Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Purcarea - Biochimie Laborator PDF
Purcarea - Biochimie Laborator PDF
INDRUMǍTOR DE LABORATOR
BIOCHIMIE
2
Prefaţӑ
3
LABORATOR 1. Măsuri de protecţia muncii în laboratoarele de biochimie
5
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse
alimentare
Analiza biochimică trebuie efectuată imediat ce mostrele recoltate sunt aduse la laborator
pentru că acestea se depreciază foarte repede fie datorită activităţii microorganismelor ce se
găsesc în sau pe produse, fie activităţii enzimelor tisulare, ambii factori fiind favorizaţi de
temperatura camerei, de prezenţa oxigenului din aer şi de lumină.
Laboratorul trebuie astfel dimensionat încât să se poată efectua cu promptitudine analizele
solicitate pentru a putea stabili operativ starea produsului.
Orice laborator de control biochimic al alimentelor trebuie să se compună din următoarele
încăperi:
1. Sala de primire a probelor;
2. Sala de pregatire a materialului.
3. Laboratorul de lucru propriu-zis prevăzut cu mese faianţate sau acoperite cu
materiale termorezistente şi rezistente la acizi şi baze, chiuvete, etajere metalice
pentru reactivi uzuali, becuri de gaz şi prize;
6
Soluţii de reactivi
Concentraţia este o caracteristică esenţială a unei soluţii şi reprezintă raportul dintre
cantitatea de substanţă dizolvată şi cantitatea dizolvantului utilizat.
Există mai multe moduri de exprimare a concentraţiei unei soluţii.
a. Concentraţia procentuală: reprezintă cantitatea de substanţă dizolvată în 100g soluţie,în
acest caz exprimarea fiind "g/g".
Dacă soluţia se prepară prin cântărirea solvatului şi aducerea acestuia la
volum constant cu solventul, este exprimare "g/V".
Dacă soluţia se prepară volumetric, ambele componente ale soluţiei fiind
lichide, avem exprimare "V/V".
b. Concentraţia molală se referă la numărul de moli de substanţă dizolvată în 1000ml
solvent.
c. Concentraţia molară reprezintă numărul de moli de substanţă dizolvată în 1000ml
soluţie.
d. Concentraţia normală se referă la numărul de echivalenţi (vali) în 1000ml soluţie.
Normalitatea unei soluţii se notează fie cu "n", fie cu "N". Soluţia
care conţine un val substanţă în 1000ml soluţie, se numeste soluţie 1N.
Echivalentul gram (val) reprezintă cantitatea dintr-o substanţă în grame, egală cu
echivalentul său chimic. Echivalentul se calculează diferit pentru acizi, baze şi săruri,
conform următoarelor relaţii:
Pentru acizi
Se calculează împărţind masa moleculară a acidului la numărul atomilor de hidrogen ai
acidului.
Exemplu:
Pentru baze
Se calculează împărţind masa moleculară a bazei la numărul de grupări hidroxilice
7
Exemplu
Pentru sare
Se calculează împărţind masa moleculară a sării la numărul atomilor de metal înlocuiţi de
hidrogen :
Exemplu
EMgCO3=84,3/2=42,15g
8
De exemplu, pentru o soluţie exact 0,1N de NaOH titrul teoretic este de 0.004. Pentru o
soluţie aproximativ 0,1 N să presupunem că titrul real este 0.004328. Factorul acestei soluţii
va fi:
Aceasta înseamnă că la 1ml din soluţia noastră corespund 1.082ml din soluţia exact 0.1N.
In general, dacă se titrează o soluţie a substanţei A cu greutate moleculară M A, cu
reactivul B având normalitatea n şi factorul F, folosind V ml din reactivul B, cantitatea de
substanţă A din proba analizată va fi:
TEST
9
4. Balanta analitică se instalează in:
a. camera de primire probe
b. camera frigorifică
c. laboratorul propriu-zis
d. cameră specială in care trepidatiile sunt minime
5. Solutiile de reactivi se prepară in:
a. cilindru gradat
b. pahar Berzelius cotat
c. balon cotat
6. Concentratia normală reprezintă:
a. număr de moli de substantă in 1000 ml solutie
b. cantitatea de substantă dizolvată in 100 g de solutie
c. număr de echivalenti dizolvati in 1000 ml de solutie
7. Cât hidroxid de sodiu trebuie cântărit pentru a obtine 250 ml solutie 10% NaOH?
a.5 g
b. 30g
c. 25g
d. 60g
8. Pentru a prepara 500 ml solutie NaOH 0,3N avem nevoie de:
a. 120 gNaOH
b. 6 g NaOH
c. 40g NaOH
d. 12 g NaOH
9. Pentru a prepara 300 ml NaCl 2M trebuie să cântărim:
a. 58,5g NaCl
b. 117 g NaCl
c. 11,7 g NaCl
d. 35,1 g NaCl
10. Câti ml de HCl sunt necesari pentru a prepara 250 ml HCl de concentratie 1M,
folosind HCl 36% cu densitatea 1,183g/cm3?
a. 18,56 ml
b. 21,43 ml
c. 56,71 ml
d. 33,11 ml
10
11
LABORATOR 2. Metode de analizǎ folosite în biochimie
12
- Potenţiometrice
- Conductometrice
2.3.1. Metode optice
a. Metodele colorimetrice reprezintă metodele de analiză care se bazează pe compararea
vizuală a intensităţii coloraţiei soluţiilor de concentraţii diferite cu cea a unei soluţii standard.
Aceste analize prezintă avantajul că necesită cantităţi mici de substanţă şi un timp relativ
redus în comparaţie cu analizele chimice.
b. Metoda fotocolorimetrică se bazează pe fenomenul efectului fotoelectric (fotoefect),
adică fenomenul de desprindere a electronilor din atomii substanţei sub influenţa fluxului
luminos.
Celulele fotoelectrice transformă energia luminoasă în energie electrică. Fotocurentul care
ia naştere este proporţional cu intensitatea I a radiaţiei şi se măsoară cu un galvanometru de
sensibilitate mare.
Inlocuirea ochiului observatorului cu celule fotoelectrice elimină erorile subiective.
c.Metoda spectrofotometrică se bazează pe determinarea coeficientului de extinţie a
soluţiei la diferite lungimi de undă.
Fig. Spectrofotometru
Pe baza raportului dintre lungimea de undă şi capacitatea de percepere a ochiului omenesc
radiaţiile luminoase se împart în trei categorii:
radiaţii vizibile, a căror lungime de undă se situează în domeniul 400-760nm;
radiaţii ultraviolete, cu lungimea de undă mai mică de 400nm;
radiaţii infraroşii, cu lungimea de undă mai mare de 760nm.
Lungimile de undă corespunzătoare spectrului vizibil sunt redate în următorul tabel.
13
Culoarea Domeniul lungimilor de undă
Violet 400-450 nm
Albastru 450-500 nm
Verde 500-570 nm
Galben 570-590 nm
Portocaliu 590-620 nm
Roşu 620-760 nm
14
e.Refractometria se bazează pe fenomenele de refracţie sau de reflecţie totală a unui fascicol
de radiaţii luminoase la limita de separaţie dintre două medii cu indici de refracţie diferiţi.
