Principiile recoltarii si controlului spermei

Comportamentul sexual al masculilor

Comportamentul sexual al mamiferelor se bazează pe un schimb reciproc
de semnale specifice care, în final se materializează în actul sexual propriu-zis. La
animalele crescute în libertate, întreţinute în padocuri sau boxe comune pentru
ambele sexe, comportamentul sexual se desfăşoară secvenţional:
- căutarea reciprocă a celor doi parteneri;
- sincronizarea comportamentală;
- actul sexual propriu-zis.
La toate speciile, activitatea sexuală începe printr-o căutare reciprocă de
contact între mascul şi femelă. Schimburile de informaţii senzoriale fac posibilă
identificarea receptivităţii sexuale a celor doi parteneri, apoi provoacă
răspunsurile comportamentale care induc reacţiile de atitudine necesare
împerecherii. Semnalele caracteristice emise de femelă indică stadiul receptivităţii
sexuale, femela neacceptând saltul masculului decât în momentul impregnanţei
estrogenice maxime. La toate mamiferele, femela se va imobiliza înaintea
împerecherii, luând o poziţie care să permită masculului intromiterea penisului.
Cunoaşterea particularităţilor fiziologice ale comportamentului sexual este
necesară în momentul obişnuirii reproducătorilor folosiţi la însămânţările
artificiale, cu recoltarea materialului seminal. Obişnuirea presupune răbdare şi
tact, astfel încât, să se suprapună peste reflexele necondiţionate, cele condiţionate
pozitive, permiţând o bună recoltare a spermei, fără a stresa masculul respectiv.
După obişnuirea masculului cu recoltarea spermei, datorită reflexelor condiţionate
pozitive, ejaculatul poate fi recoltat uşor, pe o femelă în oricare stadiu al ciclului
sexual, pe un mascul sau pe un manechin adaptat ca formă, mărime şi aspect
speciei respective.
Recoltarea spermei cu ajutorul vaginului artificial se bazează pe
succesiunea fiziologică a reflexelor sexuale, cu deosebirea că sperma este depusă
în alt loc decât în cazul montei, mediul natural de la nivelul secţiunii copulatoare
a aparatului genital femel fiind reconstituit prin mijloace artificiale.
Baza fiziologică a recoltării spermei cu vaginul artificial este reprezentată
de reflexele sexuale înnăscute peste care s-au suprapus reflexele dobândite în
urma asocierii lor repetate.
În desfăşurarea reflexelor sexuale necesare recoltării spermei, un rol
deosebit revine corpusculilor senzitivi şi terminaţiilor nervoase existente la
nivelul penisului. În tegumentul glandului se găsesc corpusculii care reacţionează
la excitaţiile termice, corpusculii Meissner care recepţionează impulsurile tactile,
corpusculii Vater-Paccini, pentru recepţionarea impulsurilor de presiune,
corpusculi pentru recepţionarea durerii. Totodată, un rol deosebit revine şi
organelor de simţ. Factorii mediului extern (lumina, temperatura, mirosul specific
al femelelor în călduri, efectuarea montei între alţi parteneri, îmbrăţişarea
efectuată de mascul sau femelă etc) provoacă excitaţii, care ajunse la nivelul
hipotalamusului, declanşează mecanismul neuro-endocrin care stă la baza
formării reflexelor sexuale.
 Fiziologia actului sexual constă dintr-o succesiune de etape care se
manifestă prin următoarele reflexe sexuale: reflexul de apropiere, reflexul de
erecţie, reflexul de îmbrăţişare, reflexul de intromisiune şi reflexul de ejaculare.
Reflexul de apropiere constă într-o căutare reciprocă de contact între
mascul şi femelă. Schimburile de informaţii senzoriale, care au loc cu acest prilej,
provoacă răspunsuri comportamentale care induc atitudinile caracteristice
desfăşurării actului sexual. Un rol particular în realizarea contactului între mascul
şi femelă îl au semnalele olfactive datorate feromonilor care declanşează reacţii
specifice, de stimulare sau inhibiţie. Fonaţia, audiţia, contactul corporal între
parteneri, jocul, lupta care precede acceptarea masculului, îndeplinesc un rol
deosebit în apropierea partenerilor. Toţi aceşti factori induc excitaţia
precopulatoare. La mamifere, sursa cea mai puternică de excitaţii o constituie
stimularea tactilă astfel încât este posibilă declanşarea excitaţiei precopulatoare
chiar prin simple excitaţii mecanice ale zonei genitale. Excitaţia precopulatoare
se manifestă prin libidou, care este datorat impregnării structurilor necesare de
către hormonii androgeni.
Acest tip de excitare se caracterizează printr-un complex de manifestări
variate ca: accelerarea pulsului, creşterea tensiunii arteriale, modificări ale
circulaţiei periferice cu ridicarea temperaturii tegumentului, aflux sanguin,
creşterea tensiunii nervoase etc. Un semn caracteristic al excitaţiei sexuale este
reacţia ce se declanşează în cadrul excitaţiei sexuale precopulatoare
(Gluhovschi,1978).
Reflexul de erecţie. Erecţia constă în schimbarea formei, volumului şi
constituţiei organului copulator. În repaus, penisul este adăpostit în furou, şi la
unele specii este flasc. Din această stare, penisul, prin erecţie, este exteriorizat din
furou şi devine rigid printr-o modificare specială a ţesutului erectil.
Erecţia este consecinţa fenomenelor dilatatoare care se produc la nivelul
corpului spongios şi al corpilor cavernoşi ai penisului, urmată de umplerea
acestora cu sânge. În urma acumulării intense a sângelui, are loc dilatarea
cavernelor, capsula fibroasă se întinde, muşchiul se contractă şi penisul devine
rigid, se alungeşte la maxim şi este propulsat din furou. Ţesutul erectil al corpului
spongios şi al corpilor cavernoşi reprezintă un sistem spongios de spaţii vasculare,
presărate cu artere şi vene. În stare de repaus, aceste spaţii sunt colabate şi conţin
cantităţi mici de sânge; o dată cu erecţia ele devin cavităţi mari, umplute cu sânge.
Creşterea afluxului de sânge este determinată pe cale neuro-hormonală şi
asigurată de compresiunea căilor venoase de întoarcere prin contracţia muşchilor
bulbo- şi ischiocavernoşi. Afluxul de sânge la nivelul ţesutului cavernos se
produce treptat. La început se umplu cu sânge cavernele care, datorită
vasodilataţiei arteriale, se destind, urmată de erecţia ţesutului spongios din jurul
uretrei. Ţesutul spongios se încarcă cu sânge venos ca urmare a stării provocate de
stimularea nervilor splahnici pelvieni, iar stimularea inervaţiei simpatice
determină constricţia arterelor penisului şi încetarea erecţiei. Erecţia este un reflex
înnăscut provocată pe cale reflexă, centrul fiind situat în măduva sacrală, la
nivelul neuromerelor S1-S2. Arcul reflex include nervii dorsali, ruşinos şi
hipogastric, centrul medular, nervii simpatici şi parasimpatici. Senzaţiile vizuale,
auditive, tactile şi olfactive stimulează sistemul nervos central de la nivelul căruia
porneşte impulsul excitator al centrului erecţiei. Din centrul erecţiei pleacă nervii
centrifugi care provoacă dilataţia vaselor penisului şi contracţia muşchilor ischio-
şi bulbocavernoşi. Erecţia este determinată şi de excitarea mecanică a receptorilor
penieni, reflex care stă la baza recoltării spermei prin masturbaţie.
Erecţia este însoţită de eliminarea la nivelul meatului a unei secreţii
mucoase, clare, filante cu rol lubrifiant produsă de glandele Littré şi de glandele
bulbo-uretrale. Această secreţie, împreună cu cele ale glandelor Bartholin,
facilitează intromiterea penisului în conductul vestibulo-vaginal. Erecţia este
însoţită de contracţia tunicii externe a burselor testiculare, în urma căreia
testiculele sunt apropiate de orificiul extern al canalului inghinal.
Durata erecţiei depinde de specia şi vârsta reproducătorului. La masculii
tineri, erecţia se poate menţine un timp mai îndelungat (chiar o jumătate de oră),
însă durata erecţiei scade progresiv cu vârsta. Manifestarea erecţiei este
determinată de nivelul hormonilor androgeni din organism, de tipul de sistem
nervos al masculului, de vârstă, condiţii de exploatare, întreţinere etc. Erecţia
diminuă consecutiv uzurii nervoase, a abuzului sexual, obişnuinţei, oboselii,
alimentaţiei şi întreţinerii necorespunzătoare.
În caz de îmbătrânire, erecţia se produce intermitent, până ce dispare
complet, stare ce se observă la taurii, berbecii şi vierii bătrâni. În diversele boli ca
meningita, turbarea, tetanosul, erecţia este mai pronunţată decât la animalul
sănătos. Toxina tetanică, având o elecţie specială pentru sistemul nervos, scade
centrul de excitabilitate a tuturor centrilor medulari, deci şi a centrului erecţiei.
Substanţele afrodiziace (iohinibina, stricnina etc), cele parasimpatice comimetice
stimulează erecţia peniană, fie prin provocarea vasodilataţiei locale (iohinibina),
fie prin scăderea pragului de excitabilitate a centrului erecţiei (stricnina).
Anafrodiziacele (opiumul, bromurile etc) intoxicaţiile cu diverse săruri de mercur,
potasiu, arseniu etc, inhibă erecţia.
Sunt şi numeroşi centri nervoşi superiori, localizaţi în bulb, hipotalamus
şi centri corticali, ca sediu al reflexelor condiţionate care, în urma excitaţiei,
determină erecţia.
Inervaţia senzitivă parasimpatică este vasodilatatoare şi erectilă, pe când
cea ortosimpatică este vasoconstrictoare.
Reflexul de îmbrăţişare. Excitaţiile acumulate în timpul reflexelor de
apropiere şi de erecţie determină necesitatea reflexelor de îmbrăţişare şi
intromisiune. Este un reflex înnăscut, masculii tineri încercând să efectueze saltul
pe orice femelă sau pe alţi masculi. După efectuarea saltului, masculul fixează
femela (sau partenerul de recoltare) cu membrele anterioare şi execută mişcări
caracteristice de căutare, cu penisul, a organelor genitale femele externe.
Executarea cu siguranţă a saltului se transmite ereditar şi este unul din
semnele bunei fertilităţi a taurului. Îmbrăţişarea poate fi normală, când se produce
la scurt timp după erecţie, rapidă, când se produce înaintea erecţiei şi tardivă, când
apare mult după erecţie (masculii bătrâni, bolnavi, subalimentaţi). Cunoaşterea
tipului de reactivitate a masculului este importantă atunci când are loc pregătirea
masculului pentru recoltare, de o corectă pregătire a acestuia depinzând volumul
spermei.
 Reflexul de împerechere (intromisiune, coit). Este un reflex înnăscut şi
constă în intromiterea organului copulator în conductul vestibulo-vagino-cervical
al femelei în călduri. Intromiterea penisului este facilitată de secreţiile glandelor
Littré, bulbo-uretrale (parţial), glandelor Bartholin şi de smegma prepuţială.
Introducerea penisului are loc la nivelul vaginului la rumegătoare şi carnivore,
până la cervix la cabaline şi până în uter la suine.
Reflexul de ejaculare constă în proiectarea, sacadat şi sub presiune,
spermei în afara căilor genitale mascule.
Ejacularea se produce pe cale reflexă, consecutiv excitaţiilor acumulate în
timpul actului coital şi transmise sistemului nervos. În primul rând sunt excitate
terminaţiile nervoase din penis, reprezentate în special prin corpusculii Vater-
Paccini, Meissner şi genitali. Ejacularea este iniţiată de stimulii genitali şi mediată
de nervii care transmit impulsuri la creier. De la creier, în sens invers, sunt
elaborate impulsuri la nivelul sistemului simpatic lombar (L2-L4-centrul
ejaculator) de unde impulsurile eferente trec prin ganglionii simpatici, de-a lungul
nervului presacral şi a celui pelvin, la toate organele din cavitatea pelvină. Ele dau
fibre motorii pentru muşchii netezi ai tractusului genital (epididim, canale
deferente, canal ejaculator, prostată, glande seminale). Prin contracţia fibrelor
musculare netede de la nivelul acestor organe, conţinutul este împins în uretra
peniană, segmentul prostatic, unde, din amestecul fluidului testicular şi
epididimar cu secreţiile glandelor anexe, se formează sperma. Sperma, o dată
formată, acţionează reflex şi determină închiderea gâtului vezicii urinare şi
contracţia fibrelor musculare netede de la nivelul uretrei pelvine, sporind pesiunea
exercitată de spermă şi împingând-o spre baza penisului. În acest moment intervin
şi muşchii penisului, bulbo- şi ischiocavernoşi şi contracţia ritmică a uretrei,
învingând rezistenţa periferică şi expulzând sperma în jeturi ritmice.
La producerea ejaculării este necesară contracţia sincronă a muşchilor
epididimului, canalelor deferente, canalului ejaculator, uretrei şi penisului. Aceste
contracţii determină ejacularea sacadată la armăsar, vier şi câine şi spontană la
rumegătoare.
Prin excitaţiile electrice produse la nivelul centrului ejaculator din
măduva lombară, se provoacă eliminarea spermei. Acest principiu stă la baza
electroejaculării.
Modul de eliminare a spermei diferă cu specia:
- la taur, berbec şi ţap toţi componenţii spermei se elimină simultan;
- la armăsar, la început se elimină secreţia glandelor Littré şi a celor
bulbo-uretrale, lipsită de spermatozoizi, apoi sunt expulzaţi
spermatozoizii împreună cu secreţia prostatică, la urmă fiind
eliminată secreţia glandelor seminale;
- la vier, ejacularea este multifazică; prefaza, cu o durată de 1-2
minute, în decursul căreia se elimină secreţiile glandelor uretrale
lipsite de spermatozoizi (2-5% din conţinutul ejaculatului); faza
principală, cu o durată de 2-3 minute, reprezentată de secreţiile
epididimului, veziculelor seminale, prostatei şi glandelor bulbo-
uretrale (30-50% din conţinutul ejaculatului); faza postspermatică, cu
o durată de 4-5 minute, şi un conţinut de 50-60% din ejaculat, săracă
 în spermatozoizi, compusă în cea mai mare parte din secreţiile
veziculelor seminale şi ale glandelor bulbo-uretrale.
1.4.1.2. Specificul reflexelor sexuale la principalele
specii de animale

