Universitatea Babes Bolyai Cluj Napoca

Facultatea de Stiinta Mediului

Drojdiile ca agenţi
biotehnologici
- proiect la Microbiologie –

ISBE, an II, gr.1

2009
  Microorganismele incluzând bacteriile, drojdiile, fungii filamentoşi şi algele
unicelulare au fost folosite în culturi submerse pentru obţinerea diferitelor produse printre
care şi biomasa proteică. De la începuturile producţiei pe scară largă de penicilină,
streptomicină şi de alte antibiotice şi până la conversia steroizilor de către o varietate de
microorganisme, s-au dezvoltat şi o serie de echipamente pentru culturile submerse dintre
care, mai utilizate sunt două tipuri: bioreactorul cu agitare mecanică, cu diferite variante
de agitatoare şi sisteme de spargere a spumei, fermentatorul airlift care poate fi
considerat un hibrid între fermentatorul clasic cu agitare mecanică şi tipul cu draft al
fermentatorului airlift.
            Factorii limitativi ai dezvoltării celulare în astfel de echipamente de fermentaţie
sunt transferul de căldură şi transferul de masă, ultimul influenţând folosirea nutrienţilor,
în special a oxigenului de către celule precum şi cantitatea produşilor de metabolism.
            În jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogată literatură de specialitate, care
descrie efectul acestor factori asupra dezvoltării culturilor submerse microbiene, cu
punerea în evidenţă a factorului limitativ pentru producţia de masă celulară şi de
metaboliţi primari sau secundari.
            În Figura 1 sunt prezentate principalele aplicaţii industriale tradiţionale şi
moderne ale drojdiilor bazate pe exploatarea dezvoltării drojdiilor şi pe procesele
metabolice specifice acestora la nivel industrial.

Figura 1. Biotehnologii tradiţionale şi moderne bazate pe drojdii.

