Diagnostic de laborator în RABIE

Boală infecţioasă de natură virală, sporadico-enzootică, întâlnită la toate speciile de animale homeoterme,
transmisibilă la om, caracterizată prin evoluţie acută cu manifestări nervoase exprimate prin
hiperexcitabilitate şi agresivitate, urmate de paralizii şi moarte.

Familia Rhabdoviridae,
Genul Lyssavirus, ARN
aspect cilindru cu vârf alungit (profil de glonte)
120 - 180 nm lungime / 60 - 80 nm lăţime
Programului Strategic
Scop: realizarea eficientă programului de control, supraveghere ş̦i monitorizare a
rabiei pentru apărarea sănătății publice și a sănătății animale, scăderea răspîndirii
rabiei în populaţiile de animale domestice și sălbatice care va duce treptat la
eradicarea rabiei in România.

Grupa de animale țintă - toate animalele susceptibile la infecţia cu virusul rabiei în

regiunile de risc din mediul urban, silvatic, rural.
Supraveghere:
- prin examinarea clinică obligatoriu și punerea sub observație timp de 14 zile a
animalelor care au mușcat sau zgâriat persoane și animale
- prin examene de laborator – animale moarte/suspecte și ucise, care au
manifestat tulburări de compartiment ce pot fi atribuite rabiei
SUSPICIUNEA DE RABIE
Date epidemiologice
Receptivitate: toate mamiferele sălbatice şi domestice (cabaline, rumegătoare mari şi
mici, carnivore, om).
Surse de infecţie: animale bolnave; rezervor urban, rezervor silvatic.
Căi de transmitere: muşcătură sau zgârietură; contact mucoasele sau pielea, inhalare,
ingestie.
Mod de evoluţie: sporadico-enzootic.
Date clinice – 2 forme clinice principale:
Forma furioasă: debut cu modificări de
comportament, hipersalivaţie, dromomanie,
hiperexcitabilitate psihică şi motorie, agresivitate,
în final intervin paraze şi paralizii şi moarte.
Forma paralitică: paraze şi paralizii şi moarte
 Diagnostic in RABIE
! la animale doar postmortem
Aspecte epidemiologice Suspiciune de rabie
Semne clinice

Prelevare probe: SNC

Confirmare

Confirmarea suspiciunii de rabie se bazeaza pe rezultatele urmatoarelor teste de laborator:

1. Imunofluorescență directă = IFd (detectarea antigenului viral prin intermediul unui ser specific

antirabic marcat fluorescent) - Ordinul nr. 70/2017

2. Bioproba (inocularea intracerebrala la soricei) - conform Programului strategic 2016, 2017

3. Inoculare pe culturi celulare -conform Programului strategic 2011

Examen histopatologic (evidențierea corpusculilor Babes-Negri = leziune patognomonică, incluzii oxifile

localizate în citoplasma neuronilor)

 SUSPICIUNE DE RABIE

- IFd Expunere umană

IFd Inoculare IC/inoculare culturi
+ celulare
confirmare

Ifd

Carnasiere domestice și sălbatice găsite moarte

Examen prin IFD cu eliberare de buletin de analiză

Supravegherea circulației tulpinilor virale - prin PCR/ secvențiere

Se prelevează probe de la toate animalele domestice și sălbatice pozitive la
IFD şi se transmit de la LSVSA la LNR pentru Rabie - IDSA.
 Prelevare probe

 de la animalele de talie mare extremitatea cefalică și coloana vertebrala, encefal, cerebel de la bovine, iar de la
animale de talie mică se trimite cadavrul în totalitate.
Persoanele care recoltează probele sunt expuse riscului de contaminare și vor respecta măsuri de protecția a muncii:
mănuși de cauciuc, ochelari.
 OIE: Talamus, cerebel (! bovine), hippocamp (cornul lui Ammon)
 RO: cerebel (! bovine), hippocamp (cornul lui Ammon), vermix
Probele se trimit către laborator refrigerate sau în formol sau glicerol pt a evita degradarea țesuturilor. Pentru
examen histopatologic se trimite encefal formolizat, pentru bioproba organele se trimit refrigerate sau imersate în ser
fiziologic glicerinat 5%.
•Probele de creier de la rumegătoarele cu simptomatologie nervoasă, se vor examina concomitent prin
examene de laborator pentru boala Aujeszky, rabie, listerioză si encefalopatii spongiforme transmisibile
Recoltarea cornului lui Ammon: se practică două secțiuni la nivelul emisferelor
cerebrale pentru a se deschide ventriculii laterali, apoi se sectionează transversal la limita
dintre treimea mijlocie și cea posterioară si apoi o nouă secțiune longitudinală
perpendiculară pe prima (se evidentiază cornul lui Ammon, cu forma caracteristică și
culoare sidefie).
cornul lui Ammon, cerebel, scoarța cerebrală, trunchi cerebral
 Imunofluorescență directă (IFd)