1.4.1.2.1. Reflexele sexuale la taur

Reflexul de apropiere este puţin exteriorizat şi se bazează, în principal, pe
excitaţiile vizuale, taurul apropiindu-se de femele, indiferent de stadiul ciclului
sexual în care se află acestea. În cazul recoltării spermei cu ajutorul vaginului
artificial, taurul se apropie de partenerul de recoltare, contenţionat în stand
(femelă, mascul) (foto 1).
Reflexul de erecţie
este necondiţionat, peste
care se suprapun reflexe
condiţionate, prin interme-
diul cărora acest reflex
poate fi dirijat în sens
pozitiv. Erecţia se produce
chiar din momentul intrării
în sala de recoltare sau
numai la vederea vaginului
artificial şi a operatorului
recoltator cu care s-a
obişnuit. Din această cauză,
vaginul artificial trebuie să
fie corect pregătit, în caz
Foto 1 Reflexul de apropiere la taur contrar se formează reflexe
condiţionate inhibitoare ale
acestui reflex.
Reflexul de îmbră-
ţişare (salt, cuprindere) (foto
2) este bine evidenţiat la
taurii crescuţi în libertate,
împreună cu femelele. În
cazul practi-cării montei, se
formează un reflex
condiţionat numai pentru
vacile în călduri. În cazul
recoltării spermei cu
ajutorul vaginului artificial
se crează un reflex condi-
Foto 2 Reflexul de îmbrăţişare şi ejaculare la taur
ţionat pentru masculul
partener, recoltarea „taur
pe taur“ fiind practicată în cvasitotalitatea unităţilor care se ocupă cu producerea
de material seminal conservat. La taurii folosiţi la însămânţări artificiale se
practică aşa-numitul salt „în gol“ cu scopul îmbunătăţirii volumului ejaculatului.
În cazul examenului andrologic al taurilor de reproducţie, printre altele, se
notează şi modul în care masculul efectuează saltul, acesta fiind dependent de
temperamentul fiecăruia şi constituie o însuşire ce se transmite la descendenţi. În
cazul unor afecţiuni la nivelul coloanei vertebrale, membrelor posterioare etc,
acest reflex poate fi inhibat .
Reflexul de intromisiune (împerechere, coit) constă în introducerea
penisului în conductul vestibulo-vaginal al femelei în cazul montei, sau în
lumenul vaginului artificial corect pregătit, în cazul practicării însămânţărilor
artificiale. Şi acest reflex poate fi inhibat în cazul pregătirii necorespunzătoare a
vaginului artificial: tempera-tură, presiune şi lubrifiere necorespunzătoare, falduri
în spirală etc.
Reflexul de ejaculare se produce având la bază senzaţiile termice, de
presiune şi tactile recepţionate de corpusculii dispuşi la nivelul penisului şi
transformate în stimuli pe calea filetelor nervoase aferente pentru centrul
ejaculator lombar de la nivelul căruia, pe calea filetelor nervoase eferente, sunt
transmise la nivelul musculaturii netede a diverselor segmente ale aparatului
genital şi, prin contracţia acesteia, se produce expulzarea spermei. Reflexul de
ejaculare la taur este foarte rapid, suprapunându-se intromisiunii. În cazul
recoltării spermei cu vaginul artificial, dacă acesta este corect pregătit, ejacularea
este rapidă, fără a influenţa negativ şi în timp desfăşurarea reflexelor sexuale la
taurii de reproducţie. Tipul de sistem nervos influenţează manifestarea şi
desfăşurarea reflexelor sexuale. Cunoaşterea particularităţilor temperamentale ale
fiecărui taur folosit la însămânţări artificiale este o condiţie esenţială pentru
obţinerea unei sperme de bună calitate. De altfel, selecţia reproducătorilor include
şi criteriul temperamentului, fiind reţinuţi pentru folosirea la însămânţări
artificiale taurii cu sistem nervos echilibrat şi cu temperament vioi şi liniştit.

1.4.1.2.2. Reflexele sexuale la berbec

Pentru animalele în libertate, comportamentul sexual, care se termină în
mod normal printr-o împerechere, se caracterizează printr-o secvenţă specifică a
reflexelor sexuale.
Reflexul de apropiere constă în interesul berbecului pentru oaia în călduri
şi căutarea acesteia. Această căutare şi curtenirea care urmează depinde în mod
egal şi de rolul activ al femelei în estru. Masculul dirijează parada sexuală
(apropieri ritualizate laterale, însoţite de mişcări ale unui membru anterior).
Adulmecă oaia în călduri, urmând ridicarea capului şi manifestarea unui rictus al
buzei superioare. Abordarea oii în călduri se face prin lovirea acesteia cu capul în
regiunea abdomenului şi apoi cu membrul anterior. Imobilizarea oii constituie
semnul vizual de identificare a stării de estru cu ajutorul unui berbec încercător.
Recunoaşterea olfactivă a acestei stări joacă rolul de „declanşator“ pentru
comportamentul sexual al berbecului. Un berbec tânăr este mai puţin apt să
identifice starea de estru a oilor. Atunci când contactul este stabilit, imobilizarea
femelei constituie semnalul desfăşurării următoarelor reflexe sexuale.
 Reflexul de erecţie se realizează prin ştergerea S-ului penian. Caracteristic
erecţiei este întinderea şi îndepărtarea apendicelui uretral al glandului, urmată de
executarea unor mişcări ondulatorii ale acestuia.
Reflexul de îmbrăţişare constă în cuprinderea oii sau a partenerului de
recoltare cu membrele anterioare. Ca şi la taur şi la berbec se formează reflexul
condiţionat şi pentru oile care nu sunt în călduri sau pentru masculi, recoltarea
făcându-se şi „mascul pe mascul“.
Reflexul de intromisiune constă în introducerea penisului în conductul
vestibulo-vaginal al oii în călduri, în cazul montei, sau în lumenul vaginului
artificial, când se practică însămânţarea artificială. În situaţia în care vaginul
artificial este corect pregătit, se produce imediat ejacularea.
Reflexul de ejaculare este foarte rapid şi se evidenţiază printr-o zvâcnire
evidentă a întregului corp şi mai ales a trenului posterior. În cazul recoltării
spermei, aceasta este proiectată în cea mai mare cantitate, direct în paharul
colector, adaptat la vaginul artificial. Când vaginul artificial nu este pregătit
corespunzător, actul sexual se întrerupe la reflexul de intromisiune.

1.4.1.2.3. Reflexele sexuale la vier

Reflexul de apropiere se manifestă prin căutarea reciprocă dintre vier şi
scroafă. Vierul caută scroafa folosind simţul mirosului, văzului şi auzului. Vierul,
introdus într-un lot de scroafe, cu ajutorul mirosului examinează pe rând aproape
toate scroafele, adoptând poziţia „cap la cap“, prin aplicarea unor lovituri uşoare
în regiunea flancurilor şi încercări de salt. Prin acest comportament, vierul
depistează starea de estru a scroafelor, însă nu se opreşte la cele în estru. În
apropierea celor doi parteneri, rolul principal revine scroafelor în călduri. În
prezenţa scroafei în călduri, vierul se plimbă în jurul ei, grohăie caracteristic, o
loveşte în regiunea flancului, adulmecă regiunea vulvară, această agitaţie
permanentă fiind determinată de reflexele olfacto-sexuale. Acest „preludiu“
sexual durează, în medie, 5-10 minute şi este mai evident şi de durată în timp mai
mare la vierii tineri. Se mai remarcă mişcări caracteristice ale maxilarului inferior,
urmate de o secreţie abundentă de salivă şi eliminarea ritmică a unor cantităţi mici
de urină (Feredean T., 1969).
Reflexul de erecţie constă în exteriorizarea treptată a penisului prin
ştergerea S-ului de la acest nivel, în urma iniţierii „jocurilor“ descrise.
Reflexul de îmbrăţişare constă în fixarea crupei scroafei sau părţii
posterioare a manechinului cu membrele anterioare, penisul intră în erecţie
deplină, vierul modificându-şi permanent poziţia, căutând insistent fanta vulvară.
Penisul este introdus în conductul vestibulo-vaginal, porţiunea spiralată ajungând
la nivelul conductului cervical, unde stă fixat pe toată durata ejaculării.
Reflexul de ejaculare se caracterizează prin contracţii ritmice ale
musculaturii din regiunea anală, apropierea testiculelor de orificiul extern al
canalului inghinal, concomitent cu retractarea burselor testiculare. Durata
ejaculării este de 4-8 minute şi se realizează fazial: prespermatică, spermatică şi
postspermatică.

