Modele experimentale în ateroscleroză

Definiție

Ateroscleroza este o afecțiune a pereților vaselor sangvine care, în timp, conduce la

reducerea diametrului vasului de sânge (prin formarea de plăci ateromatoase ce contin colesterol,
calciu, material lipidic si lipofage) pâna la înfundarea acestuia.

Tablou clinic

Ateroscleroza nu se manifestă clinic decăt atunci când se realizează o obstrucție critică de

aproximativ 60-70% din lumenul arterial.

Cauzele aterosclerozei

Ateroscleroza este o afecțiune progresivă care poate debuta încă din copilărie, însă
evoluția sa este extrem de lentă.
Cu toate că nu se cunoaște încă cu exactitate cauza care declanșează ateroscleroza, este
cert că această afecțiune debutează în urma daunelor produse pereților arterelor. De exemplu,
diabetul zaharat poate favoriza afecțiunile cardiovasculare, printre care si ateroscleroza.

Aceste daune pot fi provocate de:

 Hipertensiune

 Colesterol marit

 Trigliceride mari

 Fumat
  Rezistenta la insulină, obezitate sau diabet

 Inflamație cauzată de afecțiuni precum artrita, anumite tipuri de sindrom autoimun, lupus
sau infecții.
 stilul de viață:

-fumatul

-sedentarismul

-consumul excesiv de alcool

Semne si simptome

Ateroscleroza nu prezintă, de regulă, niciun simptom până în momentul în care placa de

aterom atinge proportia de 40%. În urma instalării aterosclerozei, pot fi afectate atât arterele
coronariene, cerebrovasculare, cât si arterele periferice.

Prin afecțiunea coronariană sunt îngustate arterele inimii. Din cauza acestor îngustări,
riscul de infarct miocardic crește considerabil.

Simptome:

• Durere toracică (junghi, arsuri, angina)

• Durere abdominală, de gât, maxilar, umăr/braț

• Senzație de slăbiciune

• Transpirații excesive

• Dificultate în respirație

Tratament- statine, antitrombotice, blocante ale canalelor de calciu, diuretice. (3)

 Efectele extractelor Shenlian asupra aterosclerozei prin inhibarea răspunsului
inflamator

Un număr larg de studii epideomiologice și clinice au demonstrat faptul că

antiinflamatoarele steroidiene și non-steroidiene, antibioticele, fibrații, inhibitorii 5-
lipooxigenazei și antagoniști ai receptorilor pentru leucotriene joacă un rol important în
reducerea formării aterosclerozei și în stabilizarea plăcilor aterosclerotice. A fost sugerat faptul
că inflamația corelată cu leucotrienele va deveni principala țintă în blocarea aterosclerozei.
Extractele Shenlian reprezintă o serie de extracte bazate pe o serie de plante de origine chineză.

În cadrul unor studii anterioare s-a demonstrat faptul că aceste extracte au un rol benefic
în formarea aterosclerozei prin reglarea contracției și relaxării la nivel endotelial, studiile fiind
realizate pe șobolani. S-a demonstrat totodată căci extractele pot amâna și reduce semnificativ
severitatea bolii pe baza unor studii realizate pe iepuri, prin acțiunea lor la nivelul
metabolismului lipidic. (3)

În acest studiu, efectele farmacologice ale extractelor Shenlian asupra aterosclerozei pe

termen lung și pe termen scurt au fost evaluate folosind ca model iepuri cărora li s-a indus
această boală. Zona de formare a plăcii aterosclerotice a fost utilizată ca un indicator al
eficacității generale al tratamentului. Factorii de adeziune, citokinele, factorii de creștere și
factorii chemotactici din ser sau de la nivelul țesutului vascular au fost măsurați pentru a obține o
indicație cu referire la severitatea reacției inflamatorii. (14)

Materiale și metode

Animalele și administrarea medicamentelor

Ca și animale de experiență s-au utilizat iepuri sănătoși cu o greutate cuprinsă între 2,2 și
2,8 kg. Fiecare animal a fost găzduit într-o cușcă separată, într-o cameră la o temperatură de
aproximativ 22 de grade Celsius. Toate experimentele s-au realizat conform ghidurilor prevăzute
de comitetul de îngijire al animalelor din China.

