Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Mihaela Alua
Simion Simon
Editori
Mihaela Alua
Simion Simon
Material editat n cadrul proiectului Program doctoral performant pentru formarea resursei umane
nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, ID 36154
Prefa
n calitate de director al proiectului cu titlul Program doctoral performant
pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific
interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc s
mulumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza i profesionalismul lor la realizarea acestui volum i, implicit, la dezvoltarea programului doctoral.
Mulumirile mele se ndreapt de asemenea ctre echipa de management a
proiectului, n urmtoarea componen:
Prof. dr. Simion Simon, coordonator tiinific program doctoral
Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator tiinific relaii internaionale
Cristina Dominic, asistent manager
Andra Ghira, responsabil logistic i asistent manager
Jr. Alexandru Braoveanu, consilier juridic
Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar
Ing. Carmen Ciplea, expert IT
Ec. Istvn Psk, expert contabil
Am convingerea c informaia cuprins n aceast lucrare va sprijini generaiile prezente i viitoare de conductori de doctorat n activitatea lor de
cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor n lumea minunat a tiinei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de
cercettor o vocaie.
Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane
nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract
POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanat din Fondul Social European prin
Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013.
C.S.III. dr. Mihaela ALUA
5
Cuvnt nainte
Institutul de Cercetri Interdisciplinare a fost nfiinat prin Hotrrea Senatului Universitii Babe-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare
i transfer tehnologic, avnd ca obiectiv de activitate att realizarea de studii i
cercetri interdisciplinare n domeniile biologie molecular, biomateriale i
sisteme biologice, materiale avansate i mediu ambiant, sisteme
nanostructurate natural i artificial, ct i transferul rezultatelor obinute ctre
beneficiari locali, naionali sau internaionali. Institutul beneficiaz de o cldire
proprie, cu o suprafa desfurat de peste 3000 mp, modernizat la nivelul
standardelor internaionale din punct de vedere al dotrilor conexe i avnd
laboratoare de cercetare structurate n acord cu nevoile cercetrilor interdisciplinare menionate. ntre timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au
decis s-i dedice energia i cunotinele cercetrilor la interfaa Bio-NanoSistemelor, a devenit Institutul de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nanotiine (ICI-BNS). n cadrul acestuia i desfoar activitatea n prezent 12
profesori universitari (dintre care 10 conductori de doctorat), 25 alte cadre
didactice i cercettori i peste 40 de doctoranzi cu frecven. Acetia aparin
domeniilor Fizic, Chimie, Biologie, Informatic, tiina mediului i Psihologie.
Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane
nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar a oferit posibilitatea
de a mobiliza un set de cercettori valoroi, cu experien deosebit n tehnicile
experimentale frecvent utilizate n cercetrile interdisciplinare din domeniul
Bio-Nano-tiinelor.
Marea majoritate a experilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoctorale n prestigioase laboratoare din lume unde au dobndit o bogat experien n utilizarea echipamentelor de nalt performan de care dispune Institutul nostru.
Studenii doctoranzi, dar i specialiti din domenii ca: fizic, chimie, biologie,
geologie sau tiina mediului interesai n studii experimentale interdisciplinare
vor gsi n materialele incluse n prezentul volum date teoretice dar mai ales practice, despre tehnici experimentale avansate prezentate ntr-o form accesibil, cu
exemple semnificative, menite a facilita nelegerea fenomenelor studiate i a contribui la creterea aportului fiecrui cercettor la dezvoltarea domeniului n care i
va desfura activitatea tiinific.
Prof. Dr. Simion SIMON
Director ICI-BNS
CUPRINS
I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13
Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de
proteine.......................................................................................................................... 13
Asist. univ. dr. Iulia Lupan
Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare ........... 36
Asist. univ. dr. Iulia Lupan
II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64
Culturi celulare ........................................................................................................... 64
Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac
Culturi celulare partea a II-a .................................................................................... 82
Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac
III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN............................................................ 101
Microspectroscopia Raman....................................................................................... 101
Conf. dr. Monica Maria Baia
Microspectroscopia Raman partea a II-a................................................................ 121
Conf. dr. Monica Maria Baia
IV. SPECTROMETRUL IR........................................................................................... 134
Spectroscopia de absorbie n infrarou .................................................................. 134
Lect. dr. Nicolae Leopold
Tendine moderne n spectroscopia de absorbie IR ............................................. 147
Lect. dr. Nicolae Leopold
V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160
Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160
Conf. dr. Dana Maniu
Spectrofluorimetria - aplicaii ................................................................................... 172
Conf. dr. Dana Maniu
VI. SPECTROMETRUL DE REZONAN MAGNETIC NUCLEAR ......... 191
Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) .................. 191
C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Alua
Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) Implementarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaii pe sisteme moleculare organice n faza solid .......................................................................................................... 216
C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Alua
10
11
12
I. ANALIZE GENETICE
Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional
pentru obinerea de proteine
Asist. univ. dr. Iulia Lupan
Cuprins
1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem
procariot ................................................................................................................. 13
2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii
interdisciplinare ..................................................................................................... 31
3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular ................... 33
4. Bibliografie ............................................................................................................. 34
aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare sintezei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un fragment
de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000
de nucleotide 2minute.
Etapa iniial
de denaturare
5'
3'
3'
5'
ADN genomic cu
fragmentul int
5'
3'
3
3
'
5'
3'
5'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
Ciclu I
Sfritul
primului ciclu
5'
3'
5'
5'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
3'
5'
3'
3'
3'
5'
3'
5'
3'
Ciclu
II
5'
3'
5'
17
5'
3'
3'
5'
5'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
Ciclu III
5'
3'
3'
5'
5'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
3'
5'
3'
Taq polimeraza
amors
amors ce indic direcia de sintez
B
EcoRI
5 GAATTC
SmaI
5 GGGCCC
CTTAAG
3
5 G
CTTAA
3
CCCGGG
5
AATTC
G
3
5
5 GGG
CCC
3
CCC
GGG
3
5
Figura 3. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i SmaI (B) i capetele libere dup
tiere. Locurile de tiere sunt indicate cu sgei.
19
B amH I (533)
H infI (7 5)
E coRI (605)
E coRV (5 8)
H infI (32)
H infI (616)
H infI (461)
E coRI (633)
B amH I (7 7 3)
NcoI (7 7 7 )
H infI (942
Y LR3 7 7 C
1047 bp
Figura 4. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre n paranteze
sunt indicate situsurile enzimelor de restricie.
Figura 5. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a dou fragmente ADN care au
capete netede.
Vectori de clonare
Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN transportatoare
ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd. Vectorii sunt de mai
multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i vectori artificiali. Aceti
vectori sunt utilizai n dependen de scopul clonrii. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o molecul dublu catenar de
ADN, care este circular, nchis i capabil de replicare autonom n celule
20
gazd. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nite secvene specifice necesare replicrii, clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pentru replicarea autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care
este originea de replicare. Nicio molecul de ADN nu poate fi replicat fr
o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de
ADN de unde poate ncepe replicarea i care este recunoscut de anumite
proteine care iniiaz replicarea.
O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). n aceast
regiune se introduce fragmentul int de ADN cu ajutorul enzimelor de
restricie i a ligazei. Att vectorul ct i fragmentul ADN sunt tiate cu
aceleai enzime de restricie i legate mpreun cu ajutorul ligazei. SMC
conine secvenele de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie
care nu se conin n alt regiune a vectorului.
O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii de
selecie care sunt de obicei nite gene, a cror produs (enzim) fac posibil
selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai frecveni markeri utilizai sunt genele ce confer rezisten la
antibiotice, mai corect spus produsul genei confer rezisten. Spre exemplu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin. Plasmidele care conin
gena pentru aceast enzim vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dac un amestec de celule transformate cu plasmide care
vor conine att celule cu, ct i fr plasmid, se nsmneaz pe un mediu
cu ampicilin, vor supravieui doar celulele care conin plasmidul.
Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu plasmid recombinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert se refer la
fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul multiplu de clonare
se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n SMC nu a fost introdus
niciun fragment ADN atunci gena este intact, produsul ei este o protein
activ. Dac n SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este
modificat i produsul ei este inactiv. Spre exemplu dac SMC se afl n
gena lacZ care codific subunitatea a enzimei -galactozidaz, atunci
produsul acestei gene mpreun cu subunitile codificate din genomul
celulei gazd bacteriene vor forma o enzim activ capabil s metabolizeze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil
galactopiranozid) care este adugat n mediu i este incolor. Dac
-galactozidaza este activ atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul
format n urma reaciei va avea o culoare albastr. n acest fel coloniile re21
zultate dup transformare care conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar
cele ce conin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim
activ capabil de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie
utilizeaz o enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu
plasmid fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor.
Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncional
i vor supraveui.
Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva mii de pb
i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn la 2000-3000
pb (Figura 6: A, B). O caracteristic important pentru plasmide este numrul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un numr
mai mare de copii per celul. Acest fapt permite obinerea unei cantiti
mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de bacterii (din 3-5 ml de cultur se pot obine cteva g de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari
numrul copiilor per celul este mai mic, n consecin i pentru a obine o
cantitate mai mare de ADN este necesar o cantitate mai mare de cultur.
Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofer n plus posibilitatea exprimrii genei clonate (Figura 6 C). Plasmidele de
exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii de
clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc i n genom i fac parte
dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START
i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul englezesc este
Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se afl n amonte de
gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixeaz la nivelul
promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n prezena promotorului exprimarea va fi foarte sczut, de aceea situsul de legare al ribozomilor
(termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secven care se
transcrie dar care nu se traduce i care este recunoscut de ribosomi.
Ribosomii se leag la acest situs i se deplaseaz de-a lungul ARNm pn
ntlnesc primul codon START de unde ncepe traducerea. Codonul START
la procariote este n cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei
inclus n situsul multiplu de clonare, n caz contrar acesta se poate introduce n fragmentul int cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus i el
de obicei n situsul de clonare. n unele cazuri acesta este prezent dup regiuni care codific anumite aa-zise etichete. Etichetele faciliteaz purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des
utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza
(GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este
termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte integrant a proteinelor la
22
ClaI (25)
Eco RI (4360)
LacZ
HindIII (30)
Sca I (3847)
EcoRI
Eco RV (188)
PvuI (3737)
Sac I (6
BamHI (376)
SphI (567)
AP r
Pst I (3612)
Kpn I (6
bla(AmR)
SalI (652)
Xba I (6
pTZ57R
TC r
Bam HI
2886 bp
pBR322
MCS
4361 bp
Apa I (6
SalI (6
Pst I (6
Hin dI
ORI
T7 p
T7 terminator
Ori
His tag
XhoI (159)
Not I (167)
HindIII (174)
SalI (180)
f1 origin
Sac I (191)
M CS
Eco RI (193)
BamHI (199
bla (Ap)
NdeI (239
pET-21a
5443 bp
T7 prom
BglII (34
lacI
Figura 6. Hrile unor vectori plasmidici. A harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezisten
la antibiotice: Apr confer rezisten la ampicilin, iar TCr rezisten la tetraciclin, situsul multiplu
de clonare l poate constitui oricare dintre cele dou gene de rezisten, n dependen de gena selectat pentru inserare, rezistena la antibioticul respectiv se va pierde . B harta plasmidului de clonare
pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezisten la ampicilin, iar situsul multiplu de clonare se afl n gena lacZ' care ofer selecia alb-albastr a clonelor pozitive. C harta vector
de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care confer rezisten la ampicilin,
situsul multiplu de clonare care conine un codon START i un codon STOP dup eticheta de 6
histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.
23
Celule de
E.coli
Splarea celulelor
bacteriene
2 min
42C
Celule transformate
de E.coli
1800 V
5 msec
Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i purificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea ADN
26
(ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, estimarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de extracie. ADN
poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin excizarea fragmentului int i purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de
purificri.
Verificarea moleculelor recombinate
Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12-18 ore
de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariia
coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a clonrii, deoarece acestea pot conine un amestec de colonii pozitive i colonii cu plasmid fr
insert. Chiar dac se folosete un sistem alb-albastru de selecie a coloniilor
pozitive, acestea necesit totui o dovad n plus a prezenei plasmidului
recombinat. n acest scop se va efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu
cu antibiotic care se va nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate
se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin
digestie enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se
va realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector
sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast digestie
va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ mrimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena fragmentului clonat.
Secvenializarea fragmentului int este verificarea definitiv a clonrii.
Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza utilizat pentru
amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sintez. Pentru a
evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN polimeraz care are
proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt
Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza . a. Taq polimeraza nu are
activitate de corectare a erorilor, dar asigur de obicei randamente de sintez mai mari. n unele cazuri se utilizeaz un amestec de 2 polimeraze (3
pri de Taq polimeraz i o parte Pfu polimeraz) pentru a combina un
randament mai mare cu o fidelitate crescut.
n cadrul Centrului de Biologie Molecular exist 2 secveniatoare:
Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu detecie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis
System (laser cu detecie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizeaz
principiul Sanger de secveniere. Acest principiu presupune utilizarea unei
variante de PCR pentru secveniere. Matria ADN ce urmeaz a fi
secveniat este denaturat, apoi la unul din capetele sale are loc ataarea
27
unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar
i di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n
poziia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul
nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece
se folosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de cicluri este
de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc n toate
punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor, fiecare ddNTP
este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de civa microlitri vor fi separai n gelul din capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n
dependen de mrimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele
mai mari. n ultima parte a capilarului exist o fereastr transparent prin
care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescena emis va fi
captat i prezentat sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Electroforegramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena existent n bazele
de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenializate variaz
ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matrie dificile
(cu secvene repetitive) este necesar utilzarea unor kituri speciale.
Figura 9. Electroforegrama unei secvene obinut cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.
Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand, care ns cteodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce cele mai dese ori
strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul exprimrii genei i obinerii de
protein recombinat include cteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi clonat direct n vectorul de exprimare.
Plasmidele de exprimare conin neaprat un promotor recunoscut de ARN
polimeraza celulei gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon
START i unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important n acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea exact pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul. Promotorii din
aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor
este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre
exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigur de obicei o
supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conine promotorul de la
fagul T7, situsul de recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul multiplu de clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se opteaz pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei pentru
facilitarea purificrii, atunci din gen se va nltura codonul STOP. Dac aceast etichet nu este necesar, atunci n gen se va pstra codonul STOP i traducerea se va opri nainte de etichet. Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre
ARN polimeraza de la E. coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli
care conin gena pentru ARN polimeraz de la fagul T7. Aceast gen se afl
sub controlul promotorului lac UV5 i a operatorului lac (Figura 10).
Figura 10. Inhibiia exprimrii genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 i a genei int n celulele gazd de E. coli n lipsa inductorului.
29
30
Caracteristici
Achiziia i interpretarea imaginilor de pe geluri de
poliacrilamid sau geluri de agaroz
Purificarea apei pn la o rezistivitate de 18,2 M/cm
(apa MilliQ)
Thermocycler, Eppendorf,
Germania
Thermocycler, Corbett
Research, Australia
Electroporator Eppendorf,
Germania
Spectrofotometru UV-Vis
monofascicul M301, CamSpec,
Marea Britanie
Spectrofotometru Jasco V-530
dublu-fascicul cu termostatare,
Jasco, Japonia
Patru instalaii electroforez
proteine, Consort, Belgia
ase instalaii electroforeza
acizi nucleici, Consort, Belgia
pH-metru P901 (dou buci),
Consort, Belgia
Congelator temperaturi foarte
sczute, 70 litri, Sanyo, Japonia
Congelator temperaturi foarte
sczute, 100 litri, Snijders
Scientific, Olanda
Dou balane analitice, Scaltec,
Germania
Dou incubatoare bacteriologice, Memmert, Germania
Doua bai de apa cu agitare,
Memmert, Germania
33
4.Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
34
Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th edition, New York: Garland Science.
Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York:
W. H. Freeman Company.
Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition,
Wiley-Blackwell Publishing.
Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant
DNA, 2nd Edition, Academic Press.
Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles
and Applications of Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press.
Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression
Systems (The Practical Approach Series), 2d edition, Oxford University Press.
Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic
Analysis, New York: W. H. Freeman Company.
Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An
Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company.
Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman Company.
10. McPherson M.J., and. Mller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench,
1st edition, Springer-Verlag Telos.
11. Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1
edition, Taylor & Francis.
12. Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Editura Tehnic, Bucureti.
13. Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA:
Genes and Genomes - A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.
35
Cuprins
1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminai.................................................... 36
2. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor ............................................... 57
3. Bibliografie ............................................................................................................. 60
poate fi lizatul brut de E .coli, la care s-a indus sinteza acestei enzime. Sinteza continu a fost realizat prin ncorporarea enzimelor n gel de
poliacrilamid. Imobilizarea asigur sinteza continu a aminoacizilor i
reciclarea amoniului i piruvatului neutilizate, folosite n exces
[Deconttignies-Le Marchal i colab., 1979; Fukui i colab., 1974].
Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost utilizate n sinteza acidului aspartic [Fusee i colab., 1981; Tosa i colab., 1973].
Aceeai metod de imobilizare a fost folosit i n sinteza alaninei cu celule
de Pseudomonas dacunhae care prezentau o activitate mare a L-aspartat
-carboxilazei [Fusee i Weber, 1984].
Utilizarea de cofactori (NADH, NADPH), costisitori n sintezele enzimatice, nu permite extinderea sintezelor la scar industrial. Acest impediment a cauzat folosirea sistemelor enzimatice cuplate, n care se utilizeaz enzime pentru regenerarea cofactorilor. Astfel, 3-fluoroalanina s-a obinut din 3-fluoropiruvat, reacie catalizat de alanin dehidrogenaz ntr-un
sistem cuplat cu formiat dehidrogenaza pentru regenerarea NADH. Mediul
de sintez mai conine formiat de amoniu, ionul de amoniu fiind necesar n
reacia de sintez a aminoacidului, iar ionul formiat pentru reacia de regenerare a NADH [Oshima i colab., 1988].
Producerea continu de L-valin folosind valin dehidrogenaza i glucozo dehidrogenaza pentru regenerarea NADH a fost studiat detailat
[Monot i colab., 1988; Honorat-Pascal i colab., 1990]. Honorat i col. [1990]
au sintetizat L-alanina i L-valina folosind sistemul cuplat de alanin
dehidrogenaz, respectiv valin dehidrogenaz, cu glucozo dehidrogenaz
pentru regenerarea NADH. n strategia de sintez s-au utilizat enzime provenite de la un singur microorganism i anume Bacillus megaterium. S-a testat eficiena sintezelor n cazul folosirii lizatelor i a enzimelor purificate.
Numai n cazul sintezei alaninei s-a evideniat o cretere a randamentului
sintezei de la 80%, n cazul folosirii lizatului brut pn la 92%, n cazul folosirii fraciunilor purificate.
Sistemul multienzimatic a fost utilizat i n sinteza L-leucinei din
-cetoisocaproat, utiliznd leucin dehidrogenaz de la Bacillus
stearothermophilus [Oshima i colab., 1985] i formiat dehidrogenaza de la
Candida boidinii, pentru regenerarea NADH [Schtte i colab., 1976]. Utilizarea enzimelor de la microorganismele termofile prezint avantajul c au
o stabilitate mai mare.
Producerea acidului aspartic la scar industrial s-a realizat enzimatic
pornind de la fumarat i sruri de amoniu i utiliznd aspartaza ca i catalizator [Chibata i colab., 1976].
37
Aminoacid dehidrogenaze
Aminoacid dehidrogenazele (EC 1.4.1.X) sunt enzime care fac parte din
familia oxidoreductazelor. Aceste enzime catalizeaz eliminarea gruprii
amino din L-aminoacizi cu formare de cetoacizi corespunztori, n prezen
de NAD(P)+.
Aminoacid + NAD+ + H2O -cetoacid + NADH + H+ + NH3
Majoritatea aminoacid dehidrogenazelor sunt specifice pentru
-aminoacizi, dar exist i cteva enzime care reacioneaz i cu aminoacizii . Cele mai bine studiate aminoacid dehidrogenaze sunt cele care au
importan industrial (fenilalanin-, leucin-, alanin-, valin- i glutamat
dehidrogenaza).
Aminoacid dehidrogenazele au fost intens studiate n vederea utilizrii
lor n diverse ramuri industriale. Ele au fost folosite la construirea biosenzorilor, care pot s monitorizeze nivelul ridicat de aminoacizi din plasma
sanguin, caracteristic n unele patologii. Aceste enzime au ntrebuinare i
n sinteza industrial de aminoacizi. Deoarece ele acioneaz stereospecific,
enzimele produc L-izomeri ai aminoacizilor naturali puri, aceast caracteristic fiind foarte important pentru industria farmaceutic.
Alanin dehidrogenaza
Aminarea reductiv a cetoacizilor la L-aminoacizi n procese
NAD(P)H-dependente este catalizat de o suprafamilie de enzime omoloage de aminoacid dehidrogenaze, care include fenilalanin dehidrogenaza
(PheDH), leucin dehidrogenaza (LeuDH), valin dehidrogenaza (ValDH) i
glutamat dehidrogenaza (GluDH). Nu exist asemnri semnificative ntre
secvenele alanin dehidrogenazelor (AlaDH) i membrii acestei familii de
aminoacid dehidrogenaze, cu excepia domeniului de legare a cofactorului,
care este comun pentru toate aceste enzime. Dei realizeaz unul i acelai
proces biologic, alanin dehidrogenazele i suprafamilia de aminoacid
dehidrogenaze au evoluat separat [Baker i colab., 1998].
Alanin dehidrogenaza (L-alanin oxidoreductaz NAD+ dependent,
1.4.1.1) catalizeaz reversibil reacia de dezaminare a L-alaninei cu formare
de piruvat.
L-alanina + NAD+ + H2O piruvat + NADH + H+ + NH3
Alanin dehidrogenaza a fost descris de ctre Wiame i Pirard n 1955
[Norbert i colab., 1994]. Aceast enzim a fost purificat i studiat n
principal la mai multe specii din genul Bacillus. Enzima are un rol important n furnizarea energiei necesare germinrii sporilor. S-a demonstrat c
n lipsa enzimei sporularea avea loc cu mari dificulti [Siranosian i colab.,
38
1993]. Alanin dehidrogenaza este o enzim oligomeric. Majoritatea enzimelor studiate sunt hexameri, cum ar fi cele de la B. subtilis, B. cereus, B.
sphaericus, B. stearothermophilus, Mycobacterium, Thermus, Anabaena. Alanin
dehidrogenaza este o enzim NAD+ dependent. Mecanismele cinetice ale
AlaDH au fost studiate la mai multe specii. NAD+ se leag naintea
piruvatului n reacia de dezaminare oxidativ, iar NADH n reacia de
aminare. AlaDH poate utiliza ca substrate n reacia de aminare att
piruvatul, ct i 3-hidroxipiruvatul, cu ultimul reacia fiind mult mai lent.
Un caz unic printre alanin dehidrogenazele bacteriene este cea de la Bacillus
sp DSPM730 care reacioneaz n egal msur cu ambele substrate. Aceast enzim poate fi foarte util n sinteza de L-serin din 3-hidroxipiruvat
[Nagata i colab., 1989]. Lizina din poziia 74 din secvena de aminoacizi a
AlaDH de la B. subtilis este esenial n cataliz i este conservat i la alte
alanin dehidrogenaze. Aminoacizii din vecintatea acestei lizine prezint o
regiune conservat, dar care nu este specific altor aminoacid
dehidrogenaze. [Delforge i colab., 1997].
Leucin dehidrogenaza
Leucin dehidrogenaza (EC 1.4.1.9) (LeuDH) este o oxidoreductaz
NAD+-dependent, care catalizeaz reversibil dezaminarea L-leucinei i a
unor L-aminoacizi alifatici la cetoacizii corespunztori.
Leucina + NAD+ + H2O -cetoisocaproat + NADH + NH4+ + H+
Echilbrul reaciei este deplasat spre formarea aminoacidului.
Ca i majoritatea aminoacid dehidrogenazelor, LeuDH intervine n catabolismul unor aminoacizi. Leucin dehidrogenazele studiate provin n
mare parte de la genul Bacillus precum i de la Thermoactinomyces [Ohshima
i colab., 1994], Natronobacterium magadii MS-3 [Katoh i colab., 2003].
O mare atenie s-a acordat leucin dehidrogenazelor provenite de la microorganisme mezotermofile, deoarece sunt mai stabile. Una din aceste
enzime este cea de la B. stearothermophilus, a crei gen codificatoare a fost
clonat, iar proteina exprimat n celule de E. coli. [Nagata i colab., 1988].
Diferenele de termostabilitate ale proteinelor totale de E. coli i proteina
recombinat de LeuDH permit purificarea acesteia ntr-o singur etap,
prin denaturare termic. Enzima nu-i pierde activitatea dup incubare
timp de 30 min la 70C [Oka i colab., 1989]. Enzimele termostabile nu prezint numai avantajul termostabilitii, fiind, n general, stabile i la ali
factori care afecteaz proteinele, cum ar fi enzime proteolitice, solveni organici, detergeni, mediu acid sau alcalin.
Aspartat amoniu-liaza
L-aspartat amoniu-liaza (AAL) sau aspartaza (EC 4.3.1.1) catalizeaz
reversibil transformarea acidului L-aspartic la fumarat i NH4+. Aceast
39
enzim joac un rol important n metabolsimul azotului la bacterii. Majoritatea aspartazelor studiate au masa molecular n jur de 200 kDa i sunt
alctuite din patru monomeri identici, de circa 50 kDa. Enzima este activat
n prezen de ioni de Mg2+ la un pH alcalin; la pH mai mic ea nu necesit
ioni de metal [Karsten i Viola, 1991].
Metode
Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze
Genele ce codific leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus,
alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz dehidrogenaza de la
Bacillus subtilis i aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin
metoda PCR utiliznd amorse specifice. n secvena amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricie necesare inserrii genei n vectorul de exprimare. Pentru clonarea genelor ce codific leucin dehidrogenaza,
alanin dehidrogenaza i aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare
pET21b (Novagen). Acest vector ofer posibilitatea exprimrii genelor la
inducere cu IPTG. Produii PCR au fost purificai din gel i digerai cu enzimele de restricie corespunztoare (Tabel 1). Vectorii de exprimare au fost
digerai cu aceleai enzime de restricie. Produii de digestie (produii PCR
i vectorii) au fost separai cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.
Tabelul 1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor.
Organism surs
Enzime
de
restricie
Vector
utilizat
Bacillus subtilis
BamHI
XhoI
pET21b
Bacillus
stearothermophilus
BamHI
XhoI
pET21b
Escherichia coli
NdeI
BamHI
pET21b
5'-GGAATTCCATATGCTGAACGAAACTCCCGCAC-3'
GalM
Escherichia coli
(P0A9C3) 5'-CGCGGATCCTCACTCAGCAATAAACTGATATTCCG-3'
NdeI
BamHI
pET24a
NdeI
BamHI
pET24a
Enzima
Amorsele utilizate
5-GAGGGATCCGATGATCATAGGGGTTCCTAAAG-3
AlaDH
Q08352
5-GGTCTCGAGTATAGCACCCGCCACAGATGATT-3
5-GGTGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGG-3
LeuDH
P13154
5-TATTCTCGAGTATTGCCGAAGCACCTGC-3
ALL
(P0AC38)
GlucDH
P12310
5-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3
5-CGCGGATCCTCAACCGCGGCCTGCCTGG-3
Bacillus subtilis
Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroz. Pentru inserarea genelor n vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a
40
LeuDH
1
AAL
1
94
42
94
67
43
30
20,1
14,4
94
67
67
43
43
30
20,1
42
54
30
20,1
14,4
41
cetoacid 100 mM
15NH4Cl 100 mM
NADH 1 mM
glucoz 670 mM
Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacia s-a declanat prin adugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcai au fost
efectuate la 30C cu urmrirea pH-lui i agitare. Pe parcursul sintezei s-a
urmrit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Aceast metod const
n formarea unui compus de culoare, la interaciunea ionului de amoniu, a
fenolnitroprusiatului i a cloraminei. Probele s-au preparat dup urmtoarea procedur: 10 l de prob diluat de 20 ori, 200 l de fenolnitroprusiat,
200 l de hipoclorit de sodiu i 590 l ap. Developarea culorii s-a fcut
prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100C. S-a msurat absorbana
la 623 nm. nainte de declanarea sintezelor s-a preluat o prob care a servit
la alctuirea unei curbe etalon. Ca martor a servit amestecul de sintez fr
clorur de amoniu (din care cauz se aduga la sfrit). n Figura 2 este
prezentat curba etalon de la sinteza de [15N]-L-metionin. Pe baza curbelor
etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rmas n mediul de sintez.
Sintezele au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor, timp de 15
min la 85C.
y = 0.068852 + 0.013334x R= 0.99935
1.4
DO
623nm
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
20
40
60
80
100
120
NH Cl (% )
4
baia de ap, dup care s-a precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lsat
peste noapte, iar precipitatul obinut s-a filtrat i uscat. n continuare, aminoacizii astfel obinui au fost supui determinrii structurii, puritii i
concentraiei izotopice.
Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas
Pentru analiza calitativ prin metoda spectrometriei de mas a aminoacizilor este necesar o derivatizare a produsului de reacie. Derivatizarea,
care trebuie facut la ambele funciuni polare ale moleculei de aminoacid, la
carboxil i amin, s-a facut prin sililare, utiliznd metoda Das Neves i
Vasconcelos, care introduce la fiecare funciune polar din molecul cte o
grupare ter-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul c, datorit substituentului ter-butil voluminos, la amin se introduce o
singur grupare silil, i nu una sau dou n mod statistic, cum se ntmpl n
cazul derivatizrii cu grupri trimetilsilil. Derivatizarea s-a fcut utiliznd ca
reactiv N-metil-N-(ter-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) n
calitate de donor al gruprii silil, reactivul avnd i un coninut de 1%
ter-butil-dimetil-clorsilan, n calitate de catalizator. Derivatizarea s-a fcut
pe cantitai de prob de ordinul 0.5-1 mg de prob, cu 150 l de acetonitril ca
solvent i 50 l reactiv MTBSTFA, la 120C timp de 20 minute.
Separarea gaz-cromatografic a produilor de sintez sub form de
TBDMS-derivai s-a fcut pe o coloan capilar cu faz staionar DB5 de
30 m lungime, cu hidrogen ca i gaz purttor i cu temperatur programat
ntre 55 i 250C. La ionizarea cu impact de electroni, aminoacizii sub form
de TBDMS-derivai se produc n cea mai mare parte sub form de ioni prin
fragmentarea moleculelor. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fiecrui aminoacid. Prin ruperea n diferite poziii din gruparea tert-butildimetilsilil se formeaz ioni cu masele M-43, M-57 i M-85, iar prin ruperea
legturii dintre carboxil i atomul de carbon alfa, adiacent, ia natere un
fragment cu masa M-159. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze
Hewlett Packard 5840 A, iar spectrele s-au nregistrat cu un spectrometru
de mas cuadrupolar HP 5985.
Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N
Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze
chimice i enzimatice. n primele etape de marcare a acizilor aminai cu
izotopi stabili s-au folosit metode de sintez chimic. Aceste metode prezint un ir ntreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei cantiti mari
de amoniac, randamente sczute datorit mai multor etape de sintez, obinerea racemicului.
44
Cetoacid
NADH
AADH
Acid gluconic
GDH
GalM
L-(15N)aminoacid
NAD+
-glucoz
-glucoz
Aminoacid dehidrogenazele catalizeaz reacia de formare a aminoacizilor pornind de la 15NH4Cl i cetoacizii corespunztori. Sinteza de aminoa45
LeuDH429
Acid -cetoisovaleric
Acid ceto--metilvaleric
Acid -cetoizocaproic
Acid -cetocaproic
Acid -ceto--metiltiobutiric
Acid -cetobutiric
168 (100)
46,5 (28)
36,8 (22)
17,4 (10)
7,8 (4,6)
4,7 (2,8)
Sinteza de [15N]-L-Val
Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-valin s-a realizat cu reactivii
la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 6 A).
15NH
3,0
8,0
12,0
4Cl
Randamentul sintezei
(%)
79
86
92
Sinteza de [15N]-L-NorLeu
Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-norleucin s-a realizat cu
reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode.
100
100
201
73
90
80
70
I, %
60
60
15
NH Cl (%)
80
50
40
30
40
57
20
75
10
20
275 303
147
133
346
0
0
10
20
30
70
90
120
50
100
150
200
250
300
350
400
m/z
min
50
15NH
4Cl
2,0
4,7
78
78
100
100
73
80
70
60
60
I, %
NH4Cl (%)
80
15
90
261
50
40
40
289
147
30
57
20
133
10
20
303 331
0
0
0
0
15
30
min
60
90
120
50
100
150
200
250
300
350
m/z
51
90
80
80
73
70
60
I, %
60
NH Cl (%)
201
100
100
50
15
40
40
303
30
57 75
20
10
20
275
147
133
345
0
0
0
0
10
20
40
min
60
90
120
50
100
150
200
250
300
350
400
m/z
Fumarat mM
Aspartat mM
73
100
1000
90
70
60
I, %
Fumarat/Aspartat (mM)
80
800
600
50
40
30
400
75
20
10
200
147
202 244
0
0
0
0
50
100
150
200
250
300
350
50
100
150
200
250
302
316
300
350
418
390
400
460
450
500
m/z
min
Figura 11. Sinteza de acid aspartic. (A) Consumul de acid fumaric i formarea de acid aspartic n
cursul reaciei de sintez a acidului aspartic, catalizat de aspartaza recombinat din E. coli. Componena mediului de sintez a fost: acid fumaric 1 M, NH4Cl 0,8 M, pH s-a ajustat la valoarea de 8,5 cu
NaOH. Reacia s-a declanat cu aspartaz 2 U/ml. (B) Spectrul de mas al acidului aspartic. DMTBS
derivat, M = 457, fr marcare cu 15N.
L-leucin
Lactat
NAD+
LeuDH358
NADH
Acid cetoisocaproic
LDH
Piruvat
NH4+
+
Fumarat
AAL
Acid aspartic
de dezaminare a L-leucinei. Reacia catalizat de aspartaz este i ea reversibil, dar n acest caz echilibrul reaciei este deplasat spre formarea de acid
aspartic, deci spre consumarea de NH4+. Pentru regenerarea coenzimei am
utilizat lactat dehidrogenaza din muchi de bovine.
Un impediment care poate aprea pe parcursul sintezelor de acest gen
(cu mai multe enzime) este reacionarea enzimelor secundare cu produsul
sintezei. Este cunoscut specificitatea strict a aspartazei pentru acid aspartic, de aceea am testat numai activitatea LDH cu diferii cetoacizi (Tabelul
6). Surprinztor este faptul c, totui, unii cetoacizi sunt substrate pentru
LDH. Pentru sinteza cetoacizilor ce servesc ca substrate i pentru LDH trebuie cutate alte enzime pentru regenerarea coenzimei.
Tabelul 6. Activitatea LDH din muchi de bovine (Boehringer) n prezena diferiilor -cetoacizi n raport cu substratul fiziologic (acid piruvic)
cetoacid
Acid piruvic
Acid hidroxipiruvic
Acid fluoropiruvic
Acid cetobutiric
Acid cetocaproic
Acid cetovaleric
Acid ceto metiltiobutiric
Acid cetoizocaproic
Acid ceto metilvaleric
Activitate
U/mg protein
140
69
38
10
0,38
0,13,
0,02
0,00
0,00
%
100
49
27
7,1
0,27
0,093
0,014
0,00
0,00
Mediul de reacie conine n volumul final de 1 ml: tampon TrisHCl 50 mM (pH 8,5), MgCl2
6 mM, NADH 0,15 mM, -cetoacid 1 mM.
55
Piruvat/cetoisocaproat (mM)
100
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
min
Figura 13. Consumul de acid piruvic i formarea de acid -cetoisocaproic n cursul reaciei de sintez
a acidului -cetoisocaproic n sistemul cuplat LeuDH/AAL/LDH. Componena mediului de sintez a
fost: acid fumaric 150 mM, acid piruvic 120 mM, L-leucin 100 mM, NAD 1 mM, pH-ul s-a ajustat
la valoarea de 8,5 cu NaOH. Reacia s-a declanat cu 2 U/ml aspartaz, lactat dehidrogenaz i leucin
dehidrogenaz (LeuDH358).
Figura 14. Formarea cromozomului Philadelphia translocaia reciproc ntre cromozomul 9 i 22.
atunci cnd nanoparticulele sunt administrate nainte de infectare sau imediat dup (2-4 ore) aceasta (Speshock i col., 2010).
Unele substane chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor asupra
proliferrii celulare, angiogenezei i rol antiinflamator. Un astfel de exemplu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care induce
apoptoza (moartea celular) n celule umane de melanom A375 i G361
(Cabello i col., 2009). DCPIP s-a dovedit a avea aciune antiangiogenez i
antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116.
Efectul acestuia este mai intens dac este ncapsulat n particule de poliacizi (lactic i glicolic). Concentraiile de 6 g/ml de colorant (DCPIP) induc moartea celular prin apoptoz (Mondalek i col., 2010).
Nanobiotehnologiile urmresc nu numai crearea de nano-vehicule pentru transportarea diferitor substane, dar i crearea i manipularea unor
adevrate nano-motoare, utile n nanomanipulare celular. F1-ATP-aza este
un veritabil nano-motor rotativ, a crei micri pot fi controlate cu ajutorul
unor stimuli optici i chimici (Ristic i col., 2009).
Sisteme particulare capabile de transport intit i eficient a diferitor
substane, cu puine efecte adverse, se datoreaz probabil endocitozei
transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide cationice i
polielectrolii s-au dovedit a fi crui exceleni pentru transportul
amfotericinei B un antifungicid pentru Candida albicans (Vieira i
Carmona-Ribeiro, 2008).
Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat
bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul c HDL
este numit colesterolul bun deoarece este implicat n transportul moleculelor hidrofobe (colesterol) n fluxul sangvin care este un mediu hidrofil.
Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una simpl, fiind alctuit din fosfolipide i apolipoprotein (apo). Cea mai abundent form de
lipoprotein din plasma sanguin uman este apoA-I, care este alctuit
din 243 de aminoacizi, este bine caracterizat i la incubarea cu vezicule de
fosfolipide n vitro formeaz HDL revers, capabil de transportul moleculelor hidrofobe (Ryan, 2010). Fosfolipidele cele mai frecvent utilizate pentru
asamblarea veziculelor sunt DMPC (dimirisstoil-fosfatidil colina) i DMPG
(dimirisstoil-fosfatidil glicerol). Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se
autoasambleaz ND-HDL. Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar
dac nu este utilizat enzima integral, ci numai fragmente de
apolipoproteine (Weers i col., 2001). ND-HDL reprezint astfel un mediu
favorabil pentru studierea proteinelor transmembranare, transportul unor
substane hidrofobe.
59
3. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
60
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
61
22. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003).
Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic
halophile, Natronobacterium magadii MS-3. Journal of Molecular Catalysis, 23, 231-38.
23. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P
Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors
n human colon cancer cells n vitro and n ovo by free and nanoparticle-encapsulated
redox dye, DCPIP, Journal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9.
24. Monot F., Benoit Y., Lemal J., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous
production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus
megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration.
Biocatalysis, 2, 161-74.
25. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989).
Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning,
purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63.
26. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K.,
(1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from
Bacillus
stearothermophilus
and
structural
comparison
with
other
NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62.
27. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J.S., (1994). The biochemistry and
enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews n Biochemistry and
Molecular Biology, 29, 415-67.
28. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J. A., Redmond K. A., van Antwerpen R.,
Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the
polyene antibiotic amphotericin B, Journal of Lipid Research, 47(2), 260-67.
29. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T.,
Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and
sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase
from Thermoactinomyces intermedius. European Journal of Biochemistry, 222, 305-12.
30. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine
with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97.
31. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine
production n a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and
Bioengineering, 26, 1616-18.
32. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction
of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its
one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and
Applied Biochemestry, 11, 307-11.
33. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective
response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine,
3, 11119
34. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D.,
(2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, Journal of
Nanobiotechnology, 7:3.
35. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density
lipoprotein, Journal of Nanobiotechnology, 8:28.
36. Schtte H., Flossdorf J., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of
formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii.
European Journal of Biochemistry, 62, 151.
62
37. Siranosian J.K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is
required for normal sporulation n Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 175,
6789-96.
38. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a
case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria, Journal of Colloid and
Interface Science, 275, 17782.
39. Speshock J. L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M.,
(2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, Journal of
Nanobiotechnology, 8:19.
40. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production
of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27,
886-89.
41. Vieira D. B., and Carmona-Ribeiro A. M., (2008) Cationic nanoparticles for delivery
of amphotericin B: preparation, characterization and activity n vitro, Journal of
Nanobiotechnology, 6:6.
42. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid
binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, European Journal of Biochemistry, 268, 3728-35.
63
primare
da
identic
secundare
da
asemntor
imortale/canceroase
unele/nu
asemntor/rotunde
identic
identic
asemntor/diferit
crescut
da
2-3
crescut
sczut
crescut
da
<100
sczut
crescut
crescut/limitat
da/nedifereniate
nelimitat
sczut
crescut
n mod normal, celulele cresc n vasul de cultur pn cnd stabilesc contact cu vecinele
lor, moment n care i opresc creterea. Celulele canceroase pierd aceast caracteristic fenotipic i dup ce ajung s fie confluente ncep s creasc una peste cealalt formnd ghemuri
de celule uor de distins la microscopul optic.
65
Culturi primare
Majoritatea celulelor din culturile primare necesit ancoraj. Cultivarea
celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se face prin
biopsierea esutului i formarea unei suspensii unicelulare. Aceste celule
vor crete aderente de suprafaa vasului de cultur. Pentru a le separa de
acesta i pentru separarea celulelor unele de altele se folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Pe de alt parte, cultivarea celulelor prelevate
din sngele periferic se face ntr-o manier care nu necesit ancorarea acestora de pereii vasului de cultur. Este posibil ca celulele s formeze aderene ntre ele dar de obicei acestea sunt de o mic intensitate. Diferite substane (factori de cretere ai diferitelor populaii leucocitare i/sau mitogeni
substane care stimuleaz mitoza) pot fi utilizate pentru diferenierea i
nmulirea celulelor n cultur.
Culturi secundare
Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultur primar se pot obine
aa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultur secundar pot parcurge pn la 100 de diviziuni nainte de a-i pierde potenialul proliferativ.
Dei nu prezint alterri ale setului de cromozomi (karyotipului), aceste
celule acumuleaz anumite caracteristici fenotipice care le fac s devin o
linie celular distinct. Pe lng derivarea culturilor secundare, subcultura
are ca scop meninerea celulelor n faza logaritmic de cretere, evitarea
confluenei care poate avea ca rezultat inhibarea creterii, ndeprtarea celulelor moarte i a produilor de metabolism celular i adugarea substanelor nutritive.
Culturi de celule imortalizate
Este posibil ca unele celule din culturile secundare s sufere anumite
transformri care le confer caracterul de imortalitate adic posibilitatea de
a se divide la nesfrit. Aceste celule pot aprea ca urmare a unor modificri (transformri) la nivelul cromozomului prin factori chimici, fizici (radiaii) sau biologici (virusurile oncogene). Unele dintre aceste celule imortale
(transformate) pot avea caracter oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea
lor la animalele de laborator este urmat de apariia tumorilor la acestea.
Dup cum se poate observa din tabelul 1, celulele canceroase au unele
proprieti care le difereniaz de celelalte celule imortale necancreoase: nu
mai prezint inhibiia de contact; pot crete cu mai puini nutrieni etc.
66
mentul clinic, cercetare fundamental i aplicat (metode de izolare a diferitelor substane recunoscute), catalizatori ai reaciilor chimice (abzymes).
Folosirea terapeutic a anticorpilor monoclonali n diferite afeciuni
umane urmeaz dou direcii: markeri diagnostici care pot identifica diferite tipuri de antigene din populaii celulare in vivo i terapia intit a diferitelor afeciuni n care anticorpului monoclonal i sunt ataate substane chimice toxice sau radioactive.
antigen
PEG
HAT
Screening
Subclonare
Splina este izolat la cteva saptmni (timp necesar pentru mbogirea repertoriului de celule B specifice) dup imunizarea animalului cu antigenul fa de care se dorete producerea anticorpilor monoclonali. Celulele
B sunt izolate i combinate cu mieloamele (partea stng) n prezena PEG
care mediaz fuziunea celulelor. Celulele hibrid sunt singurele care vor
supravieui n mediul suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin
Thymidine (HAT). Screeningul face posibil identificarea coloniilor care
produc anticorpi fa de antigenul dorit. Urmeaz apoi subclonarea realizat prin diluarea celulelor din coloniile productoare n aa fel nct fiecare
68
anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele fiind apoi difereniate n numeroase celule finale. Pe lng potenialul terapeutic enorm, celulele stem prezint i aplicaii diagnostice. Este posibil ca una dintre cele opt
celule ale embrionului rezultat n urma fertilizrii in vitro a unui ovul s fie
ndeprtat i analizat din punct de vedere genetic (celula este dispensabil deoarece restul celulelor rmase refac embrionul). n urma analizelor
care pot s depisteze diferite defecte genetice se poate decide
neimplantarea embrionului n uterul viitoarei mame.