1.4.1.2.4. Reflexele sexuale la armăsar

 Reflexul de apropiere este evident la armăsar, care, în prezenţa iepei
devine neliniştit.
Reflexul de erecţie se manifestă treptat, începând cu preerecţia la distanţă
de iapă, penisul fiind evidenţiat circa jumătate, întărindu-se şi îngroşându-se
progresiv.
Reflexul de îmbrăţişare se manifestă energic.
Reflexul de intromisiune, de regulă se desfăşoară ajutat de o persoană
aşezată lateral. Armăsarul execută 5-10 mişcări de pistonare în urma cărora
penisul ajunge la momentul maxim al erecţiei. Glandul este puternic tumefiat, cu
diametrul de 10-12 cm, în formă de ciupercă.
Reflexul de ejaculare se desfăşoară la câteva secunde de la intromisiune,
eliminarea spermei făcându-se fazial.

1.4.2. Principii şi metode de recoltare a spermei

Recoltarea este operaţia prin care se obţine sperma de la reproducător cu
ajutorul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Fiind o operaţie foarte
importantă şi dificilă, recoltarea a constituit obiectul de studiu al multor
cercetători care au căutat să găsească noi metode de obţinere a spermei fără a
prejudicia calitatea spermei şi sănătatea reproducătorului mascul.
Recoltarea spermei se bazează pe următoarele principii:
- realizarea, prin mijloace artificiale, a condiţiilor existente în secţiunea
copulatoare a femelei în călduri: temperatură, presiune, lubrifiere,
respectiv recoltarea spermei cu vaginul artificial;
- excitarea artificială a centrului ejaculator din măduva lombară prin
intermediul curentului electric de o anumită tensiune şi intensitate,
respectiv recoltarea spermei prin electroejaculare;
- realizarea artificială a unor excitaţii mecanice prin masaj local,
efectuat manual la diverse niveluri şi anume: masajul penisului prin
traversul tecii furoului, respectiv recoltarea spermei prin masturbaţie;
- recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi ale
glandelor seminale;
masajul regiunii abdominale la masculii păsărilor, respectiv recoltarea spermei
prin masaj abdominal.

1.5. Examenul însuşirilor spermei

Examenul însuşirilor spermei apare ca o necesitate legată atât de

cunoaşterea fertilităţii reproducătorului, căt şi de tehnica diluării şi aprecierii
spermei în diferite faze de prelucrare şi conservare.
Aprecierea calităţii spermei se practică în trei situaţii:
- controlul cotidian, care se execută pentru fiecare ejaculat, la unităţile
de tip „SEMTEST“ şi la punctele de însămânţare artificială pentru
ovine şi suine, unde se foloseşte spermă brută sau diluată, conservată
pentru o scurtă perioadă de timp;
 - controlul periodic, care se efectuează în cazul montei, pentru
verificarea producţiei spermatice a reproducătorilor;
- controlul de expertiză, ce se practică în anumite cazuri în vederea
diagnosticului infertilităţii la anumiţi masculi utilizaţi în reţeaua de
însămânţări artificiale sau la montă.
Examenul spermei este esenţial pentru aprecierea unui reproducător.
Compoziţia spermei, inclusiv proprietăţile sale biochimice şi biofizice, variază în
funcţie de specie şi chiar reproducător, calitatea spermei diferă în decursul
aceleiaşi zile, funcţia spermatogenetică fiind dependentă de numeroşi factori
exogeni şi endogeni. Metodele care se folosesc pentru aprecierea calităţii spermei
se pot împărţi în următoarele categorii: examenul însuşirilor fizice; examenul
însuşirilor biologice; examenul citologic; examenul biochimic; examenul
bacteriologic şi micotic.
Rezultatele obţinute se consemnează într-un formular oficial denumit
spermogramă şi care este hotărâtoare pentru aprecierea unui reproducător.

1.5.1. Examenul însuşirilor fizice ale spermei

Pentru acest examen se apreciază volumul ejaculatului, culoarea, mirosul,
vâscozitatea, pH-ul, sedimentarea, tensiunea superficială, greutatea specifică,
presiunea osmotică, conductibilitatea spermei. Evaluarea însuşirilor fizice se face
cu ajutorul organelor de simţ şi prin metode specifice.
Volumul spermei se apreciază direct în paharul colector dacă este gradat
sau în recipienţi din sticlă cu pereţi dubli care sunt gradaţi, termoizolaţi şi
aseptizaţi.
Volumul ejaculatului variază în funcţie de specie, iar în cadrul aceleiaşi
specii în funcţie de rasă, individ, vârstă, frecvenţa ejaculărilor, starea de
întreţinere, metoda de recoltare, alimentaţie, etc. La speciile care aparţin tipului
uterin de însămânţare (cabaline, porcine, canine) sperma are un volum mare, iar la
speciile care aparţin tipului vaginal de însămânţare (taurine, ovine, caprine,
iepuroaică) sperma are un volum redus. Limitele considerate normale ale
volumului ejaculatului la principalele specii de animale sunt: taur 5-8 ml, berbec
0,8–1,5 ml, ţap 1 ml, vier 150–300 ml, armăsar 50–100 ml, câine 5–10 ml
(limitele extreme fiind cuprinse între 2–30 ml, funcţie de rasă), cotoi 0,1–0,3 ml,
iepure 0,7-1 ml (limite între 0,4–6,0 ml funcţie de rasă), cocoş 0,5–0,8 ml, curcan
0,3 ml.
Abaterile de la volumul normal sunt considerate ca patologice. Reducerea
volumului spermei poartă denumirea de parvisemie iar creşterea peste normal a
acestuia numită multisemie, se constată mai rar şi se datorează congestiei
glandelor seminale şi a prostatei.
Culoarea normală a spermei este alb-lăptoasă, alb-cremoasă, cu nuanţă
uşor gălbuie la taur şi berbec; alb-gălbuie cu reflexe gri-albăstrui la vier; alb-
cenuşie la armăsar şi măgar; aspect apos, uşor tulbure la câine, cotoi şi iepure;
alb-cremoasă la păsări.
În anumite stări patologice ale tractusului genital sau în prezenţa unor
elemente anormale, culoarea spermei se poate modifica. Sperma poate prezenta o
culoare gălbuie, din cauza amestecului cu urina; culoarea roză sau roşietică se
datorează prezenţei urmelor de sânge proaspăt, provenit de la nivelul testiculelor,
al tractusului genital sau glandelor anexe; culoarea galbenă-portocalie a spermei
apare atunci când masculii au fost hrăniţi cu nutreţuri bogate în caroten. În toate
aceste situaţii, reproducătorii se supun unui examen atent în vederea precizării
diagnosticului, apoi se supun unui tratament adecvat şi după completa vindecare,
se folosesc la reproducţie.
Vâscozitatea spermei depinde de concentraţia în spermatozoizi şi de
temperatură şi în consecinţă, poate varia între limite destul de largi. Vâscozitatea
medie a spermei de taur este de 3,74 iar a celei de armăsar de 1,509, comparativ
cu valoarea pe care ne-o dă apa distilată. Cercetările au evidenţiat faptul că există
o corelaţie pozitivă foarte semnificativă (r = 0,89) între vâscozitatea şi
concentraţia spermei în spermatozoizi. Schimburile nutritive dintre spermatozoizi
şi plasma seminală ca şi cele dintre spermatozoizi şi secreţiile de la nivelul
tractusului genital femel, sunt influenţate de vâscozitatea mediului în care se
găsesc celulele sexuale mascule. Vâscozitatea spermei creşte în cazul proceselor
inflamatorii de la nivelul tractusului genital sau al glandelor anexe (îndeosebi de
la nivelul epididimului şi al prostatei).
Sedimentarea constă în separarea în straturi diferite a spermatozoizilor de
plasma seminală, atunci când sperma este lăsată în repaus un interval de timp
după recoltare. Viteza de sedimentare este mai ridicată la sperma rară şi mai
scăzută la sperma deasă. Sperma de armăsar şi vier sedimentează 10–12 mm/oră,
ier sperma de taur şi berbec nu sedimentează în prima oră.
Greutatea specifică a spermei variază în funcţie de specie şi este strâns
legată de densitatea spermei, de raportul dintre spermatozoizi şi plasma seminală,
presiunea osmotică, punctul crioscopic, raportul dintre spermatozoizii maturi şi
cei imaturi. La taur, greutatea specifică a spermei este de 1,035, iar la câine de
1,011.
pH-ul spermei (reacţia spermei) este influenţat de cantitatea de acizi
prezenţi în plasma seminală, dar cea mai puternică influenţă o exercită ionii de H
pe care acizii îi pun în libertate în urma disocierii. Reacţia spermei este
determinată de reacţia glandelor anexe şi diferă cu specia. Astfel, sperma de taur
şi berbec are tendinţă spre aciditate datorită conţinutului în glucide care conduc,
în urma metabolismului la formarea unor cantităţi crescute de acid lactic. Sperma
de armăsar şi vier este săracă în glucide şi deci se formează foarte puţin acid
lactic, tendinţa acidităţii mergând spre alcalinitate sau spre un pH neutru.
În medie, pH-ul spermei variază la diferite specii după cum urmează: la
armăsar 7,23; la taur 6,7; la berbec 6,8; la vier 7,57; la cocoş 7,25; la iepure 6,8.
În cadrul speciei, chiar la acelaşi reproducător, pH-ul spermei poate să
difere de la un ejaculat la altul în funcţie de cantitatea de lichid secretat de
glandele anexe care au rolul de a contracara pH-ul acid al spermatozoizilor de la
nivelul epididimului (pH = 6,10). Dacă aportul secretor al glandelor anexe a fost
mai abundent, pH-ul spermei tinde spre reacţia alcalină iar dacă aportul secretor al
acestora este mai redus, pH-ul spermei va înclina spre reacţia acidă.
pH-ul spermei este influenţat şi de concentraţia spermei în spermatozoizi
şi mobilitatea acestora; cu cât densitatea spermei este mai mare, cu atât pH-ul
tinde spre aciditate, datorită metabolismului crescut şi a acumulării în cantităţi
ridicate a acidului lactic. Cu cât mobilitatea spermatozoizilor este mai mică cu
atât alcalinitatea creşte.
Sarcina electrică negativă cu care se încarcă la nivelul epididimului
reprezintă un factor important în prevenirea aglutinării lor. Reducerea sau
pierderea totală a sarcinii electrice determină aglutinarea spermatozoizilor care
are loc în urma schimbării pH-ului. Spermatozoizii se grupează în rozetă când
pH-ul este uşor acid, iar când aciditatea este pronunţată se produce aglutinarea
dezordonată a spermatozoizilor care sunt lipsiţi de mişcare.
Presiunea osmotică este apropiată de cea a sângelui şi variază cu specia.
Presiunea osmotică a plasmei seminale este izotonică cu cea a spermatozoizilor.
Presiunea osmotică se exprimă prin valoarea punctului crioscopic. Acesta
oscilează între 0,550 – 0,560 la armăsar iar la taur între 0,530 - 0,650. Mediul
hipotonic sau hipertonic determină moartea spermatozoizilor.
Conductibilitatea electrică depinde de numărul ionilor sau al altor
particule încărcate electric. Din punct de vedere practic, conductibilitatea este
egală cu inversul rezistenţei electrice exprimată în ohmi. Valoarea
conductibilităţii electrice la unele specii este: 89,5 – 116,3 la taur, 48,5 – 80,5 la
berbec, 191,3 – 192,5 la armăsar şi 123,3 – 134,6 la vier (Gluhovschi N.,1978).

