Microscopia Raman

Profesor coordonator: PROF. UNIV. DR. HABIL. TITUS VLASE

Student: Diana Răcănel, master CCL, an II
9/2/2020
INTRODUCERE
Microscopia Raman a fost dezvoltată în anul 1970, iar în anul 1975 au fost efectuate
primele măsurători de către Delhaye. Simultan, Rosasco a proiectat un instrument
microprobos Raman la Biroul Național de Standarde (NIST). Acestă lucrare timpurie a
stabilit utilitatea spectroscopiei Raman pentru microanalize. Tehnica oferă capacitatea de
obținere analitică-calitativă a spectrelor Raman cu o rezoluție spațială de 1 µm utilizând
probe în intervalul picogramic [1]. Toate tehnicile spectroscopice au la bază același principiu:
în anumite condiții materialele sunt capabile să emită sau să absoarbă energie [2].
Microscopia Raman este o tehnică spectroscopică Raman, incorporând microscoape
optice, lasere de excitație, dispozitive de filtrare și manipulare optică și spectrometre.
Microscopul Raman oferă avatajele unei rezoluții spațiale ridicate și senzitivitate optică,
datorită creșterii fluxului de fotoni de la sursa laser cu focusare crescută și eficiența de
colecție înaltă a lentilelor obiectiv. Pentru oferirea informațiilor specifice cu privire la
nivelele de energie vibrațională a legăturilor chimice și a moleculelor, microscopia Raman
este o ustensilă neprețuită pentru materialele cu „amprentă” și se găsesc aplicații din ce în ce
mai multe în varii domenii cum ar fi medicina, biotehnologia, științele materialelor și chir
criminalistică.
Microscopia Raman poate de asemenea oferi informații cu privire la materialele țintă
foarte rapid, cu latențe măsurate la ordin de secunde sau chiar fracțiuni de secundă, permițând
proceselor de monitorizare în timp real să fie considerate practice în aceste sisteme.
Sistemele microscopice Raman sunt unele dintre cele mai bune unelte pentru
înțelegerea proprietăților interfațelor solid/lichid, deoarece fasciculul de excitație poate fi
strâns concentrat la interfață.
Efectul Raman ia loc atunci cand lumina iluminează o regiune, interacțoinând cu
moleculele ce sunt prezente în regiune. Fotonii incidenți nu au suficientă energie pentru a
excita o tranziție cuantică de la o configurație electronică stabilă la alta, însă interacția
fotonică perturbă configurația electronică a moleculei la o stare „virtuală” instabilă pe durata
împrăștierii fotonilor.
În Figura 1 este prezentat un sistem microscopic Raman convențional, care este
format dintr-un filtru dicroic și o „pin-hole” (gaură cu pini) cu un diametru controlabil pentru
a asigura că semnalele dintr-un volum mic la punctul focal sunt colecționate. Spectrometrul
numără intesitatea luminii colectată la varii frecvențe. [3].
Această tehnică are o gamă largă de aplicabilitate. Utilizând un microscop Raman, se
pot efectua analize secvențiale ale straturilor individuale de secțiuni transversale ale vopselei
multistrat. În cea mai mare parte, acestă tehnică este nedistructivă deși există posibilitatea de
a creaa mici cratere în vopseluri când nivelele de putere ale laserului sunt prea ridicate [4].
 Figura 1. Diagrama schematică a sistemului Raman confocal cu o unitate
microfluidică

PRINCIPIUL DE FUNCȚIONARE
Limitările majore în ceea ce privește proiectarea unei microprobe Raman sunt legate
de efectul Raman slab și de dimensiunea minutului probei. Este nevoie de optimizarea
semnalului Raman și acest lucru este acompaniat prin luarea în considerare în procesul de
dezvoltare a configurației optice anterioare pentru a oferi un sistem de detecție numerică
ridicat.
Configurarea optică anterioară este extrem de importantă în optimizarea microprobei
Raman. Este nevoie de o diagramă numerică mare (NA) pentru a colecționa lumina
împrăștiată peste un unghi solid mare pentru a asigura faptul că mai multă lumină împrăștiată
Raman din probă este detectată. Este utilizat un colector cu deschidere mare, care
minimalizează împrăștierea elastică și neelastică de la substrat. Substratul trebuie să aibă un
spectru Raman sau o fluorescență mică în regiunea de interes. MgO poate fi utilizat ca și
substrat, deși diapozitivele de sticlă sunt utilizate cel mai des. Nu au un spectru Raman și au
proprietăți termice bune. O lamă de sticlă la microscop poate fi utilizată în unele cazuri.
Substratul trebuie să fie lustruit optic pentru a oferi observație vizibilă a cristalului de
dimensiune micro. În plus, este important să se alinieze fasciculul de excitație pe subtrat
pentru a preveni reflectarea speculară de la a intra pe calea de împrăștiere a Ramanului. Un
filtru spațial este utilizat pentru a minimaliza alte surse ale interferenților spectrali.
Proiectarea microprobei este făcută cu scopul de a oferi căi optice total independente pentru
radiația de excitație și pentru radiația risipită, și cele două căi sunt apoi cuplate prin
proprietățile de împrăștiere ale particulei ce este studiată.
Pentru instrumentele cu un singur canal este nevoie de un analizor micro eficient
pentru a oferi suficientă stabilitate pentru a permite măsurătorii să fie efectuate, în mod
special pentru lungi perioade de timp [1].

Microscopia Raman în microfluide

1. Suprafețele picăturii - Când picături imagistice (din interiorul canalelor

microfluidice, plasate pe substrat sau pe suprafața microcanalelor deschise), forma
convexă/concavă a suprafeței unei picături pot afecta în mod negativ abilitatea sistemului
Raman de a măsura cu acuratețe materialele suspendate în asemenea picături. Acest lucru se
datorează în parte faptului că există un index refractiv diferit între picătura și aer. Forma
suprafeței picăturii crează un efect de lentilare ce distorsionează focusarea și reduce rezoluția
spațială. Prin urmare, este important a se asigura că excitația Raman introduce picătura printr-
o suprafață cât de plată posibil, ideal printr-un substrat optic transparent, cum ar fi sticla sau
cuarțul. Pentru proiectările canalului microfluidic deschis, este important de luat în
considerare lățimea microcanalului pentru a asigura că lichidul este cât se poate de plat pentru
a minimaliza orice problemă cauzată de varii distorsionări și aberații cromatice.