            Accentul este pus pe relaţia dintre fiziologia celulelor de drojdie şi biotehnologie
pe de o parte şi ADN recombinant şi tehnologiile de fermentaţie pe de altă parte. Privitor
la drojdiile non Saccharomyces, creşterea importanţei lor industriale este în particular
datorată producţiei masive de substanţe şi preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost
evidenţiată importanţa drojdiilor ca modele experimentale în studiile fundamentale ale
ştiinţelor biomedicale.
 Aspecte privind biologia drojdiilor
            Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece în cea mai mare măsură sunt
utilizate pentru producerea de alimente, vin, bere, substanţe bioterapeutice şi produse
farmaceutice. În prezent au fost recunoscute aproximativ şapte sute de specii de drojdie.
Deoarece drojdiile sunt adesea utilizate în biotehnologia tradiţională şi modernă,
descoperirea de noi specii este legată şi de noile tehnologii.
   Pentru descrierea domeniului drojdiilor au fost utilizate mai multe definiţii. În
conformitate cu Guilliermond (1912) şi Lodder (1970) drojdiile sunt fungi unicelulari cu
reproducere prin înmugurire ori fisiune. În acest sens, s-a recunoscut că drojdiile sunt
fungi unicelulari adevăraţi, dar în realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice
şi produc pseudohife şi hife, pe lângă dezvoltarea unicelulară. Similar, majoritatea
fungilor hifali sunt dimorfici şi, în mod uzual, aceştia au fost denumiţi yeast – like.
            Identificarea, numirea şi plasarea drojdiilor în propiul lor cadru evolutiv sunt
importante pentru multe domenii ale ştiinţei care includ agricultura, medicina, ştiinţele
biologice, biotehnologia, industria alimentară.
            Investigaţii comparative care includ morfologia, fiziologia, genetica, biochimia,
ecologia şi genetica moleculară, au îmbogăţit taxonomia drojdiilor.
            Prima perioadă în sistematica drojdiilor care se situează până la nivelul anilor
1960, este caracterizată prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriţională
comparată şi genetică convenţională.
            Iniţial pentru utilizări taxonomice se foloseau teste care se refereau la numărul
atomilor de carbon asimilaţi şi la folosirea compuşilor azotului. Wickerman (1951) a
extins aceste cercetări şi astăzi aproximativ un număr de 60 de teste sunt utilizate curent
şi ele includ fermentaţia şi asimilarea compuşilor carbonului, asimilarea compuşilor
azotului, cerinţele în vitamine, rezistenţa la cycloheximide, necesităţi de temperatură.
            Studiile genetice relevă prezenţa diferitelor stadii sexuale. Ciclul sexual la
ascomicete poate fi haplontic, diplontic ori diplohaplontic. Speciile de drojdii pot fi
homotalice, heterotalice, sau o combinaţie a acestora.
            A doua perioadă în sistematica drojdiilor este considerată de la 1960 până în
prezent, şi este caracterizată printr-o aprofundare a studiului caracterelor morfologice
datorită introducerii microscopiei electronice, a aplicării criteriilor biochimice şi a
introducerii studiilor de genetică moleculară. Microscopia cu transmisie de electroni a
relevat diferenţe între drojdiile ascomicete şi bazidiomicete. Drojdiile ascomicete au
pereţii celulari transparenţi la electroni şi conţin în majoritate β - glucani, pătura externă
fiind formată din α - manani. Drojdiile bazidiomicete au pereţii celulari cu o structură
lamelară netransparentă la electroni şi formaţi în majoritate din β - glucani. Formarea
mugurelui este de asemenea diferită la cele două grupuri de drojdii. Drojdiile ascomicete
prezintă o înmugurire holoblastică, care constă în participarea întregului perete celular, la
formarea noului perete, a mugurelui pe când la drojdiile bazidiomicete care au o
înmugurire enteroblastică, participă numai stratul interior al peretelui celular.
            Ultrastructura septului arată diferenţe importante între cele două clase de drojdii.
Septul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai mulţi micropori. Septul simplu are
un singur por central, pe lângă unii pereţi despărţitori de la unele bazidiomicete, care au o
structură de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membrană perforată numită
parentezom.
            Pentru diferenţieri taxonomice au fost utilizate caracteristici biochimice,
compoziţia în glucide a pereţilor celulari şi capsulelor, spectrul de rezistenţă magnetică a
pereţilor celulari, numărul unităţilor izoprenice din coenzima Q, citocromii, compoziţia în
acizi graşi şi paternul izoenzimelor.
            Introducerea studiilor ADN, furnizează în principal, un parametru obiectiv în
estimarea distanţelor evolutive din punct de vedere taxonomic. Diferitele metode utilizate
oferă soluţii la diferite niveluri taxonomice. Valoarea taxonomică a compoziţiei în baze a
ADN (mol% G+C) este în special caracteristică taxonomică de specie. Tulpinile
fenotipice care diferă au un procent mai mare de 2 – 3% în compoziţia bazelor, sunt
considerate specii diferite. Limitele în compoziţia de baze a ADN, diferă pentru drojdiile
ascomicete şi bazidiomicete. Cele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de
guanină şi citozină (mol% G+C) mai mic de 50, pe când majoritatea bazidiomicetelor au
acest procent peste 50 (Tabelul 1).

Tabelul 1. Distribuţia mol% G+C la diferite ascomicete şi bazidiomicete

Procentajul la drojdiile Procentajul la drojdiile

Mol% G+C
ascomicete bazidiomicete
25 - 20   0,75 -
30 - 34 14,5 -
35 - 39 28 1
40 - 44 32,5 1
45 - 49 16  10
50 - 54   5,5  35
55 - 59  2  31
60 - 64   0,75  18
65 - 69 - 4
            Studiile de hibridare a ADN au fost utilizate pentru determinarea similarităţilor
între specii. Metodele utilizate în aceste studii se referă la analiza spectrofotometrică a
formării heteroduplexului şi la cele fluorometrice şi colorimetrice.
            Tehnicile electroforetice utilizate în sistematica drojdiilor au creat posibilitatea
realizării de studii la nivelul cromozomilor individuali. Multe specii de drojdii au o
variaţie considerabilă ca număr şi dimensiune a ADN cromozomal.