1.5.2. Examenul citologic al spermei

Examenul microscopic al spermei se face între lamă şi lamelă, cu care
ocazie se apreciază: prezenţa sau absenţa spermatozoizilor, energia valurilor,
activitatea cinetică la marginea picăturii, desimea spermei, morfologia
spermatozoizilor, proporţia de spermatozoizi vii şi a celor normali şi anormali (foto
12).
Prezenţa sau absenţa
spermatozoizilor se face printr-
un examen simplu al spermei,
între lamă şi lamelă: pe o lamă
curată şi degresată se pune o
picătură de spermă proaspăt
recoltată, peste care se adaugă o
lamelă; se examinează la
microscop, cu obiectivul mic la
început, apoi cu obiective mai
mari; dacă se observă în câmpul
microscopic spermatozoizi, cu
Foto 12 Examenul general al spermei morfologia lor caracteristică, în
(SEMTEST IA{I)
mişcare, sperma este corespunzătoare; dacă nu se evidenţiază spermatozoizi în
câmpul microscopic – azoospermie – masculul se exclude de la reproducţie.
Energia valurilor sau a undelor în mişcare este un criteriu de apreciere a
energiei cu care se desfăşoară mişcările întregii mase a spermatozoizilor la
speciile cu spermă deasă.
 Tehnica de lucru. Din sperma brută proaspăt recoltată, se pune cu
ajutorul unei baghete sau a unei pipete Pasteur, o picătură mică pe o lamă curată şi
degresată. Se examinează la microscop cu obiectivul mic. În câmpul microscopic
se observă o succesiune de zone întunecate (umbre) şi de zone mai luminoase.
Zonele întunecate sunt date de grupurile de spermatozoizi în mişcare concentrică
sau radiară. Dacă zonele întunecate se succed des şi rapid se consideră că sperma
conţine un număr mare de spermatozoizi care au mişcări energice de înaintare.
Sperma se notează cu E (valuri energice). Dacă zonele întunecate sunt mai subţiri
şi se succed rar şi lent, sperma este de calitate mai slabă şi se notează cu S (valuri
slabe). Dacă în câmpul microscopic nu apar valuri, sperma se notează cu L (lipsă
valuri).
În aceeaşi picătură de spermă se apreciază şi activitatea cinetică a
spermatozoizilor la marginea picăturii. Dacă mişcarea spermatozoizilor este
prezentă până la marginea picăturii (unde influenţele nefavorabile ale factorilor de
mediu sunt mai evidente) sperma este de calitate bună. Dacă la marginea picăturii
apare o zonă mai mult sau mai puţin întinsă în care spermatozoizii sunt morţi,
sperma este de calitate slabă.
Desimea spermei, respectiv numărul de spermatozoizi dintr-un ejaculat se
poate evalua în urma unui examen sumar sau se poate determina exact prin
numărarea spermatozoizilor.
Tehnica de lucru. Pe o lamă degresată se pune o picătură de spermă între
lamă şi lamelă. Lamela nu se presează, se suprapune din poziţie oblică, cu atenţie,
pentru a nu se forma bule de aer. Lamele se păstrează în cristalizoare cu alcool de
96o. Înainte de întrebuinţare, lamele vor fi bine uscate, în caz contrar
spermatozoizii venind în contact cu apa sau alcoolul vor fi omorâţi. Examenul se
face la început cu un obiectiv mic pentru fixarea câmpului, apoi cu obiectiv mai
mare.
Sperma se încadrează în mai multe categorii de calitate în funcţie de
distanţa medie dintre spermatozoizi în câmpul microscopic. Din acest punct de
vedere, la speciile cu sperma deasă, se pot deosebi mai multe categorii de spermă
(fig 9).
Spermă deasă, notată cu D. Tot câmpul microscopic este acoperit de
spermatozoizi, iar distanţa dintre ei este aproximativ egală cu lăţimea capului unui
spermatozoid. Cu aproximaţie, această spermă conţine peste un miliard de
spermatozoizi pe mililitru.

D M R
O
 Fig. 9 Evaluarea calităţii spermei pe baza desimii spermatozoizilor

Spermă foarte rară sau oligospermie, notată cu O. În câmpul microscopic

se observă puţini spermatozoizi (5 – 10), distanţa medie dintre ei fiind mult mai
mare decât lungimea unui spermatozoid.
Precizăm că aspermia reprezintă absenţa spermei.
Se subînţelege că sperma deasă şi eventual mijlocie sunt cele mai
valoroase şi vor fi prelucrate în vederea conservării şi inoculării la femelele în
călduri.
Concentraţia spermei în spermatozoizi constă în determinarea cu
exactitate a numărului de spermatozoizi pe unitatea de volum. Determinarea
concentraţiei spermei în spermatozoizi se poate realiza prin trei metode:
hemocitometrică, fotocolorimetrică sau electronic.
a) Determinarea concentraţiei spermatozoizilor prin metoda
hemocitometrică.
Principiu: numărarea directă la microscop a spermatozoizilor aflaţi într-
un volum cunoscut de lichid, diluat într-o proporţie cunoscută.
Diluţia spermei se face pentru a număra spermatozoizii care sunt foarte
numeroşi şi pentru a-i imobiliza.
Materialele necesare: lichidul de diluţie, pipetă pentru eritrocite, cameră
de numărare, microscop.
Pipeta pentru diluţia eritrocitelor se compune dintr-un tub capilar gradat
şi o bulă de diluţie cu o perlă mobilă. Tubul capilar este gradat şi se citesc pe el
notaţile 0,5 şi 1, iar spaţiul dintre ele este divizat în 10 segmente egale. Deasupra
bulei de diluţie este notaţia 101. Dacă sperma este aspirată în tubul capilar până la
diviziunea 0,5 sau 1 şi apoi completat cu lichidul de diluţie până la notaţia 101, se
obţine o diluţie a spermei de 1/200 sau respectiv 1/100. Capacitatea totală a
pipetei este de 101 volume dar diluţia este de 1/100 şi 1/200 datorită faptului că
un volum de diluant rămâne în tubul capilar şi nu diluează sperma.
După întrebuinţare, pipetele se spală cu apă, apoi cu alcool şi eter, se
usucă, se sterilizează la căldură.
Camera de numărat. Oricare cameră de numărare are înscrise pe ea
următoarele date: înălţimea camerei, care este de 1/10 mm; două cifre 1/400 şi
1/25 sau 1/400 şi 1/16, care variază după celulă şi indică a câta parte dintr-un mm2
este pătrăţelul mic şi pătrăţelul mare care nu au subdiviziuni. Există mai multe
modele de camere de numărat (fig.10).
 Thoma Bürker Goreaev

Fig. 10 Diferite modele de camere de numărat

1. Camera Thoma. Cadrilajul camerei Thoma are latura de 1 mm şi

suprafaţa de 1 mm2. Această suprafaţă este divizată în 400 de pătrăţele, suprafaţa
unui pătrăţel fiind de 1/400 mm2. Pe suprafaţa de 1mm sunt delimitate 16 pătrate
mari, prin linii triple.
2. Camera Bürker are o suprafaţă de 9 mm2, împărţită în 9 pătrate de câte
1 mm2, delimitate prin linii triple. Fiecare mm2 este subîmpărţit prin linii duble în
16 pătrate. La întretăierea liniilor duble se înscriu pătrate care reprezintă 1/400
dintr-un milimetru pătrat; acestea pot fi folosite pentru numărarea eritrocitelor.
3. Camera Bürker-Türk are o suprafaţă de 9 mm2 şi reţeaua sa este
gradată după tipul Türk, combinat cu Thoma. Suprafaţa de 9 mm2 este mărginită
pe toate laturile de o triplă linie şi este
împărţită în 9 pătrăţele de 1mm2 prin
linii triple. Pătratul din mijloc de 1
mm2este de tipul Thoma, fiind împărţit
în 400 de pătrăţele mici: 1/400 dintr-un
mm2 care se foloseşte la numărarea
eritrocitelor. Pătratele inferioare şi
superioare, laterale drepte şi stângi sunt
împărţite în 16 pătrăţele separate între
ele prin linii duble (fig 11). Un astfel de
pătrăţel are o suprafaţă de 1/25 dintr-un
mm2, adică o suprafaţă egală cu 16
pătrăţele mici a 1/400 mm2. Aceste
suprafeţe se folosesc pentru numărarea
Fig. 11 Reţeaua camerei Bürker-Türk globulelor albe.
4. Camera Goreaev are un cadrilaj în care alternează pătratele mici de
1/400 dintr-un mm2 pentru eritrocite, în grupuri de 16, cu pătrate pentru leucocite.
5. Camera Fuchs-Rosenthal are o suprafaţă de 16 mm2, împărţită în 16
pătrăţele cu suprafaţa de 1 mm2 fiecare, separate între ele prin linii triple. Pătratul
de 1 mm2 este divizat în 16 pătrăţele prin linii simple. Adâncimea camerei este de
0,2 mm iar volumul de 3,2 mm3 (practic 3 mm3 ).
Microscop: se lucrează cu obiectiv uscat de 20 sau 40, ocular 10 sau 7,
lumină slabă.
Tehnica de numărat: se aspiră în pipetă spermă până la diviziunea 0,5
sau 1. Dacă sperma depăşeşte uşor diviziunea, prin atingerea vârfului pipetei cu o
hârtie de filtru, vată, şi la nevoie cu pulpa degetului, coloana de spermă se poate
aduce exact până la diviziunea dorită. Se aspiră apoi lichidul de diluţie (soluţie de
NaCl 3%) până la diviziunea 101. Pipeta se aşază în poziţie orizontală, se astupă
cele două capete cu degetul mare şi cel mijlociu şi se agită viguros pentru
omogenizare. Până la numărare pipeta rămâne în poziţie orizontală.
 Umplerea camerei de numărat: se aplică lamela pe lama celulei de
numărat astfel încât la zona de contact să se formeze inelele Newton (inele
colorate de refracţie). Pentru o bună aderenţă lamela se va umezi uşor la margini,
aburind-o.
Se agită pipeta timp de 2 – 3 minute, apoi primele picături care se scurg
sunt lăsate să cadă pe o hârtie de filtru. Vârful pipetei se apropie de marginea
camerei acoperite cu lamela şi se lasă să intre prin capilaritate în cameră o
cantitate de lichid în spaţiul de 1/10 respectiv 1/20 mm format între lamă şi
lamelă.
Este de dorit ca să se introducă dintr-o dată atâta lichid încât spaţiul dintre
lamă şi lamelă să fie umplut în întregime fără ca lichidul să treacă în şanţurile
laterale, fără ca lamela să se deplaseze, fără să intre bule de aer în cameră; în caz
contrar, operaţia se repetă după ştergerea camerei. Se aşteaptă câteva minute
pentru sedimentarea spermatozoizilor pe cadrilaj.
Numărarea spermatozoizilor: se examinează camera la microscop şi se
numără spermatozoizii care se găsesc cu capul pe cadrilaj în pătratele mici de
1/400 mm2. Se numără de exemplu 5 pătrate de dimensiunea 1/25, conţinând
fiecare 16 pătrăţele de 1/400 mm2, deci în total 8o de pătrăţele mici de 1/400 mm2
(fig 12).
Pentru a nu număra de două ori acelaşi spermatozoid, spematozoizii
situaţi cu capul pe intersecţii se numără numai pe două laturi, de exemplu sus şi
stânga. Pentru a afla numărul total de spermatozoizi pe mm3 se aplică formula:

