1.

COMPOZITIA CHIMICA A BACTERIILOR

Compozitia chimica a bacTeriilor esTe asemanaToare TuTuror organismelor vii. Ea cuprinde n jur de 20 de elemenTe ale sisTemului periodic, care se poT mparti n Trei grupe: elemenTele de baza, H, C, N, O, P si Sulf, care inTra n compozitia subsTantelor cu rol primordial sTrucTural si energeTic a oricarei celule vii (proTeine, lipide si zaharide), elemenTe n concenTratie sub 1% si mai ales sub forma ionizaTa cum sunT K+, Na+, Mg2+, Cl-, Ca2+ eTc. cu rol functional n procesele de acTivare a unor enzime (Mg), n permeabiliTaTea sisTemului membranar al celulei bacTeriene (Ca), n vscoziTaTea ciToplasmei eTc. oligoelemenTele, cum sunT Mn2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Cu2+, MoO42+, SeO32-, WO42- eTc., ce se gasesc n celula bacTeriana n canTiTati foarTe reduse, sub 0,001%, si care inTra n sTrucTura unor coenzime absoluT necesare desfasurarii meTabolismului, continuTul n apa al bacTeriilor se siTueaza n medie la 85% din masa celulara. Apa esTe faza n care se solubilizeaza, sunT TransporTati elecTrolitii si subsTantele neelecTroliTice si mediul n care se peTrec ToaTe reactiile meTabolice. Ea parTicipa la mulTe din acesTe reactii (hidroliza, reactii anabolice eTc.) si formeaza mpreuna cu subsTantele anorganice si macormoleculele organice continuTe o uniTaTe fizico-chimica si biologica.

2. NUTRITIA BACTERIANA
NuTritia bacTeriana reprezinTa ToTaliTaTea proceselor prin care bacTeriile si procura din mediul nconjuraTor subsTantele necesare supravietuirii, cresTerii si nmultirii , iar respiratia bacTeriana modaliTaTea de a-si produce energia necesara acTiviTatii meTabolice. Sursa de energie. n functie de sursa de energie pe care o folosesc, bacTeriile se mparT n: foTosinTeTizanTe, care uTilizeaza energia luminoasa penTru sinTeza compusilor proprii si chimiosinTeTizanTe, care si procura energia prin reactii de oxidoreducere a unor subsTante. BacTeriile care oxideaza subsTantele anorganice se numesc liThoTrofe, iar cele care oxideaza subsTante organice chemoorganoTrofe. Sursa de carbon. Dupa sursa de carbon, bacTeriile se clasifica n: auToTrofe, care sinTeTizeaza compusi organici pornind de la subsTante anorganice, sursa de carbon fiind CO2, mixoTrofe, care folosesc ca sursa de carbon aTT subsTante organice cT si CO2, heTeroTrofe, care uTilizeaza ca sursa de carbon numai subsTante organice. Sursa de azoT a bacTeriilor de inTeres medical o consTiTuie n general aminoacizii, dar unele bacTerii uTilizeaza si sarurile de amoniu (Escherichia coli, Salmonella eTc.).

Necesarul de oxigen penTru dezvolTarea bacTeriilor esTe variabil si va fi discuTaT n cadrul reactiilor de energogeneza.

2.1. NecesiTatile nuTriTive ale bacTeriilor de inTeres medical

BacTeriile de inTeres medical sunT, cu foarTe putine exceptii, chimiosinTeTizanTe heTeroTrofe. Ele au nevoie penTru mulTiplicare de subsTante organice, diversi ioni, oligoelemenTe si facTori de cresTere (viTaminele B1, B2, acid panToTenic, bioTina, lacToflavina acid folic eTc.). Necesarul de subsTante organice esTe foarTe diferiT de la o specie bacTeriana la alTa. AsTfel, de pilda, Escherichia coli culTiva foarTe bine pe medii care au n compozitie o singura sursa organica de carbon (glucoza, aceTaT sau succinaT), o sursa de azoT [(NH4)2SO4)], ioni esentiali dezvolTarii (K+, Mg2+ eTc.) si oligoelemenTe (Cl-, Co, Cu, Mo, Ni, Se, Zn eTc.). AlTe bacTerii au nevoie de subsTante organice ca aminoacizi, purine, pirimidine, viTamine, facTori de cresTere eTc. pe care nu le poT sinTeTiza, deoarece sunT adapTaTe la habiTaTul lor naTural (organismul uman sau animal), care le asigura acesTe subsTante. Cu cT necesiTatile nuTriTive bacTeriilor sunT mai mari cu aTT dependenta lor fata de o gazda naTurala cresTe. AsTfel, o caTegorie aparTe n cadrul bacTeriilor heTeroTrofe sunT bacTeriile paraTrofe. Ele sunT lipsiTe de unele enzime (genul RickeTTsia) sau nu sunT capabile de energogeneza (genul Chlamydia) si nu se poT nmulti decT n celule vii, avnd deci un habiTaT naTural obligaTor inTracelular. NecesiTatile nuTriTive difera chiar si n cadrul aceleiasi specii. AsTfel, prin muTatii sau alTe mecansime ale variabiliTatii geneTice, unele Tulpini pierd proprieTaTea de a sinTeTiza un compus necesar dezvolTarii, nmultirea depinznd de prezenta acesTuia n mediu. AsTfel de Tulpini se numesc auxoTrofe, iar Tulpinile originale din care au proveniT se numesc proToTrofe. De exemplu, Tulpinile proToTrofe de E. coli, principalul agenT eTiologic al infectiilor urinare, sunT capabile sa sinTeTizeze Timidina necesara replicarii ADN. S-a observaT, nsa, la bolnavii cu infectii urinare care au fosT TraTati Timp ndelungaT cu bisepTol, aparitia unor Tulpini auxoTrofe care pierd proprieTaTea de a sinTeTiza Timidina. Deci, uroculTura, pe mediile uzuale, lipsiTe de Timidina, va fi consTanT fals sTerila, Tulpina auxoTrofa prezenTa n urina nepuTndu-se dezvolTa n lipsa acesTui nucleoTid.