Animalele au fost grupate randomizat în 6 grupuri a câte 10 iepuri: un grup de control și

5 grupuri care au servit drept modele de ateroscleroză. Un grup a fost tratat cu apă distilată, 3
grupuri cu diferite doze de extracte Shenlian ( 90 mg/kg, 180 mg/kg și 360 mg/kg) și un grup a
primit simvastatină 10 mg/kg corp. Fiecărui grup i s-a administrat tratamentul intragastric odată
pe zi. Extractele Shenlian ce conțin tanșinonă IIa, acid salvianolic B, tanșinol și andrografolid au
fost asigurate de către unul din laboratoarele chimice al Institului Chinez. (4)

Inducerea aterosclerozei

Inducerea aterosclerozei la iepuri s-a realizat prin intermediul angioplastiei și în urma

unei diete bogate în colesterol. (2)

Măsurarea lipoproteinelor din sânge

La 10 săptămâni după inițierea aterosclerozei și administrarea medicamentelor, iepurii au

fost anesteziați cu dietil eter, ulterior probele de sânge fiind colectate de la nivelul inimii. Probele
de sânge au fost introduce într-o serie de sticluțe de mici dimensiuni, fiind lăsate pentru
coagulare timp de 4 ore, după care a avut loc centrifugarea timp de 20 de minute. Lipoproteinele
din sânge, incluzând colesterolul total, triacilglicerolii și lipoproteinele cu densitate mare au fost
evaluate cu ajutorul unui autoanalizor biochimic.

Măsurarea proteinei CD18 din monocitele de la nivelul sângelui periferic

Sângele periferic, în volum de aproximativ 0,5 ml a fost colectat din vena urechii
iepurilor și a fost anticoagulat cu EDTA 10% după 10 săptămâni de tratament. Expresia proteinei
CD18 asupra monocitelor a fost detectată prin metoda citometriei în flux și metoda western blot,
o metodă specifică pentru identificarea unor anumite proteine dintr-un amestec.

Evaluarea histopatologică

La 10 săptămâni după administrarea tratamentului, toate animalele au fost sacrificate. Un

vas de sânge de aproximativ 2 cm situat între aorta abdominală și artera femurală a fost extras și
fixat cu 4% paraformaldehidă, apoi încorporat în parafină și colorat cu hematoxilină-eozină.

Măsurarea factorilor responsabili de apariția inflamației

Nivele factorilor TNF-alfa, IL-1 și IL-8 au fost testate prin radioimunotest. Nivelele
proteinei C reactive au fost testate prin intermediul imunoturbidimetriei. Nivele de VCAM-1,
ICAM-1, MCP-1 și IGF-1 au fost măsurate cu ajutorul tehnicii Elisa. (8)
 Rezultate

Evaluarea histopatologică

În comparație cu grupul de control, în cadrul secțiunilor histologice colorate cu

hematoxilină-eozină de la animalele cu ateroscleroză indusă s-a observat fenomenul de denudare
endotelială și o desprindere a celulelor de la nivelul arterei femurale. O cantitate mare de lipide și
celule spumoase au apărut sub nivelul arterei femurale, iar o parte din lipide s-au contopit ,
formând așa numitele “bazine de lipide”.

Pe baza acestei evaluări histopatologice, s-a concluzionat faptul că modelul animal poate
fi considerat într-o stare avansată de ateroscleroză. Tratamentul cu simvastatină și diferite doze
de extract Shenlian au îmbunătățit aceste schimbări patologice, prevenind extinderea lor.

Măsurarea lipoproteinelor din sânge

În grupul de iepuri cu ateroscleroză indusă, nivelele de colesterol, trigliceride și

lipoproteine cu densitate mică din sânge au fost mai mari în comparație cu grupul de control, dar
lipoproteinele cu densitate mare au avut un nivel semnificativ mai scăzut în comparație cu
animalele de control. Pretratamentul cu simvastatină și doze administrate gradat din extract
Shenlian a dus la reduceri importante a nivelului colesterolului total din sânge, trigliceridelor și
LDL-ului.