Polarimetre
Pentru o anumită lungime de undă, unghiul de rotaţie specifică a unei substanţe aflate sub
formă de soluţie, este proporţional cu grosimea stratului traversat şi cu concentraţia ei.
Constanta de proporţionalitate specifică fiecărei substanţe se numeşte ―unghi de rotaţie
specifică‖ şi se notează cu (α)D20, unde 20 reprezintă temperatura la care se face citirea, iar D,
linia sodiului (ca sursă de lumină, aparatele sunt echipate cu lămpi de sodiu).
In practica, polarimetria se foloseşte pentru determinarea concentraţiei unor glucide cu
ajutorul aparatelor numite polarimetre.
Fiecare substanţă optic activă are un unghi specific de rotaţie, în condiţii determinate de
lucru. In tabelul următor sunt trecute valorile unghiului de rotaţie specifică a unor glucide de
importanţă biologică.
Substanţa (α)D20 Substanţa (α)D20
Glucoză +52.74 Lactoză +55.30
Fructoză -93.78 Manoză +14.50
Galactoză +80.70 Arabinoză +105.0
Maltoză +136.90 Xiloză +19.00
Zaharoză +66.50 Celobioză +35.00
15
2.3.2. Metode de separare - Metode cromatografice
Permit separarea substanţelor dintr-un amestec pe baza capacităţii de distribuţie între o fază
staţionară şi una mobilă având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a componentelor
purtate de faza mobilă de-a lungul fazei staţionare.
Metodele cromatografice se pot clasifica după starea de agregare a fazei staţionare şi
mobile şi după fenomenul de absorbţie sau de repartiţie între două faze nemiscibile în:
cromatografie pe hârtie
cromatografie în strat subţire
cromatografie pe coloană de sephadex
cromatografie în fază gazoasă
lichid cromatografia
a.cromatografia pe hârtie are loc o repartiţie a substanţelor ce se separă între stratul de
lichid polar (apă) aderent de hârtie şi faza mobilă (organică), nemiscibilă cu apa. Deci, este o
cromatografie de repartiţie de tip lichid-lichid.
Ca suport se utilizează hârtia cromatografică Whatman, Schleicher-Schűll, etc.
-Pentru aplicare se pot folosi siringi, micropipete, pipete Pasteur.
-Developarea se face în aparate speciale de sticlă, care să asigure o atmosferă închisă.
-Soluţiile developante sunt specifice substanţelor ce se cercetează.
După developare şi uscare la aer a cromatogramelor, acestea se pulverizează uniform cu o
soluţie revelatoare cu compoziţie specifică substanţelor ce se cercetează. Se usucă din nou la
aer, apoi se expun la etuvă, la temperatura de 90-100ºC pentru evidenţierea spoturilor.
16
Rf-ul se defineşte ca fiind raportul dintre distanţa parcursă de substanţa separată prin
cromatografie şi distanţa parcursă de solvent. Deci, pentru calcularea Rf-ului se măsoară
pe de o parte distanţa de la punctul de start până la linia de migrare a solventului (L), iar
pe de de altă parte distanţa de la punctul de start până la centrul geometric al spotului
substanţei respective (l).
Rf=l / L
Valoarea Rf-ului este totdeauna subunitară şi în aceleaşi condiţii de lucru fiecare
substanţă are un Rf cu valoare absolut specifică.
Pentru evaluarea cantitativă, fiecare spot identificat se decupează, eluează şi se supune
determinării fotometrice faţă de un standard de referinţă cu concentraţie cunoscută.
In biochimie, cromatografia pe hârtie are multiple domenii de aplicare, dar se foloseşte în
special pentru separarea, identificarea şi determinarea aminoacizilor şi a substanţelor
glucidice.
b. Cromatografia în strat subţire este asemănătoare cromatografiei pe hârtie cu deosebirea
că în locul hârtiei se folosesc plăci de sticlă acoperite cu un strat adsorbant, uniform distribuit,
de grosime prestabilită, din silicagel sau alt material asemănător. Prezintă avantajul unei mai
bune separări a compuşilor din amestec şi a unei foarte bune reproductibilităţi. Metoda poate
fi utilizată şi în cazul unor substanţe developante care ar ataca hârtia cromatografică.
http://images.1233.tw/tlc-developing-tanks/
17
c. Cromatografia pe coloană de sephadex. Principiul este asemănător cu al cromatografiei
pe hârtie sau în strat subţire cu deosebirea că suportul şi faza staţionară sunt introduse într-o
coloană cilindrică de sticlă. Substanţele din amestec sunt purtate de faza mobilă de-a lungul
fazei staţionare, distribuindu-se în mod specific, în funcţie de capacitatea lor de migrare, în
acest fel realizându-se separarea lor.
Cromatografia pe coloane
http://www.drgpdreamdot.com/chromatography/
18
străbat coloana cu viteze diferite, deci, se separă unele de altele. La extremitatea opusă a
coloanei există un sistem de detecţie care semnalizează ieşirea din coloană a fiecărui element.
Intensitatea semnalelor emise este proporţională cu concentraţia fiecărei substanţe, ceea ce
permite evaluarea cantitativă. Semnalele transmise de detector sunt amplificate, apoi se
înregistrează grafic sub forma de ―picuri‖ a căror înalţime sau arie e proporţională cu
concentraţia. Identificarea şi evaluarea cantitativă se fac cu ajutorul standardelor de referinţă
cu concentraţie cunoscută.
d. Cromatografie de lichide de înaltă performanţă - Metoda se bazează pe acelaşi
principiu ca şi celelalte metode cromatografice şi anume repartizarea diferită a componentelor
unui amestec de substanţe între o fază staţionară şi o fază mobilă. Deosebirea majoră între
această metodă şi cromatografia de gaz este aceea că faza mobilă este lichidă şi nu gazoasă.
În plus, faza mobilă nu are un simplu rol de cărăuş ci participă activ la procesul de separare
datorită unor interacţiuni complexe.
19
pH-ul se defineşte ca fiind logaritmul cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de
hidrogen dintr-o soluţie. Se exprimă prin valori cuprinse între 1-14.
Valoarea 7 corespunde mediului neutru
Valorile mai mici decât 7 corespund mediului acid
Valorile mai mari decât 7 corespund mediului bazic (alcalin)
pH-ul are o importanta deosebita in desfasurarea reactiilor biochimice din organism.
In mediul biologic, valoarea constantă a pH este 7.2-7.4.
Determinarea pH-ului se poate face prin metoda cu hârtie indicator, metoda cu soluţie
indicatoare, dar pentru determinarea exactă a pH-ului se foloseşte metoda potenţiometrică –
pH-metria.
hârtie de pH pH-metru
TEST
21
Laborator 3 - 4.Glucide
22
Extragerea glucidelor din produsele alimentare
Extragerea monoglucidelor şi a oligoglucidelor din produsele alimentare se poate realiza
prin presare sau prin extracţia produsului respectiv cu anumiţi solvenţi.
