o secund. Unele proteine de membran difuzeaz n timp de un minut la distan de civa microni; alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca i lipidele, altele sunt virtual imobile (fibronectina). Lipidele prezint difuziune lateral micare paralel cu planul bistratului (difuziune n planul membranei) sau transvers (tip fleep - flop), adic rotaie spontan a moleculei lipidice de pe o fa a membranei pe cealalt. Este un proces foarte lent. Se produce o rotaie la cteva ore (de exemplu, fosfolipide, urmrite prin tehnica de rezonan magnetic). Pe baza datelor prezentate se poate considera c att fluiditatea dublului strat lipidic, ct i liber deplasare a lipidelor i proteinelor n structurile membranare, constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare. 2.1.2.4. Carbohidraii componeni minori ai membranelor celulare Carbohidraii se ntlnesc pe suprafaa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote i reprezint 2 10% din greutatea componentelor membranare. Carbohidraii, sub forma oligo- i polizaharidelor se leag covalent de proteine i lipide formnd glicoproteinele
20
Ecotoxicologie
i respectiv, glicolipidele. Dac majoritate proteinelor aflate pe suprafaa celular sunt glicoproteine, numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conine carbohidrai. Carbohidraii se ntlnesc i n structura proteoglicanilor, molecule membranare integrale alctuite din lanuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Proteina din structura proteoglicanilor traverseaz dublul strat lipidic, n timp ce lanurile polizaharidice rmn n afara celulei, constituind parte component a matrixului extracelular. Zaharurile sunt foare hidrolitice, ele prefer s se orienteze spre suprafaa apoas a membranei (i nu spre miezul hidrofob), deoarece orientarea invers ar cere un consum foarte mare de energie; deci absena respectivei cantiti de energie reprezint o barier puternic n calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Hidrocarbonaii de pe suprafaa celular au o mare densitate de structur i au rol n recunoaterea intercelular (fa de celulele sistemului imunitar). Structurile de glicoproteine au funcie de receptori ele primesc informaia din mediul extern i o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacii biochimice, care au drept consecin modificri ale activitii celulare (activitatea secretorie, de multiplicare, etc). 2.1.2.5. Glicocalixul Suprafaa celular este alctuit din trei elemente: cortexul celular (zona periferic citoplasmei), membrana plasmatic i glicocalixul. Glicolixul reprezint zona periferic de la suprafaa celulei animale. n structura sa intr att lanurile oligo- i poliglucidice ale glicolipidelor i glioproteinelor membranare, ct i glicoproteine sintetizate de celul i apoi absorbite pe suprafaa celular (Fig. 4). Faptul c ultimele dou componente ale glicocalixului sunt n acelai timp i elemente ale matricei extracelulare face dificil stabilirea unei linii clare de demarcai ntre suprafaa celular i matrice Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Concentraia mare de oligozaharide complexe la suprafaa celular poate sprijini ipoteza implicrii acestei structuri n procese de recunoatere celul-celul sau celul-matrice. De asemenea, majoritatea lanurilor oligozaharidice conin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic, molecul cu sarcin electric negativ. Glicocalixul realizeaz, deci distribuia sarcinilor electrice pe suprafaa celulei. n plus, datorit ncrcrii electrice negative, glicocalixul poate funciona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizai n celul n funcie de necesitile exprimate la un moment dat.
Fig. 4. Prezentarea schematic a glicocalixului 2.1.2.6. Apa Apa deine un loc important n structura membranar alturi de celelalte componente chimice.Se gsete n proporie de 30-40 % asociat intim fiestructurilor de la suprafa,fie sub form foarte ordonat,structural asemntoare gheii (apa legat chimic ).ntr-o astfel de
21
Ecotoxicologie
stare,apa joac un rol precumpnitor n procesele de organizare molecular a membranei,intervenind n stabilitatea structurilor proteice i fosfolipidice bistratificate,ca un liant. Permeabilitatea selectiv poate fi privit ca fiind n raport cu apa structuralizat din membran.Modificrile de permeabilitate determinate de procesul de excitaie poate fi consecina topirii structurii hidrice n anumite regiuni. 2.1.2.7. Asimetria distribuiei componentelor membranare Imaginea membranei celulare ca o soluie lipidic n care plutesc moleculele proteice pare, astzi, simplist. n multe celule proteinele i lipidele sunt meninute n regiuni bine delimitate ale membranelor. Distribuia asimetric a moleculelor membranare joac un rol esenial n realizarea funciilor celulare. Distribuia asimetric a compartimentului lipidic pe cele dou fee ale dublului strat lipidic a fost pus n eviden pentru prima dat n membranele eritrocitelor. Astfel, n timp ce n monostratul extern al membranei predomin fosfatidilcolina i sfingomielina, stratul intern conine fosfotidiletanolamina i fosfatidilserina drept componente lipidice majore. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limiteaz doar la natura gruprilor polare, ea se refer i la gradul de nesaturare a lanurilor hidrocarbonate, ceea ce, n planul membranei, determin o fluiditate diferit a celor dou straturi lipidice. n acest context este de remarcat faptul c exist i o distribuie asimetric a sarcinilor electrice. Singurul fosfolipid cu sarcin electric negativ, fosfatidilserina, este localizat n monostratul intern al membranei eritrocitare. Implicaiile asimetriei lipidelor la nivel funcional nu sunt nc pe deplin cunoscute. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare s fie dependent de microclimatul creat prin prezena fosfolipidelor specifice. De asemenea, activitatea enzimatic a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiionat de sarcina electric a fosfolipidelor. Localizarea glicolipidelor n monostratul extern al membranelor plasmatice, ct i caracterul lor specio- i esut specific sugereaz implicarea acestor molecule ca receptori n procesele de comunicare intercelular. n acelai timp, toate proteinele membranare integrale au o orientare strict n raport cu faa citoplasmatic i cea extern a membranei celulare. n plus, proteinele transmembranare sunt, n majoritate, molecule glicolizate. n membranele plasmatice lanurile oligozaharidice marcheaz faa exoplasmatic, n timp ce, n membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic, aparat Golgi) ele se gsesc pe faa citoplasmatic. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelat cu funciile celor dou fee ale membranelor celulare. Moleculele proteice transmembranare ce conin cistein cunosc i ele o orientare strict. Mai mult, gruprile sulfhidril ale cisteinei formeaz puni disulfurice inter i/sau intra-catenare, doar pe fa extern a membranei. n anumite celule, distribuia asimetric a lipidelor i proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice n membranele plasmatice. Astfel, membrana celulelor epiteliale este mprit n domenii distincte: apical i latero-bazal, ambele avnd un coninut proteic i lipidic diferit. Ca urmare, celulele epiteliale sunt capabile s mpiedice difuzia moleculelor membranare. Acest lucru se realizeaz prin intermediul jonciunilor strnse ce funcioneaz ca o barier ntre cele dou domenii membranare. 2.1.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare Celula din punct de vedere termodinamic, este un sistem deschis, existena sa fiind condiionat de stabilirea unei permanente comunicri cu mediul nconjurtor. Abordnd aceast problem din perspectiva schimbului de substane pe care celula l realizeaz cu mediul extern, un rol major revine membranei plasmatice datorit caracteristicii sale fundamentale, permeabilitatea selectiv. Aceasta face posibil alimentarea celulei cu molecule eseniale (glucoz, aminoacizi, lipide) i eliminarea att a produilor fiziologic activi (enzime, hormoni), ct i a celor rezultai ca deeuri n urma metabolismului celular (CO2, sruri de amoniu,
22
Ecotoxicologie
uree). n paralel cu asigurarea continuitii acestor schimburi, permeabilitatea selectiv creeaz cadrul favorabil desfurrii unei activiti metabolice stabile, att prin meninerea n spaiul intracelular a unei concentraii relativ constante de substane organice, metabolii i electrolii, ct i prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaiilor osmotice celul-mediu. Permeabilitatea selectiv se modific dinamic aflndu-se sub influena modificrilor mediului extracelular i a metabolismului celulei. Aceast caracteristic a membranelor celulare prezint particulariti n raport cu diferenierea funcional a celulelor. Selectivitatea difereniat se manifest att la trecerea substanelor din exterior n celul, ct i n sens invers. Deci, la baza noiunii de permeabilitate selectiv st conceptul de membran ca barier a schimburilor celulare. Traficul de substane ce se desfoar att prin membrana plasmatic, ct i prin membranele interne ce delimiteaz organitele celulare antreneaz diferite mecanisme de transport. 2.1.3.1. Procesul calitativ al traversrii membranelor Se consider c au loc urmtoarele etape (fig. 5): - molecula trebuie s avanseze n zona apoas (mediu i zona periferic a membranei), ceea ce se realizeaz dup legile difuziei simple n mediu apos. Fiecare molecul formeaz legturi de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Agitaia termic a moleculelor asigur moleculei energia de activare necesar ruperii unor legturi de hidrogen, cu refacerea lor spontan i imediat. n momentul cnd molecula atinge stratul hidrofil al membranei, acesta, avnd coninut de ap apropiat de cel al mediului permite continuarea micrii libere a moleculei. Prin urmare, traversarea stratului exterior hidrofil se realizeaz fr consum de energie (fig. 5, poriunea a); - n etapa urmtoare, molecula trebuie s se desprind de stratul hidrofil i s treac n stratul lipofil, ceea ce necesit o energie de activare molecular (fig. 5, poriunea b). n raport cu caracteristicile moleculare, variaz i intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei n stratul hidrofob; - continuarea difuziei n startul hidrofob nu reclam energie de activare suplimentar pentru c trebuie s se desfac legturi de hidrogen (fig. 5, poriunea c); - n fine, molecula prsete stratul hidrofob (fig. 5, poriunea d), fenomen facilitat de formarea legturilor de hidrogen cu moleculele de ap din stratul membranar proteic hidrofil interior, de unde trece prin acelai fenomen, n citoplasm (fig. 5, poriunea e).
Fig. 5. Modificrile energetice care nsoesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membran biologic (dup Maziliak) Se descriu urmtoarele posibiliti de traversare a unei membrane:
23
Ecotoxicologie -
proces pasiv: transfer pasiv, care asigur trecerea moleculelor mici hidrosolubile, inclusiv apa, prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) i a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare n membran (difuzia simpl); proces biochimic: transport specializat, fie activ, fie facilitat; proces biologic: endocitoz, cnd particulele de substan sunt nglobate de membrana celular prin micri de invaginare i transfer astfel spre interior.
2.1.3.2. Transportul ionilor i moleculelor mici prin membranele celulare Maniera n care substanele trec prin membranele celulare este determinat pe de o parte de caracteristicile substanelor (greutate molecular, dimensiuni, form, grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de alt parte, de compoziia chimic a membranelor. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport l reprezint dimensiunile substanelor ce strbat membrana. Astfel, n timp ce ionii i moleculele mici traverseaz dublul strat lipidic prin difuziune sau implicnd proteinele membranare, transportul macromoleculelor i al particulelor necesit sechestrarea lor n vezicule delimitate de membrane. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolic sub form de ATP. Din acest punct de vedere se disting dou tipuri de transport: pasiv i activ. TRANSPORT PASIV Traversarea membranelor celulare de ctre molecule i ioni n sensul gradientului de concentraie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraie i gradientul electric) poart numele de transport pasiv. Procesul nu implic consum de energie (ATP), dimpotriv, el decurge cu pierdere de energie liber. Unele gaze (O2, CO2) i unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile s strbat dublul strat lipidic membranar prin difuziune simpl. Transportul moleculelor solubile n ap (glucoz, nucleotide, amonoacizi) i al unor ioni (H+, K+, Na+, Ca2+) nu poate fi realizat n aceeai manier, necesitnd participarea unor proteine membranare specifice. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitat. a1) Difuzia simpl Cel mai simplu tip de transport pasiv const n difuzia fizic a moleculelor determinat de gradientul lor de concentraie sau electrochimic. n difuzia simpl moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare n timpul trecerii lor prin membran. Viteza cu care se desfoar etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular n interiorul hidrofob al membranei este dependent de coeficientul de partiie (K) al moleculei. Acesta msoar afinitatea relativ a moleculei pentru mediul lipidic n raport cu apa, ilustrnd gradul de hidrofobicitate al moleculei. Astfel, cu ct valoarea sa este mai mare, cu att molecula are un mai pronunat caracter hidrofob, deci, este mai liposolubil i ptrunde mai repede n celul. Se constat existena unei relaii de direct proporionalitate ntre coeficientul de partiie al unei molecule i constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Datorit vscozitii dublului strat lipidic, viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioar vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. n cazul transportului prin difuzie simpl a moleculelor fr sarcini electrice, se respect legea lui Fick. Aceasta enun c viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporional cu diferena de concentraie, suprafaa (S) i coeficientul de permeabilitate (P). Deci viteza de difuziune a unei molecule prin membran coform legii lui Fick este:
(dn/dt)= PxS (C1aq C2aq)