Măsurarea factorilor responsabili de apariția inflamației

La 10 săptămâni după tratament, nivelele din ser ale factorului TNF-alfa, IL-8 și proteinei
C reactive au fost mai mari la iepurii cu ateroscleroză decât la cei de control. Doze variate de
extract Shenlian au redus valorile factorului TNF-alfa din ser ( 180 și 360 mg/kg), ale proteinei C
reactive ( 90, 180 și 360 mg/kg), IL-8 (360 mg/kg). Nivelele IL-1beta nu s-au modificat
semnificativ la niciun grup.

Nivelel proteinei transmembranare ICAM-1, anticorpului monoclonal VCAM-1,

chemokinei MCP-1, factorului de creștere insulinic IGF-1 au crescut puternic la grupul de
control în a 10-a săptămână de tratament. Pretratamentul cu simvastatină și doze administrate
gradat din extractul Shenlian au redus puternic nivelele de VCAM-1 ( 90 și 360 mg/kg), nivelele
de IGF-1 ( 90 și 180 mg/kg), dar nu a avut un impact relevant asupra ICAM1 și MCP-1. (10)

Măsurarea proteinei CD18 din monocite

Nivelele de proteină CD18 din monocitele din sângele periferic au crescut semnificativ la
iepurii cu ateroscleroză, această creștere fiind observată în săptămâna a 10-a. Variate doze din
extract au redus nivelul anormal al proteinei, într-o manieră depedentă de doză. Fiecare din cele
3 doze a inhibat creșterea valorii CD18, în timp ce în cazul simvastatinei nu s-a observat un
asemenea efect. (6)

Teoriile referitoare la reacțiile inflamatorii și la ateroscleroză relatează faptul că plăcile

ateromatoase se formează gradual la nivelul pereților vaselor de sânge printr-un proces
inflamator cronic cu rol distructiv. Răspunsul inflamator reprezintă unul dintre aspectele cheie
ale patologiei aterosclerotice și ale intervențiilor antiinflamatorii care pot bloca răspunsul
inflamator, așadar amânând procesul sau diminuând procesul distructiv care are loc încă de la
începutul patologiei.

Tratamentul antiinflamator reduce, de asemenea, cu success incidența evenimentelor

cardio-cerebro-vasculare în cazurile avansate de ateroscleroză. Așadar, medicația
antiinflamatorie are o valoare importantă din punct de vedere practic și teoretic pentru prevenția
și tratamentul aterosclerozei.

În ultimii ani, mulți medici specialiști chinezi au sugerat din experiențele lor clinice, căci
ateroscleroza este strâns legată de toxinele ce pătrund pe cale endogenă și respectiv de afectarea
colaterală la nivelul creierului ce este provocată de către aceste toxine.

În prezent, metodele de detoxifiere și îndepărtare a toxinelor sunt utilizate pe scară largă

în medicina chineză, în vederea tratării aterosclerozei și a afecțiunilor cerebrovasculare. (7)

Astfel, se consideră căci extractele Shenlian prezintă multiple efecte terapeutice și de

preventive împotriva bolilor cardiovasculare, inclusive a aterosclerozei. Anterior, s-a demonstrat
faptul că aceste extracte pot inhiba formarea aterosclerozei la șobolani prin reglarea
metabolismului lipidic, inducând contracția celulelor endoteliale și excreția, și îmbunătățind
hemoreologia.
 În cadrul acestui studiu, s-a demonstrat faptul că extractele Shenlian reduc în proporție
importantă formarea plăcilor ateromatoase. Mecanismele prin care acționează aceste extracte
sunt următoarele: îmbunătățirea metabolismului lipidic cu reducerea depozitării lipidelor,
inhibarea depozitării lipidelor având loc printr-un mecanism indirect, antiinflamator. De
asemenea, aceste extracte inhibă formarea și eliberarea de agenți inflamatori, reducând
concentrația de citokine proinflamatorii, molecule de adeziune, factori chemotactici și factori de
creștere. (9)

