Aplcații ale HPLC în biochimie – Detectoare cu șir/arie de fotodiode

În HPLC o indetificare sigură a analitului de interes se poate doar cu detectorul MS. Din
păcate aplicabilitatea sa este limitată de prețurile incă excesvi de mari ale acestor tipuri de detectoare.
Dacă spectrele analiților de interes diferă semnificativ între ele și față de cele ale contaminanților
atunci cu ajutorul detectoarelor cu șir (sau arie) de fotodiode (PDA, adică photodiode array sau
DAD, adică diode array detector) identificarea este, de asemenea, sigură. Dacă analiții de interes au
proprietăți caracteristice de fluorecență sau redox, identificarea lor se poate face cu destulă siguranță
și cu detectoarele de fluorescență și cele electrochimice. Identificarea compușilor doar pe baza
timpilor de retenție nu constituie o metodă sigură.
În practică sunt destul de dese situațiile în care doi soluți nu pot fi separați cromatografic și ar fi
necesar ca măsurătorile să se facă la două lungimi de undă diferite în același timp. Acest lucru este
posibil cu detectoare cu căi optice duble sau detectoare ce pot trasa spectrul UV. Acestea din urmă
sunt de două feluri:
 Detectoare care necesită oprirea circulației fazei mobile prin sistem, pentru a permite
detectorului sa scaneze spectrul;
 Detectoare șir (arie) de diode.
Figura următoare (1) prezintă schema unui detector șir (arie) de diode, model Hewlett Packard
(HP), una din cele mai bune și cunoscute firme de aparatură HPLC din lume.
Lentilele acromatice
focalizează lumna policromatică de
la lămpile de tungsten și deuteriu în
celula de măsurare. Lumina este apoi Figura 1
dispersată pe suprafața unei rețele de
difracție și cade apoi pe suprafața
unui cip format din șiruri de diode
(traducerea termenului de diode
array variază în funcție de autor, cele
mai utilizate forme fiind șir de diode,
arie de diode sau rețea de diode).
Domeniul de măsurare viariază, în
funcție de model și de firmă, dela 190-355 (Perkin-Elmer LC-235 C), la 190-800 nm (Merck L-7450,
Waters PDA 996) și 190-900 (HP 1100). De asemena, numărul de diode per cip variază în funcție de
model și de firmă (512 la Merck L-7450 și Waters PDA 996 și 1024 la HP 1100). Acuratețea măsurii
este, de obicei, de 1-1,2 nm. Prezența unui filtru special de oxid de holmiu permite o rapidă
verificare a acurateții lungimii de undă.
Majoritatea modelelor sunt dotate cu celule de măsurare ce rezistă la presiuni ridicate (peste
100 atm), astlfe încât detectoarele pot fi folosite atât cu coloane narrow-bore cât și în hyphenated
chromatography (utilizarea mai multori tipuri de detectoare
cuplate în cascadă, la care presiunea după ieșirea din
coloană se menține ridicată mai mult timp). Volumul
celulelor de măsurare variază de la 13 L la 1,7 L, cu un
drum optic variind de la 10 nm la 6 mm, respectiv.
Majoritatea DAD sunt mono-fascicul, dar există și
modele cu dublu-fascicul. Figura alăturată (2) prezintă
Figura 2
schema unui astfel de model. În acest caz, eventualele
fluctuații ale intensității luminii sunt compensate automat. Linia de bază este realizată prin soft,
memorându-se caracteristicile spectrale la momentul injecției.
Deoarece cantitatea de informație este foarte mare, DAD necesită ajutorul unui software
specializat. De fapt, actualmente puterea acestor tipuri de detectoare nu mai constă în caracteristicile
tehnice ale aparatului propriu-zis ci în facilitățile oferite de software.
Una din facilitățile oferite de acest tip de detectoare este posibilitatea de a face instantaneu
măsurători la mai multe lungimi de undă. Măsurarea variației intesității de lumină pe intreg domeniul
de lungimi de undă duce la obținerea unui spectru de absorbție. Pentru analize de rutină, DAD poate
fi folosit cu aceleași performanțe ca un detector UV obișnuit, măsurându-se absorbanța optică la o
singură lungime de undă (cu scopul de a salva spațiu în memoria calculatorului). În mod normal
DAD este folosit pentru a trasa spectrele de absorbție pe un domeniu caracteristic de lungimi de undă
pentru analitul de interes. Rezoluția spectrală depinde de lărgimea benzii la care de fac măsurătorile.
Aceasta poate fi programată cu ajutorul unei fante acționate de un servomtor, de la 1 sau 1,2 nm (cât
reprezintă valoarea maximă a rezoluției aparatului respectiv, aceasta fiind rezoluția digitală) la valori
relativ mari, cum ar fi 16, sau mai mulți nm (termen denumit rezoluție optică sau spectrală).
Rezoluția digitală = domeniul lungimilor de undă acoperit de rețeaua de difracție (lărgimea
maximă a spectrului) supra numărul de diode din șirul de diode al cipului.
Rezoluția optică = domeniul lungimilor de undă din spectrul maxim al rețelei de difracție
care se va constitui într-o singură valoare de absorbanță optică. Valoarea rezoluției optice poate fi
aleasă prin modificarea fantei programabile sau din soft.
Rezoluția optică poate fi ridicată maxim până la nivelul celei digitale (1,2 nm), când fanta
permite trecerea unui fascicul de
lumină cu o fereastră optică egală
cu dimensiunea unei diode din aria
de diode, sau rezoluția optică poate
fi un mutliplu al celei digitale. Figura 3
Figura 3
Dacă analiza în curs cere o sensibilitate mai mare rezoluția optică poate fi scazută, dacă însă este
necesar o acuratețe mai mare a spectrului atunci ea va fi crescută până la nivelul rezoluției digitale.
De notat că rezoluția optică este maximă când fereastra
fantei are valoarea minimă, adică egală în rezoluția Figura 4
digitală și rezoluția crește când numeric valoarea fantei
scade și viceversa.
Adaptarea lărgimii benzii rezoluției optice duce la
modificarea sensibilității semnalului detectorului. Datele
de finețe pot fi înregistrate când rezoluția optică este
maximă, deși în acest caz și raportul semnal/zgomot este
prea mare (figura 4).
Capacitatea de a distinge între structuri spectrale fine
crește foarte mult pe măsură ce rezoluția optică crește.
Pe de altă parte folosirea unei rezoluții optice mai
scăzute duce la obținerea unui semnal mai puternic și
evidențierea mai multor sau chiar a tuturor soluțiilor
eluați. Exemplu (figura 5):
 Figura 5

