Diagnosticul molecular al -talasemiilor

RODICA TALMACI Institutul de Genetic al Universitii Bucureti Aleea Portocalilor nr. 1-3, sector 6, Bucureti; e-mail: rtalmaci@botanic.unibuc.ro

1. Introducere
Dezvoltarea rapid a biologiei moleculare a contribuit semnificativ pentru o mai bun cunoatere a mecanismelor ce stau la baza multor boli genetice. Metodele de analiz ADN sunt utilizate pentru diagnosticul clinic al multor boli genetice, iar aplicarea lor este una din principalele elemente ce definesc ct de moderne sunt tehnicile i metodele de diagnostic. Deoarece 60% dintre boli sunt considerate a fi genetice, diagnosticarea lor ar trebui s se bazeze pe diagnosticul molecular. Aplicarea metodelor de analiz ADN n diagnosticul clinic poate indica direct sau indirect prezena unei gene deficiente la un pacient cu modificri genetice i la familia sa. De asemenea, se pot identifica mutaiile responsabile pentru acest defect. n prezent, pot fi diagnosticate peste 100 de boli, utiliznd metodele de analiz ADN. Laboratorul de Diagnostic Molecular al Institututului de Genetic este implicat n studii privind diagnosticul molecular al -talasemiiilor din Romnia. n diagnosticul molecular al -talasemiilor se aplic dou abordri metodologice. Prima este analiza modului de transmitere a bolii la familiile cu risc genetic, iar a doua este identificarea mutaiilor responsabile pentru defectul din gena analizat. -TALASEMIILE sunt determinate de incapacitatea sintezei -globinei, prin reducerea cu 5-30% (+) sau absena () sintezei lanurilor ale hemoglobinei (Hb). Acest fapt determin un exces de lanuri care se acumuleaz i distrug globulele roii ale sngelui, determinnd anemii grave care, n final, duc la decesul persoanelor afectate n jurul vrstei de 20 de ani. La homozogoii cu -talasemie, electroforetic se constat scderea drastic a fraciei de Hb A1 i creterea fraciilor de Hb F i A2. Heterozigoii sunt persoane care nu necesit, de obicei, tratament medical i nu pot fi identificati dect prin analiza microscopic a hematiilor. Ei nu prezint nici un fel de tulburri clinice manifeste, dei au o anemie microcitar hipocrom. Heterozigoii sunt identificai deseori ntmpltor sau n cadrul programelor de screening. Caracteristic, ei prezint fracia de Hb A2 crescut la mai mult de 4%.

2. Mutatiile -talasemice
-talasemiile sunt expresia unei considerabile diversitati de evenimente mutationale in gena -globinei (clusterul de gene -globinice este localizat pe cromozomul 11 intr-o regiune de 50 kb): mutatii ale promotorului, deletii, modificari ale cadrului de citire a genei, mutatii de splicing, anomalii ale semnalului de poliadenilare, mutatii ale secventelor consens, situsiri de splicing in exoni, situsuri de splicing in introni, mutatii ale codonului de initiere a translatiei (tabelul 1).
179