unde: S reprezint suprafaa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei; C1aq, C2aq sunt concentraiile mediilor apoase separate de membrana celular. Difuzia simpl prin membranele celulare se realizeaz cu pierdere de energie liber. Calculele termodinamice demonstreaz c la deplasarea unui mol de substan fr sarcin
24
Ecotoxicologie
electric, de la o concentraie de 1M la o concentraie de 0,1M (la 250C) sistemul pierde o energie liber de 1,359 kcal/mol. n difuzia moleculelor ncrcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate, procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic a2) Difuzia facilitat n procesul de difuziune facilitat, transportul pasiv al moleculelor prin membran este mediat de proteine membranare numite permeaze. Spre deosebire de difuzia simpl, difuzia facilitat se caracterizeaz prin specificitate fa de molecula transportat. Permeaza leag reversibil i complementar la un situs activ o singur specie molecular sau molecule aparinnd unei singure familii. n urma legturii ce are loc pe o fa a membranei se formeaz un complex molecul-permeaz ce traverseaz dublul strat lipidic, disociindu-se pe cealalt fa a membranei cu eliberarea moleculei transportate. Unul din modelele care au ncercat s explice maniera n care se desfoar difuzia facilitat este modelul transportorilor crui (carrier model). n acest model se consider c transportorul exercit o micare de navetare sau rotaie n dublul strat lipidic, fiind astfel capabil s treac molecula transportat de pe o fa pe alta a membranei celulare. Deoarece difuzia facilitat este un tip de transport pasiv, iar rotirea unei molecule proteice n planul membranei este defavorizat din punct de vedere energetic, modelul carrier rmne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de ctre polipeptide antibiotice (de exemplu, transportul ionului de K+ de ctre valinomicin). Cea mai bine caracterizat permeaz D-gluco-permeaz (sau D-hexozo-permeaz) catalizeaz difuzia facilitat a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. 6). D-gluco-permeaz este o protein transmembranar alctuit de 12 -helixuri care au n majoritate un caracter hidrofob. Are o greutate molecular de 45.000 Da.
Fig. 6. Mecanismul transportului mediat de D-gluco-permeaz n parte, permebilitatea selectiv a membranelor plasmatice poate fi explicit prin existena proteinelor canal. Aceste proteine transmembranare, strbtute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili, formeaz porii membranari. Proteinele canal specializate n transportul selectiv al diferitelor specii ionice se numesc proteine canal de ioni. Transportul mediat de aceste proteine nu necesit consum de energie, ionii difuznd cu viteze diferite prin membran n sensul gradientelor de concentraie. Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu caracteristic ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poart (gated channels). De regul, deschiderea canalelor reprezint un rspuns celular la diferite semnale recepionate de membrana plasmatic. n funcie de factorii ce comand deschiderea porilor, se deosebesc trei tipuri de proteine canal: - cu poart comandat de stimuli mecanici;
25
Ecotoxicologie -
cu poart comandat de liganzi. n acest caz canalele se deschid n urma legrii la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmitor) sau un mediator intracelular (ion, nucleotid, protein de legare a GTP) (Fig. 7, 8); cu poart comandat de voltaj (dependente de valoarea potenialului de membran) (Fig. 9).
Fig. 7. Modificarea conformaional a receptorului acetilcolinic protein canal de Na+ cu poart comandat de ligand.
Fig. 8. Schema jonciunii neuromusculare i principalele proteine canal de ioni implicate de declanarea contraciei musculare sub aciunea impulsului nervos. A - starea de repaus B - starea activat
26
Ecotoxicologie
Fig. 9. Structura canalului de Na+ cu poart comandat de voltaj B. TRANSPORTUL ACTIV Deplasarea moleculelor i ionilor prin transport pasiv evolueaz spre egalarea concentraiilor de o parte i de alta a membranei i, implicit, dispariia potenialului membranar. Pentru a menine homeostazia mediului intracelular, celula i-a creat mecanisme de transport activ capabile s deplaseze moleculele i ionii n sens invers gradientelor lor de concentraie i electrochimic. Acest tip de transport este mediat de proteine specifice i prezint toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. Plusul de independen fa de compoziia mediului nconjurtor, pe care transportul activ l ofer celulei, implic consum de energie metabolic. Astfel, eritrocitele utilizeaz 50% din energia stocat n moleculele de ATP pentru a menine o concentraie ionic relativ constant a mediului intracelular. n funcie de modul n care este utilizat energia se deosebesc dou tipuri de transport activ. n transportul activ propriu-zis, molecula transportoare are funcie ATP-azic, fiind capabil s utilizeze direct energia rezultat n urma hidrolizei ATP n procesul de transport (pompele inonice). Al doilea tip de transport activ poart numele de cotransport. n cadrul acestui transport moleculele i ionii sunt deplasai mpotriva gradientelor lor de concentraie pe seama energiei eliberate n transportul pasiv al altor molecule i ioni. n unele cazuri de cotransport, energia moleculelor de ATP este utilizat indirect prin intermediul gradientelor ionice. b1) Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cupleaz direct transportul ionilor mpotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legturilor fosfodiesterice din molecula de ATP i formarea de ADP (adenozin difosfat) i fosfor anorganic (P): clasa ATP azelor P; clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze); clasa ATP-azelor F. Clasa ATP-azelor P conine trei reprezentani. Primul reprezentant al acestei clase i cel mai rspndit Na+ - K+ - ATP-aza (pompa de Na+ - K+) prezent n membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. Na+ - K+ - ATP-aza pompeaz Na+ n mediul extracelular i introduce K+ cu sarcin n celul. Mecanismul de aciune Na+ - K+ - ATP-aza, dei insuficient cunoscut, are la baz modificarea conformaional a enzimei. Astfel, este posibil formarea unor canale n proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ i K+ -prin membrana plasmatic. Energia ce asigur conversia conformaiei enzimei (E1 E2) ct i pomparea ionilor mpotriva gradientului lor de concentraie este furnizat de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. 10). Funcionarea Na+ - K+ - ATP-aza asigur meninerea unei concentraii intracelulare relativ ridicat a ionilor de K+ ce condiioneaz desfurarea normal a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteic, activitatea catalitic a unor enzime (piruvat-kinaza) i meninerea potenialului de membran a celulelor excitabile. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+ - ATP-aza (pompa de Ca2+). Este localizat n membranele plasmatice asigurnd meninerea unei concentraii intracelulare
27
Ecotoxicologie
sczute a ionilor de Ca2+. n celulele musculare enzima este prezent n membrana reticulului sarcoplasmic, fiind implicat n transportul ionilor de Ca2+ din citosol n acest organit celular. Traficul Ca2+ prin membrana reticului sarcoplasmic n celulele musculare mediat de Ca2+- ATPaza, este esenial n procesul de contracie relaxare muscular. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic n citosol determin contracia muscular, n timp ce nlturarea ionilor din citosol permite relaxarea muscular. O protein capabil s lege specific ionii de Ca2+ a fost identificat i n citosol. Proteina numit calmodulin, este alctuit dintr-un singur lan polipeptidic i are o funcie reglatoare modificnd viteza de pompare a ionilor de Ca2+ n raport cu concentraia citosolic a acestora. Ultimul constituient al ATP-azelor P transport ionii de H+, n unele cazuri mpreun cu K+.
Fig. 10. Schema funcionrii Na+ - K ATP-azei. A- proteina aflat n conformaie E1 leag Na+ la situsurile aflate pe faa citoplasmatic a subunitii ; B-legarea ATP este urmat de hidroliza acestuia i fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P); C-energia legturii macroenergice E1~P asigur modificarea conformaional a proteinei (E1-P) i transportul Na+ n spaiul extracelular; D-K+ se leag la situsurile de pe faa exoplasmatic ale subunitii ; E-defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaiei (E2); F-transportul K+ prin membrana plasmatic i eliberarea lui n citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaia iniial (E1) Clasa ATP-azelor V (H+ - ATP-aze) este reprezentat de proteine transportoare ce realizeaz deplasarea protonilor n sens invers gradientului lor de concentraie. H+ - ATP-aza este prezent n membranele plasmatice ale celulelor ce secret produi acizi (membrana apical a celulelor epiteliale ce mrginesc lumenul vezicii urinare) i n membranele lizozomale. Pompa de H+ dependent de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menine un pH sczut (4,5 - 5) n interiorul acestui organit celular. Clasa ATP-azelor F, ca i cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor. Ceea ce caracterizeaz ATP-azele din clasa F, localizate n membrana mitocondrial, este faptul c acioneaz n sensul cuplrii-deplasrii H+ de la o concentraie mai mare la una mic cu sinteza ATP din ADP i P. b2). Cotransportul activ al ionilor i al moleculelor prin membrana plasmatic nu utilizeaz n toate cazurile direct energia eliberat prin hidroliza ATP. Folosirea energiei gradientelor ionice n transportul transmembranelor activ constituie o cale indirect de utilizare
28
Ecotoxicologie
a energiei stocate n ATP. Deplasarea ionilor i moleculelor mpotriva gradientelor lor de concentraie cuplat obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni numii ioni cotransportai definete procesul de cotransport. n acest transport activ, ionii de Na+ au un rol important n transportul zaharurilor i aminoacizilor n celul. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport; 2) sinport; 3) antiport. Transportul uniport reprezint trecerea prin membran, la un moment dat, a unei singure specii moleculare sau ionice, fr a fi cuplat cu micarea altei specii moleculare. n acest caz, moleculele neutre nu se acumuleaz mpotriva gradienilor de concentraie, ci transportul lor prin membran este facilitat de gradientul de concentraie sczut i catalizat de o protein de import numit importer (fig. 11 a) . Tipul simport reprezint cotransportul a dou specii deosebite ( o structur chimic solvit i un ion ncrcat H+) n aceeai direcie, purtai fiind de ctre o protein porter (fig. 11, b1). Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoz n celula bacterian (Escherichia coli) (fig. 11, b2). Antrenarea n circulaie sanguin a glucozei absorbit din lumenul intestinal i deplasarea aminoacizilor din tubii renali n snge reprezint procese cu o desfurare similar, n care un rol important l joac celulele epiteliale intestinale i respectiv, tubulare. Ptrunderea acestor molecule n celulele epiteliale este cuplat obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate n regiunea apical (cu microvili) a membranei plasmatice (fig. 12).
Fig. 11. Mecanisme de cotransport
29
Ecotoxicologie
Fig. 12. Proteina ce realizeaz simportul glucoz Na+ asigur acumularea glucozei, mpotriva gradientului de concentraie, n celulele epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal. Na+ - K+ ATP-aza menine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor n afara celulei epiteliale. Cooperarea celor dou proteine transportoare face posibil preluarea continu a glucozei din lumenul intestinal. Sistemul antiport reprezint transportul de interschimb (fig. 11, c) ntre dou substraturi solubizante n dou direcii opuse, transport catalizat de o protein antiporter. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta, de exemplu Na+ n locul ionului de H+, sau Cl- n locul gruprii HCO3-. Prin acest tip de transport activ, Na+ este transportat intracelular, iar concomitent Ca2+ este scos n spaiul extracelular; acest antiport reuete s menin sczut nivelul citosolic al calciului n multe celule. Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport, n celulele animale, sunt declanate de gradieni de Na+, generai, la rndul lor, de pompe ionice de Na KATP-az. Proteinele uniporter, simporter i antiporter au structuri asemntoare, sunt nrudite din punct de vedere evolutiv i funcioneaz prin mecanisme similare. Cele trei tipuri de transport , uniport, simport i antiport au fost descrise nti la bacterii (Escherichia coli), ulterior dovedindu-i valabilitatea n toate celulele organismelor vii (fungi, plante, animale). C. Transportul apei i reglarea volumului celular C1. Presiunea osmotic-factor critic n transportul molecular de ap Deplasare moleculelor de ap prin membrana plasmatic sau printr-un strat de celule este rezultatul aciunii diferenei de concentraie a celor dou soluii separate de membran (stratul de celule) i /sau gradientul de presiune hidrostatic. Mecanismul transportului molecular de ap prin dublul strat lipidic nu este nc cunoscut. Studii recente sugereaz posibilitatea existenei unor proteine canal de ap la nivelul membranelor plasmatice. C2. Reglarea volumului celular i a presiunii osmotice interne Plasarea unei celule ntr-un mediu hipertonic determin contracia i respectiv destinderea spaiului intracelular. n anumite limite, celulele sunt capabile de a-i modula tensiunea osmotic intern i prin aceasta i pot menine volumul relativ constant. Introducerea unei celule ntr-un mediu hipertonic (cu o concentraie salin superioar coninutului celular) este urmat de scderea pH-ului citosolic, fapt ce determin activarea sistemului antiport Na+ H+ i ClHCO3-. Primul sistem asigur intrarea n celul a Na+ n schimbul ieirii H+. Al doilea sistem acioneaz n sensul deplasrii Cl- n celul i exportul de HCO3-. Speciile ionice exportate n mediul extracelular (H+ i HCO3-) sunt generate n celul ca rezultat al aciunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. Influxul de Na+ i Cl- conduce la creterea concentraiei saline i a tensiunii osmotice celulare ce fac posibil
30
Ecotoxicologie
intrarea moleculelor de ap n celul i n unele cazuri restabilirea volumului celular iniial (fig. 13).
Fig. 13. Principalele proteine transportoare implicate n reglarea volumului celular, condiiile n care celula se gsete ntr-un mediu hiperton (0,25 M NaCl)
2.1.3.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana plasmatic Schimbul de substane pe care l realizeaz celula cu mediul nconjurtor nu este limitat numai la ioni, molecule mici i ap. Diferitele macromolecule (proteine, polinucleotide, poliglucide) i particule traverseaz membrana plasmatic prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Se disting trei tipuri de transport: exocitoza, endocitoza i transcitoza. Prin exocitoz macromoleculele sintetizate n celul sunt excretate n spaiul extracelular. Endocitoza este implicat n transportul n celul a diverselor molecule, ct i a fraciunilor din fluidul interstiial (pinocitoza). Fagocitoza este un proces fundamental diferit de pinocitoz. Prin fagocitoz celulele ingereaz particule ale cror dimensiuni sunt de ordinul micrometrilor (bacterii, debriuri celulare etc). Dei decurg dup mecanisme diferite, cele trei procese de transport menionate prezint unele caracteristici comune: i) sechestrarea moleculelor i a particulelor transportate n vezicule; ii) asigurarea unui transport strict direcionat; iii) rolul critic al procesului de fuziune membranar. Materialele ce ptrund n celul prin endocitoz sunt fie supuse aciunii enzimelor hidrolitice lizozomale, fie eliberate din nou n mediul extracelular. De cele mai multe ori macromoleculele de screie sunt eliberate din celul prin aceeai regiune a membranei plasmatice prin care ele au ptruns. Exist ns situaii n care macromoleculele traverseaz spaiul celular fiind secretate printr-o alt regiune membranar. Acest ultim tip de transport poart numele de transcitoz. Procesul de exocitoz st la baza desfurrii secreiei celulare (fig. 14). Studiul transportului macromoleculelor din celul n mediul extracelular sugereaz existena a dou tipuri de exocitoz: constitutiv i reglat (fig. 15). Exocitoza constitutiv este comun tuturor celulelor i asigur eliminarea continu a macromoleculelor sintetizate n spaiul extracelular. Secreia celular de hormoni, neurotransmitori i enzime digestive este realizat prin exocitoz reglat. n acest caz moleculele sunt mpachetate n vezicule de secreii iar fuziunea lor cu membrana plasmatic este comandat de un semnal extracelular, de cele mai multe ori, un mesager chimic.
31
Ecotoxicologie
Fig. 14. Calea clasic de transport a moleculelor de secreie n spaiul extracelular
Fig. 15. Prezentarea schematic a exocitozei constitutive i reglate Endocitoza definete transportul mediat de vezicule din mediul extracelular n celul al unor macromolecule, ct i a substanelor dizolvate n lichidul intestiial (fig. 16). n funcie de mecanismul procesului de endocitoz distingem: endocitoza mediat de receptori i pinocitoza. Endocitoza mediat de receptori (absorbtiv) reprezint un tip de transport specific i eficient al macromoleculelor. n urma recunoateri i legrii lor la receptori de membran. Macromoleculele intr n celule sub forma complexului de ligand-receptor, fr a fi nsoite de fluidul extracelular. De exemplu, colesterolul circul n snge legat de o protein cu care formeaz complexe numite lipoproteine cu densitate sczut (LDL) (fig. 17). Pinocitoza (gr. pinen=a bea) sau endocitoza de fozofluid este un proces constitutiv, comun tuturor celulelor, prin care ptrund n celul molecule n soluie. Cantitatea macromoleculelor antrenat n acest tip de transport nespecific, este direct proporional cu concentraia lor n fluidul extracelular.
32
Ecotoxicologie
Fig. 16. Calea urmat de particulele ce au ptruns n celul prin endocitoz
Fig. 17. Endocitoza mediat de receptori pentru LDL Fagocitoza (gr. fagiere=a mnca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile s ingere diverse particule din spaiul extracelular. Dac la organismele unicelulare fagocitoza reprezint principala cale de nutriie, la mamifere procesul joac un rol important n aprarea organismului. Celule specializate numite fagocite sunt capabile s nglobeze i s distrug substane strine, microorganisme, celule mbtrnite i maligne, resturi celulare etc. n organismele animale se disting dou tipuri de celule sanguine ce acioneaz ca fagocite: monocitele (ce migreaz n esuturi dnd natere macrofagelor i ele celule cu funcie fagocitar) i neutrofilele.
33
Ecotoxicologie
Legarea particulelor de fagocit prima etap a fagocitozei implic participarea receptorilor de membran ce recunosc specific liganzii aflai pe suprafaa particulei int. Pentru a putea fi fagocitate, bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. opsonein=a pregti pentru mncare) ce const n acoperirea suprafeei bacteriene cu anticorpi i /sau componente ale complementului. Anticorpii se ataeaz pe suprafaa bacteriilor n aa fel nct regiunea prin care acetia se leag la receptori, numit regiune Fc, este expus spre exterior. Receptorul Fc din membrana plasmatic a fagocitelor interacioneaz cu anticorpii legnd cele dou suprafee membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibil fagocitoza (fig. 18). Exist posibilitatea stabilirii unor legturi ncruciate ntre anticorpii ataai pe suprafaa celulei int cu formarea unor aglomerri (clusterii), proces numit patching. Dup un scurt timp de la formarea cluster-ilor, anticorpii se deplaseaz spre un pol al celulei-int genernd o structur de tip calot ce mpiedic fagocitarea celulei in (fig 19). Procesul de calotare (copping) este energo-dependent necesitnd prezena moleculelor de ATP. Activarea receptorilor specifici de ctre anticorpi, componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaa microorganismelor, prin formarea complexului ligandreceptor, genereaz un semnal intracelular ce declaneaz ingestia.
Fig. 18. Fagocitoza se realizeaz printr-un mecanism membrane-zipper A distribuirea uniform a anticorpilor pe suprafaa celulei int face posibil fagocitarea acesteia B procesul de capping mpiedic fagocitarea celulei-int nglobarea particulei int cea de-a doua etap a fagogitozei se realizeaz prin emiterea de ctre fagocit a unor prelungiri numii pseudopode ce nchid complet particula ntr-o vezicul, odat internalizat vezicula poart numele de fagozine. Fagozinul fuzioneaz cu vezicule din compartimentul prelizozomal (lizozomi primari) dnd natere fagolizozomilor unde materialul ingerat este supus aciunii enzimelor hidrolitice (faza de digestie). Substanele utile trec n citosol, iar substanele nedigerabile rmn n fagolizozomi formnd corpii reziduali care sunt eliminai la exteriorul celulei. Lizozomii din macrofage conin, pe lng hidrolizele specifice compartimentului lizozomal, enzime ce catalizeaz reacii n urma crora rezult substane toxice (peroxid de oxigen H2O2; anion superoxid O2, etc), ce au rol de a suprima bacteriile fagocitate.
34
Ecotoxicologie
Pn n prezent, mecanismul prin care formarea complexului ligand-receptor iniiaz ingestia, ct i cel care st la baza emiterii pseudopodelor de ctre fagocit, sunt neclare. Faptul c unele substane (citocalozina) ce blocheaz polimerizarea moleculelor de actin inhib fagocitoza sugereaz caracterul actino-dependent al mecanismului de formare al pseudopodelor. Transcitoza definete un tip de transport specific transcelular, al diferitelor microelemente. Procesul este ntlnit n celule (epiteliale) ale cror membrane plasmatice sunt mprite n domenii distincte (apical i latero-bazal) datorit pronunatei asimetriei n distribuia elementelor lipidice i proteice componente. Un exemplu de transcitoz l reprezint transportul din stomac n circuitul sanguin al anticorpilor la nou-nscut, anticorpi primii odat cu laptele matern.