Extracţia prin presare
Se aplică produselor alimentare cu conţinul mare de apă şi glucide solubile. In urma
presării se obţine un suc care conţine glucide solubile. Acest suc se utilizează la dozarea
glucidelor prin metode refractometrice şi densitometrice. Rezultatele acestor măsuratori sunt
orientative deoarece în sucul obţinut pot exista şi alte substanţe solubile în apă.
Extracţia cu solvenţi specifici
Această metodă este folosită frecvent în scopuri analitice şi industriale. Solvenţii utilizaţi
sunt: apa la 75-80ºC sau etanolul la temperatura de fierbere.
a). Extracţia apoasă la cald cu defecare
Extractul primar obţinut prin această metodă are un grad de puritate mai mare decât prin
presare, deoarece prin procesul de defecare se îndepărtează substanţele neglucidice cu
ajutorul unor reactivi numiţi defecanţi. (In latină, termenul de ―defecare‖ înseamnă desfacere,
purificare).
b). Extracţia alcoolică
Metoda se foloseşte pentru produsele cu conţinut ridicat de amidon sau în scopuri
microanalitice. Amidonul este insolubil în etanol şi în felul acesta se înlătură posibilitatea
antrenării sale în extract. In cazul microanalizei glucidelor se aplică extracţia alcoolică,
deoarece etanolul are un rol dublu: de extractant şi de defecant. Extractul alcoolic poate fi
tratat cu schimbător de ioni pentru a scoate eventualii anioni şi cationi existenţi în extract sau
poate fi tratat cu cărbune activ pentru înlăturarea pigmentilor solubili în etanol.
23
3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul
Indicele de refracţie
Indicele de refracţie este o constantă specifică fiecărei substanţe. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mărimea şi structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraţia unei soluţii şi astfel se poate stabili procentul de substanţă
uscată sau de apă.
Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abbé.
Indicele de refracţie este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca determinările
să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele sunt cuplate de
obicei cu baie ultratermostatată.
24
Tipuri de refractometre:
Se numeşte indice de refracţie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase faţă de
verticala (α) şi sinusul unghiului de refracţie (β).
Indicele de refracţie=sin α/sin β
Indicele de refracţie
Indicele de refracţie este o constantă specifică fiecărei substanţe. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mărimea şi structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraţia unei soluţii şi astfel se poate stabili procentul de substanţă
uscată sau de apă.
Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abbé.
Indicele de refracţie este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca
determinările să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele
sunt cuplate de obicei cu baie ultratermostatată.
Modul de lucru pentru refractometrul Abbe-Zeiss
1. Se depărtează prismele una de alta, se spală suprafaţa cu alcool şi se lasă să se usuce.
25
2. Cu o pipetă se pun câteva picături din lichidul de studiat pe suprafaţa prismelor, după
care se închide blocul prismelor.
3. Cu ajutorul oglinzii se îndreaptă fasciculul luminos către prisme.
4. Privind prin luneta din dreapta se pune la punct imaginea firelor reticulare prin învârtirea
ocularului. Apoi se caută domeniul de separaţie dintre câmpul luminos şi întunecat
învârtind butonul din stânga. Dacă în câmpul lunetei se observă o figură neregulată,
înseamnă că lichidul nu a acoperit întreaga suprafaţă a prismei. În acest caz se mai pun
câteva picături de lichid, până când domeniul luminos şi cel întunecat sunt separate
printr-o linie dreaptă.
5. Cu butonul din stânga se aduce încrucişarea firelor reticulare în suparapunere cunlinia de
separaţie. Cu lupa din stânga se citeşte pe scala gradată direct indicele de refracţie IR al
lichidului
6. Se repetă măsurătorile de cel puţin 3 ori.
Date experimentale:
Nr Repetitii/medie IR Conc SU
probei. solubila in apa
1 R1
R2
R3
M
2 R1
R2
R3
M
3 R1
R2
R3
M
26
3.2.Determinări cantitative ale glucidelor
Calcule si observatii
27
28
3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool
Determinarea zahărului reducător dupa această metodă este mult mai rapidă, nu
necesită aparatura specială (filtru G4) însă este mai puţin exactă decât metoda Bertrand.
Prin această metodă, cantitatea de oxid cupros formată se determină indirect, prin
dozarea iodometrică a sulfatului de cupru existent în soluţia Fehling, înainte şi după reducere.
Diferenţa obţinută reprezintă cantitatea de cupru redusă de către zahăr .
Reacţiile chimice care au loc sunt următoarele:
2 CuSO4 + 4 KI = 2 CuI + 2 K2SO4 + I2
I2 + Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6
Reactivi necesari: - soluţie Fehling I
- soluţie Fehling II
- tiosulfat de sodiu 0,1N
- iodură de potasiu 10%
- acid sulfuric, d=1,11
- amidon solubil 1%
Mod de lucru: Intr-un balon Erlenmeyer de 300ml se introduc 10ml soluţie Fehling I, 10ml
soluţie Fehling II şi 20ml din soluţia de analizat. Balonul se încălzeşte pe sită de azbest,
reglându-se astfel flacăra becului încât soluţia să fiarbă după trei minute. Se fierbe două
minute, se răceşte apoi soluţia în curent de apă după care se adaugă 20ml soluţie de iodură de
potasiu şi 15ml acid sulfuric.
Se titrează iodul pus în libertate, prin reducerea cuprului în iodură cuproasă, cu Na2S2O3
0,1N în prezenţa amidonului ca indicator. Titrarea se continuă până la dispariţia culorii
albastre.
Se face o probă martor pentru stabilirea titrului cantităţii de cupru din cei 10ml soluţie
Fehling.
Proba martor se lucrează în aceleaşi condiţii ca şi proba de analizat, cu diferenţa că în
locul soluţiei de zahăr se adaugă 20ml apă distilată.
Cantitatea de cupru redusă de către zahăr se află în funcţie de cantitatea de tiosulfat de
sodiu 0,1N folosită la titrare, pe baza relaţiei :
V =V1 – V2 în care
V = ml Na2S2O3 0,1N corespunzător zahărului care se găseşte în proba de analizat, in ml
V1 = ml tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei martor, în ml
V2 = ml de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei de analizat în ml
29
Determinarea zahărului invertit şi glucozei după Schoorl
Soluţia de Cupru mg Glucoză mg Zahăr Invertit
Na2S2O3 0,1N ml mg
1 6,4 3,2 3,2
2 12,7 6,3 6,4
3 19,1 9,4 9,7
4 25,4 12,6 13,0
5 31,8 15,9 16,4
6 38,2 19,2 19,8
7 44,5 22,4 23,2
8 50,9 25,6 26,5
9 57,3 28,9 29,9
10 63,6 32,3 33,4
11 70,0 35,7 36,8
12 76,3 39,0 40,3
13 82,7 42,4 43,8
14 89,1 45,8 47,3
15 95,4 49,3 50,8
16 101,8 52,8 54,3
17 108,1 56,3 58,0
18 114,4 59,8 61,8
19 120,8 63,3 65,5
20 127,2 66,9 69,4
21 133,5 70,7 73,3
22 139,8 74,5 77,2
23 146,2 78,5 81,2
24 152,6 82,6 85,2
25 159,0 86,6 89,2
Calcul şi observaţii
30
31
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu
Lactoza din lapte este unul din componentele extractului uscat total reprezentând
aproximativ 35%. Lactoza este un compus instabil suferind fermentaţii sub infuenţa
microorganismelor prezente în lapte.