RODICA TALMACI

Aceste mutatii se incadreaza in doua clase de mutatii ce afecteaza gena -globinei: Mutatii care blocheaza sinteza -globinei, dand fenotipul o Mutatii nonsens exemplu: mutatia cd39 (C T) introduce codonul de terminalizare AUG in gena, respectiv UAG in ARNm, rezultand un ARNm nefunctional Mutatiile cadrului de citire a genei exemplu: -1 in cd41 (UGA); -1 in cd6 Mutatiile in regiunea de splicing (splice jonction) exemplu: IVSI-1 (G A); IVSII-1 (G A). Toate jonctiunile intronexon confirma regula Chambon 5 GT/AG 3 care este ncesara pentru un splicing normal. Mutatii care diminueaza sinteza -globinei, dand fenotipul +: mutatii consens exemplu: IVSI-5 (G- T); IVSI-6 (T - C) - se formeaza situsuri de splicind alternative mutatii punctiforme in exoni exemplu: cd27 (G T) mutatii punctiforme in introni exemplu: IVSI-110, IVSII-745 mutatii ale promotorului exemplu: -88 (C T); -31 (A G). Secventele promotoare se afla langa situsul de initiere a transcriptiei si include cutia CAAT si cutia TATA. Studii de expresie genica au aratat ca deletia acestor regiuni box, substitutii ale unui singur nucleotid in interiorul acestor regiuni sau schimburi in distana dintre ele cauzeaza o descrestere a nivelului transcriptiei genei. Tabelul 1. Tipurile de mutaii n -talasemii
CLASA DE MUTAII ARNm NEFUNCIONAL MUTAII NONSENS Codonul 17(AT) Codonul 39(CT) Codonul 15 (GA) MUTAII ALE CADRULUI DE CITIRE (FRAMESHIFT) -2 codon 8 -1 codon 16 -1 codon 44 +1 codonii 8/9 -4 codonii 41/42 -1 codon 6 +1 codonii 71/72 MUTAII N PROCESAREA ARN SCHIMBRI SPLICE JONCTION IVS-1 poziia 1(GA) IVS-2 poziia 1(GA) SCHIMBRI CONSENS IVS-1 poziia 6(TC) SCHIMBRI INTERNE N INTRONI IVS-1 poziia 110(GA) IVS-2 poziia 705(TG) IVS-2 poziia 745(CG) IVS-1 poziia 116(TG) SUBSTITUII N REGIUNI CODIFICATOARE Codonul 27(GT) MUTAII DE TRANSCRIPIE -87 (CG) TIPUL POPULAIA DETECTAREA DIRECT Oligo Mae I Oligo

o o o

Chinez Mediteranean Indian

0 0 0 0 0 0 0

Turc Indian Kurdish Indiana Indiana Mediteraneana Chinez

Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo Mst II Oligo

0 0 + + + + ? Knossos + 180

Mediteranean Mediteranean Mediteranean Mediteranean Mediteranean Mediteranean Mediteranean Mediteranean Mediteranean

