UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA IAI FACULTATEA DE BIOLOGIE

PROIECT IDEI nr. 249/01.10.2007, COD CNCSIS 440

IMPACTUL UNOR TULPINI RIZOBACTERIENE ASUPRA PROCESELOR DE CRESTERE SI DEZVOLTARE LA PLANTE DE SOIA (GLYCINE MAX L. MERR.)
- sintez lucrare faz unic 2009 -

Director proiect, Lect. dr. tefan Marius

INSAMINTAREA IN LOTURI EXPERIMENTALE A MATERIALULUI SEMINCER INOCULAT CU PGPR 1.1. Obinerea biopreparatelor pe baza de PGPR 1.2. Inocularea boabelor de soia in vederea nsmnrii n cmp 1.3. nfiinarea i ntreinerea dispozitivelor experimentale conform protocolului experimental 2. STUDIUL INFLUENTEI PGPR ASUPRA DEZVOLTARII IN VIVO A PLANTELOR DE SOIA IN DIFERITE FAZE ONTOGENETICE 2.1. Determinarea activitii unor markeri enzimatici (catalaza, superoxidismutaza) 2.2. Determinarea coninutului de pigmeni asimilatori n esuturile foliare 2.3. Determinarea coninutului de glucide reductoare solubile n boabele recoltate 2.4. Determinarea coninutului de lipide totale n boabele recoltate 2.5. Determinarea coninutului de proteine solubile totale n boabele recoltate. 2.6. Analiza unor parametri biometrici (nlimea plantei, nr. de frunze, suprafaa foliar) 3. APRECIEREA PRODUCTIEI/HA 3.1. Determinarea MMB 3.2. Determinarea MH 3.3. Determinarea nr. de plante/ha (densitii) 3.4. Determinarea nr. mediu de psti/plant CONCLUZII BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1.

3 3 3 3 4 4 7 8 8 8 9 12 13 13 13 13 14 14

Numeroase studii au demonstrat c unele bacterii asociate suprafeelor radiculare pot stimula creterea i dezvoltarea plantelor de soia [6, 9, 12], fiind numite din acest motiv plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR). Mecanismele prin care rizobacteriile pot stimula creterea i dezvoltarea plantelor nu sunt nc pe deplin elucidate, cunoscndu-se ns faptul c ele pot include: 1. capacitatea de a produce fitohormoni: acid indolilacetic, acid giberelic, citokinine [9]; 2. fixarea azotului atmosferic [11]; 3. stimularea formrii de nodoziti active fixatoare de azot [5]; 4. reducerea sau prevenirea efectelor duntoare cauzate de fitopatogeni [18], producnd -1,3glucanaz [8], chitinaz [14], antibiotice [17] etc; 5. solubilizarea fosforului anorganic i a altor nutrieni [7]. Deoarece soia reprezint o plant cu o valoare economic deosebit i pentru c diferite tipuri de tratamente chimice se aplic att pe materialul semincer ct i n vegetaie, investigaiile noastre au fost realizate n scopul aprecierii efectelor induse de utilizarea unor tulpini rizobacteriene (izolate i caracterizate pe parcursul fazei din 2008 a prezentului contract) asupra creterii i dezvoltrii plantelor de soia n condiii ecologice (nu sau utilizat ngrminte, nu s-au aplicat pesticide sau alte tipuri de tratamente chimice pe parcursul desfurrii experimentelor). 1. NSMNAREA N LOTURI EXPERIMENTALE A MATERIALULUI SEMINCER INOCULAT CU PGPR 1.1. Obinerea biopreparatelor pe baz de PGPR Cinci tulpini rizobacteriene: Bacillus macerans Rs1, Bacillus macerans Rs2, Bacillus pumilus Rs3, Bacillus pumilus Rs4 i Arthrobacter globiformis Rs5, izolate din rizosfera plantelor de soia, au fost utilizate pentru obinerea unui biopreparat. Toate tulpinile au prezentat capacitatea de a solubiliza fosforul anorganic i au demonstrat activitate antimicrobian fa de o serie de bacterii test: (Staphylococcus aureus ATCC - 6538p, Bacillus cereus ATCC 9634, Pseudomonas aeruginosa Ip 5838, Escherichia coli ATCC 10536). Deoarece rizobacteriile rspund diferit dup inoculare la condiiile de mediu [15], s-a preferat utilizarea unui amestec din cele 5 tulpini n vederea obinerii efectului de stimulare a creterii plantelor de soia. Fiecare tulpin a fost cultivat separat pe mediu lichid Bunt Rovira, n baloane de 2000 ml, agitate (210 rpm) la temperatura de 270 C. Dup cinci zile au fost subcultivate n aceleai condiii ca cele descrise anterior. nainte de inocularea boabelor de soia, volume egale din cele cinci subculturi rizobacteriene au fost amestecate, fiind lsate apoi 30 min la temperatura camerei, obinndu-se astfel o densitate celular de 6,4 x 107 UFC/ml. 1.2. Inocularea boabelor de soia n vederea nsmnrii n cmp Boabele de soia (Pioneer PR91M10/91M10) au fost iniial pregtite pentru semnare folosind metoda descris de Bhuvaneswari et al. [3], ce cuprinde o etap de sterilizare cu hipoclorit de sodiu (2 % coninnd 4 ml/l Tween 20) i una de splare cu ap distilat steril. Boabele prob au fost ulterior inoculate prin splare rapid cu suspensia alctuit din cele cinci tulpini rizobacteriene, n timp ce boabele lotului martor au fost trecute rapid prin ap distilat steril. Dup uscare, toate boabele au fost transportate n condiii sterile la locul nsmnrii. 1.3. nfiinarea i ntreinerea dispozitivelor experimentale conform protocolului experimental Experiena de tip monofactorial a fost amplasat n com. Botesti, jud. Vaslui, fiind realizat dup metoda blocurilor randomizate n 4 repetiii, suprafaa unei parcele fiind de 40 m2 (Foto 1). S-a utilizat o rotaie de doi ani soia porumb. FACTORI EXPERIMENTALI V1 Martor netratat V2 varianta inoculat cu rizobacterii n toamna anului 2008 s-a efectuat lucrarea de baz a solului (artur la 25 cm adncime), cu plugul reversibil n agregat cu Tractorul Valtra. Pregtirea patului germinativ n primvara anului 2009 s-a realizat cu combinatorul Lemken n agregat cu tractorul Valtra n preziua semnatului. Semnatul s-a realizat cu SPC-6+U650, utilizndu-se o norm de smn (Pioneer PR91M10/91M10) de 90 kg/ha (450.000 boabe/ha). nainte de semnat s-a realizat inocularea cu biopreparatul format din cele 5 tulpini rizobacteriene pentru varianta V2. Nu s-au administrat ngrminte organo-chimice i nici erbicide preemergente. Combaterea