Aspecte de genetică moleculară

Ingineria genetică, sau în sens strict tehnologia ADN recombinant a revoluţionat
rapid câteva domenii de bază în genetică şi biologia aplicată. În ultimii ani drojdia
Saccharomyces cerevisiae a fost utilizată ca model experimental pe care s-a studiat
expresia genelor din eucariotele superioare. În Figura 2 sunt prezentate schematic
procedeele de bază în tehnologia ADN recombinant la drojdii.
      La tulpinile de drojdii industriale aspectele de genetică moleculară se referă la
alegerea vectorilor, promotorilor, la selecţia markerilor şi la semnalele de secreţie.
Aplicaţiile biotehnologice sunt dependente de clonarea genelor heteroloage pentru
drojdii, izolate din ADN viral, procariote sau eucariote.
Figura 2. Procedeele de baza în ingineria genetica la drojdii.

            Numeroşi vectori plasmidiali au fost construiţi pentru transformarea genetică a

celulelor de drojdie (Tabelul 2). În general pentru o transformare cât mai eficientă a
celulelor de drojdie, vectorii trebuie să conţină:
-         secvenţe de plasmide bacteriene (E. coli), care servesc la producerea clonării şi
amplificării şi care permit ca ADN să se insereze în celula gazdă;
-         secvenţă (ARS) care se  replică autonom;
-         secvenţă centromerică (CEN) pentru stabilitatea segregării mitotice;
-         markeri selectaţi corespunzător şi avantajos;
-         unul sau câteva situsuri pentru enzimele de restricţie, care permit inserarea ADN
heterolog.

Tabelul 2. Vectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie

Tipuri de vector Exemple Caracteristici

Frecvenţe scăzute de integrare în loci cromozomali
Plasmidă
Plasmide de prin recombinare homoloagă. Ylps sunt integrate în
integrativă de
integrare copii singulare, iar transformanţii sunt stabili, chiar
drojdie (Ylp)
în absenţa presiunii selective.
Plasmide dePlasmidă Frecvenţe înalte de transformare (500 – 2000 de
replicare replicativă detransformanţi per ηg ADN) datorită elementelor
independentă drojdie (YRp) ARS care menţin replicarea extracromozomală.
Plasmidele sunt instabile pe timpul dezvoltării
 drojdiei datorită segregării asimetrice în diviziunea
celulară. Yrps sunt utilizate rar.
Acestea sunt derivate din plasmidele de 2 ηm din
Plasmidă
Saccharomyces cerevisiae cu origine în secvenţele
epizomală de
de replicare. Yeps sunt relativ stabile, susţinute
drojdie (YEp)
extracromozomal de 50 – 100 copii per celulă.
Includerea secvenţelor centromerice (CEN)
Plasmidele
funcţionale de drojdie, conduce la segregarea stabilă
centromerice de
în mitoză. Plasmidele sunt susţinute de 1 – 3
drojdie (YCp)
copii/celulă şi sunt stabile în diviziunea celulelor.
Plasmidă Acestea sunt plasmide cromozomale artificiale care
lineară deconţin secvenţe telomerice pentru susţinerea
drojdie (YLp) stagiului linear
Cromozomi artificiali, lineari liberi sunt foarte stabili
Cromozomi
(conţin secvenţe CEN). Sunt utilizaţi pentru
artificiali de
receptarea de inserţii libere de ADN, în analizele
drojdie (YACs)
genomului uman, bogate în tehnici fizice curente
Conţine promotor transcripţional şi secvenţe
Plasmide
Plasmidă determinale, de care genele heteroloage se pot lega. De
specializate
expresie (YXp) asemenea, conţin secvenţe pentru modificarea şi
secreţia proteinelor externe
pGKL1 şi 2 din Kluyveromyces lactis sunt plasmide
Plasmide Killer Killer lineare, care pot fi dezvoltate ca vectori de
clonare
Plasmide de
Utilizate pentru pierderea totală a secvenţei de
dezintegrare
vectori bacterieni.
(YDp)