Oligo Hph I Sfa NI Oligo Oligo Rsa I Mae I Hb Knossos Avr II

Diagnosticul molecular al -talasemiilor

2.1. Mutaiile ce afecteaz procesarea ARNm a hemoglobinelor ARNm nefuncionale. Mai multe mutante talasemice determin producerea de ARN nefuncional. Acestea sunt cauzate fie de mutaii nonsens, fie de mutaii ale cadrului de citire (frameshift). Mutaiile nonsens sunt substituii ale unei singure nucleotide n codoni normali care creeaz un codon de terminalizare. De exemplu, n otalasemia care este dat de substituia C cu T n codonul 39 introduce codonul de terminalizare UAG n ARN globinei. Aceast mutaie s-a descoperit la marea majoritate a cromozomilor talasemici de la pacieni din regiunea Mediteranean. Mutaia cd 39 i mutaia nonsens a codonului 17 descoperit n China, sunt detectate utiliznd enzima Mae I. O a treia mutaie nonsens, mutaia din codonul 15 a fost descris n India. 2.2. Mutaiile cadrului de citire (frameshift) sunt deleii sau inserii a 1, 2, sau mai mult de 3 nucleotide care altereaz cadrul de citire al ARNm prin introducerea unui codon de terminalizare. De exemplu, a fost descris o gen otalasemic la un pacient din India, avnd o deleie a unei singure nucelotide (C) n poziia a treia a codonului 41. Aceasta determin un cadru de citire alterat al ARNm, dnd natere la un codon (UGA) de terminalizare ntr-o poziie ce corespunde codonilor 6061. Mutaiile frameshift par a fi cauza cea mai frecvent a otalasemiei i se afl n regiuni cu repetiii directe, scurte, ce apar prin mecanisme de replicare de tip slippage. Interesant este faptul c o mutaie frameshift n codonul 6 la un pacient mediteranean d natere unui fragment de restricie identic cu cel din mutaie S. Peptidele care rezult din translaia ARNm anormale produse de astfel de mutaii de terminalizare prematur sunt instabile, ntruct ele nu au fost identificate n celule eritroide. 2.3. Mutaii ale procesrii ARN Studiul detaliat al genelor -talasemice prin analiza de secveniere i funcionare in vitro are o valoare enorm n nelegerea procesrii ARNm. Toate jonciunile intron exon confirm regula Chambon (5 GT/AG3) necesar pentru un splicing normal. Mutaiile ce altereaz aceste nucleotide nu vor avea un splicing normal i va rezulta un fenotip o-talasemic. Una dintre aceste mutaii (GA) din intronul II (IVS II) este detectabila cu enzima de restricie Hph I. Au fost descrise dou mutaii, n care exist o deleie mic la captul 3 al IVS I ce inactiveaz complet un splicing normal. Dou mutaii n IVS I la captul 5 al secvenei consens dau natere la +-talasemie. Una dintre aceste mutaii (TC la poziia 6 din IVS I) este de origine mediteranean i este asociata cu o form uoar, din punct de vedere clinic, de +-talasemie. Au fost descrise i alte mutaii ce duc la -talasemie prin crearea de situri de splicing alternative. Prima mutaie descris a fost substituia GA la nucleotidul 21 de la captul 3 al jonciunii primului intron. Mutaia -talasemic creeaz un AG ceea ce permite secvenei de la aceast poziie s se comporte ca un situs de splicing. Studiile de expresie ale acestor mutante n celulele HeLa au artat c primul intron a fost incorect procesat n aproximativ 90% din ARNm n cazul noului situs de splicing creat la punctul de mutaie. Restul de 10% din ARNm a fost corect procesat i tradus. Trebuie notat c aceast mutaie particular este foarte des asociat cu polimorfismul AvaII rar identificat n cromozomii A normali. Astfel, utilizarea acestui polimorfism a sporit realizarea unui diagnostic prenatal prin analiza de linkage n populaia mediteranean. Aceast +-talasemie i mutaia cd 39 n o-talasemie constitue majoritatea cazurilor -talasemice n populaia mediteranean. Mutaiile n secvena codificatoare pot de asemenea, determina procesri anormale ale ARNm. Secvena din jurul dinucleotidului GT din codonul 25 are 6 din 9 poziii n comun cu secvena consens de la situl de jonciune de la captul 5, dar nu par s fie implicate n tipul procesrii normale. Trei mutaii au fost descrise n interiorul acestui situs de splicing care duc la activarea sa. Prima mutaie (GA din codonul 26) d natere structurii proprii HbE care
181