buruienilor s-a realizat numai prin praile mecanice fr a utiliza nici un fel de produs chimic. Ulterior s-a urmrit rsrirea i dezvoltarea plantelor pe ntreaga perioad de vegetaie. Periodic s-au recoltat probe de plante i sol n vederea efecturii determinrilor biochimice i analizele de productivitate, iar n teren s-au efectuat msurtori morfometrice i biometrice ale plantelor, difereniat pentru fiecare variant n parte.

Foto 1 Amplasarea loturilor experimentale pe parcursul anului 2009 2. STUDIUL INFLUENEI PGPR ASUPRA DEZVOLTRII IN VIVO A PLANTELOR DE SOIA N DIFERITE FAZE ONTOGENETICE Pentru aprecierea influenei exercitate de tulpinile rizobacteriene asupra dezvoltrii in vivo a plantelor de soia, ne-am propus investigarea unor markeri biochimici i ai unor parametri biometrici. n acest sens au fost prelevate probe medii reprezentate din frunze complet formate i s-au efectuat msurtori n diferite faze ale dezvoltrii ontogenetice a plantelor de soia: - 7.07.09 vegetaie - 14.07.09 vegetaie - nceput nflorire - 30.07.09 nflorire - 12.08.09 fructificare - 14.08.09 fructificare 2.1. Determinarea activitii unor markeri enzimatici (catalaza, superoxidismutaza) Este cunoscut faptul c n cursul etapelor de fosforilare oxidativ din cadrul procesului de respiraie, transferul electronilor n cadrul lanului transportor de electroni nu este 100 % eficient [13]. Pierderile de electroni duc ntotdeauna la formarea de specii reactive de oxigen (ROS). Apariia acestora este deci normal i pn la un punct, este direct proporional cu capacitatea celulei de a produce ATP, deci cu nivelul energetic al acesteia. Recent s-a demonstrat de asemenea c nivele crescute de ROS n celule duc la inhibarea procesului de fotosintez [10]. n cadrul experimentelor realizate, singura surs de ROS o reprezint respiraia. Chiar dac, prin activitatea lor din sol, rizobacteriile utilizate ar putea genera ROS, este foarte puin probabil ca aceste specii reactive de oxigen s ajung n frunze, n special datorit timpului de njumtire extrem de mic. innd cont de aceste elemente, enzimele implicate n neutralizarea speciilor reactive de oxigen devin indicatori preioi n primul rnd al metabolismului energetic al celulei i n al doilea rnd al capacitaii de aprare mpotriva stresului oxidativ. Enzimele folosite ca indicatori au fost catalaza (determinat prin metoda cu bicromat de potasiu descris de Artenie i colab. [2]) i superoxidismutaza (folosind metoda cu riboflavin descris Artenie i colab. [2]). Inocularea cu rizobacterii a boabelor de soia nainte de germinaie nu determin modificri semnificative ale activitii catalazei (Fig. 1) i nici ale superoxid-dismutazei (Fig. 2) pe parcursul dezvoltrii vegetative. Aceste observaii pot indica intensiti asemntoare ale proceselor respiratorii n plantele prob i martor. n plus, fa de activitile prevzute n planul de realizare, s-au efectuat investigaii i n ceea ce privete metabolismul proteinelor la plantele de soia. Aceast alegere este motivat de faptul c importana economic a plantei investigate rezid tocmai din capacitatea ei de a depozita n semine cantiti mari de proteine. n acest scop s-au determinat, pe de o parte, cantitatea de proteine totale solubile din frunze (folosind