2. Distanța focală – Cum pereții și substratele dispozitivului microfluidic, Figura 2,

pot fi de grosimea a câțiva milimetri, distanța focală trebuie să fie suficient de lungă pentru a
penetra interiorul mediului lichid. Prin urmare, lungimea focală corectă este cerută pentru a
integra cu succes microscopia Raman și microfluidele. Lungimea focală a unui sistem Raman
este determinată de aranjamentul optic al microscopului, însă cel mai important de lentilele
obiectiv. Lentilele obiectiv de magnificație scăzută tind să aibă distanțe focale mai lungi,
facându-le în general mai potrivite pentru sistemele microfluidice. Magnificarea crescută,
obiectivele de lucru pe distanță lungă pot fi de asemenea folosite, în detrimetrul intensității
optice și, prin urmare semnalele reduse la raport de zgomot. Obiectivele de imersare apa și
uleiul pot fi luate în considerare de asemenea. În unele cazuri lentilele nu sunt necesare, în
special în cazul sistemelor Raman bazate pe fibre, în care fibra este integrată cu microcanalul
și vârful fibrei este expus la lichidele țintă.
 Figura 2. Schema sistemului optic ce arată definițiile mărimii spotului, adâncimea
câmpului, distanța focală și volumul de detecție

3. Volumul de detecție - Sistemele microscopiei Raman focusează fasciculul de

excitație într-un volum mic utilizând lentile obiectiv. Marimea zonei de detecție este
determinată de dimensiunea spotului, sau diametrul, fascicului de excitație la punctul focal.
Diametrul (d) este proporțional cu lungimea focalului f al lentilei și cu lungimea de undă ʎ a
sursei laserului și este invers proporțională cu D, diametrul lentilelor. Un alt parametru
important pentru volumul de detecție este profunzimea focalizării. Adâncimea focalizării
(cunoscută de asemenea ca și parametru confocal) este în general estimată ca de două ori
distanța Rayleigh ( distanța dintre punctele de mărime a spotului √ 2 d ). Valoarea poate fi
aproximată ca πd2/2ʎ. În ordinea obținerii unei adâncimi mici a focalizării microscopul
trebuie să fie operațional în modul confocal, unde mărimea fantei intrării spectrometrului este
redusă la cea mai mică valoare compatibilă cu semnalul cerut prin care trece.
Pentru a introduce măsurătorile Raman și microfluidice, dimensiunea optimă a
punctului trebuie să fie aleasă, precum volumul focal maxim este în general plasat fără
madiul lichis pentru a asigura faptul că semnalele Raman apar primar din interacțiunile cu
analiții țintă. Utilizarea obiectivelor microscopice magnificate pentru spectroscopia Raman
tindă să crească semnalul la raport de zgomot și să reducă limita de detcție minimă prin
focusarea fasciculului mai mică și prin creșterea unghiului de colectare. Detecția țintă este de
asemenea posibilă în microfluide utilizând stadiile mecanice ale probei pentru a muta țintele
cu acuratețe spațială de ordinul sub-micronilor ( cum ar fi stadiile piezoelectrice).

4. Lungimea de undă a excitației – Alegerea optimă a lungimii de undă laser a

excitației este importantă pentru aplicațiile spectroscopice Raman în microfluide. Intensitatea
împrăștierii Raman cântărește invers ca și o a patra putere a lungimii de undă, deci se preferă
în general utilizarea lungimilor de undă de excitație mai mică. În orice caz, apar probleme
când microscopia Raman asupra probelor biologice este cerută, datorită potențialului de a
produce semnale de fluorescența cu inteferență mare odată cu creșterea energiei fotonului.
Zgomotul împușcat al semnalului fluorescenței poate masca semnăturile Raman dorite ale
probelor. Majoritatea probelor biologice sunt de asemenea absorbatori puternici ai energiei
optice, în particular la lungimi de undă mai mici (albastre și UV). Microscoapele Raman
moderne oferă în general unele opțiuni diferite pentru lungimile de undă de excitație, pentru
aceste sisteme eficiența de barieră a difracției și senzitivitatea detectorului trebuie de
asemenea luate în considerare pentru fiecare lungime de undă operatoare.
Pentru probele biologice, utilizarea unei lungimi de undă de excitație tipică de 532 nm
poate produce semnale în fluorescență. O soluție pentru aceasta constă în utilizarea laserelor
cu lungimi de undă mai mari cum ar fi roșu, sau infraroșu aprpiat, astfel încât energia
fotonului să fie sub banda de excitație a fluorescenței. În timp ce acestă metodă poate reduce
fluorescența în probă, reduce de asemenea și eficiența împrăștierii Raman a sistemului,
necesitând lasere de putere crescută sau timpi de integrare mai lungi. Alegerea lungimilor de
undă de excitație este critică pentru rezonanță și pentru creșterea suprafeței rezonanței
împrăștierii Raman. În timp ce lungimile de undă rezonante pot fi avantajoase pentru detecția
la nivele de urme, alte lungimi de undă ar putea fi preferate in situații în care legăturile de
nerezonanță sunt de interes analitic.

5. Puterea optică – În general, intensitatea împrăștierii poate fi crescută simplu prin

creșterea puterii de excitație, însă densitățile puterii crescute la punctul focal pot cauza
distrugeri ale probelor biologice răspunzătoare termic în mediul microfluidic. Puterea
laserului mărită la puctul foccal poate cauza turbulențe localizate sau să inducă efecte de
pensetare pe nano-coloizi în microfluizi. Prin urmare, puterea optică pentru excitația Raman
ar trebui să fie optimizată cu grijă în fiecare caz pentru a asigura faptul că proba nu este
avariată pe durata măsurătorii. A fost efectuată mai multă muncă în determinarea deteriorării
pragului pentru puterea optică aplicată probelor biologice.
O altă strategie pentru a reduce deteriorările potențiale ale probelor biologice este de a
reduce timpul de expunere al laserului prin micșorarea timpilor de integrare. În orice caz,
odată ce timpul de integrare este redus, raportul semnal-zgomot al spectrului Ramaneste de
asemenea redus.operatorul trebuie să determine o balanță între avarerea materialului biologic
și puterea semnalului. alegerea puterii laserului, împreună cu magnificarea lentilei obiectiv,
guvernează puterea aplicată per unitate de volum a analitului. O dimensiune mai mare a
spotului permite utilizarea puterilor mai mari. În general, la magnificații de 40 de ori mai
mari este bine de ținut puterea laserului sub 1 mW pentru timpi de expunere mai mari. Acesta
este un caz în care microfluidele sunt în stare să beneficieze de microscopia Raman, la fel
cum fluidele ce curg au tendința de a disipa energia căldurii și de a îndepărta analiții afectați
din regiunea focalului, prin urmare permițând puteri mai mari ale laserului să fie utilizate.
Eventualul efect depinde de conductivitatea termică a mediului și de parametrii fluxului.

