UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ DIN

BUCUREȘTI

_____________________________________________________________________________

Metode moderne de investigare

a proprietăților chimice ale vinurilor

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

BUCUREȘTI
2020
CUPRINS

1. SCOP..............................................................................................................................................3
2. ISTORIC........................................................................................................................................3
3. METODE DE ANALIZA ȘI REGLEMENTĂRI LEGISLATIVE..............................................3
3.1. PREZENTARE GENERALĂ STANDARDE PENTRU VIN...............................................3
Standarde pentru vin..................................................................................................................3
3.2. METODE DE ANALIZĂ MODERNE PENTRU VIN.........................................................7

1
 3.2.1. Determinarea sulfiților din vin (SO2)...............................................................................7
3.2.2. Determinarea acidității totale a vinului............................................................................9
3.2.3. Determinarea valorii pH-ului vinului............................................................................10
3.2.4. Determinarea antocianilor din vin..................................................................................11
3.2.5. Determinarea glucidelor reducătoare (glucoză, fructoză, zaharoză) din vin.................12
3.2.6. Determinarea polifenolilor totali din vin.......................................................................14
3.2.7. Determinarea concentrației alcoolice din vin (% vol.)..................................................16
3.2.8. Determinarea îndulcitorilor sintetici (aspartam, acesulfam de K, zaharină și sărurile
sale de Na, K și Ca) din vin.....................................................................................................16
Materiale și metodă adaptată..................................................................................................18
Materiale..................................................................................................................................18
Soluții standard și pregătirea probelor...................................................................................19
Metoda cromatografică.............................................................................................................19
Rezultate și discuții..................................................................................................................19
Concluzii..................................................................................................................................21
4. BIBLIOGRAFIE..........................................................................................................................22

1. SCOP

Scopul raportului este de a investiga metodele moderne de determinare a parametrilor

chimici ai vinurilor în vederea alegerii setului metodelor ce vor fi aplicate determinărilor din
studiul denumit Aspectele privind corelația calității vinurilor cu o serie de proprietăți chimice ale
acestora.

2
2. ISTORIC

Primele metode de analiză specifice vinurilor au început să fie dezvlotate încă din anii ‘70,
precum cele analitice ori fizico-chimice, cum ar fi determinarea concentrației alcoolice - STAS
6182 / 6 - 70 , determinarea densității - STAS 6182 / 8 – 71 sau determinarea
hidroximetilfurfuralului - STAS 6182 / 29 – 73. În anii 2000 unele dintre ele au început să fie
perfecționate iar altele au fost nou dezvoltate, precum cele spectrofotometrice, enzimatice sau
cromatografice, cum ar fi determinarea caracteristicilor cromatice - SR 6182 – 35 / 2009 ori
determinarea sulfitului - SR EN 1988 – 2 / 2003.

3. METODE DE ANALIZA ȘI REGLEMENTĂRI LEGISLATIVE

3.1. PREZENTARE GENERALĂ STANDARDE PENTRU VIN

În România există o serie de standarde reglementate care descriu metode de identificare și

cuantificare a diferiți parametri fizico-chimici ai vinurilor și care se pot folosi ca referențial în
interpretarea rezultatelor obținute. Mai jos sunt enumerate aceste standarde specifice analizelor
pentru matricea vin. O serie dintre metode încă sunt utilizate, în timp ce unele metode de analiză
descrise în aceste standarde au fost perfecționate iar altele au fost nou dezvoltate prin tehnici mai
moderne.

Standarde pentru vin

SR 6182 – 45 / 2009 Determinarea taninurilor

SR 6182 – 35 / 2009 Determinarea caracteristicilor cromatice
SR 6182 – 34 / 2009 Determinarea acidului tartric
SR 6182 – 26 / 2009 Determinarea acidului citric
SR 6182 – 25 / 2009 Determinarea substanței uscate solubile. Metoda refractometrică
SR 6182 – 18 / 2009 Determinarea zahărului reducător + Erată
SR 184 – 17 / 2009 Identificarea substanțelor colorante artificiale (pentru alcool etilic și băuturi
alcoolice)
SR 6182 – 14 / 2009 Determinarea valorii pH
SR 6182 – 13 / 2009 Determinarea dioxidului de sulf
SR 184 – 11 / 2008 Determinarea dioxidului de sulf. (pentru alcool etilic și băuturi alcoolice)
SR 6182 – 12 / 2009 Determinarea sulfaților
SR EN 6182 – 2 / 2008 Determinarea acidității volatile
SR 6182 – 1 / 2008 Determinarea acidității totale
SR EN 1988 – 2 / 2003 Determinarea sulfitului. Partea 2. Metoda enzimatică (pentru produse
alimentare)
SR EN 1988 – 1 / 2003 Determinarea sulfitului. Partea 1. Metoda optimizată Monier-Williams
(pentru produse alimentare)
SR 13445 / 2001 Condiții tehnice de calitate
SR 7588 / 1999 Reguli pentru verificarea calității și condiții de ambalare, marcare, depozitare și
transport (pentru vin și produse pe bază de must și vin)
SR 6182 – 5 / 1994 Vin.Determinarea plumbului
SR 6182 / 19 - 90 Vin.Determinarea cuprului
SR 6182 – 22 : 1995 Vin.Determinarea staniului

3
SR 6182 / 28 - 89 Vin.Determinarea arsenului
SR 6182 / 40 - 75Vin.Determinarea alcoolului metilic
SR 6182 / 41 - 75 Vin.Analiza microbiologică
STAS 6182 / 53 – 91 Vin.Determinarea cadmiului
STAS 6182 / 42 – 83 Identificarea îndulcitorilor sintetici
STAS 6182 / 17 – 81 Determinarea zaharozei
STAS 6182 / 9 – 80 Determinarea extractului sec total
STAS 6182 / 31 – 74 Determinarea clorurilor
STAS 6182 / 29 – 73 Determinarea hidroximetilfurfuralului
STAS 6182 / 8 – 71 Determinarea densității
STAS 6182 / 6 - 70 Determinarea concentrației alcoolice

SR 7588 / 1999 și SR 13445 / 2001 definesc termenul „vin” ca fiind băutura obținută
exclusiv prin fermentarea alcoolică, completă sau parțială, a strugurilor proaspeți, a cărei tărie
alcoolică dobândită prin fermentare este de peste 8,5% vol. La temperatura de 20°C (ASRO,
2001) și de asemenea stabilesc regulile pentru verificarea calității și condițiile de ambalare,
marcare, depozitare și transport ale vinului (ASRO, 1999). Acestea prevăd condițiile de
admisibilitate ale vinurilor pentru a putea fi puse pe piață, recomandă metode de verificare ale
parametrilor specifici și reguli pentru asigurarea calității acestora.

SR 6182 – 34 / 2009 Determinarea acidului tartric, se poate realiza prin metoda

gravimetrică sau cea colorimetrică. Pentru metoda gravimetrică acidul tartric din probă precipită
ca racemat de calciu și se dozează gravimetric, dacă este necesar dozându-se apoi și volumetric
pentru comparare. Iar pentru metoda colorimetrică se dozează colorimetric cu acid vanadic după
ce în prealabil acidul tartric a fost fixat pe o rășină anionică bazică în formă acetat și eluat cu
soluție de sulfat de sodiu (ASRO, 2009).

SR 6182 – 26 / 2009 Determinarea acidului citric prin metoda iodometrică (având

sensibilitate 50,0 mg/L) ori prin metoda spectrofotometrică fie cu acid sulfanilic diazotat (la
lungimea de undă 420 nm, având sensibilitate de 62,5 mg/L), fie cu anhidridă acetică (metodă
rapidă, la lungimea de undă 363 nm, având sensibilitate 5,0 mg/L) (ASRO, 2009).

Determinarea substanței uscate solubile se efectuează conform SR 6182 – 25 / 2009 prin

metoda refractometrică, determinând indicele de refracție după eliberarea componenților volatili
sau prin metoda densimetrică cu ajutorul aerometrului (densitatea produsului din probă fiind direct
proporțională cu substanța uscată solubilă). Din conținutul de substanță uscată se poate deduce
conținurul de zaharuri cu ajutorul anexei standardului (ASRO, 2009).

SR 184 – 17 / 2009 stabilește metodele de identificare a substanțelor colorante artificiale

prin metoda cromatografică pe hârtie și cea cu alcool amilic (ASRO, 2009).
Valori ale absorbanței pentru eșantioanele de vin au mai fost determinate și cu ajutorul
unui spectrofotometru folosind o cuvă de 1 mm. Intensitatea culorii (CI) a fost calculată prin suma
absorbanțelor la 420 nm, 520 nm și 620 nm cu ajutorul modelului colorimetric Konica Minolta
Chroma Meter CR 400 (Grutzmann Arcari și col., 2013).

Determinarea caracteristicilor cromatice ale vinurilor roșii și rose se poate efectua conform
SR 6182 – 35 /2009 prin spectrofotometrie (prin metoda de referință) la lungimile de undă 445
nm, 495 nm, 550 nm și 625 nm sau (prin metoda rapidă) la 420 nm, 520 nm și 620 nm (ASRO,

4
2009). Metoda spectrofotometrică a fost utilizată și de către Valentin și col, 2020, fiind la fel de
eficientă ca metoda testului de culoare tip Somers (Schelezki și col., 2020).
La fel și Christofi S. Și col., 2020, au determinat parametrii cromatici, flavonele și
activitatea antioxidantă spectrofotometric iar conținutul de antociani și cel de taninuri prin tehnici
cromatografice utilizând echipamente HPLC sau HPLC/MS.