metoda Bradford [4], iar pe de alt parte, dou enzime importante din calea de biosintez a aminoacizilor: alaninaminotransferaza i aspartat-aminotransferaza, folosind metoda propus de Artenie i colab.[1].
35 30 25 microM/min/g 20 15 10 5 0
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09

Martor Proba

data recoltarii

Fig. 1 - Variaia activitii catalazei n esuturile foliare pe parcursul dezvoltrii plantelor de soia
0,35 0,3 0,25 USOD/mg 0,2 0,15 0,1 0,05 0
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09

Martor Proba

data recoltarii

Fig. 2 - Variaia activitii superoxid-dismutazei n esuturile foliare pe parcursul dezvoltrii plantelor de soia Analiznd datele prezentate n Fig. 3 se pot observa o serie de diferene nregistrate ntre plantele martor i cele inoculate cu PGPR n ceea ce privete coninutul de proteine totale solubile. Dac n etapele de cretere vegetativ i de nflorire diferenele sunt nesemnificative, pe parcursul procesului de fructificare (14.08.09) se poate observa o cretere semnificativ statistic a concentraiei proteinelor n esuturile foliare ale plantelor prob (p<0,033).
140 120 100 mg/ml 80 60 40 20 0 7 iulie 09 14 iulie 09 12 august 09 14 august 09 Martor Proba

data recoltarii

Fig. 3 - Coninutul de proteine totale solubile din esuturile foliare ale plantelor de soia

Analiza calitativ a proteinelor solubile folosind electroforeza n condiii denaturante (SDS-PAGE n sistemul de soluii tampon al lui Laemli) [16] Foto 2 demonstreaz de asemenea c nu exist diferene semnificative ntre variantele experimentale.

Foto 2 Analiza electroforetic a extractelor de proteine solubile din frunzele de soia M - marker de mas molecular 1,3,5,7 plante inoculate cu PGPR 2,4,6,8 - plante martor, neinoculate

n ceea ce privete activitatea aspartat i alanin aminotransferazelor (Fig. 4, Fig. 5), nu s-au evideniat diferene statistic semnificative ntre cele doua variante experimentale. Se pare totui c exist o oarecare sincronizare ntre activitile celor dou enzime analizate. n cazul alanin-aminotransferazei, datele nregistrate n iulie (momentul nfloririi i nceputul fructificaiei) demonstreaz o activitate mai intens n cazul martorului comparativ cu proba. Odat cu luna august, corespunztoare momentului fructificrii, asistm la o cretere a activitii acestei enzime n esuturile foliare ale probei comparativ cu martorul. n cazul aspartataminotransferazei situaia este opus, martorul prezentnd nivele ale activitii acestei enzime mai reduse n luna iulie, respectiv mai ridicate n luna august comparativ cu proba.

350 microM piruvat /min/g 300 250 200 150 100 50 0

7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09

Martor Proba

data recoltarii

Fig. 4 - Variaia activitii alanin-aminotransferazei n esuturile foliare pe parcursul dezvoltrii plantelor de soia Alanin-aminotranferaza se constituie ca o legtur ntre metabolismul glucidelor i cel al proteinelor prin intermediul acidului piruvic [13]. Din acest considerent am ales s determinm suplimentar concentraia de glucide reductoare solubile n frunze prin metoda cu acid dinitrosalicilic [2]. Dinamica activitii alanin-aminotranferazei descris anterior poate fi corelat att cu concentraia glucidelor solubile (Fig. 6) ct i cu cea a proteinelor solubile determinate n frunze.