RODICA TALMACI

este asociat cu fenotipul unei -talasemii uoare. Similar, Hb Knossos are o mutaie n codonul 27 i prezint fenotip -talasemic. A treia mutaie ce face parte din acest tip este substituia AT din codonul 24. Aceasta este o substituie silenioas la nivel de protein, dar este asociat cu o severitate moderat a fenotipului +-talasemic. 2.4. Mutaii transcripionale Compararea secvenelor de ADN dintre specii au demonstrat c exist secvene conservate la captul 5 n genele funcionale. Aceste secvene promotorare se afl lng situsul de iniiere a transcripiei i include secvena CAAT (CAAT box) i secvena TATA (TATA box). Studii de expresie genic au artat c deleia acestor regiuni, substituii ale unui singur nucleotid n interiorul acestor regiuni sau schimbri n distana dintre ele cauzeaz o scdere a nivelului transcripiei genei. Au fost descoperite ase gene globinice talasemice care au o substituie a unui singur nucleotid n secvenele sale promotoare. La trei dintre acestea s-a studiat expresia lor i s-a artat c aveau o transcripie redus. 2.5. Mutaii n poliadenilare. O mutaie talasemic de poliadenilare a fost descris la un pacient negru american. Baza molecular a acestei talasemii este analoag cu mutaia talasemic de poliadenilare. 2.6. Mutaii silenioase Recent a fost raportat o alel +-talasemic la o familie albanez, care, studiat prin analiza standard a structurii i funciei genei, nu avea mutaii demonstrabile n gena globinei. n plus, analiza polimorfismelor ADN n familie a sugerat posibilitatea c alela transmis silenios poate s nu fie linkat la clusterul genic globinic. Mecanismul iniial este ns ipotetic. S-ar putea s existe o mutaie structural care blocheaz transcripia; s-ar putea s lipseasc o gen reglatoare distant, care mpiedic expresia genei structurale sau s lipseasc ntreaga secven de control situat aproape de gena structural pentru globin. n alte cazuri ARNm se formeaz, ajunge n citoplasm i totui sinteza lanului nu are loc. Pentru a explica acest fapt s-a presupus c sinteza implic prezena unui factor, indispensabil atarii ARNm de ribozomi i c uneori acest factor poate lipsi. Absena sintezei ar putea fi condiionat i de o deficien intrinsec a ARNm. Manifestrile clinice ale +-talasemiei sunt asemntoare cu cele ale otalasemiei, dei geneza lor este fundamental diferit. Exist, de asemenea, talasemii silenioase, care pot fi bnuite la copiii cu anemie Cooley care au doar un singur printe heterozigot cert. Rmn ns destul de multe necunoscute. Important este faptul c studiul talasemiei a dat o nou explicaie variabilitii genetice.

3. Metode i tehnici de diagnostic molecular

Progresul remarcabil n caracterizarea mutaiilor -talasemice din populaii a fost posibil odat cu dezvoltarea strategiilor eficiente pentru clonarea diferitor gene globinice din -talasemii. Aceste arii de dezvolare au dus la descoperirea c diferite haplotipuri (lincajul RFLP de-a lungul unui cluster a genei globinei) tind sa fie asociate cu diferite mutaii talasemice. Bolile monogenice, precum -talasemiile, sunt caracterizate prin tehnici de diagnostic bazate pe reactia de polimerizare n lan (PCR), analiza situsului de restrictie, hibridizare cu oligonucleotide specifice, s.a. 3.1. Amplificarea genei -globinei prin metoda PCR PCR permite amplificarea in vitro a genei de interes, prezent ntr-o populaie heterogen de ADN. Pentru amplificarea secvenei int sunt necesari doi primeri
182