Efectele exercițiilor de anduranță și a dietei asupra aterosclerozei la șoareci

În cadrul a numeroase studii a fost demonstrat faptul că o creștere a numărului de celule

reglatoare T conduce la o regresie a aterosclerozei. De asemenea, exercițiile fizice prelungite și
realizate frecvent accelerează creșterea frecvenței celulelor reglatoare T. În plus, exercițiile fizice
duc la o creștere a metabolismului și la o scădere a numărului de lipide, precum și la o scădere a
nivelului presiunii din sânge. Medicii recomandă exerciții pacienților, fiind bine știut faptul că
exercițiul moderat este benefic în numeroase boli, printre care amintim hipertensiune, diabet,
boli cardiovasculare în general. Obezitatea este un factor major de risc pentru dezvoltarea
aterosclerozei, indivizii obezi suferind de inflamații de natură cronică datorită unei eliberări
constant de citokine proinflamatorii din țesutul adipos. Exercițiile fizice conduc la o reducere a
țesutului adipos visceral, cu o reducere a citokinelor proinflamatorii eliberate din adipocite,
precum IL-6. (11)

Există o serie de studii realizate pe șoarece care demonstrează că exercițiul fizic

contribuie la reducerea mărimii plăcii ateromatoase. Ținta studiului ce va fi descris ulterior, este
aceea de a investiga modul în care exercițiile de anduranță și dieta afectează în mod direct
procesul de ateroscleroză, pe 2 categorii de șoareci: șoareci cu deficit de apoliproteină E și
șoareci sălbatici. (16)

Materiale și metode
 Studiul s-a realizat pe șoareci cu deficit de apoliproteină E și șoareci sălbatici care au fost
ținuți într-o cameră cu un ciclu 12 ore zi/12 ore noapte, fiind hrăniți cu apă și mâncare ad
libitum.

Șoarecii ulterior au fost puși pe o bandă de alergat un anumit interval de timp, timp de 5
săptămâni consecutive. La începutul experimentului, șoarecii au fost supuși unei diete
vegetariene, care a fost alternată cu o dietă bogată în colesterol ( în concentrație de aproximativ
21,2 % grăsime). Animalele au fost împărțite în grupuri randomizate de câte 6, grupurile de
control fiind formate din șoareci care au primit fie o dietă vegetariană, fie una bogată în
colesterol. S-au utilizat totodată 2 metode de calcul.

Pentru a testa ipoteza nulă, și anume aceea că regresia plăcii ateromatoase este estimată la
aproximativ 90% din șoarecii care realizează exerciții fizice, s-a utilizat un anumit tip de
software. Astfel, acest software are capacitatea de a detecta reducerea plăcii aterosclerotice la
șoarecii ce sunt supuși exercițiilor fizice, în comparație cu cei care nu realizează exerciții fizice.

Ulterior, șoarecii au fost puși pe o bandă de alergat timp de 1h, la o viteză de 16m/min,
cu un unghi de înclinare de 5 grade timp de 5 zile pe săptămână, în cadrul a 5 săptămâni
consecutive. Programul de exerciții a fost realizat pe baza unor studii anterioare care au
demonstrat reducerea plăcii ateromatoase și o stabilitate îmbunătățită, după 5 săptămâni de
exerciții. La 2 zile după ultimul exercițiu, șoarecii au fost cântăriți și sacrificați prin inhalarea de
dioxid de carbon și dislocare la nivel cervical. Nodulii limfatici inghinali, brahiali și axilari și
mușchii anteriori tibiali au fost utilizați în vederea unei procesări ulterioare. (17)

Rezultate

La șoarecii tineri, deficienți în apoliproteină E, s-a observat un trend descrescător în ceea

ce privește mărimea plăcii ateromatoase, atât la grupurile tratate cu dieta vegetariană, cât și cu
cea bogată în colesterol. Prin contrast, exercițiile fizice nu au dus la micșorarea plăcii la șoarecii
în vârstă ( la cei tineri o reducere de 20 % , la cei în vârstă 0,1-0,2%). Cei tineri, sălbatici au o
predispoziție genetică de a opune rezistență la ateroscleroză.

Datele obținute din studiu sugerează faptul căci este posibilă, reducerea incidenței
aterosclerozei la șoarecii vârstnici, cu condiția să nu aibă o predispoziție genetică, amintită mai
sus. A fost observat un trend clar care arată căci animalele tinere, deficiente în apoliproteină E,
au prezentat o reducere a mărimii zonei aterosclerotice, în contrast cu cele în vârstă unde nu s-a
observant vreo diferență. (13)

În ceea ce privește nivelele de colesterol și trigliceride la șoarecii sălbatici și cei deficienți

în apoliproteină E s-a identificat o creștere în urma dietei cu colesterol.