30
microM piruvat /min/g

25 20 15 10 5 0
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09
Martor Proba

data recoltarii

Fig. 5 - Variaia activitii aspartat-aminotransferazei n esuturile foliare pe parcursul dezvoltrii plantelor de soia 2.2. Determinarea coninutului de pigmeni asimilatori n esuturile foliare Determinarea coninutului de clorofil a, b i caroteni s-a realizat prin metoda spectrofotometric descris de Artenie i colab. [1], folosind aceton ca solvent extractant. n condiiile agro-climatice ale anului 2009, inocularea boabelor de soia cu rizobacterii a influenat nesemnificativ statistic concentraia pigmenilor asimilatori n perioada premergtoare nfloririi (Fig. 7).
14 12 mg/g glucoza 10 8 6 4 2 0 7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 14 august 09 data recoltarii Martor Proba

Fig. 6 Concentraia glucidelor reductoare solubile n frunzele de soia

250 200 mg % mat. veg. 150 100 50 0 clorofil a clorofil b caroteni 48,60 46,12 151,92 143,21 80,63 76,29 martor prob

Fig. 7 Concentraia pigmenilor asimilatori n frunzele de Glycine max (L.) Merr. - perioada creterii vegetative (valorile sunt medii E.S.M., n=5/lot)

La momentul nfloririi, coninutul de pigmeni asimilatori n frunzele plantelor de soia a variat ntre 149,61 mg % clorofil a, 51,82 mg % clorofil b, 63,42 mg % caroteni (martor) i 180,56 mg % clorofil a, 68,37 mg % clorofil b, 79,43 mg % caroteni (prob) Fig. 8. Aplicarea testului T a demonstrat existena unor diferene semnificative ntre martor i prob (p < 0,04 - clorofil a, p < 0,009 - clorofil b i p < 0,04 - caroteni), ceea ce poate demonstra o intensificare a proceselor de fotosintez ca urmare a prezenei pe suprafaa rdcinilor a tulpinilor bacteriene testate. 2.3. Determinarea coninutului de glucide reductoare solubile n boabele recoltate Din motive obiective (necorelarea perioadei de recoltare cu cea de raportare), n cele ce urmeaz vom prezenta date obinute pe parcursul anului 2008 cnd au fost derulate experimente similare. Pentru determinarea coninutului de glucide reductoare din seminele recoltate s-a metoda cu acid dinitrosalicilic [2]. Experienele au demonstrat c nu exist diferene semnificative statistic n ceea ce privete coninutul de glucide reductoare ntre variantele experimentale (Tabel 1).

250 200 mg % mat. veg. 150 100 50 0 149,61

180,56

68,37 51,82

*
63,42 79,43

martor prob

clorofil a

clorofil b

caroteni

Fig. 8 Concentraia pigmenilor asimilatori n frunzele de Glycine max (L.) Merr. la momentul nfloririi: *p < 0,04, **p < 0,009, *p < 0,04 fa de martor (valorile sunt medii E.S.M., n=5/lot) Tabel 1. Indicatori biochimici investigai Martor neinoculat Prob inoculate cu PGPR Indicator biochimic (media eroarea (media eroarea standard) standard) Concentraia de glucide reductoare 2,44 0,087 2,53 0,08 solubile (mg glucoz/g) Coninut de proteine solubile (mg/g) 425,52 6,22 438,13 3,87 Coninut de lipide (%) 22,08 0,39 21,76 0,28 Umiditatea relativ (%) 6,02 0,06 6,13 0,077 2.4. Determinarea coninutului de lipide totale n boabele recoltate Utilizarea unui aparat Soxlet pentru extracia lipidelor folosind eter de petrol urmat de determinarea gravimetric a materialului extras [2] nu a evideniat modificri statistic semnificative ale coninutului de lipide totale n boabele recoltate de la plante prob comparativ cu martorul (Tabelul 1). 2.5. Determinarea coninutului de proteine solubile totale n boabele recoltate Proteinele solubile din seminele de soia au fost extrase folosind tampon TRIS/HCL, pH 7,01, concentraia lor fiind msurat folosind metoda Bradford [16]. Determinrile efectuate demonstreaz c utilizarea PGPR pentru inocularea seminelor poate duce la o cretere a concentraiei proteinelor n boabele recoltate de la plantele prob comparativ cu martorul (Fig. 9), diferenele nregistrate fiind semnificative statistic (p<0,002). Analiza extractelor proteice prin SDS-PAGE a demonstrat faptul c nu apar diferene de natur calitativ ntre cele dou tipuri de boabe supuse analizelor (Foto 3), deci diferenele cantitative pot fi puse doar pe seama creterii ratei de acumulare a proteinelor normale n semine. Din acest punct de vedere, folosirea P(T<=t) two-tail 0,47 0,002 0,52 0,31

