XVII.4.2.

Biomarkeri ai riscului în bolile cardiovasculare

Proteina C reactivă (CRP, C-reactive protein)
Aparţine unei familii de proteine numite pentraxine, fiind formată din 5
subunităţi polipeptidice neglicozilate identice formate din 206 aminoacizi fiecare,
legate noncovalent şi aranjate spaţial sub formă de disc pentamer. Are o greutate
moleculară de 120 kDa şi migrează electroforetic în fracţiunea gama-globulinelor.
Face parte din categoria „proteinelor de fază acută” pozitive (proteine
plasmatice a căror concentraţie creşte în cursul „răspunsului de fază acută”).
Denumirea iniţială de proteină C–reactivă provine de la proprietatea serului bolnavilor
cu afecţiuni inflamatorii acute de a precipita polizaharidul C din extractele
pneumococice.
CRP se leagă de fosfocolina din membrana celulelor lezate sau moarte sau de
pe suprafaţa unor bacterii, formând un complex care activează sistemul
complementului, care facilitează apoi înlăturarea acestora de către fagocite. Acest
proces de acoperire a agenţilor patogeni cu proteine pentru a stimula
fagocitoza se numeşte opsonizare.
Sinteza hepatică a CRP indusă de IL-6 creşte rapid în primele 6 ore de la
debutul reacţiei inflamatorii, concentraţia acesteia crescând de până la de 3000 de
ori valoarea normală. Este cel mai sensibil marker de fază acută (superior VSH).
Valori crescute apar în inflamaţiile acute şi cronice, infecţii bacteriene, traumatisme
severe, intervenţii chirurgicale, proliferări neoplazice, infarct miocardic acut. CRP nu
este un indicator specific dar are valoare ca marker general.
În mod normal în sânge se găsesc concentraţii minime de CRP, creşterea
concentraţiei fiind caracteristică infecţiilor acute sau inflamaţiei (valori >10 mg/L).
Rolul patogenic al CRP în bolile cardiovasculare (BCV)
BCV aterosclerotică este un grup de afecțiuni ale inimii și vaselor de sȃnge
cauzate de ateroscleroză, care includ boala coronariană (angină, infarct miocardic
acut), boala cerebrovasculară (accident vascular cerebral), boală arterială periferică
(disecție de aortă, arteriopatie obliterantă cronică a membrelor inferioare).
Legătura dintre inflamaţie şi ateroscleroză este bine stabilită. Inflamaţia este
element cheie în procesul aterosclerotic şi contribuie în toate stadiile acestuia
(formarea şi creşterea plăcii, ruptura plăcii).
Astfel, este de aşteptat ca nivelele serice ale markerilor inflamaţiei să
contribuie la stratificarea riscului pacienţilor candidaţi la boli cardiovasculare.
În plus, modificări ale stilului de viaţă – scăderea în greutate, dieta alimentară,
exerciţiile fizice şi oprirea fumatului, împreună cu administrarea de medicamente cum
ar fi statinele (inhibitori ai enzimei HMG-CoA reductaza implicată în sinteza
colesterolului) determină scăderea valorilor CRP şi a riscului cardiovascular.
Testele tradiţionale de evaluare a CRP (latex-aglutinare) nu sunt însă suficient
de sensibile pentru a detecta nivelele joase ale inflamaţiei, necesare evaluării riscului
cardiovascular. Folosirea CRP ca şi biomarker al patologiei cardiovasculare a devenit
accesibilă atunci când a fost dezvoltat un nou test CRP de înaltă sensibilitate
(hsCRP), având ca şi principiu de determinare metoda ELISA.
Proteina C reactivă ultrasensibilă (High-Sensitivity C-Reactive Protein,
hsCRP)
Se referă de fapt la aceeaşi CRP descrisă anterior, dar datorită metodelor noi
imune ce utilizează anticorpi monoclonali şi pot detecta CRP la concentraţii mai mici
de 1 mg/L a primit numele de hsCRP.
 Testarea hsCRP este indicată în determinarea riscului pentru bolile
cardiovasculare la pacienții cu risc intermediar (riscul SCORE la 10 ani de 10-20%)
de a dezvolta BCV, fără inflamație sau infecție. În funcţie de valorile obţinute pacienţii
sunt grupaţi astfel:

- < 1 mg/L - risc scăzut de a dezvolta boli cardiovasculare

- 1-3 mg/L - risc mediu
- > 3 mg/L - risc înalt
- > 10 mg/L - evaluarea pacientului pentru prezenţa altor patologii
inflamatorii, infecţii acute.

Utilitatea clinică a hsCRP:

Prevenţie primară a afecţiunilor cardiovasculare la pacienţi asimptomatici,
aparent sănătoși cu risc de a dezvolta evenimente cardiovasculare,cărora
li se poate recomanda
o modificarea stilului de viaţă (scădere în greutate, dietă hipolipidică,
hipoglucidică, încetarea fumatului, exerciţii fizice),
o tratament cu aspirină şi eventual statine chiar la valori normale ale LDL
colesterolului dacă hsCRP prezintă valori crescute.
Prevenţie secundară la pacienţii cu afecţiuni cardiovasculare:
o predictor independent de evenimente subsecvente (reinfarctizare,
insuficiență cardiacă, deces)
Aprecierea riscului de a dezvolta diabet zaharat (DZ) şi boli
cardiovasculare la pacienţii cu sindrom metabolic.
Aprecierea riscului de AVC la hipertensivi
Aprecierea rezultatului tratamentului cu statine în conjuncţie cu valorile
LDL.
Influenţa medicaţiei asupra hsCRP
Scad hsCRP:
Statinele (inhibitori ai HMG-CoA reductazei);
- au şi efect antiinflamator, de aceea sunt de preferat altor agenţi
hipolipemianţi la pacienţii cu valori crescute ale hsCRP;
- ţinta tratamentului cu statine este scăderea şi a CRP, nu numai a LDL.
Insulina;
Antidiabeticele orale.