6. Efectul de memorie – Înafară de beneficiile integrării microfluidelor Raman, există

încă multe alte provocări. O astfel de provocare o reprezintă posibilitatea „efectului de
memorie”. Acest lucru se datoreză unelor particule și a unor analiți ce rămân blocați pe
suprafața microcanalelor, cauzând semnale de fond Raman permanente. Multe strategii pot fi
împărțite pentru a elimina această problemă. Spre exemplu, pot fi utilizate cipuri (jetoane) de
unică folosință pentru a evita un astfel de efect de memorie. Dacă jetoane reutilizabile sunt
proiectate atunci pereții ar trebui curățați cu mare atenție după fiecare utilizare sau ar trebui
protejați pe durata procesului pentru a evita interacția oricărui analit țintă cu acestea. Pentru
început, un sistem de curgere segmentat poate fi implementat, în care un strat subțire de ulei
este utilizat pentru a proteja pereții microcanalului de contaminare. Există de asemnea multe
alte metode ce pot fi aplicate pentru a altera hidrofobicitatea pereților și substratului,
reducând apariția problemelor efectelor de memorie.

7. Portabilitatea – Una din provocările prezente la comunitatea microfluid-Raman este

problema portabilității. Sistemele microfluidice sunt foarte portabile, fiind de dimensiuni mici
și cu robustețe relativă. În orice caz, dimensiunile unităților microscopiei Raman pot fi mult
mai mari, și în mod particular în cazul împrăștierii coerente Raman, alinierea relativă a
eșantionului cu instrumentația poate fi critică plasând constrângeri stricte pe interfața optică
până la jetonul microfluidic.
Spectrometrele Raman de mână cu costuri reduse au rezoluții spectrale ce nu depășesc
deplasări Raman de 20 cm-1, în timp e rezoluția spectrometrelor de laborator cu grătare de
difracție optimizate, lugimile căii optice și detectoare de cuplare-schimbare răcite pot fi mici
de 0.1 ccm-1. Preocupări similare aplicate de asemenea la rezolția spațială, în timp ce costul
reprezintă un factor de determinare major pentru senzitivitatea detectorului. Spectrometrele
cu senzitiviate scăzută necesită puterea laserului mai mare, ceea ce în schimb limitează
tipurile de probe ce pot fi analizate, în particular materiale organice ce pot fi afectate la puteri
mari.
Eforturile în reducerea mărimii și complexității echipametului optic supot sunt în curs
de desfășurare; acoperind idei precum crearea surselor laser cu jeton și înlocuirea lentilelor
confocale cu alte dispozitivecum ar fi ghiduri de undă și fibre. Microlentilele „Kinoform”
proiectate recent pentru focusarea în canalele microfluidice pot fi potențial utilizate în
sistemele Raman. În ciuda acestor avantaje, cea mai mare dificulate în obținera portabilității
este reducerea mărimii spectrometrului optic în timpul menținerii rezoluțiilor acceptabile [3].

Figura 3 ilustrează schema optică a micropropei Raman Spex Micramate. Proba

studiată este plasată pe treapta microscopului și este iluminată de lumina din iluminatorul de
transmisie. Focusarea asupra probei este ajustată prin vizualizarea din punct de vedere optic
și ajustarea obiectivului. Lampa iluminatoare este oprită și fasciculul cu laser este direcționat
către despicatorul de fascicule. Punctul de vedere optic este închis și camera TV este pornită
prin rotirea prismei. Lumina împrăștiată din probă este colectată de către obiectiv și trimisă în
spectrometru. Microscopul este un Zeiss 20 „trei-turele” modificat cu treaptă/bază detașată.
Un detector fotomultiplicator răcit și procesare de numărare de fotoni este utilizat pentru a
oferi senzitiviatea și zgomotul scăzut necesare [1].
 Figura 3. Calea optică pentru intrarea cu laser și transferul semnalului Raman la
monocromator pentru probele micro

Metale- Metalele pure în formă normală nu produc nicio semnătură Raman. Acest
lucru se datorează prezenței electronilor liberi din structura metalului, care blochează lumina
incidentă să atingă legătura metalului. Această proprietate face metalele reflective și le dă
conductivitatea electronică crescută. În orice caz, filme foarte mici de metale pure au arătat că
dau semnătură Raman, Figura 4, precum conductivitatea filmelor subțiri nanometre este
suficient de joasă pentru a permite fotonilor să atingă legăturile metalice cu zăbrele. Nano-
coloizii și alte nanostructuri rugoase sunt de asemenea capabile să producă semnături Raman
cu suprafață îmbunătățită. Utilizarea filmelor de metal sau a coloizilor pentru a crește
împrăștierea Raman este în particular aplicabilă dispozitivelor microfluidice.