PGPR ca biofertilizatori poate prezenta un avantaj economic deosebit fa de metodele clasice, permind creterea concentraiei de proteine din boabele de soia.
445 Proteine solubile (mg/g BSA) 440 435 430 425 420 415 410 405 Martor Proba

Fig. 9 - Concentraia proteinelor totale solubile n seminele de Glycine max (L.) Merr.

Foto 3 Analiza electroforetic a extractelor de proteine solubile din frunzele de soia M - marker de mas molecular S - plante inoculate cu PGPR C - plante martor, neinoculate

2.6. Analiza unor parametri biometrici (nlimea plantei, nr. de frunze, suprafaa foliar) nlimea plantelor Pe parcursul perioadei de vegetaie, activitatea rizobacteriilor inoculate au determinat o cretere a nlimii plantelor de soia (Fig. 10).
90 75 cm 60 45 30 15 25.06.2009 07.07.2009 14.07.2009 30.07.2009 12 08 2009 proba martor

Fig. 10 Efectele inoculrii cu rizobacterii asupra nlimii plantelor de soia

Diferenele nregistrate ntre cele dou variante experimentale sunt statistic semnificative (p0.005) pe ntreaga durat a desfurrii experimentelor: p<0.0004 (25.06.2009), p<0.00001 (07.07.2009), p<0.002 (14.07.2009), p<0.012 (30.07.2009), p<0.015 (12.08.2009). Numrul de frunze Prezena tulpinilor rizobacteriene testate a determinat o stimulare a dezvoltrii aparatului foliar (Fig. 11). Dei numrul de frunze la plantele lotului prob a fost mai mare comparativ cu cele martor pe ntreaga durat a derulrii experimentelor, diferenele au fost statistic semnificative doar n primele faze ale dezvoltrii vegetative (25.06.2009, 07.07.2009).
30 numrul de frunze 25 20 15 10 5 0 25.06.2009 07.07.2009 14.07.2009 30.07.2009 12 08 2009

proba martor

Fig. 11 Efectele inoculrii cu rizobacterii asupra numrului de frunze O alt observaie efectuat pe durata derulrii experimentelor in vivo este legat de faptul c plantele lotului prob au nflorit mai devreme comparativ cu plantele martor. Acest decalaj n dezvoltarea celor dou tipuri de plante de soia ar putea fi determinat de efectul indus de activitatea rizobacteriilor testate. Dup momentul nfloririi, strategia de dezvoltare se modific, toate resursele nutritive ale plantei fiind ndreptate ctre formarea florilor i procesul de fructificare. n acest sens, creterea vegetativ scade n intensitate, numrul de frunze rmnnd practic constant. Acest parametru biometric devine, dup nflorire, lipsit de semnificaie pentru stabilirea efectului indus de utilizarea rizobacteriilor, fapt demonstrat i de evoluia sa marcat n Fig. 11, diferenele nregistrate n fazele trzii (14.07.2009, 30.07.2009, 12.08.2009) fiind nesemnificative statistic. Suprafaa foliar Pentru aprecierea suprafeei foliare s-a msurat mereu foliola central a ultimei frunze complet formate (Foto 4), utilizndu-se metoda planimetric. Pe durata desfurrii experimentelor n cmp s-a observat c utilizarea rizobacteriilor determin creterea suprafeei foliare comparativ cu plantele lotului martor. Diferenele nregistrate ntre cele dou variante experimentale au fost semnificative statistic Fig. 12.

Foto 4 Modalitatea de apreciere a suprafeei foliare la plantele de soia cultivate in vivo