         Promotorii sunt utilizaţi ca vectori de clonare în drojdii pentru mărirea transcripţiei
genelor de interes. Secvenţele promotor care derivă din drojdii sunt (homoloage) sau
heteroloage. Cei mai frecvenţi promotori constitutivi de drojdie sunt genele glicolitice
care conduc la o expresie transcripţională înaltă. Enzimele glicolitice din celule de
drojdie fermentate pot fi între 1 – 5% din totalul proteinei solubile, astfel că promotorii
ADH, PGK şi ENO sunt cel mai remarcabili în mărirea activităţii transcripţionale a
genelor heteroloage. Reglarea promotorilor este în primul rând facilitată de dezvoltarea
celulei de drojdie în absenţa expresiei genei heteroloage. Pe de altă parte, creşterea
biomasei poate fi temporar separată din expresia genei care controlează disponibilitatea
pentru anumiţi nutrienţi (galactaza în cazul GAL1, fosfatul în cazul PHO5, metionina în
cazul MET25 sauu ionii de cupru în cazul CUP1) (Tabelul 3).
Tabelul 3. Reglarea fiziologică a promotorilor transcripţionali în drojdii

Promotor Reglare fiziologică

Represat de glucoză, indus de galactoză
Represat de înalte şi indus de scăzute niveluri de fosfat
GAL1
anorganic
PHO5
Represat de glucoză, derepresat natural către sfârşitul
ADH2
dezvoltării pe glucoză
MFa1
Activ în celule MATa, inactiv în celule MATα sau a/α
MFα1
Indus de şiftul de temperatură scăzut
CUP1
Indus de ionii de Cu
MEL1
Indus de galactoză, represat de glucoză
MET25
Represat de metionină
Hibrid PGK/ARE
Indus de dihidrotestosteron
Hibrid CYC/GRE
Indus de deoxicorticosteron
PGK sau TPS/a 2 generator
Indus de siftul de temperatură scăzut
HSE
Indus de şocul de căldură (390C)
AOX1
Represat de glicerol, indus de metanol (în Pichia pastoris)
MOX1
Represat de glicerol, indus de metanol (Hansenula
polymorpha)
            Sifturile de temperatură pot fi, de asemenea, utilizate pentru reglarea expresiei
genelor heteroloage în drojdie.
            În mod particular activitatea transcripţională puternică a genelor heteroloage
poate fi găsită în drojdiile metilotrofe Hansenula polymorpha şi Pichia pastoris.           
Un alt aspect de genetică moleculară relevat cu succes de tehnologia ADN recombinant
este selecţia markerilor corespunzători care sunt utilizaţi la izolarea şi identificarea
celulelor transformante (Tabelul 4).
Tabelul 4. Selecţia markerilor genetici utilizaţi în tehnologia ADN recombinant la
drojdii.
Tipul de marker Gena Caracteristici
LEU2
Gene cu mutaţii auxotrofice
TRP1
complementare pentru biosinteza
HIS3
aminoacizilor
LYS2
Recesiv
URA3 Gene cu auxotrofie complementară
ADE2 pentru nucleotide
Amiloglucozidază
Gene care conferă activitate enzimatică
β - Lactanază
Dominant CUP1 Rezistenţă la cupru.
R
G418 Rezistenţă la antibiotic
TUNR aminoglicozidic.
KILK1 Rezistenţă la Tunicamicin.
C230 Imunitate la toxina Killer.
SMR1 Marker cromogenic.
SFA Rezistenţă la metil sulfometuran.
 Codifică formiat dehidrogenaza (celule
care se dezvoltă în 6mM formaldehidă).
HygromicinR
MetotrexatR
CloramfenicolR Gene care conferă rezistenţă la
DiuzonR medicamente
ZeocinR
CanavaninăR
          
  Markerii recesivi sunt gene care sunt complementare la o mutaţie auxotrofică
specifică în tulpina de drojdie gazdă.Markerii specifici dominanţi sunt necesari pentru
selecţia transformanţilor tulpinilor industriale de Saccharomyces cerevisiae.
            Elementele moleculare implicate direct în secreţia de proteine sunt secvenţele
semnal ale capătului N - terminal din proteina destinată excreţiei. Aceste peptide semnal
(formate din aproximativ 15- 30 aminoacizi) care sunt îndepărtate de proteazele specifice,
sunt codificate de către drojdii (native) sau de gene străine heteroloage, care sunt inserate
în joncţiunea dintre partea finală a celui de-al 5’ şi 3’ promotor (Tabelul 5).