Aplicaţie practică
Determinarea hsCRP serică prin metoda ELISA
Principiul determinării
Testul ELISA pentru determinarea hsCRP are la bază o metodă de
determinare imunometrică (tip sandwich). Pe suprafaţa internă a godeurilor este fixat
primul anticorp monoclonal anti-CRP (de şoarece), în timp ce în soluţia de enzimă
conjugată se găseşte al doilea anticorp monclonal anti-CRP (de capră) marcat cu
peroxidază de hrean.
Antigenul (CRP) va reacţiona simultan cu cei 2 anticorpi care vor prinde
moleculele de CRP ca într-un sandwich. După o incubare la temperatura camerei,
godeurile se spală cu apă pentru a îndepărta anticorpii marcaţi care nu s-au legat de
moleculele de CRP. Apoi se adaugă o soluţie substrat de tetrametilbenzidină (TMB)
şi se incubează până la apariţia unei coloraţii albastre.
Reacţia se opreşte prin adăugarea unei soluţii de HCl 1 N care va determina
virajul coloraţiei albastre în galben. Concentraţia CRP este direct proporţională cu
intensitatea culorii. Absorbţia de lumină se măsoară spectrofotometric la 450 nm.
Cu ajutorul calibratorilor din kit (soluţii standard de CRP) se generează o curbă de
etalonare ce va fi folosită la determinarea concentraţiilor CRP din probele analizate.

Reactivi şi materiale
Un kit conţine:
1. Placă de reacţie cu 96 de godeuri ce conţin anticorpi monoclonali anti-CRP
(de şoarece).
2. Un set de 6 calibratori ce conţin CRP cu concentraţii cunoscute (0; 0,005;
0,010; 0,025; 0,050 şi 0,100 mg/L). Calibratorii sunt gata preparaţi în soluţie
tampon.
3. Soluţie diluţie probe (Sample Diluent) ce conţine o soluţie tampon fosfat-BSA.
4. Reactiv Enzimă conjugată cu anticorpi anti-CRP ce conţine anticorpi de capră
anti-CRP conjugaţi cu peroxidază de hrean.
5. Reactiv TMB - conţine 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidină (TMB).
6. Soluţie Stop - conţine HCl 1 N.
Alte materiale necesare:
- pipete automate cu volum de pipetare de: 5 µl, 10 µl, 50 µl, 100 µl şi 1000 µl;
- vârfuri de pipete;
- cititor ELISA capabil să citească absorbţiade lumină la 450 nm;agitator;
- hârtie de filtru.
Mod de lucru
1. Probele de ser ale pacienţilor (şi controlii dacă e cazul) trebuie diluate 1:100
înainte de analiză. Calibratorii (soluţiile standard CRP) NU se diluează!
2. În placa de reacţie se alege numărul dorit de godeuri în funcţie de numărul de
probe de ser care se doresc a fi analizate (la care se adaugă calibratorii şi
controlii în cazul în care nu s-a realizat calibrarea testării).
3. Se pipetează 10 µl ser din fiecare probă diluată în godeuri (când se doreşte
realizarea curbei de calibrare, în primele godeuri se vor pipeta calibratorii şi
controlii diluaţi, apoi fiind pipetate probele).
4. Apoi se pipetează 100 µl Reactiv Enzimă conjugată cu anticorp anti-CRP în
godeuri. Se agită bine timp de 30 de secunde.
5. Se incubează la temperatura camerei (18-25°C) timp de 30 (45) de minute.
6. Apoi se golesc godeurile prin răsturnarea plăcii într-un recipient pentru
deşeuri.
7. Se spală godeurile de 3-5 ori cu apă distilată sau deionizată. După ultima
spălare se răstoarnă placa cu godeuri pe o hârtie de filtru şi se scutură bine
pentru a elimina şi ultimele picături de apă.
8. Se pipetează 100 µl reactiv TMB în godeurile cu probe. Se amestecă uşor
timp de 5 secunde.
9. Se incubează la temperatura camerei 10 (20) minute.
10. Pentru oprirea reacţiei se pipetează 100 µl Soluţie Stop în fiecare godeu. Se
amestecă uşor timp de 30 de secunde, astfel încât să se producă virajul de
culoare din albastru în galben în toate godeurile.
11. Se citeşte absorbţia de lumină la 450 nm în decurs de 15 minute. Pentru
stabilirea rezultatului se poate folosi orice cititor de godeuri la 450 nm. Cititorul
de godeuri va procesa automat datele, construieşte curba de etalonare,
apreciază concentraţia probelor şi prezintă rezultatele finale.
Intervale de referinţă
- <1 mg/L - risc scăzut de a dezvolta boli cardiovasculare;
- 1-3 mg/L - risc mediu;
- 3 mg/L - risc înalt;
- >10 mg/L - evaluarea pacientului pentru prezenţa altor patologii
inflamatorii, infecţii acute.