Diagnosticul molecular al -talasemiilor

oligonucleotidici care hibridizeaz cu secvenele complementare ce flancheaz regiunea de interes; precursori dezoxinucleotidici (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) i o ADN polimeraz termorezistent. Tehnica PCR cuprinde urmatoarele etape: -denaturarea ADN prin incubare la 94oC; -asocierea primerilor la cele doua capete ale secventei de interes; -extinderea primerilor prin activarea ADN polimerazei; se foloseste Taq-polimeraza care este termorezistent i nu este distrus de denaturrile repetate prin temperatur mare n timpul reaciei PCR. Aceste trei operatiuni se repet pentru un numar dorit de cicluri. Aceste cicluri se realizeaz cu ajutorul aparatului thermo-cycler. 3.2. Analiza situsului de restricie Gena amplificat este supus digestiei enzimatice cu endonucleaze de restrictie pentru identificarea situsurilor n care apar mutaii. Existena situsurilor depinde de faptul c modificrile n secvena de baze altereaz fenotipul. O microdeleie sau o inserie care afecteaz situsul de restricie va cauza o reducere corespunztoare sau o cretere n marime a fragmentelor de restricie n care se afl, astfel apare polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (RFLP). Acest polimorfism poate fi utilizat ca marker genetic n evaluarea genotipului (Fig. 1). Identificarea unui astfel de marker ofer o procedur de diagnostic pentru identificarea bolii. Dac markerul de restricie este legat de fenotip, atunci prezena lui poate fi utilizat n diagnosticul pre- sau postnatal al bolii. Polimorfismul situsului de restricie Hpa I lng gena -globinei i polimorfismul situsurilor de restrictie Mae I, Dde I, Mst II, Rsa I din interiorul genei au fost utilizate n diagnosticul molecular al -talasemiei. Pentru detectarea lantului din hemoglobinopatii, acest tip de analiz este posibil pentru acele cupluri cu risc, la care parinii sunt heterozigoi pentru unul sau mai multe situsuri polimorfice n cluster-ul -globinic. Studii familiale au deobicei succes n a determina care forme de polimorfism segreg cu alela modificat a -globinei i care cu alela normal a -globinei la ambii prini. Examinarea tipului de polimorfism n ADN fetal, identific ce tipuri de polimorfism sunt motenite de fetus. RFLP-ul este uor de utilizat pentru diagnosticul hemoglobinopatiilor, datorit gradului nalt de polimorfism n regiunea genei -globinei i, de asemenea, datorit aplicabilitii sale n determinarea prenatal a unor variante genice ale globinei. Mutaia (6 GluVal) ce schimb CCTGAGGCCTGTGG poate fi detectat cu ajutorul enzimelor de restrictie Mnl I, Dde I, Mst II. Cea mai des utilizat este Mst II. n ADN normal se produce un fragment de 1,2 kb. Mutaia schimb acest fragment de 1,2 kb n unul de 1,4 kb. Folosind fragmentul de 1,2 kb ca prob n analiza Southern blot se permite determinarea genotipurilor. ntr-o mulime de alele -talasemice sunt alterate situsurile de recunoatere pentru endonucleazele de restricie. Diagnosticul molecular, pe baza polimorfismului situsurilor de restrictie n gena -globinei, a fost aplicat i pentru o mutaie nonsens (CAGGlnTAGStop) n codonul ce corespunde aminoacidului 39 - mutaia cd 39. Prezena mutaiei n genom determin crearea unui situs Mae I (GATC) suplimentar n gena -globinei. Mutaia cd 39 este o mutaie cu fenotip [0] , care se caracterizeaz prin apariia, n poziia 39 a exonului I, a unui codon nonsens, alternd astfel translaia lanului al globinei.

183

RODICA TALMACI

Figura 1. Harta genetic a genelor globinice. (A) Cluster-ul genic -globinic. Prin sgei este artat localizarea celor 18 situsuri polimorfice de restricie. Situsurile sunt detectate cu: 1-Taq I; 2- Hinc II; 3-Hind III; 4- Hind III; 5- Pvu II; 6- Hinc II ; 7- Ava II; 8- Hinc II; 9- Rsa I; 10- Taq I; 11- Hinf I; 12- Rsa I; 13- HgiA I; 14Ava II; 15- Hpa I; 16- Hind III; 17- Bam HI; 18- Rsa I; (B) Cluster-ul de gene -globinice. Prin sgei este artat localizarea polimorfismelor ADN. Liniile ntrerupte dintre dou sgei indic regiuni cu variabilitate nalt (HVR); situsurile polimorfice de restricie sunt detectate cu: 1- Eco RI; 2- Sac I; 3- Bgl II.

3.3. Primare specific alelei (allele-specific priming) O modificare a metodei PCR, care permite detecia mutaiilor punctiforme cunoscute prin amplificare cu specificitate alelic a ADN este metoda ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR). ARMS este o metod care nu implic utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotiparea este posibil prin simpla examinare a migrrii produsului PCR prin elecroforez n gel de agaroz. Aceast tehnic este prezentat n figura 2 i este cunoscut ca sistem mutaional de amplificare refractar, descris pentru prima dat de Newton i colaboratorii. IVS I-5 (G-C)

IVS 1 285 B M

IVS 2 861 E CONTROL D

Figura 2. Diagrama ce arat gena -globinic i poziia mutaiei IVS I-5 (G-C) n secvena intronic (IVS I), mpreun cu poziiile primerului ARMS mutant (M) ce detecteaz mutaia IVS I-5, primerul B i perechea de primeri control D i E.