Figura 4. Intervalele de deplasare ale picului Raman pentru legături organice

 Nemetale- Microscopia Raman este capabilă să ofere o reprezentare bună a
materialelor anorganice, nonmetalice, oferind informații cu privire la legăturile lor chimice,
aranjamete de structură și cristal. Această capabilitate este în general utilă pentru identificarea
morfologiilor diferite ale materialelor, polimorfelor anorganice precum și diferențierea
fazelor materialelor amorfe sau cristaline. Oxizii metalici au semnătură Raman unică cum
putem vedea ca exemple în TiO2,WO3 și MoO3. Împrăștierea Raman poate oferi informații
unice cu privire la structura materialelor în cazul grafenelor, unde este posibilă identificarea
numărul de straturi și gradul de oxidare din structura sa. Oxizii metalici pot fi utilizați cu
sistem microfluidic fie ca detecția urmelor analiților, interogând puritatea probelor, fie ca
particule oxidice metalice utilizate pentru a urmări elementele Raman neactive din interiorul
dispozitivului microfluidic. Nemetalele cum ar fi sticla, siliconul și cuarțul sunt frecvent
incorporate în structura microfluidelor.

Materialele organice- Spectre Raman normalizate ale posibilelor substrate

microfluidice (Figura 5) [3].

Figura 5. Spectre Raman normalizate ale posibilelor substrate microfluidice precum: PDMS
(polidimetilsiloxan), plexiglas, silicon, sticlă, cuarț și apă
APLICAȚII
Microprba Raman a oferit aplicații într-o serie de diverse domenii ale științei. În
general domeniile de aplicații se împart în două categorii majore:
1. Identificarea prim amprentă a contaminanților microscopici;
2. Caracterizarea unor materiale noi.

Identificarea contaminanților de suprafață- Prezența contaminaților organici de dimensiuni

mici de 1 µm sau filme subțiri de 1 µm pe napolitane de siliciu pe durata procesului de
fabricație ale circuitelor integrate poate fi identificată rapid. Acești contaminanți pot afecta
performanța dispozitivului și trebuie să fie neapărat identificați. Figura 6 arată identificarea
unor posibili contaminanți Teflon. Alte tehnici, precum IR, difracția de raze X, Auger și
microproba electron, sunt insensibile în identificarea naturii contaminantului.

Figura 6. Spectrul micrprobei Raman al contaminantului hidrocarbon fluorinat și spectrul

Raman al politetrafluoroetilenei. Laser, 135 mW la 514.5 nm. Fante 300 μm. Timp, 0.5 s per
punct de date

Compușii biologici- Microproba Raman a fost utilizată la detectarea corpurilor străine în

diferite țesuturi. În Figura 7 se pot vedea spectre ale țesutului ganglionar limfatic cu
dimensiuni de 5 µm, care a fost obținut din biopsia unui pacient. Corpul străin a fost
identificat ca și o particulă din cauciuc siliconic (dimetilsiloxan).
Figura 7. Spectrul RMP obținut într-un studiu al biopsiei unor cadavre din țesutul ganglionar
limfatic; S, caracteristicile substratului

Includeri în materiale solide anorganice- Natura includerilor solid, lichid sau gazos ce pot fi
găsite fără sticlă anorganică transparentă sau materiale cristaline poate fi determinată prin
tehnicile microprobice Raman fără distrugerea probei. Alte tehnici analitice, cum ar fi
spectroscopiea de masă sai microscpia electron, pot fi folosite pentru obținerea unor
informații ce cer distrugerea probei originale. Această capabilitate a microprobei este utilizată
dacă una vrea să analizeze includerile într-un material înainte și după un tratament al probei.
Singura limitare este aceea că poziția includerii în material trebuie să fie localizată fără lucru
la distanță ale lentilelor obiectiv din microscop.

Figura 8 ilustrează spectrele microprobei Raman ce au fost măsurate pentru o

includere cu bule care a fost formată ca și defect într-o sticlă de NaPO 3 pe durata nitrării
sticlei cu amoniac. Sticla a fost nitrată pentru a-i crește tăria mecanică. Spectrele de rotație
Raman rezultate indică clar faptul că amoniacul rămas în bulă s-a descompus în azot
molecular și hidrogen pe durata acestui tratament. Dacă o nouă fază solidă a fost formată pe
suprafața bulei pe durata tratamentului, natura sa ar fi putut fi de asemenea identificată fără a
distruge proba prin focusarea fasciculului de laser al microprobei pe el pe durata
măsurătorilor spectrale [1].
Figura 8. (a) Spectrul Raman rotațional al unei bule dintr-o sticlă NaPO3 din regiunea 5–100
cm−1 indicând N2. (b) Spectrul Raman rotațional al unei bule dintr-o sticlă NaPO3 din
regiunea 550–650 cm−1 indicând H2.

Investigarea analiților- Una dintre cele mai importante caracteristici a spectroscopiei Raman
o reprezintă oferirea informațiilor relevante asupra cantității și tipului de legături chimice din
probă. Fasciculul cu laser Raman poate fi ușor concentrat într-un volum mic de material fără
un sistem microfluidic și permite analiza doar a acelui volum mic. Dispozitivele
microfluidice Raman arată de asemenea promițătoare pentru detecția analiților dintr-un
amestec complex, precum măsurătorile cu acuratețe ale diferiților analiți ce pot fi efectuate
simultann.
Multe lichide organice pot fi detectate eficient cu microscopia Raman. Există multe
exemple raportate ce au exploatat această proprietate. Pentru început, Fletcher et al. Au
studiat un dispozitiv microfluidic în formă de T pentru amestecul de etanol și acid acetic.
Cartografierea microscopică Raman a fost utilizată pentru detectarea a doi analiți la diferite
stadii de amestec. Rezultatele au arătat un flux laminar foarte bine controlat în sistem.
Detecția analiților specifici dintr-un lichid este ceva de interes general pentru detecția,
monitorizarea concentrațiilor scăzute ale materialelor prețioase și alte aplicații ale proceselor
de control. Când se are a face cu analiți cu concentrații mici este important să existe o
înțelegere bună a analitului țintă și asigurarea faptului că parametrii sistemului Raman
incorporat au fost bine porniți pentru detecția acestor ținte. Pentru început, sistemele Raman
ce folosesc excitație NIR pot fi utilizate eficient pentru detecția și măsurarea cu acuratețe a
concentrațiilor probelor organice cum ar fi glucoza, acidul lactic și creatinina.
Detecția analiților cu concentrații mici poate fi dificilă utilizând sistemele Raman
convenționale.