Pentru determinarea lactozei din lapte se folosesc mai multe metode chimice
(metoda Bertrand, varianta Elser, metoda cu fericianurӑ de potasiu), sau se folosesc metode
instrumentale (metoda polarimetricӑ).
Lactoza, reduce în mediu alcalin şi la cald, fericianura de potasiu K3[Fe(CN)6] în
ferocianură de potasiu, K4[Fe(CN)6], ceea ce va duce la decolorarea soluţiei galbene de
fericianură.
Reactivi necesari : - sulfat de cupru, soluţie saturată
- soluţie alcalină de fericianură de potasiu: se dizolvă 23g fericianură de
potasiu în cca.400ml apă, iar în alt pahar 23g hidroxid de potasiu tot în cca. 400ml apă.
Cele două soluţii se trec în balon cotat de 1000ml, se completează cu apă la semn şi se
omogenizează.
- soluţie standard de lactoză: 5g lactoză se aduc cu apă în balon cotat de
1000ml, se completează la semn şi se omogenizează.1ml din această soluţie conţine
5mg lactoză.
Mod de lucru
Stabilirea titrului soluţiei de fericianură de potasiu : Intr-un vas Erlenmeyer se introduc
10ml soluţie alcalină de fericianură de potasiu, peste care se adaugă 30ml apă distilată şi se
aşează pe sita de azbest, iar deasupra lui se potriveşte biureta cu soluţie standard de lactoză.
Se porneşte flacăra şi când începe fierberea se picură soluţie de lactoză din biuretă agitând
flaconul după fiecare picătură, până în momentul în care culoarea galbenă dispare brusc.
Ritmul de picurare trebuie să fie rar,iar soluţia din vas în continuă fierbere moderată.
Titrul soluţiei de fericianură de potasiu exprimat în numărul de mg lactoză necesar pentru a
reduce 1ml soluţie de fericianură, se stabileşte cu ajutorul formulei :
T = V x5 / 10
în care : V = volumul soluţiei de lactoză folosit, în ml
5 = conţinutul de lactoză, în mg , corespunzător la 1ml soluţie
10 = volumul soluţiei de fericianură folosit,în ml
32
Determinarea: Intr-un balon cotat de 100ml se introduc 10ml lapte peste care se adaugă cca.
40ml apă şi se omogenizează. Adӑugӑm 1 ml soluţie saturatӑ de CuSO4, (0,5 ml solutie
saturata de fericianura de potasiu). Amestecul se agitӑ de 3-4 ori şi se completeazӑ cu apa
pâna la semn, dupa care se lasӑ 5 minute în repaus. După un repaos de 5 minute se filtrează
prin filtru cutat şi se obţine un lichid clar de culoare slab albăstruie. Pentru a îndepărta
excesul de sulfat de cupru adăugăm 0,5-1,0g pulbere de zinc, se omogenizează şi se filtrează
din nou. Astfel se obţine un lichid incolor şi perfect limpede.
Filtratul se introduce în biuretă şi se procedează în continuare ca la stabilirea titrului
soluţiei de fericianură.
Calculul rezultatelor
a. Calcul Titru
33
Interpretarea rezultatului
Continutul în lactoza al laptelui de vaca este în medie 4,55%.
Cantitatea de lactoza din lapte scade în cazul falsificӑrii laptelui cu apa precum si în cazul
modificarilor inflamatorii ale glandei mamare. Laptele cu aciditate de peste 21ºT nu se
preteazӑ pentru determinarea lactozei. În acest caz se vor obtine valori mai mici decât
cele pentru laptele proaspӑt deoarece procesele fermentative se desfӑşoarӑ în primul rând
pe seama lactozei.
Test
34
Laborator 5-6. Lipide
36
presiunea de jos în sus a glicerinei din pahar. Aproape instantaneu picătura de grăsime se
desprinde de capătul tubului capilar şi se ridică la suprafaţa stratului de glicerină.
37
potasiu, şi 100ml apă distilată, apoi se titrează repede cu tiosulfat de sodiu. Spre sfârşitul
titrării, când culoarea soluţiei se deschide la galben, se adaugă 3-5 picături soluţie de amidon;
soluţia se colorează în albastru. Se continuă titrarea agitând mereu, foarte energic, până la
dispariţia culorii albastre.
In aceleaşi condiţii se face si o probă martor, dar fără grăsime.
Calculul rezultatelor :
Indicele de iod = 0,01269 • (V – V1) • 100 / m în care:
0,01269 = cantitatea de iod, în g, corespunzătoare la 1ml tiosulfat de sodiu soluţie 0,1N
V = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martor
V1 = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei ce se analizează.
m = cantitatea de grăsime, în g, luată în lucru.
38
Din aceştia se calculează apoi numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru
saponificarea unui gram de grăsime şi care reprezintă indicele de saponificare.
Indicele de saponificare = (N1 – N2)• FHCl • 28 / G în care:
N1 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei martor
N2 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei de grăsime
28 = cantitatea de hidroxid de potasiu, în mg, corespunzătoare la 1ml hidroxid de potasiu,
G = masa de grăsime
39
- tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1N şi 0,01N
- amidon, soluţie 1%, proaspăt preparată
Mod de lucru: Probele de grăsime pentru această determinare se recoltează în borcane brune
de sticlă cu dop rodat. Recipientul se umple complet cu grăsime fără a se forma goluri de aer,
se închide etanş şi se păstrează la rece şi întuneric pe tot parcursul, până în momentul
analizei.
Proba se încălzeşte moderat pe baia de apă cu 5-10°C peste punctul de topire al
grăsimii, apoi se omogenizează uşor fără a se îngloba aer. Dacă grăsimea topită are un
conţinut mare de apă (este pronunţa tulbure) se adaugă cca. 20% sulfat de sodiu anhidru, se
omogenizează şi se lasă în repaus pentru decantare.
Din stratul clar de la suprafaţă se cântăreşte foarte exact într-un flacon cu dop rodat o
cantitate corelată cu indicele probabil de peroxid şi anume.
40
5.1.6. Reacţia Kreis
Aldehida epihidrinică se formează în mod constant în procesul de oxidare avansată a
grăsimilor. Ea reacţionează cu fluoroglucina în mediu acid, formând un compus colorat.
Intensitatea culorii este proporţională cu cantitatea de aldehidă epihidrinică, deci şi cu
procesul de oxidare.
Reactivi necesari: - fluoroglucină, soluţie eterică 0,1%. Se păstrează max 1 sӑpt. în sticle
brune
- acid clorhidric concentrat(d=1,19)
Mod de lucru: Intr-o eprubetă curată se introduce o anume cantitate din proba de grăsime,
după topirea prealabilă la temperatură moderată (cca.50°C). Se adaugă acelaşi volum de acid
clorhidric concentrat şi se omogenizează bine. Se adaugă în continuare acelaşi volum de
soluţie de fluoroglucină şi se omogenizează din nou.
Dacă untura este proaspătă soluţia din eprubetă rămâne incoloră sau capătă o tentă gălbuie.