Efectul benefic al exercițiilor fizice nu a fost evident la animalele cu deficit de

apoliproteină E, în special la cele în vârstă, acest lucru fiind confirmat de o lipsă a reducerii
plăcii și o creștere a lipidelor din plasma, fiind sugerate dereglări la nivelul metabolismului
lipidic și la nivelul căilor insulinei.

În urma experimentului, a fost analizat și nivelul celulelor reglatoare T. Nivelul celulelor

reglatoare T a fost analizat prin citometrie în flux, cu ajutorul celulelor limfoidale recoltate de la
nivelul nodulilor axilari, inghinali și brahiali de la 6 șoareci. La șoarecii cu deficit de
apoliproteină E, cât și la cei sălbatici tratați cu ambele tipuri de diete s-a observat o creștere a
nivelului de celule reglatoare tip T. (5).

Alți parametri analizați au fost reprezentați de factorul de necroză tumorală alfa și și

respectiv IL-6 și IL-10. Nivelele de IL-6 și IL-10, cât și a factorului de necroză tumorală alfa au
fost foarte reduse, fiind aproape nedetectabile. (15)

Astfel, exercițiile de anduranță sunt suficiente pentru a reduce formarea timpurie a

leziunilor la nivel de aortă, independent de dietă. Oricum, acest lucru este adevărat în cazul
șoarecilor cu leziuni minore la nivelul aortei, în timp ce la cei cu plăci aterosclerotice mari,
avansate, complicate nu s-a observat o reducere a dimensiunilor în urma exercițiilor fizice.

Efectul reglator al epigalocatehingalatului asupra proteinei reactive C și a altor

marker inflamatori pe un model experimental cu ateroscleroză indusă

În studiul prezent s-a dorit evaluarea efectului reglator al epigalocatehingalatului asupra

proteinei reactive C și a altor markei inflamatori la șobolani hrăniți cu o dietă aterogenă.
Șobolanii au fost divizați în câte 3 grupuri a câte 9 fiecare.
 Primului grup de animale ( normal) i s-a administrat intraperitoneal soluție salină , al 2-
lea grup (aterosclerotic netratat) a primit o dietă aterogenă timp de 45 de zile, fiindu-i
administrate intraperitoneal soluție salină de la ziua 31 până la 45 inclusiv, iar grupul al 3-lea
(aterosclerotic tratat) a primit o dietă aterogenă timp de 45 zile, apoi fiindu-I administrat
epigalocatehin galatul din ziua 31 pana la 45. După cele 45 de zile, toți șobolanii au fost
eutanasiați. Parametrii biochimici, proteina C reactivă și parametrii hematologici ai inflamării
( rata de sedimentare eritrocitară, volumul total de leucocite, numărul de eritrocite) au fost
determinați. Proteina C reactivă și expresia Mrna au fost determinate prin imunoblotare. Grupul
2 de șobolani a prezentat o creștere semnificativă în sânge a ratei de sedimentare eritrocitară și a
numărului total de leucocite, prin comparație cu grupul 1. De asemenea, nivele mai scăzute ale
markerilor inflamatori au fost identificate la grupul 3, în comparație cu al 2-lea grup.

S-a concluzionat faptul că, aceste rezultate sugerează căci epigalocatehingalatul, o

componentă majoră a catehinelor din ceaiul verde poate scădea riscul de afectare cardiovasculară
prin reducerea nivelelor markerilor inflamatori în sânge la șobolanii hrăniți cu alimente bogate în
colesterol. (12)

Efectele factorului de necroză tumorală asupra plăcii ateromatoase la șoarece

Studiul s-a realizat pe o serie de 40 de șoareci cu o vârstă de 2 luni deficitari în LDL,

divizați în câte 4 grupuri, hrăniți cu alimente bogate în colesterol pentru o perioadă de 12
săptămâni. În paralel, șoarecilor li s-a administrat anticorp monoclonal anti-Tnf-alfa sau
imunoglobulina G.