Particulele nano/micro- Abilitatea de a măsura și identifica materialele suspendate este foarte

utilă cu aplicații în evaluarea contaminanților în apă și ieșiri micro-reactor, determinând
concentrația amestecului și identificând materialele suspendate necunoscute. Microfluidele
Raman pot fi luate în considerare pentru determinarea calității ingredientelor slului,
interacțiilor chimice, activitățile catalitice și efectele de coroziune.
Metodele tradiționale de deteecție implică proceduri de preparare lungi, precum
uscarea probei și/sau centrifugarea probelor lichide pentru a obține soluții mai conentrate.
Aceste proceduri pot fi accelerate în dispozitive microfluidice, după care micorscopia Raman
este capabilă să identifice multe materiale, livrând „amprenat” lor chimică.
Multe nanoparticule sunt sintetizate și ținute în formă coloidală, ceea ce este potrivit
pentru procesarea microfluidică. Microscopia Raman poate oferi informații non-invazive
neprețuite despre un asemenea sistem coloidal: poate fi identificat tipul nanoparticulelor
suspendate, concentrația coloidală poate fi determinată utilizând intensitatea picurilor Raman
și până și mărimea nanoparticulelor poate fi măsurată din deplasările picurilor Raman și a
lățimii lor. Microscopia Raman poate fi folosită în mod eficient pentru nanoparticule care
generează rezonanțele plasmonului de suprafață, cum ar fi coloizii de aur și argint, și poate fi
utilizată pentru a determina mărimea acestora pe durata sintezei. Sistemele microfluidice sunt
potrivitte pentru analiza interacțiilor analiților organici și a chimicalelor pe plasmonul
nanparticulelor. În plus, microscopia Raman poate fi utilizată pentru a determina alte
nanoparticule cum ar fi particule bazate pe carbon (nanotuburi de carbon, carbon negru și
grafene), oxizi metalici și calgogenide utilizând picurile lor Raman puternice. Concentrația
nanoparticulelor la diferite zone ale microfluidelor poate fi mapată și relația lor cu forțele
dinamice ale curgerii pot fi obținute.
Ceea ce este dificil la manipularea materialelor suspendate în mediile microfluidice
este „efectul de memorie”. Acest efect se datorează atașamentului materialelor la interiorul
suprafeței microcanalelor, după cum s-a discutat în secțiunea „Principiul de funcționare”.
Acest efect de memorie poate introduce semnale Raman nedorite, oferind citiri false ale
concentrației și cerând înlocuirea regulată a microdispozitivelor. Cu scopul de minimiza
aceste probleme se creează o interfață apă/ulei pe interiorul suprafeței microcanalului pentru
a reduce șansa atașării materialului. În plus, sistemul de curgere este aranjat pentru a forma
micro-bule, sau nano-picături, a lichidului cu scopul de a minimiza timpul la care este expusă
suprafața microcanalului la materialele potențiale de murdărire.
Pentru a îmbunătăți magnitudinea semnalelor Raman cerue, este comună creșterea
concentrației materialului suspendat dinainte analizelor. Microfluidele oferă platforma
perfectă pentru acest pas, ca pre-concentrarea să fie realizată pe cip. Multe tipuri diferite de
forțe pot fi utilizate pentru acest scop, precum unde ultrasonice drepte sau dielectroforezele.

Proteine- proteinele joacă un rol important în multe funcții biologice cum ar fi semnalizarea
celulară, răspunsul imun, structurarea celulei, aderența celulară și ciclurile vieții celulei.
Aceștia sunt constituenți biologici sensibili necesitând metode de măsurare non-invazive și
non-distructive. Proteinele sunt făcute din lanțuri de amino-acizi, ce produc semnături Raman
puternice, spcifice tipului de aminoacizi. Acestea pot fi diferențiate cu o bună acuratețe
utilizând microscopia Raman.
Proteinele precum enzimele și anticorpii, cum și proteinele purtătoare sau membrană,
au fost studiate extensiv în microfluide. Dispozitivele microfluide Raman pot fi utilizate
eficient în studiul comportamentului proteinelor, a funcționalităților acestora și a răspunsului
lor sub diferiți stimuli. Microfluidele pot fi de asemenea utilizate pentru purificarea
proteinelor din alți componenți ai celului și acest întreg proces poate fi monitorizat continuu
utilizând microscopia Raman. Enzimele și anticorpii pot fi incorporat eîn microfluide pentru
a stabili eticheta-liberă senzitivă crescută și biosenzorii specifici moleculei bazat pe
microscopia Raman.

Acidul dezoxiribonucleic (ADN) și acidul ribonucleic (ARN)- ADN și ARN sunt mediile de
depozitare pentru informația genetică și sunt constituite fie din riboze, fie din dezoxiriboze
zaharoase. Importanța acizilor nucleici este evidentă și identificarea lor și caracterizarea este
supremă pentru multe domenii de cercetare. Probele de ADN sunt implicate în multe aplicații
incluzând recunoașterea anormalităților genetice și de asemenea în identificarea
criminalistică. Alte utilizări ale ADN-ului includ ingineria genetică, bioinformatica,
identificarea bolilor și biodetecția. ADN-ul produce semnături spectroscopice Raman și poate
fi dispersat în mediul apos, făcând microscopia Raman destul de potrivită pentru detecția în
sistemele microfluidice ce procesează ADN.
Pentru monitorizarea ADN-ului în microfluide, multe probleme ar trebui luate în
considerare. Sistemele de reacție ale lanțului polimerazei pot fi integrate în dispozitivul
microfluidic Raman, oferind suficiente tulpini ADN pentru detecție. Aplicațiile linker-ilor,
coloranțior și grupărilor căutătoare de suprafață sunt factori importanți deoarece permit o
aderență și imobilizare eficiente a tulpinilor ADN pentru procesele de monitorizare.
Procedurile pre-proces precum amestecul și filtrarea sunt de asemenea importante în
microfluidele Raman ADN. Ca și o alternativă la amestecul coloid, sunt raportate
implementări ce folosesc caracteristice de microcanal solid pentru atingerea amestecului și
intensificarea Raman.