NxSxDxI
X= în care:
n

X = numărul de spermatozoizi pe mm3;

N = numărul de spermatozoizi număraţi;
S = suprafaţa unui pătrăţel mic (1/400 mm2);
I = înălţimea spaţiului capilar (1/10 mm2);
D = diluţia spermei (1/100 sau 1/200);
n = numărul pătratelor mici pe care s-a făcut numărarea.
 Fig. 12 Schema numărării spermatozoizilor

Introducând în formulă se obţine: X = (Nx400x10x200)/80; X = Nx10000 în

cazul când diluţia este 1/200 şi s-au numărat spermatozoizii din 80 de pătrăţele
mici. Dacă diluţia este de 1/100, pentru a afla numărul de spermatozoizi pe mm3
se înmulţeşte N cu 5000.
Pentru a exprima concentraţia spermei în spermatozoizi/ml, rezultatul
obţinut, exprimat în spermatozoizi/mm3 se înmulţeşte cu 1000.
Exemplu: în cele 80 de pătrăţele mici s-au numărat 120 de spermatozoizi,
diluţia fiind de 1/200.
X = 120x10000 = 1.200.000 spermatozoizi/mm3. Se recomandă ca
numărarea spermatozoizilor să se facă de două ori pentru un ejaculat; eroarea
admisă pentru speciile cu spermă concentrată: 100 – 200 de mii.
În cazul utilizării camerei Fuchs-Rosenthal, se examinează cu obiectiv 20
şi ocular 5. Când densitatea spermatozoizilor este de circa 50 pe un pătrat mare, se
numără cele patru pătrate mari ale diagonalei, iar numărul spermatozoizilor pe
mm3 este egal cu suma lor de pe cele patru pătrate mari înmulţit cu 4/3. Când
densitatea spermatozoizilor este mică, se numără toate cele 16 pătrate mari, iar
suma împărţită la trei dă numărul de spermatozoizi pe mm3.
b) Determinarea concentraţiei spermei în spermatozoizi prin metoda
fotocolorimetrică (foto 13).
Principiul: reţinerea
fasciculelor de lumină de către
spermatozoizi, ceea ce face ca
opacitatea suspensiei să fie direct
proporţională cu concentraţia în
spermatozoizi.
Tehnica de lucru. Înainte
de fiecare determinare se citeşte
proba martor, care constă din 7,9
sau 3,9 ml (în funcţie de tipul
aparatului) de citrat de sodiu,
soluţie 2,9% care se introduce în
Fig. 13 Tipuri de fotocolorimetre eprubeta (cuva) perfect
transparentă. Acul galvanometrului
se fixează pe poziţia 0. Într-o altă eprubetăă de aceeaşi construcţie şi mărime,
peste aceeaşi cantitate de citrat de sodiu, 2,9%, folosită la proba martor, se adaugă
0,1 ml spermă brută. Sperma trebuie să cadă liber prin gravitaţie, în cuvă. După
scurgerea spermei se aspiră puţină soluţie şi se spală pipeta în eprubetă (cuvă).
Eprubeta se închide cu un dop sau cu degetul mare şi se răstoarnă de câteva ori, în
vederea omogenizării, fără a se agita, pentru a nu se crea spumă.
 Eprubeta se şterge atent pentru a se îndepărta urmele de praf şi
amprentele şi se introduce în locaşul special al aparatului în locul probei martor.
Se aşteaptă puţin până ce curenţii din soluţie se liniştesc după care se urmăreşte
gradaţia la care se opreşte acul galvanometrului. Pentru fiecare ejaculat se
recomandă citirea a două probe şi se face media. Conversiunea valorilor citite pe
scala colorimetrului în miliarde spermatozoizi pe ml, se face pe baza unui tabel
ale cărei indicaţii diferă în funcţie de modelul comercial care se verifică
comparativ cu datele obţinute la camera de numărat.
Fotocolorimetrul electric asigură o apreciere rapidă şi exactă a
concentraţiei spermei, fapt ce uşurează activitatea de diluţie şi prelucrare a
materialului seminal în unităţile specializate.
c) Determinarea concentraţiei spermei în spermatozoizi prin mijloace
electronice
În ultimul timp, în cadrul unor centre de însămânţări artificiale şi în
diferite centre de cercetare ştiinţifică în domeniul reproducţiei animalelor şi al
însămânţărilor artificiale numărarea spermatozoizilor se face şi prin intermediul
aparatelor electronice adaptate acestui scop.
Principiul determinării se bazează pe modificarea de către spermatozoizi
a câmpului electric creat de doi electrozi din platină, plasaţi într-un capilar de
trecere al spermei. Construcţia aparatului diferă după modelul comercial, funcţie
de care diferă şi tehnica de lucru. În 10 – 15 secunde rezultatul determinării este
afişat pe ecranul aparatului. În prezent, astfel de aparate sunt destul de
costisitoare, ceea ce încetineşte mult ritmul de folosire în mod curent al acestora
în unităţile specializate.
Examenul morfologic al spermatozoizilor
Aprecierea microscopică a calităţii spermei unui reproducător se
completează obligatoriu cu examenul morfologic sau citostructural al
spermatozoizilor, întrucât sperma conţine pe lângă spermatozoizi normali şi o
anumită proporţie de spermatozoizi patologici. Rol important în desfăşurarea
fiziologică a fecundaţiei revine integrităţii citostructurale a celor doi gameţi.
Spermatozoidul fecundant trebuie să fie cu o citostructură normală, pentru ca
evoluţia noii fiinţe să se desfăşoare normal. Punerea în evidenţă a tuturor
abaterilor de la structura morfologică normală poate da indicaţii valoroase privind
capacitatea fecundantă a reproducătorului respectiv.
Examenul morfologic urmăreşte evidenţierea prin diferite metode de
colorare, a formelor anormale de spermatozoizi, aprecierea lor procentuală şi
stabilirea proporţiei anomaliilor în ejaculat. Totodată se apreciază şi proporţia de
spermatozoizi vii şi morţi dintr-un ejaculat.
Spermatozoizii dintr-un ejaculat, din punct de vedere morfologic, pot fi:
- normali (vii şi morţi);
- anormali: cu modificări patologice (anomalii primare şi secundare) şi
nematuri.
Studiul morfologic al elementelor figurate din spermă impune colorarea
spermei prin punerea în contact a spermatozoizilor vii cu colorantul utilizat, în
cazul coloraţiei intravitale, sau prin colorarea într-un interval de timp cât mai mic
de la recoltare, pentru a nu fi afectată viabilitatea spermatozoizilor şi deci,
însuşirile morfocitochimice ale acestora. De asemenea frotiul trebuie să fie foarte
subţire şi de preferinţă va fi fixat în aer liber, câteva minute, pentru a se evita un
eventual şoc termic. Ejaculatele prea concentrate vor fi diluate în prealabil, într-o
proporţie de 1/10 – 1/20 cu ser fiziologic, în condiţii de izotermie.
Determinarea proporţiei de spermatozoizi vii şi morţi dintr-o probă de
spermă (coloraţie vitală)
Principiul se bazează pe însuşirea membranei spermatozoizilor de a
permite sau de a bloca pătrunderea colorantului în celulă. Astfel, spermatozoizii
care au fost vii în momentul contactului cu soluţia colorantă, având membrana
integră funcţional, vor apărea în câmpul microscopic necoloraţi, translucizi, pe un
fond dat de nuanţa colorantului utilizat.
În acest caz, membrana celulară se opune pătrunderii în interiorul celulei
a soluţiei colorante. Din contra, spermatozoizii care au fost morţi în momentul
contactului cu soluţia colorantă, vor apărea în câmpul microscopic coloraţi,
deoarece membrana acestora nu-şi mai poate îndeplini rolul fiziologic menţionat.
Coloraţiile efectuate cu scopul identificării formelor de spermatozoizi vii
şi morţi se fac la temperatura de 37 – 38oC în condiţii de izotermie, în maxim 15
minute de la recoltarea spermei, perioadă de timp în care afinitatea tinctorială a
celulelor este nemodificată.
În literatura de specialitate sunt descrise mai multe metode de colorare
pentru evidenţierea spermatozoizilor vii şi morţi, din care le menţionăm pe cele
mai practice şi eficiente.
Metoda cu cerneală de China (Bürii). Pe o sticlă de ceas curată şi
degresată, se amestecă o picătură de spermă cu aceeaşi cantitate de cerneală de
China. După 3 – 4 minute se ia o picătură din acest amestec şi se pune pe o lamă
degresată. Cu ajutorul altei lame cu marginile şlefuite, se face un frotiu subţire şi
se usucă la temperatura camerei sau la flacără şi apoi se examinează la microscop,
cu obiectiv 40. Spermatozoizii apar translucizi sau coloraţi în negru, pe un fond
negru.
Metoda de colorare cu opal blau (Lagerlöf) se bazează pe folosirea
unei soluţii apoase saturate de opal blau (3 g opal blau la 100 ml apă distilată). Se
încălzeşte o cantitate mică din această soluţie şi apoi se răceşte. Pe o lamă