10

70 60 50 40 cm2 30 20 10 0 25.06.2009 07.07.2009 14.07.2009 30.07.2009

proba martor

12 08 2009

Fig. 12 Efectele inoculrii cu rizobacterii asupra suprafeei foliare Analiza indicilor biometrici utilizai demonstreaz c inocularea cu rizobacterii, n condiiile neutilizrii fertilizanilor, poate stimula creterea i dezvoltarea plantelor de soia. n cadrul experimentelor realizate, plantele inoculate s-au dezvoltat mai bine pe nlime, au prezentat un numr mai mare de frunze i o suprafa foliar mai bine reprezentat. Pe lng aceasta, rizobacteriile testate au dus la o dezvoltare ontogenetic mai rapid a plantelor provenite din semine inoculate. Aceste rezultate ne ndreptesc s afirmm c tulpinile rizobacteriene testate de noi ar putea fi utilizate ca biofertilizatori - premis a practicrii unei agriculturi ecologice. Rezultatele obinute n condiiile noastre experimentale confirm informaiile prezentate n literatura de specialitate. Astfel, o serie de autori [7], [18] menioneaz efectul benefic al bacteriilor din rizosfera plantelor n procesele de cretere i dezvoltare. n plus fa de indicii biometrici prevzui iniial n planul de realizare, s-a urmrit i influena rizobacteriilor testate asupra procesului de formare al nodozitilor fixatoare de azot (numrul de nodoziti active). Tulpinile bacteriene izolate din rizosfera plantelor de soia i inoculate ulterior pe suprafaa boabelor au determinat creterea numrului de nodoziti fixatoare de azot la plantele investigate. Determinrile efectuate au evideniat prezena unui numr mai mare de nodoziti active la plantele de soia aparinnd lotului prob (media variind ntre 59,9 i 171,5) comparativ cu plantele lotului martor (media variind ntre 49,4 i 129,1) - Fig. 13, Foto 5. Diferenele nregistrate sunt semnificative statistic cu o probabilitate de 0,001001 pentru F (12,10875) > F critic (4,019541).
170,7 171,5

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

nr. nodozitii active

129,1 59,9 120,3

49,4
1 iul. 09 8 iul. 09 30 iul. 09

martor

prob

Fig. 13 Numrul de nodoziti active la Glycine max (L.) Merr

11

Foto 5 Influena inoculrii cu rizobacterii asupra procesului de formare a nodozitilor fixatoare de azot: stg. - martor, dr. - prob Stimularea de ctre rizobacteriile utilizate a procesului de formare a nodozitilor pe rdcinile plantelor de soia poate exercita efecte directe asupra fixrii azotului atmosferic i indirect asupra dezvoltrii plantelor prin creterea cantitii de azot atmosferic fixat. Creterea numrului de nodoziti ca urmare a utilizri unor microorganisme rizosferice constituie o preocupare a oamenilor de tiin. Astfel Hossain i Alexander (1984) consider c adugarea unor bacterii izolate din rizosfera plantelor de soia are ca prim efect modificarea microbiotei rizosferice cu efecte directe asupra formrii nodozitilor fixatoare de azot. Al-Mallah i colab. (1990), Dashti i colab. (1998), Lucas-Garcia i colab. (2004) evideniaz, prin studiile efectuate la soia, rolul rizobacteriilor n stimularea procesului de formare a nodozitilor. Din datele prezentate anterior se poate observa c diferenele nregistrate ntre prob i martor n cazul markerilor biochimici nu sunt semnificative din punct de vedere statistic, n timp ce indicii bio-morfo-metrici arat clar efectul de stimulare a creterii pe care microorganismele testate de noi le au asupra plantelor in vivo. O posibil explicaie a acestui fapt o poate constitui sensibilitatea metodelor biochimice utilizate. Este posibil ca diferenele dintre martor i prob s nu poat fi decelate prin metodele experimentale folosite. Din acest considerent ne propunem ca n urmtoarea faz a proiectului s mbuntim i s selectm metode i indicatori noi, cu o mai mare precizie. 3. APRECIEREA PRODUCIEI/HA Din motive obiective (necorelarea perioadei de recoltare cu cea de raportare), n cele ce urmeaz vom prezenta date obinute pe parcursul anului 2008 cnd au fost derulate experimente n cmp similare. n cazul analizelor de productivitate s-au determinat masa a o mie de boabe (MMB - conform SR 6123/1999), masa hectolitric (MH - conform SR 6123-2/1999 utiliznd o balan tip Buhler MLI 55) i producia pentru fiecare variant n parte exprimat n kg/ha la umiditatea STAS (Axinte M. i colab., 1992, 1999). De asemenea, s-au fcut msurtori i determinri biometrice: nr. ramificaii/plant, nr. psti/plant, nr. boabe/pstaie, nr. boabe/plant, n scopul evidenierii eventualelor diferene dintre variantele experimentate (Tabelul 2). Tabelul 2 - Influena tratamentului cu PGPR asupra caracteristicilor biometrice i a elementelor de productivitate Producia Diferena Semnificaia Determinare Varianta (U.M.) statistic U.M. % fa de M martor 1,95 100,0 Nr. proba 2,30 117,9 0,35 ramificaii/planta DL5% = 0,8 DL1% = 1,4 DL0,1% = 3,1 nr./pl nr./pl nr./pl