Metoda const n utilizarea a doi primeri care prezint aceeai secven de nucleotide cu excepia nucleotidului terminal 3 unul complementar cu alela normal, iar cellat cu alela mutant. Pentru amplificarea enzimatic se folosete Taq-polimeraza, aceast enzim nu are activitate 35 exonucleazic, ceea ce implic necesitatea unei perfecte complementariti a primerului cu capatul 3 al matriei ADN. Rezultatul se obine n urma electroforezei n gel de agaroz prin prezena sau absena produsului de amplificare respectiv. Pentru tehnica ARMS se construeste un primer oligonucleotidic care s amplifice preferenial o alel fa de alta. Specificitatea este obinuta dac oligonucleotidul este complementar cu secvena alelei dorite, dar nu este complementar cu cealalt alel la captul 3 sau n vecintatea captului 3' al primerului alelic specific. Alela dorit este intens
184

Diagnosticul molecular al -talasemiilor

amplificat, n timp ce cealalt alel nu este amplificata deloc. Neamplificarea este rezultatul nepotrivirii dintre ADN matri i oligonucleotidul primer. Pentru c Taq-polimeraza nu are activitate exonucleoazic n direcia 3'5', aceast nepotrivire mpiedic eficient elongarea la capatul 3' cu ajutorul Taq polimerazei (figura 3). Metoda este aplicabil, n general, n detecia mutaiilor punctiforme cunoscute, mici deleii i inserii, polimorfisme i alte variaii n secvena ADN. Utiliznd aceast tehnic, se realizeaz screeningul mutaiilor genice, analiza haplotipic, screeningul pacienilor i testarea purttorilor de tare ereditare pentru mai mult de 65 alele cu substituii mononucleotidice diferite.
I Alela 1 este perfect complementar cu primerii a i b a ADN b 25 cicluri PCR amplificare de peste 1milion ori ADN b X 25 cicluri PCR neamplificare II Alela 2 nu este complementar cu primerul b la capatul 3' a

Figura 3. Schema amplificarii prin reactie de polimerizare n lan a alelelor specifice ADN - cele doua catene antiparalele ale ADN cromozomal. Directia 5' 3' este indicata prin jumti de sageat. Alelele 1 i 2 difer printr-un singur nucleotid (reprezentat prin X). Mai nti, sunt separate catenele prin nclzire la o temperatur nalt, apoi se aliniaz primerii oligonucleotidici a i b. Urmeaz elongarea cu Taqpolimeraz, al treilea pas n PCR. Acest proces este reprezentat prin linii ntrerupte care pornesc de ca capatul 3' al oligonucleotidelor. Dac oligonucleotidele sunt perfect complementare la ADN matri (I), elongarea se iniiaz eficient. Dac exist o nemperechere n ADN matri (X n II), elongarea nu poate fi iniiat eficient pentru oligonucleotidul b. Dupa 25 cicluri PCR, n I apare o amplificare de la 1 pn la 10 milioane de ori, pe cnd n II nu apare amplificare. Cnd produsul PCR este supus electroforezei n I se poate detecta o cantitate mare de produs amplificat de mrime corespunztoare. n II nu este detectat nici un produs amplificat. De aceea, o mutaie (sau un polimorfism) poate fi detectat prin utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat care permite o elongare eficient, n cazul unui cromozom mutant i o elongare ineficient, n cazul unui cromozom normal.

3.4. Identificarea direct a mutaiilor n ADN prin hibridizare cu oligonucleotide sintetice Studiile de pionerat ale lui Wallace i colaboratorii au demonstrat c duplexurile cu o singur baz substituit ntr-o secven nucleotidic scurt (1113 baze lungime) au fost mai puin stabile dect corespondenii duplexului perfect. Dup aceste condiii, hibridizarea heterolog (nepotrivit) poate fi minimizat comparativ cu hibridizarea omoloag (potrivit).
185