3. METABOLISMUL BACTERIAN
MeTabolismul bacTerian cuprinde ToTaliTaTea reactiilor biochimice care au loc n celula bacTeriana, precum si cele care sunT deTerminaTe de microorganism n mediul nconjuraTor. Ele au ca scop final cresTerea si mulTiplicarea bacTeriei si se mparT n: reactii caTabolice, prin care se fragmenTeaza subsTraTul nuTriTiv n uniTati componenTe cu eliberare de energie, reactii meTabolice inTermediare, prin care energia rezulTaTa din primele reactii esTe nmagazinaTa n compusi macroergici si reactiile anabolice, prin care celula bacTeriana si sinTeTizeza subsTantele propri, cu consum energeTic. ToaTe acesTe reactii sunT caTalizaTe de enzime a caror acTiviTaTe esTe conTrolaTa geneTic asTfel ncT inTensiTaTea lor sa fie cT mai eficienT adapTaTa conditiilor n care bacTeria cresTe si se nmultesTe.

3.1. Reactiile caTabolice

BacTeriile heTeroTrofe caTabolizeaza subsTante organice din mediul nconjuraTor prinTr-o succesiune de reactii enzimaTice, care parcurg n principiu 4 faze: descompunerea exTracelulara a subsTantelor organice n uniTati mai mici sub actiunea unor exoenzime. La bacTeriile care au ca habiTaT omul, macromoleculele din mediul ambianT sunT reprezenTaTe de proTeine, acizi nucleici, colagen, mucopolizaharide, lipide eTc. PenTru scindarea acesTor subsTante bacTeriile invazive secreTa exoenzime hidroliTice, care poT fi n acelasi Timp si facTori de paTogeniTaTe. absorbtia subsTantelor din mediul exTern se face prin 3 mecanisme: - pasiv n functie de diferenta de concenTratie a unei subsTante n inTeriorul si exTeriorul celulei ca, de exemplu, n cazul glicerolului; - acTiv prin fosforilarea, cu consum energeTic, a subsTantei ce urmeaza a fi absorbiTa ca, de pilda, glucoza care se absoarbe numai sub forma de glucozo6-fosfaT; - acTiv cu consum energeTic prin legarea subsTantelor de proTeinele de TransporT numiTe permeaze. PrinTr-un asTfel de mecanism se absorb subsTantele pe care celula bacTeriana le depoziTeaza n concenTratii foarTe mari fata de concenTratia din mediu. AsTfel daca celula bacTeriana esTe lipsiTa de permeaza penTru lacToza, aceasTa nu poaTe fi absorbiTa nici daca bacTeria, compleT lipsiTa de lacToza, se afla nTr-o solutie cu continuT foarTe mare de lacToza. O mentiune speciala o meriTa TransporTul Transmembranar de fier, necesar bacTeriilor n mulTiplicare. n tesuTurile organismului fierul nu se gasesTe n sTare libera ci legaT de proTeine, cum sunT Transferina si siderofilina. BacTeriile au dezvolTaT mecanisme ingenioase de absorbtie a fierului prin secretia sideroforilor, subsTante chelaToare de fier care scoT fierul din combinatiile sale facndu-l absorbabil. pregaTirea subsTantelor penTru oxidare prin reactii de decarboxilare, dezaminare, fosforilare eTc. si oxidarea subsTantelor cu eliberare de energie sau respiratia bacTeriana. Oxidarea se definesTe ca o pierdere de elecTroni sau de ioni de hidrogen. SubsTanta care se va oxida esTe donorul, iar cea care se reduce, accepTorul de hidrogen. Deci, n urma oxidarii va rezulTa o subsTanta oxidaTa, o subsTanta redusa si o anumiTa canTiTaTe de energie libera. SubsTanta energogeneTica de baza esTe la mulTe bacTerii glucoza, monozaharid ce poaTe fi meTabolizaT pe mai mulTe cai n functie de performantele oxidaTive ale bacTeriilor. La bacTerii deosebim n functie de accepTorul final de hidrogen, 3 Tipuri de oxidatie: respiratia, n care accepTorul final de hidrogen esTe oxigenul aTmosferic, fermenTatia, n care accepTorul final de hidrogen esTe o subsTanta organica, si respiratia anaeroba, n care accepTorul final de hidrogen esTe oxigenul prezenT nTr-o sare anorganica (niTraT sau sulfaT) care se va reduce. Subliniem ca Termenul de respiratie anaeroba pe care l folosim, noi bacTeriologii, penTru a desemna bacTeriile sTricT anaerobe se refera de fapT la fermenTatie n absenta oxigenului. Respiratia esTe legaTa de sisTemul membranar al bacTeriilor (membrana ciToplasmaTica, mezozomi). CanTiTaTea de energie eliberaTa prin respiratie esTe mai mare decT cea eliberaTa prin fermenTatie, deoarece oxidarii de subsTraT i urmeaza oxidatia de Transfer, n care elecTronii sunT TransporTati pe lantul