SR 6182 – 45 / 2009 Determinarea taninurilor, stabilește metoda spectrofotometrică de

determinare a taninurilor din vin la lungimea de undă 550 nm și metoda semicantitativă cu clorură
ferică (pentru vinurile albe) (ASRO, 2009). Distribuția mărimii taninului din vin se poate
determina și prin cromatografie cu permeabilitate gel (GPC) (Schelezki și col., 2020) sau prin
cromatografie de lichide (Christofi S. Și col., 2020).

STAS 6182 / 9 – 80 stabilește metodele de determinare a extractului sec total din vin,
respectiv metoda prin evaporare la presiune redusă și metoda densimetrică indirectă ori cea prin
calcul cu formula Taberie, toate având o sensibilitate de 0,2 g/L (MAIA, 1980).

STAS 6182 / 31 – 74 Determinarea clorurilor din vin prin metoda argentometrică sau
metoda rapidă prin titrare cu azotat de argint, sensibilitatea metodei fiind de 0,05 g/L (MAIA,
1974). Clorul din vin poate proveni din sol sau din produsele enologice aditivate.
S-a efectuat, de asemena, determinarea elementelor minerale prin ICP-MS și CZE.
Determinarea a zece elemente minerale a fost efectuată cu ajutorul unui spectrometru de masă cu
plasmă cuplată inductiv, folosind nebulizare pneumatică cu un nebulizator cu flux transversal.
Următoarele elemente fiind determinate conform metodologiei lui Catarino, Curvelo-Garcia, și
Bruno de Sousa (2006): aluminiu (Al), cobalt (Co), cupru (Cu), fier (Fe), mangan (Mn), nichel
(Ni), plumb (Pb), cadmiu (Cd), taliu (Tl) și zinc (Zn) (Grützmann Arcari și col., 2013).
Determinările de sodiu (Na), potasiu (K), calciu (Ca) și magneziu (Mg) au fost efectuate
prin electroforeza zonei capilare, în modelul de echipamente Agilent Technologies HP3DCE
echipate cu diode de detector (DAD) (Grützmann Arcari și col., 2013).

STAS 6182 / 29 – 73 stabilește metoda de determinare a hidroximetilfurfuralului (HMF)

din vinuri prin spectrofotometrie la lungimea de undă 550 nm, sensibilitatea metodei fiind de 1 mg
HMF/L. Conșinutul de HMF se remarcă prin intensitatea culorii care poate varia de la roz deschis
(pentru cantitate mică de HMF) până la roșu vișiniu intens (pentur cantitate mare de HMF)
(MAIAA, 1973).

STAS 6182 / 8 – 71 stabilește metodele de determinare a densității și a densității relative a

vinului prin metoda aerometrică (cu precizie de 0,0003 g/cm 3) sau metoda picnometrică (cu
precizie de 0,0003 g/cm3 sau precizie de 0,0001 g/cm3) (MAIASA, 1971).
Compușii fenolici, mineralele și conținutul mai mare de alcooli, raportul izotopilor de
carbon, culoarea și activitatea antioxidantă pot fi determinați pentru vinuri albe și roșii folosind
tehnici de spectrofotometrie, colorimetrie, cromatografie lichidă de înaltă performanță,
spectrometrie de masă plasmatică cuplată inductiv, capilar electroforeza zonelor, cromatografia de
gaze și raportul izotopic spectrometrie de masă. (Grutzmann Arcari S. și col., 2013)

Determinarea alcoolilor superiori prin tehnica cromatografiei de gaze utilizând un

cromatograf de gaz cu un detector FID (GC-FID) a fost studiată de către Grützmann și col. (2013).
Coloana Varian (30 m × 0,25 mm diametru intern, 0,25 μm) a fost utilizată la o temperatura
inițială de 40 ° C, crescând treptat cu 5 ° C pe minut până la 200 ° C. Temperatura injectorului la
220 ° C și temperatura detectorului la 250 ° C.

5
 Identificarea și cuantificarea alcoolilor superiori a fost efectuată folosind standardele de
etanol, acetat de etil, metanol, izobutanol (2-metil-1-propanol) și alcooli izoamilici (2-metil-1-
butanol și 3-metil-1-ol). Curbele de calibrare au fost pregătite pentru fiecare standard în patru
concentrații diferite și coeficienții de regresie obținuți au fost > 0,99.

Determinarea compușilor volatili poate fi efectuată prin gaz cromatografie cu ajutorul unui
sistem HS-SPME-GC-MS și cuantificarea compușilor fenolici prin lichid cromatografie cuplată cu
triplu cuadropol spectrofotometru de masă (LC-MS/MS) (Valentin și col., 2020; Schelezki și col.,
2020).
Determinarea compușilor fenolici poate fi efectuată prin spectrofotometrie prin metoda
Folin-Ciocalteau (Singleton și Rossi, 1965) folosind acidul galic ca etalon sau prin cromatografie
de lichide prin HPLC conform studiului lui Grützmann și col. (2013) care au identificat și
cuantificat compușii fenolici (cu acid galic, catechină, acid cafeic, acid p-coumaric, acid ferulic și
quercitină) folosind un cromatograf de lichide Shimadzu, echipat cu un sistem cuaternar de pompe
(model 10-AT), un degazator de vid (model DGU-14A), un detector UV – Vis (SPD-10AV) și o
buclă Rheodyne de 20 µL. Setul a fost controlat de software-ul CLASS VP 6.1, cu un comunicator
model SCL-10A. Faza staționară a fost compusă din o coloană cu fază inversă Hichrom cu o
lungime de 250 mm și diametru intern 4,6 mm cu particule de 5 μ. De asemenea, o precoloană a
fost folosită pentru a proteja coloana analitică.

Tot Grützmann și col. (2013) au determinat trans-resveratrolul conform metodologiei lui

Souto și colab. (2001) cu unele modificări ale parametrilor: faza mobilă a fiind o soluție de apă și
acetonitril (75:25) cu pH-ul ajustat la 2,4 cu H3PO4 concentrat, debit de eluție de 1,2 mL /min la
lungimea de undă 306 nm. Toate probele au fost pretratate înainte de injectare în cromatograf
folosind metodologia de extracție lichid-lichid descrisă de Bravo și col. (2008). Identificarea
transresveratrolului a fost efectuată prin compararea timpilor de retenție ale eșantioanelor și
standardelor.
Activitatea antioxidantă poate fi determinată prin metoda ABTS (acid 2,2-acid-azinobis (3-
etilbenzotiazolina) -6-sulfonic) conform metodologiei descrisă de Re și colab. (1999) și
perfecționată de Kim și col. (2002).

SR EN 6182 – 2 / 2008 stabilește metoda de determinare a acidității volatile din vin. Acizii
volatili se separă prin antrenare cu vapori urmată de titrare cu soluție de hidroxid de sodiu (NaOH,
0,1N) în prezența fenolftaleinei (ASRO, 2008).

SR 6182 – 12 / 2009 denumit Determinarea sulfaților stabilește metodele gravimetrice (I și

II) și metoda turbidimetrică de determinare a sulfaților din vinuri, rezultatul exprimându-se în g
K2SO4/L (ASRO, 2009).

3.2. METODE DE ANALIZĂ MODERNE PENTRU VIN

3.2.1. Determinarea sulfiților din vin (SO2)

Dioxidul de sulf are un rol important în industria vinificației, fiind un aditiv cu rol
antioxidant și antiseptic. Însă de când au fost raportate reacții alergice la conținutul de sulfit din
alimente, se manifestă un interes important pentru înlocuirea acestuia sau reducerea cantității
utilizate.

6
 Studiile arată ca 34% dintre consumatori pot manifesta dureri de cap în urma consumului
moderat de vinuri iar conținutul în sulfit al acestora este cel mai des asociat cu acest fenomen.
(Costanigro M., 2014)
O tehnică eficientă care are în vedere reducerea cantității de sulfit, este presiunea înaltă
hidrostatică (HHP), aceasta dovedind eficiență în conservarea vinului (Christofi S. Și col., 2020).
Alte metode alternative la utilizarea sulfitului, cu rol în conservarea vinurilor sunt utilizarea de
ultrasunete și impulsuri în câmp electric sau utilizarea de complex de argint coloidal. De
asemenea, mai există extractele naturale din semințe și tulpină de struguri care pot fi utilizate
simple sau în combinație cu argint coloidal. Au același efect antimicrobial ca sulfitul iar dacă se
adaugă argintul coloidal devine mult mai eficient cu privire la bacteriile lactice si acetice. Se poate
dezvolta o modificare la nivelul culorii în sensul migrării culorii spre tonuri de maro însă fără a
înregistra modificări în direcția oxidării.Vinurile albe în care s-au introdus doar semințe de
struguri au evidențiat creșteri în flavone și compuși volatili din punct de vedere chimic si o
amărăciune la nivel senzorial.Vinurile albe în care s-a introdus doar exctract din tulpină de
struguri au prezentat caraceristici mai apropiate cu cele în care se introduce sulfit (Marchante L. Și
col., 2019).
Tendința este de a reduce utilizarea și implicit consumul de sulfit iar pentru determinarea
nivelului de sulfit au fost dezvoltate standardele:
- SR EN 1988-1 / 2003 „Determinarea sulfitului. Partea 1: Metoda optimizata Monier-Williams”,
care stabilește metoda de distilare pentru determinarea conținutului de sulfit, exprimat ca dioxid de
sulf, în care conținutul de sulfit este de cel puțin 10 mg/L. Metoda fiind aplicabilă în prezența altor
compuși volatili ai sulfatului (ASRO, 2003).
- SR EN 1988-2 / 2003 „Determinarea sulfitului. Partea 2: Metoda enzimatică”, aceasta stabilind
metoda spectrofotometrică de determinare a sulfitului liber (ASRO, 2003).