Scop: detectarea Ag rabic în sectiuni/amprente de SNC prin intermediul unui ser specific antirabic
marcat fluorescent
Principiu: detecția de Ag rabic în țesuturile infectate se produce în urma cuplării specifice a
acestui antigen de către anticorpii specifici antirabici din serul marcat fluorescent; pentru
vizualizarea complexelor imune fluorescente se examinează la microscop în lumina UV.
Materiale și metodă: se fac amprente din SNC/12 lame/probă (cornul lui Ammon, cerebel, scoarța
cerebrală, trunchi cerebral) pe lame degresate și după uscare sub hotă de aspirație se expun la
lumina UV pentru inactivarea virusului- timp de 20 de minute la o putere a lămpii de 20-40 W și o
distanță de la sursă de lumină de 20 cm.
Pobele se fixează în acetona (răcită la -20°C, timp de 30 minute) și după uscare se aplică o
picatură de ser specific antirabic fluorescent. Preparatele se introduc în camera umedă la termostat
(37°C) timp de 30 minute, după care se spală cu tampon fosfat salin, se usucă și se examinează la
microscop cu UV.
 IFd
Rezultat + când amprenta prezintă fluorescență
evidentă, cu aspect de incluzii colorate galben-
verzui (măr verde)
Rezultat – când este absentă fluorescența.
Valoare de diagnostic: este testul cu
sensibilitatea si specificitatea cele mai mari
pentru diagnosticul rabiei, test oficial în
Romania, test recomandat de OIE. Se practică
în mod curent, fiind specific şi rapid - asigură
un diagnostic de certitudine până la 98 - 100 %
din cazuri, în 24 de ore, putându-se folosi şi ca
metodă unică de diagnostic.
 Bioproba
 în stabilirea diagnosticului, pentru probele negative la IFD, se efectueaza bioproba pe soricei
 luând în considerare principiul celor 3R (replacement - înlocuire, reduction - reducere,
refinement - îmbunătățire), numărul de șoareci utilizați la fiecare bioprobă, a fost limitat la 5;
 soareci sugari de 48 de ore sau şoareci de 3 - 4 săptămâni (i.c.)
Preparea inoculului
 4-5 grame de omogenat din probe (cortex, cornul lui Amon, cerebel) se suspendă în 18 ml de
apă distilată sau ser fiziologic și se centrifughează la 1500 rpm/minut/10min.
 din supernatant se aspiră 1 ml se adaugă intr-o eprubetă și se aseptiezează cu streptomicina
0,05% și penicilina 10.000 UI.
 se agită și se lasă la temperatura camerei (20-22°C) timp de o ora sau la 4 °C până a doua zi.
 din supernatantul obținut se inoculează lateral de linia mediană craniană 0,015 ml. Este
obligatorie anestezierea șoarecilor înainte de inoculare pentru a reduce durerea și stresul.
 acul se introduce paramedian în zona parietală. După ce vârful acului a depășit peretele osos se
pătrunde în tesutul cerebral pe o adâncime de 0.1-0.2 mm și se inoculează. Se va evita inocularea
în zona mediana întrucât perforează sinusul venos longitudinal urmat de hemoragii și moartea
animalelor.
 după inoculare șoarecii sunt monitorizați zilnic timp de 28 zile și la
fiecare șoarece mort se examinează prin testul IFD pentru rabie
 animalele care mor în primele 4 zile nu se vor lua în considerare,
moartea datorându-se lezării unor regiuni intinse de la nivelul SNC.
 în majoritatea cazurilor simptomele de turbare apar între a 7- 10 zi,
dar există cazuri când pot apare în a 5-a zi sau după 10 – 12 zile, în
mod exceptional după 20 zile.
 manifestările clinice -abatere, tremuraturi musculare, horipilatie,
pareze si paralizii la nivelul trenului posterior, iar animalele mor
dupa câteva zile – apariția semnalor nervoase la șorecii inoculați nu
constituie certitudinea bolii - IFd
 moartea animalelor se poate produce si datorită altor cauze - proba
nu a fost aseptizată corespunzător sau a fost contaminată cu
germeni rezistenți la antibioticele folosite - în acest caz șoarecii pot
muri înaintea apariției semnelor de turbare cu fenomene de
meningoencefalită bacteriană - probele se repetă
 Testul este considerat pozitiv dacă în perioada activă de observație la unul sau mai
multe exemplare din soriceii inoculati ce au murit sau au fost ucisi ca urmare a
constatării manifestărilor clinice caracteristice, prin efectuarea de examene specifice
de imunofluorescență s-au obținut rezultate pozitive.
 Testul este negativ atunci când soriceii nu mor în perioada de observație activă sau
când testele specifice efectuate pe șoarecii morți sau uciși au fost negative.