Dacă sunt instalate procese de oxidare, apare o culoare roşie de diferite intensităţi, funcţie
de gradul râncezirii. Culoarea se dezvoltă imediat şi este stabilă o oră.
Calcule si observatii
41
6.1. Determinarea grăsimii –metoda Soxhlet –principiul metodei
Extractoare Soxhlet
42
6.2. Determinarea grăsimii din produsele lactate – metoda Gerber –
principiul metodei
Componentele majore din ţesurile şi umorile animale au greutate specifică 1,00 (apa) sau mai
mare de 1,00 (protidele, glucidele şi substanţele minerale). Lipidele au greutate specifică mai
mică decât unu. Există deci posibilitatea separării şi determinării lipidelor prin centrifugare.
Pentru aceasta este necesar ca toate componentele să se găsească sub formă de soluţie,
emulsie sau suspensie coloidală, situaţie ce se poate realiza în condiţii optime prin hidroliză
acidă.
Metoda se foloseşte în special pentru determinarea grăsimii din lapte şi din produsele
lactate. Prin adaptări corespunzătoare însă, se poate utiliza pentru determinarea grăsimii din
orice produs de origine animală.
Produsul de cercetat este introdus într-un recipient de sticlă special numit butirometru
unde este supus unei hidrolize rapide cu ajutorul acidului sulfuric. Grăsimea eliberată din
structura în care este încorporată, se separă prin centrifugare. Pentru uşurarea separării se
foloseşte alcoolul amilic. Cantitatea de grăsime, exprimată procentual, se citeşte direct pe tija
gradată a butirometrului.
Butirometre
Centrifugă Gerber
43
Test
44
Laborator 7-8-9. Determinarea proteinelor din produsele alimentare
Protidele sunt substanţe chimice esenţiale ale materie vii. Ele sunt formate în special din
aminoacizi. Sunt substanţe complexe care conţin C, H, O, N şi uneori sulf, fosfor, fier sau
cupru.
Rolul fundamental este cel plastic şi funcţional şi mai puţin energetic. Ele sunt
considerate cele mai importante substanţe prezente în regnul animal şi vegetal.
Aminoacizii sunt acizi carboxilici în care un atom de hidrogen a fost înlocuit cu o
grupare amino, -NH2; ei rezultă prin hidroliza acidă, bazică sau enzimatică a proteinelor.
Din punct de vedre al comportării faţă de diferiţi solvenţi protidele se clasifică în
proteine simple şi proteine conjugate. Prin hidroliză proteinele simple eliberează numai
aminoacizi, iar proteinele conjugate eliberează pe lângă aminoacizi şi o componentă
neproteică numită grupare prostetică.
In constituţia corpului omenesc se găsesc câteva mii de proteine diferite, cu structuri
speciale care corespund anumitor funcţii specifice.
Analiza calitativă şi cantitativă a aminoacizilor se bazează pe reacţiile specifice date
de gruparea amino, carboxil, de radicalul moleculei fiecărui aminoacid, de legăturile
peptidice, pe valoarea punctului izoelectric şi pe masa moleculară.
Reacţiile chimice prin care pot fi identificate protidele se împart în:
- Reacţii de culoare specifice sau generale
- Reacţii de precipitare
45
7.1. Obţinerea extractelor proteice
a.Albumina vegetală: 25g făină de grâu se amestecă cu 100ml apă distilată şi se lasă să
stea 30 minute, agitând din când în când. Se filtreză pe filtru cutat. Dacă primele porţiuni sunt
tulburi se filtrează din nou.
b.Albumină de origine animală : La 50ml lapte se adaugă un volum egal de apă distilată
şi apoi, în picături amestecând, 0,2-0,3ml acid acetic concentrat, până la obţinerea unui
precipitat floconos.
După 5-10 minute amestecul se filtrează printr-o pânză umezită în prealabil. Primele
cantităţi se refiltrează. Soluţia limpede, puţin gălbuie conţine albumină şi o parte din
globulina din lapte. Reziduul de pe filtru este constituit din cazeină şi grăsime.
c.Obţinerea proteinelor din albuşul de ou
O soluţie concentrată de proteine se formează dintr-un albuş de ou la care se adugă 5-6g
NaCl. Se agită puţin, se pune într-un vas de 500ml . Când trebuie preparată o soluţie diluată,
se ia un anumit volum din soluţia concentrată şi se diluează de două sau de trei ori cu apă
distilată.
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire
Proteinele sunt alcătuite dintr-un amestec de aminoacizi în diferite proporţii şi din această
cauză este important să cunoaştem aminoacizii constituenţi.
Separarea şi identificarea aminoacizilor constituenţi este posibilă prin cromatografie pe
hârtie sau în strat subţire.
In cromatografia pe hârtie se foloseşte hârtie de filtru îmbibată şi străbătută de diferite
amestecuri de solvenţi, de exemplu fenol-apă sau butanol–apă. Aceleaşi amestecuri de
solvenţi sunt folosiţi şi în cromatografia în strat subţire cu deosebirea că în acest caz faza fixă
este dispusă pe o placă de sticlă, şi este constituită dintr-un material poros solid–silicagel sau
oxid de aluminiu.
Aminoacizii se deplasează cu viteze diferite de-a lungul hârtiei sau a plăcii cromatografice.
Deoarece aminoacizii sunt incolori, trebuie să se realizeze o reacţie de culoare cu ninhidrină.
Aminoacizii se prezintă sub formă de pete de dimensiuni diferite, cu intensităţi diferite de
culoare.
Pentru a identifica în parte se face o cromatogramă de comparaţie, folosind câte un
aminoacid cunoscut, astfel se poate cunoaşte poziţia fiecărui aminoacid în cromatogramă.
Aparaturӑ necesara : - amestec de 2-3 aminoacizi (1mg/ml apă, 0,1%)
46
- soluţii de control de aminoacizi (1mg/ml)
- amestec de developare butanol-acid acetic- apă 4:1:5
- ninhidrină 0,1-0,2% în butanol
- Hârtie cromatografică Whatman nr.1 sau plăci cromatografice
Mod de lucru: Pe o placă cromatografică se trag linii paralele la distanţe de 1cm. La 2cm de
marginea inferioară se aşează cu micropipeta câte o picătură din soluţia de cercetat şi din
soluţiile de control. Diametrul fiecărei picături trebuie să fie cca. 2-3mm, iar cantitatea
maximă de aminoacizi într-o pată în jur de 0,03mg/. Placa cromatografică se introduce în
tancul de cromatografiere care conţine amestecul de developare, astfel încât capătul pe care
au fost puşi aminoacizii să ajungă în soluţie. Petele de aminoacizi nu trebuie să intre în
amestecul de developare. Se lasă un timp, până când frontul solventului ajunge la 2cm de la
marginea superioară a plăcii. Se scoate placa, se usucă în etuvă la 100°C şi se pulverizează
cu ninhidrină. Se introduce 10 minute în etuvă la 90°C, apoi se observă poziţia şi intensitatea
culorii petelor apărute şi se calculează Rf-ul.