- SR 184 – 11 / 2008 Determinarea dioxidului de sulf, stabilind metodele de determinare a

dioxidului de sulf liber (prin metoda iodometrică) și total (prin metoda iodometrică sau
spectrofotometrică) (ASRO, 2008).
- SR 6182-13 / 2009 „Determinarea dioxidului de sulf”care stabilește metodele de determinare ale
dioxidului de sulf liber, total și combinat prin metde de referință, curente și rapide (de tip
potențiometric și iodometric), având precizie de până la 10 mg/L (ASRO, 2009).
De asemenea, studiile intense în această direcție au făcut ca Lajin B. și Goessler W. în
2019 să dezvolte metoda de determinare directa a sulfitului și a altor compuși ai sulfului din vinuri
roșii și albe prin tehnica cromatografiei de lichide utilizând HPLC-ICPMS/MS, metodă la care
nivelul pH-ului fazei mobile are un rol foarte important.
Cea mai utilizată la ora actuală rămâne totuși metoda spectrofotometrică pentru care se
folosesc kituri enzimatice de determinare a cantității de sulfit total sau a celei de sulfit liber.
Principiul metodei:
Sulfitul (acidul sulfuros) este oxidat de către sulfit-oxidaza (SO 2-OD) în prezența
oxigenului, transformându-se în sulfat. (1)
0 2  OD
(1) SO32  O2  H 2 O S  SO42  H 2 O2

Hidrogen peroxidul format în această reacție este redus de enzima NADH-peroxidază (NADH-
POD) în prezența nicotinamidei-adenină nucleotidei redusă (NADH) (2)
 POD
( 2) H 2 O2  NADH  H  NADH
  2 H 2 O  NAD 

Cantitatea de NADH oxidată în reacția (2) este echivalentă cu cantitatea de sulfit sau de aldehida
sulfit legată chimic. NADH este determinată prin măsurarea absorbanței la 340nm. Conținutul de
sulfit este determinat la o valoare a pH-ului la care sulfitul este eliberat de parametrii săi
obligatorii (ex: acetaldehida) și reacționează cu un reactiv colorat specific. Cantitatea
cromogenului său este stoechiometric influențată de cantitatea de sulfit prezent în probă și se
determină cu ajutorul unui spectrofotometru la lungimea de undă de 340 nm.

7
 Modul de lucru:
Kiturile enzimatice conțin flacoane cu soluții gata pregătite pentru determinarea unui numar
prestabilit de analize.
- Kitul EnzytecTM Liquid SO2-Total/R-Biopharm (Art.Nr.E8600)
o Sticla 1 – reactiv 1 (tampon): două flacoane ≥ 100 mL;
o Sticla 2 – reactiv 2 (cromogen): două flacoane ≥ 25 mL;
o Sticla 3 – calibrator (SO2=150mg/L): un flacon ≥ 3,5 mL;
Reactivii sunt stabili până la data expirării indicată pe ambalaj (până la sfarșitul lunii
indicate) dacă este păstrat la temperatura de 2-8°C. A nu se îngheța reactivii! Reactivii
se aduc la temperatura camerei (20-25°C) înainte de a fi utilizați.În utilizarea kit-ului se
aplică regulile generale de siguranță pentru activitățile specifice laboratoarelor. A se
evita contactul cu pielea și zonele cu mucoase.
Vinurile albe se testează ca atare, în timp ce vinurile roșii trebuie să aibă pH-ul ajustat la
7,5-8 înainte de testare. Probele aduse la 20-25˚C, puse în cuve din sticlă sau plastic cu lungimea
drumului optic de 1 cm, se testează pentru absorbanță la lungimea de undă stabilită (340 nm), față
de aer, cu ajutorul unui spectrofotometru UV-VIS. (R-Biopharm)
Calcul rezultat:
Concentrația analitului de interes se calculează cu ajutorul următoarelor formule de calcul:

A  ( A2  df  A1 ) prob ă / calibr ator  ( A2  df  A1 ) blank

df  factor de dilutie al densitatii optice prin volum de reactivi

proba  R1
df   0,808
proba  R1  R2

c calibr ator  g / L
c proba  g / L   A proba
Acalibr ator

În situația în care concentrația calibratorului este 150 mg/L se utilizează următoarea formulă de
calcul:
A proba
c proba  g / l   150 
Acalibrator

Rezultatul se exprimă ca SO2 și se referă la cantitatea totală, disponibilă din toate sursele,
un conținut de SO2 de până la 10 mg/L, nefiind considerat a fi prezent și nefiind necesar să fie
declarată cantitatea lui pe etichetă ci doar să apară mențiunea ca poate exista sulfit în produs (Reg.
CE 1333/2008). O limită maximă admisă a prezenței sulfitului în vin este de până la 200 mg/L
(Reg. CE 1129/2011).

3.2.2. Determinarea acidității totale a vinului

Principiul metodei:

8
 Aciditatea totală este suma acizilor minerali și organici din vin. Adesea este confundată cu
aciditatea titrabilă măsurată, aceasta din urmă reprezentând o aproximare a acidității totale însă
fiind mai mică decât aciditatea totală.
Aciditatea totală se poate determina potențiometric sau titrimetric (în prezența indicatorului
albastru de bromtimol sau a indicatorului roșu de fenol) conform SR 6182-1 / 2008 Determinarea
acidității totale.
Modul de lucru și calcul rezultate::
Probele nu trebuie să fie pretratate pentru această determinare.
Pentru metoda potențiometrică se titrează potențiometric proba de vin cu o soluție de
hidroxid de sodiu (NaOH, 0,1N), după eliminarea prealabilă a dioxidului de carbon și a dioxidului
de sulf. Sensibilitatea metodei fiind de 0,5 miliechivalenți (sau 0,005 g dacă rezultatul se exprimă
în acid tartric sau 0,025 g dacă rezultatul se exprimă în acid sulfuric).
Se iau în lucru 20 mL probă vin peste care se adaugă picătură în picătură sol NaOH (0,1N)
până pH-ul ajunge la 7 la temperatura de 20°C. Durata titrării este de aproximativ 5 minute. Se
recomandă efectuarea a două astfel de determinări în paralel.
Rezultatul de exprimă în miliechivalenți la litru, grame acid tartric la litru sau grame acid
sulfuric la litru și se calculează astfel:
0,1*V1
V1= vol sol NaOH(0,1N) folosot la titrare
aciditate _ totala  *1000(miliechivalenti / L  V= vol probă luat în lucru, în mL
V
0,0075 este cantitatea în g de acid tartric
necesară reacției cu 1 mL sol NaOH (0,1N)
0,0075 *V1
aciditat _ totala _(acid _ tartric)  *1000 g / L) 0,0049 este cantitatea în g de acid sulfuric
V necesară reacției cu 1 mL sol NaOH

0,0049 *V1 Metoda titrimetrică are o sensibilitate

aciditate _ totala( acid _ sulfuric)  *1000( g / L) mai slabă decât cea potențiometrică,
V
respectiv 1 miliechivalent (sau 0,07 g dacă
rezultatul se exprimă în acid tartric sau 0,050 g dacă rezultatul se exprimă în acid sulfuric). Pentru
aceasta, se titrează proba de vin cu o soluție de hidroxid de sodiu în prezența indicatorului ales
(albastru de bromtimol sau roșu de fenol), după eliminarea prealabilă a dioxidului de carbon și
ținând seama de faptul că din rezultatul final se scade aciditatea titrabilă dată de dioxidul de sulf
liber și cel combinat, dozate la determinarea acidității volatile conform SR 6182-2 / 2008 (ASRO,
2008).
Se iau în lucru 10mL probă vin peste care se adaugă 25 mL apă și 1 mL soluție indicatoare.
Apoi începe să se titreze soluția cu NaOH (0,1N) până la virajul culorii. Volumul de NaOH folosit
la titrare este V1 din formula de calcul de mai jos:

0,1* (V1  V0 )
aciditate _ totala  *1000(miliechivalenti / L 
V

0,0075 * (V1  V0 )
aciditat _ totala _(acid _ tartric)  *1000 g / L)
V

0,0049 * (V1  V0 )
aciditate _ totala(acid _ sulfuric)  *1000( g / L)
V

0,0075 este cantitatea în g de acid tartric necesară reacției cu 1 mL sol NaOH (0,1N)
0,0049 este cantitatea în g de acid sulfuric necesară reacției cu 1 mL sol NaOH