 Se afirmă că un animal nu a fost sau nu este turbat când simptomele se

remit și animalul supraviețuieste, aceasta având în vedere ca vindecările în
turbare sunt excepțional de rare, practic inexistente.
 Examen virusologic

Virusul rabic este încadrat în familia Rhabdoviridae, genul

Lyssavirus, are aspect de cilindru cu vârf alungit (profil de
glonte), 120 - 180 nm lungime / 60 - 80 nm lăţime.
Cultivarea virusului in vitro este dificilă, necesitând perioade
variabile de adaptare. Unele tulpini de virus au putut fi
cultivate în ouă embrionate de găină şi raţă prin inoculare pe
cale corioalantoidiană, alantoidiană, intravitelină sau în
creierul embrionilor. În toate cazurile virusul se găseşte în
cantităţi mari în sistemul nervos central al embrionilor. S-a
reuşit cultivarea pe celule tumorale de şoarece, celule
embrionare de găină, celule renale de hamster, de porc, de
câine, liniile celulare KB, BHK 21, Vero, celule diploide
umane, fără a produce efect citopatic.
Pentru confirmarea prezentei virusului - IFd
 Examen histopatologic
!!!!! Corpusculi Babes-Negri - (leziune patognomică)
 incluzii oxifile, formă rotundă sau ovalară, 0,25 - 30 microni diametrul (în medie de 4 - 5 microni), unic/
multiplii în aceeaşi celulă
 situate în citoplasma neuronilor şi în prelungirile acestora, mai ales în neuronii din cornul lui Ammon, în
celulele piramidale din scoarţa cerebrală şi în celulele Purkinje din cerebel (la bovine) dar pot fi întâlniţi şi în
alte zone ale sistemului nervos central sau periferic, chiar în unele organe şi glande.
Mărimea, numărul şi prezenţa incluziilor sunt în relaţie directă cu durata bolii clinice, cu specia animală şi
tulpina de virus.
Metode de evidentiere: Mann, Giemsa, Sellers

!!!!!! Neuron cu corpuscului Babes-Negri

Neuron fără incluzii

!!!!! câine în 90 - 96 % din cazuri, la bovine în 64 %, la porcine în 53 %, la cabaline în 21 %.
!!!!!!! Prezența incluziilor CONFIRMĂ RABIA, absența lor NU EXCLUDE RABIA!!!!!!!!
Rabie - Corpusculi Negri în interiorul
celulelor Purkinje
Corpusculi Babes-Negri
 Corpusculi Babes-Negri

Infiltrat celular mononuclear

Rabie - Corpusculi Babes-Negri în interiorul
celulelor Purkinje
Rabie - Corpusculi Babes-Negri – imunohistochimie -IP
 Celule gliale – noduli Babeș Perivascularită limfocitară

Leziunile nespecifice: encefalită virală (nesupurată) - infiltraţii de tip limfohistiocitar în jurul neuronilor (satelitoză şi
neuronofagie) şi al vaselor de sânge (perivascularită), cu fenomene alterative neuronale (degenerare hidropică,
tigroliză, picnoză şi cariorexă)
distrucţii neuronale (proces distrofico-necrotic)
se dezvoltă un proces reparator cu celule gliale → apar noduli Babeş.
 la nivelul encefalului → meningoencefalită limfocitară nepurulentă ≡ infiltraţie limfocitară difuză în SNC.
perivascularită limfocitară
în ganglionii senzitivi – proces de proliferare glială – noduli (fenomen evidenţiat de van Gehuchten – Nellis)
IFd → pe amprentă de SNC cu ser antirabic marcat fluorescent; limitele metodei - ţin de metoda şi
de stadiul evolutiv al bolii în momentul recoltării materialului patologic; reacţii fals pozitive
(captarea de către antigen fluorescent a celulelor moarte). Avantaj → rapiditate (maxim 3 ore).

Bioproba → inoculare de triturat de SNC aseptizat intracerebral la şoriceii sugari

- şoriceii se ţin sub observaţie 28 zile → cei care au murit după a 5-a zi se examinează prin Ifd

Examen histopatologic → necesită minimum trei zile

→ rezultat pozitiv: incluziile intracitoplasmatice oxifile Babeş-Negri (absenţa lor nu exclude
boala) → unele tulpini nu produc incluzii; la unele specii există localizare mai frecventă în
anumite regiuni (rumegătoare – cerebel; câine → strat poliedric Ammon).
 Examene serologice
ELISA, SN se utilizează pentru evaluarea capacității imunogene a unui vaccin sau verificarea statusului imun
postvaccinal (titrul de anticorpi specifici antirabici)

Conform Programului strategic 2016, 2017 –

Grupa de animale ţintă: vulpi din mediul silvatic.
Scop: evaluare postvaccinală
Prelevarea de probe de vulpi împușcate (4 vulpi\100 km2\ an) după cel puțin 45 de zile de la distribuirea vaccinului
antirabic
1. ELISA pentru determinarea anticorpilor antirabici postvaccinali din serurile/lichidele toracice recoltate
de la vulpe.
2. 2. Examenul virusologic prin testul de imunofluorescenţă directă (IFD) se realizeaza la toate vulpile
impuscate in scop de evaluare a activitatii de vaccinare antirabica la vulpi.
Probele (omogenat creier) pozitive prin imunofluorescenţa directă (IFD) se vor prelucra pentru
identificarea şi caracterizarea genomului specific virusului rabic pentru discriminarea tulpinei vaccinale
de tulpina sălbatică