Celulele- Structura unei celule este complexă, cu mulți constituenți biologici în crearea lor,
precum proteinele, ADN-ul, aminoacizii și varii alți componenți. Microscopia Raman este
foarte potrivită pentru detecția simultană și analiza selectivă a componenților a unor
amestecuri așa complexe. Celulele sunt mult mai active în mediul lichid, unde nutrienții pot fi
absorbiți de către lichid și comunicațiile chimice sunt eliberate. Sistemele microfluidice sunt
ideale pentru susținerea celulelor într-un mediu apos în care controlul constant al
„machiajului” chimic și a altor factori de mediu este posibil. Un asemenea control este
extrem de important pentru studiile extinse în care celulele sunt crescute pe durata întregului
lor ciclu de viață. În plus, microscopia Raman poate fi utilizată pentru a monitoriza
semnăturile chimice al fiecărui stadiu al acestui ciclu de viață și în plus permite clasificarea
celulelor în stările ciclului de viată, incluzând viabile, necrotice și apoptotice.
Siatemele microfluidice Raman sunt capabile să identifice și să studieze celulele
contaminate, inclusiv bacteria, pentru situații precum controlul calității apei și studierea
efectelor anticorpilor pe tulpini particulare. Un monitor de controlul calității apei a fost
dezvoltat în scopul asigurării că nicio celulă E. Coli nu este prezentă per 100 mL apă, și a fost
proiectat pentru a avea situri de capturare de anticorpi interne pentru E. Coli. Sistemul de
operare necesită ca un volum specific de apă să treacă printr-un canal microfluidic, echipat cu
locuri de prindere a E. Coli, după care coloidul de argint a fost introdus să învelească orice
celulă E. Coli prinsă. Utilizând picul Raman proeminent de la 565 cm -1, sistemul a fost
capabil să detecteze prezența oricărei celule E. Coli, chiar și sub nivelul semnalului celulei.
Sisemele microfluidice pot fi implementate să filtreze și să scurteze celula, cu
capacitatea de a crea probe de celule pure. Microscopia Raman este capabilă să detecteze
diferențele și defectele din celule, și când sunt cuplate cu microfluidele potrivite, pot fi
utilizate ca și senzor component al unui sistem de sortare a celulei.

Țesutul- Microfluidele Raman s-au găsit a fi aplicabile și în ingineria țesutului, în care

beneficiile unor asemenea sisteme includ curgerea continuă a nutrienților și a gazelor vitale
precum oxigenul, precum și a retragerii constante a produselor reziduale. În plus,
microfluidele oferă platforma perfectă pentru studierea fenomenului biologic fundamental,
inclusiv expunerea țesutului la variațiile înconjurătoare în stadiile critice de creștere pentru
monitorizarea efectelor lor. Aplicațiile acestor tehnologii sunt în particular foarte importante
pentru studierea medicamentelor, unde testele pot fi implementate în siguranță pe țesutul
oamneilor vii într-un mediu foarte controlat în timp ce permite măsurători de acuratețe. Acest
lucru ar putea reduce drastic rata eșecului medicametelor potențial implicate în studiile
clinice umane. Unele exemple extind acest concept la fel de departe ca și microsisteme
„organ-on-a-chip” ceea ce permite studiile la nivel organic in vitro, spre deosebire de
sisstemele bazate pe celule. Microscopia Raman poate fi aplicată la acest sisteme „organ-on-
a-chip” pentru detecția în linie și monitorizarea probelor, oferind măsurători de acuratețe
crescută a cosntituenților chimici. Microscopia Raman este permisă pentru detecția non-
invazivă și non-contact în mediul LOC, oferind necontaminare și rezulatet bine controlate.

Alte probe organice- În plus la probele organice mai sus menționate, sisteme microfluidice
Rmana sunt capabile să studieze mulți alți candidați, inclusiv celulele ADN, proteinele ADN,
microbi, toxine și complecși proteine-celule, și compoziția lor cu chimicale anorganice.
Sistemele microfluidice Raman sunt de asemenea unelte excelente pentru investigarea
zigotelor și embrionilor. Monitorizarea zigotelor și embrionilor în medii microfluidice ce
simulează gazda lor este în mod particular importantă pentru investigarea deformațiilor
gentice, anormalităților și țesuturilor înrudite și oferă informații neprețuite despre procesul
reșterii lor. Microscopia Raman a fost deja utilizată pentru identificarea și studierea celulelor
zigot de drojdie cu scopul aplicării mapării Raman pentru studiile fără etichetă a proliferîrii
celulei.