9
V1= vol sol NaOH(0,1N) folosot la titrare
V= vol probă luat în lucru, în mL
V0= 0,035 V2 + 0,025 V3
V2=vol sol de iod 0,01N folosit la titrarea dioxidului de sulf liber, în distilatul pentru determinarea
acidității volatile (SR 6182-2)
V3=vol sol de iod 0,01N folosit la titrarea dioxidului de sulf combinat, în distilatul pentru
determinarea acidității volatile (sr 6182-2)
0,035 este un coeficient stabilit pe baza echivalenței dintre soluția de NaOH (0,1N) folosită la
titrarea acidității totale și sol iod 0,01N folosită la titrarea dioxidului de sulf liber
0,025 este un coeficient stabilit pe baza echivalenței dintre soluția de NaOH (0,1N) folosită la
titrarea acidității totale și sol iod 0,01N folosită la titrarea dioxidului de sulf combinat

Aciditatea titrabilă si pH ul pot fi determinate și cu un titrator automat care titrază proba

până la punctul final de pH=8,2 cu o soluție de NaOH (0,33M) (Schelezki și col., 2020)

3.2.3. Determinarea valorii pH-ului vinului

Principiul metodei:
Determinarea valorii pH a vinurilor se face în conformitate cu standardul SR 6182 – 14 /
2009, măsurând diferența de potențial dintre doi electrozi cufundați în proba de analizat, un
electrod fiind de referință cu potențial fix iar celalalt având potențial în funcție de valoarea pH a
probei (ASRO, 2009). Pentru aceasta se utilizează un aparat denumit pH-metru cu precizie de 0,05
unități pH, prevăzut fie cu un electrod indicator din platină și un electrod de referință din sticlă ori
calomel, fie un electrod combinat (ASRO, 2009).
Modul de lucru și raportarea rezultatelor:
Aparatul trebuie să fie calibrat în prealabil la temperatura de 20°C ± 5°C, cu soluții tampon
de pH=4,00; pH=7,00 și pH=10,00. Probele nu necesită pretratare în sensul determinării valorii
pH. Ele doar se aduc la temperatura camerei sau cât mai aproape de temperatura soluțiilor etalon
(soluții tampon) cu care s-a efectuat calibrarea. Se imersează electrodul indicator de pH în proba
de analizat și simultan se imersează, de asemenea, și senzorul de temperatură simultan pentru o
determinare a pH-ului probei în funcție de temperatură. (Aparatele de ultimă generație pot avea
senzorul de temperatură inclus în electrodul combinat de pH, pentru o mai mare fiabilitate).
Valoarea pH a probei de vin se va stabiliza (în 1-2 minute, odată cu stabilizarea temperaturii
înregistrate) și se citește direct pe scala aparatului (Potlog și col., 2020). Se fac două determinări
succesive la o temperatură cât mai apropiată de 20°C (20°C ± 5°C) și se calculează media
aritmetică a acestora, valorile trebuind să nu varieze între ele cu mai mult de 0,1 unități de pH.
Media aritmetică reprezintă rezultatul final și valoarea acestuia se raportează cu două zecimale
(ASRO, 2009).
Studiile de specialitate au evidențiat modificările ce pot fi aduse vinurilor prin variația
valorii pH, atât în sens negativ cât și în sens benefic.
La vinificație, gestionarea corespunzătoare a acidității și a pH-ului este de o importanță
fundamentală, deoarece determină în final calitatea vinurilor. PH-ul unui vin este legat strict de
produsul microbiologic și stabilitatea fizico-chimică, deoarece afectează selecția de
microorganisme precum și unele reacții chimice importante, inclusiv echilibrul dioxidului de sulf
(Comuzzo și Battistutta, 2018). De asemenea, aciditatea și pH-ul joacă un rol important în
proprietățile senzoriale și echilibrul vinurilor (Comuzzo & Battistutta, 2018; Picariello și colab.,
2019).
În prezent, determinarea măsurii în care pH-ul afectează producția de vinuri de înaltă
calitate este o problemă majoră. Creșterea constantă a temperaturii în urma variației condițiilor

10
climatice pe scala globală a redus aciditatea strugurilor și în consecință a produs creșterea
nivelului pH-ului vinului (Van Leeuwen & Darriet, 2016). Prin urmare, probabil că vor continua
să apară consecințe asupra comportamentului chimic al metaboliților susceptibili la fluctuații de
pH (Forino M. și col., 2020).
O altă metodă aplicată în paralel de către Forino M. și col., 2020, a fost cea a indicelui
precipitațiilor salivei. pH-ul are un impact mare asupra reactivității taninurilor cu saliva umană,
determinând astfel astringența specifică vinului, percepută precum o uscăciune în timpul
degustării. Acesta este în principal rezultatul precipitațiilor taninurilor din vin datorate
interacțiunilor cu proteine salivare. Astringența crește pe măsură ce valoarea pH-ului scade. În
plus, taninurile au crescut ușor pe măsură ce pH-ul a crescut, dar reactivitatea taninurilor față de
salivă a scăzut confirmând rolul decisiv al pH-ului și asupra astringenței vinului (Forino M. și col.,
2020).
Variații ușoare ale pH-ului influențează proprietățile senzoriale și stabilitatea vinurilor
(Forino M. și col., 2020). Studiile de specialitate au arătat că solubilitatea antocianilor a scăzut
odată cu creșterea pH-ului. O scădere semnificativă a solubilității a fost observată la pH 3,3.
Analiza vinurilor bazată pe RMN, la un eșantion de probe cu pH variabil ajustat între 3,2 și
3,9 a arătat ca extracția de antociani s-a dovedit din ce în ce mai mică pe măsură ce pH-ul probelor
a crescut. S-a dovedit că alte molecule de interes enologic, în principal catechine și cinamate, sunt
afectate de pH-ul probelor. În plus, taninurile au crescut ușor pe măsură ce pH-ul a crescut, dar
reactivitatea taninurilor față de salivă a scăzut confirmând rolul decisiv al pH-ului și asupra
astringenței vinului (Forino M. și col., 2020). De asemenea, rezultatele au indicat o scădere a
nivelului rezistenței la oxidare a vinurilor care prezentau pH-uri mai ridicate (Forino M. și col.,
2020).
Aceleași caracteristici obținute prin analiza RMN au fost confirmate și prin
spectrofotometrie. În timp ce metoda RMN este capabilă să permită o cuantificare a moleculelor
prezente în soluție, metoda spectrofotometrică determină concentrația de antociani la 420 nm și
520 nm a două soluții tamponate, determinând astfel intensitatea culorii vinurilor.
După cum era de așteptat, în studiul efectuat de către Forino și colab., 2019, intensitatea
culorii vinurilor a scăzut pe măsură ce pH-ul vinurilor a crescut datorită a două efecte diferite: i)
intrinsec - continut redus de pigmenti in vinuri; și ii) schimbarea antocianinei - echilibru față de
formele lor incolore (Forino și colab., 2019).

3.2.4. Determinarea antocianilor din vin

Principiul metodei:
Conținutul de antociani se determină prin metoda variației pH-ului. În mediu acid există un
echilibru între formele colorate și formele incolore ale antocianilor. Acest echilibru este în funcție
de pH. Variația intensității colorante între două valori de pH este proporțională cu conținutul de
antociani. Se alege pH= 0,6 și pH= 3,5. Prin această variație funcția fenolică nu este afectată și se
admite că ceilalți compuși fenolici (taninuri) nu interferează determinarea. Exprimarea
conținutului de antociani se exprimă în mg/L și se face cu ajutorul curbei de etalonare trasată pe
baza diferenței de absorbanță la lungimea de undă 520 nm dintre cele două soluții analizate.
Mod de lucru:
- Reactivii necesari sunt:
o Reactiv 1: etanol 96° cu 0,1% HCl concentrat
o Reactiv 2: soluție HCl 2% cu pH = 0,6
o Reactiv 3: soluție tampon cu pH = 3,5 preparată din fosfat disodic și acid citric

11
 Într-un balon de volum 100 mL se pune 0,1 mL HCl(conc.37%) și se aduce la semn cu
etanol 96°, aceasta fiind soluția de HCl 0,1% ce va fi utilizată în analiză (reactiv 1).
Într-un alt balon 100 mL se vor pune 2 mL HCl 37% și se va aduce la semn cu apă ultra
pură, iar apoi se va regla pH-ul cu acid acetic 10% (pentru a scădea pH-ul) sau cu NaOH 10%
(pentru a crește pH-ul), rezultând astfel soluția HCl 2% cu pH= 0,6 (reactiv 2).
Descriere cum se face sol tampon pH 3,5 cu fosfat disodic si acid citric (reactiv 3).
Apoi pentru analiza probelor de vin, s eintroduc într-o eprubetă 1mL probă vin, 1 mL
reactiv 1 (sol etanol cu HCL 0,1%) și 10 mL reactiv 2 (sol HCl 2% cu pH=0,6).
În altă eprubetă se introduc 1 mL probă vin, 1 mL reactiv 1 (sol etanol cu HCL 0,1%) și 10
mL reactiv 3 (soluție tampon cu pH = 3,5).
Se măsoară absorbanțele probelor din cele două eprubete cu ajutorul unui spectrofotometru
la lungimea de undă 520 nm, față de apă distilată. Diferența dintre cele două absorbanțe se
raportează pe o curbă etalon, care indică direct conținutul vinului în antociani.
Calcul rezultat:
Pe baza unei curbe de etalonare specificate în metoda de analiză, se interpolează pe grafic
diferența dintre cele două absorbanțe și se exprimă direct în mg antociani la 1 mL vin luat în
analiză. Ulterior se exprimă rezultatul la 100 mL vin.