Folosirea acestor celule face posibil i obinerea animalelor modificate
genetic prin introducerea unor gene n embrionul tnr. Se pot produce
astfel animale chimera care exprim genele implantate n diferite organe.
Dac aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaii unei mperecheri
dintre doi astfel de oareci chimera pot produce un knock-out/knock-in
pentru acea gen. Dei deosebit de atractiv, tehnologia cultivrii celulelor
stem embrionare este puternic ngrdit de normele actuale ale eticii cercetrii.
Celula stem
Pluripotent
Celula stem
Multipotent
Celula stem cu
potenial limitat
Celula difereniat
Parial
Celula difereniat final,
postmitotic
Figura 2 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final
70
(medii
cultur,
stocuri
de
antibiotice,
Alte componente
Baie de ap
o pstrarea mediilor i altor reactivi la temperatura de 37 grade Celsius;
o o alternativ este nlocuirea apei cu perle metalice care prezint urmtoarele avantaje: reducerea contaminrii reactivilor cu care vin n contact, igienizare uoar, economisirea
consumului de energie, stabilitate n timp.
72
Consumabile
pipete serologice, pot fi din plastic (de unic folosin) sau din sticl
(refolosibile dup sterilizare);
vase de cultur - codate n funcie de aria util de cultivare i de volumul maxim de mediu care poate fi coninut;
medii de cultur (multe celule pot fi cultivate n DMEM/RPMI+10%FBS
la care se adaug diferite concentraii de L-glutamina i antibiotice);
73
Conologic se poate vorbi de existena a dou categorii de medii; cele naturale care includ serul sanguin i alte secreii de origine animal i medii sintetice n care componentele de baz sunt produse separat i apoi
amestecate de obicei de ctre firme specializate. Chiar dac este vorba
de un mediu sintetic, cu unele excepii serul este considerat un component de baz. La ora actual, serul provine de la animale mari, n general de la vac - de unde i numele de fetal bovine serum (FBS). Mediile de
cultur sunt soluii saline tamponate. Compoziia mediilor de cultur
este complex incluznd: aminoacizi, acizi grai, carbohidrai, sruri,
microelemente, vitamine, hormoni, factori de cretere i alte componente. Cele mai multe medii conin i phenol red, un indicator al pH-ului
care trebuie s rmn ntre 7 i 7,4. Dac acesta vireaz spre galben indicnd un mediu acid este cazul ca mediul s fie schimbat.
suplimente pentru mediile de cultur: antibiotice uzual se folosete
un ameste de penicilin/streptomicin, L-glutamin, Na-pyruvat, bicarbonat, glucoz i altele n funcie de particularitile experimentului.
3.2.Strategii de lucru
Din punct de vedere tehnic, exist cteva principii de baz ale lucrului
cu celulele:
culturile celulare vor fi fcute ntr-o camer dedicat acestui scop.
Este de dorit ca aceast ncapere s fie oarecum izolat fa de restul
laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest
motiv, accesul personalului n aceast camer va fi restricionat pe
ct posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct
implicai n procesul de lucru cu celulule;
personalul care urmeaz s lucreze cu celulele va fi instruit corespunztor (vezi mai jos);
acele ncperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezint risc infecios pentru cei implicai; de aceea ncperile vor fi semnalizate corespunztor;
toate mediile i suplimentele care urmeaz a fi folosite n cultura celular trebuie s fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule (indicaia cell culture certified/approved trebuie s apar pe ambalaj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor celulare cu care urmeaz a se lucra n laborator;
spre deosebire de celulele vegetale i bacterii, celulele animale sunt
pretenioase n ceea ce privete condiiile n care pot sa creasc; exist riscul contaminrii cu diferite microorganisme care datorit ratei
74
nalat ci a ntregului stoc de celule. Pe lng considerentele financiare, contaminarea recipientelor cu coninut original (celule produse n laborator i
care nu pot fi achiziionate de la companiile specializate sau transferate de
la ali investigatori) reprezint cel mai neplcut aspect care poate afecta un
laborator de culturi celulare. Toi cei care urmeaz s lucreze cu celule vor
fi n prealabil instruii teoretic nainte de a ptrunde pentru prima dat n
laborator. Practic, ei vor ncepe prin a observa manoperele de lucru i a le
discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar dup aceast perioad este permis lucrul direct, mai nti sub supravegherea direct a celor
familiarizai i mai apoi n mod independent. Chiar i dup ctigarea independenei n lucru, cel proaspt iniiat va fi supravegheat din umbr de
ctre un coleg cu experien care ar putea observa anumite manopere executate neconform cu normele curente.
Asigurarea asepsiei i antisepsiei
Exist anumite msuri care asigur igiena n lucrul cu celulele:
Utilizarea echipamentului de protecie - pentru evitarea contaminrii celulelor i operatorului:
o halat cu mneci lungi
o pantofi nchii
o mnui de unic folosin
Splatul pe mini nainte i dup lucrul cu celulele;
O soluie antimicrobian1 de ethanol 70% trebuie s fie n permane
la ndemn;
Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice
obiect (pipeta, recipient etc.) care urmeaz s fie introdus n hota pentru
lucrul steril trebuie dezinfectat nainte sau imediat dup introducere;
Orice pipet trebuie folosit o singur dat2; nu este permis pstrarea pipetei n mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera
mediu de la un recipient la altul;
Orice mediu sau obiect contaminat din greeal va fi aruncat3;
Orice lichid care ajunge n contact cu suprafaa de lucru steril va fi
ndeprtat imediat cu ajutorul unui prosop de hrtie mbibat n
ethanol 70%;
1 n categoria substanelor cu efect antimicrobian sunt incluse alturi de antisepticele aplicate pe
esuturi vii, antibioticele care acioneaz n interiorul organismului i de asemenea dezinfectantele care distrug microorganismele aflate pe suprafeele neaparinnd fiinelor vii.
2 Excepie fac pipetele de sticl care pot fi splate i sterilizate.
3 Este vorba despre acele medii/suplimente/alte substane care nu mai pot fi sterilizate (fie
prin sterilfiltrare fie prin autoclavare) i respectiv obiecte care nu mai pot fi sterilizate.
76
WASTE
cultur coninnd celulele este transferat unor tuburi n care se centrifugheaz (centrifuga trebuie echilibrat n prealabil - dac avem un singur
tub cu celule va trebui s folosim un al doilea tub cu aceeai greutate care
poate s conin ap distilat sau orice alt lichid cu densitate asemntoare). Pentru o separare bun este nevoie de 10 minute la 200-250g/min
(ntr-o centrifug de mas cu rotor standard 1000rpm). Celulele vor sedimenta ca i n figura 5. Dup centrifugare celulele se resuspend n mediu
proaspt i apoi 10 microlitri sunt combinai cu 10 microlitri de soluie
Trypan blue 0,5% i pipetate n camera de numrat. Sub microscopul optic,
leucocitele apar ca i celule glbui/transparente cu o membran brun.
Soluia de trypan blue va ptrunde n celulele moarte care apar albastre. n
funcie de tipul camerei de numrt, exist formule de calcul dup care
putem s aflm numrul total de celule. O viabilitate de peste 90-95% este
n general acceptat pentru toate manipulrile ulterioare.
nea transportul ntre laboratoare este mai uor dac celulele sunt
ngheate.
Nu n ultimul rnd, metoda face posibil revenirea la celule cu un
numr mai mic de pasaje.
Este esenial ca nainte de nceperea procedurii respective s notm
urmtoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celul, numrul de celule, numrul de pasaj i data la care a fost creat stocul.
nghearea4 va fi lent i constant pentru a minimaliza efectele adverse asupra viabilitii celulelor. Mediul de ngheare5 cel mai frecvent folosit
conine mediul de cultur recomandat pentru linia celular + 20% FCS +
5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid (DMSO) sau 10-15% glycerol care
are rolul de a scdea temperatura de nghe permind apei s ias din celul i mpiedicnd astfel formarea cristalelor de ghea care ar putea distruge
membrana. Dup centrifugarea i verificarea vitalitii (se recomand folosirea celulelor vitale n proporie de >90-95% la colorarea cu trypan blue),
celulele vor fi resuspendate direct n mediul de ngheare rcit n prealabil
la 4 grade la o concentraie de 1x106-1x107/ml6 i transferate imediat7 la -20
de grade C pentru 1-2 ore. Urmeaz apoi transferul peste noapte la -80 de
grade Celsius i apoi stocarea de lung durat n azot lichid.
Dezghearea celulelor trebuie fcut extrem de rapid (ideal n mai puin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot, pe gheaa
uscat, direct n baia de ap la 37 de grade Celsius. Odat ce dezghearea
permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheat) aceasta se transfer ntr-un
tub de 15ml peste care se adaug pictur cu pictur8 o cantitate de mediu
prenclzit echivalent cu de dou-trei ori cantitatea suspensiei, dup care
se poate aduga mai rapid mediu pn la 10ml. Se centrifugheaz n general la 200rpm timp de 2-5 min pentru a elimina urmele mediului de ngheare. Se resuspend n 10 ml de mediu i se transfera n sticlele de culturp
etichetate. Prin micri fine se distribuie celulele. Dup cteva ore (cel trziu a doua zi dimineaa) se verific starea celulelor prin vizualizarea la microscop. Mediul va fi schimbat pentru a nltura celulele moarte i resturile
de cryoprotector (DMSO sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat).
Exist dispozitive speciale care permit coborarea temperaturii cu un grad pe minut.
Exist linii celulare la care se prefer folosirea altor substane n locul DMSO.
6 Numrul de celule/aliquot variaz n funcie de tipul de celule; este important s avem o
suspensie omogen unicelular.
7 DMOS este toxic pentru celuele la temperatura camerei. De aceea trebuie limitat contactul
acestuia cu celulele.
8 Pentru a preveni socul osmotic; la ngheare apa iese din celule unde presiunea osmotic
va crete.
4
5
80
4.Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; Freshney RI, John Wiley &
Sons 5th Edition 2005
Molecular Biology of the Cell 4th ed., Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P - Garland Science, 2002
Short Protocols n Cell Biology 1st ed., Bonifacino JS, Dasso M, Harford JB,
Lippincott-Schwartz J, Yamada KM, John Wiley & Sons 2004
Zell- und Gewebekultur 4. Auflage, Lindl T, Spektrum Akademischer Verlag 2000
www.protocol-online.org
www.invitrogen.com
81
Culturi celulare
partea a II-a
Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac
Cuprins
1. Studiul de literatur privind cercetri exploratorii recente ................................... 82
1.1. Producerea proteinelor recombinate n celule mamifere.................................. 88
1.2. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai ............................................ 88
2. Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale platformei ................... 93
3. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i metodologii ......... 94
4. Bibliografie ............................................................................................................. 99
alterate (cum ar fi celulele tumorale). Din punct de vedere didactic, rspunsul imun poate cuprinde dou variante:
rspunsul nnscut care reprezint o prim barier ntmpinat de
ctre agenii patogeni venii din afar (acest tip de rspuns apare pe
scara evolutiv nc de la bacterii i plante i este pstrat i la mamiferele superioare inclusiv la om);
rspunsul adaptativ numit i specific care este iniiat atunci cnd
rspunsurile nnscute nu reuesc s produc efectul dorit. Rspunsurile adaptative apar pentru prima dat pe scara evolutiv la petii
cartilaginoi ca o completare a sistemului imun nnscut.
Se poate vorbi n acest context despre o mprire judicioas a sarcinilor
n sistemul imun al mamiferelor. Exist aa-numitele celule, cum ar fi granulocitele, celulele natural killer etc. care aparin sistemului imun nnscut
i alte celule cum sunt limfocitele care aparin sistemului adaptativ. Deoarece sistemul imun adapatativ nu apare n urma unui salt brusc de la sistemul imun nnscut, exist diferite structuri care asigur trecerea lin de la
un sistem la altul asigurnd astfel o continuitate ntre cele dou sisteme.
Celulele ca i macrofagele, celulele dendritice, celulele B1, NKT sunt considerate a fi cele care prin diveri receptori i ci de semnalizare celular fac
posibil comunicarea ntre sistemul adaptativ i cel nnscut. Datorit diversitii extraordinare pe care mediul o ofer, exist diverse mecanisme
care au evoulat cu timpul pentru a satisface cu eficien maxim rezolvarea
fiecrei situaii ivite. Se vorbete despre un sistem imun cu componente
umorale adic cel n care produii celulelor imune circul prin snge sau
secreii (lacrimi, sudoare etc.) ntr-o form finit, de sine stttoare i cel cu
componente celulare n care celulele sunt cele care ndeplinesc funcia major de aprare (Figura 1, Tabel 1).
Dup cum menionam anterior, funcia sistemului imun este s ne protejeze fa de patogenii din mediu i fa de structurile proprii modificate.
n ciuda specificitii remarcabile a rspunsurilor imune, recunoaterea
structurilor strine se face ntr-un mod indirect. Acest fapt permite apariia
unor erori care au ca i rezultat declanarea unor reacii mpotriva propriilor structuri, fenomen caracteristic bolilor autoimune. Dei mecanismul
apariiei acestor boli nu este pe deplin neles, exist din ce n ce mai multe
date care au permis elaborarea unor teorii i modele experimentale care
s-au dovedit utile n caracterizarea acestor boli. Se consider c bolile autoimune constituie un grup heterogen de afeciuni care apar la aproximativ
5% din populaie. Ele pot fi clasificate n boli specifice pentru anumite organe aa cum este spre exemplul pemfigusul vulgar care intereseaz pielea
83
Th
Imunitate nnscut
Imunitate adaptativ
Granulocyte,
celule natural
killer, macrofage, sistem
complement
Tc
B (Ig)
Figura 1 Organizarea ierarhic a sistemului imun al mamiferelor. La mamifere, sistemul imun este
organizat ierarhic n sensul ca exist o unitate de control care integreaza informatiile primite de la
toate celelalte componente i pe baza lor stabilete care este cea mai bun soluie de urmat. Acest
centru de control i decizie este reprezentat de ctre celula (limfocitul) T helper (Th). Acesta primete
informaii de la sistemul imun nnscut, coordoneaza activarea sistemului imun adaptativ i
controleaza mecanismele efectoare ale sistemului innascut inchizand astfel circuitul. Exista totodata
schimburi directe intre sistemul innascut i cel adaptativ care au loc cel mai adesea prin intermediul
citokinelor, produsi de secretie ai celulelor imune care mijlocesc schimbul de informatii intre acestea
(sageata cu doua sensuri).
Imunitate celular
Imunitate umoral
Granulocite,
NK, 1
Sistemul complement,
Peptide antimicrobiene
Limfocitele B i
limfocitele T
Anticorpii (imunoglobulinele)
i mucoasele, diabetul zaharat de tip I care afecteaz celule beta ale pancreasului sau tiroidita Hashimoto care apare la glanda tiroida, i boli
autoimnune generalizate care intereseaz mai multe organe sau esuturi aa
cum este spre exemplu lupusul sistemic eritematos n care unul dintre au84
Fab
Fc
-NH2
Imunoglobulinele sunt glicoproteine heterogene alctuite din dou lanuri grele (cu masa molecular mai mare, situate spre interior n aceast
figur) i dou lanuri uoare (situate nspre exterior n partea de sus). Lanurile grele sunt identice ntre ele la fel cum lanurile uoare sunt identice
ntre ele. Din punct de vedere funcional, imunoglobulina (numit i anticorp cnd se gasete sub form circulant n snge/secreii) are dou poriuni: zona superioar (N-terminal) Fab are rolul de a recunoate specific
antigenul iar zona inferioar (C-terminal) Fc are rolul de a ndeplini funciile efectoare, interaciunea cu diverse componente ale sistemului imun
(cum ar fi complementul, receptorii pentru poriunea Fc de pe fagocite, sau
cu receptorii de pe celulele placentei permit trecerea anticorpilor de la
87
mam la ft). Ataat de aceste cozi Fc, se gsesc reziduuri de glucide care
au rol n modularea interaciunii dintre Fc i receptorii sistemului imun
(vezi text).
Descoperirea antibioticelor n anii 30-40 ai secolului trecut alturi de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor ntr-un con de
umbr. ncepnd cu 1975 situaia avea ns s se schimbe. ntr-o lucrare de
referin pentru literatura biomedical, doi cercettori anun n revista
Nature [17] o metod prin care se pot obine cantiti teoretic nelimitate de
anticorpi cu specificitatea dorit. Diferena ntre anticorpii policlonali (cei
care erau la acea or n uz medical) i noii anticorpi (numii monoclonali)
poate fi comparat, chiar i numai pentru a face lucrurile mai uor de neles, cu diferena dintre dou persoane, prima purtnd haine de diferite mrimi, forme i culori i a doua purtnd haine personalizate de ctre un croitor profesionist, ncepnd de la lenjerie i pn la ultimul nasture al paltonului. Chiar dac uor exagerat i poate nu cea mai potrivit din punct de
vedere bio-medical, folosirea acesteia are un substrat uor de neles i
anume n literatura de specialitate de limba englez termenii tailor made
antibodies sunt folosii pentru a descrie producerea de anticorpi
monoclonali specifici pentru diferite situaii [18]. Dezvoltarea acestei noi
tehnici, a dus la nlturarea primului din cele dou mari dezavantaje ale
folosirii anticorpilor policlonali, i anume lipsa unei surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu timpul, noua tehnologie
a premis obinerea lor prin tehnici relativ simple i cu costuri substanial
diminuate nlturnd astfel cel de-al treilea dintre dezavantajele amintite
anterior. Anticorpii monoclonali produi iniial au pstrat neajunsul de a fi
produi n alte specii ducnd la declanarea unui rspuns imun masiv din
partea primitorului (cel de-al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest
motiv, lumea bio-medical i industria farmaceutic a fost n prima instan
rezervat la posibila utilizare a acestora pe scar larg. Aceast temere a
fost dublat i de avansarea tehnicilor industriale de producere a moleculelor cu mas molecular mic care preau s fi rezolvat n sfrit problema
inexistenei unor medicamente perfecte. n ciuda acestor piedici, entuziatii
au continuat ns lucrul la producerea anticorpilor monoclonali ducnd la
aprobarea utilizrii primului anticorp produs n acest fel nu ns mai repede de un deceniu de la publicarea metodologiei de ctre Koehler i Milstein
[16]. Totui n anii care au urmat, potenialul imens al noii tehnologii a incitat att curiozitatea comunitii tiinifice (interesat n definirea noilor
aplicaii pentru care anticorpii monoclonali reprezentau unealta
mult-cutat, cel de-al patrulea neajuns amintit mai sus) ct i de ctre
pragmatismul industriei farmaceutice (care gsea o nou min de aur n
comercializarea noilor gloane magice aa cum le numea Paul Ehrlich,
89
B devine cel de-al treilea medicament admis pe piaa din SUA pentru tumori ale celulelor B. ntre timp acest medicament este folosit i n tratamentul unor boli autoimune cum ar fi artrita reumatoid, bolile buloase (pemfigusul, pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitic autoimun, vasculita autoimun etc. Acest anticorp chimer (combinaie ntre uman
i murin) are multiple mecanisme de aciune dintre care merit amintite:
inducerea toxicitii celulare indus de anticorpi (ADCC) i citotoxicitatea
mediat de complement (CDC), alturi de un mecanism de inducere a
apoptozei celulelor care exprim CD20 pe suprafa. n general, anticorpii
sunt substane care interacioneaz cu structuri extracelulare sau de pe suprafaa celulelor. Mare parte dintre eforturile actuale au menirea de a crete
penetrana acestor glicoproteine pentru inte din interiorul celulelor. n plus
dac anticorpii iniiali aparineau clasei IgG1, investigaii actuale sunt concentrate asupra diversificrii activitii prin schimbarea clasei i deci a paletei de efecte posibile. Mai mult, exist cteva direcii prin care se urmrete
creterea posibilelor interaciuni terapeutice. Dintre acestea amintim:
o
91
B
Celula
tumorala
Celula
tumorala
Celula
imun
Celula
imun
C
Celula
tumoral
Celula
tumoral
Celula
Celula
imun
imun
nano
nano
93
Obiective
Stablilirea dozei 50%1
Model de studiu
Culturi celulare ex
vivo
Strategie
Anticorp pur
Anticorp funcionalizat cu
nanosfere
Anticorp funcionalizat cu
nanosfere + Rx/toxic
Stabilirea potenialului
preventiv/curativ al
anticorpilor
funcionalizai
Model animal n
vivo
Anticorp pur
Anticorp funcionalizat cu
nanosfere
Anticorp funcionalizat cu
nanosfere + Rx/toxic
Este vorba despre doza care provoac moartea a 50% dintre celule.
94
Activiti
Stabilirea planului de clonare
Designul i producerea de amorse specifice
Izolarea ARN-ului mesager
RT-PCR
Clonarea produilor obtinui prin PCR
Exprimarea proteinelor recombinate
Producerea modelului
activ de boal
Producerea modelului
pasiv de boal
95
Celula
imun
Celula tumoral/
autoimun
5,6
4
Celula
imun
3
2
1
nano-r
x/tox
ROS, proteaze
CDC
Reprezentant
Referina bibliografic
ADCC1
CDC
Anti-CD20
Anti-CD20
[23,24]
[22]
Inducerea apoptozei
Anti-CD20
[25]
Anti-EGFR
[26]
Anti-EGFR
[26]
[27]
Anti-Her2/neu
Inhibarea neoformrii vaselor sangvine
Anti-EGFR
Anti-VEGF-A
Anti-
Diveri
[28,29]
[22]
Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizai acioneaz asupra intelor specifice prin acest
mecanism; legarea concomitent a Fv (partea a Fab) de antigenul int i a Fc de o celul
cum ar fi macrofagul sau celula NK care posed receptori pentru aceast poriune duce la
activarea celulei imune urmat de distrugerea celulei intit specific. Cercetri recente au
artat c ADCC este mai eficient la acei indivizi care prezint anumite polimorfisme n
poriunea Fc (respondeni cu grad nalt) [23,24].
98
4.Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
99
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
100
101
Energie
h0
h0
v=1
v=0
h0
h0
Imprastiere
Rayleigh
h0
h0 - hs
Imprastiere
Raman
(Stokes)
h0 + hs
h0
Imprastiere
Rayleigh
Imprastiere
Raman
(anti-Stokes)
Figura 1. Diagrama tranziiilor care au loc ntre diferite nivele energetice vibraionale i care corespund proceselor de mprtiere Rayleigh i Raman
h0
h0 - hs
h0 - hs
h0
h0 - hs
h0
(a)
(b)
(c)
Figura. 2. Diagrama tranziiilor care au loc ntre diferite nivele energetice n cazul (a) efectului
Raman convenional; (b) efectului Raman pre-rezonant; (c) efectului Raman rezonant.
benzilor observate. n plus, se modific regulile de selecie i vor fi amplificate doar anumite tranziii vibraionale Raman. Tranziiile de ordin superior, care de obicei nu se observ ntr-un spectru Raman convenional, sunt
deseori observabile ntr-un spectru Raman rezonant. Astfel, apar benzi noi
din analiza crora se pot obine informaii structurale suplimentare.
Spectroscopia Raman rezonant se folosete mai ales la investigarea
moleculelor poliatomice mari, cum sunt cele biologice, unde absorbia este
localizat ntr-o anumit zon a moleculei, la aa numiii cromofori. Amplificarea Raman rezonant permite izolarea benzilor Raman datorate acestor
cromofori i a unitilor structurale situate n vecintatea lor facilitnd astfel analizarea zonei cromoforice care este de obicei zona activ, n lipsa
unor semnale spectrale datorate mediului nconjurtor (ex. proteine).
Modificarea regulilor de selecie precum i amplificarea tranziiilor
vibraionale specifice de pn la 106 ori permit utilizarea spectroscopiei
Raman pre-rezonant ct i rezonana la un numr mare de aplicaii din
fizicp, chimie, biochimie i biologie. Pentru folosirea efectului Raman rezonant nu este necesar un echipament special, se folosesc doar lasere cu lungime de und variabil care s permit ajustarea energiei de excitare la valoarea necesar unei absorbii electronice.
S I L N m T s , unde I L este intensitatea radiaiei laser incident pe prob (Wcm-2), este seciunea specific de mprtiere Raman
(cm2sterad-1molecula-1), N m reprezint numrul de molecule din volumul
de prob investigat V P , este unghiul solid din care se face colectarea
luminii mprtiate Raman, iar T and s reprezint capacitatea de nregistrare a instrumentului i respectiv sensibilitatea detectorului la lungimea de
und . Se poate observa c atunci cand se dorete examinarea unui volum V P foarte mic dintr-o prob, doar civa parametrii pot fi modificai
astfel nct s se compenseze reducerea numrului de molecule N m . Acetia sunt intensitatea radiaiei laser incident pe proba I L i unghiul solid
din care se face colectarea luminii mprtiate Raman. Astfel, utilizarea
unei linii laser, a crei putere poate fi reglat ntr-un domeniu relativ larg,
i a unui obiectiv de microscop, care focalizeaz radiaia laser i culege lumina mprtiat sub un unghi solid mare, duce att la obinerea unui spectru Raman mai bun din punct de vedere calitativ ct i la localizarea unei
anumite zone de interes comparativ cu cazul n care acesta este nregistrat
fr obiectiv de microscop [16].
Eficiena de colectare a luminii este aproape n totalitate influenat de
apertura numeric NA a obiectivului de microscop care este definit de
relaia NA = n sin max n care n este indicele de refracie al mediului dintre
obiectiv i prob iar max este unghiul maxim de colectare al obiectivului.
Se poate observa c n cazul unor msurtori efectuate cu un obiectiv de
microscop imersat ntr-un mediu al crui indice de refracie este apropiat
de cel al probei investigate (nu exist o modificare a drumului razelor de
lumin la trecerea ntr-un mediu cu indice de refracie diferit) apare o mbuntire a eficienei de colectare i a rezoluiei spaiale. Utilizarea unui
astfel de mediu (ap, ulei, etc.) impune utilizarea unor obiective speciale
care posed caracteristici diferite pentru fiecare mediu, specificate foarte
exact de ctre productor. Important n astfel de situaii ramne faptul ca
mediul n care se face imersarea s nu influeneze structura i proprietile
probei investigate.
n numeroase studii micro-Raman apare un neajuns deoarece informaia spectral obinut nu este culeas dintr-un volum suficient de mic (referirea se face n termeni de rezoluie spaial perpendicular la axa optic
sau rezoluie lateral, i rezoluie spaial paralel la axa optic sau rezoluie axial). n microscopul convenional ntregul cmp vizual este uniform
106
iluminat i observat. Spre deosebire de acesta, microscopul confocal utilizeaz o diafragm (pinhol) care izoleaz radiaia luminoas care provine
din zona marginal a volumului n care a fost focalizat fascicolul laser (zona din afara focarului). Astfel, prin prezena pinholului se realizeaz o filtrare spaial a radiaiei, la detector ajungnd doar radiaia din volumul n
care a fost focalizat laserul [17]. Confocalitatea poate fi de asemenea obinut i prin restrngerea ariei de pe detector unde intensitatea radiaiei
Raman este mare (realizarea unei aperturi electronice). Utilizarea primei
metode de obinere a confocalitii necesit n general folosirea unor obiective de microscop cu apertur numeric mare (NA = 0.9 0.95) i poate
conduce la obinerea de informaie spectral dintr-un tub focal cu un diametru de 1.22/NA i o adncime de 4/NA2 [17].
apar clar definite benzi datorate vibraiilor date de structuri grafitice (notate G) i de structuri dezordonate (notate D i D). Extrem de important este
faptul c n cazul nanotuburilor de carbon apar, n regiunea numerelor mici
de und (< 200 cm-1), benzile datorate modurilor de respiraie radial (Radial Breathing Mode) cu ajutorul crora se poate determina diametrul
nanotubului (relaie de invers proporionalitate cu valoarea frecvenei
Raman) [19].
111
01. laserul
02. fibra optic standard
03. obiectivul
04. platforma de scanare
05. fibra optic multimod
06. spectrometru UHTS 300
07. lampa cu lumin alb pentru
iluminare
08. sistem de focalizare
motorizat pe axa z
09. camera video
Figura. 3. Drumul razelor n microscopul Raman WITec CRM 200.
d 0
M
, unde M este mrirea obiectivului, d0 diametrul
NA v P max
pinholului, NA apertura numeric a obiectivului de microscop, lungimea
este
de und, iar vPmax este un parametru variabil a crui valoare trebuie stabilit
n funcie de tipul de informaie spectral care se dorete a fi obinut (ex.
pentru a obine cea mai mare rezoluie lateral vPmax 0.5, iar pentru vPmax
4 nu se modific semnificativ rezoluia axial). Partea stng a ecuaiei este
legat doar de parametrii obiectivului de microscop.
113
10 /
0,25
53
20 /
0,4
50
40 /
0,6
67
60 /
0,8
75
100 /
0,9
111
100 /
1,25
80
100 /
1,4
71
440
29
71
142
286
571
488
26
64
129
258
515
532
24
59
118
236
472
633
20
50
99
199
397
785
16
40
80
160
320
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Parametrii folosii:
fibra multimode de 100 m
obiectivul 100X aer
linia laser 632.8 nm
puterea laserului 640 W
timp de integrare/msurare 60 s
3.2.2. Imagistica Raman confocal
Pentru imagistic este indicat utilizarea obiectivului de 100X (n aer
sau cu imersie n ulei). naintea efecturii unei scanri se stabilesc parametrii optimi de nregistrare (puterea laserului i timpul de integrare) prin
msurarea spectrelor individuale i time series. Referitor la timpul de integrare, ideal este s fie ct mai mic cu puin (ntre 0,1 s i 1 s), iar stabilirea
lui depinde de tipul probei, de puterea laserului i de aria scanat. n ceea
ce privete stabilirea numrului de linii i de puncte pentru suprafaa pe
care dorim s-o scanpm, n general pentru o arie de 10 m x 10 m se
utilizeazp minim 75 linii i 75 de puncte pentru fiecare linie (la un numr
prea mic de linii i de puncte imaginea este de proast calitate).
Exemplu. Harta spectral a intensitii benzii Raman de la 737 cm-1 din
spectrul SERS al adeninei nregistrat pe substrat solid obinut prin picurarea soluiei coloidale de argint cu adenina pe o sticl de microscop.
115
737
500
400
300
200
100
0
500
1000
1500
-1
116
Parametrii folosii:
fibra optic multimod 100 m
obiectivul 100X (aer)
linia laser 532 nm
putere laser 3 mW.
suprafaa scanat 10 m x 10 m
nr. de linii 150, puncte 150/linie
timp de integrare 0.2 s/punct
3.3. Accesorii
3.3.1. Modul de microscopie de for atomic model alpha 300
Echipamentul de microscopie Raman confocal CRM 200 cu scaner este
combinat cu un modul de microscopie de for atomic (AFM) model alpha
300.
peraturi.
4.Bibliografie
1.
119
120
Microspectroscopia Raman
partea a II-a
Conf. dr. Monica Maria Baia
Cuprins
1. Stadiul actual al cercetrilor exploratorii prin spectroscopie Raman................... 121
1.1. Substrate SERS ............................................................................................. 122
1.2. Identificarea unor bacterii ............................................................................. 122
1.3. Caracterizarea celulelor ................................................................................. 123
1.4. Diagnosticarea unor boli ............................................................................... 124
1.5. Aplicaii n domeniul farmaceutic................................................................. 125
1.6. Aplicaii n domeniul alimentar .................................................................... 125
1.7. Nanotuburi de carbon ................................................................................... 126
2. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman confocal din
cadrul platformei ICI-BNS................................................................................... 126
3. Tematici de cercetare posibil de implementat n cadrul laboratorului de
microscopie Raman confocal al platformei ICI-BNS .......................................... 128
4. Bibliografie ........................................................................................................... 130
123
124
imagistica Raman au fost utilizate pentru o testare rapid a hranei n vederea deteciei melaminei pentru a crete sigurana i securitatea public. n
toate aceste studii s-a urmrit banda caracteristic a melaminei de la 676
cm-1. Limita de detecie a melaminei a fost de 1%.
Spectroscopia micro-Raman confocal a fost utilizat i la stabilirea
compoziiei unor sucuri de fructe [28]. S-a determinat existena a trei componente importante ale sucurilor de fructe i anume pectina, fructoza i
-carotenul. Acest fapt ar permite utilizarea acestei metode pentru monitorizarea on-line a coninutului acestor substane n sucurile aflate n diferite
stagii de producie. Astfel, microspectroscopia Raman poate fi o metod de
analiz complementar sau alternativ msurtorilor de turbiditate care
sunt de obicei utilizate n industria alimentar n producia berii, monitorizarea apei, etc. n plus, pe lng faptul c ar detecta particule nedorite,
aceast metod ar putea oferi informaii i despre caracteristicile lor biochimice. Prin utilizarea combinat a spectroscopiei Raman cu alte tehnici de
analiz se pot obtine informaii cantitative referitoare la particulele nedorite
prezente n sucurile de fructe [29].
(a)
(b)
Figura. 1. Selecie de imagini a substratelor SERS ordonate (a) i a nanoparticulelor de metal nobil
sintetizate (b).
i termice ale nanoparticulelor de aur n detecia i tratamentul la nivel celular al cancerului (hipertermie local indus laser) sau n evaluarea profilului de toxicitate a nanopartirculelor n medii celulare. Astfel, s-a demonstrat c o serie de nanobastonae de aur sau alte nanoparticule de metal
nobil anizotrope, de obicei nvelite ntr-un strat polimeric biocompatibil,
pot fi utilizate n terapia fototermic a cancerului [40]. Au fost de asemenea
efectuate studii de detecie SERS intracelulare utiliznd nanoparticule de
aur PEGylate i marcate cu colorani [44] Rezultatele obinute demonstreaz faptul c nanoparticulele prezint stabilitate, conservndu-i identitatea
Raman in vitro, caracteristici care confer acestui tip de markeri SERS aplicabilitate ca i ageni imagistici n interiorul organismelor vii [44].
n cadrul unui alt studiu s-a dovedit c o serie de nanoparticule de argint de form triunghiular invelite n chitosan posed activitate
bactericidal, fiind capabile s distrug Staphylococcus aureus [45]. n majoritatea studiilor spectroscopia Raman a fost acompaniat de imagistica
Raman sau AFM.
3. Tematici de cercetare posibil de implementat n cadrul laboratorului de microscopie Raman confocal al platformei
ICI-BNS
Avnd n vedere stadiul actual al cercetrilor exploratorii prin spectroscopie Raman precum i dotrile existente n cadrul platformei, n grupul de
cercetare care utilizeaz echipamentul de microscopie Raman confocal
WITec CRM 200 combinat cu modulul de microscopie de for atomic
(AFM) model alpha 300, s-ar putea aborda noi tipuri de experimente
bio-medicale de diagnosticare a unor boli cum ar fi cele ale sistemului osos
sau arteroscleroza, realizndu-se i studii complementare de absorbie n IR.
Exist numeroase studii n literatur referitoare la utilizarea metodelor
spectroscopice complementare Raman i de absorbie n IR n analizarea
osului i a cartilajelor. Au fost efectuate numeroase investigaii cu scopul
nelegerii spectrelor, i corelrii caracteristicilor spectrale cu modificrile
care apar datorit vrstei sau a diverselor boli, la animale i n cteva cazuri
i la oameni. Doar n ultimii ani, cercettorii au considerat spectroscopia
vibraional ca o metod capabil s furnizeze informaii legate de diagnosticarea bolilor care apar la nivelul esuturilor muscularo-scheletale [46, 47].
Au fost investigate dou dintre cele mai importante boli ale oaselor i
anume osteoporoza, o boal metabolic, i osteogeneza imperfect, care
const dintr-o serie de defecte genetice care afecteaz scheletul. Se tie c
128
un os afectat de osteoporoz are un grad de cristalinitate crescut i un domeniu mai ngust de cristalinitate dect osul sntos. Aceste modificri ale
structurii sunt reflectate n spectrele Raman i IR ale probelor [46, 47]. Osteogeneza imperfect este o maladie genetic al crei principal semn clinic
este fragilitatea osoas crescut, manifestat n special prin fracturi la nivelul oaselor lungi. Aceast boala apare ca urmare a mutaiilor de la nivelul
genelor care codific producerea de colagen tip I. Metodele spectroscopice
vibraionale sunt capabile s identifice esuturile anormale afectate de
aceast boal [48]. n prezent, maladia se trateaz medical cu
aminobisfosfonai iar spectroscopia poate juca un rol important n urmrirea progresului tratamentului. S-a constatat c n principiu metodele spectroscopice vibraionale pot fi att un instrument de diagnosticare ct i o
metod care s monitorizeze progresul tratamentului asupra bolii.
Arteroscleroza st la baza apariiei majoritii bolilor cardiovasculare
(angina pectoral, cardiopatie ischemic, infarct miocardic, accident vascular cerebral, arteriopatie obliterant etc.). Ea se datoreaz prezenei
aa-numitelor plci ateromatoase pe pereii arterelor. Aceste plci se formeaz datorit colesterolului i grsimilor prezente n cantiti excesive n snge (datorit greelilor de alimentaie) care se "infiltreaz" n pereii arterelor. n timp, prin depunerea de calciu se formeaz plcile ateromatoase. Ele
stnjenesc din ce n ce mai mult circulaia liber a sngelui prin artera afectat: din laminar i fluent, ea devine turbulent i inegal.
Metodele spectroscopice complementare Raman i de absorbie n IR
sunt capabile s coreleze informaiile histopatalogice ale unei aorte afectate
de arteroscleroz cu compoziia chimic a unei aorte sntoase [49-51]. Se
pot monitoriza benzile caracteristice proteinelor (colagen, elastina, actina,
etc.) i lipidelor, i se pot localiza plcile ateromatoase prin prezena benzilor
caracteristice carbonatului de calciu [49-51].
n ultima perioad, spectroscopia Raman s-a dovedit a fi o metod fezabil n studiul materialelor nanostructurate. n cadrul unui studiu a fost
analizat dependena deplasrii benzilor Raman n funcie de dimensiunea
unor nanocristale [52]. De asemenea au fost investigate prin spectroscopie
Raman efectele de confinare a fononilor optici n materialele
nanostructurate [53]. Aceast confinare duce la modificri ale spectrului de
vibraie al materialelor nanostructurate n comparaie cu cel al materialului
bulk, deoarece absena periodicitii la dimesiuni sub cele ale particulei
relaxeaz regulile de selecie ale fononilor optici n regiunea central a zonei Brillouin i prin urmare, n spectrul Raman, vor exista contribuii ale
fotonilor din afara acestei zone. Studii efectuate pe nanostructuri poroase
129
4.Bibliografie
1.
2.
3.
4.
130
L. A. Nafie, Recent advances n linear and nonlinear Raman spectroscopy. Part IV,
J. Raman Spectrosc. 41, 1566, 2010.
L. A. Dick, A. D. McFarland, C. L. Haynes, R. P Van Duyne, Metal Film over
Nanosphere (MFON) Electrodes for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy
(SERS): Improvements n Surface Nanostructure Stability and Suppression of
Irreversible Loss, J. Phys. Chem. B 106, 853, 2002.
L. Baia, M. Baia, J. Popp, S. Astilean, Gold Films Deposited over Regular Arrays of
Polystyrene Nanospheres as Highly Effective SERS Substrates from Visible to NIR,
J. Phys. Chem. B 110, 23982, 2006.
M. Sackmann, S. Bom, T. Balster, A. Materny, Nanostructured Gold Surfaces as
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
131
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
132
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
133
IV. SPECTROMETRUL IR
Spectroscopia de absorbie n infrarou
Lect. dr. Nicolae Leopold
Cuprins
1. Introducere ........................................................................................................... 134
2. Moduri de vibraie ................................................................................................ 135
3. Oscilatorul armonic ............................................................................................. 137
4. Reguli de selecie pentru spectroscopia IR ........................................................... 138
5. Legea Lambert-Beer .............................................................................................. 139
6. Instrumentaia i metodologia obinerii spectrelor IR .......................................... 141
7. Bibliografie ........................................................................................................... 146
1. Introducere
Materia este format din electroni, nuclee, ioni pozitivi i negativi. Fiecare subdiviziune a materiei, cum ar fi un atom, o molecul, sau un solid
prezint o distribuie de sarcin specific. Aceste sarcini nu sunt doar sarcini izolate (monopoli), ci sunt sarcini pozitive i negative ce formeaz dipoli i multipoli electrici. n interaciunea luminii cu materia, cmpul electric (i ntr-o msur mai mic i cel magnetic) al undei electromagnetice
poate s modifice distribuia de sarcin i n acest fel s induc un moment
de dipol.
n unda de lumin, cmpul electric oscileaz cu o frecven de aproximativ 1015 Hz, ceea ce nseamn c modificarea distribuiei de sarcin va avea loc
134
cu aceeai frecven n materie. Pe de alt parte, modificri (oscilaii) ale distribuiei de sarcin, precum un dipol oscilator poate genera, la rndu-i, un cmp
electric. Aceste procese, ce apar la interaciunea luminii cu materia, sunt n
tratarea clasic procesele de baz ale fiecrei metode spectroscopice.
De vreme ce distribuia de sarcin este specific pentru un anumit tip
de materie, molecula unei anumite substane de exemplu, schimbul de
energie ntre unda electromagnetic i materie este de asemenea specific,
oferind informaii unice despre materie.
n teoria cuantic, procesele sunt descrise de anihilarea unui foton, urmate de tranziia n stri de energie mai mari, sau generarea unui foton
cnd sistemul trece de la o stare energetic ridicat la una joas. Probabilitatea specific, ca fotonii s interacioneze cu materia este descris de aa
numita seciune eficace a efectului spectroscopic.
2. Moduri de vibraie
Spectroscopia de absorbie n infrarou, pe scurt spectroscopia IR, precum i spectroscopia Raman ofer informaii despre modurile vibraionale
i vibraional-rotaionale ale moleculelor. Benzile vibraional-rotaionale
sunt observate doar cnd proba se afl n stare de gaz, unde moleculele se
pot roti liber. n fazele condensate (lichid sau solid), pot fi observate doar
frecvenele de vibraie ale probei.
n funcie de simetria moleculei, cele dou tehnici, IR i Raman, pot fi
privite ca fiind complementare. O vibraie va fi activ IR dac are loc o variaie a momentului de dipol n timpul vibraiei. n schimb, acele vibraii
care duc la o modificare a polarizabilitii moleculare vor fi active Raman.
Astfel, activitatea unui mod vibraional depinde de simetria lui i de simetria moleculei. O regul simpl de simetrie este aa numita regula
excuziunii mutuale. Conform acesteia, n cazul moleculelor cu centru de
simetrie, vibraiile active Raman nu sunt active IR, i invers.
Numrul modurilor de vibraie posibile al unei molecule poate fi determinat din numrul atomilor N din molecul i geometria molecular.
Geometria molecular este specificat de coordonatele carteziene ale fiecrui atom. Molecula are aadar 3N grade de libertate, trei dintre aceste grade
fiind folosite pentru specificarea micrii de translaie a moleculei n spaiu,
i alte dou (molecule liniare) sau trei (molecule neliniare) grade sunt necesare pentru a specifica micarea de rotaie. Gradele de libertate rmase corespund numrului modurilor de vibraie:
3N-5 pentru molecule liniare, i
3N-6 pentru moleculele neliniare.
135
ntindere simetric
ntindere asimetric
deformare (forfecare)
ntindere asimetric
ntindere simetric
136
3. Oscilatorul armonic
Cel mai simplu model pentru vibraia unei molecule diatomice este oscilatorul armonic. n acest model se consider cei doi atomi de mase m1 i
m2 ai moleculei legai printr-un resort elastic. Descrierea matematic a micrii de vibraie a acestor dou corpuri cu masele m1 i m2 poate fi simplificat prin considerarea unui singur corp cu masa redus
=m1*m2/(m1+m2), ce oscileaz n jurul centrului de mas al moleculei
biatomice, ntr-un cmp potenial de tipul kx2/2.
Figura 3. Modelul oscilatorului armonic pentru molecula diatomic. Variaia energiei poteniale cu
distana internuclear.
1
) , v=0,1,2.