degresată se pun 2 – 4 picături din această soluţie răcită, peste care se adaugă 1 –
2 picături de spermă de analizat. Se omogenizează bine amestecul şi după circa
trei minute, cu ajutorul unei baghete se face un frotiu subţitre care se usucă în aer
liber, apoi se examinează la microscop. Spermatozoizii vii vor apărea clar pe un
fond albastru.
Metoda de colorare cu roşu de Kongo dă bune rezultate pentru
examinarea spermei congelate. O cantitate redusă din soluţia de roşu de Kongo
3% în apă distilată, se încălzeşte apoi se răceşte. Pe o sticlă de ceasornic se
amestecă 1 – 2 picături din sperma de analizat cu 1 – 2 picături din soluţia adusă
la temperatura spermei. Se lasă în repaus 3 minute, după care se execută un frotiu
subţire pe o lamă curată şi degresată. Frotiul se usucă la aer, apoi examinează la
microscop, spermatozoizii morţi fiind coloraţi în roz-roşietic, iar cei vii vor apărea
necoloraţi pe un fond roz-roşietic.
 Metoda de colorare cu eozină-nigrosină (Blom) se bazează pe
proprietatea eozinei de a penetra membrana spermatozoizilor morţi pe care îi
colorează, iar nigrosina se foloseşte pentru contrast. Se utilizează eozină soluţie
5% şi nigrosină 10%, ambele în apă distilată. Pe o lamă degresată se pune o
picătură de spermă la care se adaugă două picături de eozină 5% în apă distilată şi
se omogenizează uşor cu o baghetă din sticlă. Se adaugă apoi o picătură de
nicrosină soluţie 10% în apă distilată şi se omogenizează din nou. După 3 – 5
minute, din acest amestec se execută un frotiu subţire care se lasă la uscare în aer.
Frotiul astfel preparat se examinează la microscop, obţinându-se un fond negru-
violet. Spermatozoizii vii sunt incolori, iar cei morţi se colorează în roz.
Indiferent de metoda de colorare folosită pentru precizarea proporţiei de
spermatozoizi vii şi morţi din proba de spermă, se examinează la întâmplare, în
câmpul microscopic 200 – 500 de spermatozoizi care se încadrează în două
categorii – vii şi morţi – exprimarea făcându-se procentual. Proporţia de
spermatozoizi vii trebuie să aibă o valoare superioară dar apropiată de mobilitatea
acesora exprimată procentual, întrucât în categoria spermatozoizilor vii sunt
incluşi şi spermatozoizi cu mişcări anormale (retrograde, vibratorii, circulare).
Determinarea proporţiei de spermatozoizi cu modificări morfologice
(anormali)
În spermă, pe lângă spermatozoizii normali apare un număr variabil de
spermatozoizi anormali şi nematuraţi care influenţează negativ capacitatea
fecundantă a spermei. Anomaliile structurale ale spermatozoizilor pot să
intereseze, izolat sau simultan, diverse părţi constituiente ale acestuia: cap, gât,
flagel. Anomaliile pot fi primare şi secundare.
Anomaliile primare apar în perioada spermatogenezei fiind cauzate
frecvent de factorii genetici, alimentari, neuro-hormonali etc. Din aceste anomalii,
mai frecvent apar: spermatozoizi cu capul în formă de pară, alungit, îngustat, liră,
prins lateral de piesa intermediară, spermatozoizi cu capul mare (macrocefali), cu
capul mic (microcefali), cu două capete (bicefali). Tot în această categorie se
încadrează spermatozoizii mai mari decât normalul (macrospermatozoid), mai
mic (microspermatozoid), giganţi (megalospermatozoizi). Gâtul spermatozoidului
poate fi mare, îngroşat (macrocol), mic (microcol) sau lipseşte total. Forma
gâtului poate fi conică, fusiformă sau atipică.
Coada spermatozoizilor patologici poate fi mai scurtă (microcaudat),
multiplă (policaudat), dublă (bicaudat), mai lungă şi îngroşată (macrocaudat). Se
mai poate întâlni coada inelară atunci când pH-ul mediului este modificat sau
spermatozoizi la care flagelul este implantat lateral.
Un semn al degenerării epiteliului seminifer este apariţia de
spermatozoizi imaturi care vor influenţa negativ fertilitatea masculului.
Spermatozoidul nematur prezintă o picătură citoplasmatică la nivelul gâtului ce se
va deplasa, la nivelul epididimului, în cazul unui stocaj mai prelungit, către piesa
intermediară, sau se va desprinde complet de spermatozoizi.
Anomaliile secundare sunt determinate de reţinerea prelungită a
spermatozoizilor la nivelul cozii epididimului sau al ampulelor canalelor
deferente. Aceste anomalii apar şi în urma manipulărilor legate de recoltarea
spermei şi de examenul acesteia.
Anomaliile secundare cele mai frecvente se referă la: discontinuitatea
calotei acrozomiale consecutiv îmbătrânirii spermatozoizilor în epididim sau a
efectului glandelor anexe care au un conţinut modificat al componentelor
biochimice şi biofizice; perforarea acrozomului şi pierderea conţinutului acestuia,
ca urmare a şocului termic din momentul congelării; condensarea acrozomului ca
urmare a infecţiilor virale; desprinderea capului de flagel; diversele forme de
torsionare a flagelului (forma de bici, de opt, în jurul capului etc.); fracturarea
cozii etc.
Excesul de forme patologice se numeşte teratospermie. Pe lângă
spermatozoizi, sperma conţine şi alte celule ca: spermatocite, spermatide, celule
epiteliale descuamate din căile urinare, leucocite, eritrocite, spermiofage etc.
Pentru determinarea proporţiei de spermatozoizi anormali, se folosesc
multe metode de colorare, între care menţionăm pe cele mai simple şi uşor de
realizat. Înainte de colorarea propriu-zisă, se pregăteşte proba de spermă, în sensul
că se diluiază într-o proporţie de 1/5 – 1/20 cu o soluţie de ser fiziologic. O
picătură din sperma diluată se pune pe o lamă de microscop curată şi perfect
degresată. Se execută cu ajutorul unei lame şlefuite, un frotiu subţire cu multă
atenţie, pentru a nu provoca desprinderea capului de flagel. Frotiul se lasă să se
usuce la temperatura camerei sau la termostat la temperatura de 35 – 39oC, timp
de 2 - 5 minute. După uscare preparatul se fixează timp de 30 – 40 de minute cu o
soluţie de fixare, cum ar fi de exemplu soluţia de formol 40%, 10 – 20% în ser
fiziologic. După fixarea frotiului se colorează preparatul, metoda de colorare fiind
în funcţie de ce se urmăreşte a fi pus în evidenţă.
După executarea şi uscarea preparatului, frotiul din spermă se acoperă cu
o soluţie de albastru de metil 10% sau cu o soluţie de roşu de Bengal (3 g roşu
Bengal dizolvat în 99 ml apă distilată la care se adaugă 1ml formalină 40%), sau
cu o soluţie de eozină 1%, sau o soluţie 3% de albastru de Victoria în alcool
metilic, soluţie 3% de roşu de Kongo, fucsină (o picătură soluţie saturată de
fucsină în alcool, peste 40 ml apă distilată), soluţie 3% opal blau, violet de
genţiana etc.
Oricare ar fi colorantul folosit, acesta este menţinut deasupra frotiului cu
spermă 3 – 5 minute, apoi frotiul se spală cu apă distilată, se usucă la etuvă şi se
examinează la microscop cu obiectivul cu imersie.
Metoda Williams constă în faptul că după uscarea şi fixarea frotiului
acesta se acoperă cu o soluţie de cloramină 5o/oo pentru a se îndepărta mucusul. Se
spală cu apă distilată şi alcool 96o. Se colorează cu o soluţie de fucsină fenicată-
eozină (câte o parte alcool şi eozină 5% şi două părţi fucsină fenicată). Lama se
agită în timpul colorării pentru a se evita precipitarea colorantului. După 3 – 5
minute, frotiul se spală cu apă distilată şi se usucă şi examinează cu obiectivul cu
imersie.
Indiferent de metoda de colorare utilizată, se examinează în câmpul
microscopic, la întâmplare, un număr de 300 – 500 spermatozoizi care se vor
încadra citologic în una din următoarele categorii: normali, cu anomalii primare,
cu anomalii secundare, nematuri.
 Spermatozoizii cu anomalii primare se admit în proporţie de până la 2 –
3% la taur, berbec şi 5% la vier, armăsar şi cocoş.
Spermatozoizii cu anomalii secundare se admit în proporţie de până la
15% la taur, berbec şi armăsar şi de 10% în sperma de cocoş.
Spermatozoizii nematuraţi se admit într-o proporţie de maxim 2%. În
această categorie se includ şi celulele în diferite faze de evoluţie: spermatocit I şi
II, spermatide.
Depăşirea proporţiei normale de forme nematurate indică existenţa unor
deficienţe la nivelul epiteliului germinativ.