Distanţa de la linia de start la pată
Rf = ——————————————————————
Distanţa de la linia de start până la frontul solventului
47
http://www.reachdevices.com/TLC_aminoacids.html
http://www.youtube.com/watch?v=tDaKxskUwA0
48
8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen
50
8.2. Determinarea conţinutului de cazeinӑ din lapte
Principiul metodei
Metoda are la bazӑ determinarea titrului proteic prin metoda Sorensen.Formaldehida adӑugatӑ
în lapte blocheazӑ grupӑrile amino, din proteine si determinӑ creşterea aciditӑţii libere.
Mӑsurarea nivelului aciditӑţii libere dupӑ blocarea grupӑrilor aminice stӑ la baza determinӑrii
proteinelor din lapte.
Mod de lucru
Intr-un balon Erlenmeyer de 100 ml se adaugӑ 10 ml lapte; 0,5 ml soluţie alcoolicӑ de
fenolftaleinӑ şi se titreazӑ cu NaOH 0,1 M pânӑ la culoarea roz. Adӑugӑm 2 ml formaldehidӑ
20% şi se titreazӑ din nou cu NaOH 0,1M pânӑ la apariţia coloraţiei roz care persist 30
secunde.
Conţinutul de casein se calculeazӑ cu ajutorul formulei urmӑtoare
Caseinӑ g% = V x 1,47
Unde, V = – volumul NaOH folosit la a doua titrare
1,47 – factor de conversie pentru cseiӑ
Conţinut mediu de cazeinӑ în diferite tipuri de lapte:
vacӑ - 2,60%,
caprӑ - 2,90%,
oaie - 4,50%,
51
9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului
Principiul metodei
Sulfatul de cupru în mediu bazic reacţioneazӑ cu substanţele care conţin 2 sau mai
multe legӑturi peptidice formând un complex colorat în albastru- violet. Intensitatea culorii
este direct proporţionalӑ cu numӑrul legӑturilor peptidice din proteinӑ. Numele metodei
provine de la compusul biuret H2N-CO-NH-CO-NH2 care dӑ reacţie pozitivӑ tipicӑ. Metoda
este folositӑ pentru determinarea unor cantitӑţi relativ mari de proteinӑ (1-20 mg).
Reactivi
- Soluţie standard de albuminӑ sericӑ bovinӑ 5mg/ml preparatӑ extemporaneu
- Reactiv biuret (3g CuSO4 x 5 H2) si 9 g tartrat de sodiu si potasiu in 500 ml solutie NaOH
0,2M, se adaugӑ 5g KI şi se aduce la 1 l cu NaOH 0,2 M.
- extract proteic total obţinut prin centrifugarea unui omogenat (1g tesut hepatic /10 ml apӑ
distilatӑ)
Mod de lucru
In 6 eprubete se pipeteazӑ:
Nr. ml solutie ml apa Proteinӑ Absorbanta
crt standard distilatӑ mg/2ml DO
1 0 2,0 0
2 0,1 1,9 ,5
3 0,5 1,5 2,5
4 1,0 1,0 5
5 1,5 0,5 7,5
6 2,0 0 10
52
Calcule şi observaţii
53
9.2.Determinarea proteinelor – metoda Kjeldhal –principiul metodei
Componenta de bază, cu valoare nutritivă, din majoritatea produselor alimentare de
origine animalădar si vegetalӑ este proteina. Calitatea acestor produse se apreciază, în primul
rând, după conţinutul lor în proteine.
Proteinele dintr-un anumit tipde aliment au un conţinut de azot cu valoare relativ
constantă, la 100g proteine. Cunoscând conţinutul de azot se poate calcula cantitatea de
proteine cu ajutorul unui factor de convertire
Exemplu pentru carne -Continutul de azot este 16 g la 100 g protein. Factorul de
convertire este 6,25 (rezultat din raportul 100/16).
Principiul metodei
Proba de analizat se mineralizează prin încălzire cu acid sulfuric concentrat în
prezenţa unui catalizator. în urma degradării proteinelor şi a celorlalţi compuşi cu azot, se pun
în libertate ionii de amoniu care se combină cu acidul sulfuric formând bisulfatul de amoniu.
Amoniacul pus în libertate prin alcalinizare puternică este distilat şi titrat.
TEST
54
Laborator 10. Enzime
Enzimele sunt substanţe de naturӑ proteicӑ, fiind constituite fie numai din resturi de
aminoacizi, legaţi prin legături peptidice, fie din catene polipeptidice şi alte componente
organice sau anorganice. Acestea prezintă structuri spaţiale complicate.
Enzimele, numite şi biocatalizatori, accelerează viteza reacţiilor biochimice de 10 8 –
1011 ori prezentând o capacitate catalitică superioară catalizatorilor chimici.Reacţiile care în
laboratoarele de chimie decurg în condiţii speciale de temperatură, presiune, pH, în prezenţa
enzimelor decurg în condiţii moderate.
Activitatea catalizatorilor, indiferent de natura lor chimică, se caracterizează prin
faptul că poate fi decelată când aceştia se găsesc în cantităţi foarte mici. La sfârşitul reacţiei
atât catalizatorul chimic cât şi enzima se regăsesc, într-o stare neschimbată, putând participa
la un nou atac catalitic.
Enzimele au un grad deosebit de complexitate, motiv pentru care sunt uşor
denaturabile prin modificarea temperaturii, pH-ului, prin acţiunea razelor UV, a
ultrasunetelor, prin congelări şi decongelări repetate etc.
Deosebirea esenţială dintre enzime şi catalizatorii chimici constă în înalta specificitate
de acţiune a enzimelor, având capacitatea de a cataliza un singur tip de reacţie biochimică,
uneori a unei singure substanţe chimice (specificitate absolută de substrat).
56
10.2. Influenţa factorilor fizico-chimici asupra activităţii enzimelor
10.2.1.Influenţa temperaturii asupra activităţii enzimelor
Acţiunea temperaturii asupra reacţiilor enzimatice este dublă:
- modifică viteza reacţiei enzimatice
- denaturează enzima, respectiv apoenzima care este de natură proteică
Majoritatea enzimelor au o temperatură optimă, între 20-40°C. La temperaturi sub 0°C,
activitatea enzimelor scade foarte mult, fără să fie distruse. Sub formă uscată, enzimele îşi
păstrează activitatea şi unele pot rezista scurt timp la o temperatură de 100°C. Se preferă ca
temperatură de lucru +37°C, deoarece distrugerea enzimei este practic nulă, iar viteza reacţiei
este suficient de mare.
Reactivi necesari : - salivă diluată
- soluţie de amidon 1% în clorură de sodiu 0,3%
- reactiv Fehling
Mod de lucru: In două eprubete se măsoară câte 4ml soluţie amidon 1% în clorură de sodiu
0,3%. Intr-o eprubetă se adaugă 1ml salivă proaspătă, nefiartă, iar în a doua 1ml salivă fiartă.
Se agită şi se introduc în termostat la + 37°C timp de 15 minute. Se adaugă în fiecare
eprubetă 1ml reactiv Fehling şi se fierbe pe baie de apă 5 minute. In eprubeta cu salivă
nefiartă, reactivul Fehling este redus la suboxid de cupru de culoare roşie cărămizie. In
eprubeta cu salivă fiartă, unde amilaza este distrusă prin fierbere, amidonul; nefiind
hidrolizat, reactivul Fehling nu este redus, deci culoarea nu se schimbă.