Fig. 19. n urma interaciei anticorpi proteine de pe suprafaa celular proteinele se pot asocia n cluster-i (patching) i se pot aglomera la un pol al celulei (capping) 2.2. CI DE PTRUNDERE N ORGANISM Cunoaterea cilor de ptrundere a toxicilor n organism are o deosebit importan, cci de acestea depinde, n mare msur ritmul absorbiei, care condiioneaz concentraia la nivelul receptorilor. Cile de ptrundere sunt clasificate n: - ci indirecte (mediate): asigur ptrunderea substanei din mediul exterior n esut prin tegumente, mucoase sau seroase, trecnd apoi n circulaia general. Ele sunt: calea transcutanat, gastrointestinal, respiratorie, alte ci transmucoase, cile transseroase; - ci directe (imediate, parenterale): asigur ptrunderea substanei n esut printr-un mijloc mecanic. Numai calea venoas permite ptrundere integral, pentru c substana ptrunde direct n circulaie, nct lipsete faza de absorbie. n celelalte ci parenterale (subcutanat, intramuscular, intradermic) se poate produce o nchistare a substanei la locul injectrii; totui n comparaie cu calea gastro-intestinal, absorbia este mai rapid i mai intens deoarece nu mai intervine aciunea selectiv a epiteliului.
35
Ecotoxicologie
Calea de ptrundere are influen att asupra gradului de toxicitate, a tipului de toxicitate ct i a tipului de aciune toxic. n general, toxicitatea crete cu ct se asigur o trecere mai rapid n circulaie i din acest punct de vedere cile de ptrundere se claseaz, n ordinea descresctoare: intravenoas, respiratorie, intraperitoneal, intramuscular, subcutanat, oral, cutanat. 2.3. ABSORBIA, FIXAREA, DISTRIBUIA I DEPOZITAREA TOXICULUI Efectul unui toxic depinde de cantitatea principiului activ ajuns la sediul aciunii, precum i de timpul ct persist la acest nivel. Dup absorbie adic dup ptrunderea n snge sau n limfa circulant substana rmne un timp scurt n aceast faz, fie sub form liber (dizolvat n lichidul plasmatic), fie fixat pe hematii sau legat de proteinele plasmatice (vehicule plasmatice). Capacitatea de fixare pe proteinele sanguine variaz cu natura substanei i cu specia animal. Spre deosebire de receptori, care fixeaz numai substane cu o anumit structur, proteinele plasmatice sunt capabile s fixeze molecule mici cu structuri foarte variate, deci fenomenul nu este specific. Fixarea se realizeaz prin diferite tipuri de fore intermoleculare, n funcie de distana i caracteristicile situsurilor de fixare de pe macromolecula proteic. Astfel, unele metale (ex. Pb) se fixeaz sub form de pulberi, vapori sau compui anorganici, pe eritrocite n proporie de 90%. Numeroase medicamente i toxici se leag de proteinele plasmatice: dieldrin, benzen, toluen, benzin, clorur de etil, chinin, barbituricile, salicilat de sodiu, dicumarol, sulfamide, unele antibiotice, fenilbutazona etc, ceea ce ntrzie biotransformarea i eliminarea din organism. Distribuia reprezint transportul sau transferul substanei din snge n esuturi i organe sau n alte lichide de distribuie. Unele substane difuzeaz uniform n toate esuturile (ex. etanolul). Majoritatea se distribuie ns selectiv n anumite esuturi datorit faptului c permeabilitatea membranei celulare din diferite esuturi nu este aceeai pentru toate substanele. De aici decurge o repartiie neuniform a aceleiai substane n esuturi diferite: iodul se acumuleaz selectiv n glanda tiroid, zincul n os i testicule etc. Alte substane difuzeaz iniial n acele organe care corespund proprietilor lor fizico-chimice apoi sunt redistribuite (ex. barbituricele cu aciune foarte scurt administrate intravenos difuzeaz rapid n creier, apoi revin n snge i de aici n alte organe lipoide, de unde trec treptat n snge). O fraciune de substan astfel distribuit ntlnete centrii receptori unde i poate exercita aciunea biologic. Alt fraciune se poate depozita provizoriu n anumite esuturi. Depozitarea are loc n: - esutul adipos: insecticidele organoclorurate, solveni organici, nitroderivai etc; - esutul osos: Pb, Sr, Br, Ca, F, P; - celulele sistemului reticulo endotelial joac rol n fagocitoz i pinocitoz, nglobnd particule mari ca virusuri, bacterii, particule coloide, unele lipide; - proteinele tisulare: se formeaz complexe cu constituenii diferitelor parenchime, apoi acetia se disociaz lent, ca urmare a metabolismului proteic: ex. Bi se fixeaz pe gruprile SH ale proteinelor din rinichi, As pe gruprile SH din piele i ficat; Cd este nglobat n tionein; metacrina se leag de proteinele din ficat i plmn (unde prezint concentraii de cteva mii de ori mai mari dect n snge); - fanere: arsen, seleniu; - piele: aur, argint; - lichidele necirculante normale (LCR) i patologice (lichid pleural, ascitic) pot depozita unele substane exogene. ntre fraciunile libere i cele legate se stabilete un echilibru dinamic, ns sub influena unor modificri (factori interni sau externi) poate rezulta o mobilizare rapid a toxicului din depozite cu apariia brusc a fenomenelor nocive. Pe de alt parte, unele esuturi de depozit (ex. esutul adipos) poate constitui, n unele cazuri, o saltea de atoxicitate, prin nglobarea
36
Ecotoxicologie
anumitor toxici i protejarea astfel a structurilor mai fine de aciunea nociv. Rezult c nu ntotdeauna se pot extrapola la nivel tisular, datele observate la nivel molecular i celular i c trebuie inut seama de caracteristica structural a unui esut. Sediul de fixare selectiv poate corespunde aciunii biologice: de ex. compuii cu arsen se fixeaz n piele i mucoase; anestezicele, hipnoticele, se fixeaz pe celulele nervoase. n alte cazuri ns, cele dou sedii nu coincid: digitoxina se fixeaz mai mult n tubul digestiv dect n cord; stricnina i nicotina se localizeaz n mare parte n ficat; multe substane se fixeaz pe parenchimul renal nainte de a fi excretate n urin; pento- i hexobarbitalul se fixeaz n esutul adipos (mai rapid dect alte barbiturice), nct cantitatea lor n snge descrete rapid, explicnd aciunea lor trectoare. Prin urmare, repartiia substanelor exogene n organism nu reflect aciunea lor specific, iar fixarea se face n mod preferenial la nivelul receptorilor. 2.4. BIOTRANSFORMAREA I ELIMINAREA TOXICULUI 2.4.1. Biotransformarea Biotransformarea (metabolizarea) este o conversie enzimatic, avnd ca urmare transformarea substanelor exogene n metabolii mai polari, mai uor excretabili i de obicei mai puin toxici (pentru c strbtnd mai greu barierele lipidice, reabsorbia tubular este mai redus). Se consider compui exogeni, acei compui care ptruni n organism nu sunt utilizai pentru producerea de energie sau elaborarea componenilor tisulari; n generali ei sunt strini cilor metabolice normale ale organismului. Organismul animal poate metaboliza aproape toate structurile chimice cunoscute. De aceea marea majoritate a compuilor organici strini indiferent dac sunt sau nu toxici sufer metabolizare, fiind eliminai sub form de metabolii. Numai dou categorii de compui traverseaz organismul fr biotransformare i sunt excretai ca atare (tab.6).
Tabelul 6 Compui excretai fr prealabil metabolizare (dup Smith, 1974) acid 5,5 - metilen disalicilic acizi tari acid 2,4,5-triclorfenoxiacetic - compui puternic polari sruri de hexamentoniu baze tari metilglicoxal bisguanid hidrazona 2,4,5,2,4,5 - hexaclordifenil - compui nepolari eter etilic veronal
37
Ecotoxicologie
Noiunea de detoxicare a fost introdus de Baumann, care a observat c produii de metabolizare sunt mai puin toxici dect cei iniiali. n anul 1874 Jaffe a identificat n urin acidul glucuronic. n anii urmtori, mai multe grupe de cercettori (Baumann, Jaffe , Cohn etc) au descoperit succesiv conjugrile cu acidul glucuronic, sulfuric, glicocolul, apoi rolul conjugrii mercapturice, al acetilrii, metilrii i detoxicrii sulfocianice a iodului cian. n anul 1893, Cohn a artat c aceeai substan poate suferi metabolizri multiple: oxidri, hidrolize, conjugri. n secolul XX cercetrile s-au axat pe mecanismele interne, biochimice i fiziopatologice, ale transformrilor metabolice, ajungndu-se la rezultate remarcabile. Dup Williams, transformrile cantitative ale unei substane exogene n organism comport dou faze. n faza I, un compus A (biologic activ sau inactiv) este transformat prin reacii de oxidare, reducere sau hidroliz, ntr-un nou compus activ (B) sau inactiv (B 1). n faza II, compuii A,B,B1 pot trece ntr-un alt compus C, inactiv, n general rezultatul unei sinteze (fig.20). n fiecare faz compusul strin, de obicei liposolubil, devine mai polar. n faza 1 metaboliii sunt mai polari dect compusul iniial, iar n faza 2, metaboliii sunt foarte polari i adesea sunt acizi puternici. n unele cazuri transformarea nu este acidifiant ci alcalinizant. Biotransformarea unui compus exogen apare mai curnd ca un proces avnd tendina s creasc polaritatea, dect s i reduc toxicitatea.
B A C
B1 FAZA 1 FAZA 2
Activare Inactivare
Fig. 20. Metabolismul calitativ (dup Williams, 1959) n faza 1 intervin reacii de oxidare, reducere i hidroliz. Oxidarea este reacia cea mai comun dintre reaciile fazei 1, alturi de care au loc i alte reacii. Reducerea este mai puin ntlnit, dar pentru unele tipuri de substane este singura cale de metabolizare. Hidroliza realizeaz degradarea esterilor, amidelor i glicozizilor. De fapt multe substane exogene sufer biotransformri multiple, dintre care una este calea principal, iar celelalte secundare. Enzimele care controleaz reaciile fazei 1 sunt oxidaze, hidrolaze, reductaze, aminoreductaze, esteraze; acestea sunt grupate n dou categorii enzime normale i enzime de metabolizare a substanelor strine sau enzime parametabolice. Aceste enzime de metabolizare a substanelor strine au rolul major n biotransformarea acestora. Ele sunt localizate n diferite organite ale celulei i de asemenea n fraciunea solubil (hialoplasm). Studiile in vitro ale acestor sisteme enzimatice sunt efectuate pe preparate izolate din reticulul endoplasmatic. Prin zdrobire i omogenizare, reeaua fin se fragmenteaz n mici vezicule denumite microzomi care sunt separai prin ultracentrifugare. S-a considerat c
38
Ecotoxicologie
enzimele din microzomi metabolizeaz numai compui strini; totui i unii compui normali (de ex. steroizii) sunt biotransformai n microzomii hepatici de hidroxilaze. Este deci posibil ca proprietatea indispensabil pentru a fi substratul acestor enzime s fie liposolubilitatea, datorit creia substana poate s ptrund n microzomi, lund contact cu enzima i nu calitatea de a fi strin organismului. Substanele exogene hidrosolubile nu pot ptrunde n microzomi; ele sunt biotransformate de enzimele din alte fracii celulare. Transformrile metabolice ale substanelor liposolubile se realizeaz n general n reticulul endoplasmatic (RE), att forma rugoas, legat de ribozomi (RER), ct i forma neted lipsit de ribozomi (REN). Reticulul endoplasmatic neted (REN) prezint ns activitatea enzimatic maxim. Dup unii autori, diferena puterii enzimatice dintre cele dou forme ale reticulului se datorete capacitii mai mari a REN, dect a RER, de a reduce cit. P450. Sistemul microzomal al transportului de electroni. Reacia dominant din faza I este oxidarea. Oxidarea biologic se reduce n esen la mecanismul hidroxilrii. Ea necesit un sistem transportor de electroni microzomal, analog aceluia din mitocondrii. n ambele cazuri, particip dinucleotide i citocromi, ntr-o succesiune determinat de potenialul lor de oxidoreducere. La nivelul microzomilor, dinucleotidul este NADPH, iar citocromul este aa numitul citocrom P450. Intervine, de asemenea, o flavoprotein, NADPH reductaza cit. P450 i o lipid (fosfatidilcolina). Cit. P450 este o hemoprotein, cu masa molecular de ordinul 50.000, reprezentnd aproximativ 20% din proteinele endoplasmatice (5 mg/g ficat). El nu se gsete numai n ficat, ci i n microzomii i mitocondriile suprarenalei, n microzomii rinichiului i ai nucoasei intestinale. Cantitatea de cit. P450 este maxim n ficat, redus n rinichi i plmni i aproape inexistent n creier, muchi i inim, iar activitatea enzimelor microzomale variaz n acelai sens. Sub form redus (cit. P450 Fe2+) prezint o absorbie caracteristic la 450 nm n prezena CO. Prin adaos de substane exogene, se observ modificri ale spectrului de absorbie a formei oxidate (cit. P450 Fe3+). De exemplu, hexobarbitolul, determin o depresiune la 420 nm i un pic la 390 nm, anilina, nicotilamida produc o depresiune la 400 nm i un pic la 430 nm. Aceste modificri ale spectrului de absorbie reflect formarea cu substratul R, a unui complex (cit. P450 Fe3+ - R). Sub aciunea NADPH reductazei - cit. P450, complexul este redus la cit. P450 Fe2+- R. Pe complexul redus se fixeaz oxigenul molecular, rezultnd un nou complex, ternar, O2 - cit. P450 Fe2+- R. Acesta este scindat n substratul oxidat R OH i cit. P450 Fe3+ , capabil s reintre n reacie. Dei prin biotransformare substanele exogene trec n metabolii mai polari, acetia nu sunt automat mai puin activi biologic. Din reaciile fazei I pot rezulta metabolii mai activi (ex. insecticide: schradan, paration; carcinogen: -naftilamid; anestezic: tricloretilen; antibacterian: prontozil), mai puin activi sau inactivi (ex. insecticid: DDT; malaoxon; analgezic: antipirin; hipnotic: fenobarbital; stimulent: adrenalin), sau cu activitate diferit (ex. codeina care prin Odemetilare trece n morfin i din analgezic devine narcotic). n faza a II a gruparea reactiv din faza I se combin cu un compus exogen, realiznduse o conjugare sau sintez. Dac substana exogen posed deja gruparea reactiv, poate trece direct la conjugare (de ex. fenolul). Alte substane se metabolizeaz n ntregime n faza I i nu mai sufer, conjugare (de ex. etanolul). Cele mai multe substane se metabolizeaz n dou faze (de ex. benzenul este oxidat n faza I la fenoli i difenoli, iar n faza a II-a acetia sunt sulfo- sau glucuronoconjugai). Glucuronoconjugarea este mecanismul cel mai rspndit de detoxificare, probabil pentru c agentul de conjugare (nucleotidul), glucuronil-uridin-fosfat (o substan intermediar) i enzimele implicate sunt prezente n majoritatea esuturilor i de asemenea, din cauza varietii gruprilor pe care acidul glucuronic se poate transfera. Deci, dac n faza I nu rezult n mod obligatoriu metabolii mai puin toxici n faza II se formeaz, n marea majoritate a cazurilor,
39
Ecotoxicologie
compui hidrosolubili i netoxici (sau mai puin toxici) excretabili n urin (de exemplu acidul salicilic este conjugat cu glicocolul, dnd acid saliciluric; clorbenzenul este cuplat cu glutationul i ulterior excretat ca acid clorfenilmercapturic). n mod excepional, compuii exogeni pot lua parte i la reacii de sintez, din care rezult produi toxici sau consecine toxice. Aceste sinteze au fost denumite letale i se deosebesc de reaciile din faza II (reacii de conjugare sau sintez). Sinteza letal are loc atunci cnd compusul strin sau metabolitul din faza I imit un metabolit intermediar natural: de exemplu fluoroacetatul, asemntor acetatului, intr n locul acestuia n ciclul Krebs i l blocheaz. Alteori o macromolecul important intr n reacie cu un compus strin, de ex. acizii nucleici reacioneaz cu agentul de metilare rezultat din oxidarea dimetilnitrozaminei, putnd sta la originea declanrii unui cancer; fluouracilul mimeaz uracilul i este ncorporat ntr-o mic cantitate n ARN, dnd natere unui ARN denaturat care poate provoca tumori; seleniul ingerat de animale nlocuiete sulful din tioaminoacizi (s-a detectat selenometionin i selenocistein n proteinele hepatice a animalelor tratate cu Se marcat). Sediul metabolizrii Metabolizarea are loc n diferite esuturi i organe. Enzimele de metabolizare a substanelor exogene sunt localizate n acele regiuni unde pot fi mai eficiente n aprarea organismului de efectele nocive. Ficatul este sediul major al biotransformrii. Substanele exogene ingerate sunt absorbite i transportate prin vena port la ficat, unde tind s se acumuleze i s se degradeze, n special n reticulul endoplasmatic, sub aciunea enzimelor. Organele i esuturile care favorizeaz intrarea i ieirea din organism conin enzime de metabolizare. Acestea sunt: pielea, rinichiul, plmnul, intestinul (multe reacii de metabolizare au loc sub aciunea florei intestinale), plasma , ochiul, celulele reticuloendoteliale. Sediul metabolizrii unui compus nu corespunde ntotdeauna cu sediul principal al aciunii toxice (ex. Pb Pb tetraetil acioneaz pe creier i este metabolizat n ficat). Pb tetraetilul ca atare nu este toxic pe SNC; dar este metabolizat n ficat n Pb trietil care este apoi transportat la creier unde i exercit aciunea toxic. 2.4.2. Eliminarea Substanele exogene sunt eliminate n special pe cale respiratorie, digestiv i renal. Viteza eliminrii depinde n primul rnd de calea de ptrundere, determinat n general, de proprietile fizico chimice ale substanei. n cazul excreiei renale, viteza depinde de: - debitul urinar, n funcie de factori interni i externi; - fixarea pe proteine plasmatice: substanele care se afl legate ntr-un mare procent de proteinele plasmatice, se elimin lent pe cale renal; - pH-ul urinar: compuii liposolubili se reabsorb pn ce sunt biotransformai complet n produi hidrosolubili; pH-ul alcalin favorizeaz eliminarea substanelor acide, iar pH-ul acid favorizeaz eliminarea substanelor bazice; electroliii tari se elimin rapid, indiferent de pH-ul urinar; Activarea sau inhibarea enzimatic poate modifica ritmul normal al excreiei renale, de asemenea, vrsta, integritatea funciei renale ca i diferite interaciuni (competiii pentru transport).
40
Ecotoxicologie
2.5. FACTORII CARE INFLUENEAZ TOXICITATEA Spre deosebire de proprietile fizice i chimice ale substanelor, care sunt caliti bine definite, toxicitatea este caracteristica rezultat din manifestarea biologic a organismului n care acestea au ptruns. Intensitatea aciunii toxice a unei substane variaz cu: a) factorii dependeni de substan (structura stereochimic, gruprile chimice, structura stereochimic); b) factorii dependeni de organism (specie, vrst, sex, starea psihic, starea patologic, greutatea corporal, regimul alimentar, ritmul circadian, ras, factori genetici); c) Factori dependeni de mediu (temperatur, presiunea atmosferic, zgomotul, radiaii ionizante). Fiecare subiect prezint o constelaie practic unic de factori genetici i de mediu, dintre care fiecare poate influena rspunsul la toxici sau medicamente, explicnd marea variabilitate individual a rspunsului, observat de mult vreme. n cazul medicamentelor, se tie c aceeai doz, administrat pe aceeai cale, din acelai medicament la persoane de aceeai vrst i sex, suferind de afeciuni similare, poate determina la unii manifestri toxice, la alii efectul terapeutic scontat, iar la civa un rspuns negativ. Pe de alt parte, se consider c nu exist o siguran absolut n privina efectelor unui medicament: mai curnd sau mai trziu, pot aprea efecte adverse. n consecin, pe lng efectele utile, medicamentele pot provoca i efecte (reacii) adverse (reacii nedorite care apar la doze utilizate n mod normal la om, n scop terapeutic, profilactic sau de diagnostic). Se cunosc mai multe tipuri de reacii adverse (RA), astfel: a) reacia alergic, diferit de aciunea farmacologic a medicamentului, apare la cel puin 5-7 zile dup prima expunere la medicament, nu depinde de doz i reapare la readministrarea substanei respective sau a celor cu structur nrudit; b) reacia toxic, tulburare funcional sau morfologic, prin aciunea nociv direct a medicamentului asupra diferitelor esuturi i organe; de obicei apare dup administrri repetate; c) dependena psihic, necesitatea impetuoas de administrare periodic a unui medicament, nemotivat de boal; d) dependena fizic, necesitatea impetuoas de administrare periodic a unui medicament, nemotivat de boal i la a crui suprimare apare sindromul de abstinen. Dependena (farmacodependena) poate apare accidental n cazul multor medicamente, sau la doze toxice ale acestora. n mod obinuit, farmacodependena psihic i uneori fizic, apare la urmtoarele categorii de substane medicamente: analgezice morfinice naturale i de sintez (morfin, codein, petidin, metadon etc.,) ca i produii posednd totodat proprieti morfinice i antagoniste (nalorfin etc.,); hipnotice (barbiturice, cloral, glutetimid etc.,); sedative i tranchilizante (meprobamat, clordiazepoxid etc.,); nooanaleptice (amfetamice); anticolinergice centrale (scopolamin, benzhexol etc.,); cocaina. e) intolerana, reacia diferit de aciunea farmacologic a medicamentului, care apare la prima administrare; f) toleran acut (tahifilaxie), diminuarea efectului terapeutic al medicamentului, la repetarea lui n cursul unei zile; se instaleaz rapid i pentru o durat scurt. Apare n special pentru muchii netezi (de ex. vasculari). Poate produce tahifilaxie cafeina. Prin ntreruperea administrrii se revine treptat la sensibilitatea iniial. g) tolerana cronic (obinuina), diminuarea efectului terapeutic al medicamentului, la repetarea lui timp ndelungat, nct pentru a produce acelai efect, dozele trebuie mereu crescute. n cadrul toleranei intr i noiunea de midridatism, respectiv capacitatea unui organism de a tolera, prin administrri repetate de doze crescnde, a cantitii care la prima administrare determin efecte nocive. De ex. fumtorii suport doze crescute de nicotin.
41
Ecotoxicologie
h) tolerana ncruciat, obinuina la un alt medicament similar celui folosit anterior ca de exemplu heroina cu morfina, unele tranchilizante, rezistena mai crescut a alcoolicilor la aciunea narcoticelor. De un interes deosebit este hipersensibilitatea unor subieci la administrarea unor medicamente n doze obinuite sau chiar minime (cum este cazul uneori chiar n cursul testrii sensibilitii la medicamentul respectiv). Aceast hipersensibilitate mbrac forme de manifestare de graviti diferite, putnd duce pn la ocul anafilactic, cea mai caracteristic, violent i grav form de manifestare. n funcie de gravitate, manifestrile constau din: erupii cutanate, purpur, astm, diaree, rinit, edeme, induraii ganglionare. n cazuri grave de oc anafilactic apar congestii i inflamaii viscerale, prbuirea tensiunii cu colaps care duce de obicei, n cteva minute, la sfrit letal.
42
Ecotoxicologie
Capitolul III INDUCIA I INHIBIIA ENZIMATIC