12

Nr. psti/plant

Nr. boabe/pstaie

martor proba DL5% = 22,1 nr./pl martor proba DL5% = 0,1 nr/pas. martor proba DL5% = 44,1 b/pl martor proba DL5% = 1,0 kg martor proba DL5% = 15,5 g martor proba DL5% = 608,6 kg/ha

47,6 53,0

2,3 2,3

Nr. boabe/plant

110,5 123,5

MH (kg)

71,2 71,5 175,9 178,4 2833 3006

MMB (g)

Producie (kg/ha)

100,0 111,5 DL1% = 40,6 nr./pl 100,0 100,3 DL1% = 0,2 nr/pas. 100,0 111,7 DL1% = 81,0 b/pl 100,0 100,5 DL1% = 1,9 kg 100,0 101,5 DL1% = 28,4 g 100,0 106,1 DL1% = 1117,7 kg/ha

5,45

DL0,1% = 90,0 nr./pl DL0,1% = 0,5 nr/pas. DL0,1% = 179,4 b/pl DL0,1% = 4,3 kg DL0,1% = 63,0 g DL0,1% = 2476,6 kg/ha

12,97

0,37 2,55 172,55

Elementele de productivitate la cultura de soia prezint variabilitate sub influena factorului studiat dar, cu diferene mici, nesemnificative din punct de vedere statistic. Determinarea MMB Masa a o mie de boabe (MMB) a avut valori foarte apropiate pentru cele dou variante studiate (Tabelul 2) fiind cuprins ntre 175,9 - 178,4 g. Se observ o valoare mai mare pentru varianta tratat dar, diferena de 1,5% s-a dovedit a fi neasigurat statistic. Determinarea MH Masa hectolitric (MH) a fost cuprins ntre 71,2 - 71,5 kg (Tabelul 2). i acest indicator a oscilat n limite foarte restrnse. S-a remarcat totui o diferen pozitiv n cazul variantei tratate cu PGPR fa de martorul netratat dar nesemnificativ statistic. Producia fizic Produciile obinute la cultura de soia au fost cuprinse ntre 2833 kg/ha la varianta martor i 3006 kg/ha n varianta tratat. S-a constatat faptul c varianta tratat a prezentat un spor de producie important de 172 kg/ha (aprox. 6,1 %) n plus fa de martor. Totui, aceast diferen, pentru anul de experimentare, s-a dovedit a fi neasigurat din punct de vedere statistic. Determinarea densitii: nr. de plante/ha Tratamentul la smn nu a influenat n nici un fel gradul de rsrire al culturi astfel nct nu s-au semnalat nici un fel de diferene ntre variante din acest punct de vedere. Determinarea nr. ramificaii/plant Analiznd numrul mediu de ramificaii/plant s-a constatat c plantele din varianta tratat s-au dezvoltat mai puternic vegetativ, numrul de ramificaii fiind mai mare dect n varianta martor n medie cu 17,9 % n plus. Din punct de vederea statistic, diferena nu a fost semnificativ. Determinarea nr. mediu de psti/plant i n acest caz s-au semnalat diferene pozitive fa de martor dar, neasigurate din punct de vedere statistic. Astfel, plantele din varianta tratat au avut n medie un numr de 53 de psti/plant fa de numai 47,6 n varianta martor. Determinarea nr. de boabe/pstaie Numrul mediu de boabe /pstaie a fost egal pentru cele dou variante studiate.

