UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE AGRICULTUR Sisteme de procesare i controlul calitii produselor alimentare nvmnt la distan

DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC A CLOROFILEI A I B DIN FRUNZA DE SPINACIA OLERACEA(Spanac)

Masterand : Pop Laura - Andreea

Cluj-Napoca

2011

C UPRINS

1. CLASA DE COMPUI.........................................................................................3 1.1. Definiie......................................................................................................3 1.2. Rolul clorofilei...........................................................................................3 1.3. Structuta chimic........................................................................................3 1.4. Proprietiel pigmenilor asimilatori......................................................... 4 2. SPANACUL SPINACIA OLERACEA........................................................... 5 2.1. Caracteristici generale................................................................................5 2.2. Tipuri de spanac.........................................................................................6 2.3. Componentele spanacului...........................................................................6 2.4. Rezistena spanacului.................................................................................7 3. METODE DE ANALIZ.....................................................................................7 3.1. Metoda spectrofotometric.........................................................................7 3.2. Metoda cromatografic...............................................................................9 4. METODA SPECTROFOTOMETRIC.............................................................10 5. MATERIALELE NECESARE I APARATURA UTILIZAT.......................11 6. METODA DCE LUCRU....................................................................................11 7. INTERPRETAREA REZULTATELOR........................................................... 12 8. BIBLIOGRAFIE............................................................................................... 13

DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC A CLOROFILEI A I B

1. CLASA DE COMPUI
1.1 Definiie

Clorofila (n limba greac cloros nsemnnd verde) este un pigment de culoare verde, esenial n procesul de fotosintez, prin intermediul acesteia avnd loc transformarea energiei luminoase n energie. Clorofila este una dintre substanele fundamentale din natur, care prin prezena sa n celulele plantelor i algelor, la nivelul cloroplastelor, asigur baza energetic i respiratorie aproape tuturor celorlalte organisme de pe Terra. Graie clorofilei, plantele verzi sunt organisme autotrofe, iar fotosinteza este cel mai important proces biochimic de pe Pmnt.

1.2 Rolul clorofilei

n frunze clorofila se gsete legat de o protein, plastina cu care formeaz o cromoproteid, denumit cloropastin, cu o mare stabilitate comparativ cu clorofila pur. Clorofila se afl n membrana tilacoidelor din cloroplaste unde se pare c formeaz fotosisteme (denumite fotosistemul I i II, respectiv P680 i P700 dup lungimea de und absorbit) mpreun cu pigmenii. n cadrul acestor fotosisteme clorofila se pare c ndeplinete 2 funcii:

Absorbia luminii Transferul energiei ctre cuplul clorofilei din centrul reactiv al fotosistemului. Lumina absorbit de ctre clorofil determin eliminarea unui electron cu un potenial energetic foarte mare, electron care n final va reveni la clorofil dar cu un potenial energetic mult mai mic. In cadrul acestei reacii clorofila joac rol de catalizator, molecula de clorofil oxidat, revenind din nou la forma iniial prin (re)captarea unui electron. 1.3 Structura chimic

Are la baz inelul porfirinic, acelasi care st i la baza hemului, ns ca ion central este magneziul.

Pigmenii care se gsesc n cloroplaste difer n ceea ce privete compoziia chimic. n plantele verzi exist: clorofila, n agele roii: ficoeritrina, n algele albastre: ficocianina i n unele bacterii: bacterioclorofila. Clorofila este alcatuit din 4 nuclee pirolice care formeaz nucleul porfirinic, care are la centru un atom de magneziu. De nucleul porfirinic se leag fitolul, care este alcoolul unei hidrocarburi superioare. Dintre clorofile cele mai rspndite sunt clorofila a i clorofila b. Clorofila a are o grupare metilic, n timp ce clorofila b are o grupare aldehidic. Raportul dintre clorofila a i b este 3/1 i poate crete n cazul plantelor heliofile, iubitoare de lumin. Pigmenii carotenoizi sunt reprezentai de carotin i xantofil. Carotina este alcatuit dintr-un lan de carboni cu legaturi dublu conjugate, care are la capete cate un ciclu iononic. Carotenii pot absorbi radiaiile luminoase din zona albastr a spectrului (400-600nm) i energia absorbit o pot transfera pigmenilor clorofilieni. n acelai timp au i rol de fotoprotecie, n absena carotenilor plantele sufer leziuni determinate de procesul de fotooxidare. Se observ cele 4 cicluri pirolice, legate ntre ele prin puni metilenice: Magneziul leag coordinativ 2 atomi de N datorit electronilor neparticipani.