2
(1.1)
1
2
(1.2)
137
(1.3)
(1.4)
*
M= " 0( e) ' d
(1.5)
Funciile de und " i ' reprezint strile vibraionale final i respectiv iniial, iar 0( e) este momentul de dipol electric permanent n aceast
stare electronic. Pentru vibraia unei molecule diatomice, momentul de
dipol electric permanent poate fi extins ntr-o serie Taylor dup distana
internuclear de echilibru re :
0(e) =e+ q +
r re
1
2
2 q2+
2
r re
(1.6)
Aici q=r-re, iar r este distana internuclear la un moment dat, i e este momentul de dipol cnd legatura se afl n poziia de echilibru. Probabilitatea
apariiei unei tranziii vibraionale ntr-o molecul diatomic poate fi obinut substituind forma extins a momentului de dipol electric permanent
n ecuaia momentului de dipol pentru tranziia vibraional:
'
0(e) d =
'
1
*
' q d +
2
r re
*
e " ' d +
'
2
2
r re
*
"
q2 ' d +
(1.7)
138
Primul termen din aceast ecuaie este egal cu zero de vreme ce funciile de
und vibraionale " i ' sunt ortogonale. Al doilea termen este diferit
de zero doar dac momentul de dipol depinde de distana internuclear r
0
r
(1.8)
De aceea, moleculele biatomice prezint absorbie vibraional n spectrul IR doar atunci cnd exist o modificare a momentului de dipol n cadrul micrii de vibraie. Moleculele diatomice homonucleare au momentele de dipol zero pentru toate lungimile legturilor, astfel nu prezint spectru de absorbie vibraional.
Astfel, teoria mecanicii cuantice specific faptul c absorbia luminii infraroii va aprea doar dac un mod vibraional implic o modificare a
momentului de dipol i c nivelele de energie vibraionale n molecul sunt
cuantificate. Teoria ne spune de asemenea i faptul c tranziiile pot avea
loc doar ntre nivele de energie adiacente, deoarece integrala din cel de-al
doilea termen pentru polinoamele Hermite care descrie funcia de und a
oscilatorului armonic, este diferit de zero doar dac v= 1.
5. Legea Lambert-Beer
Domeniul spectral IR al radiaiei electromagnetice este poziionat ntre
domeniul vizibil i cel al microundelor. Prin convenie, domeniul spectral
IR este subdivizat n domeniul IR apropiat (Near Infrared Region - NIR), IR
mijlociu (Mid Infrared Region - MIR) i IR ndeprtat (Far Infrared Region FIR) (Figura 4). Spectrele IR discutate n aceast lucrare sunt toate din domeniul spectral MIR.
139
Spectrul IR se obine prin nregistrarea intensitii radiaiei n lipsa probei de analiz (spectrul background) i a intensitii radiaiei IR dup ce
aceasta trece prin prob. n urma trecerii prin prob, intensitatea fasciculului se va atenua datorit absorbiei de radiaie de ctre analit, precum i a
mprtierii radiaiei la interfaa i n interiorul probei (Figura 5a). Astfel,
spectrul IR reprezentat va fi dat de mrimea:
T= Is/IR
unde, T este transmitana, Is intensitatea radiaiei IR dup, iar IR nainte de a
traversa radiaia proba. Valorile transmitanei sunt ntre 0 i 1, sau 0100%
pentru transmitana exprimat n procente.
ntre transmitan i concentraia unui compus relaia este logaritmic.
De aceea, pentru o reprezentare mai convenient, n majoritatea cazurilor,
n locul transmitanei se folosete o alt mrime, absorbana A:
A = lg
1
= lg T
T
Figura 5. (a) Atenuarea unui fascicul de radiaie la refelexia interfeei probei, mprtierea de ctre
particule i absorbia analitului. (b) Relaia dintre transmitan, T, i absorban, A, n funcie de
concentraia unui compus ipotetic.
A = ad c
(I.2)
unde a este absorbtivitatea o constant de proporionalitate a moleculei la
o lungime de und specific, d este lungimea drumului optic prin prob, iar
c reprezint cocentraia substanei analizate.
Concluzionnd, spectroscopia IR ofer att informaii moleculare calitative, prin modurile de vibraie specifice fiecrei molecule, ct i informaii
cantitative, aa cum rezult din legea Lambert-Beer.
I ( ) = 0.5 H (v ) I (v ) cos 2v I ( )
unde H( v ) este un factor de corecie dependent de numrul de und i de
caracteristicile spectrometrului. Interferograma convertit n domeniul
frecvenelor se numete spectru de tip single-beam.
141
IR-light source
Figura 6. Spectrometrul FTIR. (a) Schema bloc a componentelor de baz ale unui spectrometru IR.
(b) Principiul de funcionare a unui interferometru Michelson format din surs de lumin, divizor de
und, oglind fix, oglind mobil, detector i prob (panel sus). Oglinda mobil a interferometrului
(panel sus) produce un semnal sinusoidal la detector pentru fiecare frecven modulat (panel central). Pentru sursa IR, cu domeniu spectral de frecvene larg, semnalele modulate se suprapun i
formeaz o interferogram complex (panel jos).
Aspirina
Paracetamol
Deferoxamina
Tabloul spectral din Figura 9 prezint spectrele de absorbie n IR ale
celor trei substane analizate.
Figura 9 Spectrele FTIR/ATR ale substanelor de interes farmacologic: aspirina, paracetamol i deferoxamina.
145
Spectrele din Figura 9 sunt caracteristice structurilor moleculare corespunztoare, pentru fiecare substan putndu-se identifica o amprent spectral caracteristic. Atribuirea benzilor de vibraie se poate face pe baza literaturii de specialitate comparnd spectrele cu cele ale compuilor asemntori sau prin calcularea teoretic a spectrelor IR folosind programe dedicate
de chimie cuantic.
7. Bibliografie
1.
O. Cozar, Teoria Grupurilor n Fizica Atomului i Moleculei. 1986, Litografia Universitii Babe-Bolyai, Cluj-Napoca.
2. Chi, O. Cozar, L. David, Simetrie Molecular. 2007, Napoca Star, Cluj-Napoca.
3. Chi, V. Simon, N. Leopold, Probleme de Fizica Moleculei. 2001, Litografia
Universitatii Babes-Bolyai, Cluj-Napoca.
4. T. Iliescu, Spectroscopie Optic Molecular. 2000, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca.
5. T. Iliescu, S. Cnt-Pnzaru, D. Maniu, R. Grecu, S. Atilean, Aplicaii ale spectroscopiei vibraionale. 2002, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca.
6. S. Atilean, Spectroscopia IR i Raman. Metode i tehnici moderne de spectroscopie optic.
Vol. I. 2002, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca.
7. N. Leopold, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Selected Applications. 2009, Napoca Star, Cluj-Napoca.
8. W.E. Smith and G. Dent, Modern Raman Spectroscopy A Practical Approach. 2005,
Wiley, Chichester, UK.
9. B. Schrader, Ed. Infrared and Raman Spectroscopy - Methods and Applications. 1998,
VCH, Weinheim, Germany.
10. F. Engelke, Aufbau der Molekle. 1992, Teubner, Stuttgart, Germany.
11. J.M. Hollas, Modern Spectroscopy. 2004, Wiley, Chichester, UK.
146
Cuprins
1. Introducere ........................................................................................................... 147
2. Aplicaii analitice ale spectroscopieie IR .............................................................. 148
2.1. Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR ......................................... 149
2.1.1. mbuniri tehnice recente n cuplajul LC-IR..................................... 150
2.2. Cuplajul on-line electroforeza capilar (CE)-IR ........................................... 150
3. Aplicaii biomedicale ale spectroscopiei IR ........................................................... 151
4. Spectroscopia IR n calitatea i sigurana alimentelor ......................................... 154
5. Aplicaii ale spectroscopiei IR n geotiine.......................................................... 155
6. Bibliografie ........................................................................................................... 157
1. Introducere
Spectroscopia de absorbie n infrarou (IR) reprezint o metod analitic de investigaie molecular utilizat ntr-un numr vast de domenii.
Publicaiile din ultimii 5 ani cu tematica legat de spectroscopia de absorbie IR pot fi clasificate pe domenii tiinifice dup cum este prezentat n Figura 1.
147
Figura 1. Clasificarea pe domenii a numrului de publicaii din ultimii 5 ani cu tematica legat de
spectroscopia de absorbie IR (www.scopus.com)
Metodele de separare cromatografice i electroforetice sunt tehnici standard n laboratoare analitice privind sigurana i autenticitatea alimentelor,
detecia substanelor interzise, laboratoare medicale, sau laboratoare pentru
studii farmacologice. De regul, aceste metode de separare sunt cuplate cu
metode de detecie ca, absorbia UV-VIS sau spectrometria de mas. Desigur,
aceste metode prezint avantaje i dezavantaje n funcie de analizele efectuate. Cert este faptul c n ultimii ani sunt depuse eforturi pentru a cupla cu
spectrometria de mas i alte metode de detecie cum ar fi spectroscopia
Raman sau spectroscopia de absorbie IR.
De obicei, detecia n CE este dificil, din cauza concentraiei mici de substan disponibil pentru detecie, iar n cazul deteciei UV-Vis
sensitivitatea este limitat de diametrul mic al capilarului.
Pentru detecia prin spectroscopia infraroie mijlocie s-au raportat msurtori att off-line ct i on-line. Recent ns, tot mai multe studii arat c
detecia on-line FTIR este utilizat cu succes.
n msurtori de transmisie folosind celule transparente manufacturate
special pentru IR o parte din spectru este blocat din cauza absorbiei puternice a fazei lichide. Detecia on-line bazat pe tehnica reflexiei totale atenuate ocolete aceast problem prin reducerea eficient a drumului optic.
Utilitatea deteciei FTIR on-line a fost demonstrat prin separarea i cuantificarea adenosinei, guaninei i a adenosinei-5 monofosfat n domeniul ng
folosind electroforeza capilar convenional [16]. Un alt studiu prezint
separarea i detecia IR a 5 analii, rezultatele fiind foarte bune din punct de
vedere calitativ i cantitativ [17]. Maturitatea cuplajului CE-FTIR on-line
este considerat prin separarea i cuantificarea cu succes a glucidelor din
buturi rcoritoare [18].
Informaia molecular specific livrat de spectrul IR poate fi interpretat n mod avantajos, aa cum s-a artat la discriminarea on-line de
enantiomeri n timpul separrii chirale ntr-un mediu neapos. Interaciunea
moleculelor analit cu selectorul chiral a produs diastereomeri cu un spectru
IR clar, distinct, permind discriminarea moleculelo analit [19].
Un alt domeniu n care spectrometria IR poate furniza informaii importante este analiza proteinelor. Aplicaiile principale n acest domeniu
sunt cele privind dinamica proteinelor i elucidarea structurii secundare.
Acest ultim aspect este cel care face spectroscopia FTIR o metod de analiz
biomolecular foarte atrgtoare [20]. Acest articol raporteaz prima separare a unor proteine n electroforeza capilar cu detecia FTIR on-line.
diu a ridicat anumite probleme, respectiv apariia prin interpretarea spectrelor a unor configuraii ciudate de baze i zaharuri.
n concluzie, spectroscopia de absorbie IR reprezint o metod senzitiv n ceea ce privete analiza malignitii esuturilor cu potenial real pentru aplicaii clinice n detecia i diagnosticarea a diverse afeciuni.
atras atenia asupra limitrilor acestei metode, inclusiv n procesul de extracie i asupra nevoii unui spectru larg de probe pentru a mbunti repetabilitatea acestui model, dar au subliniat c aceast metod este o mbuntire real comparativ cu ncercrilor anterioare [70]. Metodele tradiionale
pentru autentificarea sucurilor de fructe includ cromatografia sau analiza
raportului izotopilor de carbon, niciuna dintre ele fiind foarte practic pentru c sunt costisitoare din punct de vedere al timpului necesar efecturii
lor i al setrilor pentru controlul de calitate, folosesc solveni duntori i
monitorizeaz doar un parametru la un moment dat.
Consumatorii sunt tot mai interesai de produse organice i sunt dispui s plteasc un pre mai mare pentru aceste produse. Industria de vinuri a recunoscut acest trend i astfel n multe podgorii se pune accentul pe
vinuri organice. Pn n 2009 nu a fost o metod standardizat n industria
viticol care s permit determinarea eficient a compoziiei i autenticitii
vinurilor organice [71]. Cozzolino et al. [71] au fost primii care au folosit
tehnologia IR pentru a clasifica vinuri comerciale provenite de la sisteme de
producie organic i anorganic. Aproape 200 de soiuri de vinuri roii i
albe din 13 regiuni din Australia au fost analizate folosind spectroscopia
MIR combinat cu PCA, regresia PLS discriminant (DPLS), i analiza discriminant liniar (LDA). DPLS a clasificat corect 85% din vinurile organice, iar LDA a reuit s clasifice 75%. n general, rezultatul analizei PCA a
separat vinurile organice de cele anorganice, dar a existat o uoar suprapunere [71]. Autorii aduc la cunotin c spectroscopia MIR combinat cu
tehnici chemometrice au permis o discriminare bun ntre probele produse
n sisteme de producie organic i anorganic. Explorarea rezultatelor analizei PLS nu a desemnat un parametru chimic individual care s fi explicat
diferenierea vinurilor, ci mai degrab mai muli compui chimici, incluznd compui fenolici volatili i nevolatili, care ar contribui la discriminarea vinurilor.
156
6. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
157
158
57. T. Richter, G. Steiner, M. H. Abu-Id, R. Salzer, R. Bergmann, H. Rodig and B. Johannsen, Vibrational Spectroscopy 28 (2002) 103-110;
58. B. Rigas and P. T. T. Wong, Cancer Research 52 (1992) 84-88;
59. B. Rigas, S. Morgello, I. S. Goldman and P. T. T. Wong, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 87 (1990) 8140-8144;
60. M. Huleihel, A. Salman, V. Erukhimovich, J. Ramesh, Z. Hammody and S.
Mordechai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 50 (2002) 111-121;
61. R. Smith and I. Rehman, Journal of Materials Science-Materials n Medicine 5 (1994)
775-778;
62. G. I. Dovbeshko, V. I. Chegel, N. Y. Gridina, O. P. Repnytska, Y. M. Shirshov, V. P.
Tryndiak, I. M. Todor and C. I. Solyanik, Biopolymers 67 (2002) 470-486;
63. M. M. Mossoba, S. F. Al-Khaldi, J. Kirkwood, F. S. Fry, J. Sedman and A. A. Ismail,
Vibrational Spectroscopy 38 (2005) 229-235;
64. D. Naumann H. H. J. M. K. A. Mantsch, Infrared and NIR raman spectroscopy n
medical microbiology 3257 (1998) 245-257;
65. K. J. Jalkanen, V. W. Jurgensen, A. Claussen, A. Rahim, G. M. Jensen, R. C. Wade, F.
Nardi, C. Jung, I. M. Degtyarenko, R. M. Nieminen, F. Herrmann, M.
Knapp-Mohammady, T. A. Niehaus, K. Frimand and S. Suhai, International Journal
of Quantum Chemistry 106 (2006) 1160-1198;
66. J. Binoy, J. P. Abraham, I. H. Joe, V. S. Jayakumar, G. R. Pettit and O. F. Nielsen, Journal of Raman Spectroscopy 35 (2004) 939-946;
67. M. Tarumi, M. Shimada, T. Murakami, M. Tamura, H. Arimoto and Y. Yamada,
Physics n Medicine and Biology 48 (2003) 2373-2390;
68. H. Vardin, A. Tay, B. Ozen and L. Mauer, Food Chemistry 108 (2008) 742-748;
69. R. Fugel, R. Carle and A. Schieber, Trends n Food Science & Technology 16 (2005)
433-441;
70. J. He, L. E. Rodriguez-Saona and M. M. Giusti, Journal of Agricultural and Food
Chemistry 55 (2007) 4443-4452;
71. D. Cozzolino, M. Holdstock, R. G. Dambergs, W. U. Cynkar and P. A. Smith, Food
Chemistry 116 (2009) 761-765;
72. R. Wysoczanski and K. Tani, Journal of Volcanology and Geothermal Research 156
(2006) 302-314;
73. H. Skogby, Water n Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 155-167;
74. A. Beran and E. Libowitzky H. S. J. R. Keppler, Water n natural mantle minerals II:
Olivine, garnet and accessory minerals 62 (2006) 169-191;
75. E. A. Johnson, Water n Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 117-154;
76. G. Della Ventura, F. Bellatreccia and M. Piccinini, American Mineralogist 93 (2008)
1538-1544;
77. F. Bellatreccia, G. Della Ventura, M. Piccinini, A. Cavallo and M. Brilli, Mineral.
Mag. 73 (2009) 399-413;
78. B. De Vivo, A. Lima and J. D. Webster, Elements 1 (2005) 19-24;
79. E. Libowitzky and G. R. Rossman, Physics and Chemistry of Minerals 23 (1996)
319-327;
80. P. D. Ihinger, R. L. Hervig and P. F. McMillan, Volatiles n Magmas 30 (1994) 67-121;
81. R. L. Linnen, H. Keppler and S. M. Sterner, Canadian Mineralogist 42 (2004)
1275-1282;
82. G. Della Ventura, F. Bellatreccia and M. Piccinini, Rendiconti Lincei-Scienze Fisiche E
Naturali 19 (2008) 141-159;
83. T. Andersen, M. L. Frezzotti and E. A. J. Burke, Lithos 55 (2001) IX-XI;
159
V. SPECTROFLUORIMETRUL
Spectrofluorimetria
Conf. dr. Dana Maniu
Cuprins
1. Consideraii teoretice............................................................................................ 160
2. Tehnica experimental ......................................................................................... 164
3. Avantajele spectrofluorimetriei ............................................................................ 166
4. Aplicaii ale spectrofluorimetriei .......................................................................... 166
5. Aparatura disponibil .......................................................................................... 169
6. Bibliografie ........................................................................................................... 171
1. Consideraii teoretice
Fluorescena este un fenomen de fotoluminiscen (procesul prin care
substanele absorb lumin i dup aceea reemit lumin cu o lungime de
und diferit). Din aceeai clas fac parte i fosforescena i fosforescena
ntrziat. Prin absorbie de radiaie luminoas moleculele pot fi excitate
prin trecerea unui electron de pe nivelul fundamental pe un nivel excitat.
Energia strii excitate nu poate fi meninut dect o perioad foarte scurt,
molecula dezexcitndu-se. Dac molecula se dezexcit (electronul trece din
starea excitat n starea fundamental) prin emisie de lumin, procesul se
numete fluorescen.
Moleculele care au aceast proprietate, se numesc molecule fluorescente
sau fluorofori. n starea electronic fundamental moleculele fluorescente se
afl ntr-o configuraie stabil, deci nu emit radiaie de fluorescen. Atunci
cnd radiaia luminoas ajunge pe o molecul fluorescent, aceasta poate
trece ntr-o stare electronic excitat (cu energie mai mare) n urma absorbiei
de energie de la radiaia luminoas. Exist o mulime de nivele vibraionale
ale strii electronice excitate pe care se poate afla o molecul fluorescent.
Energia acestor nivele depinde de energia (lungimea de und) radiaiei luminoase care produce excitarea. Moleculele fluorescente sunt instabile atunci
cnd se afl pe un nivel vibraional al strii electronice excitate. De aceea ele
160
trec n cea mai joas stare electronic excitat, care este semi-stabil, pierderea de energie este neradiativ, fcndu-se prin ciocnirea cu alte molecule.
Intervalul de timp n care o molecul fluorescent se afl n stare excitat se
numete timp de via i are o valoare foarte mic (ntre 10-15 i 10-9 s). Dup acest interval, moleculele fluorescente trec din stare electronic excitat n
stare electronic fundamental, excesul de energie dintre cele dou stri
regsindu-se n energia radiaiei luminoase emise n procesul de dezexcitare.
Radiaia luminoas de fluorescen are energie mai mic dect radiaia
luminoas absorbit de molecul. Deci lungimea de und a radiaiei emise
este totdeauna mai mare dect lungimea de und a radiaiei absorbite datorit energiei pierdute de molecul n timpul trecerii pe cea mai joas stare
electronic excitat.
Molecula fluorescent poate absorbi energie luminoas din nou, deci
procesul descris mai sus poate fi repetat. De fapt, procesul de fluorescen
este ciclic i are loc atta timp ct exist o radiaie luminoas, care s excite
molecula. Acest fapt este deosebit de util, deoarece nseamn c o molecul
poate emite radiaie de fluorescen de mai multe ori. Aceast proprietate
face ca fluorescena s fie o tehnic foarte senzitiv (chiar i o mic cantitate
de substan poate fi detectat).
n realitate, moleculele fluorescente sunt instabile structural n intervalul
de timp ct se afl n stare de excitaie (timpul de via), ceea ce face posibil
degradarea ei. O radiaie luminoas de mare intensitate poate provoca modificarea structurii moleculei fluorescente, astfel nct aceasta s nu mai emit
radiaie de fluorescen. Acest proces este numit photobleaching.
n urma absorbiei unui foton de ctre o molecul, sunt posibile urmtoarele procese (ilustrate n figura 1):
- conversia intern (IC) - moleculele aflate pe diferite nivele vibraionale
se relaxeaz pe nivelul fundamental al strii electronice respective; relaxarea vibraional se face prin pierderea de energie n urma ciocnirilor dintre
molecule (10-14 - 10-11 s).
- intersystem crossing (ISC) - unele molecule aflate n prima stare electronic excitat, stare de singlet (S1), pot trece n prima stare de triplet (T1).
Acest proces se poate observa la atomii grei (Br, I) sau la metale.
- fosforescena - moleculele aflate n starea de triplet pot s se dezexcite
prin emisia unui foton. O tranziie triplet-singlet este mult mai puin probabil dect o tranziie singlet-singlet. Timpul de via a unei stri excitate
de triplet poate ajunge pn la 10 s, deci emisia de fosforescen poate continua i dup ncetarea iradierii iniiale. De obicei fosforescena apare doar
la temperaturi sczute sau n medii cu vscozitate mare (dezexcitatea nivelului T1 se poate face i prin conversie intern sau alte procese neradiative).
161
- fluorescena, este proprietatea moleculelor de a emite radiaie electromagnetic la trecerea de pe prima stare excitat de singlet S1 pe un nivel
vibraional al strii electronice fundamentale S0. Fluorescena poate s apar doar n timpul absorbiei (timpul de via a unei stri excitate de singlet
este ntre 10-9 i 10-15 s). Majoritatea moleculelor nu sunt fluorescente deoarece starea excitat S1 se suprapune cu nivelele vibraionale ale strii fundamentale S0. n acest caz relaxarea vibraional este mai rapid dect relaxarea prin fluorescen.
Fluorescena se poate msura cu ajutorul eficienei cuantice Q (randament cuantic):
Q = (numrul de fotoni emii) / (numrul de fotoni absorbii)
Q are o valoare fix pentru fiecare molecul (pentru aceleai condiii),
valoarea maxim fiind 1. De aceea, moleculele fluorescente au spectre de
absorbie i de fluorescen caracteristice.
Fluorescena observat cu ajutorul spectrofluorimetrelor este cunoscut
ca Fluorescena de tip Stokes. Fluorescena de tip Stokes reprezint emisia
de fotoni cu lungime de und mai mare (frecven mai mic) de ctre o
molecul ce a absorbit fotoni cu o lungime de und mai mic (frecven mai
mare). Att absorbia ct i emisia de fluorescen sunt unice pentru fiecare
molecul. Lumina emis are totdeauna lungime de und mai mare dect
lumina absorbit (figura 2).
162
Intensitatea radiaiei fluorescente este proporional cu intensitatea radiaiei absorbit de o molecul fluorescent:
F = K'(I0-I)
unde I0 este intensitatea radiaiei incidente pe prob, I este intenstitatea
radiaiei dup ce a traversat un strat de substan de lungime b, iar K' este
o constant ce depinde de condiiile experimentale i de eficiena cuantic a
fluorescenei.
Dac inem cont de legea Beer:
I/I0 = 10-bc ,
unde A = bc este absorbana, atunci printr-o simpl nlocuire se obine
legea fluorescenei:
F = K' I0 (1 - 10-bc)
163
Spre deosebire de legea Beer, intensitatea radiaiei de fluorescen nu depinde liniar de concentraie. Dac folosim o descompunere n serie Taylor,
avem:
2!
2!
Dac bc are o valoare suficient de mic (< 0.05) termenii de ordin superior
pot fi considerai nuli, deci putem scrie:
F = 2,3K'bcI0
Relaia de mai sus ne arat ca pentru concentraii suficient de mici intensitatea de fluorescent este proporional cu concentraia i cu intensitatea
radiaiei excitatoare la frecvena de absorbie.
Pentru o concentraie mai mare dect c1 curba de calibrare nu mai este liniar.
2. Tehnica experimental
Pentru a msura fluorescena exist dou tipuri de instrumente: fluorimetre i spectrofluorimetre.
Un fluorimetru msoar abilitatea unei probe de a absorbi lumin la o
anumit lungime de und i de a emite lumin la o lungime de und mai
mare. Fluorimetrele se folosesc pentru msurtori cantitative pentru compui specifici (msurtori de rutin).
Spectrofluorimetrele folosesc dou monocromatoare, unul pentru lumina excitatoare i unul pentru radiaia de fluorescen emis. Avantajul
spectrofluorimetrelor este faptul c permit variaia controlat a lungimii de
und a radiaiei excitatoare. Astfel, proprietile fluorescente ale probei pot
fi scanate pentru un domeniu larg de lungimi de und ale radiaiei excitatoare (200-1000 nm).
Prile principale ale unui spectrofluorimetru sunt: sursa, monocromator a radiaiei excitatoare, camera probei, monocromator al radiaiei emise,
detector (figura 4). Bineneles, orice spectrofluorimetru modern este interfaat cu un computer cu ajutorul cruia se seteaz parametrii de msurare,
se nregistreaz i se prelucreaz datele. Primul monocromator analizeaz
lungimea de und a radiaiei excitatoare, iar celalalt analizeaz lungimea
de und a radiaiei de fluorescen (emise). Semnalul detectat poate fi reprezentat n funcie de cele dou lungimi de und sau numai n funcie de
una din cele dou lungimi de und. Radiaia emis este colectat la un
164
monocromator
detector
prob
monocromator
Figura 4. Schema bloc pentru un spectrofluorimetru
Sursa unui spectrofluorimetru emite n domeniul UV i vizibil (de obicei se folosesc lmpi cu Xenon). Lumina emis de surs este focalizat pe
fanta de intrare a primului monocromator cu ajutorul unei oglinzi sferice
sau eliptice.
Fanta de intrare este ajustabil continuu (cu ajutorul soft-ului) pentru a
se asigura maximul de rezoluie i reproductibilitate.
Primul monocromator descompune radiaia excitatoare n culorile componente. Prin fanta de ieire a monocromatorului radiaiei excitatoare iese
lumin cu lungimea de und dorit. Astfel radiaia luminoas incident pe
prob poate s aib lungime de und fix pentru tot timpul msurtorii, sau
poate s se modifice continuu pe tot domeniul de emisie al sursei.
Att intensitatea luminoas a radiaiei incidente, ct i lungimea de
und a acesteia este monitorizat i controlat cu ajutorul unui fotodetector
suplimentar situat ntre monocromator i camera probei.
Camera probei este de obicei destul de spaioas, pentru a permite instalarea diferitelor accesorii pentru probe solide, lichide i gazoase, sau
pentru controlarea temperaturii probei.
Lumina emis de prob este focalizat pe fanta de intrare al celui de-al
doilea monocromator. Acesta descompune radiaia de fluorescen emis
de prob n culorile componente. Deoarece radiaia de fluorescen are totdeauna lungime de und mai mare dect radiaia excitatoare, elementul
dispersiv al celui de-al doilea monocromator este astfel conceput nct s
aib maximul de eficien n domeniul vizibil. Detectorul este poziionat la
ieirea din cel de-al doilea monocromator.
165
Toate spectrofluorimetrele moderne sunt controlate de computer. Astfel, prin intermediul computerului se pot seta toi parametri necesari derulrii diferitelor tipuri de msurtori. Datele obinute n urma msurtorilor
efectuate se pot prelucra cu ajutorul programelor speciale.
3. Avantajele spectrofluorimetriei
Senzitivitatea: Limitele de detecie depind n mare msur de proprietile probei de msurat. Pentru multe substane fluorescente este obinuit o
limit de detecie de pri/miliard sau chiar pri/triliard. Aceast extraordinar senzitivitate permite detecia sigur a substanelor fluorescente (clorofil, hidrocarburi aromatice, etc.) folosind probe foarte mici. De asemenea, studiile pot fi efectuate n soluii apoase fr a fi nevoie ca probele s
fie tratate. Spectrofluorimetrele au limite de detecie mult mai bune dect
spectrofotometrele.
Specificitatea: Spectrofotometrele msoar doar lumina absorbit. Tehnicile spectrofotometrice au probleme de interferen deoarece multe materiale absorb lumina, ceea ce face dificil izolarea semnalului de la materialul
de analizat din matricea n care se afl. Spectrofluorometrele au o
specificiate ridicat i apar mult mai puine probleme de interferen deoarece substanele fluorescente pot fi incluse n solveni sau matrici care nu
sunt fluorescente, sau chiar dac au fluorescent este puin probabil ca dou substane s absoarb i s emit radiaie de fluorescen n acelai domeniu.
Domeniu de concentraie: Intensitatea semnalului de fluorescen este direct proporional cu concentraia substanei fuorescente pe un domeniu
larg. Fluorimetria poate fi folosit pe un domeniu mare de concentraii fr
a fi nevoie de diluia eantioanelor sau de modificarea celulei n care se
pune eantionul.
Vitez i simplitate: spectrofluorimetria este o tehnic analitic relativ
simpl. Senzitivitatea i specificitatea mare a acestei tehnici reduce sau chiar elimin procedurile de preparare a probelor.
ruilor, AND-ului, etc. Cu ajutorul fluorescenei se poate identifica prezena unui numr foarte mare de analii chiar dac acetia sunt n cantiti
foarte mici (sub picomolar), fapt ce are deosebite aplicaii n imunologie.
Mediul nconjurtor
Cu ajutorul fluorescenei se poate monitoriza calitatea aerului, a apei i
a solului prin detectarea urmelor de substane organice sau inorganice,
toxine, mutageni sau substane canceroase. Deoarece probele preluate din
mediul nconjurtor sunt deosebit de complexe, pentru detectarea diferitelor substane sunt necesare tehnici de mare senzitivitate i selectivitate care
s evite multiplele surse de interferen. Spectrele de fluorescen 3D pot fi
folosite ca o amprent unic care duce la identificarea calitativ a compuilor. De asemenea msurtorile de fluorescen 3D sunt folosite pentru determinarea surselor geologice a diferitelor eantioane de petrol.
Chimia analitic
n chimia analitic se studiaz spectrele de luminescen precum i eficiena cuantic a speciilor flourescente n funcie de matria n care sunt
puse. Dup ce sunt determinate caracteristicile de baz (excitaie, emisie,
randament cuantic) ale unei substane fluorescente, pot fi elaborate metode
i teste de rutin pentru analizele de laboratoar. Prin determinri de fluorescen pot fi determinate:
- efectul general de solvent
- timpul de via i randamentul cuantic
- momentul de dipol al strii excitate
- efectul prezenei atomilor grei
- efectul temperaturii
- reacia la diferite suprafee
Industria alimentar i agricultura
n industria alimentar este important mbuntirea calitii nutriionale a alimentelor, creterea termenului de garanie precum i a calitii
ambalajelor. Culturile de bacterii ce pot s apar pe alimente sunt distructive i periculoase datorit potenialului de contaminare i mbolnvire pe
care l au. Pentru a asigura calitatea produselor alimentare, productorii
trebuie s identifice contaminani, microorganisme, mucegaiuri, i chiar
pesticide utilizate n mod normal pentru a preveni rspndirea unor boli.
Calitatea ambalajelor este de asemenea important att ca membran protectoare mpotriva oxidrii alimentelor ct i datorit faptului c sunt o
posibil surs de contaminare cu urme de plastic sau de polimeri. Fluores167
168
5. Aparatura disponibil
Spectrofluorimetru Jasco FP 6500
Spectrofluorimetrul Jasco 6500 are urmtoarele caracteristici:
Sursa este o lamp cu xenon de
150 W dotat cu un fotomultiplicator
ce monitorizeaz i compenseaz orice
variaie n intensitate asigurndu-se
astfel maximul de stabilitate.
Cele dou monocromatoare sunt
echipate cu reele de difracie holografice concave (1500 trsturi/mm) cu
unghi de "blaze" optimizat, ceea ce
asigur maxim de senzitivitate pe ntregul domeniu de lungimi de und (200-850 nm).
Spectrofluorimetrul este echipat cu accesorii pentru modificarea controlat a temperaturi probei i pentru polarizarea luminii incidente, precum
i cu suporturi pentru diferite tipuri de probe (solide, lichide i gazoase).
Fantele monocromatoarelor au dimensiuni reglabile, att ca lime ct
i ca nlime.
Alte caracteristici ale spectrofluorimetrului Jasco FP 6500 sunt:
- rezoluia monocromatoarelor este de 1 nm;
- raportul semnal - zgomot este 200:1 sau mai mare;
- viteza de scanare este ntre 20 i 10.000 nm/ min pentru ambele
monocromatoare;
- acurateea lungimii de und este 2 nm pentru ambele monocromatoare.
Calibrarea spectrofluorimetrului se face cu ajutorul kit-ului inclus ce
utilizeaz ca prob standard Rodamina B.
Cu ajutorul spectrofluorimetrului Jasco 6500 pot fi efectuate urmtoarele tipuri de msurtori:
- determinarea concentraiei de substan fluorescent (analiz cantitativ),
- determinarea spectrului de fluorescen a unei probe,
- determinarea stabilitii intensitii de fluorescen n timp,
- msurtori de cinetic,
- msurtori la lungimi de und fix,
- msurtori 3D de fluorescen,
- determinarea spectrului de fosforescen a unei probe,
- determinarea timpului de via n cazul probelor fosforescente.
169
Modul "Spectrum measurement" permite msurarea fluorescenei probelor prin scanare de spectru. Astfel, se pot face spectre pe tot domeniul
sau pe un domeniu selectat de utilizator. Se pot face spectre de excitaie sau
de emisie, la viteze diferite de scanare.
Modul "3D Fluorescence measurements" permite msurarea n acelai
timp a (i) spectrului de fluorescen a unei probe n timp ce se modific
lungimea de und a radiaiei excitatoare i (ii) msurarea spectrului de excitaie n timp ce se modific lungimea de und de emisie. Se obin spectre
tridimensionale (pe o ax este reprezentat intensitatea semnalului de fluorescen i pe celelalte dou axe avem lungimea de und de excitaie, respectiv de emisie.) Analiza acestor spectre permite determinarea poziiei
maximului de excitaie i de emisie, fapt deosebit de util pentru probe necunoscute.
Modul "Time course measurement" permite verificarea stabilitii n
timp a intensitii fluorescenei soluiilor. Se face citirea la o lungime de
und selectabil ntr-un interval de timp selectabil.
Modul "Fixed wavelength measurement" permite efectuarea msurrii
fluorescenei probelor la maxim 4 lungimi de und simultan, selectabile fie
pe excitaie, fie pe emisie.
170
6. Bibliografie
1.
2.
3.
171
Spectrofluorimetria - aplicaii
Conf. dr. Dana Maniu
Cuprins
1. Fluorescena n timp real ..................................................................................... 172
2. Microscopia de fluorescen avansat .................................................................. 174
2.1. Microscopia confocal de fluorescen ........................................................... 175
2.2. Microscopia de fluorescen folosind excitaia cu doi fotoni (two-photon
excitation fluorescence microscopy) ............................................................... 176
2.3. Microscopia de fluorescen prin scanare optic n cmp apropiat (NSOM) ..... 178
3. Exemple de aplicaii ale spectrofluorimetriei ........................................................ 180
3.1. Determinarea interaciunii dintre albumina bovin i nanoparticule
de aur ............................................................................................................ 180
3.2. Evaluarea modificrilor conformaionale induse n albumina bovin
adsorbit la suprafaa nanoparticulelor de aur, n urma modificrilor de temperatur i pH. .............................................................................................. 184
3.3. Monitorizarea denaturrii termice a albuminei bovine la diferite valori ale
pH-ului ......................................................................................................... 187
4. Bibliografie ........................................................................................................... 190
medie de via, iar alte molecule excitate vor emite radiaie de fluorescen
mult timp dup durata medie de via. Timpii de via de fluorescen
sunt, n general, de ordinul 1-10 ns, dei n unele cazuri pot avea ordinul
sutelor de nanosecunde sau s fie mai mici decat 1 ns (sute de
femtosecunde). Din aceast cauz este foarte important ca aparatura experimental folosit pentru acest tip de masurtori s aib rezoluie temporal foarte bun. n figura 1 este prezentat un montaj experimental folosit
pentru determinri de fluorescen n timp real.
O surs laser emite un puls ultra scurt (de ordinul femtosecundelor) cu
lungimea de und 1 corespunztoare frecvenei 1. Armonica a doua a
acestui puls (frecvena 2) este generat ntr-un cristal neliniar, fiind separat
de fundamental cu ajutorul unui divizor de und dicroic. Pulsul de frecven 1 trece printr-un dispozitiv optic ce produce o ntrziere de faz
(optical delay line), iar pulsul de frecven 2 este focalizat pe prob (flow
cell). Emisia de fluorescen incoerent emis de prob este colectat i mixat cu pulsul de frecven 1 ntr-un cristal neliniar. Aceast mixare
("fluorescence up-conversion") genereaz lumin cu frecvena sum = 1 +
fl , ceea ce ne demonstreaz c exist o coinciden temporal i spaial
ntre 1 i fl. Cu ct este mai mare decalajul temporar dintre pulsul 1 i
emisia de fluorescen fl, cu att intensitatea de fluorescen este mai mic.
Intensitatea Isum a pulsului cu frecvena sum pentru un anumit decalaj
temporar ntre pulsul de frecven 1 i emisia de fluorescen de frecven
fl este proporional cu funcia de corelaie dintre intensitatea de fluorescen Ifl i intensitatea I1 a pulsului de frecven 1:
I sum ( ) I fl (t ) I1 (t )dt
173
Figura 1. Set-up experimental pentru fluorescen n timp real (Mialocq and Gustavsson, 2001).
(DM - oglind dicroic; HW - plac semi-und; GG420 - filtru; CCD - camer video; BBO -cristal
neliniar; M - monochromator; PM - fotomultiplicator; lockin - numrtor)
regiune unde fluxul de fotoni este foarte mare, deci trebuie folosii laseri cu
putere mare i funcionare n impulsuri, cum ar fi laserul cu Ti-safir.
Deoarece intensitatea fasciculului de excitare variaz cu ptratul distanei de la planul focal, probabilitatea de absorbie a doi fotoni n afara
regiunii focale scade cu puterea a patra a distanei. Deci, excitarea cu doi
fotoni a fluoroforului poate avea loc doar n focar. Folosind un obiectiv cu o
apertur numeric de 1,25 i un fascicul de excitare avnd 780 nm, peste
80% din intensitatea total de fluorescen va fi emis dintr-o zon situat
la 1 mm n jurul focarului. Volumul de excitaie este de ordinul a 0,1-1
femptolitri. Comparativ cu fluorometrele convenionale, acesta reprezint o
reducere a volumului de excitare de 1010 ori.
Excitarea cu doi fotoni permite obinerea unei rezoluii tridimensional
deosebit n microscopia de fluorescen. Dei efectul secionrii 3-D este
comparabil cu cel din microscopia confocal, n cazul excitrii cu doi fotoni
avem urmtoarele avantaje: (i) deoarece fasciculul de excitare este concentrat att n timp ct i n spaiu nu apare fenomenul de photobleaching n
afara focarului i (ii) fasciculul excitator nu este atenuat de abosorbia din
afara focarului, ceea ce duce la creterea adncimii de penetrare a fasciculului excitator.
Excitarea cu dou culori se folosete atunci cnd se dorete observarea
unor obiecte microscopice situate n medii puternic difuzante. Dei, n ambele tipuri de excitari (cu doi fotoni sau cu dou culori), fenomenul de difuzie duce la scderea intensitii fasciculului de fluorescen emis din focar, n cazul excitarii cu dou culori nu apare dect o cretere minimal a
background-ului de fluorescen, nedorit, ceea ce duce la obinerea unui
contrast mai bun pentru obiecte de mici dimensiuni.
177
Figura 5. Instrument NSOM construit n jurul unui microscop de fluorescenta inversat - mod iluminare.
dintre
albumina
bovin
Din spectrele de fluorescen se pot obine informaii importante (constanta de legtur i numrul siturilor de legtur) referitoare la modul
de legare a proteinelor de suprafaa nanoparticulelor de aur.
Albumina bovin (BSA) conine trei cromofori: triptofan, tirosina i
fenilalanina a cror emisie de fluorescen poate fi stins. n realitate, fluorescena intrinsec a BSA-ului este dat n principal de reziduurile de triptofan, deoarece fenilalanina are un randament cuantic foarte mic, iar fluorescena tirosinei este aproape stins dac este ionizat sau dac este
aproape de un grup amino, carboxyl sau triptofan. Triptofanul este deosebit de senzitiv la modificarea vecintii locale, de aceea studiul emisiei de
fluorescen a acestuia este deosebit de util n determinarea modificrilor
conformaionale ale proteinei i adsorbia la nanoparticule.
Spectrele de fluorescen ale unor soluii avnd diferite concentraii de
nanoparticule de aur i albumin bovin (BSA) au fost monitorizare n domeniul 290-450 nm, regiune ce coincide cu banda de emisie a triptofanului.
Msurtorile de fluorescen au fost efectuate cu o radiaie excitatoare de
280 nm, lungime de und ce este departe de banda plasmonic de rezonan a nanoparticulelor de aur. Soluia apoas de BSA are o band puternic
de fluorescen cu maximul situat la 336 nm, band ce este datorat emisiei
reziduurilor de triptofan, iar nanoparticulele de aur nu prezint emisie de
fluorescen. Dup cum se poate observa n figura 6, Iosin i colaboratorii
[4], au monitorizat stingerea semnalului de fluorescen prin creterea concentraiei nanoparticulelor de aur de form sferic. Pe lang efectul evident
Figura 6. Spectrele de fluorescen ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraii ale
nanosferelor de aur: (a) 0, (b) 0,5510-11 M, (c) 1,110-11 M, (d) 1,6510-11 M, (e) 2,210-11 M;
F0 intensitatea de fluorescen relativ a soluiei apoase de BSA, Fsat intensitatea de fluorescen
relativ a soluiei de BSA saturat cu nanosfere de aur, F concentraii intermediare.
181
Figura 7. Spectrele de fluorescen ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraii de
nanobastonae de aur: (a) 0, (b) 1,0610-14 M, (c) 2,1210-14 M, (d) 3,1810-14 M, (e) 4,2410-14
M; F0 intensitatea de fluorescen relativ a soluiei apoase de BSA, Fsat intensitatea de fluorescen relativ a soluiei de BSA saturat cu nanobastonae de aur, F concentraii intermediare.
Kb
2.34 1011
0.5 105
n
1,37
0,38
183
Figura 8. Spectre de fluorescen ale albuminei bovine la pH 2 (a), pH 5 (b), pH 6 (c) i pH 9 (d).
Figura 9. Spectre de fluorescen ale gruprii triptofan din BSA la pH = 2 pentru diferite concentraii ale nanoparticulelor de aur: (a) 0, (b) 0,551011 M, (c) 1,11011 M, (d) 1,651011 M, (e)
2,21011 M i (f) 2,751011 M. Graficul inserat reprezint curba SternVolmer.
Prin fitare liniar s-a obinut KSV = 1,11109 M1. n mod similar au fost
calculate constantele de stingere SternVolmer pentru pH = 6 i pH = 9,
obinndu-se valorile KSV = 1,7109 M1 pentru pH = 6 i KSV = 1,6109 M1
pentru pH = 9. Astfel, constanta de stingere bimolecular Kq a fost calculat, obinndu-se valorile: Kq = 0,221018 M1 s1 pentru bioconjugatele BSA
GNPs la pH = 2, Kq = 0,341018 M1 s1 la pH = 6, respectiv Kq = 0,321018
M1 s1 la pH = 9. Valoarea obinut pentru constanta de stingere bimolecular Kq este mai mare dect valoarea obinut (2,01010 M1 s1) n cazul
stingerii emisiei de fluorescen a macromoleculelor biologice datorit mecanismului de ciocnire. Deci, n cazul bioconjugatelor BSAGNPs stingerea
emisiei de fluorescen nu este iniiat de ciocniri dinamice ci de formarea
unui complex nefluorescent n urma unui mecanism de stingere static.