13

Determinarea nr. de boabe/plant Numrul mediu de boabe/plant a fost mai mare n varianta tratat cu pn la 11,7 % fa de martor datorit, evident datorit numrului mai mare de psti pe care le-au avut plantele din varianta studiat. i n acest caz diferena s-a dovedit a fi neasigurat din punct de vedere statistic. CONCLUZII Inocularea cu rizobacterii a boabelor de soia semnate nu determin modificri semnificative ale activitii enzimelor analizate (catalaz, superoxid-dismutaz, alanin-aminotransferaz i aspartataminotransferaz) pe parcursul dezvoltrii vegetative. De asemenea, nu s-au nregistrat diferene semnificative de natur cantitativ sau calitativ ntre variantele experimentale n ceea ce privete coninutul de proteine totale solubile din frunze. Utilizarea tulpinilor rizobacteriene testate determin o cretere a cantitii de pigmeni asimilatori (clorofil a i b, caroteni) n esuturile foliare, cu efecte directe asupra proceselor de fotosintez i implicit asupra cantitii de glucide solubile reductoare. Analiza indicilor biometrici utilizai demonstreaz o stimulare a proceselor de cretere i dezvoltare a plantelor prob n condiiile neutilizrii fertilizanilor. Plantele inoculate cu PGPR s-au dezvoltat mai bine pe nlime, au prezentat un numr mai mare de frunze, o suprafa foliar mai bine reprezentat, un numr mai mare de nodoziti fixatoare de azot i au intrat mai rapid n faza de nflorire. Tratamentul seminelor de soia cu PGPR a influenat n mod evident elementele de productivitate. Toate determinrile efectuate au scos n eviden efectul pozitiv al tratamentului dar, datorit condiiilor specifice anului de experimentare, diferenele n general s-au dovedit a fi neasigurate din punct de vedere statistic. Analiza principalilor compui cu valoare nutritiv depozitai n seminele recoltate arat c aplicarea PGPR pe suprafaa boabelor nainte de nsmnare nu modific semnificativ coninutul de glucide reductoare i lipide. Acest tratament duce ns la o cretere semnificativ (p<0,002) a cantitii de proteine depozitate n seminele obinute din lotul prob, fr a modifica din punct de vedere calitativ spectrul electroforetic. BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. Artenie, V., Tanase, E. (1981) Practicum de biochimie generala. Editura Univ Al. I Cuza, Iasi, 2. Artenie, V., Ungureanu, E., Negura, A. M. (2008) Metode de investigare a metabolismului glucidic si lipidic. Editura Pim, Iasi. 3. Bhuvaneswari, T. V., Goodman, R. N., Bauer, W. D. (1980) Early events in the infection of soybean (Glycine max L. Merr.) by Rhizobium japonicum. I. Location of infectible root cells. Plant Physiol. 66, 1027-1031. 4. Bradford, M. M. (1976 ) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding. Analytical Biochem. 72, 248-254. 5. Cattelan, A. J., Hartel, P. G., Fuhrmann, J. J. (1998) Bacterial composition in the rhizosphere of nodulating and non-nodulating soybean. Soil Science Society of America Journal 62, 1549-1555. 6. Dashti, N., Zhang, F., Hynes, R., Smith, D. L. (1997) Application of plant growth-promoting rhizobacteria to soybean (Glycine max [L] Merr) increases protein and dry matter yield under short-season conditions. Plant and Soil 188, 33-41. 7. De Freitas, J. R., Banerjee, M. R., Germida, J. J. (1997) Phosphate-solubilizing rhizobacteria enhance the growth and yield but not phosphorus uptake of canola (Brassica napus L.). Biol. Fertil. Soils 24, 358-364. 8. Fridlender, M., Inbar, J., Chet, I. (1993) Biological control of soilborne plant pathogens by a -1,3-glucanaseproducing Pseudomonas cepacia. Soil Biol. Biochem. 25, 1211-1221. 9. Glick, B. R. (1999) Biochemical and genetic mechanisms used by plant growth-promoting bacteria. ICP, River Edge, NJ. 10. Hideg, E., Schreiber, U. (2007) Parallel assessment of ROS formation and photosynthesis in leaves by fluorescence imaging. Photosynth Res 92, 103-108. 11. Jacobson, C. B., Pasternak, J. J., Glick, B. R. (1994) Partial purification and characterization of 1aminocyclopropane-1-carbooxylate deaminase from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR 12-2. Can. J. Microbiol 40, 1019-1025. 12. Khalid, A., Arshad, M., Zahir, Z. A. (2004) Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. J Appl Microbiol. 96, 473-480. 13. Matews, C. K., K.E., v. H., Ahern, K. G. (2000) Biochemistry, third edition. Addison-Weasly Publishing Company, San Francisco. 14. Renwick, A., Campbell, R., Coe, S. (1991) Assessment of in vivo screening systems for potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathol. 40, 524-532. 15. Saleh, S. S., Glick, B. R. (2001) Involvement of gacS and ropS in the transcriptional regulation of the plant growth promoting bacteria Enterobacter cloacae CAL2 and UW4. Can. J. Microbiol. 47, 698-705.

14

16. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 17. Shanahan, P., OSullivan, D. J., Simpson, P., Glennon, J. D., OGara, F. (1992) Isolation of 2,4diacetylphloroglucinol from a fluorescent pseudomonad and investigation of physiological parameters influencing its production. Appl. Environ. Microbiol. 58, 353-358. 18. Zahir, Z. A., Arshad, M., Frankenberger, W. T. J. (2003) Plant growth promoting rhizobacteria: applications and perspectives in agriculture. Advances in Agronomy 81, 97-168.

15