3.1. NOIUNI PRIVIND INDUCIA n faza metabolizrii pot surveni interaciuni exogene (medicamente, poluani) ceea ce explic posibilitatea ca enzimele de metabolizare s fie inhibate sau stimulate de alte substane ptrunse concomitent n organism. Astfel, un compus B poate afecta metabolizarea unui alt compus A, fie prin accelerarea, fie prin inhibarea metabolismului su, din fiecare din aceste situaii putnd rezulta metabolii toxici sau netoxici Pot avea loc deci dou fenomene contrare: - inducia enzimatic - inhibiia enzimatic. Inducia enzimatic este fenomenul de accelerare a metabolizrii unei substane exogene sau endogene prin administrarea altei substane , denumit inductor. Inducia este un fenomen adaptativ temporar. O gam foarte diferit de substane au activitate inductoare. Astfel, ncercarea lui Richardson, n anul 1952 de a mri incidentele cancerelor prin administrarea concomitent, la obolan, a doi cancerigeni un colorant aminoazoic i o hidrocarbur policiclic a dus, n mod neateptat, la rezultatul contrar. Explicaia reducerii efectului nociv const n stimularea, de ctre hidrocarbura policiclic (3-metilclorantren) a sintezei enzimei microzomale care detoxific colorantul aminoazoic (3-metil-4-dimetilaminoazobenzen), la compui necancerigeni. Descoperirea induciei generat de pesticide a fost, de asemenea, ntmpltoare. Astfel, n anul 1961 (Fouts) s-a observat la animalele tratate cu fenobarbital, reducerea cu 1/3 a perioadei de somn, n urma tratrii cutilor cu clordan n scop de dezinfecie; efectul se meninea timp de 3 sptmni dup ncetarea aplicrii pesticidului. De la aceste prime constatri, cteva sute de substane cu cele mai felurite structuri i aciuni au dovedit ulterior un efect inductor. 3.2. MANIFESTRILE EFECTULUI INDUCTOR La nivelul hepatocitului, efectul inductor este exprimat prin urmtoarele manifestri: - hipertrofia REN ca i creterea concentraiei proteinelor microzomale i a greutii ficatului; - creterea activitii cit. P450 (hemoprotein cu rol de acceptor final n lanul transportatorilor de electroni) conducnd la oxidarea substratelor exogene; - stimularea activitii enzimelor microzomale, avnd ca rezultat stimularea metabolizrii ca i formarea rapid a metaboliilor. Principalele clase de substane cu care vine omul n contact (prin contaminarea mediului nconjurtor sau prin administrare deliberat) i care n anumite condiii pot deveni nocive, sunt: medicamentele, alcoolul etilic, pesticidele, substane cancerigene. 3.2.1. Medicamentele Consumul de medicamente pe plan mondial crete ntr-un ritm mai rapid dect nsi creterea populaiei, care, dup cum se tie se dubleaz la 25 de ani. Explozia consumului de medicamente nu este legat de creterea morbiditii , ci este asociat cu tensiunea, anxietatea, sentimentul de frustrare inerente vieii moderne. Acestea favorizeaz un mare consum de vitamine, sedative, hipnotice, psihotrope, unele fiind administrate simultan. Ori s-a demonstrat c unele medicamente sunt inductori, stimulnd fie propriu metabolism, fie pe a altor substane medicamentoase sau nemedicamentoase .
43
Ecotoxicologie
De ex. n administrarea concomitent a unui antibiotic i a unui barbituric, efectul antimicrobian poate fi considerabil redus. La obolan, s-a administrat i.p. pneumococ i s-a tratat cu cloramfenicol. Efectul antimicrobian devine evident la 100 mg/zi de antibiotic, la 150 mg/zi mortalitatea scade cu 50%, iar la 200 mg/zi mortalitatea este mult mai redus. Dac se adaug ns fenobarbital, concentraia seric a cloramfenicolului scade mult i protecia este foarte redus. Din combinaia mai multor medicamente pot rezulta efecte adverse din cauza influenrii reciproce prin aciune inductoare. Metabolizarea medicamentelor poate fi influenat i de ali inductori: alcool, insecticide organoclorurate, substane cancerigene. Administrarea prelungit a unui medicament activeaz adesea procesul propriei sale inactivri (ceea ce duce la fenomenul de toleran i necesitatea creterii dozelor pentru obinerea aceluiai efect). Tolerana nu a fost observat pentru narcotice (morfina, meperidina). 3.2.2. Alcoolul etilic Etanolul poate fi considerat o substan fcnd parte din mediu ca i fumul de igar. El este toxicul cel mai rspndit, afectnd n unele ri 5% din populaie (n SUA sunt 9 milioane alcoolici, care consum zilnic, n medie 1 litru butur tare), ceea ce confer o mai mare importan social i medical dect drogurile. Din cauza ntrebuinrii masive a agenilor farmaceutici i a creterii poluanilor din mediu, ca i a faptului c muli alcoolici nu sunt recunoscui ca atare, interaciunea alcoolului cu diferii inductori constituie un risc; consumul de alcool poate afecta dozajul multor medicamente i poluani. Dup administrarea cronic de etanol se observ apariia caracterelor induciei enzimatice: proliferarea REN; creterea concentraiei proteinelor microzomale, stimularea activitii cit. P450 etc. Efectul in vivo este creterea metabolismului alcoolului. Se constat ns i creterea metabolizrii altor substane la alcoolici inclusiv sedative, barbiturice. Ca urmare, n cazul administrrii unor medicamente, trebuie crescut dozajul. Administrarea unic i masiv de etanol inhib enzimele de metabolizare a sedativelor (barbituricele, meprobamat), probabil datorit potenrii efectelor: la nivelul receptorilor S.N.C. barbituricele acioneaz ca sedative i somnifere, iar etanolul determin o faz de excitaie. Pe de alt parte administrarea cronic de barbiturice accelereaz oxidarea etanolului din aceast cauz adesea etanolul i sedativele sunt luate simultan (se ajunge la alcoolism prin obinuin). 3.2.3. Pesticidele Folosirea intensiv n ultimele decade a pesticidelor n domeniul agricol, veterinar, al sntii publice i n scopuri industriale i casnice, a contribuit la scderea bolilor vectoriale, la creterea rezervelor de hran i la ameliorarea calitii ei. Totodat a determinat ns apariia, sub form de urme, a pesticidelor, a metaboliilor i produilor de degradare, n mediul abiotic i biotic: sol, ap, aer, plante, animale, alimente etc. Efectele secundare posibile ale pesticidelor pot fi grupate astfel (tab.7): - interaciunea plante-animale pe de o parte i mediul abiotic, pe de alt parte, prin prezena unor nivele biologic active ale reziduurilor de pesticide; ca urmare, unele elemente din ecosistem sunt afectate, iar echilibrul biologic este deranjat; - prezena reziduurilor n alimente i deci ingerarea lor de ctre om, duce la rezultate nocive; - dezvoltarea rezistenei este un fenomen cauzat de pesticide la un grup de insecte din aceeai specie, cu apariia raselor rezistente. 3.2.3.1. Pesticidele organoclorurate n 1951 s-a artat pentru prima dat n SUA (Lang, Kunze, Prichett) c persoane din populaia general prezint nivele detectabile de DDT n esutul adipos, n plasm i n lapte, toxicul provenind n proporie de 90% din alimentaie. n esutul adipos, suma DDT+DDE
44
Ecotoxicologie
(principalul metabolit) este aproape constant (4-5 ppm), ceilali metabolii sau insecticidele nrudite fiind n concentraii mult mai mici. Watson (1970), cercetnd 1000 de locuitori rurali, a gsit nivelul mediu de DDE i DDT n snge, de 22,0 ppb i 4,7 ppb. Frecvena lor a fost de 99,8% pentru DDE i 84% pentru DDT. Concentraiile de dieldrin au fost n medie de 0,3 ppb. Hayes a stabilit c n cazul unei ingerri zilnice (experimental, profesional sau prin consumarea unei diete cu coninut de DDT) se ajunge la o stare de echilibru ntre absorbie, depozitare, metabolizare i excreie. Cnd absorbia se reduce, scade i depozitarea, pn la un nivel corespunztor cu noul nivel al absorbiei. La om, starea de echilibru este atins dup aprox. 1 an, apoi subiectul poate continua s absoarb aceeai cantitate de DDT fr o modificare semnificativ n depozitele tisulare. Aceeai comportare are i diedrinul, ca i HCH. Dimpotriv, alte insecticide organoclorurate (metoxiclor, endrin, ceilali izomeri ai HCH) se metabolizeaz rapid, deci nu se depoziteaz. Se consider c populaia general inger zilnic n hran, aprox. 20 g DDT i 7 g dieldrin, fr pericol, pentru c nu se ating nivele critice n snge, care s determine efecte nocive. Insecticidele organoclorurate depozitate n organism pot fi mobilizate de inductori din mediu alte insecticide, cancerigeni sau de medicamente. De asemenea, majoritatea lor sunt inductori, deci pot stimula metabolismul altor substane, exo- i endogene. ntr-adevr, dup descoperirea efectului inductor al clordanului, s-a constatat treptat, acelai efect la o serie de pesticide organoclorurate: DDT, DDE, metoxiclor, lindan, pertan, aldrin, dieldrin, endrin, keltan. n cazul stocrii n esutul adipos i a eliminrii lente n organism, efectul inductor este prelungit. Tabelul 7. Efecte secundare ale pesticidelor n mediu (dup Tiel) Elemente de Efectul secundar mediu potenial mediu abiotic - prezena reziduurilor n sol, ap i aer plante - prezena reziduurilor - efecte negative datorit fitotoxicitii - modificri ale vegetaiei (datorit folosirii erbicidelor) animale - prezena reziduurilor la animale (domestice i slbatice) - efecte fiziologice (de ex. neviabilitatea oulor de psri) - mortalitatea crescut a unor specii de animale slbatice (mamifere, psri, peti) - mortalitatea crescut a insectelor folositoare, prdtoare i parazite - modificri n populaia insectelor (de ex. dezvoltarea unor duntori ca urmare a dispariiei anumitor insecte) om - prezena reziduurilor n esuturi i organe - efectele expunerii profesionale alimente - prezena reziduurilor organism-int - dezvoltarea rezistenei
1. 2. 3.
4. 5. 6.
nc din 1964 Street a observat c tratamentul obolanilor cu DDT mobilizeaz dieldrinul din esuturi. Ulterior (1967) el a conchis c reducerea se datorete accelerrii metabolizrii, cu eliminare crescut a metaboliilor polari n urin, fapt confirmat i de ali autori. Pe de alt parte, Koranscky (1964) a semnalat accelerarea eliminrii HCH prin administrare de fenobarbital. Cercetnd efectul comparativ al fenobarbitalului i DDT ca inductori, Matsumura a constat c ultimul are eficien mai mare. Administrndu-se i alte barbiturice (heptabarbital) sau alte medicamente (amidopirin, fenilbutazon, tolbutamid) s-au observat efecte inductoare, dar mai slabe.
45
Ecotoxicologie
Privitor la mecanismul prin care se produce scderea depozitelor de organoclorurate prin pretratament cu DDT sau medicamente, exist dou posibiliti: - mecanism de inducie enzimatic, fiindc DDT este un inductor recunoscut. Morello a demonstrat c administrarea de DDT stimuleaz propriul su metabolism in vitro i c efectul este parial nlturat prin puromicin. Totui s-a constatat numai blocarea parial a mobilizrii dieldrinului de ctre DDT prin administrare de inhibitori ai sintezei proteice, ceea ce presupune i un alt mecanism; - deplasarea dieldrinului de pe proteine. nc Brodie a semnalat deplasarea unei substane cu caracter acid de pe receptori sau de pe proteinele de transport, de ctre o alt substan cu afinitate mai mare pentru aceste proteine. Aceeai competiie pentru numrul limitat de receptori ar putea exista i n cazul DDT fa de dieldrin. DDT poate aciona prin deplasarea dieldrinului din: proteinele plasmatice (responsabile pentru solubilizarea i transportul spre alte esuturi i/sau din proteinele hepatice (care leag de asemenea aceti compui). Dieldrinul deplasat este pus la dispoziia enzimelor microzomale, a cror activitate a fost accelerat de efectul inductor al DDT. Aceast ipotez ar explica: faptul c inductori activi, ca fenobarbitalul, dar fr afinitate crescut pentru proteinele plasmatice ca DDT, manifest efect inductor mai redus dect acesta; constatarea c inhibitori ai sintezei proteice (puromicina) blocheaz doar parial mobilizarea dieldrinului de ctre DDT. Mai recent Pearl (1972), studiind eliminarea dieldrinului din depozite, a folosit n paralel cu DDT, un inductor nou, derivat al tiouracilului; determinnd radioactivitatea 14C de la dieldrin a gsit, sub efect inductor, radioactivitate crescut, datorit probabil unor metabolii ai dieldrinului mai oxigenai, mai polari i deci mai uor excretabili. Este interesant de semnalat comportarea oarecum aparte a DDT, care poate influena activitatea enzimelor microzomale, fie prin stimulare, fie prin inhibare, n funcie de specie. n 1963 Hart i Fouts au raportat stimularea metabolismului hexobarbitalului de ctre DDT la obolan. Conney i muli ali autori au confirmat rezultatul la alte mamifere. n 1967 Peakall a extins cercetrile la psri i a observat creterea metabolizrii steroizilor n microzomii hepatici la porumbel. Dimpotriv, Bitman (1971) apoi Sell (1972) au gsit inhibarea competitiv a unor enzime microzomale (ca anilinhidroxilaza) la pitpalacul japonez (Coturnix japonica) sub aciunea DDT. Comportarea diferit a acestei psri fa de obolan s-ar putea explica prin diferene ntre specii n rata i/sau calea de metabolizare a DDT; probabil c aceast pasre formeaz mai uor dect obolanul, izomerii o, p/ ai DDT. Concomitent cu scderea activitii enzimei s-a semnalat creterea concentraiei cit. P450 ceea ce denot c nu exist totdeauna un paralelism ntre comportarea celor dou componente ale sistemului de transfer de electroni, n cazul administrrii DDT. S-a aplicat stimularea metabolizrii prin inducie la reducerea depozitelor de pesticide organoclorurate, att la animalele domestice, ct i la persoanele din populaia general sau expuse profesional. Depozitarea organocloruratelor n esutul adipos al animalelor, consecin a liposolubilitii, este un fenomen larg rspndit, rezultnd din contaminarea mediului (furaje etc.) cu reziduuri de pesticide. ntruct insecticidele stocate trec n laptele (au fost detectate 0,05-0,26 ppm DDT) i carnea animalelor, constituind o surs de contaminare pentru om, s-au ncercat diferite procedee, fie de a micora absorbia intestinal, fie de a mobiliza toxicul din esutul adipos. Mobilizarea s-ar realiza prin reducere esuturilor adipoase cu substane stimulatoare ale tiroidei, printr-o perioad de post (ambele neeconomice i chiar periculoase) sau prin administrarea unor inductori. Astfel, pentru reducerea depozitelor de dieldrin au dat rezultate mulumitoare DDT i fenobarbitalul, care au accelerat eliminarea substanei nocive. Se recomand totui mult pruden n folosirea tratrii cu inductori ca o practic curent, la animalele domestice, pentru c ei afecteaz toxicitatea altor substane (organofosforice i carbamai) cu care se pot gsi n contact animalele tratate cu inductori. Ori, dac toxicitatea unor organofosforice scade prin inducie la altele crete. n plus, dac inductorii
46
Ecotoxicologie
intervin n fixarea organocloruratelor pe proteine, pot interveni i alte efecte secundare, n prezent nelmurite. ncercrile pe om s-au dovedit destul de satisfctoare. Davies a constatat reducerea masiv a DDE n snge i esutul adipos la un grup de deficieni mintal tratai cu fenobarbital i difenilhidantoin. Acelai rezultat este obinut de Watson la pacienii spitalizai, deficieni mintali, tratai cu anticonvulsivante (fenobarbital, difenilhidantion), tranchilizante i sedative. Se observ scderea DDE i DDT la toate grupele, dar reducerea este maxim la grupa tratat cu fenobarbital + difenilhidantoin i minim la tranchilizante + sedative. Scderea mai mare a coninutului sanguin de DDE i DDT dup fenobarbital + difenilhidantoin i fenobarbital + difenilhidantoin + sedative s-ar putea explica astfel: - fixarea acestor medicamente pe proteine, dislocuind pesticidele i grbind catabolizarea i eliminarea lor; - asocierea fenobarbital + difenilhidantoin determin o inducie mai puternic, permind metabolizarea mai rapid a DDT. Este de presupus c exist o enzim microzomal hepatic specific pentru metabolizarea DDT. Acest mecanism de detoxicare ar fi indus ntr-o mai mare msur de combinaia fenobarbital + difenilhidantoin. Oricare ar fi mecanismul implicat, s-a pus n eviden la om capacitatea fenobarbitalului i difenilhidantoinei, i n mai mic msur a tranchilizantelor i sedativelor, de a scdea nivelul seric al pesticidelor organoclorurate. Aceste rezultate ar deschide perspectiva tratrii cu inductori a persoanelor care au primit doze excesive de organoclorurate. Un aspect aparte al influenei pesticidelor asupra mediului biotic l reprezint instalarea rezistenei unor insecte la organoclorurate i n special la DDT. Dup concepia clasic, singura responsabil de instalarea rezistenei la DDT la musca de cas (Musca domestica), era adaptarea n timp a DDT-dehidroclorinazei (DDT-az), enzima care detoxific DDT la DDE. Aceast opinie se baza pe observaia c la cteva rase de musc rezistente la DDT s-au gsit nivele crescute de DDT-az, sugernd existena i a altor mecanisme n producerea rezistenei; un rol deosebit revine i induciei enzimelor oxidative microzomale. Metabolizarea DDT la musc (i alte insecte) are loc cel puin pe dou ci paralele: formarea DDE sub aciunea DDT-azei i hidroxilare microzomal. La mai multe insecte enzimele microzomale pot fi induse. La rasele rezistente (Fc, P2 /sel) ale mutei de cas, dieldrinul stimuleaz hidroxilaza microzomal a heptaclorului, naftalenului, aldrinului i DDT. De asemenea DDT i accelereaz propriul metabolism, pe cnd la rasele sensibile (Ns, P2) inducia nu are loc. Un alt fenomen frecvent ntlnit este rezistena ncruciat; de ex. rasa Fc este rezistent la DDT i diazinon i puin rezistent la piretrin. Agosin consider c rezistena ncruciat poate fi explicat prin metabolizare microzomal a compuilor neasemntori printr-un mecanism comun, de obicei hidroxilare. Capacitatea pesticidelor organoclorurate de a-i stimula metabolismul propriu, ca i biotransformarea altor pesticide, prin enzime microzomale, sugereaz c rezistena i rezistena ncruciat aprut la insecte dup ce au fost stropite cu diferite substane chimice poate rezulta, n parte, din inducia enzimelor care detoxific aceste substane n microzomii insectelor. 3.2.3.2. Pesticidele organofosforice n timp ce efectul nociv potenial al organocloruratelor rezid n special n capacitatea de depozitare n esuturi, la majoritatea organofosforicelor, pericolul este reprezentat de marea lor toxicitate pentru om i mamifere. Spre deosebire de organoclorurate, ele nu stimuleaz, ci inhib metabolizarea microzomal; ns biotransformarea lor poate fi influenat de unii inductori. nc din 1954 Ball a observat la obolan, protejarea cu aldrin, de efectul toxic al parationului; dup pretratament timp de 4 zile cu aldrin, toxicitatea parationului (oral i i.v.) a
47
Ecotoxicologie
sczut de 7 ori. Ulterior s-a constatat c inductori din diferite clase afecteaz toxicitatea insecticidelor organofosforice. Pretratamentul cu fenobarbital reduce toxicitatea multor organofosforice. Astfel Brodeur a observat scderea toxicitii malationului i EPN (o-p nitrofenil-fenilfosfonotionat) la obolanul femel. Aceleai efecte sunt semnalate de Dubois la obolanul femel i oarecele mascul pentru mai multe organofosforice din categorii diferite. Face excepie Schradanul (OMPA), cci prin inducie se accelereaz formarea unui metabolit mai toxic. Efectul negativ este observat i la dimetoat (rogor) (DL50 198 mg/Kg pentru martori i 58 mg/Kg pentru animalele tratate). Alte medicamente inductoare (tolbutamid, clociclizin) dau rezultate asemntoare fenobarbitalului. A fost studiat efectul pretratamentului cu organoclorurate, n special DDT, aldrin, dieldrin, administrate pe diferite ci. S-a observat protejarea prin inducie pentru paration, TEPP, DFD, nu ns pentru Schradan. Concomitent, activitatea unor enzime microzomale (odemetilaz, etc) a crescut de cteva ori. Pe baza observaiei c obolanii sunt mai rezisteni dect femelele la paration i c testosteronul crete rezistena femelei, pe cnd estronul scade rezistena masculului, s-a ncercat detoxicarea unor pesticide cu hormoni steroizi sintetici i s-au obinut rezultate favorabile n cazul etionului, EPN, parationului. 3.2.3.3. Alte pesticide Mai recent se dovedete c i metabolismul altor pesticide poate fi influenat de inductori. Astfel, semiviaa plasmatic a fungicidului clorur de metilmercur este n mod normal de 70 de zile, la om, dar ea este semnificativ sczut i excreia biliar crescut, la obolanii i oarecii crora li s-a administrat fenobarbital, concomitent cu rini neabsorbabile politiolice (pentru a reine metilmercurul rentors prin bil n intestin). 3.2.4. Substanele cancerigene 3.2.4.1. Substanele cancerigene din mediu. n 1775 Pott a raportat primul caz de cancer datorat unui agent din mediul nconjurtor cancerul scrotal al hornarilor. De atunci numeroase substane din mediu au fost identificate drept cancerigeni. De obicei ei nu se gsesc izolai, ci n amestec complex, n aerul urban poluat, n fumul de igar, n produi derivai din gudroanele crbunelui sau petrolului, sau chiar n alimente (tabelul 8). Cei mai rspndii carcinogeni aparin claselor: hidrocarburi policiclice; micotoxine; nitrozamine; colorani aminoazoici. Hidrocarburile policiclice cancerigene sunt prezente n fumul de igar (poluare personal) i n aerul poluat urban (poluare general). n acest din urm caz provin din arderea incomplet a combustibililor solizi (crbune) sau lichizi (benzin, etc.), din pulberile rezultate din erodarea stratului de gudron de pe osele etc. Ele au n general structuri antracenice, fenantrenice, colantrenice, cu 4-5 cicluri condensate. Introducerea de nuclee i/sau radicali metili n anumite poziii crete potenialul cancerigen. Sunt ntlnite mai frecvent urmtoarele hidrocarburi cancerigene: 1,2,benzantracen; 1,2,5,6,- dibenzenantracen; 9,10- dimetil- 1,2-benzantracen; benz(a)piren; derivai ai 3,4-benzfenantrenului; colantren; 3-metilcolantren.
Tabelul 8. Substane cancerigene din alimente (dup Champton) Compusul Alimentul Originea luteoskirin orez specii de Penicillium cicloclorotin orez specii de Aspergillus
48
Ecotoxicologie aflatoxine ergot cicasin seleniu hidrocarburi policiclice nitrozamine safrol alcaloizi pirolizidinici arahide, cereale secar nuc de cicasin plante de nutre numeroase plante alimente vegetale condimente cereale
Maria Prisecaru, Roxana Voicu specii de Aspergillus Claviceps origin vegetal natural sol origin vegetal natural sintez bacterian origin vegetal natural specii de Seneccio