RODICA TALMACI

Mutaiile punctiforme sunt detectate prin analiza clivajului chimic al heteroduplexurilor formate ntre ADN normal i ADN mutant amflificat. ADN normal amplificat este marcat la un capt i aliniat la ADN mutant amplificat. Heteroduplexurile ce conin nemperechere la sitiusul ce prezint mutaia este clivat prin tratament cu tetraoxid de osmiu sau pipiridin. Lanul marcat la un capt este redus la o dimensiune caracteristic pentru mutaia particular i poate fi analizat prin electroforez n gel de poliacrilamid. Natura exact a mutaiei este determinat prin secveniere ADN. 3.5. Subclonarea Pentru secvenierea genei -globinei este necesar subclonarea genei ntr-un vector plasmidial. Aceasta implic amplificarea genei cu primeri ce conin la capetele 5 cte un situs unic de restricie prezent i n vectorul de clonare. Dup amplificare att produsul de amplificare, ct i vectorul folosit pentru clonare vor fi supui digestiei cu cele 2 enzime de restricie ale cror situsuri se afl la capetele genei amplificate. Prin tratare cu ADN ligaz a amestecului format din amplicon i vector se va obine un vector recombinat ce va conine gena -globina ntr-o anumit orientare. Folosind primeri complementari cu secvena vectorului din vecintatea genei se va realiza secvenierea genei, pornindu-se de la ambele capete ale acesteea. 3.6. Secvenierea regiunii de interes Secvenierea ADN pe cale enzimatic: ADN este sintetizat in vitro n aa fel nct reacia se termin specific n poziia n care corespunte unei baze date metoda Sanger ntreruperea controlat a sintezei prin ncorporarea unor analogi structurali ai dezoxiribinucleozidtrifosfailor proprii structurii ADN. Sinteza in vitro a catenei ADN complementar necesit prezena: - monocatenei ADN de secveniat, utilizat ca matri i care provine, n general, dintr-un fragment de restricie; - unui primer complementar cu o mic poriune de la capatul 3 al catenei de replicat, care se marcheaz radioactiv sau fluorescent. Aceasta se obine cu usurin innd seama de faptul c fragmentele de restricie sunt flancate de secvene cunoscute. - ADN polimeraza I, din care s-a exclus regiunea cu activitate 5-3 exonucleazic, rezultnd fragmentu Klenow. - celor patru 2-dezoxinucleozidtrifosfai: dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dintre care cel puin unul este marcat; - mici cantiti din cei patru 2-3-didezoxinucleozidtrifosfai ddNTP, ca analogi structurali ai 2-dezoxinucleozidtrifosfatilor. Este uor de imaginat c absena gruprii -OH din ddNTP face posibil continuarea sintezei ADN n momentul n care unul dintre acetia cstig n competiia cu dNTP dictat de matri. Sinteza ADN poate fi, deci, ntrerupt, prematur i ntmpltor la oricare dintre resturile nucleotidice. Pentru a determina o secven de nucleotide, ADN este supus unei serii de patru reacii separate, fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin electroforez, produii de reacie vor migra n patru culoare paralele, n acelai gel. Banda corespunztoare unei lungimi particulare apare numai n una din cele patru benzi. Baza indic nucleotidul prezent n poziia corespunztoare n ADN. Urmrind band cu band, serii de nucleotide pot fi citite potrivit culoarului n care apar benzile. Astfel poate fi citit secvena de ADN. Posibilitatea de identificare a mutaiilor are o nalt valoare diagnostic. Aceasta este baza verificrii i stabilirii unui diagnostic clinic concludent, determinnd statutul de purttor sau diagnosticul prenatal al bolii.
186

Diagnosticul molecular al -talasemiilor

Un diagnostic concludent/sigur al sindroamelor -talasemice poate fi obinut numai prin utilizarea metodelor de genetic molecular. Diagnosticul molecular al -talasemiei poate fi realizat prin analiza ADN din sange periferic, utiliznd tehnici bazate pe metodologia PCR. Diagnosticul molecular este necesar pentru identificarea heterozigoilor i pentru acele cupluri cu risc la care prinii sunt heterozigoi pentru unul sau mai multe situsuri polimorfice n gena -globina.