1.5.3. Examenul însuşirilor biologice ale spermei

1.5.3.1. Mobilitatea spermatozoizilor

Este un factor indispensabil viabilităţii lor şi reprezintă una din
caracteristicile de bază ale gametului mascul prin care se deosebeşte de celelalte
celule ale organismului. Mişcarea spermatozoidului necesită transformarea
energiei chimice în energie biologică, iar deplasarea se realizează cu ajutorul
flagelului. Prin contracţiile cozii se asigură propulsia, iar capul, prin forma sa
puţin excavată determină rotirea spermatozoizilor în jurul axului longitudinal.
Fibrele filamentului axial glisează între ele, se curbează şi revin la poziţia iniţială,
asigurând înaintarea spermatozoizilor. După direcţia în care se deplasează,
spermatozoizii pot avea mişcare de înaintare, circulatorie, vibratorie sau
retrogradă. Aprecierea mobilităţii spermatozoizilor se face printr-un examen între
lamă şi lamelă, la temperatura de 370C şi se exprimă prin note de la 1 la 5, de la
0,1 la 1 sau direct în procente. O spermă de calitate corespunzătoare trebuie să
aibă o mobilitate minimă a spemetozoizilor din sperma brută, imediat după
recoltare, de 70%, cea conservată prin refrigerare de 60%, iar cea conservată prin
congelare, după decongelare 30%.
Tehnica de lucru se bazează pe determinarea procentului de
spermatozoizi dintr-un ejaculat care prezintă mişcarea rectilinie de înaintare cu o
viteză caracteristică speciei: 7,2 mm/minut la taur, 3 mm/minut la berbec, ţap şi
câine, 5,4 mm/minut la armăsar şi 1,8 mm/minut la iepuroi. Aprecierea mobilităţii
(motilităţii) spermatozoizilor se face prin mai multe procedee, cel mai practic
fiind examenul unei picături de spermă între lamă şi lamelă, cu notarea
procentului de spermatozoizi care prezintă mişcare de înaintare rectilinie.
Examenul picăturii de spermă se face pe o platină încălzită la 37 – 38oC.
Notarea mobilităţii spermatozoizilor se poate face în trei sisteme: sistemul
notelor de la 5 la 1; sistemul zecimal în care se acordă note de la 1,0 la 0,1;
sistemul procentual.
După primul sistem se acordă note în funcţie de procentul de
spermatozoizi cu mişcare de înaintare rectilinie. Se iau în observaţie în câmpul
microscopic grupuri de câte 5 spermatozoizi şi se urmăreşte direcţia de deplasare.
Dacă toţi cei 5 spermatozoizi părăsesc punctul de observaţie cu mşcări de
înaintare, nota pentru mobilitate este 5; dacă 4 spermatozoizi prezintă mişcare de
înaintare şi unul este imobil sau are altă mişcare, nota pentru mobilitate este 4,
etc. Media notelor observaţiilor efectuate în câmpul microscopic reprezintă nota
pentru mobilitate a ejaculatului respectiv.
Notele acordate corespund la următoarele procente:
- nota 5 – 100% toţi spermatozoizii din câmpul microscopic au mişcări
de înainatare;
- nota 4 – 80% dintre spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 3 – 60% dintre spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 2 – 40% dintre spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 1 – 20% dintre spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 0 – toţi spermatozoizii din câmpul microscopic sunt imobili sau
au alt tip de mişcare.
Acest sistem de apreciere a mobilităţii spermatozoizilor este recomandat
pentru începători.
După sistemul zecimal, tehnica de lucru este aceeaşi, numai că se iau în
observaţie în câmpul microscopic grupuri de câte 10 spermatozoizi. Media notelor
acordate reprezinţă nota pentru mobilitate a ejaculatului examinat. După acest
sistem acordarea notelor se face astfel:
- nota 1,0 – când 100% din spermatozoizi din câmpul microscopic au
mişcări de înaintare;
- nota 0,9 – când 90% din spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 0,8 – când 80% din spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 0,7 – când 70% din spermatozoizi au mişcări de înaintare;
- nota 0,6 – când 60% din spermatozoizi au mişcări de înaintare;
……………………………………………………………………
- nota 0,1 – când 10% din spermatozoizi au mişcări de înaintare.
Deci, la nota 5 corespunde nota 1; la nota 4 corespunde 0,9 şi 0,8; la nota
3 corespunde 0,6 şi 0,7; la nota 2 corespunde 0,4 şi 0,5; la nota 1 corespunde 0,2
şi 0,3 iar la nota 0 corespunde 0,1.
După sistemul procentual, aprecierea mobilităţii se exprimă direct în
procente (100%, 90%, 80%, etc). Examenul se face prin urmărirea în câmpul
microscopic a 10 spermatozoizi ca în sistemul de apreciere zecimal, însă
exprimarea se face în procente.
Sperma brută, imediat după recoltare trebuie să aibă o mobilitate de
minimum 0,7 pentru a putea fi folosită la însămânţări artificiale. Frecvent, la taur
şi la berbec, mobilitatea este de 80 – 85%, iar la vier şi armăsar de 60 – 75%.
Sperma conservată prin refrigerare trebuie să aibă o mobilitate de minimum 60%
pentru a fi inoculată la femelele în călduri.
Sperma conservată prin congelare, după decongelare trebuie să aibă o
mobilitate de minimum 30% pentru a fi întrebuinţată.
Examenul mobilităţii spermatozoizilor este obligatoriu pentru fiecare
ejaculat în parte imediat după recoltare şi înainte de însămânţarea femelelor,
indiferent de modul de conservare al spermei.
Mobilitatea şi viteza de înaintare a spermatozoizilor depinde de specie,
mod de conservare, de intervalul de timp care s-a scurs de la recoltarea spermei
până în momentul examinării, de pH-ul spermei, de temperatura mediului etc.
 Concomitent cu aprecierea mobilităţii se fac şi observaţii referitoare la
energia de mişcare a spermatozoizilor:
- mişcări energice, notată cu +++
- mişcări moderate, notată cu ++
- mişcări agonice, notată cu +
De exemplu, dacă în partea examinată proporţia spermatozoizilor cu
mişcări de înaintare este de 75%, iar mişcarea se apreciază ca energică, notarea
mobilităţii acestora se face cu 0,75+++.
Aprecierea mobilităţii spermatozoizilor pe baza testului pătrunderii prin
mucusul cervical, constă în evaluarea microscopică a numărului de spermatozoizi
care străbat în două ore, la temperatura de 37oC, un tub capilar lung de 2 cm, în
care se găseşte mucus cervical recoltat de la o femelă în călduri.
Testul poate fi efectuat şi direct pe o lamă pe care se pune o picătură de
spermă în apropierea unei picături de mucus cervical de călduri. Se urmăreşte la
microscop şi se apreciază proporţia spermatozoizilor care pătrund prin mucus. În
funcţie de numărul de spermatozoizi care străbat mucusul şi de timpul necesar
pentru penetraţie, se apreciază aptitudinea de a fecunda a spermatozoizilor şi deci
calitatea spermei.
Mobilitatea şi viteza de înaintare a spermatozoizilor se poate detrmina şi
prin metoda fotogrametrică (Bogdan A.T. şi colab. 1976). Metoda constă în
fotografierea spermatozoizilor dintr-un preparat între lamă şi lamelă.
Spermatozoizii morţi apar pe fotografie cu contur clar, iar cei vii apar ca o undă
luminoasă.
Prin numărarea şi exprimarea procentuală a rezultatelor se poate
determina proporţia de spermatozoizi mobili şi imobili din proba examinată.

1.5.3.2. Metabolismul spermatozoizilor

Reprezintă însuşirea biologică fundamentală prin care se asigură energia
necesară mobilităţii şi viabilităţii spermatozoizilor. Prin fructoliză se formează o
cantitate de energie chimică ce se acumulează sub formă de acid
adenozintrifosforic (ATP) care, ulterior, prin desfacerea legăturilor macroergice,
furnizează energia necesară spermozinei (proteina contractilă care se găseşte în
flagel).
În procesul de metabolism, spermatozoizii folosesc substanţele energetice
din plasma seminală. Când se epuizează aceste rezerve, spermatozoizii folosesc
fosfolipidele care reprezintă principala sursă de energie intracelulară.
Metabolismul spermatozoizilor poate avea loc atât în mediul oxibiotic cât şi în cel
anoxibiotic, în primul caz, degradarea monozaharidelor ajungând până la CO2 şi
H2O, iar în cel de-al doilea caz până la faza de acid lactic.
La speciile a căror spermă este săracă în electroliţi dar bogată în glucide
(rumegătoare) au loc ambele procese. La speciile a căror spermă conţine puţine
glucide şi mulţi electroliţi (armăsar, vier) domină procesele oxibiotice.
Intensitatea metabolismului se poate determina în laborator cu ajutorul
testului cu albastru de metilen. El constă în măsurarea vitezei de decolorare a unei
soluţii 0,1% de albastru de metilen, colorant din clasa tiazinelor, în condiţii de
anaerobioză, la 400C sau la temperatura laboratorului (200C). Acest test
evidenţiază activitatea dehidrogenazelor care intervin în glicoliza anaerobă. Există
o corelaţie strânsă între timpul de decolorare a soluţiei de albastru de metilen şi
concentraţia şi mobilitatea spermatozoizilor din proba de spermă.
Principiu: punerea în evidenţă a activităţii dehidrogenazelor care au rolul
de a scinda glucoza în energie (folosită de spermatozoizi) şi hidrogen, care este
captat de o soluţie de albastru de metilen; când ajunge la saturaţie, soluţia de
albastru de metilen se decolorează.
Cu cât metabolismul spermatozoizilor va fi mai intens, mobilitatea mai
mare şi numărul acestora mai ridicat, cu atât timpul de decolorare al soluţiei va fi
mai scurt şi ca atare, prin analogie, şi calitatea spermei va fi mai bună.
Tehnica de lucru. Pe o sticlă de ceasornic, curată şi sterilizată se iau 0,2
ml spermă brută proaspăt recoltată, peste care se adaugă aceeaşi cantitate dintr-o
soluţie izotonică de albastru de metilen 0,1%. După omogenizare se aspiră în
tuburi capilare de sticlă astfel încât lungimea coloanei să fie de cel puţin 3 cm. Se
notează timpul când s-a aspirat amestecul în tuburi, apoi se introduc tuburile la
termostat la temperatura de 40oC. Când întreaga coloană este decolorată,
exceptând extremităţile (întrucât acceptarea hidrogenului are loc în condiţii de
anaerobioză) care vin în contact cu aerul, se scot tuburile din termostat şi se
notează timpul care s-a scurs.
În absenţa termostatului şi pentru reducerea consumului de energie,
tuburile capilare se lasă la temperatura încăperii în care se face proba. Rezultatele
se raportează la 40oC considerată standard.
Calculul se face după formula:

t
R=
(Tts − Tl ) x 0,16
, în care:

R - redoxul (timpul de decolorare la 40oC);

t – timpul de decolorare la temperatura laboratorului;
Tts – temperatura termostatului (40oC);
Tl – temperatura din laborator sau din încăperea de lucru;
0,16 – coeficient fix.
Corespondenţa dintre timpul de decolorare a soluţie de albastru de
metilen la 40oC şi numărul de spermatozoizi/ml este :
- până la 3 minute, peste un miliard;
- între 3 – 5 minute, 0,7 – 1,0 miliard;
- între 5 – 7 minute, 0,5 – 0,7 miliarde;
- între 7 – 10 minute, 0,3 – 0,5 miliarde.
În funcţie de timpul de decolorare la temperatura de 20oC sperma se
clasifică în următoarele categorii de calitate:
- sperma de taur: timp de decolorare până la 10 minute – foarte bună;
între 10 şi 20 minute – bună; între 20 şi 30 minute – mediocră; peste
30 minute – inferioară şi nu se foloseşte la însămânţările artificiale;
- sperma de berbec: timp de decolorare până la 8 minute – foarte
bună; între 8 şi 16 minute bună; între 16 şi 30 minute – mediocră;
 peste 30 minute – inferioară şi nu se foloseşte la însămânţările
artificiale.
La armăsar şi vier, din cauza cantităţii mici de hidrogen eliberat şi a
specificului scindării substanţelor energetice din spermă, această metodă nu dă
rezultate bune.