Tabelul 5. Secvenţele semnal utilizate pentru secreţia proteinelor heteroloage din drojdii.
Tip Gena secvenţei semnal Caracteristici
SUC2 Codifică invertaza periplasmică
PHO5 Codifică fosfataza acidă periplasmică din
Homoloage Toxină Killer Kluyveromyces lactis
α - factor Prepro-Mfa1 leader este cel mai frecvent utilizat
MEL1 Codifică melobioza şi secreţia de glicoproteină
Codifică serumalbumina umană (HSA prepro a fost
Heteroloage HSA
utilizat în Pichia pastoris)
Renină de Mucor pusillus
Lizozim de pui
   
Prolactin de bovine
Gastrin uman

Cele mai utilizate secvenţe semnal în Saccharomyces cerevisiae sunt cele derivate
din invertază (codificată de SUC2), fosfatază acidă (PHO5) şi α - factor (MFa1).
Specificitatea exopepdidazelor KEX2 şi STE13 este pentru secvenţele de pe N – terminal
ale punctului de sciziune (Figura 3) α - factor leader a fost folosit cu succes direct în
secreţia numeroşilor agenţi terapeutici umani .
Figura 3. Compoziţia şi procesarea α - factor leader în Saccharomyces cerevisiae.

Procesul post - translaţional şi modificarea proteinelor recombinante de drojdie

sunt  importante aspecte moleculare, care necesită o atenţie deosebită în special în ceea ce
priveşte producerea de proteine terapeutice umane. Primul pas în procesul post –
translaţional este îndepărtarea iniţiatorului de metionină din proteina astfel sintetizată de
către metionilaminopeptidaza, care este un proces comun eucariotelor superioare.
Modificările chimice pe care drojdiile le elimină odată cu proteinele heteroloage includ:
glicozilarea, fosforilarea, acetilarea, metilarea, meristilarea şi izoprenilarea.
            Sinteza şi totodată modificarea proteinelor heteroloage produse de către drojdii,
suferă mai întâi o degradare proteolitică intracelulară, înaintea purificării lor. În
Saccharomyces cerevisiae asemenea proteoliză poate fi unispecifică şi asociată cu
vacuole sau poate fi specifică şi cuplată cu sistemul ubiquitin.

Integritatea şi menţinerea genomului mitocondrial

            Instabilitatea genomului mitocondrial (ADNmt) este o problemă generală de la
drojdii până la organismul uman. Oricum, controlul lui genetic nu este foarte bine
cunoscut, cu excepţia de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. De la descoperirea, acum
50 de ani, a unor mutante petit de către Ephrussi şi colaboratori, s-a arătat că mai mult de
100 de gene nucleare influenţează direct sau indirect soarta rho+ din ADN mitocondrial.
            Nu este surprinzător că mutaţiile genelor implicate în metabolismul ADNmt
(replicare, reparare, recombinare) pot cauza o pierdere completă a ADNmt (RHO 0 petit)
şi/sau conduc la formele reduse ale acestui genom. Oricum, cele mai multe pierderi ale
funcţiei de mutaţie, care măresc instabilitatea ADNmt la drojdii, se comportă indirect prin
implicarea în controlul diferitelor funcţii genetice, cum ar fi translaţia mitocondrială,
sinteza ATP, homeostazia Fe, metabolismul acizilor graşi, morfologia mitocondriilor. În
puţine cazuri s-a arătat că supraexprimarea genelor măreşte nivelurile mutantelor petit.
Mutaţiile la alte gene sunt letale, în absenţa unui ADNmt funcţional, ceea ce transformă
aceste drojdii petit pozitive în forme petit negative şi celulele petit nu pot fi recuperate în
aceste contexte genetice. Multe dintre aceste date sunt explicate numai dacă una dintre
ele presupune că păstrarea genomului rho+ depinde de o structură asemănătoare
centromerului, indispensabilă pentru menţinerea ADNmt rho+ şi/sau a funcţiei
subunităţilor de sinteză a ATP codificate mitocondrial, în special ATP6.