FARMACEUTICĂ- Aproximativ 10% din medicamentele disponibile din întreaga lume sunt
contrafăcute. Acest număr este cel mi probabil să fie subestimat datorită dificultății
monitorizării acestei probleme [6].
Microscopia Raman poate fi utilizată pentru investigarea eficacității medicamentelor
dezvolate în mediul microfluidic controlat. Poat fi simulate diferite scenarii și testate
utilizând sistemele microfluidie Raman, utilizând procese ieftine și volume mici de probe,
înainte ca produsele farmaceutice să fie testate pe animale și oameni. Produsele farmaceutice
multi-component pot fi de asemenea testate și rezultatele categorisite utilizând proceduri de
analiză multivariate.
Microreactoarele microfluidice pot fi utilizate pentru producerea produselor
farmaceutice și testarea acestora, și fiecare stadiu al procesului poate fe controlat cu atenție.
Microscopia Raman poate fi utilizată pentru a oferi răspuns imediat în timp real al reacțiilor
chimice în astfel de sisteme. Spre exemplu, microscopia Raman poate susține ecranarea
structurilor polimorfe și procesele de dezvoltare chimică atâta timp cât este redus. Lipidele
sunt adesea componente esențiale ale produselor farmaceutice coloidale. Microscopia Raman
a dovedit senzitivitate particulară la lipide, ce conțin semnal Raman unic producând lanțuri
hidrocarbonate. Microscopia Raman poate determina structura lipidelor pentru a detrmina
comportamentul de împachetare și trazițiile de fază [7].
Microscopia confocală Raman permite determinarea morfologiei chimice a filmelor
pe stenuri, nedistructiv, de pe suprafață prin cea mai mare parte a acoperirilor. Infromația
chimică combinată de pe suprafață și cea mai mare parte oferă o înțelegere mai bună a
proprietăților acoperirii medicamentului/polimerului.
Imaginile Raman ale acoperirilor pe tulpini arată o distribuție omogenă a rapamicinei
pentru acoperiri cu cu concentrații mici ale medicamentelor și mai multe particule
asemănătoare cu cele ale rapamicinei pentru acoperiri cu concentrații mai mari ale
medicamentului. Pentru probele cu 25 % Rapamicină/75 % poli(DL-lactida-co-glicolidă)
(PLGA), limita de solubilitate a rapamicinei în PLGA apare a fi exagerată și apar zone mari
bogate în rapamicină separate de PLGA. Separarea este evidentă pentru acoperiri de 50 %
rapamicină/ 50%PLGA. Imaginile filmului cu ”capcoat„ arată un strat distinct al PLGA în
jumătatea de sus a acoperirii.
După rezultatele date, profilul de eliberare pentru 5 % rapamicină/95 % PLGA ar avea
din fericire o mică spargere inițială a medicamentului urmată de o eluție corectă constantă a
medicamentului în timp. Profilurile de eliberare pentru 25 % rapamicină/ 75 % PLGA și 50
% rapamicină/ 50 % PLGA ar putea arăta o spargere inițială mai mare a medicamentului,
datorită concentrațiilor mari ale acestuia la suprafață, urmată de eluția mai puțin controlată a
medicamentului, datorită conformației particulelor asemănătoare în matricea polimerului. În
final, proba cu ”capcoat„ ar trebui să aibă o eliberare întârziată datorită integrității straturilor
suprapuse de 3 µm [8].
 Se investighează evaluarea microscopiei Raman pentru monitorizarea interacțiilor
medicament-membrană, influnența salicilatului și ibuprofenului pe structura membranei și
acumularea lor fără bistratul membranar. Atât salicilatul, cât și ibuprofenul sunt analgezice.
Spre deosebire de alte analgezice, acestea acționează prin reducerea biosintezei
prostaglandinei prin inhibarea ciclooxigenazei (COX). O parte din activitate silicatului,
ibuprofenul, ar putea fi datorată efectului asupra proprietăților membranei dublustrat. Spre
exemplu, fluiditatea membranei ar putea fi permisă pentru legarea COX și inhibarea
transportului sulfatului facilitată. Ar putea explica de asemenea efectele toxice asupra
celulelor gastromucozale.
Salicilatul s-a dovedit a inhiba transprtul facil al sulfatului și a altor anioni prin
membrana celulelor în timp ce crește transportul cationilor [9].

Aditivi lubrifianți- Microscopia Raman oferă oportunitatea studierii coroziunii sau a

proceselor de inhibare a coroziunii in situ. Aceasta este cel mai bine facilitată utilizând un
obiectiv de lucru de distanță. În acest fel filmele de coroziune inhibată formate pe cupru în
mediiile acide prin substituirea alchil imidazolin-2-tiol a fost caracterizată prin compararea
spectrelor Raman de la cupru cu acelea obținute de la complecșii de cupru ale inhibitorilor
preparați din săruri simple de cupru.
Scanarea Raman a suprafețelor mărite (SERS) permite detectarea monostraturilor, în
uele cazuri, pe suprafețele special preparate de argint. Acestă tehnică a fost utilizată pentru
studierea modului de adsorbție a presiunii extreme (EP) a aditivului mercaptobenzotiazol pe
suprafața oțtlului placat cu argint. Suetaka a studiat spectrul SERS al acestei molecule în
mediul apos și a arătat că forma ionizată este cea care adsoarne pe suprafața electrodului de
argint. Figura 7 arată spectrul solidului (forma neutră) a unei soluții bazică (forma ionizată)
și spectrul SERS, pentru suprafața oțelului acoperit cu argint sub o soluție foarte diluată a
aditivului în hexadecan. În acest mediu nonpolar, spectrul Raman arată că din nou forma
ionizată care este adsorbită pe suprafața metalului este responsabilă pentru proprietățile EP
ale moleculei [10].
 Figura 7. Spectrul Raman al solidului (a), a soluției bazică (b) și spectrul SERS al
suprafeței adsorbite a mercaptobenzotiazolului (c).

CRIMINALISTICĂ- Analiza criminalistică precisă este cerută de către autorități pentru a

obține proceduri de succes. Sistemele curente se bazează pe jetoane ADN electroforetice, ce
necesită pre-procese, filtrare și reacții ale lanțului polimerazei pentru a crește numărul de
tulpini ADN. Alternative ale acestor jetoane ADN includ opțiuni optice precum sistemele
fluorescente, care cer utilizarea etichetelor fluorescente. Sistemele Raman pot fi de asemenea
utilizate pentru caracterizarea ADN, oferind o analiză rapidă și minuțioasă a markerilor
medico-legali biologici. Analizele Raman au fost utilizate pentru analizele medico-legale ale
urmelor de anticorpi fluidici incluzând tot sângele, fluide vaginale, investigații farmaceutice
medico-legale, explozivi și abuz de droguri.
Microfluidele au potențiialul de a crește acest domeniu, precum majoritatea probelor
medico-legale sunt organice în natură și pot fi suspendate în lichid, prmițându-le măsurarea în
dispozitive microfluidice Raman. În plus, microfluidele oferă medii ideale pentru laboratorul
cu jeton, prin urmare prepararea probei poate fi condusă într-o modalitate rapidă și portabilă.
Probele de ADN și alte fluide corporale pot fi depozitate în forma lor lichidă și microscopia
Raman oferă o metodă nondistructivă de testare, permițând probei să fie reutilizată dacă este
necesar [3].
 În Tabelul 1 sunt prezentate comparări ale tehnicilor de analiză spectrală utilizând
Microscopia Raman.