Iosin i colaboratorii [5] au determinat constanta de legtur la echilibru Kb (indic echilibrul dintre speciile adsorbante i cele resorbante), precum i numrul siturilor de legtur (n) dintre nanoparticule i BSA conform relaiilor din pargraful anterior. n urma calculelor s-au obinut urmtoarele valori pentru numrul siturilor de legtur (n): 1,77 la pH 2, 1,97 la
186
3.3. Monitorizarea denaturrii termice a albuminei bovine la diferite valori ale pH-ului
Denaturarea termic a proteinelor este un proces intrinsec, deci determinarea condiiilor n care are loc acest proces este foarte important pentru nelegerea stabilitii proteinelor. De fapt, prin creterea temperaturii
forma nativ a proteinei devine mai flexibil. Ca urmare a acestui fapt,
gruprile SH libere, sau regiunile hidrofobice devin predispuse la interaciuni intermoleculare noi. Iosin i colaboratorii [5] au studiat modificrile
structurale ce apar n cazul denaturrii termice a albuminei bovine, nainte
i dup absorbia la suprafaa nanoparticulelor de aur, analiznd emisia de
fluorescen a triptofanuluui din BSA. n acest scop, au fost monitorizate
modificrile emisiei de fluorescen a triptofanului din BSA pentru temperaturi cuprinse ntre 22 C i 85 C (domeniu n care apare o modificare important a structurii teriare a albuminei).
La temperatura camerei, soluia apoas pur de BSA are o emisie de
fluorescen puternic, cerntrat la 337 nm. Odat cu creterea temperaturii, maximul benzii de fluorescen datorat triptofanului se deplaseaz
spre numere de und mai mici, ajungnd pn la 330 nm (figura 10). Graficul inserat (denaturation curve) indic o relaie neliniar ntre deplasarea
maximului benzii de absorbie i temperatur. Dup cum observ i autorii,
curba de denaturare a albuminei bovine pure sugereaz existena a dou
temperaturi de tranziie: una la 43 C, iar cealalt la 65 C. La aceste temperaturi apare o modificare a vecintii triptofanului din albumin, deci creterea temperaturii duce la apariia de modificri structurale ale proteinei.
Platoul curbei de denaturare indic faptul c albumina i menine starea
nativ pn la aproximativ 42 C, prima temperatur de tranziie aprnd n
187
jurul pragului maxim admis al febrei ce apare n condiii de boal (42 C).
ntre 43 C i 65 C se observ o deplasare spre albastru a maximului emisiei de fluorescen a albuminei bovine, deplasare ce sugereaz tranziia albuminei de la starea nativ (compact) la o stare cu o structur mai deschis. Denaturarea complet a proteinei se face dup 65 C, valoare la care
apare un al doilea platou n curba de denaturare.
Figura 10. Dependena de temperatur a emisiei de fluorescen a gruprilor de triptofan din albumina bovin, la pH 6. Inserat: curba de denaturare termic (variaia maximului benzii de fluorescen
n funcie de temperatur - la creterea i descreterea temperaturii).
Figura 11. Variaia maximului emisiei de fluorescen a triptofanului din BSA, respectiv din
bioconjugatul BSA-nanoparticule, n funcie de temperatur pentru diferite valori ale pH-ului.
Figura 12. Curbele SternVolmer pentru stin gerea fluorescenei BSA-ului de ctre nanoparticule de
aur (pH = 6). Inserat: dependena constantei de stingere SternVolmer de temperatur.
189
Graficul Stern-Volmer ce caracterizeaz stingerea emisie de fluorescen a triptofanului din albumina bovin de ctre nanoparticulele de aur, la
pH 6 pentru diferite temperaturi (295, 318, 338, 358 K) ne indic faptul c
constanta de stingere KSV scade odat cu creterea temperaturii (figura 12).
Tabelul 2. Constanta de stingere KSV i parametrii termodinamici pentru
complexul BSA-nanoparticule de aur.
(SD - deviaia standard pentru valorile coeficientului KSV, R - coeficientul de corelaie)
pH
6
T (K)
295
318
338
295
318
338
KSV (L/mol)
1,70x109
1,41x109
9,60x109
1,11x109
6,88x109
5,05x109
SD
0,0651
0,0782
0,0683
0,0601
0,0721
0,0700
R
0,9994
0,9988
0,9980
0,9983
0,9982
0,9975
Proporionalitatea invers dintre constanta de stingere KSV i temperatur (tabelul 2), confirm faptul c mecanismul de stingere a fluorescenei
triptofanului din albumina bovin de ctre nanoparticulele de aur este iniiat de formarea unui complex ne-fluorescent prin adiia moleculelor de
albumin bovin la nanoparticulele de aur.
4. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
190
Cuprins
1. Principiul metodei............................................................................................................... 191
2. Infrastructura existent la UBB Cluj pentru exprimente RMN-S ..................................... 196
3. Tehnici experimentale de baz pentru aplicaii RMN-S n sisteme moleculare organice ....... 202
4. Bibliografie .......................................................................................................................... 215
1. Principiul metodei
Generarea semnalului RMN
Spectroscopia RMN se bazeaz pe fenomenul de rezonan magnetic
aplicat asupra momentelor magnetice nucleare i = iS, unde S este numrul cuantic de spin, iar i reprezint factorul giromagnetic, asociate speciei
nucleare i. Plasarea probei care conine momente magnetice nucleare
ntr-un camp magnetic extern intens, B0 ~ 7-23 T (generat cu ajutorul unei
bobine supraconductoare), are dou efecte majore: (i) axa polarizrii de
spin efectueaz o micare de precesie cu frecventa Larmor, 0,i = - iB0, n
jurul direciei cmpului magnetic static (direcia z), i (ii) polarizrile spinilor, distribuite izotrop n momentul aplicrii lui B0, se vor reorienta sub
aciunea cmpurilor magnetice locale fluctuante uor datorit micrii termice, astfel nct dup o perioad de ordinul aa numitului timp de relaxare
longitudinal, T1, proba va fi caracterizat de o magnetizare macroscopic
orientat de-a lungul direciei cmpului magnetic extern. Principalele proprieti ale ctorva nuclee active RMN, cu relevan n special pentru sisteme moleculare organice, sunt prezentate n tabelul de mai jos:
191
Abundena
natural [%]
0,i [MHz]
B0 = 11.7 T
B0 = 21 T
1/2
[ 107 rad
s-1T-1]
26.8
99.98
500
900
4.1
0.02
76.5
137.7
1/2
6.7
1.1
125
225
14N
1.9
99.6
35.5
63.9
15N
1/2
-2.7
0.37
50
90
Specia
nuclear, i
1H
2H
13C
Figura 1
192
transversal va precesa liber n jurul lui B0. Aceast micare induce un curent
electric oscilant pe bobina de detecie (aceeai cu bobina de transmisie) ce
poart numele de semnal RMN, sau FID (free-induction decay). FID-ul este nregistrat n intervalul de timp t2, numit timp de achiziie, pe durata cruia se
produce defazarea polarizrii transversale, astfel nct amplitudinea lui se
apropie de zero. Dup o perioad de aproximativ t0 ~ 5T1 polarizarea de spin
se reconstruiete de-a lungul direciei z i experimentul poate fi repetat. Descrierea de mai sus se refer la aa-numitul experiment RMN de un puls, i
este ilustrat schematic n Fig. 1.
Detecia semnalului RMN
Aplicnd transformata Fourier asupra FID-ului se obine reprezentarea
acestuia n domeniul de frecven, adic spectrul RMN. Att semnalul n
domeniul temporal, ct i cel n domeniul de frecven, conin o parte real
i una imaginar, corespunztor modului de detecie n cuadratur. Cu ajutorul experimentului din Fig. 1 se obine un spectru RMN 1D (unidimensional) ale crui proprieti (poziii, forme i intensiti de linie) depind n mod esenial de interaciunile la care sunt supui spinii nucleari pe
durata t2. Considernd doar interaciunea cu cmpul static extern, B0, spectrul asociat speciei nucleare i ar conine o singur linie la poziia frecvenei
Larmor asociate, 0,i, iar coninutul lui de informaii ar fi extrem de srac. n
realitate, prezena aa-numitor interaciuni de spin interne conduce la valori
ale cmpului magnetic local la poziiile diferitor spini i uor diferite de B0,
i deci implicit la apariia mai multor linii n spectrul RMN 1D. Parametrii
spectrali, de exemplu deplasrile (fa de 0,i), despicrile i/sau lrgirile
liniilor individuale sunt n direct conexiune cu elemente de structur chimic/spaial bine determinate, i constituie astfel baza multiplelor aplicaii ale spectroscopiei RMN n (bio)chimie, tiina materialelor, etc. Frecvenele asociate interaciunilor de spin interne sunt mult mai mici dect frecvenele Larmor, ceea ce face ca pentru fiecare specie nuclear i, s existe o
fereastr spectral de lrgime limitat, i << 0,i, n jurul lui 0,i care conine
ntregul spectru RMN-1D al speciei nucleare respective. n acest context,
soluia practic utilizat n spectroscopia RMN modern corespunde
aa-numitului mod de lucru pe canale rf distincte, adic nregistrarea de
spectre RMN distincte pentru fiecare specie nuclear n parte, precum este
cel ilustrat n Fig. 2 n cazul nucleelor 13C:
193
Figura 2
Noiunile introductive vor fi completate n final cu cteva precizri utile, menite s asigure legtura ntre baza conceptual-teoretic prezentat
mai sus i elementele concrete cu caracter aplicativ, privind implementarea
lor concret n practica curent:
Un spectrometru RMN este caracterizat n mod tradiional prin valoarea frecvenei Larmor a spinilor 1H n cmpul magnetic al acestuia (de exemplu un spectrometru cu un criomagnet care produce un
cmp B0 = 11.7 T va fi denumit spectrometru de 500 MHz)
Pentru a obine un spectru RMN de calitate (cu raport semnal/zgomot
ct mai mic) este n general nevoie de nregistrarea unui numr N de
FID-uri, cu un timp de repetiie determinat de valoarea lui t0 (conform
Fig. 1), care vor fi adunate pentru a genera semnalul RMN final. Valoarea optim a lui N (denumit numr de scanuri n terminologia de specialitate) depinde pentru fiecare specie nuclear de sensibilitatea asociat. Aceasta din urm este dat n principal de cantitatea de prob,
cmpul magnetic static, factorul giromagnetic, abundena izotopic i
numrul de poziii chimice distincte n sistemul studiat. Pentru exemplificare, spectrul RMN-S 13C a unui compus n faza policristalin cu
izotopul 13C n abunden natural i cu un numr de pn la 10 poziii
chimice distincte a carbonilor din molecul necesit acumularea unui
numr de ordinul miilor de scanuri pentru a obine un raport semnal/zgomot acceptabil (> 30), n timp ce pentru un spectru 1H de calitate este suficient nregistrarea unui singur scan.
Poziiile liniilor ntr-un spectru RMN sunt date fie n uniti absolute de frecven (Hz), ca i deplasare fa de o linie de referin caracteristic fiecrei specii nucleare, fie n uniti relative numite pri
pe milion (ppm) care reprezint raportul dintre aceast deplasare
fa de frecvena de referin i frecvena Larmor a speciei respective. Cel de-al doilea mod este de obicei preferat pentru c poziiile
liniilor ntr-un compus dat vor fi aceleai indiferent de valoarea
cmpului magnetic .
Un puls rf se caracterizeaz prin trei parametri distinci: (i) unghiul
de rotire a magnetizrii fa de direcia z aa-numitul unghi de
tilt (de exemplu = /2, , etc.); (ii) faza pulsului, care reprezint
unghiul pe care l face B1 fa de axa Ox; i (iii) frecvena de offset,
i = rf - 0,i, n cazul n care rf nu este exact n rezonan cu frecvena de precesie Larmor a speciei nucleare i.
Fiecare specie nuclear distinct este caracterizat de o aa-numit
fereastr spectral de lrgime limitat n interiorul creia se plaseaz toate liniile RMN posibile: de exemplu lrgimile tipice ale acestei
195
Spectrometrele Bruker DRX 400 i Bruker DRX 600 sunt complet digitale iar
controlul acestora se face n totalitate prin intermediul unui calculator de tip
PC. Ambele sisteme pot analiza att probe n stare condensat ct i probe n
stare lichid. Pentru studiul probelor solide exist n dotare mai multe capete
de sond care permit efectuarea experimentelor la temperaturi ntre -80 C i
200 C, iar rotirea mecanic a probei se poate face la o frecven de rotatie de
pn la 35 kHz. Pot fi efectuate msurtori spectroscopice de rezonan magnetic nuclear pe o gam foarte larg de nuclee: 1H, 13C, 15N, 57Fe, 27Al, 69Ga etc.
197
n imaginea de mai sus se poate observa rotorul i instrumentaia specific, necesar introducerii i tasrii substanei de msurat precum i scoaterii acesteia din rotor.
Descrierea componentelor software
Pentru comanda modulelor electronice ale unui spectrometru RMN
exist pachete software specializate prin intermediul crora elementele distincte ale unui experiment RMN sunt transpuse n comenzi specifice. n
cazul spectrometrelor Bruker, soft-ul de comand se numete XWin NMR
(pn la generaia Avance II), i respectiv TopSpin, ncepnd cu generaia de
spectrometre Avance III. Corespunztor echipamentelor existente la UBB
Cluj, primul este instalat pe spectrometrul Bruker DRX 400, iar programul
TopSpin comand spectrometrul Bruker DRX 600. Cele dou versiuni ale
soft-ului de comand Bruker difer prin interfaa grafic i prin numrul
198
200
Liniile care ncep cu ; reprezint linii de comentarii: ele sunt necesare (n special n cazul experimentelor multi-puls mai complexe) pentru a explicita semnificaia parametrilor inclui n programul de
pulsuri asociat.
Dup cum s-a precizat mai sus, valorile numerice ale parametrilor
inclui n programul de pulsuri sunt specificate n tabela de achiziie.
n afar de acetia, tabela de achiziie va mai conine n mod obligatoriu i ali parametri caracteristici experimentelor RMN, care ofer
informaii cu privire la: tipul de experiment (1D, 2D, etc.); numele
programului de pulsuri utilizat n experimentul considerat
(pulprog); tipul nucleului asociat cu canalele rf utilizate n experimentul dat ( f1, f2, etc.); numrul de scanuri (ns) numrul de semnale RMN achiziionate direct i adunate ntre ele n scopul reducerii nivelului de zgomot la un nivel acceptabil; dewll time (dw) durata de eantionare a semnaluilui RMN digitizat, adic durata ntre
dou puncte consecutive; tipul de achiziie direct (qsim n cuadratur, colectnd simultan puncte n partea real i imaginar a semnalului RMN, qseq n cuadratur, dar colectnd altenativ puncte n
partea real i imaginar a semnalului RMN, etc.); domeniul temporal (td) numrul de puncte achiziionate, exprimate de obicei n
multiplii de 16; frecvenele de offset pe canalele pe care se lucreaz
(o1, pe canalul f1, o2, pe canalul f2, etc.) se exprim n Hz sau ppm,
i reprezint devierea (cu + sau -) fa de frecvena de baz pe canalul respectiv (sf1, sf2, etc. : pentru fiecare nucleu aceasta este fixat n
momentul configurrii spectrometrului). Acetia sunt parametri cei
mai importani n cadrul unui experiment RMN tipic, ns reprezint doar o mic parte din numrul total de parametri posibili (ci
anume dintre acetia sunt utilizai efectiv ntr-un experiment dat
depinde de complexitatea lui). Pentru o descriere detaliat, se recomand consultarea manualelor Bruker.
Dup achiziionarea semnalului RMN, acesta trebuie supus transformrii Fourier pentru a genera spectrul RMN. Parametri specifici
acestui proces sunt inclui n aa numita tabel de procesare, iar tipul
i numrul acestor parametri depinde de complexitatea experimentului avut n vedere. Pentru detalii, de asemenea, se recomand
consultarea manualelor Bruker.
201
# 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/zg"
;1D sequence
# 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/Avance.incl" 1
;Avance2.incl
1 ze
2us pl1:f1
2 d1
p1:f1 ph1
go=2 ph31
wr #0
exit
ph1=0 2 2 0 1 3 3 1
ph31=0 2 2 0 1 3 3 1
;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default)
;p1 : f1 channel - high power pulse
;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1
care se observ cu usurin pierderea complet a rezoluiei prin suprapunerea sever a liniilor RMN.
(Magic Angle Spinnining) n cadrul creia proba este rotit n jurul unei axe
nclinate la un unghi, numit unghiul magic, n raport cu direcia cmpului magnetic static. Aceast metod, ilustrat schematic n Fig. 4, mediaz
efectul anizotropiei interaciunilor de spin prin faptul c rotaia mecanic a
probei determin oscilaia n timp a termenilor anizotropi i prin aceasta
micoreaz efectul lor de lrgire asupra liniilor RMN.
Figura 4
Majoritatea metodelor RMN-S moderne de nalt rezoluie sunt aplicate n condiii de rotaie a probei n jurul unghiului magic. Conform descrierii teoretice de mai sus, mecanismul de ngustare prin MAS a liniilor RMN
n solide se bazeaz pe manipularea prii spaiale a hamiltonianului de
interaciune: termenii anizotropi ai acestuia n proba rotit se descompun
ntr-o component static, care devine zero cnd axa de rotaie este nclinat la unghiul magic n raport cu direcia cmpului magnetic static, i dou
componente dependente de timp ce corespund unei modulri periodice cu
frecvenele R, i respectiv 2R. Dup cum se va prezenta n continuare,
efectul termenilor modulai devine din ce n ce mai mic cu creterea
frecventei de rotaie a probei: n perioada scurs de la introducerea metodei MAS i pn n prezent tehnologia n domeniu a avansat extrem de
mult, permind rotaii de pn la 70 kHz ale probei n jurul unghiului magic. De asemenea, trebuie menionat c, n funcie de forma explicit a
hamiltonienilor asociai acestor interaciuni, efectul lor asupra dinamicii de
spin, i implicit asupra lrgirii liniilor RMN, va fi diferit. Din acest punct de
vedere, se pot evidenia dou cazuri distincte: (i) interaciuni neomogene
(deplasarea chimic i interaciunea dipolar heteronuclear pentru care
[ H (t1 ), H (t2 )] = 0, t1 , t2 i (ii) interaciuni omogene (interaciunea dipola204
r
homonuclear
n
[ H (t1 ), H (t2 )] 0, t1 , t2 .
sisteme
multi-spin)
pentru
care
Figura 5 Spectele 1H RMN-MAS ale adamantanului (a), respectiv ale policarbonatului (b), pentru
frecvene de rotatie n intervalul 0 35 kHz
Figura 6
n clasa metodelor de decuplare homonucler, pe lng mai sus amintita metod DUMBO, mai pot fi enumerate i FSLG, PMLG, precum i RNn i SAM
(Smooth Amplitude Modulation), ultimele dou metode fiind aplicate n timpul perioadei de evoluie indirect a experimentelor de tip bidimensional.
n cazul sistemelor de spini cu factor giromagnetic mic (de exemplu 13C
sau 15N) n abunden natural (adic separai prin distane mari) cuplajele
dipolare devin neglijabile, astfel nct interaciunea dominant din sistem rmne ecranarea chimic (cu componentele ei izotropa, respectiv anizotropa).
206
Figura 8
Figura 9
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-const"
;cp (TopSpin 2.0)
;basic cp experiment
1 ze
2 d1 do:f2
210
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u pl12:f2
;go=2 ph31 cw:f2
go=2 ph31 cpd2:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
exit
ph3= 1 3
ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph2= 0
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
n final, pentru o ajustare mai fin a pulsului iniial de 900 pe canalul protonului se revine la primul pas, prin modificarea uoar a puterii pl3 n jurul valorii fixate iniial, i se reine acea valoare pentru
care intensitatea spectral atinge un maxim absolut. Aceast etap
este necesar deoarece valorile cmpului rf pe canalul 1H n general
sunt determinate cu un grad de eroare mai mare prin experimentul
de un puls dect cu ajutorul experimentului CP/MAS.
4.Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
215
1. Introducere
n acest raport se vor prezenta n mod detaliat o serie de experimente
RMN-S avansate, cu aplicaii n investigarea structurii sistemelor moleculare
organice cristaline, metode ce au fost pn n prezent implementate i testate
experimental pe infrastructura existent la UBB Cluj. Accentul va fi pus pe experimente RMN-S de dubl rezonan pe 13C. Vor fi ilustrate de asemenea tehnici bazate pe detecia 1H, ns doar n cazul acelor compui unde se obine o
rezoluie spectral satisfctoare n condiiile tehnice date. Drept urmare, nu
vor putea fi prezentate o serie de metode RMN-S intensiv utilizate n domeniu,
de exemplu cele care implic lucrul simultan pe trei canale rf [1] (metode de
tripl rezonan), sau metode de nalt rezoluie pe 1H, care necesit o electronic adaptat secvenelor de decuplare homonuclear [2] i/sau capuri de prob
de tip ultra-fast MAS, care s permit rotaii ale probei pn la 70 kHz. Deoarece acestea sunt considerate ca fcnd parte din arsenalul de baz al metodologiei moderne RMN-S pe sisteme moleculare organice, recomandm studenilor aprofundarea lor cel puin la nivel teoretic (consultnd bibliografia
indicat mai sus), chiar dac nu pot fi utilizate n practic la UBB Cluj.
Introducerea metodelor se va face progresiv, n ordinea creterii complexitii lor: se vor descriere mai nti experimente care necesit nregistrarea de seturi de date bidimensionale (2D), dar care nu necesit transformarea lor n spectre 2D, i vom ajunge n final la prezentarea de metode care
216
n prima perioad, cea de preparare, se aplic unul sau mai multe pulsuri rf, n urma crora se genereaz o mrime fizic asociat sistemului de
spini (de ex. polarizare transversal, coerente de mai multe cuante, etc.)
care va evolua pe durata t1. Urmtoarea perioad perioada de mixing,
const n aplicarea celui de-al doilea puls (sau pulsuri) de radiofrecven.
Secvena de mixing are rolul cel mai important ntr-un experiment 2D, deoarece ea definete corelaiile care se stabilesc ntre mrimile care evolueaz
n t1 i polarizarea transversal asociat fiecrui spin care se detecteaz n
mod direct, prin intermediul semnalul RMN, pe durata lui t2. Aceast succesiune de perioade poart denumirea de secven de pulsuri 2D, iar informaia care se regsete n spectrul RMN depinde concret de tipul interaciunii care a fost selectat n perioadele de preparare i de mixing.
Un spectru RMN 2D se obine n urmtorul mod: se aplic secvena de
pulsuri pentru t1 = 0, se nregistreaz i se stocheaz FID-ul corespunztor
acestei valori. Apoi se repet aceeai procedur pentru t1 egal cu multiplii
ntregi ai perioadei de sampling t1 (adica t1, 2t1, 3t1nt1, unde n este
de obicei cuprins ntre cteva zeci i cteva sute). n consecin, semnalul
RMN bidimensional const dintr-un set de n FID-uri, i va depinde explicit
de ambele variabile temporale, t1 i t2.
217
Modul de apariie a peak-urilor n spectre RMN bidimensionale i interpretarea acestora vor fi descrise pe scurt n cele ce urmeaz. Astfel, dac
ntr-un spectru 2D va aprea un peak poziionat la A n dimensiunea F1 i la
B n dimensiunea F2 (aa numitele cross-peakuri), atunci pe durata perioadei
de preparare s-a format un semnal care a evoluat cu frecvena A de-a lungul
lui t1, iar pe durata perioadei de mixing acelai semnal a fost transformat cu
ajutorul unei anumite secvene de pulsuri ntr-un alt semnal care evolueaz
cu frecvena B pe durata t2. Un alt tip de peak-uri care se pot obine ntr-un
spectru RMN 2D, numite peak-uri diagonale, corespund cazului n care frecvena de rezonan a unui semnal generat n timpul perioadei de preparare
va rmne neafectat de pulsul (sau pulsurile) care alctuiete perioada de
mixing. Multe dintre tehnicile RMN 2D utilizate n mod curent, genereaz
spectre care conin ambele tipuri de peak-uri, de exemplu Fig. 2(c).
n practic, n funcie de succesiunea de pulsuri aleas, se pot obine dou tipuri distincte de spectre RMN 2D: de separare, i respectiv de corelare [3].
n cazul spectrelor bidimensionale de separare, n dimensiunea F2 se obine spectrul izotrop al compusului studiat, iar n dimensiunea indirect, F1, se obine
spectrul anizotrop al interaciunii recuplate, separat, pentru fiecare linie izotrop. Conform schemei generale a unui experiment 2D, ilustrat n Fig. 1, o
secven de pulsuri specific spectroscopiei RMN 2D de separare corespunde cazului particular n care domeniul temporal indirect, t1, i perioada de
mixing coincid. Spre deosebire de spectrele RMN 2D de separare, n cazul
spectrelor de corelare ambele dimensiuni codific deplasrile chimice izotrope, iar interaciunea recuplat va genera peakuri de corelatie (cross-peakuri) ntre nucleele diferitelor grupri chimice dintr-un anumit compus. n funcie
de tipul de experiment RMN de corelare utilizat, vor exista diferene n ceea
ce privete (i) mrimea fizic asociat sistemului de spini (de exemplu coerente de una sau mai multe cuante), care va evolua n dimensiunea indirect
F1, i (ii) interaciunea de spin recuplat pe durata perioadei de mixing. De
218
219
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-var"
;cp (TopSpin 2.0)
;basic cp experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(vp ph1):f1 (vp ph2):f2
1u pl12:f2
;go=2 ph31 cw:f2
go=2 ph31 cpd2:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m ivp
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 3
ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph2= 0
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
setul de date 2D. Acesta este format din N spectre 13C CP-MAS, aezate n
ordinea cresctoare a duratei pulsurilor de contact p15 utilizate. Pentru
fiecare dintre liniile RMN din spectru, se reprezint grafic evoluia intensitii de linie n funcie de durata lui p15, obinndu-se n final aa-numitele
curbe CP-MAS; proprietile caracteristice ale unei asemenea curbe descriu,
pentru fiecare poziie chimic distinct a atomilor de carbon din sistemul
molecular investigat, dinamica procesului de transfer de polarizare de la
protonii nvecinai (n principiu, contribuii nsemnate vor avea cei situai
pn la o distan de 2.5-3 ).
n practic, innd cont de caracteristicile procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C, pentru durate ale pulsului de contact p15 cuprinse n
intervalul 0 200 s e preferabil utilizarea unei eantionri n pai egali
(de exemplul, 5 10 s), deoarece n interiorul acestui domeniu temporal
caracterul coerent al procesului de transfer este dominant, i se manifest
prin apariia aa-numitelor oscilaii dipolare n curbele CP-MAS corespunztoare. Peste aceast valoare a lui p15 se pot utiliza creteri cu pai din ce
n ce mai mari, astfel nct numrul de N de repetiii ale experimentului,
care coincide cu numrul de puncte ce definesc curbele CP-MAS nregistrate, s fie meninut la o valoare rezonabil, 30-50. Pentru a putea caracteriza
i parametrii relaxrii spin-reea n sistemul rotitor, care afecteaz dinamica
procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C la durate de ordinul milisecundelor, se recomand de asemenea nregistrarea curbei pn la valori ale
pulsului de contact de 3 5 ms.
n Fig. 4 este prezentat un set de date bidimensional nregistrat utiliznd
tehnica descris mai sus n cazul particular al L-Alaninei. Transformata Fourier s-a aplicat doar n dimensiunea direct, obinndu-se spectrul izotrop al
compusului, cu cele trei linii de rezonan caracteristice gruprilor CH, CH3,
respectiv COOH. Considernd variaia intensitilor de linie cu poziia spectrului CP-MAS din setul de date 2D, n dimensiunea indirect se obin curbele de transfer de polarizare (CP) corespunztoare fiecrei grupri chimice:
forma specific a fiecrei dintre aceste curbe reflect tria cuplajelor dipolare
heteronucleare recuplate. Astfel, cu ct rata de cretere a unei astfel de curbe
CP este mai mare i oscilaiile dipolare mai pronunate (vezi curba CP corespunztoare gruprii CH comparativ cu cele pentru CH3, respectiv COOH),
cu att cuplajul dipolar heteronuclear asociat este mai puternic. Dac transformata Fourier se aplic i de-a lungul lui t1, n locul curbelor CP se vor obine aa-numitele spectre dipolare: cele dou modaliti de a extrage informaii
despre parametrii interaciunii dipolare sunt ns echivalente. Procedura
descris mai sus face parte dintr-o clas mai larg de metode RMN-S numite
221
Figura 4: Set de date 2D obinut n cazul compusului L-alanina. n dimensiunea direct se aplic
transformata Fourier i se obin liniile de rezonan ale gruprilor chimice din compus, iar n dimensiunea indirect sunt ilustrate curbele CP corespunztoare acestor grupri. Aceste curbe au fost
nregistrate dup ce n prealabil puterile pe cele dou canale rf au fost calibrate la condiia n = -1 de
matching Hartmann-Hahn.
stri iniiale diferit de polarizarea uniform 1H, cum este cazul experimentului CP-MAS clasic. Noua stare iniial const ntr-o distribuie neuniform
a polarizrii protonilor, care poate fi creat cu ajutorul configuraiei experimentale format din cele dou blocuri CP ale secvenei CPPI de durate
bine determinate, p15 i p16, iar faza celui de-al doilea bloc este inversat n
raport cu faza primului.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/rem_prot_cp"
;cp (TopSpin 2.0)
;remote protons CP-MAS experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
(p16 ph1):f1 (p16 ph6):f2
(vp ph1):f1 (vp ph8):f2
1u pl12:f2
;go=2 ph31 cw:f2
go=2 ph31 cpd2:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m ivp
223
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 3
ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph2= 0
ph4= 2
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
Figura 6: Simulri ale dependenei polarizrii de spin de timpul de inversie 2 din secvena de pulsuri CPPI pentru R = 5; 8 respectiv 15 kHz, n cazul gruprii CH din L-Alanina. Prin linie continu sunt reprezentate curbele de inversie ale polarizrii pentru spinul 13C (cu negru), respectiv a
protonului legat chimic de acesta (cu rou). Cu linie punctat este reprezentat polarizarea remanent
pe protonii ndeprtai, care aparin gruprii CH3 (albastru), respectiv NH3 (verde) din sistemul de
spini considerat.
224
din Fig. 6 arat c polarizrile din cadrul gruprii CH (adic nucleului 13C
i a protonul sau direct ataat) pot fi aduse simultan la zero pentru frecvene de rotaie a probei mai mari dect 5 kHz, iar valoarea efectiv a duratei
pulsului p17 pentru care aceast condiie este ndeplinit depinde n mod
explicit de valoarea frecvenei de rotaie: de exemplu pentru R = 8 kHz se
obine un puls de contact p17 cu o durat de 42 s.
n msura n care starea iniial dorit poate fi generat cu ajutorul secvenei CPPI, curbele de transfer de polarizare nregistrate experimental
prin incrementarea duratei celui de-al treilea bloc CP din Fig. 5 se consider
ca reflect doar contribuia protonilor ndeprtai. Pentru a verifica acest
lucru, prediciile teoretice referitoare la procesul de transfer de polarizare
de la protonii ndeprtai realizat prin noua metod Remote Protons
CP-MAS, au fost testate experimental [6]. n acest scop, am extins configuraia utilizat n simulri numerice la un sistem de 10 spini (9 protoni i un
nucleu 13C) din L-Alanina, iar curbele CP simulate au fost comparate cu
cele experimentale. Molecula de L-Alanina a fost ales deoarece poziiile
protonilor, i implicit distanele H-H i C-H, sunt determinate precis, prin
difracie de neutroni (cu precizie de 0.003 ). Simulrile numerice au fost
efectuate considernd dou cazuri distincte i anume: n primul caz se consider gruparea NH3 ca fiind rigid, iar n cel de-al doilea caz aceeai grupare se consider n regim de rotaie rapid n jurul axei sale. n ambele
situaii gruparea CH3 este considerat a efectua o micare de rotaie rapid.
Prin compararea curbelor CP-MAS simulate cu cele experimentale (Fig. 7)
225
226
diferenial, care va fi transferat ntre spinii 13C ntre care exist cuplaje dipolare suficient de puternice. Din aceast cauz, n afar de peakurile diagonale, n spectrul RMN 2D obinut prin metoda PDSD apar i cross-peakuri de
corelaie ntre oricare dou poziii chimice distincte ntre care se stabilete
transfer de polarizare (spin diffusion), cu intensiti care depind de distana
la care se afl nucleele 13C corespunztoare.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/sp-diff"
;cp (TopSpin 2.0)
;13C-13C spin diffusion experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u cpd2:f2
1u pl12:f2
d0 pl4:f1
1u do:f2
(p1 ph4):f1
d5
(p1 ph5):f1
1u pl12:f1
go=2 ph31 cpd2:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
; tau mix
;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse
ph3= 1 3
ph1= (4) 0 0 2 2
ph2= 0
ph4= 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2
ph5= 1 1 1 1 3 3 3 3
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
Figura 9: Spectru 13C CP-MAS pe L-Tirozina HCl, i o reprezentare schematica a atribuirii liniilor
pentru cele 7 poziii chimice distincte ale carbonilor din molecula
228
n final vom ilustra utilizarea metodei PDSD cu rezultatele experimentale obinute n cazul particular al compusului L-Tirozina HCl, marcat
uniform cu 13C. Mai nti prezentm n Fig. 9 spectrul 13C RMN-S 1D obinut prin CP-MAS la o frecven de rotaie a probei de 10 kHz. Atribuirea
liniilor spectrale corespunde indexrii poziiilor de carbon din reprezentarea schematic a moleculei de L-Tirozina inclus n aceeai figur. Am ales
acest caz particular pentru c ne permite comportaii n cadrul unor domenii de distane internucleare 13C-13C scurte (1.5 ntre carboni direct legai chimic), medii (3-4 , de exemplu ntre carbonii alifatici i cei de pe
inelul benzenic), i respectiv lungi (4-5.5 , ntre C1 i C7 sau C8).
Posibilitatea de a estima astfel de distante C-C din spectre PDSD de corelaie 13C-13C este ilustrat n continuare prin exemplele prezentate n Fig.
10. Primul corespunde unei durate de mixing scurte, de 300 s, i evideniaz faptul c la aceast scal de timp transferul de polarizare este eficient
doar pe distane scurte, ntre carbonii direct legai chimic. Utilitatea practic a unui asemenea spectru este evident, respectiv identificarea conectivitilor chimice n cazul unui compus nou, i pe aceast cale este un instrument extrem de util n procesul de atribuire spectral.
Figura 10: Spectre RMN 2D de corelaie 13C-13C obinute pe L-Tirozina aplicnd metoda PDSD;
ele ilustreaz dinamica procesului de transfer de polarizare la durate de mixing scurte (300 s), i
respectiv lungi (5 ms)
Cel de-al doilea spectru PDSD ilustrat n Fig. 10 corespunde unei perioade
de mixing mult mai mari, de 5 ms, i este reprezentativ pentru situaia n
care transferul de polarizare se reduce pe distane mult mai mari, pn la 5
, dup cum se poate observa din prezena peakului de corelaie C1-C7.
Astfel de spectre sunt utile pentru a extrage constrngeri structurale utile
pentru investigarea conformaiei moleculare n sistemul investigat.
229
Metoda CHHC
Metoda CHHC pe care o vom discuta n continuare permite determinarea distanelor 1H-1H, cu rezoluie nalt datorit implementrii n cadrul
spectroscopiei RMN-S 2D de corelaie 13C-13C. Metoda este demonstrat
efectiv pe L-TirozinaHCl sintetizat sub form poli-cristalin i marcat
uniform cu 13C. L-TirozinaHCl a fost aleas drept sistem model deoarece
spectrul 13C RMN-S 1D prezint o rezoluie suficient de bun pentru a putea separa liniile corespunztoare tuturor gruprilor chimice din molecula
(Fig. 9), iar structura sa cristalin este bine caracterizat.
n Fig. 11 este ilustrat secvena de pulsuri asociat metodei CHHC.
Experimentul ncepe cu prepararea unei stri iniiale prin transfer de polarizare prin CP de la 1H la 13C. Polarizarea transversal astfel creat evolueaz sub influena deplasrilor chimice izotrope al carbonilor pe durata perioadei de evoluie indirect, t1, n condiii de decuplare heteronuclear prin
TPPM pe canalul 1H. Polarizarea 13C care a evoluat cu deplasrile chimice
izotrope corespunztoare fiecrei poziii distincte din molecul este apoi
transferat prin intermediul unei perioade scurte (65 s) de cross-polarizare
(CP) a protonilor direct conectai chimic. Polarizarea transversal astfel
obinut este apoi adus de-a lungul direciei z (este transformat n polarizare longitudinal) prin aplicarea unui puls /2 asupra spinilor 1H. Deoarece polarizrile 1H astfel obinute nu au aceeai valoare la toi protonii, pe
durata perioadei de mixing, tmix, se va realiza o redistribuire a acestora prin
intermediul aa-numitului proces de schimb de magnetizare, i se genereaz astfel cross-peakuri a cror intensitate este proporional cu cantitatea de
Figura 11: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D CHHC de investigare a transferului de polarizare 1H-1H codificat n spectre de corelaie 2D 13C-13C
230
polarizare schimbat de protonii corelai. Deoarece schimbul de magnetizare se datoreaz interaciunilor dipolare 1H-1H, intensitatea fiecrui
cross-peak obinut codific informaii cu privire la tria cuplajului dipolar
dintre protonii implicai si, implicit, cu privire la distanele internucleare
dintre acetia.
Dup parcurgerea etapei de mixing urmeaz transformarea polarizrii
longitudinale n polarizare 1H transversal (prin aplicarea a inc unui puls
/2 pe canalul 1H), iar aceasta apoi transferat ctre nucleele 13C direct conectai chimic (prin intermediul unei perioade scurte de CP, similar celei
prin care s-a realizat transferul 13C->1H iniial). n final, polarizarea transversal 13C este detectat sub form de semnal RMN pe durata perioadei
de evoluie direct, t2. Detecia semnalului se face de asemenea n condiii
de nalt rezoluie, adic se urmrete evoluia polarizrii transversale 13C
sub aciunea deplasrilor chimice izotrope asociate carbonilor din prob, n
condiii de decuplare heteronuclear prin TPPM.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chhc"
;cp (TopSpin 2.0)
;13C-13C spin diffusion experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u cpd2:f2
1u pl12:f2
d0
1u do:f2
1u pl2:f2
(p16 ph5):f1 (p16 ph4):f2
1u pl3:f2
p3:f2 ph8
d5
p3:f2 ph9
1u pl2:f2
(p16 ph7):f1 (p16 ph6):f2
1u pl12:f1
go=2 ph31 cpd2:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
; tau mix
231
lo to 2 times td1
exit
ph3= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph1= (4) 1
ph2= 3 3 3 3 0 0 0 0
ph4= 3 1
ph5= 1
ph6= 1
ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0
ph8= 0
ph9= 2
ph31= 3 1 3 1 0 2 0 2
Un spectru CHHC tipic este ilustrat n Fig. 12, unde este considerat cazul
particular al spectrului 2D de corelaie 13C-13C nregistrat la o valoare tmix de 50
s, utiliznd o fereastr spectral care se limiteaz la carbonii protonai (indexai conform schemei din Fig. 9). Corelaiile care se stabilesc ntre protonii asociai diferitelor poziii de carbon din molecul sunt identificate n spectrul
CHHC prin apariia cross-peakurilor care conecteaz poziiile chimice corespunztoare. Deoarece mecanismul de stabilire a corelaiilor n spectre CHHC
se bazeaz pe schimbul de magnetizare longitudinal 1H-1H determinat de
interaciunea dipolar, amplitudinea fiecrui cross-peak va fi o msur a triei
acestui cuplaj i, implicit, a distanei internucleare dintre protonii asociai poziiilor de carbon corelate. Acest mecanism este exemplificat n Fig. 12 cu corelaii ale carbonului A (a se vedea liniile punctate). n particular, se observ apariia unui cross-peak intens ntre A i carbonul C, ns este de remarcat de asemenea lipsa uni peak de corelaie similar cu carbonul din poziia B. Din punct
de vedere calitativ, acest rezultat este n perfect concordan cu distanele
intra-moleculare dintre protonii conectai chimic de acetia, i anume: 3.2
ntre protonii cei mai apropiai de carbonii A i C, i respectiv de 4.8 pentru
ceilali doi protoni prezentai n exemplul din Fig. 12.
O analiz cu caracter cantitativ relevant pentru determinarea de distane
1H-1H cu ajutorul metodei CHHC trebuie ns s ia n considerare i alte efecte
care influeneaz intensitile cross-peakurilor din spectru: pentru aceasta am
elaborat un model teoretic al dinamicii de spin n condiii specifice experimentului CHHC [7]. Rezultatele modelrii ne-au permis mbuntirea procesului
de analiz a datelor experimentale, prin introducerea de corecii adecvate pentru o serie de procese perturbative, i anume: (i) caracterul neselectiv al transferului de polarizare 1H<->13C pe durata blocurilor CP care flancheaz perioada de transfer de magnetizate (tmix n Fig. 11), (ii) efectul protonilor care nu
contribuie direct la semnalul RMN-S detectat (protonii care nu sunt legai chimic de carbon, i respectiv protonii din molecule nemarcate izotopic cu 13C), i
232
Figura 12: Spectru RMN 2D de corelaie 13C-13C obinute pe L-Tirozina marcat uniform cu 13C
aplicnd metoda CHHC; spectrul a fost obinut pentru o durat de mixing de 50 s i ilustreaz modul
n care dinamica procesului de transfer de polarizare 1H-1H (si implicit distana dintre protonii implicai) este codificat prin intensitatea cross-peakurilor corespunztoare din spectrul de corelaie 2D.
Figura 13: Curbe CHHC reprezentative pentru protoni cu contacte intermoleculare scurte (de exemplu protonul legat de C5 de pe inelul aromatic), i respectiv lungi (protonii ataai lui C2) n urma
mpachetrii moleculelor de L-Tirozina n reeaua cristalin (figura din dreapta)
233
(iii), efectul multiplicitii protonice pentru diferite grupri chimice din sistem
(CH, CH2, CH3). Coreciile introduse conduc la creterea semnificativ a gradul
de precizie cu care sunt estimate distanele proton-proton din spectre RMN-S
de tip CHHC, n particular prin intermediul aa-numitelor curbe CHHC extrase dintr-un set de astfel de spectre nregistrate pentru diferite valori ale timpului de mixing (Fig. 13). n aceast figur ilustrm comportamentul observat
pentru transferul de polarizare n care sunt implicai protonii ataai poziiilor
de carbon C2, i respectiv C5 din molecula de L-Tirozin.
Metoda CHCC
Avnd n vedere rezoluia spectral limitat a protonilor n experimente
RMN-S 2D de tip HETCOR, care sunt utilizate n mod tradiional pentru investigaii structurale bazate pe determinarea de distante C-H, am proiectat i
implementat practic un nou tip de experiment de corelare 13C-13C, numit
CHCC: acesta prezint avantajul de a cuantifica pe ambele dimensiuni spectrale deplasri chimice ale nucleelor 13C, adic spectre de nalt rezoluie. Informaia codificat n acest tip de spectre se refer tot la cuplajele dipolare 1H-13C,
iar procesul care st la baza experimentului CHCC este i n acest caz transferul de polarizare proton-carbon. n mod similar cu metoda CHHC, unde transferul de polarizare este utilizat pentru a codifica cuplajele dipolare 1H-1H, metoda CHCC se aplic n cazul compuilor uniform marcai cu 13C.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chcc"
;cp (TopSpin 2.0)
234
ph3= 1 3 1 3 1 3 1 3
ph1= (4) 0
ph2= 0
ph4= 1
ph5= 0
ph6= 1
ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0
ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2
Figura 15: Spectru RMN 2D de corelaie 13C-13C obinute pe L-Tirozina marcata uniform cu 13C
aplicnd metoda CHCC pentru valori ale ultimului puls de contact (p17) de 0.5 ms (a), i respectiv 1
ms (b); spectrele 1D de mai jos reprezint felii de-a lungul dimensiunii directe ce corespund poziiilor
de carbon C2 i C8, iar prin asterisk este marcat n fiecare caz evoluia cross-peakului specificat.