3.2.5. Determinarea glucidelor reducătoare (glucoză, fructoză, zaharoză) din

vin

SR 6182-18 / 2009 Partea 18. Determinarea zahărului reducător + Erată, stabilește

metodele de determinare a conținutului de zahăr reducător , mai exact a cantității de zaharuri cu
funcție cetonică și aldehidică (precum glucoza, fructoza, maltoza, lactoza, zahărul invertit etc.) pe
baza proprietății lor de a reduce direct o soluție alcalină a unei sări de cupru.
STAS 6182 / 17 – 81 denumit Determinarea zaharozei, stabilește metodele de determinare
și de identificare a zaharozei din vin. Determinarea se face prin invertire iar această metodă are o
sensibilitate de 0,0095 g. Identificarea zaharozei se poate face colorimetric sau prin cromatografie
în strat subțire. Identificarea colorimetrică are o sensibilitate de 0,002 g zaharoză iar identificarea
prin cromatografie în strat subțire are o sensibilitate de 2,5 μg zaharoză. Rezultatele obținute se
exprimă în g/L (IRS, 1981).
Glucoza, fructoza dar și glicerolul și acizii malic, tartric, citric și acetic pot fi determinați si
prin tehnica cromatografiei de lichide cu ajutorul unui echipament de tip HPLC (Li și col., 2017)
Însă cea mai modernă și mai frecvent utilizată metodă este metoda spectrofotometrică
pentru care se folosesc kituri enzimatice de determinare a cantității de zaharoză, glucoză și
fructoză (kit enzimatic Sucroză/D-glucoză/D-fructoză).
Principiul metodei:
Concentrația de D-glucoză este determinată înainte și după hidroliza enzimatică a zaharozei;
D-fructoza este determinată ulterior la determinarea D-glucozei.

- Determinarea D-glucozei înainte de inversia enzimatică:

La pH 7,6 enzima hexokinaza (HK) catalizează fosforilarea D-glucozei prin adenozină-5'-
trifosfat (ATP) cu formarea simultană de adenozin-5'-difosfat (ADP) (1).
(1) D  Glucoza  ATP 
HK
G  6  P  ADP

În prezența glucozei - 6 - fosfat dehidrogenazei (G6P - DH), D-glucoza-6-fosfat (G-6-P)

formată este oxidată în mod specific de nicotinamidă-adenină dinucleotid fosfat (NADP) la
fosfat D-gluconat-6 fosfat cu formarea de nicotinamidă-adenină dinucleotidei fosfat reduse
(NADPH)(2)

12
 ( 2) G  6  P  NADP  G
 6 P  DH
  D  gluconat  6  fosfat  NADPH  H 

NADPH format în această reacție este stoechiometric egal cu cantitatea de D-glucoză și

este măsurat prin determinarea absorbanței la lungimea de undă 334nm, 340nm sau
365 nm.

- Determinarea D-fructozei:
Hexokinaza catalizează, de asemenea, fosforilarea D-fructozei în D-fructoză-6-fosfat
(F-6-P) cu ajutorul ATP (3)
(3) D  Fructoza  ATP HK
 F  6  P  ADP

La finalizarea reacției (3), F-6-P este transformată prin fosfoglucoză izomerază (IGP) în
G-6-P (4)
( 4) F  6  P PGI

 G6P

G-6-P reacționează din nou cu NADP formând D-gluconat-6 fosfat și NADPH (2).
Cantitatea de NADPH formată acum este stoechiometric egală cu cantitatea de D-fructoză.

- Inversia enzimatică (și determinarea zaharozei):

La pH 4,6, zaharoza este hidrolizată de enzima ß-fructozidaza (invertază) la D-glucoză și
D-fructoză (5)
 fructozidaza
(5) Sucroza  H 2 O B   D  glucoza  D  fructoza

Determinarea D-glucozei după inversia (totală a D-glucozei) se realizează conform

principiului prezentat mai sus.
Conținutul de zaharoză este calculat prin diferența concentrațiilor D-glucozei înainte și
după inversia enzimatică.
Modul de lucru:
Kiturile enzimatice conțin flacoane cu soluții gata pregătite pentru determinarea unui numar
prestabilit de analize.
- Kitul Enzymatic BioAnalysis/R-Biopharm (Art.Nr.10 7160 260 035)
o Sticla 1 – reactiv 1 (aprox. 0,5 g liofilizat): un flacon
o Sticla 2 – reactiv 2 (aprox. 7,2g mixtură pudră): un flacon
o Sticla 3 – reactiv 3 (aprox. 1,1 mL suspenise): un flacon
o Sticla 4 – reactiv 4 (aprox. 0,6 mL suspenise fosfoglucoză izomerază): un flacon
o Sticla 5 – calibrator zaharoză: un flacon
o Sticla 6 – calibrator D-glucoză: un flacon
Reactivii 1și 2 sunt stabili timp de 4 săptămâni dacă sunt păstrați la temperatura de 2-
8°C sau sunt stabili timp de 2 luni dacă sunt păstrați la temperatura de -15°C – -25°C.
Ceilalți reactivi au valabilitate până la data de expirare inscripționată pe eticheta.
Reactivii se aduc la temperatura camerei (20-25°C) înainte de a fi utilizați. În utilizarea
kit-ului se aplică regulile generale de siguranță pentru activitățile specifice
laboratoarelor. A se evita contactul cu pielea și zonele cu mucoase.
Probele aduse la 20-25˚C, puse în cuve din sticlă sau plastic având lungimea drumului optic de 1
cm, se testează pentru absorbanță la lungimea de undă 340 nm (365 nm sau 334 nm) față de aer,
cu ajutorul unui spectrofotometru UV-VIS. Rezultatul obținut se exprimă raportându-se la
volumul de 100 ml (adică g/100 ml) (R-Biopharm).
Calcul rezultat:
Ecuația generală aplicată pentru calcularea rezultatelor este următoarea:

13
 V  MW V = volum final (mL)
c * A g / L
  d  v 1000 v = volum probă (mL)
MW = masa moleculară a substanței de analizat (g/mol)
d = lungime drum optic (cm)
Ɛ = coeficient extincție a NADPH la lungimea de undă
Hg 340 nm = 6,3 (L•mmol-1•cm-1)
Hg 365 nm = 3,5 (L•mmol-1•cm-1)
Hg 334 nm = 6,18 (L•mmol-1•cm-1)
Prin urmare, formulele de calcul adaptate pentru fiecare parametru devin următoarele:
- pentru Zaharoză:
10,34
c * Azaharoza  g / L


- pentru D-glucoză:
5,441
c * Aglucoza  g / L


- pentru D-fructoză:
5,477
c * A fructoza  g / L 


Determinarea glucidelor reducătoare din vin are rolul de a le încadra în categoriile: sec,
demisec, demidulce, dulce. Legislația în vigoare la momentul actual în România reglementează
prezența zaharinei în vinuri la cantitatea de 17,01 – 32,0 g/L pentru vinurile seci, 32,01 – 50,0 g/L
pentru vinurile demiseci și peste 50 g/L pentru vinurile dulci (H.G. nr.512/2016). Totodată mai
există recomandarea prezenței raportului de 10 g/L glucoză : 10 g/L fructoză pentru vinuri (Ordin
nr.XX)

3.2.6. Determinarea polifenolilor totali din vin

Principiul metodei:
Polifenolii sunt compuși chimici aromatici cu mai multe grupări hidroxil inserate pe
nucleul aromatic. Datorită acestei structuri au proprietăți redox, putând fi oxidați de reactivul Folin
Ciocâlteu cu formarea unei colorații albastre cu maximul de absorbție la 750 nm.
Conținutul total de compuși fenolici a fost evaluat prin metoda spectofotometrică Folin-
Ciocâlteu în varianta descrisă de Singleton si revizuita (Singleton si colab., 1999). Metoda se
bazează pe reducerea chimică a acestui reactiv (un amestec de fosfowolframați si fosfomolibdați)
cu apariția culorii albastre, a cărei intensitate poate fi masurată la 750 nm. Compușii albaștri
formați între fenolați și reactivul Folin-Ciocâlteu sunt combinații complexe între centrul metalic și
compușii fenolici.
Modul de lucru:
Reactivii necesari sunt:
- Metanol 80%
- Reactiv Folin-Ciocâlteu
- Soluție Na2CO3 20 %
- Soluție stoc acid galic 100ug/ml.
Dozarea polifenolilor:

14
 Proba diluată corespunzator (0,5 ml) se aduce într-un balon cotat de culoare brună de
volum 25 ml, peste care se adaugă 0,25 ml reactiv Folin-Ciocâlteu și 4,75 ml apă distilată. Se
incubează 10 min la întuneric în vederea formării compușilor colorați, după care se aduce la semn
cu Na2CO3 20% și apoi se citește imediat absorbanța la lungimea de undă de 750 nm față de un
martor preparat asemănător, dar în care extractul probei este înlocuit cu apă ultra pură.
Calcul rezultat:
Pentru calcularea rezultatelor se realizează o curbă de etalonare folosind o soluție stoc de
acid galic 100µg/ml. Din această soluție se prepară o serie de etaloane de concentrații cunoscute și
crescătoare (între 20 – 100 µg/ml). Se realizează reacția de culoare pentru fiecare etalon și se
determină absorbanța soluțiilor la lungimea de undă 750 nm.
Se trasează curba etalon, reprezentând grafic absorbanțele citite la spectofotometru pentru
etaloane în funcție de concentrațiile acestora.