Tabel 1. Compararea tehnicior de analiză spectrală

Tehnica Descriere Calitativ Cantitativ Exemple
Analiza Alte spectre Da Nu Tulpina bacteriei
clusterului Raman în Tulpina
ierarhic (HCA) ierarhiazarea virusului sincțial
comunelor respirator
Bacteria din
lapte, mâncare;
Medicamente
contrafăcute;
Sânge uman
Analiza Reduce Da Nu Antibioticele
componentului spectrele Raman tetraciclină;
principal (PCA) la câteva Supozitoare;
componente Preeclampsia;
principale, Medicamente
determinând contrafăcute;
valorile scor Saliva din
pentru fiecare cancerul de
spectru plămâni;
Diagnoza
cancerului de
laringe
Parțialul Tehnica Nu Da Tabletele
ultimului pătrat regresiei farmaceutice;
(PLS) multivariate în Prednison în
care un set de tablete;
chimicale Antibioticul
cunoscute tetraciclină;
(așteptate) este Medicamente de
comparat stradă ilicite;
împotriva unui Supozitoare;
spectru compex Plasma sanguină
pentru a putea umană
extrage o relație
lineară între
concentația
cunoscută a
componentului
particular și
intensitatea
informației
spectrale Raman
Regresia Regresia lineară Nu Da Poliuretan;
componentului este folosită în Hipertensiunea
principal (PCR) componenții gestială;
 principali ai Identificarea
datelor spectrale medicamentelor
Raman pentru contrafăcute;
obținerea Diagnosticarea
cantitatea cancerului
principalilor laringeal;
componenți Saliva din
Raman fără un patentele
spectru Raman cancerului de
(similar cu PLS, plămâni
fără spectru
cunoscut)
Deconvoluție Defalcarea Da Nu Probele de piele
spectrelor umană;
Raman Celulele
complexe în canceroase;
vârfuri cu Nanotuburi de
legături carbon
cunoscute
pentru a
identifica și
cuantifica
componenții
acestuia
Corelația Compararea Da Nu Trioxid de
„wavenumber” unui spectru wolfram;
Raman cu unul Grafit;
necunoscut și Poli(L-lisina)
determinarea
corelației
acestuia
Regresia lineară Concentrația Nu Da Acidul
probei este dipicolinic;
măsurată Prometazina;
utilizând Glucoza
intensitatea
și/sau lățimile
picurilor Raman,
unde o relație
lineară dintre
valorile
concentrației
cunoscute și
datele spectrale
Raman este
făcută
ADVATAJE
S-a argumentat faptul că microscopia Raman (Figura 8) este cea mai bună tehnică
unică pentru identificarea și studierea solidelor anorganice, în mod special când acestea sunt
amestecuri heterogene pe o scală micrometrică. Caracteristicile microscopului Raman ce îl
fac să fie atât de bine calificat pentru analizele acestor materiale includ secificitatea lor
moleculară, non-distructivitatea, rezoluția spațială și spectrală mare, analizele in situ,
portabilitatea, aplicabilitatea la probe mari sau neuniforme și imunitate relativă la interferenți.

Figura 8. Schema unui microscop Raman dispersiv (modified with permission from a
drawing supplied by Renishaw plc).

LIMITĂRI
Tehnica Raman nu este fără limitări, în orice caz, o scurtă mențiune a acestora este
expusă. Pentru început, deși este extrem de potrivită pentru identificările calitative ale
materialului, microscopia Raman nu este făcută cu ușurință cantitativă datorită efectelor
parametrilor instrumentali individuali. Nu este de asemenea potrivită pentru toate formele de
analize arheologige (pe solide), cum ar fi testarea aliajelor metalice sau a amprentelor
elementare, și aproape toate metalele pure sunt invizibile din punct de vedere Raman.
Analizele Raman pot fi înșelate de către materiale organice fluorescente, prin fluorescența
atomică din unele materiale, sau prin fluorofori ce au devenit incorporați în artefacte de la
manipularea, îngroparea sau a altor procese [5].
Deși sistemele microscopice Raman sunt relativ versatile, există încă câteva rețineri
ce ar trebui luate în considerare, ce rezultă în urma limitărilor microscopiei Raman și a
sistemelor microfluidice, cum ar fi integrarea lor. În mod specific aceste provocări se
raportează la volumul mic de detecție și modul în care trebuie condus procesul de împrăștiere
pentru a optimiza eficiența colectării spectrale. Este de asemenea importantă minimalizarea
daunelor asupra probelor și a dispozitivelor microfluidice datorită nivelelor de putere optică
generată prin sistemele de excitare Raman [3].

Bibliografie:

1. John R. Ferraro, Kazuo Nakamoto, Chris W. Brown, Introductory Raman

Spectroscopy, 2nd Edition, 2003, 434, DOI: 10.1016/B978-0-12-254105-
6.X5000-8
2. Titus Vlase. Metode fizico-chimice de investigare a transformărilor în solid.
Referat doctorat.
3. Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K., Stoddart, P. R., Mitchell, A., & Kalantar-
zadeh, K. (2013). Microfluidics and Raman microscopy: current applications
and future challenges. Chemical Society Reviews, 42(13), 5880.
doi:10.1039/c3cs35515b
4. Anthony Carpi,Andrew J. Schweighardt, Forensic Chemistry Handbook, 2012,
Environmental Forensics
5. Smith, G. D., Clark, R. J., Raman microscopy in archaeological science.
Journal of Archaeological Science, 2004, 31(8), 1137–1160. DOI:
10.1016/j.jas.2004.02.008
6. Kwok, K., & Taylor, L. S. (2012). Analysis of the packaging enclosing a
counterfeit pharmaceutical tablet using Raman microscopy and two-
dimensional correlation spectroscopy. Vibrational Spectroscopy, 61, 176–182.
DOI: 10.1016/j.vibspec.2012.02.018
7. Gordon, K. C., & McGoverin, C. M. (2011). Raman mapping of
pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics, 417(1-2), 151–162.
DOI: 10.1016/j.ijpharm.2010.12.030
8. Belu, A., Mahoney, C., & Wormuth, K. (2008). Chemical imaging of drug
eluting coatings: Combining surface analysis and confocal Raman
microscopy. Journal of Controlled Release, 126(2), 111–121. DOI:
10.1016/j.jconrel.2007.11.015
9. Fox, C. B., Horton, R. A., & Harris, J. M. (2006). Detection of
Drug−Membrane Interactions in Individual Phospholipid Vesicles by
Confocal Raman Microscopy. Analytical Chemistry, 78(14), 4918–4924. DOI:
10.1021/ac0605290
10. Gardiner, D. J., Bowden, M., Graves, P. R., & Thompson, R. B. (1986). Novel
Applications of Raman Microscopy [and Discussion]. Philosophical
Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering
Sciences, 320(1554), 295–306. DOI : 10.1098/rsta.1986.0118