Caracteristicile acestor hidrocarburi de a fi stabile n atmosfer, persistnd un timp suficient pentru a fi absorbite pe particule de funingine, permind inhalarea i depozitarea pe epiteliul cilor respiratorii le face deosebit de periculoase. Drept indicator al polurii atmosferei urbane a fost selecionat benz(a)pirenul, a crui aciune cancerigen este cert i de mult timp cunoscut. O serie de cercettori au stabilit ca medie a aerului urban cifra de 6 g benz(a)piren la 1000mc. Concentraia variaz mult n funcie de sezon, i evident de regiune. O statistic n diferite orae ale lumii au artat valori extreme de 0,5-27 g/1000 mc vara i 6-390 g/1000 mc iarna. n tabelul 9 este prezentat coninutul n benz(a)piren n atmosfera unei zone din jurul oraului Osaka, cuprinznd zone puternic industrializate. Tabelul 9. Poluarea atmosferei cu benz(a)piren (dup Hitosugi, cit. de Carnow) Gradul de poluare Poluant slab mediu intens benz(a)pirenul g/1000 mc 26 31 79 Corelarea nivelului benz(a)pirenului cu incidena cancerelor pulmonare este cert: o cretere de 1 g/1000 mc determin sporirea cu 5% a mortalitii prin cancer pulmonar. Aflatoxinele i n special aflatoxina B1, sunt cele mai bine studiate dintre micotoxine. Din cei 120 fungi toxigeni, 40 sunt productori de aflatoxine. Denumirea de aflatoxin apare n 1962 i a fost dat dup numele fungului Aspergillus flavus ( Link ex Fries), izolat din fina de arahide mucegite, ns mbolnvirile produse la animalele hrnite cu furaje mucegite au fost semnalate nc naintea acestei date. S-a constat apoi c, n afar de A. flavus, i alte mucegaiuri, att din genul Aspergillus, ct i Penicillium, Mucor, Rhisopus etc, produc aflatoxine. Structura aflatoxinelor este cumarinic, cu dou inele furanice i un inel ciclopentanoic (la derivaii B) sau o lacton (la derivaii G). Compuii B2 i G2 difer de B1 i G1 prin hidrogenarea dublei legturi a nucleului furanic exterior. Aflatoxinele M1 i M2 sunt derivai hidroxilai ai compuilor B1 i B2. Principalele date privitor la aflatoxine sunt prezentate n tabelul 10. Aflatoxinele au o mare activitate biologic: toxicitate pe termen scurt (DL50 aprox. 1 mg/Kg pentru majoritatea speciilor), cancerogenitate i teratogenitate la unele specii. Marea frecven a cancerului hepatic n unele regiuni din Africa a fost observat n 1950, dar aflatoxina nu a fost considerat ca factor etiologic posibil dect dup 1965. n 1973 Peers a determinat cantitatea de aflatoxin ingerat (3,4-14,8 mg/zi) ntr-o regiune din Kenya i a corelat-o cu incidena cancerelor hepatice la populaia corespunztoare, apreciat la 525/100.000/an. Faptul c aflatoxinele pot contamina aproape toate alimentele, iar decontaminarea lor este dificil i c dei dezvoltarea mucegaiurilor toxigene este maxim n regiunile subtropicale, poate avea loc i n regiunile cu clim temperat, arat riscul deosebit prezentat de acestea. Nitrozaminele au toxicitate slab sau mijlocie (DL50 200-2000 mg/Kg) dar potenial carcinogen crescut. Producerea leziunii maligne este datorit formrii prin metabolizare a radicalilor organici.
49
Ecotoxicologie
Aciunea cancerigen a dimetilnitrozaminei a fost semnalat de Barnes i Magee (1954). n 1961 Koppang a observat afeciuni hepatice grave la vite hrnite cu fin de pete conservat cu nitrii. Acelai efect s-a produs la oi (specie foarte sensibil la nitrozamine) prin administrarea de dimetilnitrozamin. n diet, 2-3 ppm dimetilnitrozamin a provocat hepatoame la obolan. Ulterior i alte nitrozamine s-au dovedit cancerigene pentru mai multe specii animale: unele au i efect teratogen. Tabelul 10. Caracteristicile aflatoxinelor (dup Austwick) micotoxine derivai cumarinici: aflatoxinele B1 ,B2, G1, G2, M1, M2 specia de fungi Aspergillus flavus; Aspergillus parasiticus specia animal afectat om; psri de curte; porci; bovine; animale de laborator (obolan, cobai) sistem sau organ afectat ficat, apoi rinichi, creier preferenial toxicoza hepatit; ciroz; sindromul Reye; encefalopatie; hepatoame 1960 data depistrii primelor cazuri suspecte arahide; cereale; semine de bumbac; morcovi; fasole; nuci de surse (principale i secundare) cocos; carne; lapte; brnz concentraii maxime gsite n aliment conc. (ppm) alimente fine de arahide 10,5 morcovi (mucegii) 4,5 preparate din sem. de bumbac 0,12 gru 0,007 vin 0 localizare rspndire posibil n ntreaga lume; se cunosc cazuri la vite n Anglia iar la om n Uganda, Tailanda, Kenia, India, Germania, Frana. Dei experimentrile s-au fcut cu doze mult n exces fa de cele prezente n alimente, riscul posibil la om nu este exclus. Nitrozaminele au fost detectate n cantiti de ordinul microgramelor (1-10 g/Kg) n unele alimente n special tratate (unc, brnz etc). Se tie c adaosul de nitrii este legiferat ca aditiv alimentar n numeroase ri, pentru produse de carne, conserve de pete i unele brnzeturi, n proporie de 60-120 mg/Kg produs. Aminele secundare se gsesc n mici cantiti n mod normal n aceste produse. Au fost identificate nitrozamine i n fina din gru. Mici cantiti sunt prezente n fumul de igar i desigur n carnea afumat. De asemenea s-a detectat 4-etilnitrozamina-benzaldehid n plante din genul Cicada i n unele ciuperci comestibile. Dup Marquardt apariia nitrozaminelor este posibil n alimente numai dac nitritul de sodiu depete 1 mg/Kg produs. Nitrozaminele pot lua natere i direct n organism, prin interaciunea dintre nitrii i aminele secundare din alimente, la pH-ul acid din sucul gastric. Dup Drucurey (1963), la obolan cantitatea limit de dietilnitrozamin necesar pentru apariia efectului cancerigen este 70 g/Kg corp. Ulterior Sander (1967) a artat c se pot forma nitrozamine in vitro, cnd se trateaz nitrii cu amine secundare n prezena sucului gastric. Ar fi suficiente cantiti de 0,03-6,15 mg% NO2 (frecvent ntlnite n produsele alimentare) pentru a intra n reacie cu aminele secundare prezente n aliment. S-ar putea forma nitrozamine i la pH aproape neutru, dac concentraiile de nitrit i dietilamin sunt crescute. Cercetrile lui Galea i colab. au pus n eviden n produse din carne tratate cu cantiti reglementare de nitrit (120 mg nitrit de sodiu/Kg produs) valori pn la 6 mg nitrit/100g. Cu toate c pn n momentul consumrii aceste valori se reduc apreciabil, ele se menin totui peste 1 mg% (valoare critic pentru formarea nitrozaminelor n mediu acid). Consumul
50
Ecotoxicologie
produselor din carne fiind de obicei de 50-100 g (la o mas) rezult c n stomac s-ar gsi suficient nitrit pentru ca n prezena aminelor secundare s dea natere la nitrozamine. n plus, lucrrile lui Drckrey arat aciunea sumativ cantitativ a dietilnitrozaminei la obolan: dac la doza de 9,6 mg/Kg 50% din animale au prezentat hepatoame n 105 zile (t50), la doza de 2,4 mg/Kg ar corespunde un t50 de 416 zile; ori, el a fost scurtat la numai 192 zile. Prin urmare aciunea dozelor mici de dietilnitrozamin se nsumeaz i nu dispare cu timpul, ca n cazul substanelor necarcinogene. Produsele cu coninut de nitrii fiind de larg consum, ingerarea lor zilnic prezint un potenial nociv cu att mai crescut, cu ct cantitatea de nitrit este mai mare. Coloranii aminoazoici sunt derivai ai azobenzenului, necarcinogen. Introducerea gruprilor NH2 sau NR2 n poziia para, determin apariia potenialului carcinogen, n diferii compui (4-aminoazobenzen, 0-aminoazotoluen). 3.2.4.2. Efectele induciei asupra unor substane cancerigene. Hidrocarburile aromatice policiclice, aflatoxinele, nitrozaminele, coloranii aminoazoici, ca i alte structuri cu potenial carcinogen din mediul nconjurtor, sunt metabolizate de sistemele enzimatice microzomale. S-au pus n eviden, n microzomii hepatici, hidroxilaza benz(a)pirenului, N-demetilaza-dimetilnitrozaminei, N-demetilaza coloranilor azoici. Aflatoxina B1 se poate metaboliza pe 5 ci diferite, toate conducnd la derivai hidroxilai 4 din aceste ci au loc sub aciunea enzimelor microzomale, ceea ce explic faptul c metabolismul ei poate fi stimulat de anumii inductori. Pe de alt parte, hidroxilaza benz(a)pirenului a fost identificat i n alte organe. Prin urmare factorii care influeneaz prin stimulare sau inhibare aceste sisteme enzimatice, pot avea importan n apariia cancerului la om. Hidroxilaza benz(a)pirenului este stimulat prin inducie de benzen(a)pirenul nsui, de alte hidrocarburi aromatice cancerigene i de ali inductori (fenobarbital etc). Inducia a fost observat n ficat, plmn, tract gastro-intestinal, rinichi, piele i placent, la obolan. Stimularea s-a reflectat n accelerarea metabolizrii, cu creterea eliminrii biliare a metaboliilor i scderea concentraiei tisulare i sanguine a benz(a)pirenului: de ex. la 24 are dup o doz unic, concentraia n esutul adipos a fost de 250 ng/g i a sczut la 24 ng/g dup 7 doze zilnice. Mai muli cercettori au studiat efectul fumului de igar asupra hidroxilazelor substanelor cancerigene. S-a constatat c are loc stimularea activitii hidroxilazei benz(a)pirenului, la obolan, n plmn, placent, intestin i ficatul matern i fetal, demonstrndu-se astfel c substanele inductoare din fum strbat placenta, ajungnd la fetus. Un studiu interesant a evideniat o deosebire marcat ntre activitatea (sczut sau absent) a hidroxilazei benz(a)pirenului i a N-demetilazei coloranilor aminoazoici n placenta nefumtoarelor i activitatea mult crescut a ambelor enzime, la fumtoare (Conney, tabelul 11). Tabelul 11. Efectul fumului de igar asupra activitii hidroxilazei Benz(a)pirenului n placenta uman (dup Conney) Hidroxi-benz(a)piren Grupul Nr. persoane ng/g/h nefumtoare 32 105 fumtoare 37 5270 Exist ns o mare variabilitate n intensitatea stimulrii hidroxilazei benz(a)pirenului chiar n cadrul grupei fumtoarelor cu acelai numr de igri pe zi. Astfel, la 13 femei care au fumat n timpul sarcinii cte 15-20 igri pe zi s-au gsit valori ale hidroxilazei benz(a)pirenului format n placent prin inducie, ntre 240 i 17.000 ng/g/or, deci creteri de 70 de ori. Variabilitatea este datorit factorilor genetici. Aceast variaie, att a activitii bazale ct i dup inducere, a hidroxilazei n diferite esuturi umane, poate constitui o metod de depistare a diferenelor genetice n privina concentraiei enzimelor de metabolizare a carcinogenilor, la diferite persoane.
51
Ecotoxicologie
Fumul de igar, prin coninutul su n substane carcinogene, accelereaz metabolismul nu numai al carcinogenilor, ci i al unor alcaloizi i medicamente. Astfel, la om, tolerana la nicotin observat la fumtori se explic prin stimularea metabolismului nicotinei. Fumtorii de marijuana metabolizeaz 9-tetrahidro canabinolului mai rapid dect nefumtorii. Fumtorii de tutun crora li s-a administrat fenacetin prezint concentraii plasmatice ale acesteia mai sczute dect nefumtorii etc. Metabolismul aflatoxinei poate fi accelerat prin inducie enzimatic de aflatoxina nsi (prin autoinducie), ca i de ali inductori. S-a administrat la dou loturi de cte 20 de obolani, timp de 9 sptmni, o diet coninnd aflatoxin i respectiv aflatoxin + fenobarbital. La 18 luni dup nceperea tratamentului, un singur animal a supravieuit din primul lot i 11 din al doilea. Cei care au sucombat prezentau tumori hepatice masive, demonstrnd efectul carcinogen al aflatoxinei. Un estrogen sintetic (dietilstilbestrolul) a determinat descreterea semnificativ a tumorilor hepatice cauzate de aflatoxin. Rezultatul este n acord cu observaia c obolanul mascul este mai sensibil, pe cnd femela este protejat mpotriva aciunii cancerigene a aflatoxinei, ceea ce presupune o implicaie hormonal. DDT adugat n dieta obolanilor hrnii cu aflatoxin, scade efectul cancerigen. Aceste rezultate par a demonstra c aflatoxina este ea nsei un agent toxic i cancerigen i c este transformat prin enzimele de hidroxilare, n metabolii mai puin nocivi. Tratamentul cu inductori a stimulat la animal i detoxicarea altor carcinogeni, mpiedicnd apariia cancerelor. -3-metilcolantrenul (i alte hidrocarburi cancerigene) stimuleaz metabolismul coloranilor aminoazoici i 2-naftilaminofluorenului la metabolii necancerigeni; - hidrocarburile policiclice sau derivai aminoazoici stimuleaz enzimele hepatice de metabolizare a 9,10-dimetil, 1,2-benzantracenului; - fenobarbitalul stimuleaz enzimele de hidroxilare a benz(a)pirenului n derivai necarcinogeni; -3-metilcolantrenul sau 1,2-benzantracenul previn formarea tumorilor datorit 4dimetilaminostilbenului, dar nu se cunoate efectul acestora asupra metabolismului substanei. Capacitatea unei substane de a mpiedica formarea cancerelor de ctre carcinogeni, la animal, a deschis teoretic perspectiva profilaxiei cancerelor generate la om de carcinogenii din mediul nconjurtor (hidrocarburi policiclice) sau din mediul de munc (colorani aminoazoici etc.) prin administrare de inhibitori netoxici. S-au cutat astfel substane care s induc activitatea hidroxilazei benz(a)pirenului n plmn, ficat, tract gastrointestinal. Pentru c metaboliii hidroxilai sunt mai puin cancerigeni dect produsul iniial, persoanele cu nivel crescut de hidroxilaz n diferite esuturi i organe vor fi mai puin sensibile la aciunea cancerigen a hidrocarburilor policiclice. Apare de asemenea posibil ca diferene genetice n inductibilitatea acestor enzime s joace un rol important n sensibilitatea individual la carcinogeni. Unele constatri mai recente par a fi totui n dezacord cu rezultatele favorabile anterioare i anume: - s-a constatat c benz(a)pirenul este mai toxic n celulele cu activitate hidroxilazic crescut dect n acelea cu activitate redus; - metaboliii oxigenai sunt mai citotoxici n cultur, dect benz(a)pirenul; - n timpul oxidrii hidrocarburilor policiclice se formeaz intermediari reactivi de tip epoxid capabili s reacioneze cu ARN sau alte macromolecule ale organismului; - principalul metabolit al aflatoxinei B1, denumit M1, este tot att de nociv ca i produsul iniial. Dealtfel inducia enzimatic nu determin stimularea, n mod egal, a tuturor cilor metabolice ale unui compus, putnd rezulta protejarea sau din contra, accentuarea efectului cancerigen. Compusul 7,12-dimetil-benz(a)antracen se metabolizeaz n derivatul 7hidroximetilat (agent adrenocorticolitic activ) i n derivai 12-hidroximetilat i hidroxilai la nucleu (inactivi). Pretratamentul cu 3-meticolantren (sau alte hidrocarburi policiclice)
52
Ecotoxicologie
stimuleaz preferenial calea hidroxilrii la nucleu, conferind protecie mpotriva carcinogenitii. Acelai efect este obinut prin pretratament cu fenobarbital, dar pe cale diferite, pentru c derivatul 7-hidroxi-metilat este hidroxilat n continuare la 7,12-dihidroxi-metilbenz(a)antracen i ali produi inactivi. De asemenea, hepatocarcinogenul 2-acetilamino-fluoren este metabolizat prin hidroxilare la 3 metabolii: 5-hidroxi, 7-hidroxi i N-hidroxi-2acetilamino-fluoren, numai ultimul fiind carcinogen. Pretratamentul cu aceast acetanilid stimuleaz preferenial formarea compuilor 5- i 7- hidroxi, deci previne formarea cancerelor i dimpotriv, administrarea prelungit a 2-acetilamino-fluorenului determin autoinducie, cu accelerarea cii de formare a metabolitului nociv, N-hidroxi-2-acetilaminofluoren. Aceste exemple demonstreaz posibilitatea stimulrii unor ci metabolice minore, putnd conduce la metabolii cancerigeni. n fine, sunt cazuri cnd carcinogenii sunt produi, numai prin metabolizare, din compui nenocivi. Astfel, din N-oxidarea unor arilamine rezult derivai N-hidroxilai sau/i nitrozoderivai, carcinogeni. Inducia stimuleaz formarea acestor metabolii, ceea ce poate corespunde cu creterea carcinogenitii n unele organe. S-a constatat c pretratamentul cu fenobarbital stimuleaz N-hidroxilarea microzomal a 4-amino-bifenilul (un carcinogen vezical la cine) i de asemenea formarea metaboliilor carcinogeni ai 2-naftilaminei i anume 2nitrozonaftalen (carcinogen vezical la cine). 3.3 INTERACIUNEA SUBSTANELOR EXOGENE (INDUCTORI) CU CONSTITUENI NORMALI AI ORGANISMULUI 3.3.1. Poluani cu aciune estrogenic Cercetrile lui Conney privind aciunea insecticidelor organoclorurate asupra estrogenilor au dus la constatarea surprinztoare c DDT tehnic i o,pDDT (un component la acestuia) posed activitate estrogenic la obolan, apreciat ca 1/10000 din cea a 17-estradiolului. Ali autori au confirmat aceste rezultate cu alte specii animale. DDT tehnic sau o,pDDT determin creterea greutii uterului la obolance imature, dar DDT purificat, ca i ali metabolii (p,pDDD, m,pDDD, o,pDDD, p,pDDE) au dat aceleai rezultate. ntruct se obine creterea greutii uterului la obolance adulte ovariectomizate, se deduce c aciunea nu are loc prin intermediul ovarelor. DDT tehnic administrat naintea injectrii de 17--estradiol marcat i inhib fixarea la uter in vivo, probabil prin competiie pentru situsurile care leag 17--estradiolul. La obolanii tratai cu un inhibitor al metabolizrii medicamentelor (de ex. CCl4) aciunea uterotropic a DDT tehnic i o,pDDT este inhibat, demonstrnd c stimularea uterin depinde de metabolizarea substratelor n metabolii, probabil hidroxilai, cu activitate estrogenic. Asemntor 17--estradiolului, administrarea de o,pDDT determin creterea glicogenului, a sintezei ARN, a activitii unor enzime glicolitice i a untului hexozomonofosfat n uterul obolancelor ovariectomizate i de asemenea aceste efecte sunt blocate de actinomicin i cicloheximid. Bitman a studiat ali 52 de compui frecvent ntlnii n mediul nconjurtor i a pus n eviden o slab aciune estrogenic la substane cu urmtoarele structuri: difenilmetan, difeniletan i trifenilmetan (cnd poziiile p i p sunt fie neocupate, fie ocupate cu oxidrili sau grupri metoxi); difenili i trifenili policlorurai; fenolftalein. 3.3.2. Efectele contaminanilor din mediu asupra reproducerii Nu se cunoate ntreaga semnificaie, pentru sntatea public i pentru vieuitoare, a polurii mediului cu inductori enzimatici ai hidroxilazelor steroizilor i cu substane cu aciune slab estrogenic (analogi ai DDT, difenili i trifenili policlorurai, alte insecticide clorurate), totui exist unele date certe.
53
Ecotoxicologie
Efecte asupra psrilor. Dispariia unor specii de psri n Europa i America de Nord a fost atribuit folosirii anumitor pesticide organoclorurate. S-a observat, iniial la psri rpitoare i ulterior i la psri de ap, o serie de simptome, reunite sub denumirea de Raptor-Pesticide Syndrome, constnd din: - mperechere anormal de trzie; - depunerea unei singure serii de ou i n numr mai redus dect obinuit; - fragilitatea cojii, ceea ce provoac spargerea oulor n timpul clocitului; - mortalitate embrionar crescut. La baza majoritii acestor fenomene stau modificrile n metabolismul hormonilor steroizi sub aciunea inductoare a unor pesticide. La psri la care s-a administrat DDT s-a pus n eviden: - scderea estradiolului n snge, consecin a alterrii metabolizrii n microzomii hepatici. Concentraia sczut a hormonilor explic mperecherea i depunerea oulor tardiv, ca i imposibilitatea de a oua din nou, dup pierderea primei serii. - subierea cojii oulor i spargerea frecvent sunt rezultatul inhibrii carbonic-anhidrazei de ctre DDT i metaboliii si. Aceast enzim controleaz hidratarea CO2 i este deci implicat n secretarea cojii calcaroase a oului (se tie c inhibarea enzimei de ctre sulfanilamid determin coji de ou slab calcifiate). Inhibarea carbonicanhidrazei este specific anumitor organoclorurate (de ex. dieldrinul nu o afecteaz). Pe de alt parte, depozitarea calciului n medulara osoas este controlat de 17--estradiolului. Ori, stimularea metabolismului estrogenic sau ocuparea situsurilor de legtur a acestora, de ctre estrogeni slabi, ca metabolii ai DDT, contribuie de asemenea la formarea defectuoas a cojii oului. Pe lng efectul nociv, n prezent recunoscut, asupra reproducerii unor specii de psri, al reziduurilor de DDT, PCB (difenili policlorurai), etc. se adaug i efectul reziduurilor organomercurice. Fungicidele organomercurice (de tip clorur de metilmercur) cunosc o utilizare relativ redus, n agricultur, la tratarea seminelor. Acestea sunt consumate de psri mici, care la rndul lor constituie hrana psrilor de prad, contaminndu-le oule. Amploarea efectelor nocive asupra organismelor atribuite organomercuricelor nu s-ar justifica, pentru c ele reprezint doar un procent mic din cantitatea total a mercurului eliminat n mediu. Cercetri relativ recente au pus n eviden capacitatea bacteriilor metanogene de a metila ionul mercuric prin transferul gruprii metil de la metilcobalamin. Transferarea ionului mercuric n metilcompui ar explica aciunea neurotoxic, mutagen i teratogen observat la organismele inferioare. Efecte asupra mamiferelor. La cinii de vntoare administrarea de p,pDDT (6-12 mg/Kg) sau aldrin (0,15-0,30 mg/Kg), 5 zile pe sptmn timp de 14 luni, determin efecte nocive asupra reproducerii, att la masculi ct i la femele. Clordanul scade fertilitatea la obolani i oareci femele iar aldrinul produce perturbri ale ciclului la obolan. Heinrichs a observat, dup injectare cu o,pDDT la obolan, modificri hormonale asemntoare sindromului ovarian polichistic i sterilitii descrise la femele. El consider c prezena de DDT n mediul fetusului i al noului nscut poate juca un rol n dezvoltarea sindromului amintit, la om. Totui, doza folosit n experiment a fost masiv i nu s-a determinat doza minim necesar pentru declanarea dezvoltrii anormale a sistemului de reproducere. Efectele asupra omului. Rezultatele a numeroase cercetri indic deci c multe substane chimice din mediu, ca i unele medicamente, stimuleaz hidroxilarea steroizilor i modific proporia relativ a metaboliilor lor, la om. Pe de alt parte, s-au semnalat tulburri de reproducere la unele psri i mamifere. De asemenea, inductorii afecteaz i metabolismul steroizilor sintetici, ceea ce ar putea influena utilizarea contraceptivelor. Totui, n prezent nu se poate afirma c poluani din mediu ar duna homeostaziei steroizilor la om, cci nu se tie dac nu se produce creterea sintezei steroizilor n compensarea accelerrii metabolizrii i dac aceste enzime microzomale sunt efectiv limitante. 3.4. NOIUNI PRIVIND INHIBIIA
54
Ecotoxicologie
Inhibitorii ntrzie metabolizarea unor substane, crescndu-le concentraia plasmatic i prelungindu-le sau potenndu-le aciunea. Aceste efecte se datoresc: - inhibiiei competitive a acelorai enzime sau a cofactorilor; - inhibiiei sintezei enzimelor; - ncetinirea activitii enzimelor. Prima observaie asupra inhibiiei a fost fcut de Axelrod, Brodie i colab., care au gsit c somnul barbituric a fost crescut de 5 ori la obolanii care au primit SKF525-A. Explicaia const n efectul inhibitor al acestuia asupra enzimelor microzomale care transform hexobarbitalul n produi inactivi farmacologic. O clas de inhibitori ai metabolizrii substanelor exogene o formeaz unele substane organice de sintez fr activitate farmacologic. Reprezentantul cel mai important este SKF525A, acetat de -dietil-aminoetil-(difenilpropil), experimentat nc din 1952 de Macko.
C6H5 C6H5 C CH2 CH2 CH3 SKF525-A