Căile MAP - kinazei la drojdia Saccharomyces cerevisiae

            Un set de 3 proteine kinaze, cunoscute ca MAPK (protein kinaza mitogen
activată), este întâlnită în mod curent ca parte a căilor de semnalizare în celulele
eucariote. Aproape două decenii de experienţe în domeniul geneticii şi biochimiei, plus
completarea recentă a hărţii genetice a Saccharomyces cerevisiae au adus la iveală doar 5
seturi MAPK funcţionale şi distincte la această drojdie
            Conjugarea sexuală, creşterea celulară şi adaptarea la stres, de exemplu, toate
acestea necesită răspunsurile celulare mediate de MAPK. O principală funcţie a acestor
seturi pare a fi expresia genelor, ca răspuns la semnalele extracelulare sau ca parte a
proceselor de dezvoltare specifice. Seturile MAPK deseori par a regla ciclul celular şi
invers.
            În ciuda succesului erei ingineriei genetice, în descoperirea acestor căi există încă
multe lipsuri importante despre mecanismele moleculare ale activării acestor cascade, a
modului cum aceste cascade reglează funcţiile celulei. De exemplu, comparaţia căilor de
semnalizare specifice diferitelor drojdii a scos la iveală o varietate foarte mare a
diferitelor tipuri de proteine semnalizatoare, a căror funcţie activează MAPK. Totuşi
modul de activare de către aceste proteine a MAPK, rămâne neclar.
            Ştim, de asemenea, că toate căile MAPK ale drojdiei se reglează reciproc şi
interacţionează cu alte căi de semnalizare pentru a produce un model de exprimare
coordonat a genelor, dar mecanismul molecular al acestuia este foarte puţin cunoscut.

Prionii din Saccharomyces cerevisiae şi Podospora sp.

            Studiile genetice au arătat că 2 elemente genetice non – mendeliene la
Saccharomyces cerevisiae, numite (URE3) şi (PSI)  sunt prionii lui Ure2p şi respectiv
Sup35p. (URE3) face ca celula să se prerepreseze pentru catabolismul azotului, în timp
ce (PSI) ridică eficienţa supresorului ARNts. Aceeaşi abordare a dus la identificarea
elementului non – mendelian (Het-s) al fungului filamentos Podospora anserina, ca prion
al proteinei het – s. Forma prionică a proteinei het-s este cerută pentru incompatibilitatea
heterocarionului, o funcţie normală a fungului, ceea ce sugerează că alte funcţii celulare
normale pot fi controlate de prioni. (URE3) şi (PSI) implică o autopropagare şi agregarea
Ure2p şi Sup35p. In vitro Ure2p şi Sup35p, formează amiloida, o structură filamentoasă,
cu o pată birefrigentă verde caracteristică, pusă în evidenţă cu Roşu de Congo. Depozitele
amiloidice sunt de o importanţă mare pentru viitorul descoperirii unui leac împotriva bolii
Alzheimer, a transmiterii encefalopatiei spongiforme şi a multor altor boli
Bibliografia
1. ANGHEL.I si colaboratorii. Biologia si tenhologia drojdiilor, vol.II. Editura
Tehnica. Bucuresti. 1991
2. DRAGOMIR, F ; POPA, D. Microbiologie – metode de laborator. Editura
Universitaria. Craiova. 2002
3. ANTOCE, O-A. ; DINU, L. Principii si tehnici de laborator. Editura Ceres.
Bucuresti. 2002

Webografie
http://www.e-referate.ro/referate/Bacterii,_drojdii_si_mucegaiuri2005-03-18.html

http://www.ecursuri.ro/referate/referate.php?report=bacterii-drojdii-si-mucegaiuri

http://facultate.regielive.ro/referate/farmacie/specii_de_drojdii_utilizate_in_biotehnologie
-28259.html

http://www.bioterapi.ro/dictionar/index_alimentar/index_alimentarDrojdii_selectionate.ht
ml