respiraTor (ciTocromi, flavoproTeine, ubichinone) pna la accepTorul final de hidrogen (oxigenul aTmosferic) si fosforilarea oxidaTiva. AsTfel, la degradarea compleTa a unei molecule de glucoza bacTeriile obtin 38 de molecule de ATP. ExisTa si posibiliTaTea degradarii incompleTe daToriTa lipsei unor enzime oxidaTive, canTiTaTea de energie fiind mai mica. FermenTatia folosesTe compusi organici ca donori si accepTori de elecTroni si se produce pe urmaToarele cai meTabolice: glicoliza pe calea Emden Meyerhof care Transforma o molecula de glucoza n 2 molecule de acid piruvic, energia rezulTaTa fiind nmagazinaTa n 2 molecule de ATP, fermenTatia secundara a piruvaTului care poaTe fi lacTica, alcoolica, propionica, buTirica, mixTa (lacTica, formica) n functie de produsii de meTabolism rezulTati, cai alTernaTive de meTabolizare a glucozei cum sunT sunTul fosfatilor si calea EnTner-Doudoroff, aceasTa din urma specifica genului Pseudomonas. Din puncT de vedere pracTic, bacTeriile se mparT, dupa necesarul de oxigen, n: bacTerii sTricT aerobe, care se dezvolTa numai n prezenta oxigenului aTmosferic, folosind exclusiv respiratia aeroba si deci oxigenul ca accepTor final de hidrogen. AsTfel de bacTerii sunT, de exemplu, Pseudomonas aeruginosa, CorynebacTerium diphTeriae, MycobacTerium Tuberculosis eTc. bacTerii sTricT anaerobe, care nu se dezvolTa decT n absenta oxigenului, prezenta lui fiind foarTe Toxica culTurii chiar la o presiune de numai 10 -5 aTm. AcesTe bacTerii folosesc ca reactie energogeneTica exclusiv fermenTatia, n conditii anaerobe, deci oxidatia de subsTraT. Daca fermenTatia se produce n prezenta oxigenului, se formeaza radicali de superoxid (O2-) foarTe Toxici. BacTeriile sTricT anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunT lipsiTe de superoxiddismuTaza care Transforma radicalul superoxid n apa oxigenaTa si caTalaza care descompune apa oxigenaTa. Exemple de bacTerii sTricT anaerobe sunT cele din genul ClosTridium, BacTeroides, PrevoTella, FusobacTerium eTc. bacTerii faculTaTiv anaerobe, care se poT dezvolTa aTT n prezenta cT si n absenta oxigenului aTmosferic. Ele uTilizeaza ca reactii energogeneTice respiratia aeroba, fermenTatia iar unele chiar si respiratia anaeroba. MajoriTaTea speciilor de inTeres medical sunT faculTaTiv anaerobe (de pilda, enTerobacTeriile). bacTerii anaerobe aeroToleranTe folosesc numai fermenTatia n prezenta aerului aTmosferic, fara parTiciparea oxigenului la reactiile energogeneTice. Ele Tolereaza oxigenul n mediu fie penTru ca au n echipamenTul enzimaTic superoxiddismuTaza si caTalaza, fie ca enzimele exisTa n mediul de culTura. AsTfel, bacTeriile din genul STrepTococcus sunT lipsiTe de caTalaza, dar poT fi culTivaTe n conditii de aerobioza pe medii cu snge, care suplinesTe caTalaza. bacTerii microaerofile folosesc respiratia si fermenTatia, dar necesiTa o concenTratie mai mare de bioxid de carbon decT cea din aTmosfera penTru reactii de carboxilare. AsTfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria, Brucella, CampylobacTer, necesiTa concenTratii de bioxid de carbon de 6-10%. Reactiile energogeneTice ale bacTeriilor sunT n principiu aceleasi ca si la celulele eucarioTe, si anume: glicoliza pe calea Embden-Mayerhoff (n conditii de aerobioza sau anaerobioza), calea penTozofosfatilor, (n care se produce NADPH2 imporTanT donor de ioni de H penTru reactiile anabolice), beTa-oxidatia acizilor grasi,

ciclul acizilor Tricarboxilici, dezaminarea oxidaTiva si Transaminarea aminoacizilor, oxidarea de subsTraT, fosforilarea oxidaTiva. Liniile meTabolice folosiTe de diferiTele specii bacTeriene variaza foarTe mulT, n functie de subsTraTul care esTe prezenT n mediul n care bacTeria se nmultesTe si de doTarea geneTica a bacTeriei. AsTfel, specia BacTeroides fasTidiosus poaTe caTaboliza doar un singur subsTraT - acidul uric, sau produsii de degradare ai acesTuia pe cnd Pseudomonas mulTivorans poaTe folosi pesTe 100 de subsTraTuri drepT sursa de carbon. CunoasTerea preTentiilor nuTriTive ale bacTeriilor esTe esentiala penTru prepararea unor medii corespunzaToare culTivarii lor, iar cunoasTerea performantelor meTabolice ale microorganismelor esTe imporTanTa prin fapTul ca, alaTuri de morfologie, consTiTuie criTeriile de baza n idenTificarea lor.

3.2. Reactii inTermediare

Energia rezulTaTa n urma oxidarii va fi TransformaTa n energie chimica, fie sub forma unor TioesTeri, ca de exemplu AceTyl~SCoA, fie sub forma de ATP. Energia asTfel sTocaTa va fi eliberaTa la nevoie penTru amorsarea unor reactii caTabolice sau penTru sinTeza unor molecule cu rol sTrucTural sau functional. Unii din produsii inTermediari rezulTati pe parcursul reactiilor de oxidare poT fi uTilizati de bacTerie la sinTeza unor subsTante proprii.

3.3 Reactii anabolice

SunT reactii prin care celula bacTeriana si sinTeTizeaza din compusi simpli, rezulTati n Timpul reactiilor caTabolice sau inTermediare si cu consum energeTic subsTante cu rol sTrucTural (macromolecule) si functional (enzime). La acesTea se adauga sinTeza unor subsTante cu rol de rezerva energeTica (incluzii de polizaharide si lipide). Din puncT de vedere al biosinTezelor, bacTeriile au posibliTati pracTic nelimiTaTe. EsTe suficienT sa ne gndim la complexiTaTea sTrucTurilor membranare ale bacTeriilor si la sTrucTura pereTelui celular, componenTe pe care celula bacTeriana si le sinTeTizeaza, uneori, numai dinTr-un singur compus organic prezenT n mediu. PosibiliTaTea reactiilor de biosinTeza difera de la specie la specie. AsTfel, unele bacTerii sunT capabile sa sinTeTizeze Toti aminoacizii, nucleoTidele, monozaharidele si coenzimele din subsTante simple, rezulTaTe n cursul reactiilor caTabolice si inTermediare ale meTabolismului. AlTe bacTerii nsa sunT lipsiTe de unele linii anabolice, fiind dependenTe de aporTul din exTerior al subsTantelor ce se sinTeTizeaza pe acesTe cai. BacTeriile de inTeres medical se siTueaza nTre cele doua exTreme. Performantele biosinTeTice ale microorganismelor sunT exploaTaTe n diferiTele ramuri ale indusTriei, n care obtinerea pe calea sinTezei chimice a unor produsi ar fi imposibila sau nerenTabila. AsTfel, indusTria farmaceuTica obtine anTibioTicele, unii aminoacizi si viTamine prin acTiviTaTea dirijaTa a microorganismelor, indusTria alimenTara brnzeTurile si bauTurile alcoolice eTc. Unele bacTerii sunT capabile sa meTabolizeze hidrocarburi alifaTice, ele fiind speranta deconTaminarii apelor poluaTe cu titei. Reglarea meTabolismului are ca scop adapTarea economica a reactiilor si a inTensiTatii lor la subsTraTul nuTriTiv exisTenT n mediul n care TraiesTe bacTeria, asTfel ncT ele sa asigure cresTerea si nmultirea acesTeia. Reglarea se efecTueaza