n ceea ce privete mecanismul efectului de potenarea asupra acestor medicamente, s-a stabilit c nu este influenat nici de secreia renal, nici sensibilitatea receptorilor pentru medicament, (pentru c nivelul plasmatic rmne neschimbat, cu sau fr potenializator). Prin urmare, efectul de potenare are loc n faza de biotransformare, posibil prin mpiedicarea fixrii substanelor n reticulul endoplasmatic. Mecanismul intim este mai puin cunoscut, dar se consider c nu au loc interferene ale SKF525-A cu citocrom NADPH-reductaza. Alt clas de inhibitori sunt substane cu activitate farmacologic sau toxic ca: - medicamente: iponiazidaza, -fenil-izopropil-hidrazina (catron), nialamida, cloramfenicolul, acidul p, aminosalicilic, meperidina, morfina, etc. - poluani: insecticide organofosforice; pesticide sinergice de tip metilen-dioxifenil i metilendioxinaftil, tetraclorura de carbon, ozonul etc. 3.4.1. Influena metabolismului carcinogenilor Inhibitori ai enzimelor microzomale, ca: tetraclorur de carbon, piperonilbutoxid, SKF525-A, inhib metabolismul hidrocarburilor policiclice cancerigene, potenndu-le toxicitatea acut, la roztoare. De asemenea, alte substane din mediu pot crete carcinogenitatea prin inhibarea enzimelor de detoxicare. Astfel, bezpiren-hidroxilaza se gsete n fraciunea microzomal a numeroase esuturi, inclusiv mucoasa traheobronic i plmnul. Inhibiia acestei enzime favorizeaz carcinogeneza respiratorie, pentru c hidrocarbura cancerigen nu mai este detoxicat. Inhibiia poate fi provocat de poluani atmosferici, cu rol de cocarcinogeni. Astfel, s-a dovedit c ozonul inhib enzima, sczndu-i activitatea cu 50%; dup 24 de ore, activitatea
OOC (CH2)2
N(C2H5)2
55
Ecotoxicologie
revine complet la normal. Este probabil c modificrile biochimice determinate de ozon se datoresc radicalilor liberi. De asemenea, nichelcarbonilul poate interfera n metabolismul benzpirenului, accelernd carcinogeneza (Sunderman). Intensificarea carcinogenezei poate fi produs de substanele nsoitoare din uleiul de petrol sau gudroane de crbuni. Activitatea cancerigen intens a unor uleiuri de petrol procent relativ redus n hidrocarburile policiclice cancerigene, dar coninnd i hidrocarburi alifatice cu lan lung (n-dodecan), decalin, etc. se explic prin efectul cocancerigen al acestora. Efectul potenator al cocancerigenului este cu att mai mare, cu ct concentraia hidrocarburilor policiclice este mai mic, ceea ce este cazul obinuit n practic. n fraciunile de gudroane de crbune, rolul cocarcinogenilor este deinut de fenoli; dup ndeprtarea acestora incidena cancerelor pulmonare determinate de gudroane este sensibil sczut. 3.4.2. Influenarea metabolismului insecticidelor Unii matilen-dioxifenili i metilen-dioxinaftili ca piperonil-butoxidul i sesamexul sunt folosii ca insecticide sinergice pentru c prin inhibarea, la insecte, a enzimelor microzomale de detoxicare a piretrinelor, carbamailor, naftalenului, etc. le poteneaz activitatea i toxicitatea. Diferena dintre eficiena unor insecticide sinergice (piperonilbutoxid, sesamex), care cresc toxicitatea DDT cu un factor de aproximativ 20 i eficiena mult mai slab a altora (de ex. DMC) const n inhibarea de prima categorie a metabolismului oxidativ al DDT, cu creterea producerii de DDE i scderea metaboliilor polari; dimpotriv, DMC influeneaz puin producerea de DDE i de loc formarea metaboliilor polari.
CAPITOLUL IV ACIUNEA TOXICILOR ASUPRA ORGANISMULUI