Bibliografie selectiv
1. Baysal E. (1992) The and thalassemia repository. Hemoglobin 16, 237-258 2. Faa V., Rosatelli M.C., Sardu R., meloni A., Toffoli C., and Cao A. (1992) A simple electrophoretic procedure for fetal diagnosis of -thalassemia due to short deletions. Prenat. Diag. 12, 903-908. 3. Craig J.E., Barnetson R.A., Prior J., Raven J.L., and Thein S.L. (1994) Rapid detection of deletions causing thalassemia and hereditary persistence of fetal hemoglobin by enzimatic amplification. Blood 83, 1673-1682. 4. Ristaldi M.S., Pirastu M., Rosatelli C. and Cao A (1989) Prenatal diagnosis of talassemia in mediterranean populations by dot blot analysis with DNA amplification and allele specific oligonucleotide probes. Prenat Diag. 9, 629-638. 5. Old J.M., Varawalla N.Y., and Weatherall D.J., (1990) The rapid detection and prenatal diagnosis of -talassemia in the Asian Indian and Cypriot populations in the UK. Lancet 336, 834-837. 6. Varawalla N., Old J.M., and Fitches A.C. (1992) Analysis of -globin gene haplotipes in Asian Indians: Origin and spread of -thalassemia on the Indian subcontinent. Hum. Genet. 90, 443-449 7. Newton C.R., graham A. and Heptinstall L.E. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucl. Acids Res. 17, 25032516. 8. Varawalla N.Y., Old J.M., Sarkar R., Venkatesan R., and Weatherall D.J., (1991) The spectrum of -thalassemia mutations on the Indian subcontinent: the basis for prenatal diagnosis Br. Haematol 78, 242-247.0 9. Baird, M.; Driscoll, C.; Schreiner, H.; Sciarratta, G. V.; Sansone, G.; Niazi, G.; Ramirez, F.; Bank, A. : A nucleotide change at a splice junction in the human beta-globin gene is associated with beta-zero-thalassemia. Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 4218-4221, 1981. 10. Crossley M., Orkin S.H. Regulation of the -globin locus. Current Opin Genet Dev 3:232, 1993, 11. Hall G.W., Thein S.L. Nonsense codon mutations in the terminal exon of -globin gene are not associated with a reduction in -mRNA accumulation: a mecanism for the phenotype of dominant -talasemia.Blood 82:961, 1993 12. Kazazian, H. H., Jr.; Boehm, C. D. : Molecular basis and prenatal diagnosis of betathalassemia. Blood 72: 1107-1116, 1988. 13. Murru S., Loudianos G., Porcu S., Sciarratta G.V., Agosti S., parodi M.I., Cao A., Pirastu M. A -thalassemia phenotype not linked to the -globin cluster in an Italian family. Brit J Haemat 81:283, 1992 14. Pirastu, M.; Kan, Y. W.; Cao, A.; Conner, B. J.; Teplitz, R. L.; Wallace, R. B. : Prenatal diagnosis of beta-thalassemia: detection of a single nucleotide mutation in DNA. New Eng. J. Med. 309: 284-287, 1983.
187

RODICA TALMACI

15. Rosatelli, C.; Falchi, A. M.; Tuveri, T.; Scalas, M. T.; Di Tucci, A.; Monni, G.; Cao, A.: Prenatal diagnosis of beta-thalassaemia with the synthetic-oligomer technique. Lancet I: 241-243, 1985. 16. Rosatelli, C.; Leoni, G. B.; Tuveri, T.; Scalas, M. T.; Di Tucci, A.; Cao, A. : Betathalassaemia mutations in Sardinians: implications for prenatal diagnosis. J. Med. Genet. 24: 97-100, 1987. 17. Thein S.L. Dominant -talasemia: molecular basis and pathophysiology. Brit J Haemat 80:273, 1992 18. Thein S.L., Wood W.G., Wickramasinghe S.N., Galvin M.C. -talassemia unlinked to the -globin gene in an English family. Blood 82:961, 1993

188