prin modularea acTiviTatii enzimelor bacTeriene, a caror sTrucTura alosTerica favorizeaza inacTivarea lor de caTre produsul final a carui formare au caTalizaT-o.

4. CRE TEREA I NMULTIREA BACTERIILOR

CresTerea si nmultirea bacTeriilor esTe rezulTaTul nuTritiei si al meTabolismului bacTerian. ViTeza de mulTiplicare a bacTeriilor esTe foarTe mare. S-a facuT un calcul ipoTeTic din care rezulTa ca, daca la fiecare 20' are loc o diviziune, dinTr-o celula bacTeriana culTivaTa nTr-un mediu nelimiTaT ar lua nasTere nTr-o zi 1x1021 celule, ceea ce ar corespunde unei mase de 4.000 de Tone. n realiTaTe, o asemenea raTa de nmultire a bacTeriilor nu esTe posibila, fiind mpiedicaTa de epuizarea subsTantelor nuTriTive si a facTorilor de cresTere, pe de o parTe, si de acumularea meTabolitilor Toxici, pe de alTa parTe. BacTeriile se divid n marea lor majoriTaTe prin diviziune binara, cu exceptia chlamydiilor, care au un ciclu de dezvolTare unic n lumea bacTeriana. Diviziunea esTe precedaTa de cresTerea n volum a celulei bacTeriene, dedublarea maTerialului nuclear si a componenTelor ciToplasmaTice, ceea ce duce la un dezacord nTre masa si volumul celulei bacTeriene. Cnd acesT dezacord aTinge un puncT criTic se produce diviziunea celulei parenTale n doua celule fiice, idenTice cu celula din care au proveniT. La bacili diviziunea se face nToTdeauna dupa un plan perpendicular pe lungimea bacTeriilor, n Timp ce la coci planurile de diviziune sunT variaTe. Celulele fiice se poT separa imediaT dupa diviziune sau poT ramne legaTe una de cealalTa, rezulTnd o asezare caracTerisTica, uTila n recunoasTerea bacTeriilor ca, de exemplu, a celor din genul STaphylococcus, STrepTococcus, Neisseria eTc. Diviziunea bacTeriilor gram poziTive are loc prin formarea unui sepT nTre cele doua celule fiice, pe cnd bacTeriile gram negaTive se divid prin sTrangulare direcTa.

4.1. Curba de cresTere si nmultire a bacTeriilor nTr-un mediu limiTaT

Daca se inTroduce un inocul (un numar redus) de celule bacTeriene dinTr-o culTura pura nTr-un mediu de culTura proaspaT si se incubeaza nTr-o aTmosfera prielnica speciei respecTive, bacTeriile vor cresTe si se vor nmulti, iar Timpul care Trece de la o diviziune celulara la urmaToarea se numesTe Timp de generatie. Daca se apreciaza numarul de celule bacTeriene la inTervale diferiTe de Timp de la momenTul inocularii si reprezenTam grafic raporTul care se sTabilesTe nTre acesT numar si Timpul care s-a scurs, vom obtine doua curbe caracTerisTice n functie de celulele bacTeriene luaTe n calcul. o numaraToare ToTala a germenilor ce cuprinde ToaTe celulele bacTeriene care au luaT nasTere, aTT cele vii cT si cele moarTe, sau o numaraToare a germenilor viabili, cu o deosebiTa imporTanta pracTica si care apreciaza numarul de microbi capabili sa se nmulteasca n conTinuare.

4.2. Curba de mulTiplicare a bacTeriilor n mediu limiTaT cuprinde urmaToarele faze:

Faza de lag. n aceasTa perioada nu se remarca o cresTere a numarului de celule, cu ToaTe ca ele cresc n volum si dovedesc o acTiviTaTe meTabolica inTensa.