1.4 Proprietile pigmentilor asimilatori

Proprietile pigmenilor asimilatori sunt urmtoarele: Absorb energia luminoas, care este utilizat n faza de lumina a fotosintezei; Sunt solubili n solveni organici; Culoarea: - clorofila a verde albstrui; clorofila b verde glbui; carotina portocaliu; xantofila - galben;

Flurescena clorofilei; Fotooxidarea; Saponificarea.

Reacia cu acizii minerali-magneziul este nlocuit cu hidrogenul rezultnd feofitina.

SPANACUL SPINACIA OLERACEA 2.1 Caracteristici generale

Spanacul (Spinacia oleracea) este o plant legumicol anual, erbacee, care formeaz un sistem radicular puternic i o rozet de frunze mari, de lungime de la 2 pn la 30 cm i cu limea cuprins ntre 1 i 15 cm., crnoase, netede sau ondulate, de culoare verde, care reprezint partea comestibil. Tulpina florifer este nalt de 60-80 cm, goal n interior i ramificat, cu flori unisexuat dioice, cu polenizare alogam i entomofil. Plantele masculine sunt mai puin viguroase, formeaz frunze puine i nfloresc mai devreme, iar florile, cu diametrul 3-4 mm, de culoare galben verzui, sunt grupate n inflorescente. Plantele femeieti sunt viguroase, formeaz frunze mari, crnoase, n numr mai mare, iar florile se gsesc la subsuoara frunzelor, grupate mai multe la un loc. Fructul la spanac este rotund sau coluros, de culoare cenuiu-verzuie i i pstreaz facultatea germinativ timp de 4-5 ani.

2.2 Tipuri de spanac

,,Matador" - soi semitimpuriu (40-50 de zile), cu rozeta de frunze compact i semierect, ,,Matares" - soi semitimpuriu (40-50 de zile, cu frunze de culoare verde-nchis, cu suprafaa ,,Smarald" - soi trziu (50-55 de zile), foarte precoce, cu frunze de culoare verde-nchis,

frunza este neted de culoare verde-nchis. neted sau puin gofrat, rotunjite la vrf, i rozeta semierect. lanceolate i rozeta semierect.

2.3 Componentele spanacului

Componentele spanacului considerate la 100 de grame spanac proaspt sunt: Component Calorii (coninut energetic) Ap Albumin Hidrai de carbon Grsimi Acid oxalic Carotinoid Vitamina B1 Vitamina B2 Acid nicotinic (Vitamina B3) Vitamina B6 Vitamina C Vitamina E Fier Potasiu Calciu Cupru 6 Cantitate 20 kcal/85kJ 92,7% 2,5 g 1,6 g 0,4 g 0,8 g 0,7 mg 0,1 mg 0,2 mg 0,6 mg 0,2 mg 40-150 mg 2,5 mg 3-4 mg 0,45 g 130 mg 0,1 mg

Magneziu Sodiu Fosfor Zinc

23 mg 65 mg 45 mg 0,22 g

2.4 Rezistena spanacului

Spanacul este rezistent la temperaturi sczute, astfel c se cultiv toamna i se recolteaz primvara. Seminele germineaz la 3 - 4C i pot rmne n sol peste iarn fr s-i piard viabilitatea. n faza de rozet, poate rezista la temperaturi de -10C, dac solul este acoperit cu zpad. Pentru cretere, are nevoie de 14 - 15C, iar temperatura prea ridicat determin emiterea tijei florale. Nu este pretenios fa de lumin, iar calitatea frunzelor este mai bun la intensiti moderate ale luminii. n sol are nevoie de ap n cantitate optim, pe toat perioada de vegetaie, din pricina ritmului intens de cretere i a frunziului bogat, care pierde prin transpiraie cantiti destul de mari. n lipsa apei, rozetele de frunze sunt mici i mbtrnesc repede. Spanacul se cultiva pe soluri bine pregtite, mijlocii sau uoare, fertile, bogate n humus, drenate, cu mare capacitate de reinere a apei i bine expuse la soare.