În urma experimentului, s-a observat faptul căci administrarea de anticorp monoclonal a

dus la reducerea markerilor responsabili de inflamație, fără a reduce greutatea șoarecilor și fără a
afecta metabolismul glucidic al acestora. În mod neașteptat tratamentul cu anticorp monoclonal a
dus la creșterea nivelului de trigliceride din plasma și a VLDL-ului. În plus, conținutul în celule
musculare netede de la nivelul leziunii a scăzut, trendul conducând la o scădere a depunerii de
collagen prin inhibarea factorului de necroză tumorală TNF-alfa.(1)
 Bibliografie

1. Ann Kathrin Vlacil, Juta Schuett, Karsten Grote. Anti-tumor necrosis factor-α therapy
increases plaque burden in a mouse model of experimental atherosclerosis.
Atherosclerosis. 2018; 1:80-89.

2. Block PC, Banghman KI, Pasternak RC, Fallon JT. Transluminar

angioplasty: correlation of morphologic and angiographic findings in an
experimental model. Circulation. 2008; 61:776-778.

3. Chen LN. The elementary Research of Shelian Prescription for the Process of
the Atherosclerosis in rats. Beijing: China Academy of Chinese Medical Sciences.
2002; 4:58-68.

4. Duo Y, Tian YR, Ding SW. Effect of Shenlian extract on atherosclerosis. J Beijing
Univ. 2015; 3:6-12.

5. Guo L, Tian YR, Ding SW. Effect of “Compound Herba Sigegesbeckiae

Mixture” on Morphology of Atherosclerotic Endothelial Cell in Rabbits.
Shanghai J Tradit Chin Med . 2006; 40: 50-52.

6. Hansson GK, Libby P: The immune response in atherosclerosis: a double-edged

sword. Nat Rev Immunol. 2006; 6: 508–519.

7. Lahoute C, Herbin O, Mallat Z, Tedgui A. Adaptive immunity in atherosclerosis:

mechanisms and future therapeutic targets. Nat Rev Cardiol. 2011; 8:58-348.
8. Li PT, Wang YY, Huang QF. The Hypothesis of the Injury of Brain
Collaterals by Toxins and Its Theoretical and Practical Significance. J Beijing
Univ Tradit Chin Med .2001; 24:25-27.

9. Li YJ, Yang Q, Weng XG, Zhu XX. Analysis of the inflammatory reaction of
atherosclerosis model. Chin J Chin Mater Med . 2007; 32:15-19.

10. Majesky MW. Developmental basis of vascular smooth muscle diversity. Arterioscler
Thromb Vasc Biol. 2014; 27:58-64.

11. Martinet W, Kockx MM. Apoptosis in atherosclerosis: focus on oxidized lipids and
inflammation. Curr Opin Lipidol. 2011; 13:30-35.

12. Petersen AM, Pedersen BK: The anti-inflammatory effect of exercise. J Appl Physiol
2005; 98: 1154–1162.

13. Ramesh, P Geraldine, P Thomas. Regulatory effect of epigallocatechin gallate on the

expression of C-reactive protein and other inflammatory markers in an experimental
model of atherosclerosis. Chemico-Biological 2010; 183: 125-132.

14. Shimada K, Kishimoto C, Okabe TA, Hattori M, Murayama T, Yokode M, Kita T:

Exercise training reduces severity of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout
mice via nitric oxide. Circ J 2007; 71: 1147–1151

15. Steinberg D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as

partners in crime. Nat Med 2012; 8: 1211-1213.
16. Stein S, Lohmann C, Handschin C, Stenfeldt E, Boren J, Luscher TF, Matter CM:
ApoE–/– PGC-1α–/– mice display reduced IL-6,il 1 levels and do not develop
enhanced atherosclerosis. PLoS One 2010; 5:13-23.

17. Wang J, Song H, Tang X, Yang Y, Vieira VJ, Niu Y, Ma Y: Effect of exercise
training intensity on murine T-regulatory cells and vaccination response. Scand J Med
Sci Sports. 2012; 22: 643–652.

18. .Wan WC, Luo HY, Chen JW. An Experiment Study of Eliminating Toxic
Heat and Inducing Resuscitation in the Treatment of the Incomplete Cerebral
Ischemia. Shenzhen J Integr Tradit Chin West Med (Chin) 2011; 11:5-8.