DuraTa acesTei faze variaza n functie de specie, conditiile de mediu, de numarul de celule din inocul si esTe inTervalul de Timp n care celulele se adapTeaza noilor conditii de mediu. AsTfel, daca mediul n care sunT inoculaTe celulele bacTeriene difera de mediul din care au proveniT, ele vor Trebui sa-si readapTeze echipamenTul enzimaTic noilor conditii, renuntnd la secretia unor enzime pe care le vor nlocui cu alTele. n aceasTa faza se poT induce muTatii sau se produce selectia unor muTanTe capabile sa creasca sau sa se nmulteasca pe noul mediu. SensibiliTaTea bacTeriilor fata de chimioTerapice esTe crescuTa. La majoriTaTea bacTeriilor de inTeres medical, duraTa ei esTe n jur de 1/2 de ora, iar la formele sporulaTe 3-4 ore. Faza exponentiala sau logariTmica esTe precedaTa de o faza de accelerare n care celulele bacTeriene ncep sa se nmulteasca din ce n ce mai repede. Celulele se divid consTanT prin fisiune binara, deci n progresie logariTmica, raporTul dinTre numarul bacTeriilor si Timp fiind liniar. AceasTa raTa inTensa de mulTiplicare esTe posibila doar in viTro, in vivo ea fiind mulT frnaTa de mecanismele apararii anTiinfectioase. DuraTa acesTei perioade esTe dependenTa de aceleasi conditii de mediu ca si faza precedenTa dar si de specie. AsTfel E.coli are un Timp de generatie de aproximaTiv 10 minuTe iar MycobacTerium Tuberculosis pesTe 25 ore. SensibiliTaTea la anTibioTice a microbilor ramne crescuTa. Compozitia mediului de culTura se modifica pna la sfrsiTul acesTei faze pe de o parTe daToriTa consumului principiilor nuTriTivi iar pe de alTa parTe, acumularii de meTaboliti. Faza de nmultire logariTmica esTe urmaTa de o perioada de nceTinire dupa care se insTaleaza. Faza sTationara. MulTiplicarea bacTeriilor n progresie logariTmica nu mai esTe posibila, raTa de nmultire scade TrepTaT pna cnd bacTeriile Trec n faza sTationara. Numarul bacTeriilor ramne consTanT, de unde s-ar puTea deduce ca numarul bacTeriilor care se nasc esTe egal cu cel al bacTeriilor care mor. n realiTaTe, nsa, numarul bacTeriilor ramne consTanT deoarece ele nici nu se nmultesc si nici nu mor. n aceasTa faza, celulele nu mai cresc, ci are loc o acTiviTaTe meTabolica endogena, prin care celula si sinTeTizeaza rezerve de energie si produsi inTermediari necesari mentinerii n viata n noile conditii. nceTarea mulTiplicarii n faza sTationara se daToreaza n principal epuizarii unui facTor nuTriTiv esential din mediu, numiT facTor limiTanT si acumularii unor produsi Toxici cum sunT, de pilda, acizii organici care, prin scaderea pH-ul mediului, limiTeaza mulTiplicarea bacTeriilor. n acesTa faza scade sensibiliTaTea Tulpinilor la chimioTerapice. DaTa fiind schimbarea conditiilor de viata ale bacTeriilor, acesTea vor prezenTa modificari ale morfologiei si fiziologiei lor, aTT unele fata de celelalTe, cT si comparaTiv cu faza exponentiala. AsTfel, bacTeriile gram-poziTive nu mai retin crisTalul violeT si apar gram-negaTive pe froTiurile coloraTe. n faza sTationara celulele contin canTiTati mari de polizaharide si lipide, subsTante pe care nu le gasim n faza de mulTiplicare exponentiala. La ncepuTul fazei sTationare, unele specii bacTeriene produc anumiti meTaboliti secundari cu disTributie Taxonomica foarTe riguroasa. AcesT meTaboliti includ anTibioTice, colicine si exoToxine. Initierea sporogenezei la bacTeriile sporulaTe se peTrece la sfrsiTul fazei exponentiale sau la ncepuTul fazei sTationare. DuraTa fazei sTationare esTe n general de cTeva ore. Faza de declin care dureaza mai mulTe zile se caracTerizeaza prin scaderea numarului de bacTerii, remarcndu-se o divergenta nTre curba care ilusTreaza numarul ToTal de bacTerii si cea care reprezinTa bacTeriile vii. Ea se daToreaza scaderii subsTantelor nuTriTive si acumularii de subsTante Toxice penTru bacTerii. La acesTi facTori se adauga la unele specii bacTeriene proprieTaTea de auToliza cu eliberarea continuTului ciToplasmaTic n mediu. Modificarile morfologice sunT pregnanTe aTT n ceea ce privesTe forma, dimensiunile cT si caracTerele

TincToriale. n Timp mor ToaTe bacTeriile, cu exceptia celor sporulaTe, si culTura se auTosTerilizeaza. CulTivarea bacTeriilor n mediu limiTaT esTe uTilizaTa n laboraToarele de bacTeriologie medicala, penTru sTabilirea diagnosTicului unei infectii bacTeriene, caracTerele culTurale sunT deosebiT de imporTanTe n idenTificarea bacTeriilor.

4.3. Curba de cresTere si nmultire a bacTeriilor n culTuri conTinui

Cnd se urmaresTe obtinerea unei mase mari microbiene sau a unor produsi bacTerieni penTru cerceTare, preparare de vaccinuri, diversele indusTrii (farmaceuTica, alimenTara eTc.), culTivarea bacTeriilor se face n sisTeme deschise, n care mediul de culTura esTe permanenT nlocuiT cu mediu proaspaT, ndeparTndu-se n acelasi Timp masa nou formaTa de bacTerii. BacTeriile vor fi mereu n faza logariTmica, curba de nmultire avnd un aspecT liniar. n acesT fel se obtin culTurile conTinui, penTru realizarea carora esTe necesar un chimiosTaT sau un TurbidisTaT.

4.4. nmultirea bacTeriilor n organism

Urmarind curba de mulTiplicare a bacTeriilor nTr-un mediu limiTaT, puTem deduce ca dupa paTrunderea n organism a unui numar mic de microbi, se poaTe produce o infectie. Un asTfel de exemplu esTe meningiTa, n care meningococul se nmultesTe foarTe rapid punnd viata pacienTului n pericol daca nu se inTervine cu un TraTamenT anTiinfectios. Pe de alTa parTe, nsa, nu ToaTe bacTeriile se divid repede. Baciul Tuberculos, de pilda, a carui Timp de generatie esTe de 24 de ore, se va nmulti lenT si va produce o infectie cu evolutie insidioasa, cronica. n organism, cresTerea si mulTiplicarea bacTeriilor esTe diferiTa de mulTiplicarea in viTro, fiind sTresaTa de necesiTati nuTriTive (prin compeTitie cu flora normala) si prin mecanismele de aparare anTiinfectioasa. Conditiile pe care microorganismele le nTlnesc n organism le selecTeaza pe acelea care cresc n anumiTe limiTe de TemperaTura, osmolariTaTe si pH. Agentii infectiosi pe care i gasim numai n organismele infecTaTe vor supravietui in viTro numai n conditiile de TemperaTura, osmolariTaTe si pH apropiaTe organismului nosTru. Microorganismele care au si alT habiTaT decT omul cresc n limiTe mai largi, necesiTatile nuTriTive ale unui microb reflecTnd, n general, habiTaTul lui. AsTfel, goncocii, care Traiesc aproape numai n organismul uman, au preTentii nuTriTive mai mari necesiTnd penTru culTivarea in viTro medii speciale, pe cnd E. coli, Pseudomonas aeruginosa si alTe specii, care supravietuiesc frecvenT n mediul nconjuraTor, numai medii minimale. La aspecTele mentionaTe se adauga habiTaTul n organism al agentilor infectiosi. AsTfel, bacTeriile cu habiTaT exTracelular sunT expuse actiunii anTicorpilor, complemenTului, fagociTozei, spre deosebire de bacTeriile ce se nmultesc inTracelular si care sunT proTejaTe de actiunea acesTor facTorii si scapa uneori supravegherii imunologice. BacTeriile dezvolTa mecanisme adapTaTive care sa ocoleasca barierele ce se opun nmultirii lor. Precizam ca si n conditiile n care mulTiplicarea bacTeriilor esTe opriTa, simpla lor prezenta n organism poaTe consTiTui un permanenT sTimul imunologic cu urmari benefice sau dimpoTriva, daunaToare.