Având în vedere că cele 3 substațe au maxime de absorbție la

lungimi de undă diferite, rezultă că dacă s-ar flosi un detector
UV clasic ar fi fost nevoie de cel puțin 2 analize pentru a
evideția toate cele 3 substanțe. Cu DAD acest lucru se poate
realiza într-o singură analiză.

Maximele de absorbție ale analiților eluați pot fi identificate cu ușurință folosind prezentarea
tridimensională a datelor. (figura 6)
cromatograma tridimensională, obținută într- singură
analiză, poate fi utilizată apoi în multe scopuri:
 Determinarea maximelor de absorbție a
analiților eluați
 Cuantificarea fiecărui analit în parte la
lungimea de undă unde analitul respectiv are
maximul de absorbție
 Detecția contaminanților (impurităților)
 Spectrele fiecărui analit în parte pot fi
vizionate alături de cromatograma Figura 6
bidimesională
 Verificarea purității piscurilor cromatografice
În concluzie, principalele avantaje ale DAD sunt posibilitatea de a identifica analiții eluați prin
compararea spectrelor lor cu cele ale unor standarde din baza de date proprie și verificarea purității
piscurilor cromatografice, cât și posibilitatea de a realiza cromatograme extrase la mai multe lungimi
de undă. Deți în ultimii ani s-au făcut mai multe progrese în acest sens, principalul dezavantaj al
DAD este sensibilitatea relativ redusă, cel puțin atunci când se compară cu cea a detectoarelor
electrochimice și de fluorescență.