57
10.2.2. Influenţa pH-ului asupra activităţii enzimatice.
58
TEST
59
Laborator 11-12. Vitamine
Celulele conţin pe lângă componentele lor de bază, anumite substanţe organice, active la
concentraţii foarte mici, numite vitamine, care sunt vitale pentru organism. Unele organisme
nu pot sintetiza vitamine şi trebuie să le obţină din surse exogene.
Lipsa vitaminelor din organism (avitaminoză), insuficienţa (hipovitaminoză) sau
concentraţia crescută (hipervitaminoză) dau naştere la tulburări metabolice mai mult sau mai
puţin grave.
Vitaminele au structură chimică heterogenă şi din această cauză clasificarea lor este foarte
dificilă.Cel mai des folosit criteriu este în funcţie de solubilitate şi după acest criteriu există
vitamine liposolubile (A, D, E, K) şi vitamine hidrosolubile (vitaminele B, C, PP).
Fiecare vitamină prezintă reacţii caracteristice majoritatea lor fiind reacţii de culoare.
Identificarea vitaminei A
a. Vitamina A dă cu acidul tricloracetic o coloraţie galbenă care virează în albastru.
Reactivi necesari: - soluţie uleioasă de vitamina A 0,1mg%
- soluţie cloroformică de acid tricloracetic 30%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluţie uleioasă de vitamina A şi 1ml soluţie
acid tricloracetic 30%. Apare o coloraţie galbenă care virează în albastru.
60
Reactivi necesari : - concentrate de vitamina A
- cloroform purificat
- soluţie cloroformică de clorură de stibiu
Mod de lucru : la 4-5 picături de soluţie de vitamina A se adaugă 1ml cloroform şi 1-2 ml
soluţie cloroformică de clorură de stibiu. Se agită conţinutul eprubetei. Apare o coloraţie
albastră proporţională cu conţinutul de vitamina A.
In cazul determinărilor cantitative se compară culoarea obţinută cu o scară etalon sau
colorimetric.
Identificarea vitaminei D
a. Reacţia cu aldehide: Vitaminele D reacţionează cu aldehidele aromatice (vanilină,
furfural), în prezenţa acidului percloric, cu formarea de produşi coloraţi.
Reactivi necesari : - soluţie benzenică de vitamina D
- soluţie 0,1% de aldehidă aromatică în benzen
- acid acetic glacial
- amestec de acid percloric ; 2ml aldehidă acetică se tratează
2,5ml acid acetic glacial şi se încălzeşte la 95-100°C, timp
de 30 minute .
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml soluţie benzenică de vitamina D şi 1ml de aldehidă
aromatică în benzen şi se încălzesc la fierbere. Se adaugă apoi două picături de reactiv
percloric şi se fierb încă un minut, apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Soluţia
devine tulbure, colorată în verde. Se adaugă 1,5ml acid acetic şi se urmăreşte culoarea
formată.
a. Reacţia cu clorura de stibiu : soluţia benzenică de vitamina D se tratează cu cloroform
în raport de 1:10 şi apoi cu o soluţie cloroformică de clorură de stibiu.şi se obţine o coloraţie
galben-portocalie.
b. Reactia cu anilină
Reactivi necesari: - untură de peşte
- amestec anilină : HCl, în raport 15:1
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se introduc 3ml untură de peşte sau soluţie uleioasă de
vitamina D, şi 1ml amestec de anilină :HCl. Se agită uşor si se încălzeşte la fierbere. Emulsia
galbenă devine la început verde şters apoi trece în roşu. După 2-3 minute emulsia se separă în
două straturi dintre care cel inferior are o culoare roşie intensă.
61
Identificarea vitaminei E
a. Reacţia cu acidul azotic
α- tocoferolul se oxidează în prezenţa clorurii ferice sau a acidului azotic la α-
tocoferilchinonă, de culoare roşie
Reactivi necesari : - soluţie uleioasă de vitamina E
- etanol
- acid azotic concentrat
Mod de lucru : Se iau într-o eprubetă câteva picături dintr-o soluţie uleioasă de vitamina E,
se tratează cu câteva picături de acid azotic concentrat. Conţinutul se încălzeşte de la sine şi
apare o coloraţie brună roşie (se lucrează cu atenţie şi la nevoie se răceşte).
c.Reacţia cu clorura ferică
Datorită grupării hidroxil tocoferolii dau reacţie pozitivă cu clorura ferică. Reacţia este
specifică fenolilor, care sunt oxidaţi la compuşi chinonici.
Reactivi necesari : - soluţie alcoolică de vitamină E 0,1mg %
- soluţie clorură ferică 10%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 0,5ml solutie alcoolică de vitamină E şi 2-3
picături soluţie clorură ferică 10%. După agitare apare o coloratie galben-roşiatică
Identificarea vitaminelor B
a.Vitamina B1: In mediu alcalin este oxidată de fericianura de potasiu la tiocrom de culoare
roşie, care prezintă o fluorescenţă albastră în UV.
Reactivi necesari : - soluţie vitamina B1 1g ‰
- solutie de fericianură de potasiu 2%
- metanol
- NaOH 30%
- izobutanol
- etanol 96°
Mod de lucru: Intr-o pâlnie de separare se pipetează 1ml din soluţia de vitamină, 4 picături
metanol şi 1-2 picături de fericianură de potasiu 2%. Se agită şi se adaugă 1ml sol. NaOH
30%. Se lasă în repaus 2 minute şi se introduc 10ml izobutanol, după care se agită energic. Se
lasă în repaus câteva minute, după care timp se separă cele două straturi. Stratul inferior apos
se îndepărtează şi se reţine stratul cu izobutanol care conţine tiocromul. Se spală cu 3ml apă
distilată. Se separă apa, iar stratul de izobutanol se tranvazează într-o eprubetă şi se adaugă
62
2ml etanol. Eprubeta se aşează în faţa unei surse de lumină UV, când se observă apariţia unei
fluorescente albastre.
b. Vitamina B2: prezintă fluorescenţă galben-verzuie şi sub acţiunea reducătorilor trece în
leucoderivat, care nu mai prezintă fluorescenţă. Reacţia este reversibilă şi îşi recapătă
fluorescenta în prezenţa oxigenului.
Reactivi necesari : - soluţie vitamina B2 50mg %
- zinc metalic granule
- soluţie acid clorhidric 10%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 1ml soluţie vitamină B2, care prezintă o
fluorescenţă galben-verzuie. Se adaugă 20-30 mg zinc metalic şi 2ml acid clorhidric 10%. Se
agită de câteva ori şi se observă dispariţia fluorescenţei. Se astupă eprubeta cu degetul şi se
agită. Se observă apariţia fluorescenţei, datorită oxidării vitaminei sub acţiunea oxigenului
atmosferic.
Identificarea Vitaminei C
a. Vitamina C datorită proprietăţii de a se oxida uşor, reduce sărurile de argint la argint
metalic.