5. INFLUENTA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA NMULTIRII BACTERIILOR

Unii parameTri fizici ai mediului nconjuraTor influenteaza n mod hoTarTor cresTerea si mulTiplicarea microorganismelor.

5.1. TemperaTura
Temperarura opTima de dezvolTare a bacTeriilor esTe cea a habiTaTului lor naTural. n functie de aceasTa TemperaTura, bacTeriile se mparT n psihrofile, care se nmultesc opTim la 20C dar si sub aceasTa TemperaTura, mezofile, cu TemperaTura opTima cuprinsa nTre 20-40C si Termofile, care se nmultesc opTim la pesTe 45C. BacTeriile mezofile sunT cele paTogene deoarece se nmultesc la TemperaTura organismului, fiind denumiTe si bacTerii homeoTerme. LimiTele de TemperaTura n care acesTe bacTerii poT sa creasca sunT nsa mai mari si variaza de la specie la specie. AsTfel, gonococul si meningococul nu suporTa variatii mai mari de 1-2C fata de TemperaTura opTima, spre deosebire de enTerobacTerii, care cresc n limiTe foarTe largi. Microorganismele sunT sensibile la TemperaTurile ridicaTe, aplicatia pracTica a acesTui aspecT fiind sTerilizarea. TemperaTurile moderaT scazuTe, ca, de pilda, cea de +4oC din frigidere, nu disTrug bacTeriile, dar opresc n general nmultirea lor prelungindu-le viabiliTaTea. Din acesT moTiv, majoriTaTea produselor biologice sau paTologice desTinaTe examenului bacTeriologic se pasTreaza n acesTe conditii. ToTusi, exisTa Tulpini microbiene care se nmultesc si la TemperaTura frigiderului ca, de exemplu, Tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se nmultesc la 0oC si Tulpini din familia EnTerobacTeriaceae (E.coli) care se n nmultesc la +5 oC. AcesT aspecT Trebuie luaT n calcul de caTre medicul bacTeriolog, mai ales acolo unde implicatia eTiologica a unui germene nTr-o infectie se bazeaza pe criTeriul numeric. Congelarea. Daca o suspensie bacTeriana esTe supusa nghetului la TemperaTuri nu prea mici fata de 0oC, crisTalizarea apei deTermina formarea unor spatii ce contin solutii concenTraTe de saruri care nu crisTalizeaza decT la TemperaTuri mulT mai joase (-20C penTru NaCl de exemplu), cnd solutiile devin saTuraTe si poT crisTaliza. AcesTe concenTratii ridicaTe de saruri minerale, la care se adauga crisTalele de apa, vor leza sTrucTurile bacTeriene. Prin nghetare nu vor fi omorTe ToaTe celulele unei suspensii, dar nghetul si dezghetul repeTaT scad foarTe mulT numarul de bacTerii viabile. Conservarea prin congelare. TemperaTura congelaToarelor casnice (-10C) nu esTe desTul de scazuTa penTru a permiTe conservarea bacTeriilor. TemperaTura opTima esTe cea realizaTa de CO2 (-78C) sau de azoTul lichid (-180C). Conservarea bacTeriilor, a virusurilor prin congelare esTe favorizaTa de adaosul de glicerol sau dimeThilsulfoxid. AcesTi agenti chimici induc o solidificare amorfa, viTroasa care nlocuiesTe solicificarea prin crisTalizare.

5.2. pH-ul
BacTeriile se poT dezvolTa n limiTe largi de pH, cele paTogene penTru om dezvolTndu-se opTim la un pH de 7,2-7,4. ExisTa si exceptii ca, de pilda, bacTeriile din genul Brucella care cresc la un pH de 6,0 si vibrionul holeric la pH de 9,0. LacTobacilii, prezenti n flora vaginala normala se dezvolTa chiar si la un pH de 3,9.

Unele bacTerii modifica ele nsasi prin procesele meTabolice pH-ul mediului. AceasTa modificare poaTe opri nmultirea lor sau chiar disTruge culTura. Din acesT moTiv, mulTe medii au n compozitia lor solutii Tampon care mentin pH-ul n limiTe convenabile. Modificarea de caTre o bacTerie a pH-lui unui mediu poaTe avea valoare deosebiTa n idenTificarea unui microb si poaTe fi sesizaTa prin adaugarea n mediu a unui indicaTor de pH. FoarTe mulTe bacTerii se idenTifica biochimic prin proprieTaTea lor de a fermenTa diferiTe zaharuri. AceasTa capaciTaTe se evidentiaza Tocmai prin nsamntarea unei bacTerii pe mai mulTe medii ce contin fiecare alT zahar si un indicaTor de pH. n cazul fermenTarii, acidifierea va deTermina schimbarea culorii mediului.