236
de tip Single Quantum (SQ). n cazul nucleelor 13C, cuplajul J are valori
semnificative pentru a produce coerente DQ n general ntre poziii direct
conectate prin legturi chimice: din aceasta cauz, n exemplul de spectru
INADEQUATE prezentat n Fig. 17 nu va aprea cross-peakul corespunztor coerentei 1+3, adic ntre nucleele C1 i C3.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/inadequate"
;cp (TopSpin 2.0)
;13C-13C INADEQUATE experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u (pl12:f2) (pl4:f1)
(p1 ph4):f1
1u cpd2:f2
(p1 ph5):f1
d5
(2p1 ph6):f1
d5
(p1 ph7):f1
238
d0
(p1 ph8):f1
d5
(2p1 ph9):f1
d5
(p1 ph10):f1
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 1 1 1 3 3 3 3
ph1= 0
ph2= 0
ph4= 3 3 3 3 1 1 1 1
ph5= (8) 0 2 4 6
ph6= (8) 0 2 4 6
ph7= (8) 4 6 0 2
ph8= 1
ph9= 1
ph10= 3
ph31= 0 2 0 2 2 0 2 0
Figura 17: Exemplu ilustrativ de spectru RMN 2D INADEQUATE: peakurile de corelaie ntre
dou poziii chimice, i i j, corespund formrii unei coerene DQ care evolueaz n dimensiunea
indirect cu frecvena i + j i indic conectivitatea chimic direct ntre carbonii corespunztori
239
Datorit particularitilor sale, metoda INADEQUATE este intens utilizat n investigaiile structurale din chimia organic, n scopul stabilirii
conectivitilor chimice dintre diferitele grupri prezente n molecula investigat. Un exemplu relevant pentru acest tip de aplicaii practice ilustrat n
Fig. 18 corespunde spectrului 13C INADEQUATE nregistrat pe acetatul de
colesteril (C29H48O2), n abunden natural. n stare solid, aceast molecul prezint o structur cristalin puternic ordonat, care conine dou molecule n unitatea asimetric. Datorit acestui fapt, spectrul 13C unidimensional conine 58 de linii RMN (fiecrei poziii individuale a unui nucleu 13C ii
va aparine o linie de rezonan dublat), majoritatea situate n regiunea
spectral 10 60 ppm. n urma analizei spectrului 2D INADEQUATE s-au
determinat toate corelaiile posibile ntre nucleele de carbon din molecul,
concluzionndu-se asupra acurateei metodei INADEQUATE n caracterizarea conectivitilor chimice n sisteme moleculare complexe, n abunden natural [8].
Figura 18: Spectrul RMN 2D de corelare corespunztor acetatului de colesteril n abunden natural (2 molecule pe unitatea asimetric) obinut cu ajutorul secvenei de pulsuri INADEQUATE
240
Figura 19: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D 1H-1H DQ-MAS utilizat pentru
investigarea eficienei procesului de generare a coerenelor Double Quantum (DQ) 1H-1H , codificat
n spectre de corelaie 2D 1H-1H; pentru excitarea coerenelor ilizeaz secvena numita BABA2
241
242
(p1 ph5):f1
go=2 ph31
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
ph1= (4) 0 2 4 6
ph2= (4) 2 4 6 0
ph3= (4) 4 6 0 2
ph4= 0
ph5= 1
ph6= 3
ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0
ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2
Aplicaiile practice ale metodei 1H-1H DQ-MAS vor fi ilustrate n continuare, considernd cazul relativ simplu al spectrului de corelaie 1H-1H nregistrat pe L-alanina (Fig. 20), unde am utilizat secvena BABA2, la o frecven
de rotaie a probei n jurul unghiului magic de R = 30 kHz. Eficiena maxim s-a obinut pentru o singur secven BABA2. Analiznd spectrul se
constat i similariti cu un spectru tipic INADEQUATE, dar i deosebiri.
Concret, asemnrile sunt legate de faptul c liniile de rezonan corespunztoare spinilor 1H corelai, de exemplu i i j n dimensiunea direct, evolueaz cu o frecven egal cu suma deplasrilor chimice asociat spinilor,
i+j, n dimensiunea indirect (DQ). n spectrul DQ-MAS al L-alaninei
acesta este cazul pakurilor de corelaie (1,2), (1,3) i (2,3) corespunztoare coerenelor DQ care se genereaz ntre protoni aparinnd gruprilor
(CH3, CH), (CH3, NH3), i respectiv (CH, NH3). Deosebirile sunt legate de
faptul c n spectre 1H-1H DQ-MAS pot aprea i peakuri diagonale, datorit multiplicitii protonilor dintr-o anumit grupare chimic, cum este cazul gruprilor CH3 (1) i NH3 (3) n spectrul din Fig. 20, dar i din cauza
triei mari a cuplajelor dipolare 1H-1H care permit evidenierea corelaiilor
dintre protonii CH (2) aparinnd la dou molecule vecine (corelaii intermoleculare): n cazul peakurilor diagonale j, frecvena de evoluie n
dimensiunea DQ va fi de 2j.
243
Figura 20: Spectrul RMN 2D de corelare 1H-1H DQ-MAS achiziionat utiliznd secvena BABA2
pe L-Alanina.
5. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
245
Rezonana magnetic nuclear, ca orice metod spectroscopic, presupune reprezentarea grafic a unui bilan energetic. Valorile frecvenelor cu
care se lucreaz n RMN fac ns folosirea lor foarte anevoioas. Pentru
247
0
0
0 = -B0
echivalent cu parcurgerea frecvenelor. Aceast abordare este adesea utilizat n RES, dar a devenit rar n spectroscopia RMN.
A doua abordare demonstreaz chiar mai clar distincia dintre rezonana magnetic nuclear i alte spectroscopii i exemplific folosirea descrierii
clasice a cmpului de radiaie. Pentru a urmri experimentul este necesar s
folosim un sistem de coordonate care se rotete cu frecvena Larmor 0.
Acesta este cunoscut ca sistemul rotativ (the rotating frame). n aceste
248
1 = - B1
Unghiul la care se mic magnetizarea este , dat de:
= 1 t = - B1 t
aa c magnetizarea poate fi nclinat la orice unghi doar prin simpla aplicare a unui puls electromagnetic de putere i durat cunoscute. Figura 1(b)
ilustreaz acest proces pentru un unghi de 1800.
Figura 1. (a) Magnetizarea (M0) n sistemul rotativ n prezenta cmpului de radiofrecvena (B1); (b)
Magnetizarea dup un puls de 1800; (c) Magnetizarea dup un puls de 900.
Figura 2. Relaxarea transversal fiecare sgeat reprezint un vector magnetizare nuclear. (a), (b),
(c) i (d) arat evoluia n timp dup un puls de 900.
= 1/(T2)
de aceea, cu ct relaxarea se produce mai rapid, cu att linia observat este
mai larg. n multe cazuri, din cauza lrgimii liniei deplasarea chimic sau
informaiile privind cuplajul sunt obscure sau chiar pierdute.
intensitate
(a)
timp
(b)
frecventa
Tehnica transformrii Fourier, care este acum metoda aleas n cele mai
multe experimente RMN, este un exemplu de metod multiplex. Principiul
unei astfel de metode este ca, respectnd condiia ca pulsul excitaiei s
acopere o lrgime de band potrivit, toate frecvenele sunt excitate n mod
251
252
Magnetul
cea mai scump parte a spectrometrului
electromagnet din fire supraconductoare
civa km de fir
solenoid, bobina, bobine helmholtz
heliu lichid (T = 4.2 K)
straturi termoizolante i ecranante
azot lichid (T = 77.4 K)
straturi termoizolante i ecranante
orificiu central vertical (ngust sau larg)
254
255
256
257
258
Figura 20. Integrarea semnalelor pentru proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent:
CDCl3
Raportul relativ al celor trei integrale este 2:3:3, corespunztor numrului de protoni legai de fiecare dintre nucleele de carbon. Pentru a identifica
semnalele celor doua grupri CH3 vom ine cont de faptul c protonii gruprii legate de C=O dau semnal simplu (singlet), n timp ce protonii gruprii legate de CH2 dau semnal despicat (n+1), deci triplet. Astfel, identificarea corespondenei celor trei semnale de rezonan este complet.
Senzitivitatea spectrometrului RMN este o msur a numrului minim
de spini detectabili. Cum semnalul RMN crete odat cu creterea diferenei de populaie dintre nivelele energetice, senzitivitatea este mbuntit
de creterea cmpului magnetic utilizat [5]. De asemenea, diferena de populaie poate fi crescut prin scderea temperaturii probei. Analizele de tip
13C NMR vor utiliza diferite metode ce conduc la mbuntirea semnalului
RMN.
Redm mai jos i cteva exemple de analize 13C NMR pe probe relativ
simple:
259
260
261
262
263
n toate spectrele de mai sus, acolo unde s-a utilizat ca solvent CDCl3,
se observ i semnalul corespunztor solventului la 77.01 ppm, semnal
foarte util i pentru a calibra spectrul n funcie de referin.
4. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
P.S. Belton, Annual Reports on NMR Spectroscopy, Vol. 31, p. 1-18, Academic
Press, (1995);
R. Grimmer and B. Blumich, NMR Basic Principles and Progress, Vol. 30, p. 1-60,
(1994);
Joseph P. Hornak; http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/
Mihai Vasilescu, Teza de doctorat, 2007
Carrington, A.D. McLachlan, Introduction to Magnetic Resonance, Chapman and
Hall, London (1967)
265
4. Sistemul de nregistrare.
5. Sistemul de furnizare a gazelor, n scopul meninerii unei atmosfere
inerte n cuptor (pentru inhibarea oxidrii probei, eliminarea volatilelor i
asigurarea unui transfer termic ct mai bun).
Orice proces endoterm sau exoterm (cum ar fi topirea sau cristalizarea)
care are loc n prob la nclzire este nregistrat ca un peak n direcia negativ, respectiv pozitiv a axei X, pe care este reprezentat diferena de temperatur (semnalul DTA) (Fig. 2).
Calorimetria dinamic diferenial (DSC) este o tehnic n care diferena de energie dintre o substan (i/sau produii de reacie) i un material de referin este msurat ca funcie de temperatur (sau timp) n timp
ce substana i materialul de referin sunt supuse unui program de temperatur controlat - conform IUPAC (International Union of Pure and Applied
Chemistry).
Termenul calorimetrie se refer exclusiv la msurarea cldurii. Cldura
poate fi o cantitate de energie schimbat sub forma unui flux de cldur
ntre dou corpuri ntr-un interval de timp. Calorimetrele cu baleiaj diferenial sunt tehnici mbuntite ale DTA (analiza termic diferenial) n
sensul c ele au fost calibrate pentru msurtori de energie caloric, nu de
temperatur.
Efectul termic care se produce n cazul unei tranziii termice sau a unui
proces fizico-chimic este nregistrat ca diferen de flux caloric ntre prob
i referin i la rndul lui este tradus n semnal electronic, amplificat i
268
270
Bibliografie
1.
2.
3.
274
cu
termogravimetria
Specificaii aparat:
Intervalul de temperatur pe care se pot face msurtori: temp.
camerei 1500C
Acurateea balanei: 1%
Detectorii: termocuplu de Pt plus 10% Pt/Rh
275
277
279
TGA
mg
12.00
DTA
uV
-1.382%
-1.38%
20.00
Weight Loss -52%
-52.094 %
274.4
274.37 C
10.00
10.00
0.00
8.00
132
169.7
57.8
-10.00
6.00
-20.00
260
100
200
Temp [C]
300
280
DSC
mW
x=0
129
x=15
230
55
93
x=20
128.6 169.7
93.4
221
56
129
171
241.6
0
100
200
300
Temp [C]
400
500
TGA
mg
DTA
uV
8.00
-0.353%
-14.765%
993.4
10.00
1046
7.50
0.00
7.00
-10.00
505
-0.542%
-20.00
6.50
0
500
1000
Temp [C]
282
DTA
uV
-12.786%
20.00
20.00
10.00
-12.026%
15.00
491
491.18C
HA+50%Fe - t
0.00
HA+30%Fe-t
83.5
-10.00
10.00
-20.00
-8.907%
-13.554% 507
507.68C
-30.00
5.00
100
200.00
400.00
Temp [C]
600.00
DTA
uV
371
371.32C
9.00
-6.838%
50.00
-22.530%
8.00
445.94C
445
7.00
0.00
85
84.90C
6.00
-13.417%
5.00
-50.00
4.00
0.00
200.00
400.00
600.00
800.00
1000.00
Temp [C]
283
Menionm c toate aceste msurtori au fost publicate i/sau prezentate n cadrul unor conferine naionale/internaionale de specialitate.
3.Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
Bellotto, M., Gualtieri, A., Artioli, G., and Clark, S.M., Kinetic study of the
kaolinite-mullite reaction sequence. Part I: kaolinite dehydroxylation, Phys. Chem.
Minerals 22, 207-214 , 1995.
M. Tman, M. Bciu, V. Coman, V. Simon, Thermal kinetics analysis of bone
tissue organic phase, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 11, No. 4
(2009), 479-483.
L.F. Lozano, M.A. Pena-Rico, A. Heredia, J. Ocotlan-Flores, A. Gomez-Cortes, R.
Velazquez, I.A. Belio, L. Bucio, Thermal Analysis study of human bone, Journal of
Materials Science 38 (2003) 4777-4782
M.E. Bahrololoom, M. Javidi, S. Javadpour, J. Ma, Characterisation of natural
hydroxyapatite extracted from bovine cortical bone ash, Journal of Ceramic
Processing Research, vol. 10, no. 2 (2009), 129-138.
T. Radu, S. Simon, C. Prejmerean, V. Simon, A. Colceriu, C. Tamas, L. Silaghi-Dumitrescu, Thermoanalytical characterisation of new dental ionomer
biocomposites, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 10, No. 4
(2008), 958-960.
285
1. Principiul metodei
Difracia de raze X este una dintre metodele cele mai utilizate pentru
investigarea compuilor n faza solid cristalin. Principiul de funcionare a
unui difractometru de raze X este urmtorul: Cu ajutorul unui generator de
nalt tensiune se obine tensiune de ordinul zecilor de kV. Aceast tensiune se aplic ntre catodul i anodul tubului de raze X.
286
(1)
fj exp
2 i(hxj+kj+lzj)
(2)
(3)
(4)
I i = C i
(5)
mx
I js = C js
Ws
(6)
s mx
W = K issWs
unde K ijs =
I i
I js
(7)
C js
Ci s
I isWs
.
I jsWd
W =
I i W s
I js RIRs
(8)
291
D=
K
cos
(9)
cos =
0,9
+ 4 sin
D
(10)
n cazul n care profilul liniei de difracie este de tip Lorentz, unde este un
parametru care reflect deformaia reelei cristaline i reprezint deplasarea
medie a atomilor fa de poziia de echilibru.
293
0,9
, iar panta
D
2 cos 2 =
2
D2
+ 16 2 sin 2
(11)
Din reprezentarea grafic a lui 2cos2, n funcie de sin2, rezult dimensiunile cristalitelor i deformrile reelei.
2.3.3. Metode bazate pe analiza Rietveld
O alt modalitate de determinare a dimensiunilor cristalitelor i a deformrii reelei cristaline se poate face prin analiza [4] Rietveld. Conform
formulei lui Caglioti, lrgimea la seminlime depinde de unghiul , astfel:
L =
X
+ Y tg
cos
(12)
G = Utg 2 + Vtg + W +
P
cos
(13)
M 20 =
Q 20
2 < Q > N 20
(14)
Q20 este valoarea lui Q pentru a 20-a linie de difracie, N20 este numrul de
linii diferite calculate pn la linia corespunztoare lui Q20, iar <Q> este
abaterea medie dintre liniile de difracie calculate i observate.
Dac avem M20 > 10, indexarea este probabil corect.
Un alt factor de ncredere datorat lui Smith si Snyder [6] se definete
astfel:
FN=
N
< 2 > .N (g )
(15)
i wi ( y
Rwp=[
obd
i
obs
calc
i
i wi ( y ) 2
)2
]1/2
(16)
Dac funcia de cost CF este mai mic dect cea precedent, atunci se
reine noua configuraie. Dac CF este mai mare dect cea precedent,
atunci se reine noua configuraie cu probabilitatea exp(- CF/T). Probabilitatea relativ a celor dou configuraii de ncercare respect legea lui
Boltzman: P1/P2 = exp[(CF2-CF1)/T], T fiind temperatura distribuiei.
n timpul procesului de cutare temperatura se scade treptat. Astfel, n
faza iniial a procesului de cutare a configuraiei optime se poate uor
trece de la un minim local la un alt minim n scopul determinrii minimului
absolut, dar n faza final, cnd T este foarte mic, probabilitatea de a gsi
un alt minim este de asemenea mic. Exist mai multe programe de calcul
care au implementat aceast modalitate de determinare a minimului global,
dintre care amintim Powder Solve [15], Fox [16,17].
Totui, pentru a evita s cdem ntr-un minim local, un alt algoritm a
fost dezvoltat, i anume Parallel Tempering (PT) [18]. n schimbul utilizrii
unui singur lan de configuraii, cu descreterea temperaturii se aleg de la
298
nceput mai multe configuraii (un numr mic de configuraii), fiecare configuraie pornete cu o anumit temperatur care scade treptat. Periodic se
testeaz configuraiile paralele i se alege configuraia optim prin aceeai
schem ca n cadrul unui singur proces. n felul acesta, posibilitatea de a se
obine minime locale este mai mic.
2.4.3.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi
Dup extragerea intensitilor de difracie prin metoda Le Bail sau
Pawley, pentru obinerea modelului structural se poate urma procedeul
care se folosete pentru monocristale. Dificultatea adaptrii procedeului de
calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea c metodele de calcul sunt metode statistice i necesit un numr mare de intensiti de difracie. n timp ce pentru monocristale se pot colecta cteva mii de intensiti, numrul de intensiti care se pot obine pentru pulberi este de ordinul
zecilor, pn la 3 sau 4 sute. Cu toate acestea, n unele cazuri s-au obinut
rezultate bune. Paii care trebuie urmai sunt:
corectarea intensitilor de difracie de diveri factori, dintre care amintim: Factorul Lorentz, factorul de polarizare, factorul de
absorbie, factorul de extincie. Aceste corecii pot s fie fcute
i n cadrul extragerii intensitilor de difracie.
Determinarea factorului de scal i a factorului global de temperatur. Datorit faptului c atomi oscileaz n jurul poziiilor de
echilibru, intensitile acestora se reduc cu un factor de temperatur. Deoarece intensitile de difracie se msoar n uniti arbitrare, intervine un factor de scal K care trebuie determinat.
Determinarea fazei factorilor de structur [19,20]. Dac se fac coreciile intensitilor de difracie, se determin factorul de scal
i de temperatur, se obine modulul factorilor de structur. Dar
factorii de structur sunt numere complexe, faza acestor numere
complexe este arbitrar pentru structuri necentrosimetrice i are
valoarea 0 sau pentru structuri centrosimetrice, deci n acest
caz factorii de structur sunt numere reale pozitive sau negative.
Determinarea fazei factorilor de structur cnd se cunoate modulul factorilor de structur este cea mai complex problem n
procesul de determinare a structurilor cristaline pentru monocristale. Metodele de determinare a fazei factorilor de structur
se numesc n cristalografie metode directe i se bazeaz pe metode statistice aplicate invarianilor i semiinvarianilor.
Sinteza Fourier i sinteza Patterson. Cunoscnd factorii de struc299
( x, y , z ) =
1
V
hkl
exp( 2i ( hx + ky + lz ))
(17)
hkl
1
V
h , k ,l
cos( 2 ( hx + ky + lz ))
(18)
h , k ,l
S y = wi ( y i y ci ) 2
i
unde:
wi - factorul de pondere i este wi=1/yi,
300
(19)
H 2 = U tan 2 + V tan + W
(20)
RP =
| y y
y
i
ci
(21)
wi ( y i y ci ) 2
=
2
wi ( y i )
1/ 2
RWP
(22)
de atomi pe celula elementar. Exist dou tipuri de constrngeri: constrngeri slabe sau soft restrain [25] i rigid body [26]. Constrngerile
slabe este necesar s fie impuse asupra distanelor dintre atomi deoarece
exist distane standard dintre atomi, de exemplu CC, CO pentru legturi simple sau duble. Totui, aceste distane pot s varieze ntre anumite
limite. La fel se pot impune constrngeri slabe pentru unghiurile de legtur i pentru unitile structurale care sunt planare. De exemplu, pentru ciclu benzenic se impun constrngeri slabe referitoare la planeitatea acestui
ciclu [27].
Constrngerile puternice sau rigid body se aplic atunci cnd urmrim
ca o grupare de atomi s se mite mpreun sau s se modifice distanele
dintre atomi, dar forma ansamblului s nu se schimbe. Acest fel de constrngeri urmrete s se reduc numrul parametrilor ce trebuie rafinai i
obinerea unui model de structur realist. De exemplu, n procesul de rafinare a complecilor de incluziune, fiecare din cele apte uniti glicozidice care
intr n componena ciclodextrinei mpreun cu atomii de oxigen secundari
au fost considerate ca rigid body, permind translaia i rotaia acestora.
Unitile glicozidice au fost legate ntre ele prin constrngeri slabe.
4. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
303
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
304
Determinarea structurii cristaline este foarte important, att n diferitele ramuri ale tiinei, ct i n industrie i tehnologie, deoarece proprietile materialelor n stare solid depind de structura cristalin i molecular a
acestora. Pentru orice compus nou preparat ntr-un anumit fel este de dorit
s se determine structura cristalin. A determina structura cristalin pentru
un anumit compus nseamn determinarea sistemului cristalografic n care
acesta cristalizeaz, a parametrilor celulei elementare, a grupului spaial i
a poziiilor atomilor n celula elementar. Determinarea structurii cristaline
se face n principal prin difracie de raze X, dar de foarte mare ajutor sunt
metodele spectroscopice i de modelare molecular care pot s furnizeze
informaii structurale deosebit de utile. n general, structura cristalin se
determin din monocristale. n cazul n care nu se pot obine monocristale
se ncearc determinarea structurii cristaline din pulberi. Determinarea
structurii cristaline din pulberi este mai dificil deoarece, n timp ce la monocristale se pot colecta mii de intensiti de difracie, n cazul pulberilor, se
obin doar cteva zeci. Pe lng aceasta, foarte multe intensiti de difracie
se suprapun, iar extragerea acestora este dificil i afectat de erori. Totui,
305
n ultimul timp, datorit creterii puterii de calcul i rezoluiei difractometrelor, foarte multe structuri cristaline au fost determinate din pulberi. Deoarece n cadrul ICE exist difractometru pentru pulberi ne vom ocupa
doar de determinarea structurii cristaline din pulberi cristaline. Etapele
principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi sunt: indexarea difractogramelor, obinerea modelului structural i rafinarea Rietveld
a modelului obinut. Vom descrie aceste etape, iar la final se vor da cteva
exemple de determinare a structurii cristaline din pulberi.
1. Indexarea difractogramelor
A indexa o difractogram nseamn a determina sistemul cristalografic,
parametrii celulei elementare i atribuirea fiecrei linii de difracie a indicilor Miller corespunztori.
Celula elementar este un paralelipiped n interiorul cruia se gsesc
atomii sau moleculele i dac acesta se translateaz dup cele 3 direcii,
atunci se obin poziiile tuturor atomilor din celula elementar. n general,
o celul elementar se poate defini n mai multe moduri, dar se alege acea
celul care are volumul ct mai mic i simetria ct mai mare. Indexarea
difractogramelor este primul pas n determinarea structurii cristaline, dac
aceasta nu este fcut corect, nu se poate determina structura cristalin.
Dificultatea indexrii provine din faptul c, n cazul pulberilor, datele experimentale sunt proiecia unidimensional a reelei reciproce care este tridimensional. Astfel, din difractogramele pe pulberi se determin unghiurile
de difracie din care rezult modulul unui numr limitat de vectori din reeaua reciproc din care se dorete s se reconstituie ntreaga reea reciproc. Aceasta este total diferit fa de cazul determinrii structurii cristaline
din monocristale, unde se determin att modulul, ct i direcia pentru un
numr foarte mare de vectori din reeaua reciproc. Astfel, n timp ce n
cazul difraciei pe monocristale se obin mii de vectori din reeaua reciproc, la difracia pe pulberi se obin doar cteva zeci de unghiuri de difracie
din care se determin modulul vectorilor corespunztori din reeaua reciproc. Dificultile n indexarea difractogramelor provin din erorile legate
de determinarea poziiilor maximelor de difracie, dac poziiile maximelor
de difracie ar fi determinate exact, indexarea ar fi imediat. De asemenea,
trebuie menionat c indexarea este cu att mai dificil cu ct simetria este
mai sczut. Astfel, cel mai uor se indexeaz compuii care cristalizeaz n
sistemul cubic i, cel mai dificil, compuii care cristalizeaz n sistemul triclinic. Aceasta deoarece, cu ct sistemul cristalografic are simetrie mai joas, cu att are mai multe linii de difracie, dintre care unele se suprapun
306
i valori maxime preselectate pentru h,k, l notate cu hm, km, lm. Aceste
valori sunt ntre 2 i 4. Pentru fiecare permutare a indicilor se determin
parametrii celulei elementare, se genereaz unghiurile de difracie i se
verific dac unghiurile calculate se potrivesc cu cele experimentale. Se
rein acei parametrii de reea pentru care unghiurile calculate se potrivesc
cel mai bine cu unghiurile experimentale i care indexeaz toate sau aproape toate unghiurile experimentale. Se testeaz toate sistemele cristalografice
ncepnd de la sistemul cubic pn la sistemul triclinic.
Metoda cutrii pe zone ncepe prin cutarea zonelor unidimensionale,
adic de tipul h,0,0; 0,h,0; 0,0,l i bidimensionale, adic de tipul h,k,0; h,0,l;
0,k,l i construirea zonelor tridimensionale utiliznd liniile comune din
zonele bidimensionale. Cnd o zon tridimensional (reeaua) a fost construit, se ncearc atribuirea indicilor Miller pentru toate reflexiile Bragg
observate.
1
Fhkl exp( 2i(hx + ky + lz ))
V hkl
Densitatea electronic de sarcin se exprim direct n uniti electronice astfel nct, dac densitatea electronic este mai mare, exist o probabilitate mai mare s avem atomi i ne indic aproximativ i numrul de atomi Z pentru maximul de densitate electronic
respectiv. Pe baza densitii electronice se poate construi un model structural aproximativ. Dac nu s-au determinat fazele factorilor de structur i avem numai modulul acestora, atunci putem
face sinteza Patterson, dup relaia:
2
1
P(u,v,w) = Fh , k ,l cos( 2 ( hx + ky + lz ))
V h , k ,l
unde u, v, w reprezint respectiv x, y, z. Cu ajutorul acestei
relaii putem s determinm distane dintre atomi i, mai ales, distanele dintre atomii grei. Cu ajutorul sintezei Patterson putem localiza poziiile atomilor grei din celula elementar, dac acetia
exist.
(v) Rafinare Fourier. Modelele structurale obinute prin metodele directe sau metoda Patterson sunt adesea incomplete chiar i pentru
monocristale, iar pentru pulberi cu att mai mult pentru c numrul de intensiti experimentale este mult mai mic. Pentru a mbunti i completa modelul se apeleaz la tehnici de rafinare Fourier. Cele mai importante tehnici de rafinare Fourier sunt: Sinteze
Fourier succesive i Sinteza Diferen.
( x, y , z ) =
313
i wi ( y
obd
i
calc
i
obs 2
i wi ( y )
)2
]1/2
Dac funcia de cost CF este mai mic dect cea precedent, atunci se
reine noua configuraie. Dac CF este mai mare dect cea precedent,
atunci se reine noua configuraie, cu probabilitatea exp(- CF/T). Probabilitatea relativ a celor dou configuraii de ncercare respect legea lui
Boltzman: P1/P2=exp[(CF2-CF1)/T], T fiind temperatura distribuiei.
n timpul procesului de cutare, temperatura se scade treptat. Astfel, n
faza iniial a procesului de cutare a configuraiei optime, se poate uor
trece de la un minim local la un alt minim, n scopul determinrii minimului absolut, dar n faza final, cnd T este foarte mic, probabilitatea de a
gsi un alt minim este de asemenea mic. Exist mai multe programe de
calcul care au implementat aceast modalitate de determinare a minimului
global, dintre care amintim, Powder Solve [12], Fox [13,14].
Totui, pentru a evita probabilitatea s cdem ntr-un minim local, un
alt algoritm a fost dezvoltat, i anume, Parallel Tempering (PT) [15]. n
schimbul utilizrii unui singur lan de configuraii cu descreterea temperaturii, se aleg de la nceput mai multe configuraii (un numr mic de configuraii), fiecare configuraie pornete cu o anumit temperatur care scade
treptat. Periodic se testeaz configuraiile paralele i se alege configuraia
optim prin aceeai schem ca n cadrul unui singur proces. n felul acesta,
posibilitatea de a se obine minime locale este mai mic.
n procesul de cutare a minimului global ca i Cost Function, poate s
se introduc ca i criteriu pentru modelul obinut, n afar de potrivirea
dintre difractograma calculat i cea observat, minimizarea energiei poteniale de interaciune inter - i intramolecular. Pentru ca unitile structurale s nu se apropie foarte mult unele de altele, se poate introduce un
factor numit anti-bump.
Difractogramele pot fi modelate ca o sum de dou funcii, i anume,
funcia care descrie fondul (background) i o funcie care sumeaz liniile de
difracie, fiecare linie de difracie fiind centrat corespunztor. Profilul liniilor de difracie se descrie de obicei prin funcii standard de tipul Gaussiana,
Lorentziana sau pseudos-Voigt. Orientarea preferenial poate fi descris
prin funcii de tip March-Dollase.
315
Fhkl
B sin 2
= N j f j exp[2(hx j + ky j + lz j )]exp
2
j
(2)
316
pV = L + (1-)G
unde: pV - funcia pseudo-Voigt , L fiind funcia Lorentz, G funcia Gaus
iar parametru de amestecare a celor dou funcii.
Forma funciei de profil a liniilor de difracie depinde i de
semilrgimea la seminlime a liniei de difracie respective. Lrgimea la
seminlime se noteaz cu FWHM (full width half maximum) i are urmtoarea dependen unghiular, exprimat prin funcia lui Caglioti[18]:
H 2 = U tan 2 + V tan + W
(3)
1 2
sin K ) 3 / 2
G
(4)
RB =
RP =
| I
K ( obs )
I K ( calc) |
K ( obs )
ci
| y y
y
(5)
(6)
317
wi ( y i y ci ) 2
=
2
wi ( y i )
1/ 2
RWP
(7)
w (y
i
oi-yci)
2+C
w (R -R
j
oj
cj(x))
; wi=1/
(yoi)
; wj=1/
(Roj)
(8)
(yoi)
este
deviaia standard a intensitii lor msurate; Roj este valoarea ateptat pentru mrimea stereochimic respectiv care poate fi lungime de legtur,
unghiuri etc (aa numita pseudo observabil), iar Rcj(x) este valoarea calculat din poziiile atomilor (x,y,z); (Roj) este deviaia standard a pseudo-observabilei; cw este un factor de ponderare care permite s se varieze
contribuia constrngerilor n procesul de rafinare. Cu ct cw este mai mare,
cu att constrngerile sunt mai puternice. n general, se pornete cu un cw
mare, de ordinul miilor, i se tot reduce n procesul de rafinare. n cazul
programului de rafinare GSAS [17], constrngerile puternice rigid bodies
sunt incompatibile cu constrngerile slabe, aceasta nseamn c atomilor
care aparin unui corp rigid nu le pot fi aplicate constrngerile slabe n acelai timp. n cazul n care exist i grupri plane, atunci este necesar aplicarea constrngerilor de planeitate [23], ca de exemplu, pentru ciclu benzenic, cnd n afar de constrngerile slabe se aplic i constrngeri ca molecula s fie planar.
Constrngerile puternice sau rigid body se aplic atunci cnd urmrim ca o grupare de atomi s se mite mpreun sau s se modifice distanele dintre atomi dar forma ansamblului s nu se schimbe. Acest fel de constrngeri urmrete s se reduc numrul parametrilor ce trebuie rafinai i
obinerea unui model de structur realist. De exemplu, n procesul de rafinare a complecilor de incluziune, fiecare din cele apte uniti glicozidice
care intr n componena ciclodextrinei, mpreun cu atomii de oxigen secundari, au fost considerate ca rigid body, permind translaia i rotaia
acestora. Unitile glicozidice au fost legate ntre ele prin constrngeri slabe.
Ciclodextrina
Dup determinarea poziiilor maximelor de difracie, indexarea s-a fcut cu ajutorul programului de calcul Ito [9]. Structura cristalin pentru
Ciclodextrin se cunotea. Dar la interaciunea cu atenololul structura cristalin se modific total n sensul c se schimb grupul spaial, celula elementar i configuraia molecular. Structura cristalin pentru atenolol nu
a fost cunoscut la acel moment. De aceea, configuraia molecular pentru
atenolol a fost calculat cu ajutorul programului de modelare molecular
Cerius 2.0 [20].
Configuraia molecular pentru ciclodextrin a fost luat din baza
de date Cambridge Structural Database [29].
n urma indexrii s-a stabilit c, complexul de incluziune cristalizeaz
n sistemul monoclinic avnd grupul spaial C2 cu 4 molecule de
320
n mod asemntor s-a determinat structura cristalin pentru complexul de incluziune Acid Mefenamic- -Ciclodextrina.
5. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
325
17. A.C.Larson & R.B. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). Report
LAUR 86-748, Los Alamos National Laboratory, NM, 87545, USA.
18. The Rietveld Method edited by R.A. Young Oxford University Press (1993)
19. W.A. Dollase, J.Appl. Cryst. 19, 267, (1986)
20. L.B. McCusker, R.B. Von Dreele, D.E. Cox, D.Louer and P.Scardi J. Appl.Cryst., 32,
36,
21. H.Nowell, J.P. Attfield and J.C.Cole, Acta Cryst.B B58 835,(2002
22. R.E. Dinnebier Powder Diffraction 14, 84,. (1999)
23. D. Mentzafos, I.M.Mavridis, G. le Bas, G. Tsoucaris, Acta. Cryst. B47, 746 (1991)
24. G. Borodi, I. Bratu, F. Dragan, R. Peschar, R. B. Helmbholdt, A. Hernanz,
Spectrochimica Acta A,70, 1041, (2008)
25. M.Pop, K. Goubitz, G. Borodi, M. Bogdan, D.J.A. De Ridder, R. Peschar, H. Shenk
Acta Cryst. B58, 1036, (2002),
26. A. Hangan, G. Borodi, X. Filip, C. Tripon, C. Morari, L. Oprean and C. Filip, Acta
Cryst. B66, 615, (2010)
27. X. Filip, G. Borodi and C. Filip, Phys. Chem. Chem. Phys. DOI, 10.1039/c1cp21878f.
28. J.Laugier,and B.Bochu CHECKCELL, Colaborative Computational Project Number
14 (CCP14). Laboratoire des Materaux et du Genie Physique de lEcole Superieur
de Physique de Grenoble, France.
29. T. Steiner and G. Koeller J.Am.Chem. Soc. 116,5122,(1994)
30. W.I.F. David, K.Shankland, J. Van de Streek, E.Pidcock, W.D.S. Motherwell,
J.C.Cole, J.Appl. Cryst.,39, 910, (2006).
31. B.H. Toby, J. Appl. Cryst. 34,210, (1001)
326
1. Generaliti
Microscoapele sunt instrumente utilizate pentru a facilita observarea
unor obiecte la o mrire mai mare dect cea a obiectului observat. Cel mai
comun microscop este lupa, obiect ce utilizeaz lentila pentru a focaliza
lumina reflectat de un obiect ntr-o imagine mai mare.
Microscoapele optice (figura 1) sunt instrumente mai complexe care
conin un set de lentile care mresc imaginea. Limitrile microscopiei optice
const n rezoluia obinut prin aceast tehnic (aprox. 250 nm). Rezoluia
este limitat de lungimea de und a fotonilor utilizai ca surs de iluminare
a specimenului, ceea ce nseamn c dou caracteristici aflate la o distan
mai mic de 250 nm nu vor putea fi difereniate.
Pentru observarea detaliilor mai mici a fost necesar crearea unui microscop care s utilizeze o surs de iluminare caracterizat printr-o lungime de
und mult mai mic. Accelerarea electronilor permite reducerea lungimii de
und a unui fascicul de electroni ceea ce face posibila vizualizarea detaliilor
cele mai fine. Printre alte surse se numr razele X i neutronii.
n 1931, fizicianul Ernst Ruska i inginerul Max Knoll au construit un
microscop electronic prototip. Doi ani mai trziu, Ruska a creat primul microscop a crui rezoluie era superioar unui microscop optic. Compania
Siemens a patentat invenia celor doi germani, iar n 1939 primul microscop
electronic de transmisie a fost produs n scopuri comerciale.
327
1 ocular
2 revolver
3 obiective
4 viza macrometric
5 viza micrometric
6 platina
7 surs de lumin
8 - diafragma i lentila
condensor
Principiile
funcionrii
unui
croscop electronic de transmite nu
difer cu mult fa de cele ale unui
microscop optic. n vrful coloanei
exist un emitor de electroni cu
voltaj nalt care va genera fasciculul
de electroni care va traversa coloana.
Aceti electroni vor penetra proba i
vor trece printr-o serie de lentile
magnetice, iar n final vor fi focalizai
pe ecranul situat la captul coloanei.
Pentru a modifica mrirea i
punctul focal al unei imagini se pot
utiliza diferite lentile. Aperturile de
pe traseul fasciculul de electroni au
rolul de a schimba contrastul i rezoluia imaginii.
n interiorul coloanei se va stabili
un vid nalt pentru a minimaliza interaciunile dintre electroni i molecuFigura 2 - Seciune prin coloana unui TEM
lele de aer.
Tunul de electroni
Electronii sunt emii de un filament supranclzit de un curent electric
pn cnd suficient energie va fi produs (aprox. 2500K) pentru a nvinge
the work function a metalului, de obicei tungsten sau hexaborid de
lantaniu. Electronii emii au o distribuie Boltzman a energiei i trebuie s
fie concentrai pentru ca fasciculul rezultat s strbat coloana, prin prob,
lentile i aperturi.
Tunul de electroni are mai multe componente: filamentul, circuitul de
interferen (biasing circuit), un vrf Wehnelt i un anod de extracie. Prin
conectarea filamentului de partea negativ a generatorului de energie, electronii pot fi pompai de ctre filament spre placa anodic i coloana microscopului, astfel circuitul fiind complet. Prin construirea unui cilindru
Wehnelt, care este ncrcat mult mai negativ dect filamentul n sine, se
asigur convergena optim a electronilor nc din momentul emisiei.
Cele mai comune microscoape sunt cele de emisie termionic si FEG
(Field Emission Guns).
329
330
Exteriorul microscopului
Consola utilizatorului const dintr-un ecran pe care se vor afia parametrii sub care funcioneaz microscopul precum: mrirea, valoarea defocalizrii, voltajul curentului etc.
Pe consol se mai afl butoane care controleaz poziia specimenului n
interiorul coloanei, luminozitatea fasciculului, curentul, alinierea, focalizarea i mrirea.
Microscoapele electronice de nou generaie au interfee cu computerele ceea ce confer utilizatorului o mai mare flexibilitate i control.
n cazul microscopiei electronice de transmisie proba analizat este depus pe o gril de metal, iar aceasta ntr-un holder de metal (fig.5). Acest
holder de metal, prin intermediul goniometrului, va asigura introducerea
probei n vidul din coloana microscopului cu o scdere minim a presiunii
din interiorul coloanei.
Dac se dorete vizualizarea unei probe sub diferite unghiuri sau realizarea unei tomograme, goniometrul se poate roti pentru a schimba unghiul
probei.
Principii ale formrii imaginii
n momentul n care fasciculul trece prin grosimea unui specimen au loc
mai multe fenomene. Dac electronul nu lovete un atom din prob acesta va
avea o traiectorie nedeviat pn la ecranul care va colecta imaginea.
Dac electronul intr n contact cu atomi din prob poate suferi o ciocnire elastic, nu va pierde din energie, iar legea conservrii momentului va
determina unghiul la care acesta a fost deviat de la traiectorie. Acest electron va conferi o rezoluie nalt imaginii.
n cazul unei ciocniri inelastice electronul va ceda o cantitate variabil
de energie specimenului, astfel cnd electronul va ajunge la nivelul ecranului va avea energia diminuat i un unghi de inciden necunoscut. Acest
electron va cauza apariia zgomotului n imagine.
332
Figura 6. Diferena dintre proieciile unei sfere solide i a unei sfere goale n momentul vizualizrii
la TEM
Microscoapele electronice pot fi utilizate pentru vizualizarea pattern-urilor de difracie a probelor. Un pattern de difracie poate fi colectat
din probe care conin un motiv care se repet, de exemplu din cristale bidimensionale. Pattern-ul de difracie se formeaz in the back focal plane
al lentilei obiectiv. Lentila intermediar determin vizualizarea imaginii
sau a pattern-ului de difracie pe ecran.
Colectarea imaginilor se poate face n diverse moduri. Observarea direct a imaginii de ctre utilizator are loc la nivelul unui ecran de fosfor.
Pentru a nregistra imaginea se utilizeaz negative care sunt impresionate
de fasciculul de electroni sau camere CCD (Charge Coupled Device) care
traduc n format digital interaciunile electronilor cu senzorul camerei.
333
Filme de suport
Filmul Formvar este un film de natur polimeric (formal de polivinil),
fiind des folosit n microscopia electronic. Substana se gsete sub form
solid i este solubil n solveni organici, cei mai utilizai fiind cloroformul
i dioxanul. Pentru a obine un film continuu de Formvar o lam de sticl
pentru microscopia optic este curat i scufundat uniform n soluia de
Formvar. Exist dou metode pentru depozitarea filmului pe grile: una
implic aezarea grilelor pe suprafaa filmului flotat pe ap, iar a doua depunerea pe grile a filmului flotat.
Filmele de carbon
Probele trebuie depuse pe un film care este foarte stabil sub aciunea
fasciculului de electroni. Filmele de carbon sunt foarte stabile.
Principiul evaporrii carbonului este unul foarte simplu. O foaie de mic este proaspt clivat, iar noile plci sunt introduse cu partea proaspt
clivat n interiorul unei camere n care se va stabili un vid nalt. Deasupra
platoului pe care sunt aezate cele dou foie de mic se afl un fragment
de sfoar de carbon conectat la un circuit de mare voltaj. Feele proaspt
clivate ale mici sunt perfect plate din punct de vedere atomic ceea ce mbuntete proprietile filmului de carbon. Dup stabilirea vidului un
334
Contra
n timpul colorrii particulele pot fi
distorsionate. n timpul uscrii
specimenul i pierde nveliul
hidratant. n cazul proteinelor
meninerea unei stri hidratate este
important
pentru
pstrarea
configuraiei.
Ca urmare a distribuiei inegale a
coloraiei pot s apar artefacte.
Rezoluia este limitat la 20 n
condiii optime. Aceasta corespunde
cu mrimea granulei srii folosite
pentru coloraia negativ.
Dezavantaje
Raportul semnal/zgomot este foarte
mic deoarece absorbia electronilor e
sczut.
nregistrarea
imaginilor
pentru
tomografie e dificil deoarece prin
rotire stratul de ghea expus este
prea gros.
Pregtirea probelor necesit mult
337
Microscopul electronic scanning (SEM) permite observarea i caracterizarea materialelor organice i anorganice heterogene la o scar cuprins
ntre nanometri (nm) i micrometri (m). Popularitatea SEM-ului e datorat
capacitii sale de a obine imagini aparent tridimensionale ale suprafeelor
unei game largi de materiale. Imaginile SEM sunt utilizate ntr-o mare varietate media, de la jurnale tiinifice la reviste de popularizare i filme. Dei
principala lui utilizare este de a obine imagini topografice la o mrire cuprins ntre de 10-10000 de ori, SEM-ul are o adaptabilitate mare.
338
La SEM, suprafaa de examinat sau microvolumul de analizat este iradiat cu un fascicol ngust de electroni, care poate fi trecut n raster (linie cu
linie) deasupra suprafeei specimenului pentru a forma mai multe imagini,
sau care poate fi static pentru a obine analiza unei singure poziii. Tipurile
de semnale rezultate din interaciunea fascicolului cu prob includ electroni secundari, electroni reflectai, raze X caracteristice i ali fotoni cu
energii variate. Aceste semnale se obin din emisii de volum specifice probei i pot fi folosite pentru a examina multe caracteristici ale probei (topografia, cristalografia, compoziia etc.).
Semnalele de imagine de cel mai mare interes sunt electronii secundari
i reflectai, pentru c acetia variaz n primul rnd datorit diferenelor
topografice. Emisia de electroni secundari, regsii ntr-un volum foarte mic
n apropierea zonei de impact a fascicolului, aleas la diferite valori ale
energiei razei de electroni, permite formarea de imagini la o rezoluie apropiat de cea a mrimii fascicolului de electroni. Aparena tridimensional a
imaginii se datoreaz unei adncimi mari a cmpului microscopului electronic, precum i efectului de umbr dat de contrastul electronilor secundari i reflectai.
La SEM, se emit i raze X caracteristice, ca i rezultat al bombardamentului de electroni. Analiza acestor raze emise de ctre prob poate scoate n
eviden att caracteristici calitative ct i informaii cantitative de element,
din regiuni ale unui specimen avnd mrimea de 1m n diametru i 1m
n adncime (n condiii normale de operare). Evoluia SEM-ului i capacitile specifice ale instrumentelor comerciale moderne se vor discuta n cele
ce urmeaz.