3 METODE DE ANALIZ 3.1 Metoda spectrofotometric

Primele metode spectrofotometrice de determinare a clorofilei au fost determinate n urm cu 40 de ani de ctre cei ca Strickland & Parsons (1968) i Lorenzen (1967), metode care sunt folosite i n ziua de azi. Spectrofotometria msoar instrumental lumina transmis de o soluie colorat lucrnd cu o surs de lumin monocromatic. Lumina incident este filtrat prin filtre optice, avnd un spectru mai ngust (utiliznd monocromatoare). Astfel este posibil fixarea mai precis a lungimii de und la care se lucreaz. Utiliznd aceast metod se poate trasa un spectru de absorbie, adic o curb, obinut prin msurarea semnalului n funcie de lungimea de und a radiaiei incidente. Schematic, prile componente ale unui spectrofotometru de absorbie este redat n figura de mai jos. 7

n literatura de specialitate uneori se folosete pentru metoda spectrofotometric i denumirea de metod colorimetric (sau chiar spectrocolorimetric), ceea ce uneori poate crea confuzii. n domeniul UV, ochiul omenesc nepercepnd lumina, se utilizeaz doar spectrofotometria. Spectrofotometrul este un aparat spectral conceput pentru a msura extincia sau transmisia radiaiilor optice de diferite lungimi de und prin diverse probe. La modul cel mai general, un spectrofotometru este alctuit dintr-o sursa de radiaii, o fant de intrare reglabil care modific fluxul de lumin care vine de la surs, un element dispersiv (prisma sau reea dar mai des se foloete o reea), mai multe oglinzi care asigur direcionarea fasciculului de lumin, departament probelor i elementul de masur (un fotodetector i un amplificator). Adaugnd diverse accesorii, spectrometrele pot efectua i alte tipuri de msuratori cum ar fi cele de reflexie difuza, de fluorescenta etc. Alte accesorii permit automatizarea diferitelor operatii cum ar fi baleierea repetitiva, schimbarea automata a probelor, citirea extinctiilor cu un computer etc.

3.2 Metoda cromatografic Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart denumirea de faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt - faza mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. 8

Separarea se petrece n coloana cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil, denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit migrare difereniat. Adic moleculele migreaz n grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza mobil. n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce formeaz iniial proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea concurenilor la sosire n atletism. Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram. S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare: Cromatografia de adsorbie; Cromatografia ionic (de schimb ionic; Cromatografia de excluziune steric; Cromatografia lichid-lichid (LLC); Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC); Cromatogafia pe hrtie; Cromatografia pe strat subire (TLC); Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), 9

Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC) n faza staionar are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza acestora. Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.

METODA ALEAS - SPECTROFOTOMETRIC

Pigmenii asimilatori au capacitatea de a absorbi selectiv radiaiile spectrului solar. Spectrofotometria este o metod prin care este msurat cantitatea de lumin pe care o prob o

absoarbe la o anumit lungime de und. Cea mai util msur a absorbiei luminii este absorbana (A). Absorbana este msurat de un instrument denumit spectrofotometru. Instrumentul este format dintr-o surs de lumin, un dispozitiv de selecie a lungimii de und (o prism), o camer a probei, un detector de lumin, un nregistrator. Graficul absorbanei fa de lungimea de und este denumit spectru de absorbie. Pentru determinarea spectrului de absorbie al fiecrui pigment n parte se utilizeaz un extract de pigmeni n alcool etilic. Valorile absorbanei sunt citite pentru lungimile de und cuprinse ntre 400 nm i 700 nm. Analiza chimic cantitativ n spectrofotometria de absorbie se bazeaz pe legea Lambert-Beer. Se utilizeaz o curb de calibrare (etalonare): A = f(C), trasat pentru probe de concentraii cunoscute, n aceleai condiii cu cele de analizat, evident lucrndu-se cu aceeai celul i la o lungime de und ct mai riguros monocromatic. Se alege un domeniu de concentraii, pe care se pregtesc 5-8 probe cunoscute i, dup trasarea dependenei, grafic sau analitic, se poate trece la analiza cantitativ. Domeniul pe care curba de etalonare este perfect liniar nu este foarte larg (de cel mult o decad de concentraii). De aceea metoda nu poate funciona dect strict pe domeniul pentru care a fost trasat i, cel mai corect, pe poriunea de la jumtatea dreptei. Se fac mai multe citiri. Cu ct eroarea la determinarea absorbanei este mai mic cu att eroarea de determinare a concentraiei va fi mai cobort. Panta curbei este decisiv n mrimea erorii. Dac aceasta este foarte mic, eroarea la determinarea concentraiei va crete. De aceea, soluiile foarte colorate duc automat la erori, datorit aplatizrii curbei la concentraii ridicate i ca urmare coninuturile nu pot fi determinate 10