5.3. UmidiTaTea
Apa libera esTe absoluT necesara cresTerii si mulTiplicarii microbilor. Necesarul de apa variaza n functie de specie. AsTfel, daToriTa continuTului sarac n apa a unor alimenTe cum sunT gemul de frucTe, pinea, unele sorTuri de cascaval, arahidele eTc., mulTiplicarea bacTeriilor esTe pracTic imposibila, n Timp ce mucegaiurile se poT dezvolTa foarTe bine chiar si n acesTe conditii. PenTru a aprecia umidiTaTea, se compara continuTul n apa a vaporilor deasupra apei curaTe, care se noTeaza cu 1, cu continuTul n vapori deasupra mediului de culTura. BacTeriile de inTeres medical au nevoie de o umidiTaTe de 0,98, pe cnd ciupercile cresc si la o umidiTaTe de 0,8. Prin liofilizare (desicare brusca la -78oC), care esTe o meToda de conservare a microbilor, se exTrage pracTic nTreaga apa libera din celulele bacTeriene, ceea ce are ca urmare cresTerea sTabiliTatii biopolimerilor si nceTarea meTabolismului. BacTeriile liofiliizaTe se pasTreaza ani de zile.

5.4. ConcenTratia de bioxid de carbon

Cu ToaTe ca bacTeriile de inTeres medical nu poT folosi bio

 expune o culTura bacTeriana care a fosT iradiaTa cu raze UV la lumina vizibila, o parTe din dimerii de Timina se vor disocia si bacTeriile aparenT omorTe si reiau acTiviTaTea meTabolica si nmultirea. AceasTa poaTe depasi de suTe de ori acTiviTaTea initiala a culTurii neiradiaTe. n scop pracTic lampile cu vapori de mercur se folosesc penTru a reduce numarul de bacTerii exisTenTe n aer n salile de operatie, n laboraToare, n ncaperi n care sunT adaposTiTe animale de exprienta eTc. EfecTul bacTericid al razelor solare se daToreaza continuTului n raze UV (300400nm). n conditii naTurale efecTul bacTericid al luminii solare esTe mai mare n tarile sudice unde continuTul n raze UV esTe mare. Semple si Greig au araTaT n India (1909) ca bacilii Tifici expusi pe lenjerie alba la soare sunT disTrusi n doua ore, pe cnd la nTuneric si pasTreaza viabiliaTea pesTe 6 zile. S-a observaT nsa ca expunerea la lumina puTernica solara poaTe omor bacTeriile chiar cnd radiatiile UV sunT ecranaTe, daToriTa sensibiliTatii la lumina a unor subsTante necesare meTabolismului bacTerian cum sunT riboflavina si porfiriniele. AsTfel, expunerea la lumina solara a fiolelor n care se afla BCG1 va avea ca urmare pierderea viabiliTatii si deci a eficientei vaccinului.

Sensibilizarea foTodinamica. Razele luminoase vizibile au o actiune bacTericida slaba, care poaTe nsa fi crescuTa pna la nivelul actiunii razelor UV daca sunT TrecuTe prin coloranti fluorescenti ca, de pilda, eozina, rosu bengal eTc. 5.9.2. Radiatiile ionizanTe Mecanismul bacTericid al acesTor raze consTa n formarea n celula a unor radicali cu viata scurTa si proToni. AcesTi produsi vor alTera bazele azoTaTe si legaTurile dinTre ele. EfecTul bacTericid al razelor ionizanTe depinde de canTiTaTea de energie absorbiTa, TemperaTura, presiuea partiala a oxigenului, continuTul n subsTante organice, prezenta unor subsTante proTecToare ca alcoolii alifaTici sau subsTante bogaTe n grupari sulfhidrilice, specia microorganismului si continuTul n apa. Sporii sunT n general mai rezisTenti decT formele vegeTaTive ale bacTeriilor, exceptie fiind o bacTerie nesporulaTa, Micrococcus radiodurans, care esTe cel mai rezisTenT microorganism la radiatii. El rezisTa la doze de 200 de ori mai mari decT resTul bacTeriilor daToriTa fapTului ca esTe echipaT cu mecanisme deosebiT de eficienTe de reparare a alTerarilor acizilor nucleici.

6. METODE DE CULTIVARE A BACTERIILOR

CunoasTerea necesiTatilor nuTriTive ale bacTeriilor esTe foarTe imporTanTa n bacTeriologia medicala, deoarece sTa la baza prepararii mediilor de culTura desTinaTe izolarii diverselor specii bacTeriene din produsele biologice sau paTologice. La ncepuTurile dezvolTarii bacTeriologiei, prepararea mediilor a fosT arTizanala, numerosi bacTeriologi inTrnd n isToria microbiologiei prin mediile pe care le-au preparaT si care le poarTa si asTazi numele. AsTfel, aminTim, de exemplu, mediul Loeffler penTru culTivarea bacilului difTeric, mediul LwensTein-Jensen penTru bacilul lui Koch, mediul selecTiv Wilson-Blair penTru salmonele si mulTe alTele. Prin cerceTarea necesiTatilor nuTriTive ale diferiTelor specii s-au realizaT medii adecvaTe penTru aproape ToaTe bacTeriile de inTeres medical, speciile neculTivabile fiind foarTe putine, ca, de pilda, MycobacTerium leprae si unele spirocheTe prinTre care Treponema pallidum. CulTivarea bacTeriilor n scop diagnosTic pune n esenta doua probleme: alegerea unui mediu de culTura opTim, care sa permiTa izolarea TuTuror bacTeriilor care ar puTea fi prezenTe n produsul de examinaT si obtinerea bacTeriilor n culTuri pure, penTru a puTea fi idenTificaTe.

6.1. Conditii generale penTru culTivarea bacTeriilor

Un mediu de culTura uzual Trebuie sa contina apa, subsTante organice, minerale, oligoelemenTe si facTori de cresTere. PenTru saTisfacea acesTor necesiTati se ulTilizeaza diferiTe subsTraTuri biologice nuTriTive complexe care au n compozitia lor acesTe ingredinenTe. AsTfel: - pepTonele, care se obtin prin hidroliza enzimaTica sau acida a proTeinelor de origine animala (de exemplu faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarTe bine definiTa, iar prin continuTul n pepTide si aminoacizi consTiTuie o sursa universala de azoT, penTru ToaTe bacTeriile culTivabile, fiind folosiTe pracTic n prepararea TuTuror mediilor de culTura, - exTracTul de carne, ce se obtine prin deshidraTarea decocTului de carne de viTa. AcesTa contine canTiTati imporTanTe de creaTina, xanTina, hipoxanTina, acid