1.5.4. Examenul biochimic al spermei

Ca orice lichid biologic, sperma conţine substanţe, aparţinând tuturor
categoriilor specifice organismului: glucide, lipide, protide, vitamine, hormoni şi
substanţe minerale. Felul şi cantitatea acestora variază cu specia.
Glucidele din spermă sunt reprezentate atât de glucide simple (oze), cât şi
complexe (ozide). Glucidele sunt o sursă importantă de energie şi contribuie în
mare măsură la mişcarea spermatozoizilor. În sperma diverselor specii de animale
au fost identificate: glucoza, galactoza, fructoza, arabinoza, riboza, ribuloza,
glucozamina, acidul sialic, acizi neuraminici, acizi uronici, libere sau sub formă
de ozide legate cu protidele sau cu lipidele.
Fructoza se poate găsi în cantităţi de peste 2% (taur), aproximativ de 300
de ori mai mult ca în sânge. Sinteza fructozei se produce la nivelul glandelor
seminale şi prostatei, sub influenţa androgenilor secretaţi de glanda Leydig.
Ritmul de degradare a fructozei din plasma seminală se corelează cu numărul şi
mobilitatea spermatozoizilor. „Indicele de fructoliză“ reprezintă cantitatea de
fructoză, exprimată în mg, descompusă de un miliard de spermatozoizi într-o oră,
la temperatura de 370C. Valorile acestui indice la taur oscilează între 1,4 şi 23,66
(Buruiană L.M. şi colab., 1960).
În spermă se mai găsesc şi alte glucide simple care pot constitui o sursă
de energie în urma glicolizei anaerobe sau aerobe. Aproximativ 50% din glucidele
simple reducătoare din sperma de taur sunt diferite de fructoză. În plus, în spermă
se găsesc complexe glicoproteice care pot libera oze simple, uşor metabolizabile
în reacţiile de glicoliză. Nivelul acestor glucide din plasma seminală (hexoze,
hexamine, acid sialic, metilpentoze), este aproximativ de două ori mai mare
comparativ cu serul sanguin, ele constituind o sursă de energie pentru
spermatozoizi, în lipsa fructozei. Sperma de vier conţine cantităţi mari de acid
sialic şi inozitol, primul contribuind la ataşarea spermatozoidului de ovocit, al
doilea asigurând presiunea osmotică, în absenţa clorurii de sodiu la această specie.
Glicogenul este un polizaharid important ca sursă de glucoză în glicoliza
anaerobă.
Acidul citric, acid organic, este secretat la nivelul glandelor seminale la
taur şi vier, sperma de armăsar fiind mai săracă în acest component. El contribuie
la menţinerea pH-ului şi asigură presiunea osmotică favorabile schimburilor de
membrană, fiind şi un activator al fosfatazei acide.
Lipidele din spermă reprezintă circa 12% din conţinutul total al
spermatozoizilor. Calitatea lipidelor din spermă este analogă cu a ţesuturilor fiind
formate din gliceride (mono-, di- şi trigliceride), acizi graşi liberi, fosfolipide,
colesterol etc. Fosfolipidele constituie una din sursele de energie în degradarea
exogenă, participând în structura membranelor. Compoziţia în lipide a spermei se
modifică în cursul spermatogenezei, al trecerii prin epididim, fiind dependentă de
alimentaţie, climă şi alţi factori de mediu. Aşa se explică variaţia rezistenţei
spermatozoizilor la şocul termic, diluare, conservare etc.
Prostaglandinele sunt de natură lipidică, fiind identificate în plasma
seminală 13-14 tipuri care provin din transformarea acizilor graşi nesaturaţi cu 3,
4 sau 5 duble legături.
Proteinele se regăsesc în spermă într-o gamă variată şi în cantităţi
diferenţiate cu specia, rasa, individul, anotimpul, alimentaţia etc.
În spermă s-au identificat aminoacizii care intră în structura proteinelor.
Acidul glutamic se găseşte în concentraţie ridicată la taur, vier şi păsări.
Determinarea aminoacizilor liberi din spermă poate fi un test util pentru
aprecierea calităţii unei sperme şi a activităţii sexuale a donatorilor.
Pe lângă aminoacizi, sperma mai conţine şi o serie de compuşi care derivă
de la aceştia şi care sunt dotaţi cu o activitate specifică faţă de mucoase şi
membrana spermatozoizilor: colina, ergotiamina, spermina, adrenalina,
noradrenalina, creatina şi creatinina.
Proteinele din spermă sunt o categorie de substanţe care variază calitativ
şi cantitativ în funcţie de numeroşi factori: specia, vârsta, alimentaţia, anotimpul,
activitatea sexuală, starea de sănătate etc. Calitatea proteinelor din plasma
seminală este mai scăzută decât aceea din plasma sanguină. În hipogonadism sau
în alte afecţiuni tumorale sau genetice, în cazul unei alimentaţii deficitare în
proteine, a epuizării sexuale etc nivelul proteinelor variază foarte mult.
Calitatea proteinelor din spermă se apreciază prin anumite metode şi
tehnici de laborator: electroforeza în medii de o anumită porozitate,
ultracentrifugarea, filtrarea prin geluri, reacţii imunochimice etc. În spermă se
găsesc nucleoproteine, nucleotide, mucoproteine, enzime (peroxidaza, catalaza,
transaminaza, hidrolaza, fosfataza (acidă şi bazică), nucleotidaza,
adenozintrifosfataza, adenil-ciclaza, ATP-aza acidă şi alcalină, proteaze,
hialuronidaza, fibrinogenaza, veziculaza, acetilcolinesteraza, amilaza, aldolaza
etc.). Nivelul acestora poate fi determinat prin metode de laborator şi oferă indicii
asupra calităţii spermei.
Vitaminele din spermă sunt reprezentate de aproape toate aceste
substanţe, mai frecvent întâlnite fiind: acidul ascorbic (3-8 mg%), riboflavina (30
µg/g substanţă uscată), carotenul (7-40 µg/100 ml), vitamina D, tocoferoli etc.
Nivelul vitaminelor din spermă este influenţat de conţinutul respectiv în raţiile
alimentare.
Hormonii din spermă mai frecvent întâlniţi sunt: estradiolul, estrona,
estriolul şi testosteronul.
Substanţele minerale asigură presiunea osmotică necesară menţinerii
integrităţii celulare a spermatozoizilor pe de o parte, iar pe de alta, prin ionii
formaţi contribuie la activarea unor reacţii enzimatice. Elementele minerale care
se găsesc în spermă fac parte din clasa metalelor alcaline: Na, K, Mg, Ca şi a
metalelor grele: Fe, Cu, Zn, legate cu anionii: clor, fosforic, carbonic, sulfuric,
citric etc.
 1.5.5. Examenul bacteriologic şi micologic al spermei
Sperma conţine întotdeauna floră banală. În unele situaţii sperma poate
conţine şi germeni patogeni care prezintă o semnificaţie mai mare, în condiţiile
extinderii însămânţărilor artificiale. În acest context, este necesar completarea
examenului spermei şi cu examenul bacteriologic şi micologic. Contaminarea
spermei se poate realiza fie din surse interne, fie din surse externe.
Sursele externe de contaminare sunt reprezentate de microorganismele
din aerul sălilor de recoltare a spermei, de pe pielea reproducătorilor, în urma
contactului cu aparatura de recoltare şi conservare în mediu insuficient sterilizat.
Vaginul artificial incorect sterilizat contribuie într-o măsură însemnată la
contaminarea spermei. De asemenea, mediile de diluţie pot conţine
microorganisme care să polueze sperma.
Sursele interne de contaminare sunt reprezentate de diversele procese
patologice de la nivelul testiculului sau al căilor uro-genitale ca: abcese
testiculare, spermatocistite, epididimite şi prostatite. Contaminarea internă a
spermei se mai pote produce şi prin germenii de la nivelul sângelui sau din alte
umori. Furoul este o sursă permanentă de bacterii, ceea ce explică o contaminare
mai pronunţată a spermei recoltată prin masajul ampulelor canalelor deferente şi
al veziculelor seminale, comparativ cu sperma recoltată cu ajutorul vaginului
artificial. Flora din spermă poate fi încadrată în bacterii, virusuri, ricketsi,
ciuperci.
Într-un studiu consacrat maladiilor transmisibile din spermă, Oficiul
Internaţional de Epizootii (Hare, W.C.D.,1985) evidenţiază nu mai puţin de 69 de
agenţi infecţioşi patogeni, bacterii virusuri, protozoare sau ciuperci, susceptibile
de a fi prezenţi şi/sau transmişi prin spermă. Printre aceştia se pot enumera:
virusul febrei aftoase, pestei porcine, pestei bovine, Mycoplasma mycoides, a
peripneumoniei bovine, Brucella abortus, ovis şi melitensis, agentul tuberculozei,
campylobacteriozei, trichomonozei sau clamidiozelor etc. Extrema diversitate a
acestor microorganisme şi a maladiilor de care sunt responsabile, scot în evidenţă
posibilele origini ale contaminării spermei. Investigaţiile întreprinse la nivel
naţional şi internaţional au arătat că într-adevăr sperma pote fi infestată cu diverse
microorganisme prezente la nivelul aparatului genital (testicule, glande anexe, căi
genitale), atunci cănd la acest nivel este localizată o infecţie, dar poate, de
asemenea fi contaminată, în momentul recoltării, de către microorganismele care
colonizează uretra sau cavitatea prepuţială. Contaminarea este amplificată şi de
macroorganismele care provin din ecosistemul mediului înconjurător, prezenţa
acestora în spermă depinzând de condiţiile de recoltare, de tratamentul spermei,
de igiena laboratorului, tehnicile de congelare şi metodele de depozitare.
Numărul bacteriilor din spermă, imediat după recoltare este, în medie,
100000 germeni/ml sau cu limite cuprinse între 120 şi 270000 germeni/ml
(Runceanu L.,1975), varibil cu sezonul în care se face recoltarea. Pe lângă germenii
specifici, pot să ajungă în spermă şi germeni nespecifici, reprezentaţi de:
streptococi, stafilococi, corynebacterium, pseudomonas, coliformi, etc.
Prevenirea riscurilor sanitare legate de folosirea spermei animalelor de
reproducţie la însămânţările artificiale, va trebui să fie o preocupare permanentă a
specialiştilor şi să aibă în vedere o diversitate de agenţi patogeni susceptibili de a
fi vehiculaţi prin produsul seminal. Până în prezent, acţiunuile întreprinse pe linia
răspândirii maladiilor prin sperma folosită la însămânţările artificiale au permis
ameliorarea sanitară a efectivelor de animale. Însămânţarea artificilă a contribuit,
până în prezent, la profilaxia unor maladii într-o populaţie circumscrisă (regională
sau naţională, de exemplu), deschizând vaste perspective schimburilor
internaţionale. De aceea orice mascul, producător de material seminal, trebuie să
fie indemn de toate maladiile susceptibile de a fi transmise prin spermă, femelelor
însămânţate. Totodată, numărul de germeni microbieni într-un volum dat de
spermă trebuie să se încadreze în limitele acceptate pe plan internaţional; pentru
sperma congelată fiind limitat la 500 de unităţi formatoare de colonii pe doză.
Pentru reducerea numărului de microorganisme din spermă, mediul de
diluţie conţine şi antibiotice cu spectru larg, cu rol bacteriostatic sau bactericid.
Orice rezultat pozitiv la controlul reproducătorilor masculi în ceea ce
priveşte maladiile contagioase, trebuie să se soldeze cu oprirea imediată a
masculului de la reproducţie, izolarea şi/sau eliminarea sa, controlul celorlalte
animale din efectiv şi interzicerea folosirii stocului de spermă a animalului pozitiv
la febra aftoasă, tuberculoză, bruceloză, leucoză, trichomonoză,
campylobacterioză etc. Prin aplicarea unor măsuri sanitar veterinare stricte se
obţine spermă conform normelor internaţionale care pretind înalte calităţi
genetice, indisociabile de valoarea biologică şi sanitară a ejaculatelor.