Capaciti de imagistic
Microscopul electronic scanning este unul dintre cele mai versatile instrumente disponibile pentru examinarea i analizarea caracteristicilor
microstructurale ale obiectelor solide. Un motiv puternic pentru utilitatea
SEM-ului este rezoluia mare ce poate fi obinut cnd sunt examinate obiecte voluminoase; rezoluii instrumentale cu ordin de 1-5 nm (10-50 ) se
folosesc azi ca rutin la instrumente comerciale.
O alt caracteristic important a SEM-ului este adncimea cmpului,
care e cea responsabil n parte pentru aparena tridimensional a imaginii
specimenului. Cu ct e mai mare aceast adncime a cmpului cu att se
furnizeaz mai multe informaii despre specimen, aceast calitate a
SEM-ului fiind cea mai apreciat de ctre un utilizator. Cele mai multe
micrografii SEM se efectueaz la mriri sub 8000 de ori, unde aparatul ope339
nului este dintr-o dat rsucit la un unghi de 70 fa de orizontal. Intensitatea modelului reflectat Kikuchi este relativ mic, precum i contrastul
semnalului, de aceea e nevoie de camere ultrasensibile i senzori fini de
captare a contrastului. Cea mai recent descoperire n aplicaia modelului
Kikuchi la volume de analizat este dezvoltarea sistemului de nregistrare a
modelului folosind o camer video de nalt sensibilitate sau mai recent o
camer video tensio-cuplat (CCD). Aceste pattern-uri sunt mai apoi analizate printr-o metod de indexare asistat de computer. Indexarea automat
a modelelor i cartarea orientrii straturilor de cristale asistat electronic
permite identificarea fazelor de cristalizare i arat orientarea greit printre limitele cristalelor.
Analiza elemental
SEM-ul poate fi utilizat pentru a obine informaii legate de compoziie
folosind razele X caracteristice. Dezvoltarea unui instrument de analiza
chimic localizat a probelor solide (EPMA) s-a produs deodat cu apariia
SEM-ului.
Conceptul unui microanalizator electronic de probe a aprut n anii
1940 (Hillier, 1947), i de abia n 1949 R. Castaing sub ndrumarea lui
A.Guinier au descris i construit un instrument numit ,,microsond electronica(Castaing, 1951). n teza sa de doctorat, Castaing nu numai c a
demonstrat c o analiz chimic localizat poate fi desfurat pe suprafaa
specimenului, dar a i subliniat modul n care aceast informaie poate fi
cuantificat. Recunoaterea complexitii transformrii intensitii razelor X
n compoziie chimic a dus la perfecionarea analizei cantitative de ctre
numeroi investigatori pe parcursul ultimilor 50 de ani.
n timpul anilor 1950 cteva aparate EPMA au fost dezvoltate n laboratoare din Europa i S.U.A., iar primul aparat comercial a fost introdus de
CAMECA n Frana n 1956. Optica electronic era format dintr-un tun
electronic urmat de lentile convergente ce formau o sond electronic cu un
diametru de 0,1- 1 m pe specimen. De asemenea mai fcea parte din aparat i un microscop optic pentru gsirea corect a punctului de analiz i
una sau mai multe spectrometre WDS pentru analizarea intensitii radiaiei X emise n funcie de energie.
Cosslett i Duncumb (1956) au construit primul microanalizor electronic scanning de probe la Laboratoarele Cavendish n Cambridge. Dac pn atunci microprobele electronice operau cu fascicole statice de electroni,
cei doi oameni de tiin treceau fascicolul brusc pe suprafaa probei, aa
cum se face azi n SEM-rile actuale. Dei conceptul de analiz local cu raze
X este n sine un stimulent pentru folosirea microanalizatorului, adugarea
343
346
Microscopia electronic
- partea a II-a
ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran
Cuprins
1. Microscopia electronic de transmisie................................................................................. 349
2. Microscopia electronic de baleiaj ....................................................................................... 359
res. Exist, de asemenea, posibilitatea perfuziei esuturilor cu fixator, respectiv introducerea fixatorului n circulaie, asigurndu-se astfel o rspndire rapid a acestuia la nivelul esuturilor. Glutaraldehida este primul
fixator utilizat curent, deoarece este mai puin toxic, permite o mai uoar
manipulare a preparatului, ptrunde mai uor i acioneaz rapid asupra
ultrastructurii preparatului.
Dup obinerea cuburilor de esut, acestea sunt trecute n tuburi de sticl i pstrate timp de 15-30 minute n 1-1,5 ml glutaraldehid. Dup 15-30
minute se schimb glutaraldehida i se continu fixarea timp de nc 1-2-3
ore n funcie de consistena esutului.
Glutaraldehida [O=CH-(CH2)3-CH=O] are proprietatea de a lega gruprile active de hidrogen, n special de la alcooli i gruprile amino- (din
moleculele proteice) i imino-, formnd puni ncruciate i puni intermoleculare, conferind astfel o mare stabilitate structurilor celulare cu care vine
n contact. Prin urmare va prezerva foarte bine ultrastructura celular i
activitatea enzimatic a celulelor.
Glutaraldehida pur prezint un singur vrf de absorbie n UV, la 280
nm. Dac este inut la temperatura camerei, n soluie apar polimeri ai
glutaraldehidei, care vor avea un nou vrf de absorbie la 235 nm. Deci
glutaraldehida 25% (sau 50%) stoc se va pstra numai la frigider, prepararea soluiei 2,7% se va face extemporaneu, iar fixarea se va face la 4C.
Tuburile de sticl cu care se lucreaz vor fi foarte curate (bine splate
cu detergent i amestec sulfocromic, urmate de splare abundent cu ap
distilat). Ele se acoper cu dop (de cauciuc rezistent) care nu se va frmia sub aciunea substanelor ce se vor folosi. Glutaraldehida se utilizeaz
n soluie apoas 2,7% preparat extemporaneu dup reeta:
- Glutaraldehid (25%) pentru microscopie electronic
- Tampon fosfat 0,1 M pH 7,4
- Ap distilat
Tamponul fosfat 0,1 M se prepar dup reeta:
350
- NaH2PO4 H2O
(NaH2PO4 2H2O)
- Na2HPO4 anhidru
(Na2HPO4 12H2O)
1,37 g
(1,56 g)
7,154 g
(18,036 g)
- ap distilat
Pn la 500 ml
2 ml
10 ml
4,2 ml
B. Splarea
Dup prefixare, este foarte important a se nltura prin splare orice
urm de glutaraldehid, ale crei reziduuri vor mpiedica legarea osmiului.
Prin reacia posibil ntre cele dou substane fixatoare aplicate succesiv,
poate rezulta un precipitat electron-dens care duneaz calitii preparatului. n plus, dac urmele de aldehide nu sunt eliminate din esut, la
post-fixare lipidele din membrane nu se vor fixa bine cu OsO4.
Dup ndeprtarea glutaraldehidei se adaug peste piese (care nu vor
rmne niciodat neacoperite) tampon fosfat 0,1 M, pH 7,4 n 4 bi succesive
a cte o or (n a patra baie piesele se pot ine peste noapte). Dac prefixarea s-a fcut la frigider, i splarea se va face n aceleai condiii.
C. Postfixarea
Postfixarea se realizeaz cu tetraoxid de osmiu (OsO4) 1-4% n funcie de
consistena esutului de studiat. Rolul acidului osmic este de a stabiliza att
proteinele ct i bistraturile lipidice, dar i de a mri contrastul la nivelul
ultrastructurii esutului, pe care o coloreaz prin depunerea osmiului. Dup nlturarea tamponului fosfat, n tuburile cu piesele prefixate i splate
se adaug cel de-al doilea agent fixator, i anume, o soluie 1% (sau 2%) de
OsO4 n Tampon Fosfat 0,15 M, pH 7,4, pentru 15 minute. Se nltur aceast soluie, se adaug o soluie proaspt de OsO4 n care piesele vor mai sta
timp de 85 minute.
Tamponul fosfat 0,15 M se prepar dup reeta:
- NaH2PO4 H2O (NaH2PO4 2H2O)
2,064 g (2,366 g)
- Na2HPO4 anhidru (Na2HPO4 12H2O)
10,765 g (27,139 g)
- ap distilat
Pn la 500 ml
D. Splarea
Dup terminarea procesului de fixare pe cale chimic trebuie s urmeze imediat splarea pentru nlturarea total a excesului de fixator din esut. n cazul fixrilor succesive duble, splarea trebuie efectuat dup fiecare fixator folosit. Prezena urmelor de fixator n esut faciliteaz reacii ntre
acesta i soluiile de solveni organici folosite la deshidratare, cu urmri
asupra polimerizrii blocurilor la includere. Dup ndeprtarea
tetraoxidului de osmiu se adaug peste piese (care nu vor rmne niciodat
neacoperite) Tampon Fosfat 0,15 M, pH 7,4, n 4 bi succesive de cte o or
(n a patra baie piesele se pot ine peste noapte). Dac fixarea s-a fcut la
frigider, i splarea se va face n aceleai condiii.
DESHIDRATAREA
n vederea includerii pieselor (pentru a se putea efectua seciunile
ultrafine) se utilizeaz rini epoxidice: Vestopal W sau Epon 812 care sunt
substane organice hidrofobe. Deci, pentru o ct mai bun includere, este
necesar ca toat apa introdus n timpul splrii n piese s fie extras fr
a produce modificri n structura molecular a celulelor.
Pentru deshidratare se utilizeaz acetona (pentru epon se poate folosi i
alcoolul etilic) i n unele cazuri oxidul de propilen, dioxan sau toluol n
etapele finale, n soluii apoase de concentraii cresctoare:
30% timp de 15 minute;
50% timp de 15 minute;
70% timp de 30 minute;
80% timp de 30 minute;
90% timp de 30 minute;
100% (anhidr) timp de 15 minute;
100% (anhidr) timp de 15 minute;
100% (anhidr) timp de 15 minute;
La includerea n Epon 812 pot urma dou bi de oxid de propilen de
cte 15 minute fiecare. Extragerea apei se face treptat i n timpi scuri pentru ca procesul s nu fie nsoit de alterri structurale (eventuale extracii de
proteine din esut). Pn la concentraia de 70% se lucreaz la temperatura
de 4C dup care tuburile vor putea fi pstrate la temperatura camerei.
Cantitatea de soluie folosit pentru fiecare etap de deshidratare trebuie s
fie de 2-5 ml n funcie de numrul pieselor din fiecare flacon. Cnd se
ajunge la etapele finale, nlocuirea solventului trebuie fcut foarte rapid,
deoarece alcoolul sau acetona se evapor uor i piesele pot suferi procese
352
15 g
150 mg
8 picturi (0,4 ml)
ml
66
100
Soluia B (d duritatea)
Epon 812
NMA (anhidrida metil-nadic)
ml
100
84
100-200
300-400
500
600
650-700
Galben intens-maroniu
Maro
Maro albstrui
Albstrui
Verde
700-800
800-850
900-1000
1000-1100
1300-1500
357
2,6 g
20 ml
Se pipeteaz acetatul de uranil n godeurile unei plci de parafin (cear), dup care s-au lsat grilele cu seciunile n jos pe picturile de contrastant. Se in grilele pe acetat de uranil 15-20 minute dup care se spal la jet
de piset cu ap distilat-alcool i se iau pe hrtie de filtru spre a nu adera
la vrful pensei fine cu care se lucreaz.
B. Contrastarea cu citrat de plumb.
Se pipeteaz citratul de plumb n godeurile plcii de parafin (cear),
dup care se las grilele cu seciunile n jos pe picturile de contrastant. Se
in grilele pe citratul de plumb maxim 9 minute (timp dup care apar precipitate), dup care se spal la jet de ap distilat. Pentru evitarea apariiei
precipitatelor (reprezentate de carbonatul de plumb ce apare la contactul
citratului de plumb cu CO2 atmosferic), se va evita contactul contrastantului cu aerul atmosferic. Cel mai bine este s se foloseasc o soluie proaspt preparat, filtrat, iar colorarea s se fac n apropierea ctorva granule
de NaOH care s absoarb CO2.
Soluia de citrat de plumb se prepar dup reeta:
Citrat de plumb (GM 1053,85)
1,410 g
8 ml
Se completeaz pn la 50 ml
361
Temperatura critic
(oC)
HIDROGEN
-234,5
OXIGEN
-118
AZOT
-146
DIOXID DE CARBON
+31,1
MONOXID DE CARBON -141,1
AP
+374
Presiunea critic
(atm)
20
50
33
73
36
219
Deci, CO2 rmne cel mai utilizat mediu pentru deshidratarea la punct
critic i este numit fluid de tranziie. Nefiind miscibil cu apa, apa din proba
biologic trebuie nlocuit cu un alt fluid miscibil cu CO2. Acest fluid intermediar, de regul, schimb apa din esut i este miscibil cu CO2, dei se
pot utiliza i variante cu dou fluide intermediare.
naintea acestor etape se realizeaz fixarea probei, tipic pentru microscopia electronic, procedura glutaraldehid osmium.
Aa cum s-a menionat, stadiul intermediar implic deshidratarea probei biologice cu ajutorul lichidului intermediar:
(proba umed) H2O > Aceton > CO2 > DPC (proba uscat)
362
Specimenul este trecut prin diferite concentraii cresctoare ale fluidului intermediar, culminnd cu nlocuirea complet a apei din esut cu acest
fluid, deoarece prezint o tensiune superficial foarte sczut, fiind mai
puin susceptibil deformrilor datorate evaporrii fluidului de tranziie ce-l
va nlocui.
_______________aceton________________________
H2O > 30% > 50% > 60% > 70% > 80% > 90% > 100% > CO2
------------------- cte 10 minute fiecare --------------------- - trei schimbri
FLUIDE INTERMEDIARE / DESHIDRATANTE
Substana
ETANOL
ACETON
FREON (113)
AP
23
24
19
73
Cnd scopul analizei nu este achiziia unui spectru de raze X, aurul este
cel mai utilizat element pentru acoperirea probelor. Acoperirea se realizeaz prin evaporarea metalului n vid, ce presupune legarea metalului la polul pozitiv i a probei la cel negativ, la capete aplicndu-se o tensiune continu de 1 3 kV, dispozitiv instalat ntr-o incint ce menine un nivel de
vacuum (10-2 Pa) suficient pentru a asigura o depunere a atomilor de aur
ntr-un strat uniform i foarte subire, de cteva sute de nanometri.
EXAMINAREA DIFERITELOR PROBE IN SEM
Probele pentru examinarea n SEM sunt montate pe suporturi conductive din cupru cu ajutorul unor discuri de carbon adezive pe ambele fee.
Orientarea probei pe suport n aceasta faz este foarte important, innd
cont de posibilitatea limitat de nclinare a probei n microscop, aa nct
zona de interes s fie expus direct fasciculului de electroni ce baleaz proba. Astfel, montarea probelor se va realiza sub lupa binocular unde, probe
de tipul microfosilelor (foraminifere) sau segmente de aparate bucale, antene, palpi (insecte), pot fi aranjate n ordine pe un singur suport. Pulberile,
sporii sau alte probe ce nu pot fi manipulate cu pensa, vor fi presrate pe
suportul adeziv, surplusul fiind ndeprtat n momentul introducerii n vid
pentru metalizare. Probe biologice de tipul insectelor chitinoase, precum i
cele cu un coninut nesemnificativ de ap (frunze uscate) pot fi montate pe
suport i metalizate fr deshidratare, n timp ce, la celelalte probe este
obligatorie uscarea la punct critic pentru prevenirea deformrilor datorate
unei deshidratri brutale n aer, abia apoi realizndu-se acoperirea cu metale a acestora.
Probele astfel pregtite se introduc n microscop si se examineaz la diferite mriri, imaginile fiind preluate n format digital sau clasic pe film.
O anex important a SEM este sistemul de microanaliza elemental cu
raze X (EDX). Detectorul special al EDX identific, pe baza radiaiei X (specific fiecrei specii chimice) generate din prob, compoziia chimic a probei analizate att calitativ ct i cantitativ, putndu-se realiza chiar hri cu
distribuia fiecrui element chimic n zona luat n studiu.
364
mai mic de 10 um. Tehnologia SPM are la baz un concept simplu: scanarea unei suprafee cu ajutorul unui vrf (tip) foarte ascuit (sharp, vrf cu
raza de curbur de circa 3-50 nm, Figura 1).
Acest tip este ataat de o grind (cantilever) flexibil, astfel nct s
poat fi urmrit profilul suprafeei scanate. n funcie de mecanismul de
interaciune dintre prob (vrf, tip) i eantionul scanat, se definesc tehnicile SPM. n prezent, cele mai multe sisteme SPM utilizeaz un fascicol laser
pentru a determina deflexia cantilever-ului. Acest fascicul laser se reflect
de partea opus tip-ului (fabricat din Si sau Si3N4) pe un fotodetector sensibil la poziie (Figura 2).
Cu ajutorul unui astfel de sistem de
detecie este posibil msurarea indirect a forei dintre tip i suprafaa
eantionului studiat. Pentru a calcula
fora de interacie utilizm legea lui
Hook (F = kz), unde k este constanta de
elasticitate a cantilever-ului, iar z este
distana pe care cantilever-ul a suferit o
Figura 2. Detecia deflexiei cu ajutorul
deflexie. Cunoaterea acestor fore este
unui fascicul laser i a unui fotodetector.
important pentru interpretarea imaginilor SPM sau pentru a determina proprieti mecanice locale ale eantionului.
Un alt element de baz al unui SPM este scanner-ul piezoelectric. De
performanele mecan- electrice ale scanner-ului piezoelectric depind n ceea
mai mare msura performanele ntregului SPM. Mai mult, se poate spune
c este singurul element puternic limitativ n evoluia viitoare a microscopiei mecanice. Scanner-ul SPM este realizat din material piezoelectric
(PZT) care se expandeaz i contract proporional cu tensiunea aplicat,
respectiv cu polaritatea acesteia. De regul, scanner-ul este construit sub
forma unui tub (Figura 3) cu electrozi pentru deplasarea pe X, Y i Z
iar cu ajutorul lui se poate poziiona
proba (tip-ul) cu extrem precizie n
3D (3 Dimensiuni).
Scanner-ele sunt caracterizate
Figura 3. Scanner piezoelectric de forma
prin sensibilitatea lor (raportul dintre
tubulara.
deplasarea pe o direcie i tensiunea
aplicat pe acea direcie) adic, att ct se extinde sau contract un material
piezoelectric per volt. Pentru valori mari ale tensiunii, deplasarea nu este
366
370
Tabelul 1.
Mod de Operare
contact mode
non-contact mode
intermittent contact mode
lateral force mode
magnetic force
thermal scanning
Fora de Interacie
puternic de respingere fora constant sau distana constant
slab de atracie - vibrarea probei
puternic de respingere - vibrarea probei
forele de frecare exercit o torsiune a cantileverului folosit n scanare
cmpul magnetic de la suprafaa eantionului
poate fi vizualizat
distribuia conductivitii termice pe suprafaa
eantionului este vizualizat.
eantioanelor biologice (proteine, ADN, cromozomi, bacterii). De asemenea, este frecvent utilizat n studierea suprafeelor n industria electronic
(Silicon wafers, medii de stocare a datelor, circuite integrate), precum i n
studierea unor nanostructuri (suprafaa polimerilor, reele de difracie, ceramici, rini naturale).
Modul de lucru AFM trebuie ales n funcie de caracteristicile ce prezint
interes n investigare, precum i de natura suprafeei eantionului. Modul
contact este o bun alegere pentru suprafeele dure, de exemplu, dar nu este
o alegere potrivit pentru suprafeele moi, deoarece poate produce o contaminare a tip-ului sau poate ndeprta material de pe suprafaa eantionului.
Dac alegem un contact apropiat atunci AFM-ul va deveni foarte sensibil la
zgomote (vibraii) externe, dar va deforma mai puin sau deloc eantioanele
moi. Murdria i efectele de capilaritate induse de apa de pe suprafaa eantionului vor avea un rol dominat si, n final, vor degrada calitatea imaginii
obinute. Modurile AC (cu vibrarea probei) sau intermitente au fost imaginate pentru a investiga suprafaa unor eantioane biologice.
Performanele unui AFM sunt limitate de un numr de factori dintre
care amintim: capacitatea elementelor mecanice de a muta tip-ul cu precizie i de a msura poziia acestuia, calitatea tip-ului, liniaritatea scanner-ului i vibraiile ambientale. Marii productori de echipamente de microscopie mecanicp au reuit n ultimul timp s elimine o mare parte din
limitrile anterioare prin mbuntirea componentelor mecanice i electronice. Calibrarea automat tridimensional a uurat mult munca operatorului, nct multe din articolele tiinifice de ieri au devenit azi automatizare.
Reinem din aceste timpuri istorice cteva distorsiuni induse de forma
tip-ului care merit nelese. La rezoluii ridicate, imaginea obinut este
practic convoluia dintre forma tip-ului i morfologia local. n aceste situaii, este important cunoaterea formei tip-ului (geometria acestuia) pentru
o interpretare corect a imaginilor obinute.
Distorsiuni ale imaginii induse de prob. Pentru a vizualiza atomi
sau molecule este necesar ca interaciunea s fie numai ntre tip i
atomul/molecula cea mai apropiat (acest lucru se poate realiza
pentru rezoluia atomic numai n tehnologia STM). Acest lucru nu
este posibil n cazul AFM i este limitat att fizic (Van der Waals),
ct i tehnologic prin limita de ascuire a tip-ului. Aa c, n general,
ceea ce vedem ntr-o imagine AFM este mai degrab o imagine mediat a morfologiei suprafeei eantionului.
Restaurarea Imaginii (Deconvoluia Probei). Vizualizarea cu AFM a
suprafeelor pentru eantioane cu relief nalt implic utilizarea unui
372
Figura 5. Nanolitografie vectorial de la procedeu (a) la rezultat (b), litografie AFM (5 um).
373
Un alt exemplu de nanomaipulare este prezentat n figura 7 a unor particule de latex cu diametrul de 100 nm ntr-o structur complicat.
374
AFM-ul ca nano robot este extrem de util n nanomaipularea unor celule sau molecule, n special nanomanipularea moleculelor ADN. Aceste molecule cunoscute de mai mult de o jumtate de secol au atras atenia, n ultimul timp, pentru aplicaii n nanotehnologie, cum ar fi realizarea unor
circuite electronice (motivat de studierea proprietilor electrice). Molecula de AND are un diametru de circa 2.4 nm i este n esen o structur
scurt (3.6 nm) care se repet.
Dup aproximativ 15 ani de controverse relativ la mecanismul de conducie (transfer de sarcin) este acum bine demonstrat dependena de distan (tunelarea ntr-un singur pas sau hopping termic mai muli pai).
Ambele mecanisme (tunelarea sarcinii, hopping termal) au fost studiate i
verificate indirect experimental. n acelai timp, n literatura de specialitate
ADN-ul rmne pentru moment un subiect neelucidat, unele rezultate sugereaz c avem un bun conductor (chiar supraconductor la temperaturi
joase), alte rezultate l prezint ca fiind un semiconductor, iar altele ca un
izolator. Elucidarea acestor situaii nu se poate face dect prin experiene de
nanomanipulare a ADN-ului; un exemplu este prezentat n figura 8.
mite, n unele situaii, eantionul. Un alt avantaj este posibilitatea de a investiga eantionul n condiii ambientale, lucru foarte important pentru
eantioanele biologice, asigurnd n principiu o rezoluie mai bun dect
SEM, comparabil cu rezoluia unui TEM (Transmission Electron
Microscopy).
Marele dezavantaj al AFM fa de SEM se refer la aria scanat, care n
cazul SEM este de ordinul milimetrilor, cu posibilitatea de scanare simultan a unor arii diferite, toate acestea la o vitez mult mai mare. Datorit faptului c timpul de scanare n cazul AFM-ului este mare, drift-ul termic poate induce distorsiuni pe imagine, fcnd lipsit de precizie msurarea unor
structuri. Aceste limitri sunt un subiect fierbinte n cercetarea instrumental din acest domeniu i cteva succese au fost obinute prin utilizarea n
paralel a mai multor cantilevere sau, mai recent, AFM cu rata de scanare
video.
Imaginile obinute cu AFM pot fi, de asemenea, distorsionate de efectul
de hysteresis al materialului piezoelectric, precum i de efectele de mixare
ntre axele X,Y,Z care necesit refacerea n software a imaginii. Din pcate,
aceast post-filtrare poate elimina unele caracteristici ale eantionului.
Aceste limitri au fost eliminate n cazul microscoapelor AFM moderne
prin scannere n bucla nchis sau scanner-e ortogonale.
La fel ca i n orice alt tehnic bazat pe realizarea de imagini este posibil apariia de artefacte care pot fi induse de tip-ul instabil sau mediul
ambiental impropriu sau chiar de eantionul studiat. Este, de asemenea,
bine cunoscut limitarea puternic indus de existent pe eantion a unor
perei drepi sau anuri foarte adnci i nguste a cror morfologie nu poate fi pus n eviden dect prin utilizarea unor tip-uri speciale i extrem de
scumpe.
8. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
376
5.
377
Scanning
electron
microscope
Transmission
electron
microscope
Atomic force
microscope
Electron
scattering
Electron
absorption
Forces of probe-sample
interaction
Range in XY
Light absorption
(diffraction,
polarization, scattering
etc) or fluorescence
200nm 1mm
1nm-10 mm
1-100m
1-200 m
Range in Z
500nm 10 mm
What is
studied
Complicated
sample
preparation
Mechanism
of contrast
formation
378
0.5-20 m
optical slice
10 nm-1 mm limited by
ultratome
(10 nm-1 m)
surface
real thin slice
optional
necessary
optional
necessary
surface
380
bun calitate, cu un mai bun raport semnal zgomot, cu o mai bun liniaritate n sistemul de msur, adic toate mrimile fizice istorice se regsesc n
final n calitatea imaginii. n acest sens, sunt prezentate n continuare, prin
imagini, exemple cu ceea ce poate vedea un SPM (Figura 1.3).
SPM-ul a fost primul echipament (STM) care a pus n eviden atomii i
acest lucru este posibil fr echipamente complexe pe eantioane cu rugozitate sczut (monostrat atomic). n Figura 1.2 se poate vedea la rezoluie
atomic o latice de MoTe2, respectiv HOPG. De mare interes sunt imaginile ce pot fi obinute pe eantioane biologice, dat fiind interesul crescut pentru biologie i biotehnologii. n acest sens, SPM are un rol bine definit prin
capacitatea sa unic de a putea asigura o rezoluie ridicat pentru eantioane superficial pregtite (Figura 1.3). De asemenea, capacitatea de
nanomanipulare simultan a
acestor eantioane asigur premisele unui nano laborator
ntr-un singur echipament. Lrgirea platformei cu elemente
specifice microscopiei optice,
SNOM i spectroscopiei Raman
ntregete aceast tehnic modern.
Interaciunea dintre sond
(tip) i eantion, baza funcionrii SPM-ului, este exploatat i n
spectroscopia local de distan.
ntr-o msurtoare local, este
uor de pus n eviden curba
for distan atunci cnd o
legtur specific apare. Dup
cum se poate vedea n Figura
1.4, dou situaii distincte pot fi
observate n interaciunea dintre
sond (tip) i eantionul studiat:
a) nu exist o adeziune la
suprafaa eantionului;
b) ntre sond i suprafaa Figura 1.4. Nu exista adesiune (jos), adesiune intre
sonda si suprafta esantionului.
eantionului, ntr-o poziie dat (x,y), este pus n
eviden o adeziune.
381
Bazat pe observaia anterioar, se poate imagina un sistem de recunoatere molecular, plecnd de la tria adeziunii pentru o situaie dat; sonda
funcionalizat (molecula
ligant) interacioneaz cu
un eantion biologic special preparat. n Figura 1.5
este reprezentat schematic
un astfel de experiment
care printr-o tehnic specific permite discriminarea
unor receptori pe suprafaa unei celule. n general,
fiecare experiment n care
este implicat SPM ul, din
Figura 1.5. Discriminarea unor receptori pe suprafaa unei
perspectiva utilizrii acescelule.
tuia, are multe elemente
particulare care, n final, depind n mod esenial de experiena utilizatorului. Cu toate acestea, avem cteva reguli generale, cum ar fi: a) celula este
un sistem prea labil pentru a putea observa o singur protein pe suprafaa
ei; b) acest lucru este dificil i n cazul unei topologii moleculare. Tehnica
sond-ligant i analiza unei situaii particulare prin intermediul curbelor
locale for distan sunt de mare folos n diferite experimente de recunoatere a proteinelor.
Progresele recente privind rezoluia spaial a tehnologiei AFM au fcut din obinerea unor imagini topografice a unei singure proteine o operaiune de rutin. Sunt nc dificil de recunoscut proteine specifice, cum sunt
receptorii, numai pe baza acestor informaii topografice.
Deoarece interaciunea dintre liganzi i receptori este foarte specific,
tehnica funcionalizrii cu anumite biomolecule (proteine, proteoglicani,
glicani, acizi nucleici) a unui vrf AFM a deschis o cale promitoare pentru
recunoaterea unor molecule particulare. S-a dovedit c receptori independeni pot fi recunoscui de un vrf AFM funcionalizat cu anticorpi, printr-o
tehnic de cartare a forei. Toate aceste rezultate au fost obinute prin observarea unor probe corespunztor preparate pe suprafee substrat i nu n
condiii fiziologice.
Platforma Integrat pentru Nanotehnologii combin toate tehnologiile
cunoscute n Scanning Probe Microscopy (SPM) ntr-un singur produs, genernd astfel un nou i performant echipament n acest domeniu. Sistemul
NTegra produs de NT-MDT Inc. este cel mai recent echipament i singurul
382
383
in air and
liquid
in air only
Sample size
in air
in liquid
Scan Range
Temperature control
(for operation in fluid
environment )
Range
Stability
O pagin help bine documentat cu descrierea funciilor de baz i cteva exemple de utilizare asigur accesul utilizatorului la semnale de baz
din sistem. Ntegra Vita are facilitai de excepie pentru investigarea de probe biologice cum ar fi: incinte nchise/deschise stabile chimic care pot opera cu discuri Petri, controlul temperaturii pentru lichide, diverse tipuri de
nclzitoare pentru lichid i msurarea probelor biologice cu schimbarea
lichidului cu flux controlat pe parcursul experimentului, sau ntre experimente.
384
2. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
385
388
389
Vizualizarea 3D nu este ntotdeauna cea mai bun soluie pentru suprafee cu mici denivelri; de regul o vedere prin pseudo-culoare este superioar unei vizualizri 3D prin umbre. Acest lucru este adevrat din dou
considerente: pseudo-colorarea dedic ntreg domeniul de intensitate
adncimii i sunt, de asemenea, netezite micile fluctuaii cauzate de zgomotul coninut n imaginea suprafeei. Pentru caracteristicile care sunt semnificative numai prin diferena mare de nlime fa de suprafaa imaginii,
imaginile pseudo-colorate au dedicat ntreg domeniul de intensiti pentru
a evidenia aceste diferene. Folosirea umbrelor este echivalent cu desenarea suprafeei, utiliznd numai o lumin ambiental cu intensitatea funcie
de nlime. Aceast tehnologie poate lucra bine pentru imagini lipsite de
zgomot, dar imaginile din lumea real conin ntotdeauna zgomot. Pentru
imaginile SPM, o suprafa plat are un mare coninut de zgomot i acesta
este exprimat ca o fracie, din caracteristicile imaginii. Acest zgomot va determina o fluctuaie a iluminrii caracteristicilor cu aceeai magnitudine,
uneori reuind, din pcate, s le fac neobservabile.
De asemenea, micile caracteristici de pe suprafa coninute n alte mari
variaii sunt mai bine puse n eviden prin utilizarea unei hri de culoare
i iluminarea puternic a suprafeei 3D (acestea ar fi imperceptibile ntr-o
reprezentare 2D). Abilitatea cercettorului de a recunoate structuri moleculare specifice n prezena zgomotului este mbuntit prin vedere stereoscopic, grafica 3D bazat pe umbre cu hri de culoare iluminate puternic. Asigurnd afiarea stereoscopic i nu cea monoscopic, pentru
cercettor este mai uor s perceap adncimea obiectelor virtuale apropiate. Percepia spaial 3D a datelor SPM cu acuratee face posibil pentru
cercettor utilizarea cunotinelor sale tiinifice la recunoaterea unor
structuri i caracteristici de interes.
Este neateptat s ne imaginm c putem acum oferi posibilitatea cercettorului nu numai de a vedea nano suprafee cu ajutorul SPM, dar s i acioneze asupra lor i s le ating. Conceptual, acest sistem este echivalent cu
un sistem tele-robotic care opereaz ntre dou scale foarte diferite, spre deosebire de sistemele tele-robot utilizate n chirurgie. Noi utilizm o interfa
haptic cu feedback de for care sesizeaz poziia 3D a o-ring-ului SPIDAR
(cu capabiliti adiionale pentru a sesiza 3DOF grade de libertate) i aplic
forele de la nivel nano adecvat scalate n mna utilizatorului. Poziia
o-ring-ului n spaiu poate controla diferite caracteristici afiate, cum ar fi
controlul unghiului de vizualizare a suprafeei. De asemenea, pe perioada
modificrilor suprafeei, un feedback de for asigur un control intuitiv al
probei i permite sesizarea contururilor de pe suprafa. Aceast abilitate
390
Figura 3.3. Interfata SPIDAR in timpul unei operatii de recunoastere haptica a unei structuri create
anterior prin nano-manipulare.
Nevoia de noi experimente i dezvoltarea de algoritmi care pot mbunti percepia n lumea de scal nano prin stimulare n timp real vizual,
audio i haptic este un domeniu fascinant de cercetare. Feedback-ul de for
captureaz procese din SPM i acest lucru este denumit n literatura explorare haptic a nano-obiectelor. Explorarea haptic a nano-obiectelor se
refer n esen la micarea minii, utilizat de cercettor pentru a percepe
un nano-obiect. Gesturile utilizate de cercettor pentru a percepe caracteristicile unui nano-obiect au o structur logic i asigur nelegerea caracteristicilor unui nano-obiect. Captura vizual SPM poate fi ajutat prin stocarea
profilului haptic sau de atingere al unui obiect sub forma miscrilor minii.
Odat ce un obiect a fost capturat vizual, n faza de antrenament, utilizatorul urmeaz s categoriseasc perceptual forma, dimensiunea, greutatea,
textura i materialul nano-obiectului haptic. Aceste modele computaionale
sunt dezvoltate pe baza modelelor neuropsihologice i cognitiv psihologice
ale analizei caracteristicilor vizual-haptice. Modelele computaionale sunt
dezvoltate la nivelul tehnologic actual ca i prototipuri vizual-haptice.
Aceste structuri de date care stocheaz att caracteristicile vizuale ct i pe
cele haptice ale obiectului sunt baza dezvoltrii unor cartografieri automate
dintre diferite caracteristici vizuale i haptice. Aceste prototipuri stocate
ntr-o baz de obiecte haptice mpreun cu strategiile de explorare haptic
392
4. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
393
394
I. Concepte de baz
1. Analiza de suprafa
Spectroscopia fotoelectronic a fost stabilit ca una din cele mai importante metode de studiu a structurii electronice a moleculelor, solidelor i
suprafeelor [1-2]. Mai mult, are pe scar larg implicaii practice n diferite
domenii ca de exemplu fizica i chimia suprafeelor sau tiina materialelor,
i a contribuit semnificativ la nelegerea principiilor fundamentale din fizica corpului solid [1-5].
Principiul fundamental al procesului de fotoemisie este prezentat
schematic n fig.1 Aceast figur simplificat arat atractivitatea spectroscopiei de fotoemisie, pentru c proprietile fotoelectronilor emii reflect
n principal strile electronice proprii ale sistemului investigat. n principiu
se poate face distincie ntre fotoemisia cu radiaie n ultraviolet (UPS) utilizat n principal pentru investigaii ale strilor din benzile de valent i
spectroscopia de fotoemisie cu raze X (XPS) care permite identificarea atomilor la suprafaa solidelor i determinarea deplasrilor n energiile de legtur ale core-level-urilor care sunt legate de diferite moduri de legturi
chimice, la energii de legtur mai mari. Aceast separare se bazeaz n
principal pe cele dou tipuri diferite de surs de excitare cvazi-monocromatic disponibile n laboratoarele de cercetare i anume: spectrul liniei
UV a lampei de descrcare pentru energii n domeniul de aproximativ
10-50 e.V. cu gaze rare ca heliu (He I: 21.23 eV si He II: 40.82 eV) i liniile
ceraracteristice ale unei surse de raze X care utilizeaz de obicei ca materiale pentru anod aluminiul (Al - K1,2: 1486.6 eV) sau magneziul (Mg K1,2:1253.6 eV). Dei lrgimea liniei este de obicei suficient de mic pentru
multe aplicaii, de ex. civa meV pentru lampa de descrcare i aprox. 1 eV
pentru anozii sursei de raze X, folosirea unui monocromator suplimentar
poate fi un avantaj att pentru energia de rezoluie ct mai ales pentru suprimarea background-ului i a intensitilor sateliilor care pot s apar n
spectru.
Electronii cu energia de legtura EB pot fi excitai deasupra nivelului E
de ctre fotoni cu energia h > EB + 0. Distribuia fotoelectronilor I(Ekin)
poate fi msurat de analizor i reprezint n prima aproximaie o imagine
a densitii strilor electronice ocupate N(EB) n proba analizat.
n general, suprapunerea dintre rezultatele experimentele de spectroscopie de fotoemisie i teorie este necesar pentru investigarea a numeroase
proprieti a strii solide, inclusiv dispersia benzii de valen magnetismul
395
= I ph * ,
unde
(1)
- fluxul fotonilor (sec-1); Iph - densitatea fotonilor (sec-1sr-1); - unghiul
solid (sr-1);
n prima aproximaie unghiul solid rezult din zona iluminat a probei
i distana dintre capilar i prob:
=
+ r2
R=
(2)
d2
d
(1 2d*cr )
(3)
1
e* r
, unde
(4)
d
I ph = I * dc / e * * r 2 *
1 2*r
(5)
Pentru o arie iluminat a probei de aprox. 2.22 mm diametru i un curent pe proba de 55 nA, densitatea fotonilor este calculat ca fiind:
Iph= 8.3 * 1015 fotoni sr-1sec-1
398
(6)
(7)
(8)
Emax= h * ,
(9)
(10)
Aceast diferen este egal cu distana de la A la B, adic limea spectrului cu E= constant n figura 4.
Prin urmare, funcia de lucru poate fi calculat folosind formula:
= h * (Emax - Emin)
(11)
399
Aceti electroni care sunt excitai i scap fr a pierde energie, contribuie la vrfurile caracteristice n spectru; cei care sunt supui unei mprtieri inelastice i sufer pierderi de energie, contribuie la fondul spectrului.
Odat ce fotoelectronul a fost emis, atomul ionizat trebuie s se relaxeze.
Acest lucru poate fi realizat prin emisia unui foton de raze X, cunoscut sub
400
(1)
Puterea de amplificare a planului de lentile poate fi selectat. Amplificarea este schimbat electric, conectnd la electrozii lentilelor voltajul optim. Valorile voltajului sunt dependente de voltajul spectrometrului U0 care
este preponderant egal cu Ekin - Epas + funcie de lucru. Ekin este negativ
pentru electroni i pozitiv pentru ioni.
Sistemul PHOIBOS poate funciona ntr-un nivel stabilit de ntrziere
(fixed retarding ratio FRR) sau n transmisie stabilit de analiz (fixed
analyzer transmission FAT). n modul FAT, voltajul aplicat pe emisfere
este dat de ecuaia:
Epas = (-q)kV
n modul FRR, energia de trecere are valoarea:
Epas = Ekin / R,
R fiind rata de ntrziere.
Mrimea real a suprafeei probei de analizat DS este n principiu dat
de ecuaia (1). Cu toate acestea, datorit aberaiei sferice a intrrii lentilei,
imaginea n planul de intrare este difuz. Gradul de difuzie crete, pentru o
amplificare dat, cu unghiul de recepie al intrrii lentilei. Aceasta nseamn c zona observat n planurile focale ale intrrii sistemului de lentile este
tot mai mprtiat cu creterea unghiului, rezultnd astfel dimensiuni mai
mari ale probei dect cele date de ecuaia (1). Din aceast cauz unghiul de
recepie al lentilei este selectabil prin modurile de amplificare, innd aberaia sferic la o valoare cunoscut i acceptabil.
Amplificarea nalt, (figura 9), este n mod special potrivit pentru studii de rezolvare spaial. Planul imaginii probei este n coinciden cu planul intrrii analizorului. Utilizatorul poate defini zona de recepie a analizorului cu ajutorul intrrii de tiere deoarece traiectoriile electronilor emii
406
de ctre prob sunt influenate de ctre cmpurile electrice din jurul probei,T1 avnd un potenial fix care este setat ca fond la schimbarea sursei de
alimentare. Datorit aberaiilor lentilei, razele care intr n lentil deprtate
fa de axa ei la unghiuri mari, pot s gseasc un drum spre intrarea analizorului. Cu o apertur iris, aceste raze rele pot fi eliminate. Mai mult, apertura iris poate fi utilizat pentru ajustarea unghiului de recepie a analizorului. Pentru analiza cu spoturi mici, o rezoluie lateral de pn la 100 m
este disponibil, utiliznd modul de amplificare nalt i apertur iris.
Modurile de amplificare au fost optimizate pentru a permite unghiuri
foarte mari de recepie pentru surse punctiforme cu transmisie puternic (moduri de transmisie punctiform). n aceste moduri, rezoluia unghiular este
realizat cu ajutorul aperturii iris n planul de difracie al sistemului de lentile.
Folosind irisul, rezoluia unghiular poate fi ncontinuu ajustat ntre 10 i
90 , meninnd zona de recepie a probei constant. Razele apropiate de axa
407
lentilei (raze paraxiale) sunt focalizate n focarul Gaussian. Razele care intr n
lentil la unghiuri mai mari, converg mai puternic. Discul cu cea mai mic
dezordine se afl unde tubul de raze emergente are cel mai mic diametru. Focalizri mici sub lentil, implic deplasarea discului de cea mai mic dezordine, n planul imaginii. De aceea este realizat un unghi mare de recepie, dar
rezoluia spaial este nrutit. Asta face ca modurile de transmisie punctuale s fie cele mai potrivite pentru AES, ISS i studii de sincroton.
Diametrul irisului
3.5 mm
7 mm
10 mm
13 mm
15.5 mm
17.5 mm
R0 =
R in + R out
= 150 mm
2
(2)
(3)
R in R out
= 0.9375
2R0 (Rout R in )
(4)
Aceste particule ajung pe S2, parcurgnd un arc de cerc de raz R0. Dac
HSA accept jumtatea unghiului pe direcia dispersiei, rezoluia HSA sau
FWHM (full width at half maximum), a liniei transmise Ean este dat de :
Ean
S 2
=
+
Epas 2R0 4
(5)
Epass Epass 2 ,
:
Ekin Ekin
(9)
Ekin
Epas
(10)
I Ekin ,
(11)
1
Ekin
(12)
I Epass 2
(13)
gura 10). Pe de alt parte, inelul de ieire este poziionat indirect prin intermediul inelului de intrare (vezi figura 11). Prin acest aranjament se pot alege puterile de intrare i ieire independent, folosind acelai sistem rotaional.
Analizorii PHOIBOS, ncepnd cu ieirea 5, au 8 tieri de intrare i 2 de
ieire n configuraia standard. Poziiile tierii de intrare sunt indicate cu
numere (1-8) pe cadranul rotaional exterior. Poziiile tierilor de ieire sunt
indicate cu litere (A-B, sau A,B sau C). Aceti indicatori corespund celor care
apar n setrile programului de control al analizatorului SpecsLab2. Cnd
deschiderea intrrii i ieirii este schimbat, poziiile trebuie introduse n
zona de editare a datelor. Aranjamentul propriu-zis n analizor apare n seciunea de tiere a programului de control livrat mpreun cu analizorul.
413
R R0 Ek Epass D
=
R0
E pass
R0
(16)
(17)
Valoarea experimental determinat pentru dispersie poate fi puin diferit, n principal datorit cmpurilor de refringen existente pe marginea
analizorului.
Detecia multicanal se realizeaz aranjnd corespunztor 9 CEMs (multiplicator de electroni cu canale) ca i colectori, cu 9 ieiri de tiere n cercuri
concentrice n planul de ieire. Distana radial ntre ieiri de tiere vecine
R, este selectat pentru a corespunde cerinelor unei diferene de energie
cinetic constant ntre canalele vecine Ek. Numrul particulelor Nn care
sosesc la fiecare colector Cneste numrat separat, iar aceste numere sunt
stocate i procesate ntr-o unitate de achiziie a datelor.