Reactivi necesari : - soluţie vitamină C 3g%
- soluţie azotat de argint 5g%
- soluţie hidroxid de amoniu 20%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 1ml azotat de argint şi se adaugă hidroxid de
amoniu picătură cu picătură până la dizolvarea precipitatului format iniţial. Se adaugă 2ml
soluţie de vitamină C şi se încălzeşte pe baie de apă 5-10 minute. Va apărea argintul metalic
depus pe pereţii eprubetei.
b. Vitamina C se extrage din ţesuturi cu soluţii slab acide pentru a fi evitată alterarea ei, apoi
se identifică cu ajutorul fericianurii de potasiu. In prezenţa clorurii ferice, vitamina C, reduce
fericianura de potasiu, formând albastrul de Berlin.
Reactivi necesari : - soluţie de HCl 2%
- fericianură de potasiu 1%
- clorură ferică soluţie 1%
Mod de lucru: Se cântăresc 4-5g din materialul vegetal şi se introduc într-un mojar unde se
mojarează cu nisip şi HCl 2%. Se aduce apoi volumul la 100ml cu acid clorhidric şi se
filtrează. Din acest lichid se introduc 5ml într-o eprubetă şi se tratează cu o picătură de sol.
fericianură de potasiu şi o picătură de sol. de clorură ferică. Rezultă o coloraţie albastră.
63
11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale
Se bazează pe proprietatea reducătoare a acidului ascorbic. Acidul ascorbic prin
oxidare se transformă în acid dehidroascorbic. Dozările se fac prin volumetrie iar solutia de
titrare este - iodat de potasiu,
Extracţia din produse vegetale
15 g produs vegetal se mojarează timp de 10 minute cu 2,5 g de nisip si 10 ml de acid
metafosforic. Se complectează la 50 ml cu acid metafosforic, se filtrează sau se
centrifughează. Din filtrat se iau 10 ml si se dozează vitamina C la fel ca din suc.
Dozarea vitamine C
Reactivi: - soluţie standard vitamina C 1 mg/ml
- amidon 1%
- HCl 1M
- Iodat de K 0,004N (1,2g KI + 0,478g I2, se aduce la 1000 ml cu apă distilată).
- acid metafosforic 5%
10 ml de soluţie standard de vitamina C se amestecă cu 20 ml apă distilată, 2 picături
de HCl 1 M şi 15 picături de amidon 1%, se titrează cu iodat de K până la culoarea albastră
care persistă 15 secunde. Se notează cu V volumul de iodat folosit la titrare.
Se repetă aceleaşi operaţii pentru suc sau pentru supernatant, în loc de 10 ml soluţie
standard se vor folosi 10 ml suc sau filtrat.
Se notează cu V1 volumul de iodat folosit la titrare.
Calcul
Pentru suc
10 x V1
vitamina C mg /10 ml suc = -------------
V
Pentru vegetale
10 x V1 x 5
vitamina C mg /100 g produs = ----------------- x 100
Vxm
V = vol. de iodat folosit la titrarea soluţiei standard
V1 = vol. de iodat folosit la titrarea probei
5 = dilutia
10 = ml solutie standard luata in lucru
m = masa probei (15g)
100 = raportarea la 100 g produs
64
Calcul si observatii
65
11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans
In mediu acid vitamina C este oxidată la acid dehidroascorbic de către reactivul Tillmans
(2,6-diclorfenolindofenol) de culoare roşie, care se reduce consecutiv transformându-se în
leucoderivatul corespunzător incolor.
Intr-un flacon Erlenmeyer se pun 20ml lapte, peste care se adaugă sub agitare, 8ml soluţie
de acid metafosforic . Se omogenizează şi apoi se filtrează. Inr-un alt flacon Erlenmeyer se
pipetează 14ml filtrat (echivalentul a 10ml de lapte) şi se titrează cu reactiv Tillmans, până la
apariţia culorii roz persistente 30 de secunde.
66
Calcul : Conţinutul în vitamină C, exprimat în mg la 100ml lapte, se calculează cu ajutorul
formulei:
Vitamină C, mg la 100ml = V·T·100 / V1
în care:
V = volumul soluţiei de indicator, în ml, folosit la titrare
T = titrul soluţiei de indicator
V1= volumul de lapte corespunzător celor 14ml filtrat luat în lucru (10ml)
Conţinutul vitaminei C din lapte este cuprins între 10 şi 80 mg/l cu variaţii în funcţie de
specie , tipul de alimentaţie şi sezon, fiind mai ridicat vara când animalele se hrănesc cu iarbă
şi cu diferite nutreţuri verzi.
Calcule şi observaţii laborator 12
67
TEST
1. Ce este acidul ascorbic, ce rol are în organism ? Dati exemple de surse naturale de acid
ascorbic.
2. Mentionaţi pentru fiecare vitamină din grupul B, numele şi rolul în organism
3. Ce rol are vitamina A în organism, şi care sunt produsele alimentare bogate în vitamina
A? Ce sunt provitaminele A?
4. Indicaţi o metodă de identificare a vitaminei A care poate fi utilizată si pentru
determinarea cantitativă a vitaminei A.
5. Care sunt factorii care influenţează stabilitatea vitaminelor ? Daţi exemplu pentru
vitamina A, B1 şi C.
68
Laborator 13.Pigmenţi
Culoarea diferitelor organe ale plantelor se datoreazӑ unor substanţe colorate, numite
pigmenţi.
Pigmenţii naturali au rol biochimic şi fiziologic foarte important. Iau parte la
numeroase procese metabolice, formează sisteme de oxidoreducere, dau gustul, aroma şi
coloritul unor produse alimentare. Pigmenţii clorofilieni au rol esenţial în procesul de
fotosinteză
Sub aspect chimic, pigmenţii naturali sunt substanţe foarte heterogene. Ei se găsesc
în celule şi ţesuturi în stare liberă sau sub formă de cromoproteide, glicozide etc.In general se
găsesc în cantităţi mici şi se determină prin metode cromatografice, colorimetrice şi
spectrofotometrice.
http://www.uni-
regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC-e.htm
70
13.2. Determinarea spectrofotometricӑ a conţinutului de clorofilӑ
Mod de lucru
- Se cântӑresc 100 mg frunzӑ /probӑ.
- Se mojareazӑ cu 10 ml acetonӑ 80% cu ajutorul nisipului sau a sticlei pisate
- Se filtreazӑ si filtratul se colecteazӑ intr- eprubetӑ.
Determinarea concentratiei de clorofilӑ.
Blanckul folosit este acetona. Se umple cuva spectrofotometrului cu extractul obtinut
si se citesc absorbantele la urmӑtoarele lungimi de undӑ: 663 nm; 645 nm; 470 nm.
Calcule:
Folosind ecuaţia Arnon se calculeazӑ continutul de clorofila
Chl a (mg/g) = [(12.7 × A663) - (2.6 × A645)] × ml acetona / mg frunze
Chl b (mg/g) = [(22.9 × A645) - (4.68 × A663)] × ml acetona / mg frunze
Total Chl = Chl a + Chl b.
C x+c = 1000 A470 – 1.90Chla – 63.14 Chlb/214, (x = xantofila si caroten)
71
TEST
72
Laborator 14. Evaluare laborator.
73
BIBLIOGRAFIE
74
75