LP 13.

PCR metoda dublei difuzii Ouchterlony, metoda latex / 3 ore

http://www.scribd.com/doc/39480672/Lucrari-Practice-Imunologie-Mg-2008

PROTEINA C REACTIVA - CRP

Metoda Ouchterlony metoda imunochimica bazata pe reactia de precipitare in

mediu solid imunodifuzie radiala dubla.
Metoda latex metoda imunochimica bazata pe reactia de aglutinare.

PROTEINA C REACTIVA - CRP

Definitie

Este o proteina clasica de faza acuta a inflamatiei, care apare ca raspuns rapid la
bolnavii cu:
- diferite infectii microbiene (cu streptococ, pneumococ etc.)
- in inflamatii (reumatism),
- in infarctul miocardic, in tumori, etc.

Rolul
Proteina C reactiva este sintetizata in ficat si initiaza opsonizarea si fagocitoza
celulelor care patrund in organism, dar

- rolul ei principal rezida in fixarea si neutralizarea substantelor toxice

endogene provenite din leziunile celulare.

Proteina C reactiva este o proteina care nu exista in mod normal in serul

uman.

Semnificatie clinica

- Ea are importanta alaturi de alte teste cum ar fi VSH si fibrinogen.

- Toate cele trei indica prezenta unui sindrom inflamator (este marker al
inflamatiei).
- Prin proteina C reactiva se poate masura si riscul ca un pacient sa prezinte o
boala cardiovasculara. Astfel, daca el are o concentratie de sub 1mg/l atunci
riscul este practic 0, iar daca are peste 3mg/l atunci riscul este foarte ridicat.

Dozarea CRP e utila in:

depistarea proceselor inflamatorii sistemice (cu exceptia lupusului eritematos

diseminat, si a rectocolitei hemoragice)
 aprecierea eficacitatii tratamentului antiinfectios, sau antiinflamator
detectia precoce a unor complicatii postoperatorii (infectii ale plagii, tromboze,
pneumonie)
diferentierea intre infectie si reactie de rejet dupa transplant de maduva osoasa

Reactia prin care se pune in evidenta proteina C reactiva este o reactie in urma
caruia are loc un fenomen de precipitare(imunodifuzia dublu radiala-Ouchterlony)
sau aglutinare (metoda latex).
Proteina C reactiva precipita prin testarea serului de cercetat cu un antiser specific
in caz de boli inflamatorii.

Testul de imunodifuzie dubl radial (Ouchterlony)

Aceast metod se bazeaz pe difuzia antigenului i a anticorpilor unul ctre cellalt,

ntr-un mediu gelozat, care iniial nu are ncorporat nici un reactant (Rpuntean,
1994). n dou godeuri alturate, decupate dintr-un gel de agar se umplu, unul cu
protein anticorp i unul cu protein antigel omoloag, Ag i Ac vor difuza unul spre
cellalt iar la locul de ntlnire va aprea o linie de precipitat

Pentru realizarea acestei metode au fost utilizate urmtoarele:

- ser de examinat, proaspt sau pstrat la 20oC.
- ser de referin (conine PCR Ag standard)
- gel de agar
- lam de microscop
- Antiser monospecific

Mod de lucru
- Agarul topit se toarn pe lama de microscop n cantitate de 3,5 ml gel.
- Dup solidificare s-au decupat godeuri de 3 mm diametru, n model radial,
unul central i 6 periferice.
- Godeurile se umplu cu reactani cu ajutorul micropipetei, astfel: n godeul
central se pune antiser iar n celelalte se repartizeaz: n I i IV ser de referin iar n
II, III, V i VI serurile de cercetat.
- Placile au fost puse la termostat, n cutii umede, pentru a se mpiedeca
uscarea agarului.
- Citirea se face n camer obscur, la o surs de lumin, (dup 2 ore sunt
vizibile, dup 4 ore sunt clare, dup 24 ore sunt mult ntrite).

Rezultatele se exprim n prezent sau absent

Determinarea proteinei C-reactiv (CRP) prin metoda LATEX

Este un test calitativ sau semicantitativ.

CRP este o -globulin, al crui nivel crete n procesele inflamatorii, n faza acut a
unor afeciuni i dup operaii chirurgicale.
Principiul metodei
Reactivul CRP-Latex este o suspensie de particule de polistiren sensibilizate cu
anticorp uman de protein C-reactiv. Cnd reactivul ajunge n contact cu serul care
contine anticorpi de CRP, are loc o reacie antigen-anticorp usor de vizualizat, fiind o
reactie de aglutinare a latexului.