uric, acid adenilic, glicocol, uree, gluTamina ca sursa de azoT precum si glicogen, hexozofosfati, acid lacTic eTc. ca sursa de carbon, - exTracTul de drojdie, care se obtine prin culTivarea conTrolaTa a drojdiilor si care contine numeroase viTamine, mai ales cele din grupul B, n afara de ingredienTele mai sus mentionaTe mai aminTim: - clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale nTr-o concenTratie de 0,9%. PenTru culTivarea bacTeriilor halofile concenTratie poaTe cresTe pna la 10%, - mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, maniTol) poT nmbogati mediile, deoarece consTiTuie surse de carbon usor accesibile mulTor bacTerii, CulTivarea microbilor pe medii lichide. Mediile lichide se folosesc cel mai adesea penTru nmultirea unor microbi care se gasesc n numar mic nTr-un anumiT produs. Cel mai simplu mediu folosiT n laboraTorul de bacTeriologie esTe bulionul care se prepara din decocT de carne de vaca, pepTona si clorura de sodiu. CulTivarea unui produs pe medii lichide are dezavanTajul ca nu permiTe nsa obtinerea unei culTuri pure. CaracTerele culTurale ale microbilor pe medii lichide difera. AsTfel, bacTeriile apartinnd familiei EnTerobacTeriaceae Tulbura uniform mediul, alTele, ca de pilda bacTeriile sTricT aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului. AlTele formeaza agregaTe care se dezvolTa sub forma de grunji ce se depun pe pereTele eprubeTei sau la fundul mediului (STrepTococcus). Unele bacTerii secreTa n mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa). CulTivarea bacTeriilor pe medii solide. InTroducerea mediilor de culTura solide a nsemnaT un progres urias n Tehnicile de diagnosTic, deoarece permiTe dezvolTarea disTincTa a microbilor, sub forma de colonii izolaTe. O colonie bacTeriana esTe o micropopulatie ce rezulTa din nmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila n general cu ochiul liber. Cel mai simplu mediu solid esTe geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei subsTanta gelificabile, care de regula esTe geloza, un polizaharid obtinuT din alga marina agar-agar. La aceasT mediu simplu se poT adauga diferiTe ingredienTe (snge de oaie, ser, asciTa, exTracT de drojdie eTc.) penTru a puTea culTiva bacTeriile preTentioase. CaracTerele culTurale sunT foarTe imporTanTe n idenTificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie cu ajuTorul unei lupe. ElemenTele ce se descriu, n general, sunT dimensiunea, forma, pigmenTul, consisTenta, aderenta la mediu, acTiviTaTea hemoliTica si unele modificari pe care microorganismele le produc n mediul respecTiv. Coloniile cu aspecT neTed, cu marginile regulaTe si care se suspenda omogen n ser fiziologic se numesc colonii de Tip S (smooTh), pe cnd coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulaTe si care agluTineaza sponaTan n ser fiziologic - colonii de Tip R (rough). n general, cu unele exceptii, coloniile S apartin Tupinilor virulenTe, pe cnd cele R sunT nevirulenTe. CulTivarea microbilor pe medii solide permiTe, de asemenea, numaraToarea de germeni nTr-un anumiT produs. AcesT aspecT esTe deosebiT de imporTanT deoarece n mulTe infectii criTeriul de implicare eTiologic esTe numarul bacTeriilor n produsul de examinaT (infectii urinare). Medii speciale. ExisTa siTuatii n care izolarea unui microb necesiTa medii deosebiTe care sa favorizeze selecTarea lui din produse inTens conTaminaTe.

Mediile de mbogatire sunT medii lichide care permiT nmultirea preferentiala a unui microb dinTr-un amesTec. AsTfel sunT mediile cu continuT mare de clorura de sodiu (1-10%) n care se poT dezvolTa numai bacTerii halofile ca, de exemplu, sTafilococul (mediul Chapmann lichid) si enTerococul. Unele medii de mbogatire au ca facTor elecTiv anumiTe subsTante, ca, de exemplu, seleniTul acid de sodiu, care permiTe dezvolTarea salmonelelor din maTeriile fecale. AlTe medii se bazeaza pe propieTaTea unor germeni de a se dezvolTa la un pH mai acid sau mai alcalin decT majoriTaTea speciilor bacTeriene de inTeres medical. AsTfel, vibrionul holeric se dezvolTa la un pH alcalin (9) iar brucelele la la un pH acid (6). Medii selecTive. Daca un mediu de mbogatire se solidifica, rezulTa un mediu selecTiv care are avanTajul obtinerii microbilor sub forma de colonii izolaTe. DaToriTa acesTor medii, izolarea si idenTificarea bacTeriilor esTe asTazi mulT simplificaTa. Mediile selecTive, care se bazeaza pe parTiculariTatile meTabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezisTenta naTurala a acesTora la anTibioTice, sunT uTilizaTe n mod curenT n laboraToarele de bacTeriologie, deoarece permiT, pracTic, izolarea dinTr-un amesTec de microbi, a oricarui microb n culTura pura. Mediile de diagnosTic sunT medii de culTura care evidentiaza anumiTe proprieTati fiziologice si caracTere biochimice ale Tulpinilor bacTeriene pe baza carora acesTea poT fi idenTificaTe. AsTfel, de exemplu, numeroase specii bacTeriene se recunosc pe baza zaharurilor pe care le fermenTeaza. Mediile de diagnosTic cu zaharuri contin zaharul de cerceTaT si un indicaTor de pH. n cazul n care bacTeria nsamntaTa n acesT mediu va fermenTa zaharul, culoarea mediului se va schimba dupa cTeva ore daToriTa scaderii pH-ului.

Daca n TrecuT mediile de culTura se preparau n laboraToarele de bacTeriologie, asTazi productia lor a deveniT o indusTrie puTernica. ExisTa mii de firme care sunT nTr-o permanenTa concurenta, rezulTaTul fiind elaborarea unor medii de culTura din ce n ce mai performanTe, care usureaza si mbunaTatesc asisTenta medicala microbiologica.