Fig. Curba de etalonare pentru calcularea polifenolilor totali

Aplicând o fitare liniară curbei din fig., s-a obținut ecuația dreptei: Y=0.011x+0.00993

Densitățile optice ale probelor sunt tranformate în termeni de concentrație cu ajutorul acestei
ecuații, luându-se în considerare și diluțiile efectuate pentru încadrarea pe curba absorbanțelor
obținute pentru probe. Rezultatele sunt exprimate în mg echivalent acid galic/ml (mgGAE/ml).

3.2.7. Determinarea concentrației alcoolice din vin (% vol.)

Concentrația alcoolică a vinului reprezintă conținutul de alcool etilic al vinului exprimat în

procente de volum (% vol.) la temperatura de 20°C (IRS, 1970). STAS 6182 / 6 – 70 denumit
Determinarea concentrației alcoolice, definește și descrie metodele de dublă distilare și
determinare a concentrației alcoolice (cu ajutorul picnometrului, metodă ce are o sensibilitate de
0,05% vol.) și cea de distilare simplă și determinare a concentrației alcoolice (cu ajutorul
picnometrului, alcoolmetrului sau refractometrului, metodă ce are o sensibilitate de 0,1% vol.)
(IRS, 1970). Picnometrul este un dispozitiv din sticlă (asemănător unui balon cotat sau pahar
Erlenmeyer ca formă), calibrat, cu dop cu slif și care poate avea gât gradat, cu ajutorul căruia se
determină densitatea. Apoi corelând densitatea cu temperatura se determină concentrația alcoolică
a vinului. Alcoolmetrul este un aparat prevăzut cu sondă de determinare rapidă a concentrației
alcoolice prin imersarea acesteia în proba de analizat și afișarea rezultatului pe ecranul
dispozitivului.

15
 Pentru metoda refractometrică se utilizează un refractometru care să poată determina
indicii de refracție cuprinși între 1,333 și 1,346 cu o eroare maximă de 2 • 10-5. Pentru acesta
temperatura trebuie să fie determinată cu precizie de minim 0,05°C. Apoi se stabilește o
corespondență între indicii de refracție și concentrația alcoolică. Tabelul de corespondență între
indicii de refracție și concentrația alcoolică trebuie să fie stabilit cu amestecuri de alcool etilic și
apă provenite din vinuri a căror concentrație alcoolică a fost determinată prin metoda cu
picnometrul, pentru a ține seamă de impuritățile alcoolice (în special alcooli superiori) ale
distilatelor din vin care au o influență diferită asupra densității și asupra indicelui de refracție.
Modul de lucru: Distilatul adus exact la volumul inițial al probei luate pentru distilare este
luat câteva minute într-o baie la temperatura ambiantă pentru a-l aduce la o temperatură foarte
apropiată de aceea a prismei refractometrului.
Se notează indicele de refracție citit, temperatura aparatului și temperatura lichidului.
Indicele de refracție este corectat în funcție de temperatură, cu ajutorul unor tabele anexe care
însoțesc aparatul. Concentrația alcoolică se citește din tabelul de corespondență care însoțește de
asemenea aparatul. Dacă refractometrul este prevăzut cu un termostat reglat la temperatura 20 ±
0,05°C, nu mai este necesară folosirea tabeluilui de corecție pentru temperatură.
Determinarea concentrației alcoolice se mai poate face și prin tehnica gaz cromatografiei
cu ajutorul unui echipament GC cu detector cu ionizare în flacără (Valentin și col., 2020).

3.2.8. Determinarea îndulcitorilor sintetici (aspartam, acesulfam de K,

zaharină și sărurile sale de Na, K și Ca) din vin

În conformitate cu normele de producție și calitate ale vinului, legislația în vigoare prevede

că mascarea defectelor și aducerea de modificări asupra vinurilor prin adăugări diverse care
determină schimbări ale gustului, aromei și compoziției naturale, constituie produse contrafăcute.
Acest tip de fraudă este sancționat conform legislației în vigoare. Un exemplu al acestor aditivi
sunt îndulcitorii sintetici care, deși sunt interzisi, pot fi găsiți în vinuri. Consumul de îndulcitori
sintetici poate afecta sănătatea consumatorului și de asemenea, consumul de vinuri îndulcite în
mod fraudulos poate fi un real pericol pentru cei care prezintă afecțiuni care pot fi agravate de
consumul de produse dulci. (Cerchezan și col., 2020).
Industria alimentară și a băuturilor a căutat de mult timp să se alinieze standardelor
internaționale privind orientările și reglementările referitoare la aportul suplimentar de zahăr din
partea Organizației Mondiale a Sănătății. Se recomandă un nivel de zahăr adăugat de până la 5-
10%, fapt care duce la utilizarea crescută a îndulcitorilor non-calorici (OMS, 2015). Îndulcitorii
sintetici există în industria alimentară încă din anii 1800 și au fost adesea un subiect controversat.
Adăugarea de îndulcitori non-calorici (NNS) la anumite produse ridică problema efectului
cumulativ al aditivilor, precum și a posibilei depășiri a aporturilor zilnice acceptabile (ADI). Peste
tot în lume, acesulfamul K și aspartamul au fost îndulcitorii evaluați cel mai frecvent, iar datele
din diferite studii au arătat că aportul a fost redus cu privire la nivelul preocupărilor toxicologice.
Interesul principal este potențiala asociere între îndulcitorii cu un nivel scăzut de calorii sau cei
fără calorii și sănătatea populației, cu o atenție deosebită asupra modificărilor microbiotei
intestinale, a gestionării greutății și obezității, a sănătății cardiometabolice și a diabetului (Martyn
et al., 2018; Reid și colab., 2016 ; Rogers și colab., 2016). Cercetarea este concentrată în zilele
noastre pe efectele metabolice ale aportului de îndulcitori non-nutritivi. Efectul asupra microbiotei
intestinale, care poate declanșa intoleranța la glucoză (Palmnas et al., 2014; Suez et al., 2014) și
interacțiunea cu noi receptori ai gustului dulce descoperiți în țesuturile care nu au rol în perceperea
gustului, inclusiv intestinul și pancreasul care pot influența secreția de insulină (Jang și colab.,
2007; Corkey, 2012) sunt menționate în numeroase studii care dovedesc că NNSs provoacă
tulburări metabolice la subiecții umani (Suez și colab., 2014; Jang și colab., 2007; Corkey, 2012;

16
Brown și colab. ., 2009). De asemenea, datele de la cinci specii diferite de mamifere (umane,
șobolani, șoareci, porci etc.) au arătat că NNS-urile pot fi metabolizați activ (Corkey, 2012; Moran
și colab., 2010; Mitsutomi și colab., 2014). Este clar că vechiul concept conform căruia NNS-urile
sunt inerte metabolic nu mai este adevărat (Pepino, 2015). Reglementările divergente mențin o
dezbatere largă cu privire la impactul îndulcitorilor asupra siguranței alimentare, a sănătății
consumatorului și a stilului de viață al oamenilor (Carocho et al., 2017). Utilizarea îndulcitorilor
este reglementată în funcție de potențialele efecte toxicologice ale acestora, de aplicațiile propuse
și de nivelul de utilizare a produselor alimentare. Expunerea populației la aceste substanțe poate fi
monitorizată prin evaluarea nivelului concentrației îndulcitorilor din produs și a datelor de consum
ale acelui produs (OMS, 2015; D. Martyn et al. 2018).
Pentru a evita toate aceste inconveniente pentru consumatori și pentru combaterea fraudei
în sectorul vinicol, au fost dezvoltate diferite metode de analiză.
STAS 6182/42-83 este un standard de stat din România recomandat pentru identificarea
îndulcitorilor sintetici adăugați fraudulos în vin care stabilește metodele de identificare a zaharinei,
dulcinei, P-4000 și ciclamatului prin cromatografie în strat subțire, după extracția selectivă sau
după extracția simultană a îndulcitorilor. Prin cromatografia în strat subțire după extracția
selectivă a îndulcitorilor poate fi identificat un conținut de zaharină de minim 3,0 mg/L, de dulcină
de minim 1,0 mg/L, de P-4000 de minim 1,4 mg/L și de ciclamat de minim 50,0 mg/L, metoda
având o sensibilitate de 2,0 µg pentru zaharină, de 0,3 µg pentru dulcină, de 0,5 µg pentru P-4000
și de 5,0 µg pentru ciclamat. Prin cromatografia în strat subțire după extracția simultană a
îndulcitorilor poate fi identificat un conținut de zaharină de minim 10,0 mg/L, de dulcină de
minim 10,0 mg/L și de ciclamat de minim 50,0 mg/L, metoda având o sensibilitate de 5,0 µg
(MAIA, 1983).
Pentru determinarea îndulcitorilor artificiali au fost, de asemenea, dezvoltate metode
cromatografice de lichide și gaze, dar întrucât acești compuși de interes prezintă o volatilitate
scăzută, cromatografia de gaze a fost aproape abandonată pentru acest scop. Au fost raportate mai
multe metode bazate pe RP-HPLC cu detectoare UV sau DAD pentru determinarea aspartamului,
zaharinei, ciclamatului, acesulfamului K și steviosidului în diferite alimente precum băuturi,
conserve, înghețată de fructe și alte deserturi lactate (Shah și Jager, 2017) . Principalele probleme
în dezvoltarea unei metode HPLC-UV pentru NNS sunt structura chimică diferită și efectul
matricei eșantionului. Aceste dezavantaje pot fi depășite parțial atunci când se utilizează HPLC
cuplat cu spectrometrie de masă (MS / MS). De asemenea, cu acest tip de metodă pot fi atinse o
specificitate și o sensibilitate mai ridicate. S-au dezvoltat unele metode HPLC ESI-MS / MS, atât
în modul cu ioni negativi (Zygler și colab., 2011) cât și în modul de monitorizare a reacțiilor
multiple (Lim et al., 2013).