Reactivi i materiale
- Reactiv CRP Latex: 2 sau 4 ml de reactiv latex
- Control pozitiv: 0,5 ml ser uman, CRP>15mg/l
- Control negativ: 0,5 ml ser uman, CRP1mg/l
- Lame i baghete de unic folosin
- Plci de reacie cu 6 locuri

Proba: ser proaspt sau conservat, nehemolizat, fr impuriti

Mod de lucru
- Se aduc reactivii i serurile de analizat la temperatura camerei
- Se pune o pictur (40-50l) de prob i 1 pictur din fiecare control n
godeuri separate de pe plac
- Se adaug 1 pictur reactiv latex
- Se amestec cu bagheta picturile
- Se observ prezena sau absena aglutinrii n 3 min

Rezultate
1. Rezultat pozitiv apare aglutinare vizibil a particulelor de latex
Aceasta reprezint un nivel de CRP 6mg/l n serul testat
2. Rezultat negativ nu apare aglutinare n interval de 3 min
Aceasta reprezint un nivel de CRP <6mg/l n serul testat

Testul semicantitativ
- se efectueaz n acelai mod ca i testul calitativ dar se fac diluii ale serului
cu soluie salin (NaCl 9g/l)
- nivelul aprox. al CRP din serul testat, n UI, va fi cel corespunztor celei
mai mari diluii cu rezultat pozitiv: se nmulete inversul diluiei cu 6

Exemplu: Diluie Citire

+
+
1/8 -
CRP = 4 x 6 = 24 mg/dl

Valori normale 6 8 mg/l

Valoarea CRP crete foarte mult n fazele acute ale bolii, atingnd o valoare de 500
mg/l
Testul pentru identificarea proteinei C reactive
Testul este utilizat pentru identificarea proteinei C reactive (CRP) n ser pentru diagnosticul
unor afeciuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaiei.

Principiul metodei
Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o fraciune de
gamaglobulin a serului anti-uman CRP specific. Cnd CRP este prezent n prob, se observ o
aglutinare ce indic un coninut de 6 mg/l.

Reactivi
1 flacon cu reactiv latex de 5 ml
1 flacon cu control pozitiv de 1 ml
1 flacon cu control negativ de 1 ml
1 plcu pe care se efectueaz reacia

Material biologic
Se folosete ser clar i proaspt.
Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori n obinerea rezultatelor.
Dac testul nu poate fi fcut imediat, serul se pstreaz la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o
perioad mai ndelungat, serul trebuie pstrat congelat.

Modul de lucru
-Se aduc reactivii i probele la temperatura camerei naintea folosirii cu 30 min.
-Se pun 2 picturi (50 l) de control (+) n primul cerc i 2 picturi n al doilea cerc al plcuei de
testare
-Se pune o pictur (45 l) de ser nediluat din fiecare prob n cercurile ce urmeaz
-Se agit uor suspensia de reactiv latex
-Se pune n fiecare cerc folosit o pictur (45 l) de reactiv latex
Pentru omogenizare se folosete un beior pentru fiecare test efectuat
-Se rotete plcua 2 minute i se citete rezultatul imediat n dreptul unei surse de lumin

Interpretarea rezultatelor
Reacia negativ: apariia unei suspensii lptoase, fr aglutinare, ca cea observat n
controlul negativ
Reacia pozitiv: orice aglutinare observat la proba asemntoare celei observate la
controlul pozitiv
Proteina C reactiv nu este prezent n serul pacienilor aparent sntoi.
Determinarea CRP poate servi la monitorizarea activitii inflamatorii, fie ca rezultat
al terapiei, fie al remisiunii spontane
Valori normale: <6 mg/l
Valori crescute:
I. n faza iniial a inflamaiei n
-infecii bacteriene: pneumonii
-infarct miocardic, stri postoperatorii, afeciuni maligne, mielom multiplu, lupus
eritematos sistemic (LES)
II. Alte afeciuni
-febre reumatice, afeciuni reumatice diverse, colagenoze, tuberculoza activ
 Observaii
Reactivii conin azid de sodiu ce se poate combina cu Cu i Pb, putnd deveni explozibili.
Controlul pozitiv i negativ din ser uman, a fost testat prin metoda liceniat FDA i s-a
demonstrat c nu reacioneaz cu anticorpii pentru AgHBs i HIV.
Toate probele umane pot fi considerate potenial infectate.
Reactivii i controalele sunt stabile pn la data expirrii, dac sunt pstrate la temperatura
de 2-80C, maximum 72 de ore. Reactivii nu se pstreaz congelai.