Schimbnd tensiunea spectrometrului U0, traiectoria electronului este
mutat ntre fiecare analizor pas cu pas, i n acest fel fiecare colector nregistreaz un spectru corect, cu o compensare fix a energiei ntre canalele
vecine. n principiu, balend spectrul odat peste suprafaa detectorului, 5
sau 9 spectre paralele sunt nregistrate simultan. Energia cinetic En a particulelor ce ajung la colectorul Cn, fiind tiut din ecuaia (16), numrul particulelor din fiecare canal, aparinnd aceleiai energii cinetice, poate fi adugat, rezultnd numrul total de particule pentru fiecare energie cinetic.
414
R
D
(18)
Epass
sau:
Epass =
D
R
Ek
(19)
Efectul de focalizare este obinut cu ajutorul unei lentile electronice adiionale, amplasat n capul sursei, care nu exist n XR-50 standard. Voltajul
de focalizare este generat de ctre un amplificator XRC 1000 M i este transferat la sursa de raze X printr-un cablu de filament prin cele 4 puni.
Modulul XR-50 M (cu alimentarea de ap i protecia HV scoase) poate
fi nclzit pn la 250C, permind o operaie UHV. Conectorii de filtrare
rapid permit ndeprtarea rapid a liniilor de rcire cu ap i HV (de nalt tensiune).
2.2.2. Monocromatorul
Radiaia caracteristic este generat pe anodul XR-50 M i pleac de la
surs sub un unghi de 15. Aceasta este reflectat dup legea lui Bragg pe
oglinda elipsoidal din cuar n monocromatorul FOCUS 500 i focalizat
pe prob.
417
A)
Descrierea general a monocromatorului:
Ansamblul cristalului este compus dintr-o oglind din cristal de cuar
i un manipulator al oglinzii. Oglinda este fcut dintr-un suport monolitic
de nclzire, cu plane de cristal monoatomice orientate precis. Manipulatorul oglinzii poate genera trei moduri de micare: translaie (focalizare) i
dou direcii de nclinare. Este folosit pentru poziionarea oglinzii n vederea obinerii unui fascicul de raze X monocromatic.
B)
(cos)2
1456,7 eV
420
421
2.2.3.2. Rcirea cu ap
Ca agent de rcire pentru XR-50 M se folosete apa. Disiparea maxim
de putere pe anod a sursei de raze X, poate fi obinut doar dac presiunea
de rcire a apei este mai mare dect 3.5 bar (de obicei 5-6 bar) i dac debitul este de aproximativ 2.5-3.5 l/m. Temperaturi mai mici dect temperatura camerei vor duce la condensarea apei i fenomene de descrcare n interiorul conductei de ap sau al nveliului de protecie. Temperaturile nalte
au ca i consecin suprasolicitarea, de exemplu evaporarea materialului
anodului sau n cel mai ru caz, fisurarea anodului i eliberarea apei n camera de vid.
3. Flood-Gun 15/40
3.1. Informaii generale
Flood-Gunul FG 15/40 a fost conceput pentru neutralizarea general a
sarcinilor probelor, a izolatorilor ncrcai pozitiv, sau semiconductorilor, i
este folosit special pentru aplicaii XPS. Fasciculul de energie poate varia
ntre 0 i 500 eV. Curentul de emisie poate varia de la 0 la 5 mA.
3.1.1. Componente:
1.
Filament;
2.
Lentile extractoare;
3.
Anod.
Tensiunea i curenii necesari pentru operaia FG-ului sunt asigurate cu
PS FG 20. Diagrama operaional i conexiunile electrice ale
Flood-Gun-ului sunt artate n figura urmtoare:
422
4. Bibliografie
1.
Cardona M and Ley L (ed) 1978 Photoemission n Solids I (Topics n Applied Physics vol
26) (Berlin: Springer)
2. Hfner S 2003 Photoelectron
Spectroscopy.Principles
and
Applications 3rd
edn (Berlin: Springer)
3. Feuerbacher B, Fitton B and Willis R F 1978 Photoemission and the Electronic
Properties of Surfaces (Chichester: Wiley)
4. Kevan S D (ed) 1992 Angle Resolved Photoemission - Theory and Current Applications
(Studies n Surface Science and Catalysis) 74) (Amsterdam: Elsevier)
5. Schattke W and Van Hove M A (ed) 2003 Solid-State Photoemission and Related
Methods: Theory and Experiment (Weinheim: Wiley-VCH Dec.)
6. Turner, D. W.; Jobory, M. I. Al (1962). "Determination of Ionization Potentials by
Photoelectron Energy Measurement". The Journal of Chemical Physics 37:3007
7. Shockley W 1939 On the surface states associated with a periodic potential Phys.
Rev. 56 317-23
8. Davison S G and Steslicka M 1992 Basic Theory of Surface States (Oxford: Oxford
University Press)
9. Reinert F, Eltner B, Nicolay G, Forster F, Schmidt S and Hfner S 2004 The electron-phonon selfenergy of metallic systems determined by angular resolved high resolution photoemission Physica B 351 229-34
10. Ashcroft N W and Mermin N D 1988 Solid State Physics (Philadelphia, PA:
Saunders College)
11. Matzdorf R, Meister G and Goldmann A 1993 Temperature-dependent photoemission
spectra from Cu(1 0 0) and Cu(1 1 1) surfaces Surf. Sci. 286 56-65
423
1. Introducere
Spectroscopia XPS este o tehnic de analiz foarte util n domeniul
cercetrii avansate n tiina i tehnologia materialelor. Aceast metod
permite determinarea elementelor care contamineaz o suprafa i uniformitatea compoziiei elementale la suprafa sau n adncime (depth
profiling). De asemenea se poate folosi n analiza modificrilor care apar n
chimia suprafeei unui material dup ce acesta a fost supus unor tratamente fizico-chimice.
nregistrarea energiei cinetice i a numrului de electroni emii de la
suprafaa materialului datorit aciunii razei X de energie h duc la obinerea spectrului XPS. Fiecare element determin un numr caracteristic de
vrfuri XPS la valori caracteristice ale energiei de legtur care ne permit
identificarea direct a elementelor care exist pe suprafaa investigat. Pentru a detecta numrul de electroni la fiecare valoare a energiei de legtur
(energie cinetica) cu eroare minim, msurtorile XPS trebuie efectuate n
condiii de vid ultra-nalt (UHV) din cauza distanei la care se afl instrumentele de detecie n instalaiile XPS, fa de suprafaa iradiat cu raze X.
Este important de reinut c XPS detecteaz numai acei electroni care ajung
n vidul din incinta echipamentului; mai exact cei care pleac din material
de la o adncime de aproximativ 10-12 nm. Toi electronii fotoemii de la
adncimi mai mari n urma penetrrii materialului de ctre radiaia X
(aprox. 1-5 m) sunt recapturai sau blocai n diferite stri de excitare n
interiorul materialului. Pentru majoritatea aplicaiilor este de fapt o metod
nedistructiv prin care se determin chimia suprafeei oricrui material.
La baza cuantificrii unui spectru XPS obinut st presupunerea c
numrul electronilor nregistrai este proporional cu numrul de atomi
ntr-o stare dat. Instrumentul de baz pentru msurarea numrului de
424
mai mici (energii de legtur mai mari). Pentru probe conductoare conectate
electric la suport echilibrul de sarcin este restabilit uor; pentru materialele
izolatoare electronii emii trebuie nlocuii de la o surs extern - un tun de
electroni de energie joas (flood gun) pentru a restabili o stare de echilibru
d.p.d.v. electric. Pentru ilustrarea acestui efect, figura 2 prezint spectrul
unei probe nregistrat nainte i dup compensarea de sarcin [1]. Linia spectral a carbonului, C1s, este deplasat cu 120 eV ntre cele doua situaii (cu
compensare de sarcina i fr). n absena compensrii efective de sarcin ,
energia masurat pentru o linie fotoelectric poate varia n funcie de energia cinetic a electronilor. Este important de menionat c, compensarea de
sarcin nu nseamn neaprat neutralizarea suprafeei probei ci mai mult
stabilizarea suprafeei probei a. . forma liniilor spectrale sa fie cea mai bun
concomitent cu asigurarea c distana dintre vrfuri ntre tranziii este inde426
Intensitate ( u. a. )
O1s
as prep
x=0.875
O1s
as prep
x=0.875
x=0.6
x=0.6
x=0.375
O3
O2
O1
(a)
x=0.375
540
535
(b)
530
525
520
Figura 3 Deconvoluia spectrului O1s de nalt rezoluie: (a) aa cum a fost sugerat in literatur;
(b) propus n studiul nostru
428
(A )
(B)
(f)
(f)
(e)
Si 2p
C 1s
Gd 4d
Ti 2p
O KLL
Ti LMM
C KLL
Gd 3d
Intensitate (u.a.)
O 1s
(e )
(d)
(d )
(c)
(c )
(b)
(b )
(a)
(a )
1200
900
600
300
E n e r g ie d e le g a t u r a ( e V )
545
540
535
530
Intensitate (u.a.)
(C)
(D)
(f)
(f)
(e)
(e)
(d)
(c)
(c)
(d)
(b)
(b)
(a)
110
105
100
95
90
525
(a)
470
465
460
455
450
Figura 4A: Spectrele XPS survey pentru sistemul Ti:Si 1:2 (a) netratat termic, respectiv tratat
termic la (b) 350C, (c) 700C, (d) 900C, (e) 1100C i (f) 1400C .Spectrele XPS de nalt rezoluie
corespunztoare (B) O 1s, (C) Si 2p, (D) Ti 2p, pentru (a) proba netratat termic precum i pentru
probele tratate termic la (b) 350C, (c) 700C, (d) 900C, (e) 1100C i (f) 1400C.
prin peak-ul de la 459.0 eV (Ti 2p3/2) i 464.5 eV (Ti 2p1/2). Formarea celor
doi oxizi (SiO2 i TiO2) este confirmat i de forma vrfului O 1s (Fig. 4B).
Dup cum se poate observa din Tabelul 1, cantitatea de Ti 2p la suprafa
descrete de la 12.28 % pentru proba netratat termic, la 2.89 % pentru proba tratat termic la 1100C, n timp ce cantitatea de Si 2p crete de la 16.87
% la 38.05 %. Acest fapt poate fi explicat printr-o migrare a titanului de la
suprafa spre interior i a siliciului din interior spre suprafa,
reflectndu-se astfel o substituie a atomilor de Ti de ctre atomi cu o electronegativitate mai mare i polarizabilitate mai mic, cum sunt atomii de Si
n reeaua SiO2.
Cantitatea de oxigen la suprafaa probelor descrete odat cu creterea
temperaturii de tratament, fapt datorat ndeprtrii oxigenului specific
compuilor organici sau gruprilor OH, dar mai ales separrii celor dou
faze.
430
Ti 2p
Si 2p
Gd 3d
70.688
64.428
62.684
62.640
58.829
59.331
12.281
11.260
9.367
7.549
2.894
5.498
16.875
24.164
27.76
29.653
38.057
34.798
0.156
0.148
0.18
0.15
0.22
0.37
(d)
(c)
C 1s
Si 2s
Si 2p
Al 2p
O 2s
N 1s
(B)
Y 3p
Fe 2p
O KLL
C KLL
O 1s
Intensitate (u.a.)
N 1s
Y 3p
C 1s
Si 2s
Al 2pSi 2p
Fe 2p
O KLL
C KLL
Intensitate (u.a.)
O 1s
(d)
(c)
(b)
(b)
(a)
(a)
1200
800
400
600 400
200
Figura 5 Spectrele XPS survey nainte de imersie (a) i dup 5 minute (b),
2 ore (c) i 24 ore (d) de imersie n soluiile de SBF/BSA (A) i PBS/Fg (B).
n acelai timp, analiza spectrelor survey indic fotopicuri corespunztoare N 1s, datorit azotului prezent n fiecare aminoacid component al
proteinelor. Msurtorile XPS de concentraie de azot pot fi utilizate i ca
metod indirect de determinare a cantitii de protein adsorbit la suprafa [7]. Deoarece, concentraia de azot a fost practic zero nainte de imersie
n soluiile cu protein (Tabel 2, 3), azotul poate fi utilizat ca un indicator
sigur al atarii proteinelor. Rapoartele N:C de 0.2 respectiv 0.5, nregistrate
deja dup un timp de imersie de 5 minute, denot o ataare rapid a proteinei la suprafaa compusului. Deconvoluia spectrelor de N 1s (Fig. 6) de
nalt rezoluie scoate n eviden dou componente, centrate la 398.2 i 400
eV, caracteristice gruprilor C-NH2. Fotopicul N 1s nregistrat la aproximativ 400 eV este tipic pentru azotul din compuii organici [8].
Tabel 2. Concentraia relativ a principalelor componente, nainte i dup imersia
n soluiile de SBF/BSA.
Timpul de
imersie
0
5 min
2 ore
24 ore
432
6.92
28.43
28.93
33.21
5.68
6.46
6.67
2.3
2.19
1.71
1.54
36.77
25.47
25.2
23
Fe
0.18
0.04
0.03
-
0.75
0.49
0.46
0.42
Al
Si
Fe
6.92
43.11
51.81
48.53
10.69
11.5
13.52
53.08
29.26
23.25
27.83
2.3
0.8
0.41
0.1
36.77
15.96
13.02
10.02
0.18
0.02
0.01
-
0.75
0.16
-
Analizele XPS confirm creterea coninutului de azot dup diferite perioade de imersie. n plus, aa cum este de ateptat, proteina mai mare,
(Fg), produce un semnal de azot mai intens dect proteina mai mic, (BSA).
Intensitate (u.a.)
410
(c)
(c)
405
400
395
390
410
405
400
395
390
Intensitate (u.a.)
(b)
410
405
400
395
390
410
405
400
395
Energie de legatura (eV)
(a)
390
Intensitate (u.a.)
(a)
410
405
400
395
390
410
405
400
395
390
Figura 6 Deconvoluia spectrelor XPS de nalt rezoluie ale N 1s pentru BSA/Fg liofilizat (a)
dup 5 minute (b), i 24 ore (c) imersie n soluiile de SBF/BSA (coloana stng) i PBS/Fg
(coloana dreapta).
433
Intensitate (u.a.)
Intensitate (u.a.)
(A)
(e)
(d)
(c)
(b)
(e)
(d)
(c)
(b)
(a)
(a)
Figura 7 Spectrele XPS de nalt rezoluie ale C 1s nainte de imersie (a), ale C 1s pentru BSA/Fg liofilizat
(b) precum i dup 5 minute (c), 2 ore (d) i 24 ore (e) imersie n soluiile de SBF/BSA (A) i PBS/Fg (B).
(A)
(B)
(e)
(e)
(d)
(d)
(c)
(b)
Intensitate (u.a.)
Intensitate (u.a.)
n cazul probelor imersate n soluiile cu protein, semnalele de nalt rezoluie ale C 1s (Fig. 7) sunt mai largi i prezint o form asimetric, semnalnd formarea unor noi tipuri de legturi specifice carbonului n proteine [8].
Dup imersia n soluiile cu proteine, fotopicul O 1s este evident lrgit
i se deplaseaz spre energii de legtur mai mici, pe baza componentei
BSA-ului de la 530.3 eV, respectiv Fg-ului la 531.2 eV (Fig.8). Dup imersia
n soluiile cu protein, coninutul semnificativ diminuat al O 1s (Tabel 2,
3) corespunde n mare parte oxigenului peptidic constituent al proteinelor,
datorit atarii la suprafa a BSA/Fg-ului cu un coninut sczut n oxigen
fa de compusul oxidic utilizat (Fig.8B)
Astfel spectroscopia XPS a fost utilizat cu succes n acest studiu, evideniind ataarea proteinelor la suprafaa materialului i totodat
biocompatibilitatea materialului investigat [10-12].
(c)
(b)
(a)
(a)
545
540
535
530
525
545
540
535
530
525
Figura 8 Spectrele XPS de nalt rezoluie ale O1s nainte de imersie (a), ale O 1s pentru BSA/Fg
liofilizat (b) precum i dup 5 minute (c), 2 ore (d) i 24 ore (e) imersie n soluiile de SBF/BSA (A) i
PBS/Fg (B).
434
Biomaterialele dopate cu particule nano ( Au, Ag) prezint un interes crescut datorit caracteristicilor remarcabile ale acestora, ce deschid noi oportuniti n medicin. Acest tip de materiale furnizeaz avantaje valoroase i n diagnosticarea cancerului sau imagistica biomedical. Mai jos sunt prezentate
rezultatele XPS cu privire la nucleaie i procesul de cretere a nanoparticulelor
de Au n sticla bioactiv CaO-SiO2-P2O5 tratat termic la diferite temperaturi.
Spectrul Au4f este caracterizat de dou componente spin-orbit, Au 4f7/2 i
Au 4f5/2, avnd despicarea, E = 3.67 eV. Deconvoluia spectrului Au4f nregistrat pentru probele tratate termic la 300 i respectiv 500 C prezint trei
dublei la energiile de legtur: 82, 83.72 i 85.95 eV, atribuii la trei specii de
Au diferite: Au-, Au0 i Au+. Identificarea speciilor de Au prezente n probe
este foarte important deoarece studii recente au demonstrat faptul c toxicitatea nanoparticulelor de Au n tratamentul cancerului depinde de sarcina acestora [13]. Acest studiu publicat recent, [14], are importan tiinific mare datorit faptului c demonstreaz foarte clar legtura care exist ntre dimensiunea nanoclasterilor care se formeaz n matrice i modificrile observate n
spectrul Au4f i cel al benzii de valen cu creterea temperaturii de tratament
a probei. Aceste rezultate furnizeaz dovezi experimentale complete pentru
corelaia dintre dimensiunea i structura electronic a nanoparticulelor de Au
care a fost prezis teoretic.
0.6
Au4f
-
Au 5d
T (C)
500
T(C)
500
0.3
Intensitate (u. a. )
0.0
0.6
300
300
0.3
0.0
0.6
(a)
92
90
88
86
84
82
110
0.3
80
0.0
16
110
(b)
12
Energie de legatura ( eV )
435
2. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
436
3000
3100
3200
3300
3400
3500
3600
3700
m agnetic field
Cuprins
1. Consideraii teoretice .......................................................................................................... 437
1.1. Interaciunea Zeeman ................................................................................................. 438
1.2. Hamiltonianul de Spin ............................................................................................... 441
2. Obinerea i analiza spectrelor RES .................................................................................... 443
3. Caracterizarea instalaiei experimentale RES ..................................................................... 447
3.1. Principiul de funcionare al unui spectrometrul RES................................................. 447
3.2. Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400 ............................................................ 447
3.3. Exemple de spectre RES achiziionate cu ajutorul spectrometrului portabil
ADANI PS8400 ......................................................................................................... 449
4. Bibliografie .......................................................................................................................... 451
1. Consideraii teoretice
Rezonana electronic de spin este o metod larg utilizat n descrierea
strilor fundamentale i caracterizarea efectelor vecintii asupra nivelelor
energetice ale centrilor paramagnetici. RES este o metod sensibil la poziiile atomilor n structur i permite studiul simetriei locale. Metoda const
437
ven numit frecven de rezonan [1]. Diferena de energie n spectroscopia RES este predominant datorat interaciunii electronilor nemperecheai din probe cu cmpul magnetic produs de un magnet, efect denumit
efect Zeeman. n urma absorbiei de energie electronii trec de pe nivelul de
energie inferior pe unul superior, orientarea spinului trecnd din cea paralel cu cmpul n poziia antiparalel cu acesta.
Astfel, se cunoate faptul c electronul posed o proprietate cuantic
numit spin, care este privit clasic ca o rotaie n jurul propriei axe. Ca
S = g S
(1)
unde g este factorul Land care pentru electronul liber are valoarea 2.0023,
iar este raportul giromagnetic electronic; S - este momentul cinetic de
spin. Introdus ntr-un cmp magnetic static B, spinul electronului poate
avea dou orientri, paralel sau antiparalel cu cmpul magnetic. Diferena dintre cele dou direcii ale spinului, n energie, depinde de intensitatea
cmpului magnetic aplicat. Energia interaciunii Zeeman a unui electron
ntr-un cmp magnetic aplicat B este dat de relaia:
E Zeeman = s B = g B M S
unde este magnetonul Bohr,
(2)
1
E = + g B
2
1
E = g B
2
(3)
= 1 i M I = 0 .
439
Cu alte cuvinte, spectrul RES msoar energia necesar tranziiei electronului (E) ntre cele dou nivele energetice, ntr-un cmp magnetic exterior. Aceast energie, de obicei se obine de la o surs de energie electromagnetic, avnd o frecven fix de oscilaie i deci energia (h). Rezult de aici condiia de rezonan:
h = g B
(4)
unde h este constanta lui Planck, frecvena de rezonan, iar B cmpul
magnetic aplicat. Parametrul g determin poziia liniei de absorbie. De
obicei linia de absorbie nu este singular aprnd uneori un spectru de
multiplei datorit existenei nucleelor magnetice n specia paramagnetic.
440
(5)
unde,
(7)
unde direcia cmpului magnetic este aleas ca fiind axa z, SZ este operatorul de spin corespunztor proieciei acestuia dup axa z.
Pentru un singur electron cu g anizotrop hamiltonianul de spin este mai
complicat din cauza diferiilor operatori ai proieciei spinului. De exemplu,
pentru o simetrie axial hamiltonianul de spin are urmtoarea form:
H = g // B Z S Z + g B X S X
(8)
~
= S A I
(9)
B g~ S + S Ai I i
(10)
i =1
442
h
, cunoscut i sub denumirea de g efectiv (gef ), poate fi
B
relaia g =
diferit de 2,00 , mai rar scade mult sub aceast valoare, dar poate ajunge la
9,00 sau mai mult. n acest caz valoarea factorului g depinde de numerele
cuantice J, L i S astfel:
g =1+
J ( J + 1) + S ( S + 1) L ( L + 1)
2 J ( J + 1)
(11)
g =
g etalon B etalon
B proba
(12)
Dac numai anumite grupuri de spini sau pachete de spini din prob
pot absorbi direct cuantele de o frecven particular, atunci linia este lrgit neomogen.
Liniile lrgite omogen, aprute n urma unor fluctuaii dinamice n sistemul de spini (variabile n timp), sunt simetrice i au o form aproximativ
Lorentzian (Fig.2). Aceast linie este ngust n zona central i are o descretere lent spre extreme. Cauzele care determin lrgirea neomogen
sunt : interaciunea dipolar ntre spinii de acelai tip, relaxarea spin reea, interaciunea dintre spinul electronic i cmpul de microunde, difuzia
de spin, fluctuaiile datorate micrii spinilor n cmpul magnetic local.
Liniile lrgite neomogen sunt nfurtoarele liniilor lrgite omogen corespunztoare diferitelor pachete de spini, linii care au maxime de absorbie
uor diferite ntre ele datorit distribuiei de cmp magnetic local n prob.
Liniile lrgite neomogen, atunci cnd lrgirea nu este provocat de interaciunile anizotrope, se apropie de o form Gaussian. Cauzele lrgirii neomogene sunt fluctuaii spaiale de cmp magnetic i sunt datorate prezenei
unor interaciuni hiperfine, dipolare dintre spini cu frecvene Larmour diferite, anizotropiei tensorilor g i de structura fin, neomogenitilor cmpului magnetic static. Pentru sistemele reale, linia de rezonan are n general o form intermediar ntre cele dou cazuri limit.
445
Exist dou tipuri de interaciuni hiperfine: interaciunea hiperfin anizotrop i interaciunea hiperfin izotrop. Interaciunea hiperfin anizotrop este interaciunea de tip dipol magnetic ntre electronul cu spin nemperecheat i nucleul cu moment magnetic diferit de zero. Interaciunea
hiperfin izotrop sau interaciunea hiperfin de contact (interaciunea de
contact Fermi), are loc ntre nucleul cu moment magnetic nenul i electronii
cu spini nemperecheai, a cror densitate la locul nucleului este diferit de
zero. Interaciunea hiperfin izotrop este partea principal a interaciunii
hiperfine n radicali liberi, deoarece n multe cazuri interaciunea hiperfin
anizotrop nu se rezolv i are ca efect doar o lrgire a liniilor de rezonan
sau o anizotropie a formei i lrgimii liniei. Structura hiperfin a spectrelor
apare n special n cazurile cnd electronii cu spin nemperecheat sunt electroni s sau . Structura fin lipsete n cazul radicalilor liberi cu un singur
electron nemperecheat.
III. Lrgimea liniei fiind mic permite determinri foarte precise de
concentraie a radicalilor liberi i separarea efectelor diferiilor radicali prezeni n acelai timp n proba studiat. De asemenea lrgimea mic a liniilor
faciliteaz studiul structurii hiperfine, n general despicarea hiperfin fiind
mai mare dect lrgimea componentelor hiperfine.
care este echipat cu un sistem de achiziie al datelor, computerizat. Spectrometrul poate opera n urmtoarele condiii : temperatura mediului cuprins ntre (+18C) i (+28C) ; umiditatea relativ ntre 20% i 80%, i presiunea atmosferic (840 GPa 1066 GPa), (630 mmHg - 800mmHg) (Fig.3).
Parametrii spectrometrului utilizai la achiziionarea spectrelor RES sunt
diferii, n funcie de probele care urmeaz a fi studiate.
Schema bloc a spectrometrului portabil ADANI PS8400 este redat n
(Fig. 4). Sursa de radiaie electromagnetic i detectorul de afl ntr-o cavitate numit punte de microunde. Puntea de microunde este o cutie de metal care ajut la amplificarea semnalelor slabe provenite de la probe. Sursa
de microunde este reprezentat de un oscilator GUNN.
ADANI PS8400
res
, unde res este frecvena
3.3. Exemple de spectre RES achiziionate cu ajutorul spectrometrului portabil ADANI PS8400
a) spectrele RES ale unor probe de hidroxiapatit cu fier
449
b) spectrele RES ale unor probe vitroase i vitroceramice care conin fier [5]:
x (mol %)
g = 4.3
x (mol %)
g = 4.3
70
70
60
Intensitate (u.a.)
60
50
Intensitate (u.a.)
50
40
30
40
g = 2.0
30
20
20
10
1000
2000
3000
4000
10
5000
1000
2000
3000
4000
5000
spectrul experimental
spectrul simulat
3250
3300
3350
3400
spectrul simulat
3450
3250
3300
3350
B(G)
3400
B(G)
E (92 z)
E (ini)
3320
450
3340
3360
B (G )
3380
3400
3250
3300
3350
B (G)
3400
3450
3450
4. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
451
3000
3100
3200
3300
3400
3500
3600
3700
m agnetic field
Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................452
2. Aplicaii ale spectroscopiei de rezonan electronic de spin (RES) ....................................453
3. Exemple de aplicaii ale rezonanei electronice de spin ........................................................454
4. Bibliografie: .........................................................................................................................465
1. Introducere
Spectroscopia de rezonan electronic de spin (RES) este una dintre cele mai eficiente metode, non-distructive si non-invazive, folosit pentru
caracterizarea ordinii locale i a interaciunilor magnetice n materiale organice si anorganice. Spectrele RES nregistrate de asemenea n cazul: sistemelor necristaline, monocristalelor, pulberilor policristaline, soluiilor
congelate sau n cazul soluiilor lichide aduc contribuii importante cercetrilor din domeniul materialelor, fizicii, chimiei, biologiei, mineralogiei si
geologiei. Centrii paramagnetici, care pot fi investigai prin RPE sunt ionii
metalelor de tranziie i elemente ale pmnturilor rare sau centrii asociai
cu sarcinile electrice sau cu defectele neutre.
Rezonana electronic de spin este o metod larg utilizat n descrierea
strilor fundamentale i caracterizarea efectelor vecintii asupra nivelelor
452
energetice ale centrilor paramagnetici. RES este o metod sensibil la poziiile atomilor n structur i permite studiul simetriei locale. Metoda const
n studiul tranziiilor dintre nivelele electronice ale atomilor n prezena
unui cmp magnetic extern [1,2].
Astfel, spectroscopia RES este capabil s furnizeze detalii de structur
molecular inaccesibile altor metode analitice. Aceasta se datoreaz faptului c momentul magnetic de spin al electronului nemperecheat este foarte
sensibil la cmpurile magnetice locale din interiorul probei. Aceste cmpuri
de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiilor nuclei
care pot fi prezeni n vecinti.
g = 4.3
70
Intensitate (u.a.)
60
50
40
30
20
10
1000
2000
3000
4000
5000
B (G)
200
190
180
170
160
10
20
30
40
50
60
70
x (mol%)
Pentru probele cu un coninut mai ridicat de SiO2 (40 x 50) i n cazul crora a fost identificat prin difracia de raze X faza cristalin
Bi5.6Si0.5O9.4, semnalul de la gef 2.0 este slab evideniat iar linia dominant
fiind cea de la gef 4.3. n cazul probelor cu coninut ridicat de siliciu
(60 x 70) sunt prezente ambele linii, att cea de la gef 2.0 ct i cea de la
gef 4.3.
Lrgimea liniei de la gef 2.0, nregistrat pentru probele cu un coninut sczut de SiO2, scade cu x aa cum se observ n Fig. 4. n probele tratate termic, spectrele RES ale Fe3+ (Fig. 3) arat schimbrile aprute n ordinea
local n jurul ionilor de fier. Semnalul de la gef = 4.3 este nregistrat pentru
toate probele i lrgimea liniei este de aproximativ 200 G pentru toate compoziiile. Acest rezultat indic faptul c ordinea la scurt distant, din jurul
ionilor Fe3+ responsabili pentru acest semnal, este caracterizat de un cmp
cristalin relativ puternic i poate fi asociat cu poziiile fierului n reeaua
necristalin bogat n siliciu.
456
x (mol %)
g = 4.3
70
60
Intensitate (u.a.)
50
40
g = 2.0
30
20
10
1000
2000
3000
4000
5000
Linia cu gef = 2.0 este linie rezolvat numai pentru coninut sczut de
SiO2 , pn la x = 30 i este atribuit ionilor Fe3+ situai n poziii cu cmp
cristalin slab cu simetrie octaedral. Lund n considerare razele ionice pentru ionii Bi3+ i Fe3+ i starea lor identic de valent, este de ateptat ca ionii
Fe3+ s ocupe poziiile Bi3+ din faza cristalin Bi12SiO20. Remarcm de asemenea c linia se ngusteaz cu creterea coninutului de SiO2 (Fig. 4) ceea
ce denot tendina de ordonare structural n jurul ionilor Fe3+ rezonani
dispui n aceste poziii.
160
150
B (G)
140
130
120
110
100
90
10
20
30
x (mol %)
457
5.9
2.0
2.8
5.9
x=0
x=0
x = 0.14
x = 0.14
x = 0.33
x = 0.33
4.3
x = 0.5
x = 0.5
1000
2000
3000
4000
5000
B(G)
1000
2000
3000
4000
5000
B(G)
cmp intermediar. Lrgimea liniei de la g 2.0 din spectrele RES, care reflect n mod direct schimbrile n rata de relaxare spin-reea i cel mai important n dinamica medie a anizotropiei factorului g, se modific n intervalul de temperatur investigat. Linia de la g 4.3 este atribuit fierului
(III) i apare datorit tuburilor de sticl n care se pune proba pentru a efectua msurtoarea RES.
Modificrile structurale induse n probele titano-silicatice amorfe prin
tratamentele termice sunt bine puse n eviden n spectrele RES ale probelor parial i total cristaline (Fig. 7-14). Linia larg de la g 2.0 din spectrele
probelor tratate termic la 350, 700 i 900C ne indic c ionii de Gd3+ sunt
preponderent dispui n faza rezidual necristalin, n cmp cristalin slab,
rezultat n urma relaxrii structurale dar nc cu un grad mare de dezordine n jurul lor. Se observ i spectrul n U cu linii la g 5.9, g 2.8, g
2.0, specific matricelor policristaline dezordonate care conin ioni de Gd3+
destul de omogen distribuii.
Spectrele RES pentru microsferele tratate termic n intervalul 350
1400C sunt caracterizate printr-un semnal ngust, suprapus peste componenta spectral, la g 2, care crete n intensitate odat cu creterea temperaturii de tratament. n conformitate cu Kolodiazhnyi i Petric am atribuit
aceste linii vacanelor de oxigen la titan (VTi) cu spin electronic nemperecheat. Spectrele RES prezint o uoara asimetrie a liniei de rezonan (se
abat de la o funcie pur Lorentzian) care poate fi explicat prin prezena
unei anizotropii uoare i/sau a unui fundal de rezonan relativ larg de o
foarte joas amplitudine. Lrgimea liniei spectrelor RES, care reflect n
mod direct schimbrile n rata de relaxare spin-reea i cel mai important n
dinamica medie a anizotropiei factorului g, se modific n intervalul de
temperatur investigat [16].
Prin aplicarea tratamentului termic, oxigenul difuzeaz din interior
spre suprafa i se formeaz n regiunea de sub-suprafa vacante de oxigen, n timp ce titaniul difuzeaz de la suprafa spre interior, unde se formeaz ionii de Ti3+. n timp ce atomul de O difuzeaz el genereaz doi
atomi de titan cu configuraie incomplete, legai anterior de atomul de oxigen. Unul dintre aceti atomi de Ti capteaz un electron i rmne n configuraia tetraedral, iar cellalt atom de Ti se relaxeaz ntr-o configuraie
planar trigonal.
459
2.8
5.9
2.0
4.3
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1
1000
2000
3000
4000
Ti:Si 1:1
1000
5000
2000
3000
4000
5000
B(G)
B(G)
Figura 7 Spectrele RES ale microsferelor preparate prin metoda sol gel.
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000
2000
3000
4000
5000
1000
2000
B(G)
3000
4000
5000
B(G)
(a)
(b)
2.004
1.98
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
2.004
1.98
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000
2000
3000
B(G)
4000
5000
3000
3200
3400
3600
B(G)
460
3800
(a)
(b)
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000
2000
3000
4000
5000
3000
3200
3400
B(G)
3600
3800
B(G)
(b)
1400oC
o
1400 C
2.004
1100oC
1.98
1100oC
o
900 C
700oC
o
350 C
900oC
700oC
as-prep.
1000
2000
3000
4000
3000
5000
3200
3400
3600
3800
B(G)
B(G)
Figura 13 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2 preparate prin metoda sol gel si supuse diferitelor
tratamente termice, utilizand un baleaj de (a) 4000 G si respectiv (b) 600 G.
(b)
(a)
o
1400 C
o
1400 C
2.004
1.98
o
1100 C
o
900 C
o
1100 C
o
700 C
o
900 C
o
350 C
o
700 C
as-prep.
1000
2000
3000
B(G)
4000
5000
3000
3200
3400
3600
3800
B(G)
Figura 14 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:1 preparate prin metoda sol gel i supuse diferitelor
tratamente termice, utiliznd un baleiaj de (a) 4000 G i respectiv (b) 600 G.
461
Din spectrele RES prezentate n Fig.13, 14 se observ faptul c tratamentul termic joac un rol important n formarea de centrii paramagnetici
adiionali, ambele sisteme avnd o dependen oarecum similar n raport
cu tratamentul termic.
n Figurile 13 si 14 sunt evideniate evoluiile vacanelor de oxigen (pentru g2.004) si Ti3+ (pentru g1.98), n urma tratamentelor termice. n cazul
microsferelor preparate prin metoda sol gel, semnalul RES provine numai de
la ionii de Gd3+. n cazul microsferelor tratate termic la 350, 700, 900 si
1100C, peak-ul de la g2.004 poate fi atribuit vacanelor de oxigen, n bun
concordan cu literatura de specialitate i rezultatele obinute prin spectroscopie Raman unde a fost obinut un semnal de fluorescen n cazul probelor tratate termic pn la temperatura de 900C. Nakamura i col. [20] au
raportat faptul c semnalul RES la g2.004 detectat pe plasma de TiO2 tratat
termic provine de la un electron captat la o vacan de oxigen. Serwicka [21]
a observat un astfel de semnal la g2.003 pe TiO2 redus n vid i l-a atribuit
unui defect, cel mai probabil un electron captat la o vacan de oxigen. Semnale similare au fost observate i n TiO2 anatase dopate cu C [22-24], ct si
n TiO2 dopat cu B [25]. Au mai fost raportate astfel de semnale RES de ctre
Li i col. [22] la g2.0055 n spectrele RES n probe de titan dopat cu C, dup
ce au fost folosite n teste fotocatalitice, ct i de ctre Feng i col. [26] n probe de TiO2 dopat cu N, iar Serpone [27] a atribuit semnalele din intervalul
g = 2.003 2.005 unui electron captat la o vacan de oxigen.
Acest studiu este focusat n special pe efectul adiiei oxidului de galiu
n sisteme, deoarece evoluia defectelor: vacane de oxigen (g2.004) i Ti3+
(g1.98) este similar cu cea discutat anterior. Pentru microsferele tratate
termic la 1100C si 1400C se observ efectul galiului n sensul preveniei
formrii vacanelor de oxigen. n cazul microsferelor cu coninut de galiu se
dezvolt dup tratamentul termic la 1400C o nou faza, Ga2TiO5, n concordan cu difraciile de raze X. Spectrele RES evideniaz integrarea ionilor de Ti3+ n aceast faz. Vor fi prezentate doar spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2, deoarece sistemul Ti:Si 1:1 nu prezint modificri eseniale.
Ga2O3
Ga2O3
20%
20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
1000
2000
3000
4000
5000
B(G)
Figura 15 Spectrele RES ale microsferelor preparate prin metoda sol gel.
462
1000
2000
3000
4000
5000
B(G)
Ga2O3
Ga2O3
(a)
(b)
20%
20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
3000
1000
2000
3000
4000
3200
3400
3600
3800
B(G)
5000
B(G)
Ga2O3
20%
(a)
20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
(b)
0%
0%
Ga2O3
3000
1000
2000
3000
4000
3200
3400
5000
3600
3800
B(G)
B(G)
Ga2O3
(a)
Ga2O3
(b)
20%
20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
1000
2000
3000
B(G)
4000
5000
3000
3200
3400
3600
3800
B(G)
463
(a)
Ga2O3
(b)
Ga2O3
20%
20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
1000
2000
3000
B(G)
4000
5000
3000
3200
3400
3600
3800
B(G)
c) Gd3+
Prin rezonana paramagnetic electronic a fost investigat ordinea
structural din jurul ionilor de Gd3+ si interaciunea magnetic dintre ei.
Prezena n probe a ionilor de Gd3+ ne d informaii cu privire la modificrile structurale care au loc n vecintatea lor, n funcie de compoziia matricii
i este util n caracterizarea locurilor n care s-ar putea distribuii alte pmnturi rare neparamagnetice, introduse n aceeai matrice.
Spectrele RES ale probelor investigate sunt prezentate n figura 21.
Spectrele constau din linii relativ largi cu g = 2,0 fapt ce denot c vecintatea ionilor de Gd3+ se confrunt cu cmpuri cristaline slabe, ceea ce nseamn c acetia nu sunt inclui n reeaua silicatic sau germanat unde au
avut o vecintate mult mai distorsionat [28].
Aceast lrgire a liniei de rezonan este n mod normal atribuit interaciunii dipol-dipol dintre ionii de Gd3+, dar i dezordinii locale [29-32].
Liniile largi preconizate pentru o concentraie att de sczut (0,5% mol
Gd2O3), considernd c gadoliniu ar fi distribuit omogen n ntregul volum
de prob, sprijin ipoteza distribuiei sale pe suprafaa nanoparticulelor.
n acest caz, distana medie dintre ionii de gadoliniu este mai mic dect n cazul distribuiei uniforme n ntregul volum i se confrunt cu interaciuni magnetice puternice.
Diferenele observate n forma liniilor, n funcie de compoziia probelor, arat c aceast distribuie pe suprafaa nanoparticulelor nu este uniform, fiind mult mai grupat pentru probele cu raportul Si/Ge 1:2 i 1:3,
unde efectul interaciunii de schimb este clar evideniat [33].
464
4. Bibliografie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
465
466
1. Introducere
Metodele electrochimice moderne ofer chimistului electroanalist o varietate de tehnici pentru a rezolva problemele analitice. Una dintre aceste
metode este voltametria, n care curnetul este msurat ca o funcie de potenialul aplicat i este utilizat la studiul cineticii reaciei de transfer de
electroni i proprietile de transport ale reaciilor.
n principal, exist dou tipuri de metode voltametrice:
* voltametrie cu baleiaj liniar de potenial (LSV);
* voltametrie ciclic (CV).
467
(2)
Deci, cnd potenialul este baleiat de la valoarea V1 la V2, poziia de
echilibru se modific de la nici o conversie (la V1) la conversia complet (la
V2) a reactantului la suprafaa electrodului. Forma exact a voltamogramei
poate fi neleas prin luarea n considerare i a efectelor potenialului i
transportului n mas. Cnd potenialul este baleiat de la valoarea iniiala
V1, echilibrul la suprafaa electrodului ncepe s se modifice i, ca urmare,
apare un curent, conform ecuaiilor 3:
(3)
Aa cum curentul crete cu potentialul, poziia de echilibru se deplaseaz continuu n sensul conversiei reactantului. Peak-ul (vrful, maximul)
apare deoarece la un moment dat stratul de difuzie a crescut suficient nct
fluxul de reactant la electrod nu este suficient de rapid pentru a satisface
cerinele impuse de ecuaia lui Nernst. n aceast situaie curentul ncepe s
scad. De fapt, scderea curentului urmeaz acelai comportament ca i cel
estimat prin ecuaia Cottrell.
n cazul n care se modific viteza de baleiaj, alura voltamogramei se
modific i ea (Figura 3).
Figura 3. Influena
vitezei de baleiaj
asupra
voltamogramelor cu
baleiaj liniar de potenial.
Fiecare curb are aceeai form, dar este evident c curentul crete cu
creterea vitezei de baleiaj, datorit dimensiunilor stratului de difuzie i a
469
Astfel, pentru un condensator cu plci paralele, sarcina condensatorului (Q) este proporional cu cderea de tensiune n condensator (E):
Q=CE
(4)
Constanta de proporionalitate C este capacitatea mediului. Cea mai simpl descriere a capacitii electrochimice este dat de modelul Helmholtz:
C 0
=
A
(5)
dQ
dE
=C
dt
dt
(6)
473
(7)
Figura 9. Experiment de
voltametrie ciclic, n
absena speciei redox
active.
Pentru cuplul redox Fe(CN)63-/4-, care particip la reacia 8 a crei cinetic de transfer de electroni este destul de rapid, aa c se presupune c la
suprafeele electrodului, concentraiile de Fe(CN)63- i Fe(CN)64- respect
ecuaia lui Nernst 9:
Fe (CN)6 3- + 1 e- Fe(CN)6 4- ;
[Fe(CN)64 ]
[Fe(CN)36 ]
(10)
(C * C x = 0 )
dC
D
J = D
x
dx x = 0
(11)
unde: D este coeficientul de difuzie a speciilor; x este distana de la suprafaa electrodului; (dC/dx)x=0 este gradientul de concentraie la suprafaa electrodului, C* este concentraia de specie oxidat n volumul soluiei, i Cx=0
este concentraia sa la suprafaa electrodului.
Dup cum se observ din ecuaia 11, cu ct este mai mare gradientul de
concentraie, cu att este mai mare fluxul J i, prin urmare, conform ecuaiei
10, cu att este mai mare curentul catodic.
475
476
Caracterizarea
Aceasta a fost o descriere foarte calitativ a voltametriei ciclice. n 1964,
Nicholson i Shain au efectuat simulri cantitative ale voltametriei care au
dus la schimbri majore n domeniul electrochimiei. Parametrii importani
pentru o voltamogram ciclic sunt potenialele de vrf (Ep ) i curenii de
vrf (ip), care se cuantific conform figurii 11.
Proces redox reversibil
Utilitatea voltametriei ciclice este foarte dependent de analitul studiat.
Analitul trebuie s fie o specie redox n domeniul de potenial experimentat. De asemenea, este foarte de dorit ca analitul s prezinte peak-uri reversibile. Dac un sistem redox rmne n echilibru pe ntreg domneiul de
potenial scanat, procesul redox este numit reversibil (echilibru impune ca
concentraiile de suprafa de Ox i Red s fie meninute la valorile prezise
prin ecuaia Nernst). Un peak reversibil se obine atunci cnd un analit este
redus sau este oxidat pe un sens al baleiajului de potenial i apoi este
reoxidat sau redus pe sensul invers al baleiajului, conform reaciei 12:
Ox + e-
Red
(12)
(13)
unde: ip este curentul de peak (n A); n este numrul de electroni transferai; A este aria electrodului (n cm2), D este coeficientul de difuzie (n cm2
s-1); v este viteza de baleiaj (n V/s) i C* este concentraia n faza de volum
a speciei (n mol/cm3).