exact, recurgndu-se la diluri. Dac diluia este prea mare apare o cretere a erorii tocmai datorit dilurii, mai precis datorit limitelor determinrilor exacte ale volumelor, lucru ce trebuie avut n vedere. n concluzie, concentraiile soluiilor msurate trebuie s fie relativ joase.

5 MATERIALELE NECESARE I APARATURA UTILIZAT

Materialele i instrumentele utilizate sunt: material vegetal; alcool etilic; pahar Berzelius; sticla de ceas; balana ; balon cotat de 25 ml ; specrofotometru

6 METODA DE LUCRU
Metoda de lucru n cazul determinrii spectrofotometrice a clorofilei a i b este urmtoarea: se cntresc aproximativ 0,5 g de frunz; se mrunete materialul vegetal ntr-un pahar Berzelius, se acoper cu alcool etilic i apoi cu sticl de ceas; se pune la fiert si se supravegheaz pn la decolorarea total a fragmentelor vegetative; se decanteaz extractul in balonul cotat si se aduce la semn cu alcool etilic; se efectueaz citiri la spectrofotometru la urmatoarele lungimi de und: - 665 nm pentru clorofila a - 649 nm pentru clorofila b se seteaz intervalul lungimii de und cu butonul din interiorul aparatului iar apoi se seteaz lungimea de und cu butonul rotativ de pe laterala dreapt a aparatului; se apas butonul ABS (absorbanta); ntr-o cuv (eprubet de aparat) se pune solvent i se aduce la zero aparatul prin apsare pe tasta 100%T/A; 11

se inlocuiete cuva cu o alt cuv cu extract i se realizeaz citirea; se trece la alt lungime de und pentru fiecare pigment, efectund paii descrii anterior; se calculeaz concentraia pigmenilor asimilatori pe baza urmatoarelor formule (Lichtenthaler, 1987)
13 .95 * A665 6.88 * A649 *V * D d * 1000 * W

clorofila .a =

mg/ g substan proaspt;

clorofila .b =

24.96 * A649 7.32 * A665 *V * D d *1000 *W

mg/ g substan proaspt;

Unde: A = absorbana la lungimea de und indicat; V = volumul total al extractului (ml); D = coeficientul de diluie; W = masa iniial a materialului vegetal (g); D = grosimea cuvei (1 cm); 1000 = factor de conversie g n mg;

7 INTERPRETAREA REZULTATELOR
W= 0.54 g
A665 =1.426 A649 =0.748

Concentraia pigmenilor asimilatori din frunza de Spinacia Oleracea este urmtoarea:

13 .95 * 1.426 6.88 * 0.749 19 .89 5.15 * 25 * 1 = * 25 = 0.675 mg/ g frunza 1 * 1000 * 0.54 540
24 .96 * 0.748 7.32 * 1.426 18 .67 10 .438 * 25 * 1 = * 25 = 0.381 mg/ g frunza 1 * 1000 * 0.54 540

clorofila .a =

clorofila .b =

12

BIBLIOGRAFIE
Horea Iustin Nacu, Lorentz Jantschi, 2006, Chimie Analitic i Instrumental, Ed. Academic Pres & AcademicDirect, Cluj Napoca; http://www.scritube.com/biologie/FOTOSINTEZA2151420721.php

http://www.britannica.com/EBchecked/topic/449094/Pelargonium-crispum http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substante Clorofila.html http://ro.wikipedia.org/wiki/Clorofil%C4%83 http://www.infogradina.ro/legume/legume/spanacul/492/

13