4.1. ACIUNEA TOXICILOR LA NIVEL MOLECULAR I CELULAR Studii n plin desfurare i n plin progres se preocup de modul n care substana toxic ajuns n organism modific funcii i structuri. Organismul va reaciona ntotdeauna n
56
Ecotoxicologie
prezena unei substane exogene care, de fapt, nu face altceva dect s stimuleze sau s deprime o activitate celular normal, fr ns a crea noi funcii. Aceste tulburri depresive sau de excitaie, n funcie de substana exogen care le perturb, se vor manifesta n diverse grade de intensitate i reversibilitate, ducnd peste anumite doze la dereglri extrem de violente i la o epuizare funcional ireversibil, terminat deseori cu moartea. Dei aceste mecanisme nu sunt complet cunoscute, totui s-au acumulat date suficiente care s permit o explicare a multiplelor forme de aciune a toxicilor asupra organismului i o gradare sistematic a acestor mecanisme. 4.1.1. Aciunea la nivel molecular Mult timp s-a considerat c substanele exogene acioneaz prin procese fizice (de ex. adsorbia) sau chimice (reactivitate chimic). De fapt, proprietile fizice sau chimice nu sunt dect multiplele aspecte cantitative ale aceluiai fenomen: legtura ntre o substan exogen i centrul su de fixare (enzim, receptor). n mod obinuit, interaciunea se realizeaz prin dou puncte de fixare, adesea de tip diferit. Stabilitatea legturii toxic-receptor (sau enzim) este determinat n mare msur de intensitatea energiei necesare realizrii ei. Principalele legturi chimice sunt, n ordinea descrescnd a energiei implicate: legturi covalente, electrostatice (ionice), de hidrogen, coordinative, Van der Waals; intervine adesea i chelatarea, bazat pe legturi electrostatice i coordinative. Legtura covalent necesit 50-150 Kcal/mol. n funcie de elementele participante i de tipul de legtur (simpl, dubl): C O 70 Kcal/mol C = O 150 Kcal/mol CN C=N 94 Kcal/mol 49 Kcal/mol C C 59 Kcal/mol C = C 100 Kcal/mol
Legtura covalent asigur o stabilitate crescut a complexului, de aceea este rar ntlnit n asocieri biologice, fiindc acestea au caracter de reversibilitate. Legtura covalent toxic-molecul biologic este prezent n: - blocarea acetilcolinesterazei de ctre esterii organofosforici i carbamici; - inhibarea aconithidratazei prin fixarea acidului fluorcitric pe centrul su activ; - blocarea gruprilor tiol de ctre arsen i metale grele; n mod excepional, aceast legtur este destul de labil; - fixarea unor antibiotice (penicilin, bacitracin, vancomicin) pe acidul acetilmuramic, indispensabil elaborrii membranei bacteriene, mpiedicnd astfel dezvoltarea bacteriei; - formarea cloraminei, cu legturi covalente ntre clorul din HOCl (rezultat din Cl2 n mediul apos) i gruprile aminice din microorganisme, ceea ce explic aciunea bactericid a clorului; - compuii capabili s elibereze radicali R+ (electrofili) dau legturi covalente cu materialul genetic al celulei sau cu enzimele care controleaz creterea celular etc. Legtura electrostatic (ionic), dei mult mai slab dect covalena, necesitnd doar 5 kcal/mol, asigur suficient stabilitatea compusului format. Totui, complexitatea mediului biologic, permind reacii de interschimb ionic, micoreaz durabilitatea legturii. De aceea ea este adesea consolidat prin legturi de hidrogen sau fore Van der Waals, nct dou molecule pot fi unite la o extremitate prin fore ionice, iar la cealalt prin astfel de legturi. Ionizarea unei substane i poate accentua toxicitatea. De ex: - acridinaza-baz este slab bactericid, dar grefarea unor grupri aminice la nucleu i confer proprieti paraziticide crescute; 9-aminoacridina se gsete sub dou forme mezomere cationice, cu caracter bazic i deci paraziticid accentuat. Toxicitatea pentru parazit este mult crescut prin grefarea suplimentar a unui metil (sau halogen), cnd ionizarea moleculei se mrete;
57
Ecotoxicologie
- nc din 1961 Lerman a demonstrat c 3,6-diamino-acridina se fixeaz ntre dou straturi bazice ale ADN, de care se leag ionic cu acidul fosforic; - de asemenea alte substane (cloromicetina, streptomicina etc), acioneaz toxic prin intercalare n structura macromoleculelor sau ntre straturile acestora, formnd legturi ionice cu diferii componeni ai macromoleculei i periclitnd viaa organismului; - colorani trifenilmetanici (fucsina, verdele Malachit), amine alifatice, compui cuaternari, i mresc toxicitatea prin ionizarea moleculei. Exist cazuri cnd dimpotriv, toxicitatea scade prin ionizarea substanei: - derivai barbiturici ptrund cu att mai uor prin membrana oulor de arici de mare, mpiedicnd diviziunea, cu ct sunt mai puin disociai; - n mod similar, teofilina are aciune cardiotrop la broasca estoas numai sub form de alcaloid-baz; - nitrozaminele se pot forma n organism prin reacia dintre nitrit i amine secundare exogene. Reacia se petrece numai dac amina secundar nu este disociat. n stomac, dei mediul este acid, gradul de ionizare a acestor amine este redus, nct o mare parte din substan rmne nedisociat, putnd da nitrozamine. Legtura de hidrogen se datorete atraciei electrostatice exercitat de perechile de electroni neparticipani de la atomii electronegativi (oxigen, sulf, azot) asupra atomului de hidrogen:
H O H : O H
H O H : N H H
Legtura este slab (2-5 Kcal/mol), putnd fi scindat chiar prin nclzire i nu necesit un contact strns ntre substrat i receptor. Importana sa biologic const n faptul c particip la formarea texturii proteice. Legtura coordinativ implic fixarea unui ion pozitiv la dubletul unui atom cu nveli electronic incomplet. Se produce de fapt o ionizare, ceea ce are importan ndeosebi n cuaternizarea compuilor cu azot teriar, cnd toxicitatea este mrit. Cationii elementelor care dau uor compleci (Cu, Fe, Ni, Hg) formeaz legturi coordinative cu liganzi neutri de tip diamine, heterociclii cu azot, amoniac etc. Legtura Van der Waals este tipul cel mai obinuit de legtur i se realizeaz prin fore slabe (0,5 Kcal/mol) ntre atomii a dou molecule diferite, aflate ntr-un contact strns. n raport cu atomul (H, C, N, O) variaz i intensitatea legturii, pentru H fiind cea mai slab. Acest tip de legtur se consolideaz odat cu creterea greutii moleculare a moleculelor participante, deoarece astfel pot aprea multiple legturi Van der Waals. 4.1.2. Aciunea la nivel celular Toxicii i manifest aciunea, fie la nivelul membranelor, fie n interiorul celulelor. Att membrana celular, ct i membranele organitelor, au o structur asemntoare. Din punct de vedere al interaciunii cu substanele exogene, intereseaz, pe lng rolul n transport, i caracteristica lor de a poseda echipamente enzimatice i receptori fiziologici. Substanele exogene pot aciona asupra membranei modificndu-i dinamica structurii sau chiar edificiul structural, precum i activitatea enzimatic; astfel: - detergenii altereaz structura membranei; - antibioticele polipeptidice (polimixina), unii detergeni ca sruri cuaternare de amoniu cu lanuri lungi etc. distug membrana datorit efectului tensioactiv; - streptomicina se acumuleaz n peretele bacteriei, dilatndu-l i permeabilizndu-l pentru trecerea ulterioar a noi cantiti de medicament; - produsul tensioactiv triron traverseaz cu uurin membrana celular a oarecelui tuberculos i se acumuleaz n lizozomi, elibernd din acetia o lipid antituberculoas;
58
Ecotoxicologie
- florizina inhib reabsorbia tubular a glucozei; - diureticele mercuriale sau acetazolamidice blocheaz transportul activ renal al Na+. Substanele exogene pot aciona i la nivelul receptorilor fixai la suprafaa membranei; astfel: - chimioterapicele au afinitate specific pentru receptorii membranari ai parazitului, inhibndu-l; - aciunea toxic a DDT la insecte se realizeaz la nivelul receptorilor neuromusculari de la suprafaa membranei. n interiorul celulei, toxicul poate modifica starea fizic a citoplasmei, trecnd-o din sol n gel, reversibil sau ireversibil; poate reaciona cu enzime sau receptori din citosol sau din organite etc. 4.2.ORGAN INT Cunoaterea mecanismelor de aciune a toxicilor apare necesar att pentru interpretarea efectelor imediate, ct i pentru cele produse n timp asupra organismelor individuale sau a populaiilor biologice, din punct de vedere al modificrilor genetice i al dereglrii echilibrului ecologic. Stabilitatea aciunii selective a unui toxic orienteaz cercetrile spre studierea organului int asupra cruia i exercit preferenial aciunea nociv. Un organ int bine studiat este ficatul. Tetraclorura de carbon (CCl4) prezint aciune toxic direct la nivelul hepatocitului, cu distrugerea organitelor celulare, ducnd n final la steatoz i necroz. Ar avea loc urmtoarele secvene observate la microscopul electronic: - CCl4 dizolv membrana celular lipoproteic i ptrunde n hepatocit. Aici se fixeaz pe P450, fiind transformat de enzimele de hidroxilare ntr-un radical liber radioactiv, CCl3* . S-a dovedit ntr-adevr c animalele incapabile s metabolizeze CCl4 deci s produc radicali liberi sunt mai puin expuse efectului toxic al CCl4; - la numai 30 min. de la administrare, reticulul endoplasmatic (fig. 4) ncepe s fie lezat, iar la 4 ore compromiterea este complet: ribozomii se desprind de membranele foarte fine ale reticulului i polizomii se dezagreg. Deoarece ARN-mesager menine polizomii n stare de agregare, rezult c el nsui este lezat; - concomitent ncepe lezarea mitocondriilor, cu alterarea fosforilrii oxidative i perturbarea producerii de energie. Ca urmare, scade cantitatea de ATP, nct se blocheaz sinteza proteic i enzimatic. De aceea scade cantitatea de NAD, cu repercursiuni asupra ciclului Krebs. n aceast faz se observ, chiar la microscopul optic, ncrcarea gras a celulei, explicat astfel: n mod normal, trigliceridele sunt transportate afar din celul cu ajutorul proteinelor, cu care formeaz lipoproteine. Oprirea sintezei proteice mpiedic ieirea trigliceridelor, care se cumuleaz n celul. Pe de alt parte, scderea ATP determin o pierdere de ioni de K, cu reducerea vitezei de transport a lipoproteinelor. n plus, se blocheaz unirea dintre trigliceride i proteine, pentru a forma lipoproteine (fig. 21). - dup 5 ore se observ distrugerea lizozomilor, cu punerea n libertate a enzimelor hidrolitice; - alterarea membranei celulare este acum masiv, permind ieirea ionilor de K i Mg i intrarea ionilor de Na i Ca. Ionii de Ca inhib fosforilarea oxidativ, deja perturbat prin lezarea mitocondriilor; - dup 10 ore, s-a instalat un adevrat haos metabolic din cauza ncetrii producerii de enzime i coenzime; - dup 12 ore, produii de catabolism rezultai din dezagregarea citoplasmei creeaz hipertonicitate, atrgnd lichidul din spaiul Disse. Hepatocitul i mrete diametru i i clarific coninutul, apoi urmeaz faza de tulburare i n final necroza celular.
59
Ecotoxicologie
Fig. 21. Ciclul lipidelor; nivele la care intervin hepatotoxicii, realiznd ncrcarea gras a hepatocitului: a) blocarea sintezei proteice b) blocare transportului lipoproteinelor c) blocarea formrii lipoproteinelor din trigliceride i proteine (dup Judah) 4.3.MECANISME ALE ACIUNII TOXICE Mecanismul intim al modului de aciune a substanelor toxice i medicamentoase este relativ puin cunoscut. Elucidarea modului de aciune este deplin numai pentru puine substane. n plus, multe substane exogene i exercit efectul nociv prin mecanisme combinate. 4.3.1. Mecanisme enzimatice primare Multe din mecanismele cunoscute de producere a toxicitii se bazeaz pe inhibiia unor sisteme enzimatice. n funcie de cantitatea inhibitorului, inhibiia poate fi: - reversibil, cnd exist un echilibru ntre enzim i inhibitor; dac se nltur inhibitorul (de ex. prin dializ), inhibiia este oprit i enzima i reia activitatea; - ireversibil, cnd inhibitorul este n exces; prin ndeprtarea inhibitorului, enzima nu i mai poate relua activitatea; n funcie de specificitatea, pentru activitatea enzimei, a gruprilor blocate de toxic, inhibiia poate fi: - specific, reversibil, cnd substana reacioneaz cu o grupare activ esenial sau interfer cu un element indispensabil funcionrii enzimei; - nespecific, reversibil sau nereversibil, cnd substana precipit sau denatureaz proteinele, care se fixeaz pe gruprile COOH, NH2, OH, SH deci grupri comune tuturor enzimelor dar diferite de centrul lor activ (cu care se unete substratul specific). Inhibiia poate avea loc prin: denaturarea (precipitarea) apoproteinei; fixarea pe gruprile active ale apoenzimei, grupri specifice sau nespecifice activitii sale; fixarea pe centrul activ al enzimei, nlocuind substratul; fixarea n locul gruprii prostetice; inhibarea funciei de donor sau acceptor al coenzimei; imobilizarea ionilor activatori. 4.3.1.1. Inhibiie nespecific A. D e n a t u r a r e a i b l o c a r e a e n z i m e i. Este realizat de ageni ca: fenol, formaldehid, metale grele, acizi i baze tari. B. B l o c a r e a g r u p r i l o r r e a c t i v e. Gruprile COOH, NH2, OH, SH, sunt indispensabile activitii enzimelor. Ele pot fi afectate de unii toxici. Astfel gruprile tiol sunt blocate de ageni oxidani, arsen, metale grele, alchilani.
60
Ecotoxicologie
Metale grele. Compuii minerali i organici de Hg (de tip p. cloro-mercuribenzoat), ca i compui de Pb i alte metale grele inhib gruprile tiolice, cu formare de mercaptide: SH enz. SH + Me2+ enz. S S Me + 2H+
Cea mai cunoscut manifestare toxic a plumbului dei nu cea mai grav este interferena n biosinteza hemului (fig. 22).
Fig. 22. Interferenele (certe i posibile) ale Pb (n absorbie crescut) n biosinteza hemului (dup Baloh). Molecula tetrapirolic complicat a hemului provine din doi compui simpli: acidul acetic i glicocolul. Dup ce au fost activai de CoA, respectiv de piridoxal, ei formeaz acidul delta-aminolevulinic (delta ALA). Prin condensarea a 2 mol. de delta-ALA, sub aciunea ALA-dehidrazei, rezult primul compus pirolic, porfobilinogenul (PBG). Din 4 mol. de PBG se constituie uroporfirina (UP) i, succesiv, prin modificarea lanurilor laterale, coproporfirirna (CP) i protoporfirina (PP) sub aciunea enzimelor specifice. n final, hemsintetaza realizeaz ncorporarea Fe n PP, rezultnd hemul, din a crui unire cu o globin ia natere hemoglobina. Punctele de atac al plumbului n lanul biosintezei porfirinice sunt: formarea ciclului pirolic din delta ALA i ncorporarea Fe n PP (aciuni sigure); transformarea UP n CP i a CP n PP (aciuni posibile). Dei unele enzime inhibate de Pb n aceste secvene sunt tiolofore, acestea nu explic suficient mecanismul inhibrii, pentru c, pe de o parte, alte metale tioloprive nu deprim sinteza porfirinic in vivo, iar pe de alt parte, ALA-sintetaza, enzim tiolofor, nu este inhibat
61
Ecotoxicologie
de Pb, n timp ce CP-decarboxilaza este inhibat, dei nu poart grupri tiolice. n plus, Pb deprim i biosinteza globinei, prin afectarea enzimelor din ribozomi. 4.3.1.2. Inhibiie specific n aceste caz, are loc fie competiia cu substratul, mpiedicndu-l s se uneasc cu enzima, fie blocarea gruprilor enzimatice capabile s se fixeze pe substrat: grupare prostetic, coenzim, activatori. A. Competiie cu substratul Compuii organofosoforici (insecticide, STL) intr n competiie cu acetilcolina pentru centrii activi ai acetilcolinesterazei. Colinesterazele enzime care hidrolizeaz acetilcolina aparin clasei esterazelor i sunt de dou categorii: - pseudocolinesteraza, prezent n plasm i n toate esuturile (n special n ficat) hidrolizeaz, n afar de acetilcolin, i ali esteri ai colinei cu acizi organici; - acetilcolinesteraza, prezent n hematii i n sistemul nervos, hidrolizeaz numai acetilcolina i beta-metilcolina (dar cu o vitez mult mai redus). Compuii organofosforici sunt folosii ca substane toxice de lupt (STL) sau insecticide. Cu toat structura lor aparent diversificat, modul de aciune toxic este acelai: inhibarea acetilcoliesterazei. Compuii organofosforici (de ex. paratiolul) se orienteaz cu gruparea fosforic n dreptul centrului (+) din enzim, pe care l blocheaz, formnd un complex colinesterazorganofosforic. n momentul urmtor, se elimin prin hidroliz paranitrofenolul (printr-un mecanism asemntor scindrii colinei), iar restul fosforic rmne legat de enzim printr-o legtur covalent ntre P i N din histidin. Ca urmare acetilcolina nu se mai poate fixa de centrii activi ai colinesterazei i astfel nu mai poate fi hidrolizat, acumulndu-se ca atare n organism i provocnd efectele nocive bine cunoscute. Insecticidul organofosforic EPN (etil 4-nitrofenil-fenilfosfonotionat) toxic, avnd structur asemntoare malationului, puin toxic, intr n competiie cu acesta pentru enzima care l detoxific prin hidroliz. n acest mod se explic potenarea aciunii toxice a malationului cnd este administrat concomitent cu EPN: EPN blocheaz hidrolaza malationului, nct acesta persist n organism sub form activ (nemetabolizat), accentund toxicitatea amestecului. Oxidul de carbon intr n competiie cu oxigenul pentru fierul coninut n hem, gruparea prostetic a Hb. Afinitatea CO fa de Hb este de 250-300 de ori mai mare dect a oxigenului. Formarea HbCO nu lezeaz Hb, dar reduce capacitatea de transport a oxigenului la esuturi de ctre Hb, determinnd hipoxemie, a crei gravitate este dependent de procentul de HbCO din snge. B. Blocarea substratului Sistemele enzimatice funcioneaz numai dac substratul trece succesiv de la o enzim la alta. Dac substratul este substras ntr-o etap, ntregul lan metabolic este dereglat. Acidul arsenios (H3AsO3) se combin cu fosfogliceraldehida sub aciunea dehidrogenazei triozofosfailor, pentru a da acidul fosofarseno-gliceric (n loc de acid difosfogliceric). Acesta se descompune spontan, privnd de substratul lor, enzimele urmtoare din lanul glicolizei: CHO NAD, Pi CHOH E-SH CH2O PO3 H2 3-fosfogliceraldehida CH2O PO3H2 acidul 1,3 difosfogliceric 62 CH2 O PO3H2 acidul fosfoarsenogliceric CHOH ; CHOH COO PO3H2 COO As O2H2
Ecotoxicologie
C. Competiie cu coenzima Analogii nicotinamidei (v. antimetabolii, cap. IV. 4322.) D. Competiie cu gruparea prostetic Ionul cian inhib enzimele a cror grupare prostetic are structur porfirinic. Dintre acestea, inhibarea citocromoxidazei, este cea mai grav, din cauza rolului enzimei n lanul respirator mitocondrial. Se tie c n etapa final a respiraiei celulare, hidrogenul provenit din procesele de dehidrogenare a metaboliilor intermediari trebuie s se uneasc cu oxigenul molecular rezultnd ap. Reacia se realizeaz prin intermediul citocromului C oxidat (Fe+) care preia hidrogenul de pe acceptor (reacia 2) (la rndul su acesta l-a luat de la substrat, reacia 1), trecnd n forma redus (Fe2+), cu ajutorul dehidrogenazelor. La intervenia citocromoxidazei (citocrom a3), hidrogenul este preluat de la cit. C redus i transferat pe oxigenul activat (reacia 5) de nsi citocromoxidaza (reacia 4) i concomitent, cit.C redus se reoxideaz (reacia 3). Au loc urmtoarele secvene:
Substrat H2 + acceptor Acceptor H2 + cit.C (Fe3+) Cit. C (Fe2+) + citocromox.(Fe3+) Citocromox.(Fe2+) + O2 2H+ + O2-
substrat + acceptor H2 (1) 2+ acceptor + cit. C (Fe ) + H2 (2) cit. C (Fe3+)+ citocromox.(Fe3+) (3) citocromox.(Fe3+) + O2(4) H2O (5)
n intoxicaia cianhidric, Fe3+ al citocromoxidazei este complexat de CN - , blocnd lanul de reacii de oxidoreducere. Dei oxigenul se gsete n cantitate suficient n celul (pentru c Hb l poate fixa i transporta), iar citocromoxidza i pstreaz capacitatea de a capta i activa oxigenul nu poate fi eliberat pentru reaciile redox celulare, din cauza blocrii activitii oxidoreductoare a citocromoxidazei n faza de eliberare a oxigenului activ. Prin inhibarea citocromoxidazei, se blocheaz calea major de oxidare celular (fig. 23,a). n lipsa acesteia, celula recurge la calea secundar (fig. 23,b), utiliznd substane autooxidabile n contact cu oxigenul molecular din snge (flavine, glutation redus, citocrom C, rezultat din aciunea diaforazei I i NAD, n prezena H+). Calea secundar este ns cu totul insuficient, nct celula nu poate nvinge anorexia.
63
Ecotoxicologie
Fig. 23. Blocarea cii majore (a) de respiraie celular i nlocuirea ei, parial, prin calea secundar (b) n intoxicaia cu CN (dup Paulet) E. Blocarea activatorilor Multe enzime necesit ioni metalici care pot fi: - puternic legai, fcnd parte din nsi constituia enzimei (Fe din citocromoxidaz); - slab legai, acionnd ca simpli catalizatori ai unei reacii chimice. Ei sunt strict specifici i pot fi nlocuii cu alte metale cu aceeai valen (Co din arginaz; Mn din fosfataz; Fe din peptidaz; Mg din carboxilaz). Unii toxici blocheaz ionii metalici, prin complexare sau chelare. 4.3.2. Interferare n cile metabolice vitale 4.3.2.1. Sintez letal Sinteza letal reprezint includerea unui element dintr-o substan exogen netoxic ntr-un metabolit normal, cu formarea unui toxic. A fost observat pentru prima dat de Peters (1952) n cazul fluoracetatului. Acesta se metabolizeaz la fel cu acetatul, intr n ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs), apoi, prin acest ciclu, trece n fluorcitrat. Acesta inhib citricdehidrogenaza (aconithidrataza), mpiedicnd transferul gruprilor OH de la citrat la izocitrat. Ca urmare, ciclul Krebs este blocat i se acumuleaz citrat n mitocondrii. Are loc blocarea ionilor bivaleni (n special Ca), cu apariia convulsiilor i oprirea glicolizei n faza fosfofructokinazei. Consecinele n esuturi ale ntreruperii unui lan att de important de reacii nu sunt pe deplin elucidate. Este interesant faptul c un aport crescut de substrat (chiar injectat n spaiul subarahnoidian) nu influeneaz ciclul Krebs i nu amelioreaz convulsiile. Fluoracetatul nu acioneaz ca omologii si bromacetat sau iodacetat, ageni alchilani pentru c legtura C-F este foarte rezistent, dnd aadar intoxicaii de tip diferit. Dei mecanismul toxic este bine stabilit, nu s-a gsit nc explicaia pentru diferenele mari ntre specii, ca i ntre sediile aciunii toxice. Deoarece substana interfer ntr-un proces metabolic comun majoritii celulelor mamiferelor, ar trebui ca efectul toxic s fie acelai pentru celulele tuturor organismelor i speciilor animale. 4.3.2.2. Antimetabolii Antimetaboliii sunt analogi structurali ai unor metabolii eseniali (vitamine, hormoni, aminoacizi), care determin manifestri de deficien prin interferare n sinteza sau utilizarea metaboliilor. Ei afecteaz n mod indirect aciunea enzimatic, cu apariia fenomenelor toxice. a) A n t i m e t a b o l i i a i v i t a m i n e l o r i c o e n z i m e l o r Sulfanilamida: n 1940 Woods a artat c acidul p. aminobenzoic (PABA) este un antagonist al sulfamidelor, inhibnd la concentraii mici aciunea lor bacteriostatic. De fapt, se constatase c nu toate bacteriile erau egal de sensibile la aciunea sulfamidei: speciile rezistente erau cele capabile s sintetizeze PABA.