Aspartam

Acesulfam K Zaharină

17
 Figura 1. Structura chimică a celor trei cei mai utilizați îndulcitori sintetici

Legislația europeană reglementează utilizarea a nouă îndulcitori artificiali în produsele

alimentare specificate. Cele mai frecvente NNS din alimente la momentul actual sunt: acesulfamul
K (E950), aspartamul (E951) și zaharina și sărurile sale de Na, K și Ca (E954) (fig. 1).
Prin urmare, am evidențiat frecvența îndulcitorilor sintetici la vinurile îmbuteliate cu o
metodă de cromatografie lichidă. Am dezvoltat o metodă cromatografică de lichide fiabilă pentru
determinarea prezenței acesulfamului K, aspartamului și zaharinei și sărurilor sale de Na, K și Ca
în matricea de vin, utilizând un echipament UPLC-UV. Această metodă stabilește modul de
identificare și cuantificare a trei dintre îndulcitorii sintetici cel mai frecvent întâlniți în matricea
vinului (acesulfam K - E950, aspartam - E951 și zaharină - E954) prin cromatografie lichidă ultra
performantă (UPLC) cu detecție UV. Metoda prezintă selectivitate, limită de detecție și
cuantificare, liniaritate, precizie (repetabilitate și reproductibilitate), acuratețe (bias și recuperare).
Parametrii metodei au fost evaluați după cum urmează: selectivitate, liniaritate, sensibilitate,
precizie, repetabilitate, reproductibilitate, limite de detecție, limite de cuantificare, domeniu de
lucru și recuperări. După validare, metoda a fost utilizată pentru a analiza eventuala prezență a
acestor trei îndulcitori artificiali în 20 de probe de vinuri îmbuteliate.

Materiale și metodă adaptată

Materiale
Pentru acest studiu au fost utilizate standarde analitice ale acesulfamului K (ACS-K),
aspartamului (ASP) și zaharinei de sodiu (SAC). Sulfat de hidrogen tetrabutilamoniu (97%) și
acetatul de sodiu anhidru au fost utilizate pentru faza mobila, precum și metanolul de grad HPLC.
Probele de vin au fost de tip îmbuteliate, fiind achiziționate de pe piața locală.
Prin metoda prezentată au fost analizate vinurile roșii, rose și albe clasificate drept seci,
demiseci, demidulci și dulci. Probele au fost păstrate la 4-6 ° C până la analiză.

18
Soluții standard și pregătirea probelor
Soluțiile standard stoc au fost preparate în metanol 10% cu următoarele concentrații: 2500
mg / L pentru ACS K, 4000 mg / L pentru ASP și 1000 mg / L pentru SAC. Aceste soluții stoc au
fost utilizate în volume diferite pentru fiecare dintre ele pentru a pregăti o soluție standard mixtă
de lucru care conține 10 mg / L ACS K, 40 mg / L ASP și 10 mg / L SAC.
Pentru obținerea curbei de calibrare, s-au pregătit cinci niveluri standard prin diluarea
soluției standard de lucru în amestec cu apă ultrapură. Soluțiile standard stoc și soluția standard
mixtă de lucru au fost păstrate la 4-6°C înainte de utilizare.
Probele de vin au fost sonicate pentru a elimina posibilele gaze dizolvate, apoi au fost
diluate corespunzător cu apă ultrapură. După diluare, eșantioanele au fost filtrate folosind capsule
cu membrana filtranta PVDF atasabile la seringa, avand dimensiunea porilor de 0,45 um și filtratul
a fost introdus în flacoane speciale UPLC pentru analiză instrumentală.
Probele de testare fortificate au fost preparate prin fortificare la nivelul de 40 mg / L ACS
K, 60 mg / L ASP și 40 mg / L SAC.

Metoda cromatografică
Pentru identificarea și cuantificarea celor trei îndulcitori sintetici din vinuri prin metoda
cromatografiei de lichide, am folosit un echipament UPLC Waters Acquity cu detector UV. Separarea
a fost realizată cu o coloană Luna Omega C18 (1,6 um, 100 Å, 2,1 mm x 100 mm), la 22 ° C, prin
eluție izocratică cu debit de 0,2 ml / min. Faza mobilă a constat într-un amestec de doi solvenți: 400 ml
de 5 mM tetrabutilamoniu hidrogen sulfat și soluție de acetat de sodiu anhidru 6,1 mM preparată în
apă ultrapură si 171 ml metanol 100%. Solvenții au fost degazați înainte de utilizare. Volumul
injecției a fost de 2,0 ul iar timpul de rulare a fost de 15 minute. Detectarea îndulcitorilor artificiali a
fost efectuată la 220 nm. Datele au fost colectate și procesate folosind software-ul Empower 2.

Rezultate și discuții
Metoda cromatografică descrisă a fost aplicată pentru cuantificarea celor trei îndulcitori
sintetici. După diluarea soluțiilor stoc, fiecare analit a fost injectat pe rând, pentru a determina
succesiunea lor. Toți cei trei îndulcitori au fost identificați în cromatograma obținută pentru soluția
standard mixtă, în următoarea ordine: ASP (5,98 minute de retenție), ACS K (6,95 min timp de
retenție) și SAC (10,01 min timp de retenție). Analiza a evidențiat o bună separare a celor trei
compuși, indicată prin rezoluție, forma pick-urilor și simetrie (fig. 2). Ținând cont de timpii de
retenție și lățimea maximă, valorile calculate pentru rezoluție au fost 28,7 pentru ASP, 2,3 pentru
ACS K și 6,5 pentru SAC.
Metoda a fost validată pentru a demonstra caracteristicile de performanță adecvate pentru
utilizarea în scopul propus (Barwick și colab., 2014). Au fost stabiliți și confirmați parametrii de
validare specifici (Barwick și colab., 2014).
Selectivitatea este abilitatea unei metode de a măsura diferențele de analiză în prezența altor
compuși care se comportă similar (Rusea, 2016). Au fost înregistrate absența interferențelor și
identificarea clară a fiecărui compus. Pick-urile sunt complet evidențiate, fără a se suprapune (fig.
2).

19
 Figura 2. Cromatograma soluției standard mix

Limita de detecție (LOD) a unei metode analitice individuale este cea mai mică cantitate de
analit din proba de testare care poate fi detectată, dar nu înseamnă că poate fi cuantificată ca
valoare exactă (Rusea, 2016). Un raport semnal-zgomot de 3 a fost evaluat pentru LOD.
Valorile determinate pentru LOD au fost 1,4 mg / L pentru ASP, 0,3 mg / L pentru ACS K și 0,2
mg / L pentru SAC.
Limita de cuantificare (LOQ) este cea mai mică cantitate de analit din proba de testare care
poate fi determinată cantitativ cu repetabilitate și acuratețe acceptabile (Rusea, 2016). Evaluarea a
fost făcută luând în considerare valorile LOD de trei ori. Rezultatele obținute pentru LOQ au fost
4,2 mg / L pentru ASP, 0,9 mg / L pentru ACS K și 0,6 mg / L pentru SAC.
Domeniul de lucru este intervalul dintre concentrația inferioară și superioară a analitului
într-un eșantion pentru care metoda analitică a fost adecvată (Rusea, 2016). În general, este mult
mai larg decât domeniul liniar. Domeniul nostru de lucru a fost stabilit între 4,0 mg / L și 40,0 mg
/ L pentru ASP, 1,0 mg / L și 40,0 mg / L pentru ACE K și 0,5 mg / L și 40 mg / L pentru SAC.
Linearitatea este abilitatea unei metode de a furniza rezultate direct proporționale cu
concentrația de analit pe un domeniu stabilit (Rusea, 2016). Analiza cantitativă a fost efectuată
folosind metoda de calibrare externă. Curba de calibrare a fost obținută cu soluții standard cu
cinci niveluri de concentrare, cu trei injecții pentru fiecare nivel. Coeficientul de corelație a fost
mai mare de 0,99 pentru toți cei trei îndulcitori artificiali. Valorile obținute pentru r2 au fost
0,9974 pentru ASP, 0,9959 pentru ACS K și 0,9935 pentru SAC.
Sensibilitatea analitică este modificarea ca răspuns a unui instrument de măsurare împărțit
la schimbarea corespunzătoare a stimulului (Rusea, 2016). Ea exprimă capacitatea unei metode de
a înregistra mici variații ale concentrației unui anumit analit și am confirmat că această metodă
are sensibilitate analitică.
Acuratețea unei metode analitice exprimă cât de aproape de valoarea experimentală este
valoarea reală. Indică concordanța dintre valoarea medie a unui set de rezultate și o valoare de
referință acceptată (Rusea, 2016). Măsura încrederii este exprimată în termeni de părtinire care
reprezintă o eroare sistematică totală. Biasul nostru este de 6,9% pentru ASP, 4,5% pentru ACS K
și 6,8% pentru SAC.
Repetabilitate sau precizia înseamnă rezultatele apropiate dintr-o serie de măsurători
obținute de la diferite alicote ale acelorași probe omogene, în aceleași condiții (Rusea, 2016). Este
exprimată ca o abatere standard relativă (RSD%) și este o componentă a incertitudinii de
măsurare. Repetabilitatea a fost evaluată prin injectarea de 6 ori la rând a trei niveluri ale soluției
standard mixte. Valorile medii obținute pentru RSD au fost 1,6% pentru ASP, 2,1% pentru ACS
K și 1,9% mg / L pentru SAC.
Reproductibilitatea este atunci când repetabilitatea este făcută de un alt analist, sau folosind
un alt echipament (cu aceeași configurație), sau într-un alt laborator, dar urmând aceeași
procedură analitică pentru analiza aceluiași eșantion. Pentru acest studiu, reproductibilitatea a fost
evaluată prin analizarea acelorași trei niveluri de soluție standard mixtă, de 6 ori la rând de către