Chiar i cuplurile reversibile conin suprapoteniale de polarizare i astfel prezint o histerez ntre potenialul absolut de reducere (Epc) i de oxidare (Epa). Acest suprapotenial reiese dintr-o combinaie a vitezelor de
difuzie a analitului i bariera intrinsec de activare a transferului de electroni de la electrod la analit. O descriere teoretic a suprapotenialului de
polarizare este inclus n ecuaia Butler-Volmer i ecuaia Cottrell.
Urmtorii parametrii sunt folosii pentru a caracteriza voltamograma
ciclic a unui proces reversibil:
a. Separarea potenialului de peak Ep (= Epc - Epa) = 59/n [mV], la toate
vitezele de scanare, la 25 oC. Este foarte dificil pentru a atinge o sepa477
rare a peak-urilor n valoare de 59/n [mV], pe majoritatea electrozilor solizi. (Se consider o valoare mulumitoare aceea de 70 mV.
Aceasta este o funcie de pregtire a electrozilor, precum i de vitez
de scanare).
b. Diferena ntre potentialul de peak (Ep) i potentialul la care curentul
este jumtate dect la Ep, (Ep/2), este de 56.5/n [mV] la 25 C, unde: n
este numrul de electroni transferai.
c. Poziia potenialului de peak nu se modific cu viteza de scanare.
d. Raportul curenilor de peak este unitar (ipa/ipc = 1) la toate vitezele de
scanare. Acest raport poate fi perturbat pentru cuplurile reversibile
n prezena unei reacii chimice, n experimentele de stripare sau n
prezena unui fenomen de nucleaie.
e. Curenii de peak (ip) sunt proporionali cu rdcina ptrat a vitezei
de scanare (v), iar conform ecuaiei 13, funcia ip/v1/2 este independent de v. Influena vitezei de scanare asupra curentului pentru un
transfer de electroni reversibil, ilustrat n figura 12, poate fi explicat
ca i n cazul LSV, ca funcie de grosimea stratului de difuzie.
f. n cazul n care valorile constantelor de difuzie pentru speciile oxidate
i reduse sunt similare, valoarea Eo poate fi estimat ca media aritmetic a valorilor potenialelor de peak anodic i catodic (Eo = (Epa +
Epc )/2).
g. Atunci cnd se obin peak-uri reversibile, se pot determina informaii
termodinamice, cum ar fi: potenialul de semi-und (E01/2).
atunci reacia chimic are un efect semnificativ, n timp ce un efect mai redus apare n cazul n care acest raport este mai mic. Prin urmare, este posibil s se elimine efectul reaciei chimice (deci s se restabileasc reversibilitatea), prin cresterea v. Valoarea lui k poate fi calculat fie prin studii de
simulare, fie prin investigarea efectului vitezei de baleiaj asupra raportului
ipa/ipc.
Dei voltametria ciclic este foarte utilizat pe scar larg pentru caracterizarea speciilor redox (de exemplu: poteniale redox i stabilitatea diferitelor stri de oxidare) i de investigare calitativ a reaciilor chimice care
nsoesc transferul de electroni, exist o serie de dezavantaje inerente n
cadrul acestui procedeu:
a. Efectele transferului eterogen de electroni lent i reaciile chimice nu pot
fi separate. Dac ambele efecte sunt prezente, atunci constantele de vitez pentru aceste procese nu pot fi calculate folosind metode de simulare.
b. Exist un curent rezidual de ncrcare n timpul experimentului, exprimat prin vCdl (unde: Cdl este capacitatea la interfaa electrodului de lucru). Acest fapt restrnge limita de detecie la aproximativ 10-5 M. n
plus, raportul dintre curentul de peak faradaic i curentul de ncrcare
scade cu creterea v (n timp ip este proporional cu v1/2), plasnd o limit superioar a lui v dect poate fi utilizat.
n ciuda acestor limitri, voltametria ciclic este foarte potrivit pentru
o gam larg de aplicaii. ntr-adevr, n unele domenii de cercetare,
voltametria ciclic este una din tehnicile standard utilizate pentru caracterizare.
Procese redox ireversibile (control de transfer de sarcin)
n cazul transferului de electroni ne-reversibil, exist diferene considerabile n ceea ce privete parametrii voltamogramei. Cnd peak-urile sunt
ne-reversibile este imposibil s se determine parametrul E01/2. Acesta poate
fi ns determinat, cu toate acestea el necesit adesea existena de cantiti
egale de analit, n ambele stri de oxidare. Cnd un peak este ne-reversibil,
voltameteria ciclic nu poate determina dac peak-ul este la potenialul su
termodinamic sau s-a deplasat la un potenial mai extrem, datorit unui
suprapotenial. Cuplul redox ar putea fi ireversibil din cauza unui proces
chimic care urmeaz, un exemplu comun pentru metale tranziionale este o
schimbare n geometria sferei de coordonare. Dac este acesta cazul, atunci
viteze mari de scanare pot arta peak-uri reversibile. De asemenea, este
posibil ca peak-ul s fie ireversibil din cauza unui proces fizic, cel mai frec481
vent, o form de precipitare. Unele speculaii pot fi fcute n ceea ce privete peak-urile ireversibile, cu toate acestea, ele sunt n general n afara domeniului de aplicare al voltametriei ciclice.
Condiii experimentale
Metoda utilizeaz o combinaie de trei electrozi: electrodul de lucru, un
electrod de referin i un contraelectrod (figura 14). De obicei, electrolitul
este adugat la soluia de testat pentru a asigura o conductivitate suficient.
Combinaia dintre solvent, electrolit i electrodul de lucru specific determin intervalul de potenial baleiat.
Figura 14. Celula electrochimic pentru experimentul de voltametrie liniar sau ciclic.
suprafaa electrodului. Din acestea sau alte motive, adesea este necesar
curarea electrozilor ntre scanri.
Materialele uzuale pentru electrozii de lucru sunt: crbunele sticlos,
platina i aurul. Aceti electrozi sunt, n general, ncastrai ntr-un material
izolator inert, avnd doar un disc expus la unul dintre capete. Un electrod
de lucru obinuit are o raz de un ordin de mrime de civa mm. Pentru
interpretarea rezultatelor de voltametrie ciclic este important ca electrodul
s posede o arie a suprafaei controlat cu o form definit.
Pentru a executa experimente de voltametrie ciclic la viteze de scanare
mari este insuficient un electrod de lucru obinuit. Vitezele mari de scanare
creeaz peak-uri avnd intensiti mari de curent, care au ca rezultat creterea rezistenei, ceea ce duce la denaturarea formei voltamogramei. Pentru a
minimiza curentul i rezistena, pot fi folosii ultramicroelectrozi.
Contraelectrodul cunoscut, de asemenea, sub numele de electrod auxiliar, poate fi orice material care conduce cu uurin i nu va reaciona cu
volumul soluiei. Reaciile care apar la suprafaa contraelectrodului sunt
lipsite de importan, atta timp ct este asigurat o conducie bun a curentului. Pentru a menine curentul observat la contraelectrod, se vor oxida
sau reduce adesea electrolitul sau solventul.
Electrozii de referin uzuali sunt cei de calomel sau de Ag/AgCl saturai cu KCl, uneori separai de soluia testat prin capilare Luggin care s
mpiedice infestarea electrolitului cu KCl.
Remarci
Voltametrie ciclic nu este o tehnic hidrodinamic. ntr-o tehnic hidrodinamic, fluxul spre suprafaa electrodului este realizat prin agitare, pompare
a soluiei sau rotaia electrodului, cum este n cazul electrozilor disc-rotitor i
disc-inel-rotitor. Aceste tehnici intesc condiiile de stare de echilibru, care apar
oricum indiferent dac baleiajul se face dinspre valori pozitive sau negative,
ceea ce le limiteaz la voltametria cu baleiaj liniar de potenial.
Exemplu
Se realizeaz o soluie de hexacianoferat de potasiu 0.5 mM K3Fe(CN)6
prin dizolvarea cantitii corespunztoare de sare n 100 ml de KCl 1 M.
Utiliznd voltametria ciclic s sa investigheze comportamentul cuplului redox Fe(CN)63-/4- i s se determine parametrii electrochimici: Eo, Ep,
ipa/ipc, precum i D.
Celula electrochimic conine 10 ml soluie de analit i este echipat cu
3 electrozi: electrod de lucru din grafit, contraelectrodul de platin i electrodul de referin Ag/AgCl/KClsat.
483
[FeII(CN)6]3- + e- [FeIII(CN)6]4-
(13)
oxidare:
[FeII(CN)6]4- [FeIII(CN)6]3- + e-
(14)
484
Pentru sistemul studiat, se obin voltamogramele din figura 17, la diferite viteze de baleiaj. Din panta rRESezentrii log I vs log v (figura 18) se
stabilete puterea lui v i astfel se verific posibilitatea de a utiliza ecuaia
Randles-Sencik pentru calculul coeficientului de difuzie.
0.00075
20 mV/s
anodic
catodic
50 mV/s
0.00050
70 mV/s
100 mV/s
200 mV/s
0.00000
log I
I/A
0.00025
1E-3
-0.00025
1E-4
-0.00050
-0.00075
0.0
0.2
0.4
10
0.6
log v
Epa (V)
0.303
0.303
Epc (V)
0.253
0.253
Ipa (A)
1.023e-4
2.254e-4
Ipc (A)
-1.255e-4
-2.753e-4
Eo (V)
0.278
0.278
Ep (V)
0.050
0.050
ipa/ipc
0.815
0.818
Considernd o situaie n care un electrod solid este cufundat ntr-o soluie care conine forma oxidat (Ox) a unui cuplu redox la concentraie
iniial cunoscut (C0), de ex.: 1 mM. Iniial, electrodul este fixat la un potenial (Ei) mult mai pozitiv decat ale E0 a cuplului Red/Ox, asigurndu-ne
c doar Ox este prezent n soluie. Soluia conine, de asemenea, un exces
de electrolit inert, i se lucreaz n acele condiii experimentale care s asigure c fluxul spre electrod s fie strict controlat de difuzie. La un moment
t0, potenialul este modificat dup un semnal de tip treapt pn la o valoare semnificativ mai negativ dect E0 pentru cuplu redox (Es), iar forma Ox
din vecintatea electrodului este imediat transformat (dup o cinetic reversibil) la forma Red.
Ca urmare a transformrii, concentraia de Ox din vecintatea electrodului
este redus la zero fa de concentraia iniial, n faza de volum de 1 mM.
Aceasta duce la formarea unui gradient de concentraie pentru Ox, prin care
Ox din cea mai mare parte a soluiei trebuie s difuze la suprafaa electrodului,
unde este imediat redus la Red. Cu ct electrodul rmne mai mult la acest
potenial de reducere, cu att stratul de difuzie srcit n Ox, se extinde. Un
gradient similar, dar n sens opus exist pentru Red, care dup formarea sa
este liber s difuzeze departe de suprafaa electrodului, n faza de volum, pe
msur ce trece timpul. Aceast situaie este prezentat n Figura 21.
Aa cum s-a discutat anterior, curentul faradaic n condiii controlate
de difuzie este direct legat cu gradientul de concentraie, Ci/x, evaluate
la x = 0. Astfel, cum panta profilului de concentrare pentru Ox scade cu
timpul n urma excitrii sub form de treapt de potenial, acelai lucru se
va observa i n cazul curentului.
486
[A]
(15)
Cum era de ateptat din ecuaia Cottrell, curentul observat pentru prima treapt scade cu t-1/2. n acest exemplu, transferul de electroni este reversibil att chimic, ct i electrochimic. Curentul aprut la treapta de ntoarcere este conceptual mai dificil de explicat dect cel de la prima treapt.
Pentru cei interesai detaliile se afl n Bard i Faulkner. Un sistem simplu,
reversibil poate fi identificat prin compararea valorile curentului direct i
invers msurat n acelai interval de timp, dup fiecare treapt de potenial.
De exemplu, valorile curentului msurat la un moment egal cu /2, dup
fiecare treapt (notat ir i if n figura 22) pentru un astfel de sistem ar duce
la o valoare egal cu 0.293 pentru raportul dintre [-ir (2)/if ().Prezena
unei reacii chimice dup etapa de transfer de electroni va duce la un raport
diferit de aceast valoare teoretic.
Cronoamperometria se preteaz bine la msurarea exact a ariei electrodului (A) prin utilizarea unui cuplu redox bine-definit (cu n, Co si Do
cunoscute]. Cu o suprafa de electrod cunoscut, sunt uor de realizat msurtori, fie de n, fie de D0 pentru o specie electroactiv. Metoda dublei
trepte de potenial este deseori aplicat n msuratori de constante de vitez pentru reacii chimice (inclusiv produi de adsorbie) care apar n urma
primei trepte de potenial.
6.Bibliografie
1.
2.
488
3.
Anexa 1.
Criterii de identificare pentru voltametria ciclic cu specia redox n soluie
ip = (2.687 *105) n3/2 AD1/2 v1/2C* [A]; se calculeaz D
Sisteme reversibile
28.5 [mV]
RT
E p - E1/2 = - 1.109
=
n
nF
RT
28.5 [mV]
Sisteme
cvasi-reversibile
1/2
nF
i p = nFAC* D1/2
(E) v1/2
Ox RT
RT
Ep/2 - Ep = ( , )
nF
ko
=
nF
D1 D
Ox Red RT
1/2
D /2
ox k
, se calculeaz ks
s
D
v 1 / 2
= Re d
1/2
nF
Dox
RT
Sisteme ireversibile,
ip = (2.99 *105) n(na)1/2 A D1/2 v1/2 C* [A], se calculeaza D
na
=
numr
de
1/2
, se calculeaza ko
D1/2
RT
n F
electroni transferai n E p = E o' 0.78 + ln Ox + ln a + lnv1/2
o
n a F
RT
k
etapa determinat de
vitez
47.7 [mV], se calculeaza na
E p - E p/2 =
n a
[Pentru identificarea notaiilor i detalii vezi: Nicholson, Anal. Chem. 1965, 37(11), 1351]
489
Fe(CN)6 + e
Fe(CN)6
-4
(1)
(B)
(A)
600
I / A
400
200
0
anodic
5 m V /s
1 0 m V /s
2 5 m V /s
5 0 m V /s
7 5 m V /s
1 0 0 m V /s
2 5 0 m V /s
5 0 0 m V /s
7 5 0 m V /s
9 0 0 m V /s
catodic
I/A
800
1E-4
-2 0 0
10
-4 0 0
100
1000
-1
v / (mV *s )
-6 0 0
-0 .2
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
/ V vs. ESC
(C)
400
300
200
anodic
/ A
500
catodic
/ A
100
0
-1 0 0
-2 0 0
-3 0 0
-4 0 0
0 ,0
0 ,2
0 ,4
1 /2
0 ,6
/ (V /s )
0 ,8
1 ,0
1/2
(2)
catodic
R = 0.9994, n=6
R = 0.9976, n = 6
R =0.9992, n=6
R = 0.9982 n = 6
tabelul
2,
care
(3)
conine
parametrii
electrochimici
ai
Porfiria este o boal ereditar cauzat de o tulburare a sintezei hemului (fraciunea neproteic
a hemoglobinei) i caracterizat prin acumularea n esuturi a unor substane intermediare ale
acestei sinteze, porfirinele. Porfiriile sunt boli foarte rare.
11 Porfiria intermitent acut se manifest de cele mai multe ori la vrsta adult prin dureri
abdominale acute, uneori prin crampe, printr-o slbiciune muscular i prin tulburri psihice.
Urinele devin roii atunci cnd sunt lsate s atepte. Numeroase medicamente, ca barbituricele,
contraceptivele orale, sulfamidele si fenitoina, se afl la originea acestor crize.
12 Hematin, hematine, (s.f.) pigment care provine din snge i conine fier. din fr. hmatine
[Dicionarul explicativ al limbii romne, Academia Romn, Institutul de Lingvistic Iorgu
Iordan, Editura Univers Enciclopedic, 1998].
13 Haemophilus influenzae sunt cocobacili Gram negativi, mici (1 - 1,5/0,3 m), cu bacili scuri,
drepi, cu capete rotunjite, pleomorfic. Este non-motil, nu formeaz spori, facultativ anaerobe.
14 Potenialul formal standard se calculeaz ca media aritmetic a potenialelor de peak anodic i
catodic.
10
493
voltamogramelor din figura 4A se observ c la viteze de baleiaj care depesc 300 mV*s-1, separarea peak-urilor (Ep) devine superioar valorii de
59/n mV, indicnd transformarea procesului reversibil, ntr-unul
cvasi-reversibil.
(B)
300
200
=
=
=
=
=
=
=
anodic
-1
10 m V*s
-1
20 m V*s
-1
100 m V*s
-1
300 m V*s
-1
500 m V*s
-1
1000 m V*s
-1
1500 m V*s
catodic
100
log I
I/A
100
v
v
v
v
v
v
v
-100
10
-200
1
-300
-750
-500
-250
10
100
1000
log v
(C )
100
cat
/A
an
/ A
200
-1 0 0
-2 0 0
-3 0 0
0
500
1000
v / m V *s
494
-1
1500
Epa
mV vs ER
-420.0
-420.0
-420.0
-420.0
-415.1
-405.3
-405.5
-400.6
-391.7
-370.2
-361.0
Epc
mV vs ER
-420.0
-440.0
-439.9
-439.9
-444.8
-454.6
-454.4
-464.3
-478.7
-484.7
-506.4
Ipa
A
0,88
2,51
8,54
12,34
18,11
35,88
54,17
86,10
117,10
157,70
229,20
Ipc
A
-5,86
-7,08
-13,29
-16,94
-23,76
-44,53
-67,86
-108,90
-146,70
-200,50
-286,30
E =Epa-Epc
mV vs ER
0
20.0
19.9
19.9
29.7
49.3
48.9
63.7
87.0
114.5
145.4
Eo
Ipa/Ipc
420
430
429.95
429.95
429.95
429.95
429.95
432.45
435.2
427.45
433.7
0.15
0.35
0.64
0.73
0.76
0.81
0.80
0.79
0.80
0.79
0.80
pH
6.48
8
8.82
proces catodic
0.91835 0.0096
0.9995/11
0.82581 0.0318
0,99337/11
1.09837 0.0454
0.9924/11
comportrii
sistemului
(4)
a ox a p +
RT
H
ln
E=E +
nF
a red
a
RT
sau
E = E 0' +
ln ox
a red
nF
0
(5)
(6)
495
RT
p
ln a H + sau E 0' = E 0 0.059 pH , la 25 C (7)
nF
n
Comportamentul electrochimic al heminei (Fe(III)P) n soluie este influenat de pHul soluiei. Experimentele au fost efectuate n domeniul de
pH 6.5 - 10.5 n tampon 0.5 mM TRIS-HCl + 0.1 M KBr [Li M-Xl., 1997]. n
domeniul de pH studiat se observ o deplasare a voltamogramelor spre
valori de potenial mai negative odat cu creterea pHului soluiei (figura
4A). Parametrii electrochimici ai voltamogramelor sunt sintetizai n tabelul
4. Pantele dependenei potenialului formal standard n funcie de pH (figura 4B), indiferent de viteza de baleiaj, este n jur de de -47 mV*pH-1 (tabelul 5). Aceast valoare este apropiat de valoarea teoretic de 56 mV*pH-1
(conform ecuaiei 7) la 25 C, indicnd c 1 H+ este cuplat la transferul de
electroni ai heminei n timpul reaciei de electrod [Yang J., 1999]. Peste pH
>8, panta dependenei o vs. pH reflect formarea complexului
bis(hidroxo) al heminei:
unde: E 0' = E 0 + p
(H2O)(OH)Fe(III)P (OH)2Fe(III)P +
H+
(8)
+ e- (H2O)(OH)Fe(II)P
(9)
(B)
(A)
-300
10
v = 500 mV s
-350
-1
v = 300 mV s
-1
v =
-1
50 mV s
/ mV
I/mA
-10
-20
-800
-600
-400
-200
-450
o'
pH 7.16
pH 7.64
pH 8.0
pH 8.31
pH 8.82
pH 9.26
pH 9.7
-400
-500
-550
10
pH
Figura 4. (A) Influena pHului asupra voltamogramelor sistemului G//Fe(III)P si (B) dependena Eo
vs. pH. Condiii experimentale: electrolit, TRIS 0.05 M; viteza de baleiaj, 50 mV/s; potenial de start,
-0.85 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluie dezaerat.
496
v = 500 mV/s
Ec
Ea
(mV vs.
ER)
(mV vs.
ER)
(mV vs.
ER)
(mV)
(mV vs.
ER)
(mV vs.
ER)
(mV)
9,7
9,26
8,82
8,31
8,08
7,64
7,157
6,48
-455.2
-435.8
-430.2
-401.7
-400.6
-386.3
-353
-302.3
-539.7
-516.1
-497.7
-476.2
-464.3
-445.6
-425
-397.6
-465.6
-450.2
-436.6
-405.5
-385.2
-360.8
-292.3
-539.3
-505.7
-485.3
-454.4
-439.3
-411.1
-387.6
-502,45
-477,95
-460,95
--429,95
-412,25
-385,95
-339,95
-510
-460
-448
-424
-420
-390
-368
-324
-529.9
-479.9
-453.9
-421.9
-439.9
-419.9
-395.9
-367.9
-519.95
-469.95
-450.95
-422.95
-429.95
-404.95
-381.95
-345.95
Eo
-497,45
-475,95
-463,95
-438,95
-432,45
-415,95
-389
-349,95
v = 300 mV/s
Ea
Ec
Eo
v = 50 mV/s
Ea
Ec
Eo
Eo vs pH
Eo = -28.45 (48.88 3.79) pH
Eo = -38.55 (47.94 2.21) pH
Eo = -70.82 (44.26 1.82) pH
R/n
0.9824/8
0.99475/7
0.99493/8
3.1. Influena vitezei de baleiaj asupra comportrii heminei adsorbit (G/SWCNTFe(III) P-Nafion) pe electrod de grafit
Curentul de peak pentru sistemele redox adsorbite depinde de viteza
de baleiaj conform ecuaiei:
Ip =
n 2 F2
A 0* v
4RT
(10)
(B)
300
Ipa/ A
50
200
100
0
-100
-25
-50
-750
-500
-250
20 mV s
-1
50 mV s
-1
70 mV s
-1
200 mV s
-1
400 mV s
-1
500 mV s
-1
250
Ipc / A
I / A
25
-200
-300
-400
0
500
1000
1500
v / mV*s
2000
2500
-1
498
Ea
mV/s
Ipa
Ec
Ipc
E a - Ec
Eo
Ipa/Ipc
-540
1,285
-554
-1,252
-4
-542
1.02
10
-520
2,415
-544
-2,713
-24
-532
0.89
30
-516
7,068
-552
-8,264
-36
-534
0.85
50
-518
11,57
-552
-13,71
-34
-535
0.84
70
-512
15,8
-558
-18,85
-46
-535
0.84
100
-510
22,04
-560
-26,33
-50
-535
0.84
300
-498
61,49
-580
-74,45
-82
-539
o.83
500
-490,1
93,46
-596
-112,4
-105,9
-543,05
0.83
700
-475,1
120,6
-608,2
-160,1
-133,1
-541,65
0.75
1000
-456
164,2
-620
-195
-164
-538
0.84
1500
-449,2
219
-641,2
-258,2
-192
-545,2
0.85
2000
-429,9
272,8
-660
-320,5
-230,1
-544,95
0.85
R = 0.99923, n = 12
catodic
R = 0.99815, n = 12
499
16
14
12
10
8
1/m
Ep
18,8
27
34,8
48,8
61,2
72,2
82,4
91,8
100,6
130
142,4
153,8
164
173,4
182
190
197,6
204,6
6
4
2
0
0
50
100
150
200
Ep
Figura 6. Dependenta 1/m dEp conform datelor din Laviron E., 1979.
m-1
Ep
G/SWCNT
Fe(III)P-Nafion
-4
-24
0,6587
-36
1,0463
-34
0,9759
-46
1,4
-50
1,55
-82
2,982
-105,9 4,36
-133,1 6,256
-164
9,0058
-192
12,281
-230,1
4.3672 0.302
n=5
ks / s-1
0,59159
1,11731
1,99652
1,94841
2,51408
3.92034
4.46883
4.36025
4.32701
4.75957
Ep/mV m-1
G/SWCNT(UC)
Fe(III)P-Nafion
-50
1,55
-35
1,013
-45
1,3651
-55
1,7527
-55
1,7527
-55
1,7527
-80
2,8
-104,7
4,28
-124.9
5,659
-144.5
7,186
-180.4
10,816
-209
4,875 0,542
n=5
ks / s-1
0,1257
0,38468
0,85638
1,11166
1,55633
2,22332
4,17516
4,55236
4,82024
5,42279
5,40424
Ep/mV m-1
G/SWCNT(KOH)
Fe(III)P-Nafion
-20
0,536
-25
0,69
-20
0,536
-35
1,013
-30
0,85
-40
1,185
-40
1,185
-54.9
1,75
-74.2
2,599
-89.5
3,376
-122.6
5,4952
-135
6,4065
10,973 0,817
n= 6
ks / s-1
0,36351
0,56476
2,18105
1,9234
3,20914
3,28845
9,86536
11,13376
10,49547
11,5427
10,63697
12,1652
Diferena Ep < 200/n mV indic un transfer de electroni rapid. Constanta de vitez a transferului de electroni ks poate fi estimat din ecuaia:
ks = m n F V / (RT)
unde: m = parametru care depinde de Ep (conform figurii 6).
500
(11)
Viteza de transfer de electroni rapid este rezultatul puternicilor interaciuni dintre Fe(III)P i micromediul format din SWCNT si Nafion [Dai Z.,
2004].
(A)
300
40
200
20
I /A
I / A
100
-20
-100
-1
5 mV s
-1
10 mV s
-1
-200
30 mV s
-40
-1
70 mV s
-60
-400
-300
-200
-100
100
200
-300
0.0
0.5
v
1.0
1/2
1.5
-1 1/2
/ (V*s )
n tabelul 10 sunt sintetizai parametrii electrochimici ai voltamogramelor obinute pe sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion, n scopul trasrii dependenei log I - log v i apoi I - v1/2 (figura 7B).
501
v1/2
(V/s)1/2
0,07071
0,1
0,17321
0,22361
0,26458
0,31623
0,54772
0,70711
0,83666
1
1,22474
1,41421
Ipa
(A)
9,727E-6
1,332E-5
2,402E-5
2,798E-5
3,869E-5
4,781E-5
8,975E-5
1,217E-4
1,661E-4
2,072E-4
2,405E-4
Ipc
(A)
-9,043E-6
-1,318E-5
-2,279E-5
-2,926E-5
-3,809E-5
-4,542E-5
-8,924E-5
-1,074E-4
--1,571E-4
-1,899E-4
-2,19E-4
Proces
Ecuatia de
liniarizare
R
n
A (cm2)
Amediu
anodic
catodic
I = -5.8972 10-6 + I = 3.26707 10-6 1,74056 10-4 v1/2
1,5828 10-4 v1/2
0.9995
0.9995
11
11
0.01684
0,01532
0,0161 cm2
502
-0,50
10
I / A
-5
pH 6.04
pH 7.3
-10
-0,60
-0,65
pH 8.57
-0,55
G/SWCNT(UC)-Fe(III)P-Nafion
-15
G/SWCNT(KOH)-Fe(III)P-Nafion
-800
-600
-400
-200
E / mV vs Ag/AgCl, KClsat
-0,70
6,0
6,5
7,0
7,5
pH
8,0
8,5
9,0
G/SWCNT(UC)Fe(III)P-Nafion
Ea
Ec
Eo
(mV vs. ER) (mV vs. ER)
(mV)
-510
-560
0.535
-510
-560
0.535
-510
-560
0.535
-500
-540
0.52
-585
-620
0.602
-570
-615
0.5925
-570
-615
0.5925
-595
-630
0.6125
-600
-655
0.6275
G/SWCNT(KOH)Fe(III)P-Nafion
pH
Ea
Ec
Eo
(mV vs. ER) (mV vs. ER) (mV)
6.04 -545
-570
0.5572
6.3
-520
-540
0.53
6.6
-540
-560
0.55
6.9
-500
-540
0.52
7.3
-600
-620
0.61
7.68 -590
-615
0.6025
8.04 -600
-640
0.62
8.57 -650
-690
0.67
503
Tabelul 12. Regresia dependentei Eo- pH. Condiii experimentale: vezi figura 8.
Electrod
G/SWCNT(UC)Fe(III)P-Nafion
G/SWCNT(KOH)Fe(III)P-Nafion
Eo - pH
E' = -0.157 - 0.0562 pH
E' = -0.165 - 0.0577 pH
R/n
0.945/ 6
0.990 /5
A
F S *v
(mol/cm2)
(12)
(A)
15
c ic lu l 5
10
c ic lu l 1 0 0
c ic lu l 5 0
-2
/ mol*cm
5
0
-1 0
N T -S D S
= 7 .4 3 3 * 1 0
-9
+ 4 .5 9 1 * 1 0
-1 4
R = 0 .7 3 5 , n = 1 6
20
cat
-1 5
60
40
-10
-5
| * 10
I / A
80
-2 0
-8 0 0
-6 0 0
-4 0 0
-2 0 0
E / m V v s A g /A g C l, K C l s a t
1000
2000
3000
4000
tim e / s
504
Timpul
de scanare
(s)
38
190
380
570
760
950
1140
1330
1520
1710
1900
2280
2660
3040
3420
3800
Eld 1
Apc
(C)
3,008E-6
2,879E-6
2,836E-6
2,861E-6
2,8519E-6
2,8768E-6
2,8894E-6
2,8634E-6
2,8719E-6
2,874E-6
2,872E-6
2,8826E-6
2,8757E-6
2,8749E-6
2,8777E-6
2,9044E-6
pa
(mol/cm2)
8,82406E-9
8,44563E-9
8,31949E-9
8,39283E-9
8,36613E-9
8,43918E-9
8,47614E-9
8,39987E-9
8,4248E-9
8,43096E-9
8,4251E-9
8,45619E-9
8,43595E-9
8,43361E-9
8,44182E-9
8,52014E-9
Eld 2
Apc
(C)
2,1248E-6
2,2292E-6
2,192E-6
2,1898E-6
2,1898E-6
2,2088E-6
2,2424E-6
2,2438E-6
2,2553E-6
2,233E-6
2,3074E-6
2,2823E-6
2,2388E-6
2,2877E-6
2,2783E-6
2,287E-6
pc
(mol/cm2)
6,23316E-9
6,53942E-9
6,4303E-9
6,42384E-9
6,42384E-9
6,47958E-9
6,57815E-9
6,58225E-9
6,61599E-9
6,55057E-9
6,76883E-9
6,6952E-9
6,56759E-9
6,71104E-9
6,68346E-9
6,70898E-9
pc, mediu
(mol/cm2)
7,52861E-9
7,49253E-9
7,37489E-9
7,40834E-9
7,39499E-9
7,45938E-9
7,52714E-9
7,49106E-9
7,5204E-9
7,49077E-9
7,59696E-9
7,57569E-9
7,50177E-9
7,57232E-9
7,56264E-9
7,61456E-9
4. Concluzii
a. S-au studiat prin voltametrie ciclic att n soluie, ct i imobilizat
pe electrod de grafit, doi compui care conin Fe(III): K3[Fe(CN)6]
(compus cu comportament standard) i hemina (Fe(III)P, compus cu
proprieti biologice).
b. Studiul compusului standard n soluie pe electrod de platin a
permis determinarea coeficientului de difuzie, D, utiliznd ecuaia
Randles Sevcik (ecuaia 2) specific transferului de electroni difuziv.
c. Studiul sistemului G//Fe(III)P la diferite viteze de baleiaj a stabilit
c compusul studiat (Fe(III)P) se adsoarbe pe suprafaa electrodului
(panta logI-log v aproximativ 1).
d. Studiul efectului pH-ului asupra sistemului G//Fe(III)P a permis
stabilirea c n procesul de transfer de electroni intervin i protonii
(ecuaia 9, panta Eo-pH n jur de 59 mV/pH).
505
5. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
506
Bard A.J., Faulkner L.R., Electrochemical Methods, Wiley-VCH, New York, 1980, p. 522.
Ciszewski A., Milczarek G., Anal. Chem., 2000, 72 (14), 3202-3209.
Dai Z., Liu S., Ju H., Chen H., Biosensors Bioelectronics 2004, 19, 861-867.
Honeychourch M. J., Rechnitz G.A., Electroanalysis 1998, 10, 285-293.
Hrapovic S., Luong J. H. T., Anal Chem., 2003, 75(14), 3308-3315.
Laviron E., J. Electroanal. Chem. 1979, 101, 19-28.
Li M-X., Li N-Q., Gu Z-N., Zhou X-H., Sun Y-L., Wu Y-Q., Anal. Chim. Acta, 1997,
356, 225-229.
Long D.D, Marx K.A. Zhou T., J. Electroanal. Chem., 2001, 501, 107-113.
Murray RW (1983) Chemically modified electrodes, in Electroanalytical
chemistry, Bard A. J. (ed), vol. 13, Marcel Dekker, New York, p. 191.
Trevin S., Bedioui F., Devynck J., J. Electroanal. Chem., 1996a, 408, 261-265.
Trevin S., Bedioui F., Devynck J., Talanta, 1996b, 43, 303-311.
Wang B., Zhang J., Cheng G., Dong S., Anal. Chim. Acta, 2000, 407, 111-118.
Yacynych, A. M.; Kuwana, T. Anal. Chem. 1978, 50, 640-645.
Yang J., Hu N., Rusling J. F., J. Electroanal. Chem., 1999, 463, 53-62.
Ye J.-S., Wen Y., Zhang W.D., Cui H.-F., Gan L.M., Xu G.Q., Sheu F.-S., J.
Electroanal. Chem., 2004, 562, 241-246.
6. Anex
Reactivi
Clorura
de
protoporfirina
IX
fier(III)
(Fe(III)P),
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propandiol(tris-(hidroximetil)amino
metan)
(TRIS) i bromura de potasiu s-au achiziionat de la Fluka Buchs, Switzerland. Nanotuburile de carbon cu un singur perete (SWCNT), dodecil sulfatul de sodiu (SDS) i Nafionul s-au procurat de la Sigma (SUA), iar apa oxigenat (soluie 30% w/v) de la J. T. Baker i nitritul de sodium de la Merck.
Soluia de electrolit este tamponul fosfat (PB) care conine 0.1M KBr
(pH 7.5) i a fost preparat din 0.05 M NaH2PO4, 0.05 M Na2HPO4 i 0.1 M
KBr (Fluka Buchs, Switzerland) i pHul ajustat cu HCl.
Soluia 0.5 mM Fe(III)P s-a preparat prin dizolvarea srii n tampon
0.05 M TRIS-HCl + 0.1 M KBr (pH 8). Soluiile de tampon 0.1 M KBr, 0.05 M
TRIS i 0.05 M PB au fost preparate cu ap distilat i pstrate la frigider
pentru a mpiedica creteri bacteriene. Ajustrile de pH s-au fcut cu soluii
de HCl i NaOH (Carlo Erba, Italy).
Toi reactivii au fost de puritate analytical i s-au utilizat fr alte purificri.
Aparate
Msurtorile de voltametrie ciclic s-au fcut cu o combin electrochimic PGStat 10 (Autolab EcoChemie, Olanda). Celula electrochimic cu un
compartiment a fost echipat cu un electrod de lucru din grafit (2.5 mm
diameter) (Ringsdorff-Werke, Gmbh, Bonn-Bad Godesberg, Germany), un electrod de referin AgAgCl, KClsat (Radiometer, Frana) i un contraelectrod
de platin. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura camerei, n
soluii dezaerate prin barbotare de argon.
507
508
de mas (sau de volum) de adsorbant este mai mare, cu att suprafaa specific este mai mare. Unitatea de msur pentru suprafaa specific este
m2/g.
Suprafaa specific are o importan deosebit la procesele de adsorbie, cataliz eterogen i la reaciile de suprafa.
Cea mai folosit tehnic pentru estimarea suprafeei specifice este metoda BET. Mai jos sunt descrise doar cteva dintre aplicaiile cele mai utilizate ale analizelor de suprafa i a msurtorilor de porozitate:
Produse farmaceutice Analizarea suprafeei specifice si porozitatea joac
roluri importante n capacitatea de a purifica, procesa, amesteca i comprima un medicament. Rata de dizolvare (care reglementeaz rapiditatea cu
care medicamentul devine disponibil pentru organism) depinde de suprafaa i de porozitatea materialului.
Produse ceramice Analizarea suprafeei specifice i informaiile legate de
porozitate sunt necesare pentru obinerea unui produs final cu aspect, textur i densitate dorit.
Crbuni activi Suprafaa specific i porozitatea trebuie s fie optimizate,
n intervale nguste pentru a realiza n mod corespunztor recuperarea vaporilor de benzin n automobile, recuperarea solvenilor n operaiunile de
vopsire sau controlul polurii n managementul apelor reziduale.
Negru de fum Productorii de cauciucuri au descoperit c suprafaa de
carbon afecteaz durata de via, traciunea si performana cauciucurilor.
Utilizarea prevzut a cauciucului, sau tipul de vehicul pe care va fi plasat
acesta, determin dac suprafaa de carbon necesar trebuie s fie sczut
sau ridicat.
Vopsele i straturi de acoperire Suprafaa pigmentului sau a materialului de
umplere influeneaz luciul, textura, culoarea, saturaia culorii, luminozitatea
si proprietile de adeziune ale filmului. Porozitatea poate controla proprietile aplicrii, cum ar fi fluiditatea, timpul de uscare i grosimea filmului.
Propelani Suprafaa specific a propelantului utilizat n fabricarea de
muniii afecteaz n mod direct rata de ardere. O rat ridicat poate fi periculoas, iar o rat sczut de ardere poate provoca defeciuni si lips de
acuratee.
Implanturi medicale Suprafaa specific i porozitatea materialelor utilizate
n implanturile medicale influeneaz aderena materialului pe os sau pe
esuturile naturale.
510
Electronice Fabricarea condensatorilor compaci utiliznd un numr minim de materii prime costisitoare necesit dezvoltarea unui material cu
suprafaa controlat, avnd o reea de pori atent proiectat.
Aerospace Porozitatea scuturilor termice i materialele izolante afecteaz
att greutatea ct i funcionarea.
Nanotuburi Analizele de microporozitate sunt utilizate pentru a anticipa
capacitatea unui material de a stoca hidrogen.
Celule de combustibil Electrozii celulelor de combustibil necesit porozitate
controlat pentru a produce densitate de putere optim [1,2,3].
Metoda BET se folosete foarte mult n studiul materialelor pentru determinarea suprafeei solidelor prin intermediul adsorbiei fizice ale moleculelor de gaz. Brunauer, Emmet si Teller au descris 5 izoterme de baz
care sunt grafice ale volumelor de gaz adsorbit n raport cu presiunea. Tratarea matematic a izotermelor de adsorbie este dificil i n general se
pleac de la modele simplificate ale solidului i ale adsorbiei. S-a ajuns
totui ca, din izotermele de tipul II i IV, s se poat calcula suprafaa specific a solidului. n unele cazuri, pentru materiale microporoase i la
chemisorbie pot fi folosite i izotermele de tipul I. Din izotermele de tipul
III i V nu se poate determina suprafaa total. Brunauer, Emmett i Teller
pleac de la urmtoarele ipoteze:
adsorbia este localizat pe anumite centre active;
fiecare centru activ poate adsorbi numai o molecul;
energia de adsorbie a particulelor este identic pentru toate particulele adsorbite i nu depinde de prezena sau absena altor particule pe centrii vecini.
La aceste ipoteze, se mai adaug i presupunerea c o molecul din
primul strat adsorbit poate constitui un centru de adsorbie pentru o molecul din al doilea strat, iar acesta din urm pentru al treilea strat etc.
Brunauer, Emmett i Teller presupun c exist un echilibru dinamic ntre
moleculele adsorbite i cele din faza gazoas. Ei mai presupun c la primul
strat de adsorbie energia de adsorbie este E1,iar la celelalte straturi este
mai mic i egal cu cldura latent de condensare a adsorbatului. Izoterma
de tip 1 este caracteristic solidelor pe care sunt formate doar monostraturi
adsorbite. Moleculele adsorbatului pot fi considerate ca fiind depozitate pe
suprafaa ntr-un strat de grosime monomolecular. Pe masur ce presiunea crete, volumul de gaz adsorbit crete rapid pn cnd se formeaz un
monostrat; creterile ulterioare de presiune nu au ca rezultat adsorbia unei
511
cantiti mai mari de gaz (chiar dac aceast cretere se face pn la presiunea vaporilor saturai Po).
Principiul de analiz: proba de analizat se scufund n azot lichid, azotul
din amestecul de gaz care trece prin celul se lichefiaz i se depune ntr-un
strat de grosime molecular pe suprafaa i pereii porilor probei [4].
La baza acestui model st teoria lui Langmuir, i anume teoria adsorbiei n strat monomolecular, care poate fi extrapolat pentru adsorbia n
mai multe straturi, avnd n vedere urmtoare ipoteze: i) moleculele de gaz
se adsorb fizic pe solid n straturi infinite; ii) nu exist interaciune ntre
straturile adsorbite; iii) teoria lui Langmuir poate fi aplicat pentru fiecare
strat. Ecuaia BET poate fi exprimat [5,6,7]:
1
c 1 P
1
( )+
=
V [( P0 / P ) 1 ] Vm c P0
Vm c
(1)
c = exp(
E1 E L
)
RT
(2)
(3)
Unde:
St suprafaa total a probei supuse analizei
K - o constant pentru nitrogen K= 4,03
P/Po = 0,294 pentru amestec de gaz de 30% (vol.) N2 i 70% (vol.) He
Va = Volum de gaz (N2) adsorbit
Fiecare cm3 de N2 adsorbit (apoi desorbit) de ctre prob este echivalent
cu o suprafa total (St) de 2,84 m2 . Suprafaa specific se calculeaz mprind St la masa probei din celula n grame [8].
512
ncHAP >90 m
ncHAP >45 m
ncHAP >90 m + Cd (10-3 M)
cHAP >90 m
ncHAP-SiO2 5% >45 m
ncHAP-SiO2 10% >63 m
ncHAP-SiO2 10% <45 m
ncHAP-SiO2 15% >45 m
m2/g
31.2 - 54.4 (3x)
73.7 (2x)
71.5 (2x)
2.5 (3x)
89.8 (3x)
120.9 (2x)
124.4 (2x)
87.8 (2x)
Volumul mediu al
porilor
mL/g
0.15 - 0.16 (3x)
0.24 (2x)
0.23 (1x)
0.006 (1x)
0.28 (1x)
0.41 (2x)
0.46 (1x)
0.25 (1x)
516
3. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Bratu, E. A., Operaii i utilaje n industria chimic, Ed. Tehnic, Bucureti, 1970
http://www.infim.ro/~biomat/physisorption.html
Q. Jiang, a, b, , and Y. Zhaoa, Microporous and Mesoporous Materials, Volume 76,
Issues 1-3, 215-219
G. Fagerlund, Determination of specific surface by the BET method, Materials and
Structures, 6, 3, 239-245, 1973, DOI: 10.1007/BF02479039
D. Dollimore, P. Spooner, A. Turner, The bet method of analysis of gas adsorption
data and its relevance to the calculation of surface areas, Surface Technology, 4, 2,
1976, 121-160, doi:10.1016/0376-4583(76)90024-8
S. Brunauer, P.H. Emmett and E. Teller, J. Am. Chem. Soc. 60 (1938), p. 309
J.U. Keller and R. Staudt, Gas Adsorption Equilibria. Experimental Methods and
Adsorptive Isotherms, Springer, Heidelberg, 2004.
www.porotec.de
http://www.malvern.com/LabEng/technology/laser_diffraction/gas_adsorption
_bet.htm
http://www.thermo.com.cn/Article.aspx?ID=189
Bogya Erzsebet-Sara: Studii cinetice i de echilibru ale unor procese de reinere pe
materiale apatitice, tez de doctorat, 2010, Cluj-Napoca, UBB
S. J. Eichhorn and W. W. Sampson, Journal of the Royal Society, 2010 vol. 7 no. 45,
p. 641-649
S. Bau, O. Witschger, F. Gensdarmes, O. Rastoix, D. Thomas, Powder Technology,
Volume 200, Issue 3, 28 June 2010, p. 190-201
Q. Jiang, Y. Zhao, Microporous and Mesoporous Materials, Volume 76, Issues 1-3, 1
December 2004, p. 215-219
S. Kaufhold, R. Dohrmann, M. Klinkenberg, S. Siegesmund, K. Ufer, Journal of
Colloid and Interface Science, Volume 349, Issue 1, 1 September 2010, p. 275-282
517
518