64
Ecotoxicologie
ntr-adevr, sulfanilamida se substituie acidului p. aminobenzoic n cursul sintezei acidului folic. Exist deci o competiie ntre cei doi acizi pentru ncorporarea acidului benzoic; din cauza dimensiunilor foarte apropiate, parazitul nu poate deosebi substratul adevrat de cel fals i ncearc n zadar s anabolizeze sulfanilamida. Ca urmare, nu se mai sintetizeaz acid folic. Ori, acesta, sub formele sale reduse, acid dihidrofolic (FH2) i tetrahidrofolic (FH4) are rol de coenzim a unor sisteme transportoare de grupri formil. Acidul p. aminobenzoic i acidul folic sunt necesari i sintezei altor substane din metabolismul bacterian: baze purinice i pirimidinice (componeni ai acizilor nucleici), aminoacizi (metionina, serina, histidina, leucina, lizina), vit. B12. Prin substituirea PABA cu sulfanilamidele sunt blocate prin urmare mai multe ci metabolice bacteriene. Ulterior s-a constatat c antagonismul fa de un factor indispensabil nu se aplic numai la microorganisme i c exist numeroase alte cazuri cnd o caren ntr-un metabolit este determinat de analogi structurali ptruni accidental n organism. Dicumarolul. n Canada s-a observat c sindromul hemoragic aprut la vite dup hrnirea cu un anumit furaj se datora prezenei n furaj a dicumarolului (Link, 1943). Ori, acesta este antagonist al vitaminei K, factor indispensabil elaborrii protrombinei n ficat. n acest caz, antagonismul este de aciune, creat prin dublare molecular, i nu prin competiie. Acidul piridin 3- sulfonic i acetil 3 piridina. Fiind analogi structurali ai nicotinamidei i pot lua locul n structura difosfo i trifosfo piridinnucleotidelor (NAD, NADP), cu rol vital n metabolismul celulei; de asemenea pot carena organismul n aceast vitamin. Astfel, 3-acetilpiridina poate fi incorporat n NADP n locul nicotinamidei, rezultnd un NADP mult mai puin activ. Efectele toxice ale 3-acetilpiridinei au fost observate numai dup o doz masiv unic. Doze mici, repetate, sunt nenocivi, probabil pentru a nu se atinge concentraia critic n acele regiuni ale creierului, n care nlocuirea adevratului NADP cu cofactorul fals ar duce la tulburri metabolice grave i toxicitii. Aminopterina. Dup evidenierea rolului acidului folic n leucopoiez i a faptului c leucopenia este caracteristic deficienei n acid folic, s-a ncercat utilizarea antimetaboliilor si n tratamentul leucemiilor. Aminopterina se deosebete de acidul folic numai prin nlocuirea hidroxilului prin gruparea aminic, producnd deficien n acid folic i implicit scderea numrului de leucocite. Deficiena nu se repercut ns numai asupra leucopoiezei, ci i asupra altor procese de nmulire celular. Medicamentul anticanceros nu este, nici n acest caz, absolut specific pentru celula neoplazic, constituind i un risc pentru dezvoltarea celulelor sntoase. b) A n t i m e t a b o l i i a i a m i n o a c i z i l o r Etionina este analogul metioninei. Iniial, s-a considerat c ea se ncorporeaz n proteine (Levine, Tarver, 1951), apoi c inhib sinteza enzimelor de metabolizare a substanelor exogene din microzomi (Brodie, 1962). n prezent se admite c se formeaz adenozil etionin (Shull, Mc Conomy, Vogt, Castillo, Faber, 1966) i c astfel induce o leziune biochimic prin scderea cantitii de ATP prezent n celule. Procesul normal este: Metionin + ATP S-adenozil metionin + PP +Pi
Selenocistina, analogul structural al cistinei, determin eficiena n acest aminoacid sulfurat. Se CH2 CH(NH2) - COOH Selenocistina Se - CH2 CH(NH2) COOH c) A n t i m e t a b o l i i p i r i m i d i n i c i i p u r i n i c i Antimetaboliii uracilului i timinei (baze pirimidinice) sunt: 5 fluorulracilul, 4 tiouracilul, acidul uracil-5-carboxilic (izorotic);
65
Ecotoxicologie
6-clorpurina, 6-mercatopurina, 8-azoguanina, tioguanina sunt antimetaboliii bazelor purinice. Aceti antimetabolii interfer cu bazele normale ale acizilor nucleici, realiznd o ncorporare letal (Peters). S-a constatat c enzimele implicate n sinteza ADN pot folosi 5bromuracil n locul timinei. ADN rezultat se comport anormal n procesele de diviziune celular. 4.3.2.3. Inhibitori ai catabolismului i stocrii catecolaminelor (i serotoninei) n catabolismul catecolaminelor intervin dou enzime: monoamino-oxidaza (MAO) i catecolamino-O-metiltransferaza (COMT). Datorit inhibrii MAO, dar pe cale indirect, s-ar putea explica decesele subite raportate la muncitorii expui (prin inhalare sau contact tegumentar) la explozivii de tip dinitrat de etilenglicol i trinitrat de etilenglicerol. Se presupune c s-ar produce o toleran la aceti explozivi, manifestat prin dilatarea arterelor coronariene. Dilatarea este compensat de creterea puterii contractile a vaselor. La ntreruperea expunerii, spasmele vasculare compensatorii ne mai fiind anihilate de dilatarea coronarelor produs de polinitrogliceroli, pot da natere la accidente grave i chiar fatale. Inhibitori ai activitii COMT sunt: pirogalolul, catecolul, quercetina, tropolonele. Cel mai bine studiat a fost pirogalolul. Se observase de mult vreme c pirogalolul poteneaz efectele adrenalinei (mai ales efectul presor), Bacq a demonstrat c acest efect se realizeaz prin blocarea COMT, cu creterea concentraiei catecolaminelor circulante n snge i deci creterea efectului lor (Fig. 24).
Fig. 24. Eliberarea catecolaminelor din granule de stocaj (dup Delacoux). Un tip de aciune toxic n care nu este tulburat biosintaza sau distrugerea mediatorilor, ci doar eliberarea acestora din combinaia inactiv fiziologic, este manifestat de rezerpin, psilocibin i ali compui nrudii.
66
Ecotoxicologie
Acetia spoliaz rezervele de serotonin i catecolamine la nivelul esuturilor (n special creier i miocard); prin urmare, nu mai are loc stocarea lor pe structurile celulare care le inactiveaz. Efectele toxice dominante sunt tulburri psihice (oboseal, somnolen, stri depresive) i neurologice (convulsii i manifestri de tip extrapiramidal) i apar n intoxicaiile accidentale sau la administrarea dozelor mari n psihiatrie. Ele sunt consecina proceselor neuroumorale de epuizare a depozitelor de serotonin i catecolamine, prin eliberarea acestora. 4.3.2.4. Deficiena vitaminic Deficiena vitaminic poate rezulta prin: a) A n t i m e t a b o l i i v i t a m i n i c i (v. antimetabolii, cap. IV. 4322.) b) D i s t r u g t o r i a i v i t a m i n e l o r Sunt substane, care fr a fi toxice per se, produc efecte nocive prin carenarea organismului ntr-o anumit vitamin. Sulfitul, folosit n cantiti mici drept conservant alimentar distruge vitamina B1 (tiamina) de alimentul respectiv; dac acesta este singura surs a tiaminei, se produc manifestrile caracteristice carenei tiaminice. Dealtfel, n cantiti mari, sulfitul este el nsui toxic, inhibnd enzimele tiolofore, prin formare de puni disulfidice. 4.3.2.5. Antagonism ntre ioni Cadmiu acioneaz antagonic fa de Zn2+, Cu2+, Fe2+ i/sau Fe3+, Ca2+ i la rndul su este antagonizat de acetia. Astfel, Zn protejeaz mpotriva unor efecte nocive de Cd (necroz testicular, teratogenez, efect nociv asupra placentei). Cuprul reduce anemia provocat e Cd. Aciunea antagonic a Cd fa de metabolizarea Cu i Zn se explic prin competiia pentru situsurile de transport. La animalele expuse la Cd, acumularea de Cd-tionein duce la concentrare excesiv de Zn n ficat i Cu n rinichi. Interferena n metabolismul Fe2+ a Cd a fost considerat secundar interaciunii Cd-Cu (sau Zn). Totui se consider c ar avea loc i o interaciune direct, demonstrat prin ncorporarea Cd din diet n feritin (proteina care depoziteaz fierul) cu reducerea att a Fe stocat, ct i a apoproteinei. Efectul Cd asupra metabolismului Ca2+ este considerat secundar alterrii renale. Totui ar exista i o interaciune competitiv ntre Ca i Cd la locul absorbiei: absorbia de Cd este crescut n deficiena n Ca. De asemenea, Cd poate inhiba conversiunea vit. D3 ntr-o form metabolic activ. 4.3.2.6. Decuplarea fosforilrii oxidative Dinitrofenolii folosite ca insecticide i erbicide, au n comun mecanismul de aciune toxic, constnd n decuplarea fosforilrii oxidative, cu scderea concentraiei adenozintrifosfatului (ATP). n consecin, energia rezultat din oxidarea glucidelor nu mai este utilizat de celule n mod normal, ci se pierde sub form de cldur, rezultnd creterea metabolismului bazal, iar cnd posibilitatea de termoreglare este depit, apare creterea temperaturii corporale. Deoarece ATP nu poate fi sintetizat, crete concentraia acidului adenilic (AA) i a fosfatului anorganic. n paralel scade concentraia glicogenului hepatic i muscular. Leziunea biochimic accelerarea proceselor oxidative ale consumului de oxigen i a metabolismului bazal este urmat de leziuni la nivelul ficatului, miocardului i a muchilor scheletici. 4.3.2.7. Interferarea cu fluxurile ionice Unii toxici pot aciona prin interferare cu un flux de ioni, n interiorul celulei sau transmembranar (membran citoplasmatic, mitocondrial etc.).
67
Ecotoxicologie
Se tie c modificrile de permeabilitate la ionii Na+, K+, Ca2+ a diferitelor membrane poate duce la producerea i propagarea unui influx nervos, la relaxarea sau din contra, contractarea unei fibre musculare etc. S-a artat c potenialul de aciune a unor fibre rezult din creterea brusc a conductanei membranei la ionii Na+; aportul lor de sarcini pozitive neutralizeaz sarcinile negative din interiorul celulei i creeaz o inversie a potenialului de membran. n faza urmtoare, crete conductana la ionii K+, iar aceea a ionilor Na revine la normal. Micarea K+ spre exterior readuce membrana la potenialul su iniial i chiar la suprapolarizare. Urmeaz faza de recuperare, cnd gradienii electrochimici sunt restabilii cu ajutorul pompei ionice. Tetrodotoxina este o toxin coninut n unele specii de peti exotici, ca Tetrodontidae, cu aciune toxic foarte puternic (DL50 10 g/Kg la oarece i.v.). La om d intoxicaii grave, adesea mortale (doza letal 1-2 mg, oral). Considerat predominant neurotoxic, s-a dovedit c posed aciune paralizant direct asupra muchilor scheletelui, ca i asupra fibrelor nervoase. Aciunea anestezic se manifest chiar la concentraii de 10-10. Tetrodotoxina acioneaz la vertebrate prin inhibarea creterii periodice a permeabilitii membranare pentru ionii de Na+, fr a altera pentru ionii de K+. Aceste rezultate par a demonstra c Na+ i K+ circul prin canale separate n membrana celular. Blocajul se exercit numai pe faa extern a membranei nervoase sau a celulei musculare. ntr-adevr, injectarea n interiorul fibrei a doze de 1000 ori mai mari dect cele active n aplicaie extern, se dovedesc fr efect. Tetrodotoxina prezint afinitate pentru situsurile din membranele celulare nervoase i musculare, la nivelul cilor de transport transmembranar a ionilor de Na+. Se presupune c ncrctura pozitiv a gruprii guanidinice de la un pol al moleculei toxicului ar putea ptrunde n canalele pentru ionii de sodiu, fixnd astfel restul moleculei n poziie steric fa de gruprile adiacente ale peretelui membranar. Formula structural a toxinei arat c cei 7 atomi de hidrogen din ciclul din care face parte restul guanidinic sunt aezai aproximativ n acelai plan i astfel pot forma puni de hidrogen cu unele grupri ale membranei. Unele organoclorurate (DDT, lindan, dieldrin) ar interfera de asemenea cu un flux ionic. Dei nc acum 25 de ani s-a descris efectul DDT asupra nervilor periferici asemntor efectului veratrinei abia recent s-a artat c DDT ar aciona printr-un mecanism sugernd interferarea ca un flux de ioni. Alte insecticide organoclorurate (lindan, dieldrin) afecteaz de asemenea sistemul nervos, dar n special printr-un efect central, ceea ce ar fi posibil tot prin modificarea fluxului ionic. Aciunea toxic a DDT la insecte debuteaz prin stimulare nervoas. Se tie c receptorii neuromusculari la insecte sunt protejai de o membran selectiv permeabil, iar mediatorul chimic este acidul glutamic. DDT stimuleaz oxonii senzoriali prin creterea cantitii de acetilcolin liber, depozitat n vezicule, dezorganiznd astfel indirect echilibru de transfer n membrane nervoase i accelernd formarea complecilor care asigur transferul electronilor. Pentru c aceti compleci sunt stabili numai la temperaturi sub +300C, la animale cu snge cald fenomenele de excitaie nu au loc. La insecte ns, faza de stimulare nervoas determin o dereglare profund a transferului Na+/K+ prin membrana neuromuscular, urmat de tulburarea activitii motorii, paralizie i moarte. 4.3.2.8. Alchilare Agenii alchilani sunt substana care introduc un radical alchil ntr-o alt molecul. a) A z o t - i p e r i t e; i p e r i t a Muli ageni CH2 CH2Cl alchilani biologici care i exercit CH2Cl n condiii fiziologice, CH2 efectele prezentnd activitate anticanceroas fac parte din clasa azotiperitelor, iar compuii cu sulf sunt iperitele, cunoscute ca STL. S RN CH2 CH2Cl iperita CH2 CH2Cl azotiperite (R= radical alifatic, 68 aromatic sau heterociclic)
Ecotoxicologie
Azot-iperitele intervin n procesele biologice fundamentale, producnd alterarea materialului genetic celular, tradus prin ruperi i anomalii cromozomale. Modificrile moleculare sunt rezultatul stabilirii de legturi covalente ntre agentul alchilant i componentele celulare, prin substituie nucleofil. n funcie de radicalul R, mecanismul de aciune a azotiperitelor este diferit. b) N i t r o z a m i n e l e Nitrozaminele manifest aciuni biologice variate: alterare hepatocelular acut i cronic, carcinogenez i teratogenez, mutagenez. Ele alchileaz acizii nucleici din ficat, datorit radicalului alchil format prin metabolizare. Prin tratare cu deuteriu marcat a dimetilnitrozaminei s-a gsit 7-metilguanin n acizii nucleici. Totui alchilarea constituenilor celulari nu reprezint singurul mod de aciune a nitrozaminelor. Astfel, N-etil-N-nitrozureea nu alchileaz acizii nucleici in vivo i totui are efecte carcinogene i toxice. Aciunea nociv a dimetilnitrozaminei se manifest prin scderea sintezei proteice n ficat, ducnd la steatoz i necroz. Se consider c alterarea sintezei proteice are loc n stadiul de asamblare a aminoacizilor de ctre ARN- mesager din ribozomi. Dei ribozomii ar fi corespunztori din punct de vedere funcional, se produce dezagregarea i dezorganizarea reticulului endoplasmatic rugos din cauza lezrii capacitii funcionale a ARN- mesager. Dup Mizrachi i de Vries, alterarea acestora s-ar datora metilrii gruprilor fosfat, mecanism dealtfel discutabil. 4.3.2.9. Aciunea cancerigen Dup cum se tie, dintre substanele chimice sau poluani unele s-au dovedit cancerigene n experiment pe animal, iar la cteva efectul a fost confirmat i la om. De asemenea, anumite medicamente anticanceroase (de ex. ageni alchilani) sunt cancerigeni la animal, dar efectul la om este greu de apreciat, din cauza timpului n general scurt de supravieuire a pacienilor tratai cu chimioterapice antitumorale. Dintre substanele radioactive, torotrastul a determinat manifestri maligne n multe organe, la om. Problema carcinogenitii este nc mult complicat de observaia c unii compui acioneaz drept cocarcinogeni, adic produc tumori numai dup ce animalele au primit o doz subefectiv de carcinogeni; efectul a fost confirmat i la om. Lucrrile lui Miller au elucidat mai multe puncte importante din modul de aciune a unor serii de carcinogeni. El a constatat c majoritatea carcinogenilor necesit o activitate metabolic prealabil, nainte de a-i exercita efectul carcinogen. Astfel, 2-acetil-aminofluorenul i coloranii azoici, hepatocarcinogeni puternici, se gsesc legai covalent de acizii nucleici i de alte macromolecule proteice din ficat. Dimpotriv, in vitro nu se observ nici o legtur chimic atunci cnd se pun n prezen carcinogenii cu acizii nucleici sau alte proteine. Prin urmare, s-a conchis c aa numiii carcinogeni sunt de fapt precancerigeni, care sunt metabolizai n unul (sau mai muli) precursori cancerigeni i n final n metabolitul ultim activ, cancerigen. Acesta are caracter puternic electrofil, fiind deficitar n electroni. Datorit acestei caracteristici, metabolitul activ reacioneaz chimic covalent cu macromoleculele celulare, fr a necesita intervenia unor reacii enzimatice. Metabolitul ultim (cancerigen) poate suferi aciunea enzimelor de metabolizare, detoxicndu-se (fig. 25).
69
Ecotoxicologie
Fig. 25. Detoxicarea i activarea cancerigenilor chimici (dup Fuchs). Astfel, o hidrocarbur policiclic, ca benz(a)antracenul, este precancerigen; sub aciunea monooxidazelor trece n forma epoxid (cancerigen ultim), detoxicat apoi de hidrataze n compusul dihidroxi-, necancerigen. Amine aromatice, ca 2-acetilaminofluorenul, precancerigen, trece prin doi precursori nainte de a ajunge la cancerigenul ultim, electrofil, care se leag covalent de guanina dintr-un mononucleotid. Sintetizarea compusului ultim, electrofil, a 2-acetilaminofluorenului, a permis studiu in vitro a interaciunii lui cu ADN, inta cancerigenului. Dup cum se tie, n structura ADN serierea ntr-o ordine foarte precis a celor dou baze purinice (adenina i guanina) i pirimidinice (timina i citozina) constituie mesajul genetic. Perturbarea structurii acestora duce la apariia diviziunii celulare haotice i prin urmare la apariia cancerului. Ori, s-a constatat c intermediarul electrofil al 2-acetilaminofluorenului se interpune ntre cele dou lanuri ale structurii n dubl elice a ADN, crend o dezorganizare local i fixndu-se covalent pe guanin (fig. 26). Aciunea cancerigen a compuilor din grupe recunoscute cancerigene este influenat de volumul moleculei. Astfel, introducerea fluorului n poziia 7 din 2-acetilaminofluoren nu modific aciunea puternic cancerigen a moleculei. Dimpotriv, fixarea iodului n aceeai poziie anihileaz efectul cancerigen, pentru c datorit volumului su atomic mai mare dect a fluorului i hidrogenului nu se poate insera n dubla elice a ADN, i n consecin nu produce perturbarea structurii sale. Pentru acelai motiv, unele hidrocarburi policiclice cancerigene, ca 3-metilcolantrenul, benz(a)pirenul, dimetilbenzantracenul, cu dimensiunea de aprox. 3,6 , similar aceleia a perechilor de baze purinice i pirimidinice, se pot ncastra n structura acizilor nucleici. Intervine de asemenea similitudinea stereochimic.
70
Ecotoxicologie
Fig. 26. Dezorganizarea local a dublei elice prin fixarea unui cancerigen (intermediarul electrofil) (dup Fuchs) Cercetri viitoare vor demonstra dac acest model este valabil i in vivo i dac se aplic i la alte clase de cancerigene. Totui, nc de acum rezult c exist o oarecare specificitate a aciunii cancerigenului (fig. 27), i anume: - specificitatea esutului pentru unii cancerigeni este desigur datorit localizrii sistemelor enzimatice de activare a precancerigenilor; - specificitatea reaciei chimice presupune o anumit stare dinamic a ADN, care faciliteaz la un moment dat, atingerea poziiei C8 a guaninei; - specificitatea la nivelul modificrilor conformaionale: reacia ntre guanin i AAF necesit deschiderea dinamic a platoului guanin-citozin respectiv; numai o guanin plasat ntr-o regiune bogat n baze adenin-timin va fi, din motive stereochimice, mai reactiv i deci se va uni cu AAF; prin urmare nu toate moleculele de guanin sunt egal de reactive. precancerigen specificitate de esut metabolit ultim specificitate a reaciei chimice Produs de adiie pe macromolecula biol. specificitate la nivelul modificrilor conformaionale
modific. funciil. acestor macromolecule Fig. 27. Specificitatea aciunii cancerigenului (dup Fuchs)
4.4.MECANISME IMUNOBIOLOGICE O serie de substane manifest aciune alergic. Alergia este o stare alterat, dobndit i specific a organismului, bazat pe reacia antigen-anticorp. Se consider c este alterat, pentru c difer de o reacie normal, adic subiecii odat sensibilizai la un antigen, vor reaciona, datorit prezenei anticorpilor, diferit fa de modul de
71
Ecotoxicologie
reacionare nainte de sensibilizare. Reacia este dobndit, pentru c este consecina sensibilizrii organismului la substana cu care a venit n contact. n fine, reacia este specific, pentru c n formarea complexului antigen-anticorp trebuie s intervin o anumit structur fizico-chimic. Se tie c antigenul (alergenul) este o protein sau un polizaharid care acioneaz fa de organism ca un corp strin i care determin formarea de anticorpi. Haptena este un antigen incomplet, cu greutate molecular mic, putndu-se fixa n organism pe o protein, cu formare de anticorpi specifici pentru hapten. Ca haptene acioneaz o serie de toxici i medicamente. Anticorpii (imunoglobulinele) sunt globuline sintetizate n organism ca rspuns la introducerea antigenului. Ele reacioneaz specific cu antigenul care le-a produs, cu o capacitate determinat de numrul centrilor reactivi de pe suprafaa moleculei de globuline complementare grupurilor determinante de antigeni. Cele mai frecvente alergii sunt respiratorii (rinit alergic i astm) i tegumentare. Numeroi toxici i medicamente pot provoca alergii: DDT, piretrine, formaldehid, vopsele pentru pr (ursoli), acid acetilsalicilic, izocianai, anhidrid ftalic, fenilhidantoina, chinina, HIN, sulfamide, novocain, antibiotice (penicilina, streptomicina etc.).
72

Capitolul I-IV

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Capitolul I-IV

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Ecotoxicologie

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Capitolul 1 CONSIDERAII GENERALE

NOIUNEA DE TOXIC ; RELAIILE TOXICULUI CU ORGANISMUL VIU I MEDIUL NCONJURTOR

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Capitolul II CIRCUITUL SUBSTANELOR EXOGENE N ORGANISM

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

(dn/dt)= PxS (C1aq C2aq)

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Fig. 11. Mecanisme de cotransport

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Fig. 14. Calea clasic de transport a moleculelor de secreie n spaiul extracelular

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Fig. 16. Calea urmat de particulele ce au ptruns n celul prin endocitoz

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Capitolul III INDUCIA I INHIBIIA ENZIMATIC

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

C6H5 C6H5 C CH2 CH2 CH3 SKF525-A

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

CAPITOLUL IV ACIUNEA TOXICILOR ASUPRA ORGANISMULUI

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Maria Prisecaru, Roxana Voicu