20
doi analiști. Valorile medii înregistrate pentru RSD au fost 8,4% pentru ASP, 7,3% pentru ACS K
și 4,4% mg / L pentru SAC.
Recuperarea este procentul din concentrația reală a unei substanțe recuperate în timpul
procedurii analitice. Este o măsură a eficienței metodei pentru detectarea tuturor analitelor (Rusea
D., 2016). Se exprimă ca raport între răspunsul obținut pentru eșantioanele extrase la trei
concentrații de analit și răspunsul măsurat fără etapa de extracție. Testul de recuperare a fost
efectuat analizând probe de vin fortificate cu 40 mg / L ACS K, 60 mg / L ASP și 40 mg / L SAC.
Valorile de recuperare determinate au fost 92% pentru ASP, 90% pentru ACS K și 101% SAC.
Incertitudinea de măsurare este un parametru asociat cu rezultatul măsurării care
caracterizează dispersia valorilor atribuite la măsurare. Incertitudinea înseamnă evaluarea surselor
de erori în fiecare etapă și estimarea incertitudinii asociate (Rusea D., 2016) și este o componentă
esențială a procesului de validare. Incertitudinea globală se bazează pe datele disponibile din
metoda de validare, controlul intern al calității și testele de comparație. Pentru această metodă am
stabilit o incertitudine de măsurare până la 8%.

Figura 3. Suprapunerea cromatogramelor a două probe pozitive pentru Aspartam (R3 și P3) și soluția standard mix

Metoda descrisă a fost utilizată pentru evaluarea prezenței și a conținutului celor trei NNS
în 20 probe de vin de pe piața românească. Conform datelor obținute, două probe au fost pozitive
pentru aspartam, un vin roșu sec (R3) cu 4,701 mg / L și un vin rosu dulce (P3) cu 22,858 mg / L.
Suprapunerea cromatogramelor celor două probe și cea a standardului, evidențiază prezența
aspartamului și absența celorlalți doi îndulcitori (Fig. 3). Acesulfamul K și zaharina nu au fost
detectate în niciun eșantion.

Concluzii
Metoda UPLC-UV prezentată este potrivită pentru determinarea concentrației de acesulfam
K, aspartam și zaharină adăugate fraudulos în vin. Fiabilitatea acestei metode este asigurată de
valorile obținute pentru parametrii de validare. Metoda este destul de simplă, fără a fi nevoie de o
pregătire complicată a eșantionului.

21
4. BIBLIOGRAFIE

Asociația de Standardizare din România, Comitetul Tehnic român CT 95 Produse

agroalimentare și metode de analiză, 2009, SR 6182-14: 2009 Vin Partea 14:
Determinarea valorii pH
Asociația de Standardizare din România, Comitetul Tehnic român CT 95 – Metode orizontale
de analiză a produselor agroalimentare, 2003, SR EN 1988-1 / 2003 Determinarea
sulfitului. Partea 1: Metoda optimizata Monier-Williams
Asociația de Standardizare din România, Comitetul Tehnic român CT 95 – Metode orizontale
de analiză a produselor agroalimentare, 2003, SR EN 1988-2 / 2003 Determinarea
sulfitului. Partea 2: Metoda enzimatică
Asociația de Standardizare din România, Comitetul Tehnic român CT 95 Produse
agroalimentare și metode de analiză, 2009, SR 6182-13 / 2009 Determinarea
dioxidului de sulf
Bravo M. N., Feliciano R., Silva S., Coelho A. V., Vilas Boas L. și Bronze M. R., 2008,
Analysis of trans-resveratrol: Comparison of methods and contents in Muscatel
fortified wines from Setubal region in Portugal, Journal of Food Composition and
Analysis 21 634–643
Christofi S., Malliaris D., Katsaros G., Panagou E., 2020, Limit SO2 content of wines by
applying High Hydrostatic Pressure, Innovative Food Science and Emerging Technologies
62, 102342
Comuzzo P. și Battistutta F. (2018), Acidification and pH control in red wines. In A.
Morata (Ed.). Red wine Technology (pp. 17–34). London, UK: Academic Press,
Elsevier
Costanigro M., Appleby C., Menke S.D., 2014, The wine headache Consuer perceptions of
sulfites and willingness to pay for non-sulfited wines, Food quality and preference 31, 81-
89
Forino M., Picariello L., Rinaldi A., Moio L., Gambuti A. (2020), How must pH affects
the level of red wine phenols, LWT - Food Science and Technology 129 (2020)
109546
Grützmann Arcari S., Sidinei Chaves E., Vanderlinde R., Rosier J-P, Bordignon-Luiz M-T
(2013), Brazilian fortified wines: Chemical composition, chromatic properties and
antioxidant activity, Food Research International 53 (2013) 164–173
H.G. nr. 512/2016 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Legii viei şi vinului în
sistemul organizării comune a pieţei vitivinicole nr. 164/2015
Kim D. O., Lee K.W., Lee H. J. și Lee C.Y., 2002, Vitamin C equivalent antioxidant capacity of
phenolic phytochemicals, Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 3713–3717
Lajin B. Și Goessler W., 2019, Exploring the sulfur species in wine by HPLC-ICPMS/MS,
Anaytica Chimica Acta 1092 (2019) 1-8
Li S., Bindon K., Bastian S.E., Jiranek V., Wilkinson K.I., 2017, Use of winemakeing
supplements to modify the composition and sensory properties of Shiraz wine, Journal of
Agricultural and Food Chemistry 65 1353-1364
Marchante L., Loarce L., Izquierdo-Canas P., Alanon M.E., Garcia-Romero E., Pere-Coello
M.S., Diaz-Maroto M.C., 2019, Natural extracts from grape seed and stem by-products
in combination with colloidal silver as alternative preservatives to SO2 for white
wines.Effects on chemical composition and sensorial properties, Food research
international 125 108594
Ministerul Agriculturii și Industriei Alimentare, Trustul economic și de producție pentru
viticultură și vinificație – Laboratorul de analize și control, Responsabil Chim. Aneta
Leucă Aprobat de Institutul Român de Standardizare, 1981, STAS 6182 / 17-81 Vin:

22
 Determinarea zaharozei, Editura Tehnică, București, Ediția I
Ministerul Agriculturii și Industriei Alimentare, Institutul de cercetări pentru viticultură și
vinificație – Valea Călugărească, Responsabil Ing. Ioniță Valeria, Redactat de Institutul
Român de Standardizare, Ing. Elena Costescu, 1983, STAS 6182/42-83 Vin: Identificarea
îndulcitorilor sintetici, Editura Tehnică, București, Ediția I – 1550/27
Picariello L., Rinaldi A., Forino M., Petracca F., Moio L. și Gambuti A. (2019), Modification
of the organic acid profile of grapes due to climate change alters the stability of red wine
phenolics during controlled oxidation. Vitis, 58, 127–133.
R-Biopharm, Protocol kit enzimatic EnzytecTM Liquid SO2-Total, Colorimetric assay for
wine, must and other food samples, Art.No. E8600
Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M. și Rice-Evans C., 1999, Antioxidant
activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical
Biology & Medicine 26 1231–1237
Regulamentul (CE) nr. 1333/2008 al parlamentului european şi al consiliului din 16
decembrie 2008 privind aditivii alimentari
Regulamentul (CE) nr. 1129/2011 pentru completarea Regulamentului nr. 1333/2008, 14.2.2.
vin și alte produse definite în Reg. nr. 1234/2007 și omologii fără alcool
Schelezki O.J., Antalick G., Suklje K., Jeffery D.W., 2020, Pre-fermentation approaches to
producing lower alchol wines from Cabernet Sauvignon and Shiraz: Implications for
wine quality based on chemical and sensory analysis, Food Chemstry 309 125698
Singleton V. L. și Rossi J. A., 1965, Colourimetry of total phenolics with
phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and
Viticulture, 16 144–158
Souto A. A., Carneiro M. C., Seferin M., Senna M. J. H., Conz A. și Gobbi K., 2001,
Determination of trans-resveratrol concentrations in Brazilian red wines by HPLC,
Journal of Food Composition and Analysis, 14 441–445
Valentin L., Barroso L.P., Barbosa R.M., Paulo G.A., Castro I.A., 2020, Chemical typicality
of South American red wines classified according to their volatile and phenolic
compounds using multivariate analysis, Food Chemistry 302 125340

23